ES2828094T3

ES2828094T3 - Dops de saponina C: un nuevo agente antitumoral

Info

Publication number: ES2828094T3
Application number: ES04760194T
Authority: ES
Inventors: Xiaoyang Qi
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2004-03-17
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2024-03-17
Also published as: BRPI0409926A; JP2006524681A; CA2911022C; WO2004096159A2; WO2004096159A3; JP4762132B2; US8937156B2; CA2911022A1; EP1635856A4; AU2004233775C1; US20150125497A1; CA2522833C; US20040229799A1; EP1635856B1; US20090269373A1; CA2522833A1; AU2004233775B2; US10188698B2; AU2010200264A1; EP1635856A2

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicha composición un polipéptido relacionado con la saposina C y un componente de la lámina interna, en donde el componente de la lámina interna es una fosfatidilserina seleccionada del grupo que consiste en palmitoiloleoilfosfatidilserina, palmitelaidoiloleoilfosfatidilserina, miristoleoiloleoilfosfatidilserina, y dioleoilfosfatidilserina; y en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: - la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; y - una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde dicho polipéptido retiene la afinidad por la membrana plasmática.

Description

DESCRIPCIÓN

Dops de saponina C: un nuevo agente antitumoral

Sector de la técnica

El alcance de la invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines de información. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para modular el volumen de células en proliferación, más particularmente para modular el volumen del tumor y del cáncer. Además, la invención se refiere a composiciones y métodos para tratar el cáncer.

Estado de la técnica

Las saposinas, una familia de glicoproteínas de pequeño tamaño (~ 80 aminoácidos), termoestables, son esenciales para la actividad hidrolítica in vivo de varias enzimas lisosómicas en la ruta catabólica de los glicoesfingolípidos (véase Grabowski et al. (1990) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25:385-414; Furst et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta. 1126:1-16; Kishimoto et al. (1992) J. Lipid Res. 33:1255-1267). Cuatro miembros de la familia de las saposinas (A, B, C y D se hidrolizan proteolíticamente a partir de una sola proteína precursora, la prosaposina (véase Fujibayashi et al. (1985) Am. J. Hum. Genet. 37:741-748; O'Brien et al. (1988) Science 241:1098-1101; Rorman et al. (1989) Genomics 5:486-492; Nakano et al. (1989). JBiochem. (Tokyo) 105:152-154; Reiner et al. (1989) J Mol. Neurosci. 1:225-233; incorporados en el presente documento por referencia. La secuencia de aminoácidos completa de las saposinas A, B, C y D se ha publicado, así como la organización genómica y la secuencia del ADNc de la prosaposina (véase Fujibayashi et al. (1985) Am. J. Hum. Genet. 37:741-748; O'Brien et al. (1988) Science 241:1098-1101; Rorman et al. (1989) Genomics 5:486-492).

Las saposinas se definen como proteínas activadoras de esfingolípidos o coenzimas. Estructuralmente, las saposinas A, B, C y D tienen aproximadamente un 50-60 % de similitud, incluidos seis restos de cisteína estrictamente conservados (véase Furst et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1126:1-16) que forman tres puentes de disulfuro intradominio cuyas ubicaciones son idénticas (véase Vaccaro et al. (1995) J Biol. Chem. 270:9953-9960). Todas las saposinas contienen un sitio de glicosilación con ubicación conservada en la mitad de la secuencia N-terminal, pero la glicosilación no es esencial para sus actividades (véase Qi et al. (1998) Biochemistry 37:11544-11554 y Vaccaro et al. (1995) J Biol. Chem. 270:30576-30580, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad).

Todas las saposinas y las proteínas y dominios similares a las saposinas contienen un "pliegue de saposina" cuando están en solución. Este pliegue es un motivo de haz a-helicoidal múltiple, caracterizado por tres estructuras disulfuro conservadas y varios polipéptidos anfipáticos. A pesar de este pliegue de saposina compartido en solución, las saposinas y las proteínas similares a la saposina tienen diversas funciones biológicas in vivo en la potenciación de la degradación de esfingolípidos lisosomales (SL) y glucoesfingolípidos (GSL) por hidrolasas específicas. Debido a estas funciones, las saposinas ocupan una posición central en el control del metabolismo de esfingolípidos lisosomales y glicoesfingolípidos (véase Kishimoto et al. (1992) J Lipid Res. 33:1255-1267; Fujibayashi et al. (1985) Am. J Hum. Genet. 37:741-748; O'Brien et al. (1988) Science 241:1098-1101, incorporados en el presente documento como referencia). Además, las saposinas participan en la fusión y desestabilización de vesículas de fosfolípidos ácidos (véase Vaccaro et al. (1994) FEBS Letters 349:181-186, incorporados en el presente documento como referencia).

La saposina C es necesaria para la hidrólisis óptima de la glucosilceramida por la 13-glucosidasa ácida (Gcase, EC 3.1.2.45) in vivo e in vitro. Además, la fusión inducida por saposina C hacia vesículas que contienen fosfatidilserina se ha observado mediante microscopía electrónica (véase Vaccaro et al. (1994) FEBS Letters 349:181-186, incorporados en el presente documento como referencia). Adicionalmente, la saposina C tiene la propiedad general de actividad de unión a la membrana lipídica o afinidad por la membrana plasmática. Las saposinas se asocian con las membranas lipídicas incrustándose en las láminas externas. Las hélices H-1 y H-5 son parte integral de este proceso, lo que sugiere que la interacción adecuada de la membrana de la saposina C afecta a su especificidad y actividad. Además, la saposina C induce cambios estructurales de la membrana. Los procesos dinámicos de las interacciones de la saposina con las bicapas de fosfolípidos planares se han visualizado en tiempo real utilizando microscopía de fuerza atómica (véase Qi et al. (2001) 1 Biol. Chem. 276:27010-27017 y You et al. (2001) FEBS Lett. 503:97-102, incorporados en el presente documento como referencia).

La asimetría de los fosfolípidos es una característica bien conocida de las membranas plasmáticas de los mamíferos. La lámina externa de la bicapa lipídica es rica en fosfolípidos de colina, mientras que los aminofosfolípidos se encuentran preferentemente en la lámina interna (Bevers et al. (1998) Lupus Suppl. 2:S126-S131). La fosfatidilserina (PS) y la fosfatidiletanolamina (PE) residen casi exclusivamente en la lámina interna, y la fosfatidilcolina (PC) y la esfingomielina están en grandes cantidades en la lámina externa. La asimetría de los fosfolípidos puede ser una propiedad general de todas las células (Woon et al. (1999) Cell Calcium 25(4):313-320). La asimetría de los fosfolípidos de la membrana plasmática se mantiene a través de una variedad de mecanismos, que incluyen translocasas de aminofosfolípidos y scramblasas de fosfolípidos (solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20020081698).

En general, las células tumorales o cancerosas crecen rápidamente en comparación con las células normales. Estas células anormales producen una cantidad significativa de protones principalmente al generar ácido láctico durante la glucólisis o al generar dióxido de carbono durante la respiración debido a una tasa metabólica rápida. Por tanto, los sitios circundantes de estas células y tejidos suelen ser más ácidos que los de las células con una tasa de crecimiento normal.

Los carcinomas de células escamosas (SCC) de la piel son uno de los cánceres de la piel más frecuentes con un riesgo sustancial de metástasis asociada (Alam et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344:975-983, incorporados en el presente documento como referencia). Los cánceres de piel se clasifican en dos categorías, cánceres de piel melanoma y no melanoma (NMSC). Según la estimación de la Sociedad Americana del Cáncer, cada año se diagnostican más de un millón de casos de NMSC en los Estados Unidos. El SCC representa aproximadamente el 20 % de todos los tumores cutáneos y cada año se producen aproximadamente 200.000 nuevos casos de SCC en los Estados Unidos. El SCC es la forma más frecuente de tumor maligno en la transición de la piel a la mucosa y en la propia mucosa (Boni et al. (2002) Neuroendocrinology Letters 23S2:48-51). Los tratamientos actuales de los pacientes con SCC incluyen electrodesecación y curetaje, escisión, crioterapia, escisión quirúrgica o cirugía de Mohs. El uso apropiado de la electrodesecación y el curetaje, la escisión, o la crioterapia pueden eliminar tumores pequeños (<1 cm de diámetro), bien definidos, con un riesgo bajo de metástasis. La escisión quirúrgica y la cirugía de Mohs ofrecen las tasas más altas de curación para los pacientes con SCC primarios o recurrentes de alto riesgo. Sin embargo, estos tratamientos son más costosos y tienen riesgo de hematoma, seroma, infección y dehiscencia de la herida.

Por lo tanto, es deseable el desarrollo de un tratamiento del SCC eficaz, de bajo costo con mejores resultados cosméticos. También es importante desarrollar un tratamiento eficaz, de bajo costo para otros tipos de cáncer, tales como los cánceres de mama y de próstata y los linfomas.

Bibliografía:

El documento WO 98/42746 divulga análogos de péptidos sintéticos no naturales derivados de la región neurotrófica activa de la saposina C.

El documento Utsugi et al. (1991) Cancer Res. 51(11):3062-6 se refiere a la expresión elevada de fosfatidilserina en la lámina de la membrana externa de las células tumorales humanas y al reconocimiento por los monocitos sanguíneos humanos activados.

El documento WO00/02902 divulga que la saposina B tiene propiedades antiangiogénicas y antiproliferativas y que su administración es eficaz en el tratamiento de tumores en ratones.

Objeto de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para modular la distribución de componentes de las láminas interna y externa de las membranas plasmáticas. Los agentes de un aspecto de la divulgación comprenden un componente de la lámina interna y un polipéptido relacionado con prosaposina. Por "componente de la lámina interna" se entiende cualquier molécula o análogo estructural de la misma que se encuentre de forma natural en la lámina interna de una membrana plasmática de una célula, en particular una célula animal, más particularmente una célula de mamífero. En la invención, el componente de la lámina interna es una fosfatidilserina particular, tal como dioleoilfosfatidilserina (DOPS). La secuencia de aminoácidos de prosaposina se expone en la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias. Los polipéptidos relacionados con la prosaposina comparten al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma y retienen la afinidad de la membrana plasmática. En una realización, el polipéptido relacionado con la prosaposina es la saposina C (SEQ ID NO: 2 de la lista de secuencias) o un polipéptido relacionado con la saposina C, que comparte al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. y retienen la afinidad de la membrana plasmática. La relación molar entre el polipéptido y el componente de la lámina interna en un agente de aspectos de la divulgación está en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:50, preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:25, más preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10, aún más preferentemente de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 1:3. En una realización, los agentes de la invención además comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un agente de la invención promueve la muerte celular, tal como la muerte celular por apoptosis. En una realización, el agente induce preferentemente la apoptosis en células hiperproliferativas, tales como, pero sin limitación, células tumorales y cancerosas. Por lo tanto, en una realización de la invención, el agente es un agente antitumoral. En un aspecto de la invención, el agente induce preferentemente la apoptosis en células cancerosas, tales como, pero sin limitación, células de sarcoma, células de neuroblastoma y células de carcinoma de células escamosas.

Se proporcionan métodos para modular la distribución de un componente de la lámina interna en la membrana plasmática de una célula de un sujeto. Tales métodos implican la administración de un agente que comprende un componente de la lámina interna y un polipéptido relacionado con la prosaposina a un sujeto. Los métodos alteran la distribución del componente de la lámina interna en la lámina externa de una membrana plasmática de una célula del sujeto. Puede aumentarse la concentración del componente de la lámina interna en la lámina externa. En un aspecto de la divulgación, la modulación de la distribución de un componente de la lámina interna ocurre preferentemente en células hiperproliferativas del sujeto. Preferentemente tales células hiperproliferantes son células tumorales o células cancerosas. En un aspecto de la divulgación, la modulación de la concentración de un componente de la lámina interna en la lámina externa de la membrana plasmática induce la apoptosis.

Se proporcionan métodos para modular el volumen tumoral en un sujeto. Tales métodos implican la administración de un agente que comprende un componente de la lámina interna y un polipéptido relacionado con la prosaposina a un sujeto. El agente puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos, particularmente seres humanos, con tumores. En una realización, el agente promueve la muerte celular en células hiperproliferantes. La muerte celular puede ocurrir por apoptosis. Cualquier tumor es una diana potencial de la invención. Los tumores diana contienen células hiperproliferantes, tales como células tumorales y células cancerosas. Dichos tumores diana incluyen, aunque sin limitación, sarcomas, neuroblastomas y carcinomas de células escamosas. En una realización, modular el volumen del tumor da como resultado una disminución del volumen del tumor. Se prevé que la muerte de las células hiperproliferantes dentro del tumor de como resultado una disminución del volumen del tumor.

Se proporcionan métodos tratar un cáncer en un sujeto. Tales métodos implican la administración de un agente que comprende un componente de la lámina interna y un polipéptido relacionado con la prosaposina a un sujeto. El agente puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos, particularmente seres humanos, con cánceres. En una realización, el agente promueve la muerte celular en células hiperproliferantes. La muerte celular se produce mediante un proceso, tal como, pero sin limitación, apoptosis. Cualquier cáncer es una diana potencial de la invención. Los cánceres diana contienen células hiperproliferantes, tales como células tumorales y células cancerosas. Las células cancerosas diana incluyen, aunque sin limitación, células derivadas de sarcomas, neuroblastomas, carcinomas de mama y carcinomas de células escamosas. En un aspecto de la invención, el agente se administra por vía enteral, por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, o tópica. Se puede administrar una dosis única o múltiple del agente a un sujeto para tratar un cáncer.

Descripción de las figuras.

La Figura 1 presenta queratinocitos inmortalizados normales (NIK) (Paneles A y B) y células de carcinoma de células escamosas (SCC) (Paneles C y D). Las células de los Paneles A y C recibieron tratamientos con placebo. Las células de los Paneles B y D se trataron con un agente de la invención que comprendía saposina C 8 pM y DOPS 26 pM. Los detalles del experimento se describen en otra parte del presente documento.

La Figura 2 presenta células de linfoma murino de la línea celular L5178Y-R. Las células del Panel A recibieron un tratamiento con placebo. Las células del Panel B se trataron con DOPS 60 pM. Las células del Panel C se trataron con saposina 20 pM. Las células del Panel D se trataron con un agente de la invención que comprende saposina C 10 pM y DOPS 30 pM.

La Figura 3 presenta los resultados obtenidos a partir de la evaluación del volumen tumoral promedio en ratones desnudos portadores de xenoinjertos de carcinoma de células escamosas humano antes y después de la inyección subcutánea de un placebo (solución salina tamponada con fosfato, indicado con triángulos negros y líneas discontinuas) o el agente de la invención. (saposina C a 10 mg/kg de peso corporal/DOPS a 2 mg/kg de peso corporal, indicado con cuadrados negros y líneas continuas). Las barras de error indican el error estándar. El volumen tumoral está indicado en mm3, y el tiempo está indicado como días de crecimiento tumoral. El panel A presenta los resultados obtenidos de ratones tratados dos veces. Los días de la primera y segunda inyección se indican con flechas. El panel B presenta los resultados obtenidos de ratones tratados una vez. El día de la inyección se indica con una flecha. Los detalles de los experimentos se describen en otra parte del presente documento.

La Figura 4 presenta micrografías fluorescentes de tejidos tumorales de carcinoma de células escamosas humano de xenoinjertos. Las células del Panel A se trataron con una mezcla marcada con fluorescencia de fosfatidilserina y DOPS (NBD-DOSP/DOPS). Las células del Panel B se trataron con una mezcla marcada con fluorescencia de fosfatidilserina, DOPS y saposina C. Los detalles del experimento se describen en otra parte del presente documento.

La Figura 5 presenta micrografías de tejidos tumorales de carcinoma de células escamosas humano de xenoinjertos. Se obtuvieron tejidos de tumores tratados con DOPS (2 mg/kg de peso corporal, Paneles A y C) o saposina C (10 mg/kg de peso corporal) y DOPS (2 mg/kg de peso corporal, Paneles B y D). Los tejidos se tiñeron con tinción TUNEL (Paneles A y B) o hematoxilina y eosina (Paneles C y D). Las flechas en el Panel B indican células apoptóticas. La tinción oscura en el Panel D indica el área de necrosis.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una composición para usar para el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicha composición un polipéptido relacionado con la saposina C y un componente de la lámina interna, en donde el componente de la lámina interna es una fosfatidilserina seleccionada del grupo que consiste en palmitoiloleoilfosfatidilserina, palmitelaidoiloleoilfosfatidilserina, miristoleoiloleoilfosfatidilserina, y dioleoilfosfatidilserina; y en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; y

- una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde dicho polipéptido retiene la afinidad por la membrana plasmática. Adicionalmente, la presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para modular células hiperproliferantes, particularmente trastornos que implican células hiperproliferantes, más particularmente tumores y cánceres, tales como carcinomas de células escamosas y linfomas. Las composiciones comprenden un agente con un polipéptido relacionado con la prosaposina, particularmente saposina C, y un componente de la lámina interna, particularmente una fosfatidilserina o un análogo estructural de la misma, más particularmente dioleoilfosfatidilserina (DOPS). Las combinaciones de estos dos compuestos exhiben actividad antitumoral y, por tanto, se denominan agentes antitumorales. Por "actividad antitumoral" se entiende una reducción en la tasa de proliferación celular y, por lo tanto, una disminución en la tasa de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que surge durante la terapia, y/o destrucción de células neoplásicas (tumorales) existentes. o células neoplásicas recién formadas y, por tanto, una disminución del tamaño total de un tumor durante la terapia. El tratamiento con una combinación de saposina C (o un polipéptido relacionado con la prosaposina) y DOPS (o un componente de la lámina interna) provoca una respuesta fisiológica que modula la distribución de un componente de la lámina interna en la membrana plasmática.

La actividad antitumoral de un agente de la invención no se limita a un modo de acción particular, sino que puede funcionar a través de una variedad de modos de acción que incluyen, pero no se limitan a, apoptosis. Los factores ambientales contribuyen al efecto preferencial del agente sobre las células tumorales. Estos factores ambientales incluyen, aunque sin limitación, niveles de pH más bajos cerca de las células tumorales, condiciones de hipoxia crecientes y presentación de lípidos alterada en la membrana externa de las células tumorales. La hipoxia es un factor epigenético que estimula la expresión y liberación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf ) de las células tumorales. El VEGF se conoce en la técnica como un factor de permeabilidad vascular y puede desempeñar un papel en las vasculaturas desorganizadas y laxas de los tejidos tumorales en comparación con la vasculatura normal. Un agente de saposina C-DOPS de la invención penetra preferentemente en el tejido tumoral en lugar de en el tejido sano después de la administración intravenosa.

La divulgación abarca composiciones de polipéptidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Un polipéptido "aislado" o "purificado", o una parte biológicamente activa del mismo, está sustancial o esencialmente exento de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína que se encuentra en su entorno natural. Por lo tanto, una proteína aislada o purificada está sustancialmente exenta de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente exenta de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, el 5 % o el 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o una parte biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, preferentemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, el 5 % o el 1 % (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son proteínas de interés.

Como se usa en el presente documento, un "polipéptido relacionado con la prosaponina" es cualquier polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la prosaposina expuesta en la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, o un fragmento procesado proteolíticamente del mismo, en donde dicho polipéptido retiene la afinidad por la membrana plasmática. Los fragmentos y variantes del polipéptido de prosaposina (SEQ ID NO: 1) también son un aspecto de la presente divulgación. La prosaposina se procesa proteolíticamente en cuatro saposinas, las saposinas A, B, C y D. Como se utiliza en el presente documento, un "polipéptido relacionado con la saposina C" es cualquier polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la saposina C expuesta en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en donde dicho polipéptido retiene la afinidad por la membrana plasmática. También se incluyen fragmentos y variantes del polipéptido relacionado con la saposina C (SEQ ID NO: 2). Por "fragmento" se entiende una parte de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, de la proteína. Los fragmentos de proteína de prosaposina retienen la actividad biológica de la prosaposina y, por tanto, poseen afinidad por la membrana plasmática. Los fragmentos de proteína de la saposina C retienen la actividad biológica de la saposina C y, por tanto, poseen afinidad por la membrana plasmática. Como se utiliza en el presente documento, "afinidad por la membrana plasmática" se refiere a la capacidad de interactuar con superficies de fosfolípidos a través de interacciones electrostáticas o hidrófobas.

Un fragmento de una parte biológicamente activa del polipéptido de prosaposina de un aspecto de la divulgación codificará al menos 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520 aminoácidos contiguos o hasta 524 aminoácidos presentes en un polipéptido de prosaposina de un aspecto de la divulgación. Un fragmento de una parte biológicamente activa de polipéptido de saposina C como se define anteriormente codificará al menos 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 aminoácidos contiguos presentes en un polipéptido de saposina C de la invención.

Por "variantes" se entiende secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservadoras incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de prosaposina de un aspecto de la divulgación. Se pueden identificar variantes alélicas de origen natural tales como estas mediante el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen también secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio, pero que todavía codifica un polipéptido de prosaposina.

Por proteína "variante" se entiende una proteína derivada de la proteína nativa por deleción (denominada de esta manera truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N y/o al extremo C de la proteína nativa; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa, o polipéptidos producidos sintéticamente que tienen tal secuencia de aminoácidos. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la afinidad por la membrana plasmática como se describe en el presente documento. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, el polimorfismo genético o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína de prosaposina nativa de un aspecto de la divulgación tendrán al menos aproximadamente 80 %, 85 %, preferentemente al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, y más preferentemente al menos aproximadamente 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa determinada mediante los programas de alineación de la secuencia descritos en otra parte en el presente documento. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de esta proteína en tan solo 1-15 restos de aminoácidos, tan solo 1-10, tal como 6-10, tan solo 5, tan solo 4, 3, 2 o incluso 1 resto de aminoácido.

La proteína saposina C puede alterarse de diversas maneras incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos, e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de la proteína prosaposina mediante mutaciones en el ADN. Son bien conocidos en la técnica los métodos los métodos para las mutagénesis y alteraciones en las secuencias de nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de Estados Unidos N.° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citados en los mismos. Pueden encontrarse directrices en lo que respecta a lo adecuado de las sustituciones de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) y Qi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:27010-27017, incorporados en el presente documento por referencia. Las sustituciones conservativas, tales como intercambiar un aminoácido con otro que tenga propiedades similares, pueden ser preferibles.

Por lo tanto, el polipéptido de saposina C y las secuencias de aminoácidos de la invención incluyen tanto las secuencias de origen natural como las formas mutantes, variantes, y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán poseyendo la actividad de afinidad por la membrana plasmática deseada. Evidentemente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que pudieran producir una estructura secundaria del ARNm. Véase, publicación de solicitud de patente EP N.° 75.444.

Las deleciones, inserciones, y sustituciones de la secuencia de la proteína abarcadas en el presente documento no se espera que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción, o inserción por adelantado antes de hacerlo, un experto en la materia apreciará que se evaluará el efecto mediante ensayos de cribado rutinarios. Es decir, la afinidad de la membrana plasmática se puede evaluar mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, espectrofotometría de fluorescencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o mediciones de dicroísmo circular. Véase, por ejemplo, Qi et al. (2001) J Biol. Chem. 276:27010-27017, incorporados en el presente documento por referencia.

Las proteínas variantes abarcan también proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tales como la transposición del ADN. Con dicho procedimiento, se pueden manipular una o más secuencias de saposina C diferentes para crear una nueva saposina C que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de manera homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando esta estrategia, pueden reordenarse motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre el gen de la prosaposina de un aspecto de la divulgación y otros genes de la prosaposina conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una afinidad por la membrana alterada. Se conocen en la técnica estrategias para dicha transposición de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las Patentes de EE. UU. N.° 5.605.793 y 5.837.458.

Se usan las siguientes expresiones para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de aminoácidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial".

•(a) Como se utiliza en el presente documento, "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada com o una base para comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de polipéptidos o aminoácidos de longitud completa o la secuencia génica completa.

(b) Como se usa en el presente documento, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. En general la ventana de comparación es de al menos 20 aminoácidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la materia entienden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia de aminoácidos se introduce normalmente una penalización por hueco y se resta del número de coincidencias.

Se conocen bien en la técnica procedimientos de alineación de secuencias para la comparación. Por lo tanto, puede lograrse la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualesquiera usando un algoritmo matemático. Los ejemplos preferidos, no limitantes de dichos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981) Adv. AppL Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Pueden utilizarse implementaciones computarizadas de estos algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Para fines de la presente invención, la comparación de secuencias de nucleótidos o proteínas para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia con las secuencias divulgadas en el presente documento se realiza preferiblemente usando el programa GCG GAP (Versión 10.00 o posterior) con sus parámetros predeterminados o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que tiene emparejamientos de restos de nucleótidos o aminoácidos idénticos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico en comparación con la alineación correspondiente generada por el programa preferido.

Los programas de comparación de secuencia incluyen, pero sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Versión 8 (comercializado por Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., EE.UU.). Pueden efectuarse alineamientos usando estos programas usando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL está perfectamente descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et cd. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988), anteriormente citado. Con el programa ALIGN se puede usar una tabla PAM 120 de restos por peso, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4 cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), anteriormente citado. Pueden efectuarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa BLASTN, puntuación=100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la divulgación. Pueden efectuarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa BLASTX, puntuación=50, longitud de palabra=3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede usarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) anteriormente citado. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN) para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también puede llevarse a cabo manualmente mediante inspección.

(c) Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" o "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido hace referencia a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de restos que no son idénticas normalmente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los restos de aminoácido por otros restos de aminoácido con propiedades similares (por ejemplo, carga o hidrofobia) y por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede ajustarse por exceso el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Normalmente, esto implica puntuar una sustitución conservativa como un emparejamiento erróneo parcial en lugar de completo, aumentando de este modo el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como se implementa en el programa p C/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).

(d) Como se usa en el presente documento, el "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentra la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

(e) (i) La expresión "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia, preferentemente, al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 % y lo más preferentemente al menos 95 %, en comparación con una secuencia de referencia, usando uno de los programas de alineamiento descritos usando parámetros convencionales. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos fines normalmente significa una identidad de secuencia de al menos 60 %, más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, y lo más preferentemente al menos 95 %.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajo que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una y fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, condiciones rigurosas abarcan temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 20 °C menos de la Tm, dependiendo del grado de rigurosidad deseado como se califica de otro modo en el presente documento. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones de rigurosidad aún son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

(e) (ii) La expresión "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, preferentemente 80 %, más preferentemente 85 %, lo más preferentemente al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación especificada. Preferentemente, el alineamiento óptimo se realiza usando el alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos producidos contra el segundo péptido. Por lo tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solo por una sustitución conservativa. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se indicó anteriormente, excepto que las posiciones de los restos que no son idénticos pueden diferir por cambios conservativos de aminoácidos.

Los agentes de un aspecto de la divulgación comprenden un polipéptido similar a prosaposina y un componente de la lámina interna. Por "componente de la lámina interna" se entiende cualquier molécula o análogo estructural de la misma que se encuentre de forma natural en la lámina interna de una membrana plasmática de una célula, en particular una célula animal, más particularmente una célula de mamífero. En general, la concentración de un componente de la lámina interna en la lámina interna será mayor que la concentración de ese componente de la lámina interna en la lámina externa. Se reconoce que durante ciertas perturbaciones celulares, tales como la apoptosis, la necrosis y el crecimiento hiperproliferativo, se altera la composición normal de las láminas interna y externa. Los ejemplos de componentes de la lámina interna incluyen, aunque sin limitación, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina y análogos estructurales de las mismas. Por "análogo estructural" de fosfatidilserina se entiende cualquier fosfolípido aniónico o lípido de ácido con un grupo de cabeza cargado negativamente, incluyendo, pero sin limitación, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, palmitoiloleoilfosfatidilserina, palmitelaidoiloleoilfosfatidilserina, miristoleoiloleoilfosfatidilserina, dilinoleoilfosfatidilserina, palmiticlinoleoilfosfatidilserina, lisofosfatidilserina, y dioleoilfosfatidilserina.

En un aspecto, las composiciones y métodos de la invención se refieren a modular la distribución del componente de la lámina interna en una membrana plasmática. En otra realización, las composiciones y métodos de la invención se refieren a la modulación y tratamiento de trastornos que involucran células hiperproliferantes, tales como tumores y cánceres. Por "modular" se entiende alterar, cambiar, variar, modificar o permutar en al menos el 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %. Modular la distribución de un componente de la lámina interna en una membrana plasmática altera la cantidad del componente en la membrana plasmática, altera la ubicación relativa del componente en la lámina interna o altera los porcentajes del componente que se encuentra en la lámina interna y la lámina externa de la membrana plasmática. Tal modulación puede tener como resultado un aumento de la concentración del componente de la lámina interna en la lámina externa de la membrana plasmática. La modulación del volumen del tumor altera el volumen del tumor, el volumen de al menos una célula tumoral o el número de células tumorales.

Los métodos de ensayo de la distribución de componentes en una membrana plasmática son conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, microscopia confocal, microscopio de fuerza atómica, FRET, desactivación fluorescente, microscopía electrónica, dicroísmo circular, RMN, MALDI-TOF, análisis de los espectros de emisión, dispersión lumínica, espectrometría de masas por electronebulización. Véase Chang et al. (1978) Anal. Biochem.

91:13-31; Kishimoto et al. (1992) J. Lipid Research 33:1255-1267; Vaccaro et al. (1995)1 Biol. Chem. 270:9953-9960; y Fu et al. (1994) J. Mol. Neurosci. 5:59-67, incorporados en el presente documento por referencia en su totalidad.

Los métodos de ensayo del volumen tumoral son conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, mediciones del calibre, volumetría, ultrasonidos, imágenes de resonancia magnética, ELISA, examen físico, rayos X, tomografía de emisión de positrones, gammagrafía ósea, espectroscopía de resonancia Raman, imágenes táctiles, estudios de imagen de tomografía computarizada y/o CAT.

Como se usa en el presente documento, los términos "cáncer", "hiperproliferativo" "tumor", y "neoplásico" se refieren a células que tienen la capacidad de crecer de manera autónoma, es decir, un estado anormal o afección caracterizado por un crecimiento celular de rápida proliferación. Los estados patológicos hiperproliferativos y neoplásicos pueden categorizarse como patología, es decir, que caracterizan o constituyen un estado patológico o pueden categorizarse como no patología, es decir, una desviación respecto de la normalidad, pero no asociada con un estado patológico. Se pretende que el término incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados en malignos, independientemente del tipo histopatológico o del estadio de invasividad. El término hiperproliferativo incluye además células de músculo liso que experimentan un crecimiento celular de proliferación rápido como ocurre en ciertas miocardiopatías. Las células "hiperproliferativas patológicas" se producen en estados patológicos caracterizados por un crecimiento tumoral maligno. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociada a la reparación de heridas.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciación celular incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, trastornos metastásicos o trastornos neoplásicos hematopoyéticos, por ejemplo, leucemias. Un tumor metastásico puede surgir a partir de una multitud de tipos tumorales primarios, que incluyen, pero sin limitación, aquellos de origen en la próstata, colon, pulmón, mama e hígado.

Los términos "cáncer" o "neoplasias" incluyen neoplasias malignas de diversos sistemas y órganos, tales como los que afectan al pulmón, mama, tiroideo, linfoide, gastrointestinal, o del tracto genitourinario, así como adenocarcinomas que incluyen neoplasias tales como la mayor parte de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago.

El término "carcinoma" está reconocido en la técnica y se refiere a neoplasias malignas de tejidos epiteliales o endocrinos, incluyendo carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Los ejemplos de carcinomas incluyen aquellos que se forman a partir del tejido del cuello de útero, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un "adenocarcinoma" se refiere a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el que las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles.

El término "sarcoma" está reconocido en la técnica y se refiere a tumores malignos de origen mesenquimal.

Los tumores y los cánceres de la piel incluyen, aunque sin limitación, melanoma maligno; tumores epiteliales benignos, incluyendo pero sin limitación, queratosis seborreicas, acantosis nigricans, pólipo fibroepitelial, quiste epitelial, queratocantoma, y tumores anexiales (apéndices); tumores epidérmicos premalignos y malignos, incluyendo pero sin limitación, queratosis actínica, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, y carcinoma de células de Merkel; tumores de la dermis, incluyendo pero sin limitación, histiocitoma fibroso benigno, dermatofibrosarcoma protuberans, xantomas y tumores vasculares dérmicos; tumores de inmigraciones de células a la piel, incluyendo pero sin limitación, histiocistosis X, micosis fungoide (linfoma cutáneo de linfocitos T), y mastocitosis.

Los tumores y cánceres de células de la médula ósea incluyen, aunque sin limitación, trastornos que tienen su origen en estas células. Estos trastornos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: enfermedades que afectan a las células madre hematopoyéticas; células progenitoras comprometidas linfoides; células linfoides incluyendo linfocitos B y linfocitos T; progenitores mieloides comprometidos, incluyendo monocitos, granulocitos y megacariocitos; y progenitores eritroideos comprometidos. Estas incluyen pero sin limitación leucemias, incluyendo leucemias linfoides de linfocitos B, leucemias linfoides de linfocitos T, leucemias indiferenciadas; eritroleucemia, leucemia megacarioblástica, monocítica; [se incluyen leucemias con y sin diferenciación]; leucemia linfoblástica crónica y aguda, leucemia linfocítica crónica y aguda, leucemia mielógena crónica y aguda, linfoma, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide crónica y aguda, leucemia mielomonocítica; leucemia mieloblástica crónica y aguda, leucemia mielógena crónica y aguda, leucemia promielocítica crónica y aguda, leucemia mielocítica crónica y aguda, tumores malignos hematológicos del linaje monocitos-macrófagos, tales como leucemia mielógena crónica juvenil; LMA secundaria, trastorno hematológico antecedente; angioendoteliomatosis cutánea reactiva; trastornos fibrosantes que implican la expresión alterada de células dendríticas, trastornos que incluyen esclerosis sistémica, síndrome E-M, síndrome del aceite tóxico epidémico, formas localizadas de fascitis eosinofílica de esclerodermia, queloide, y colonopatía fibrosante; histiocitoma fibroso angiomatoide maligno; carcinoma, incluyendo carcinoma primario de células escamosas de cabeza y cuello; sarcoma, incluyendo sarcoma de Kaposi; fibroadenoma y tumores filoides, incluyendo fibroadenoma mamario; tumores estromales; tumores filoides, incluyendo histiocitoma; linfomas de linfocitos T; y linfomas de linfocitos B.

Los tumores y los cánceres del corazón incluyen, aunque sin limitación, tumores cardíacos primarios, tales como mixoma, lipoma, fibroelastoma papilar, rabdomioma, y sarcoma, y efectos cardíacos de neoplasias no cardíacas.

Los tumores y los cánceres de los vasos sanguíneos incluyen, aunque sin limitación, hemangioma, linfangioma, tumor glómico (glomangioma), ectasias vasculares, y angiomatosis bacilar, y tumores de grado intermedio (maligno de grado bajo en el extremo), tal como sarcoma de Kaposi y hemangioendotelioma, y tumores malignos, tales como angiosarcoma y hemangiopericitoma.

Los tumores y los cánceres de linfocitos B incluyen, aunque sin limitación, neoplasias de precursores de linfocitos B, tales como leucemia/linfoma linfoblástica. Las neoplasias de linfocitos B periféricos incluyen, aunque sin limitación, leucemia linfocítica crónica/linfoma microlinfocítico, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, neoplasias de células plasmáticas, mieloma múltiple, y entidades relacionadas, linfoma linfoplasmacítico (macroglobulinemia de Waldenstrom), linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal (MALToma), y leucemia de células pilosas.

Los tumores y los cánceres del hígado incluyen, aunque sin limitación, hiperplasias nodulares, adenomas, y tumores malignos, incluyendo carcinoma primario del hígado y tumores metastásicos.

Los tumores y los cánceres del cerebro incluyen, aunque sin limitación, gliomas, incluyendo astrocitoma, incluyendo astrocitoma fibrilar (difuso) y glioblastoma multiforme, astrocitoma piloquístico, xantoastrocitoma pleomórfico, y glioma del tronco encefálico, oligodendroglioma, y ependimoma y lesiones paraventriculares relacionadas, tumores neuronales, neoplasias mal diferenciadas, incluyendo meduloblastoma, otros tumores parenquimatosos, incluyendo linfoma de cerebro primario, tumores de células germinales y tumores parenquimatosos de la región pineal, meningiomas, tumores metastásicos, síndromes paraneoplásicos, tumores de la vaina del nervio periférico, incluyendo schwannoma, neurofibroma y tumor maligno de la vaina del nervio periférico (schwannoma maligno), y síndromes neurocutáneos (facomatosis), incluyendo neurofibromatosis, incluyendo neurofibromatosis de Tipo 1 (NF1) y neurofibromatosis (NF) de Tipo 2, esclerosis tuberosa y enfermedad de Von Hippel-Lindau.

Los tumores y los cánceres del ovario incluyen, aunque sin limitación, tumores del ovario, tales como, tumores del epitelio celómico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores endometroides, adenocarcinoma de células claras, cistadenofibroma, tumor de Brenner, tumores epiteliales superficiales; tumores de células germinales, tales como teratomas maduros (benignos), teratomas monodérmicos, teratomas malignos inmaduros, disgerminoma, tumor del seno endodérmico, coriocarcinoma; tumores del estroma de los cordones sexuales, tales como, tumores de células de la granulosa-teca, tecoma-fibromas, androblastomas, tumores de células de Hill, y gonadoblastoma; y tumores metastásicos, tales como tumores de Krukenberg.

Los tumores y los cánceres del riñón incluyen, aunque sin limitación, tumores benignos, tales como adenoma papilar renal, fibroma o hamartoma renal (tumor de células intersticiales renomedulares), angiomiolipoma, y oncocitoma, y tumores malignos, incluyendo carcinoma de células renales (hipernefroma, adenocarcinoma de riñón), lo que incluye carcinomas uroteliales de la pelvis renal.

Los tumores y los cánceres del músculo esquelético incluyen, aunque sin limitación, rabdomiosarcoma.

Los tumores y los cánceres de células formadoras de hueso incluyen, aunque sin limitación, osteoma, osteoma osteoide, osteoblastoma, osteosarcoma, osteocondroma, condromas, condroblastoma, fibroma condriomixoide, condrosarcoma, defectos corticales fibrosos, displasia fibrosa, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma de Ewing, tumor neuroectodérmico primitivo, tumor de células gigantes, y tumores metastásicos.

Los tumores y los cánceres del páncreas incluyen, aunque sin limitación, tumores quísticos y carcinoma del páncreas; tumores de células de los islotes, incluyendo, pero sin limitación, insulinomas, gastrinomas, y otros tumores de células de los islotes raros.

Los tumores y los cánceres de la mama incluyen, aunque sin limitación, tumores del estroma tales como fibroadenoma, tumores filoides, y sarcomas y tumores epiteliales, tales como papilomas de conductos grandes; carcinoma de mama incluyendo carcinoma in situ (no invasivo) que incluye carcinoma ductal in situ (incluida la enfermedad de Paget) y carcinoma lobulillar in situ, y carcinoma invasivo (infiltrante) incluyendo, pero sin limitación, carcinoma ductal invasivo, tipo no especial, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma medular, carcinoma coloide (mucinoso), carcinoma tubular, y carcinoma papilar invasivo, y neoplasias malignas varias.

Los tumores y los cánceres de la mama del hombre incluyen, aunque sin limitación, carcinoma.

Los tumores y los cánceres de la próstata incluyen, aunque sin limitación, carcinoma.

Los tumores y los cánceres del colon incluyen, aunque sin limitación, pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorrectal, carcinoma colorrectal, y tumores carcinoides.

Los tumores y los cánceres del pulmón incluyen, aunque sin limitación, carcinoma broncogénico, incluyendo síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores varios, y tumores metastásicos; tumores pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.

Los tumores y los cánceres del timo incluyen, aunque sin limitación, timomas, incluyendo tumores de células germinales, linfomas, enfermedad de Hodgkin, y carcinoides. Los timomas pueden incluir timoma benigno o encapsulado, y timoma maligno de Tipo I (timoma invasivo) o de Tipo II, carcinoma tímico designado.

Los tumores y los cánceres de amígdala incluyen, aunque sin limitación, linfoma no Hodgkin y linfomas de linfocitos B.

Un agente de un aspecto de la divulgación que comprende un polipéptido relacionado con la prosaposina y un componente de la lámina interna (también denominado en el presente documento como "compuestos activos") puede incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Tales composiciones comprenden normalmente un polipéptido relacionado con la prosaposina, un componente de la lámina interna y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el polipéptido relacionado con la prosaposina y el componente de la lámina interna forman una nanovesícula. El diámetro de la nanovesícula está en el intervalo de 0,01 a 10 |jm, preferentemente, de 0,1 a 1 jm , más preferentemente de 0,1 a 0,5 aún más preferentemente de 0,2 a 0,4 jm , aún todavía más preferentemente de 0,2 a 0,3. Los diámetros típicos de la nanovesícula incluyen, aunque sin limitación, 10 nm, 100 nm, 150 nm, 160 nm, 170 nm, 180 nm, 190 nm, 200 nm, 210 nm, 220 nm, 230 nm, 240 nm, 250 nm, 260 nm, 270 nm, 280 nm, 290 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 nm y 1000 nm.

El término "administrar" se usa en su sentido más amplio e incluye cualquier método para introducir las composiciones de la presente invención en un sujeto. Por "sujeto" se entiende un mamífero, por ejemplo, un ser humano, o un modelo experimental o animal o de enfermedad. El sujeto también puede ser un animal no humano, tal como, pero sin limitación, un primate no humano, caballo, vaca, cabra, cerdo, conejo, ratón, cobaya, perro u otro animal doméstico. Adicionalmente, las composiciones de la invención son útiles para el tratamiento de trastornos descritos en el presente documento. Por lo tanto, las terapias para trastornos asociados con células hiperproliferantes, tales como tumores o cánceres, están incluidas en el presente documento. "Tratamiento" se define en el presente documento como la aplicación o administración de un agente de la invención a un paciente, o la aplicación o administración de un agente de la invención a un tejido o línea celular aislado de un paciente, que tiene una enfermedad o un síntoma de una enfermedad, con el propósito de curar, cicatrizar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad o síntomas de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Un agente antitumoral o composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p. ej., inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa, intraperitoneal, y rectal.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringuillas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL.TM. (BASF; Parsippany, N.J.), o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En unos casos, la composición ha de ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y ha de preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los principios activos (p. ej., un polipéptido relacionado con la prosaposina y un componente de la lámina interna) en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización, lo que proporciona un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución esterilizada por filtración de los mismos.

Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden atraparse en cápsulas de gelatina o compactarse formando comprimidos. Con el objetivo de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se usa como enjuague y se expectora o ingiere. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja. Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono o un nebulizador.

En un aspecto, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto contra su rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para preparar dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente a través de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a ser tratado conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 15 mg/kg (p. ej., de 0,1 a 20 mg/kg) del agente de la invención es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o un periodo mayor, dependiendo de la afección, se continuará el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Un ejemplo de régimen de dosificación se divulga en el documento WO 94/04188. La especificación para las formas de dosis unitaria de la divulgación está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto que se vaya a lograr y de las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica. Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (p. ej., con bases para supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

Los agentes antitumorales o anticancerígenos descritos en el presente documento se pueden administrar por vía transdérmica. La administración transdérmica normalmente implica la administración de un agente farmacéutico para el paso percutáneo del fármaco a la circulación sistémica del sujeto o paciente. Los sitios de la piel incluyen regiones anatómicas para la administración transdérmica del fármaco e incluyen el antebrazo, abdomen, el pecho, la espalda, las nalgas, el área mastoidea, y similares.

La administración transdérmica se logra exponiendo una fuente del agente o complejo a la piel de un paciente durante un período de tiempo prolongado. Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de un agente farmacéutico al cuerpo (véase Hadgraft and Guy (eds) (1989) Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Marcel Dekker, Inc.; Robinson & Lee (eds) (1987) Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, Inc; y Kydonieus & Berner (eds) (1987) Transdermal Delivery of Drugs vols 1-3, CRC Press, incorporados en el presente documento como referencia). Dichas formas de dosificación se pueden preparar mediante disolución, dispersión o de otro modo incorporando la combinación del polipéptido relacionado con la saposina C y dioleoilfosfatidilserina (DOPS) en un medio apropiado, tal como un material de matriz elastomérico. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de dicho flujo se puede controlar proporcionando una membrana controladora de la velocidad o dispersando el agente en una matriz polimérica o gel.

En los métodos descritos en el presente documento se pueden usar diferentes tipos de parches transdérmicos. Por ejemplo, se puede preparar un parche adhesivo simple a partir de un material de soporte y un adhesivo de acrilato. El agente farmacéutico y cualquier potenciador se formulan en la solución de colada adhesiva y se dejan mezclar completamente. La solución se vierte directamente sobre el material de soporte y el disolvente de colada se evapora en un horno, dejando una película adhesiva. Para completar el sistema se puede incluir una capa desprendible.

Como alternativa, se puede emplear un parche de matriz de poliuretano para administrar el agente. Las capas de este parche comprenden una capa de soporte, una matriz de fármaco/potenciador de poliuretano, una membrana, un adhesivo y una lámina protectora. La matriz de poliuretano se prepara utilizando un prepolímero de poliuretano curado a temperatura ambiente. La adición de agua, alcohol y complejo al prepolímero da como resultado la formación de un elastómero firme pegajoso que se puede moldear directamente sobre el material de soporte.

Otro aspecto de la divulgación utilizará un parche de matriz de hidrogel. Normalmente, la matriz de hidrogel comprenderá alcohol, agua, fármaco y varios polímeros hidrófilos. Esta matriz de hidrogel se puede incorporar en un parche transdérmico entre la capa de respaldo y la capa adhesiva.

Para los sistemas de administración pasiva, la velocidad de liberación se controla normalmente mediante una membrana colocada entre el depósito y la piel, por difusión desde un dispositivo monolítico o por la piel misma que actúa como una barrera de control de la velocidad en el sistema de administración (véanse las patentes de Estados Unidos números: 4.816.258; 4.927.408; 4.904.475; 4.588.580; 4.788.062, incorporados en el presente documento como referencia). La velocidad de administración del fármaco dependerá en parte de la naturaleza de la membrana. Por ejemplo, la velocidad de administración del fármaco a través de las membranas del cuerpo es generalmente más alta que a través de las barreras dérmicas. La velocidad a la que se administra el agente desde el dispositivo a la membrana se controla de manera más ventajosa mediante el uso de membranas limitantes de la velocidad colocadas entre el depósito y la piel. Cuando la piel es suficientemente permeable al complejo (es decir, la absorción a través de la piel es mayor que la velocidad de paso a través de la membrana), la membrana servirá para controlar la velocidad de dosificación experimentada por el paciente.

Los materiales de membrana permeable adecuados pueden seleccionarse basándose en el grado deseado de permeabilidad, la naturaleza del agente y las consideraciones mecánicas relacionadas con la construcción del dispositivo. Los ejemplos de materiales de membrana permeables incluyen una amplia variedad de polímeros naturales y sintéticos, tales como polidimetilsiloxanos (cauchos de silicona), copolímero de etilenvinilacetato (EVA), poliuretanos, copolímeros de poliuretano-poliéter, polietilenos, poliamidas, poli(cloruros de vinilo) (PVC), polipropilenos, policarbonatos, politetrafluoroetilenos (PTFE), materiales celulósicos, por ejemplo, triacetato de celulosa y nitrato/acetato de celulosa, e hidrogeles, por ejemplo, 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA).

En el dispositivo pueden estar contenidos otros elementos, tales como otros vehículos farmacéuticamente aceptables, dependiendo de las características físicas deseadas. Por ejemplo, las composiciones de acuerdo con los aspectos de la divulgación pueden incluir también uno o más conservantes o agentes bacteriostáticos, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, clorocresol, cloruro de benzalconio, y similares. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener otros principios activos, tales como agentes antimicrobianos, particularmente antibióticos, anestésicos y agentes antipruríticos.

Otro aspecto de esta invención proporciona la administración tópica de un agente de la invención. Este régimen de tratamiento es adecuado para la administración sistémica del agente antitumoral o para la terapia localizada, es decir, directamente al tejido patológico o enfermo.

Normalmente, las formulaciones tópicas comprenderán una preparación para administrar el agente directamente al área afectada que comprende el complejo, normalmente en concentraciones en el intervalo de aproximadamente 0,001 % a 10 %; preferentemente, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 %; más preferente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 %; y lo más preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 %, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, no tóxico (Barry (eds). Dermatological Formulations: Percutaneous Absorption (1983) Marcel Dekker, Inc; para dosificaciones estándar de agentes farmacéuticos convencionales, véase, por ejemplo, Physicians Desk Reference (Edición 1992); y American Medical Association (1992) Drug Evaluations Subscriptions).

Las preparaciones tópicas se pueden preparar combinando el agente con diluyentes y vehículos farmacéuticos convencionales comúnmente usados en formulaciones tópicas secas, líquidas, crema y aerosol. El ungüento y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de sustancias espesantes y/o gelificantes adecuadas. Dichas bases pueden incluir agua y/o aceite, tal como parafina líquida o un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete o aceite de ricino. Los agentes espesantes que se pueden usar de acuerdo con la naturaleza de la base incluyen parafina blanda, estearato de aluminio, alcohol cetoestearílico, propilenglicol, polietilenglicoles, lanolina, lanolina hidrogenada, cera de abeja, y similares. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y, en general, también incluirán uno o más de los siguientes: agentes estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes colorantes, perfumes y similares. Los polvos pueden formarse con la ayuda de cualquier base adecuada, por ejemplo, talco, lactosa, almidón y similares. Las gotas pueden formularse con una base acuosa o no acuosa que también contiene uno o más agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes solubilizantes y similares.

Las formas de dosificación para administración tópica de un agente de la presente invención incluyen polvos, pulverizaciones, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propelente que se pueda requerir.

Las pomadas, pastas, cremas y geles también pueden contener excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, talco y óxido de cinc o mezclas de los mismos. Los polvos y las pulverizaciones también pueden contener excipientes tales como lactosa, talco, hidróxido de aluminio, silicatos cálcicos y polvo de poliamida o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener además propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano.

Los métodos de aspectos de la divulgación también son aplicables a la administración de agentes farmacéuticos a través de membranas mucosas tales como las membranas gastrointestinal, sublingual, bucal, nasal, pulmonar, vaginal, corneal, y membranas oculares (Mackay et al. (1991) Adv. Drug Del. Rev. 7:313-338).

Para la administración a las membranas bucal o sublingual, se utilizará normalmente una formulación oral, tal como una pastilla, comprimido o cápsula. El método de fabricación de estas formulaciones es conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, la adición del agente a un comprimido prefabricado; compresión en frío de una carga inerte, un aglutinante y encapsulación.

Otra formulación oral es aquella que se puede aplicar con un adhesivo como el derivado de celulosa, hidroxipropilcelulosa, a la mucosa oral, por ejemplo como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 4.940.587, que se incorpora como referencia. Esta formulación adhesiva bucal, cuando se aplica a la mucosa bucal, permite la liberación controlada de un agente en la boca y a través de la mucosa bucal.

Para la administración a las membranas nasal y/o pulmonar, normalmente se empleará una formulación en aerosol. El término "aerosol" incluye cualquier fase suspendida transportada por gas de un agente de la invención que pueda inhalarse en los bronquiolos o las fosas nasales. Específicamente, el aerosol incluye una suspensión transportada por gas de gotitas de los compuestos de la presente invención, como se puede producir en un inhalador o nebulizador de dosis medida. El aerosol también incluye una composición de polvo seco del agente suspendido en aire u otro gas portador, que puede administrarse mediante inhalación desde un dispositivo inhalador.

Las composiciones de la invención son útiles para tratar cualquiera de los trastornos descritos en el presente documento. Las composiciones se proporcionan en cantidades terapéuticamente eficaces. Por "cantidades terapéuticamente eficaces" se entiende una cantidad suficiente para modular la respuesta deseada. Como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido en el agente (es decir, una dosis eficaz) varía de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, y aún más preferentemente de aproximadamente 1 a 15 mg/kg. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un componente de la lámina interna en el agente (es decir, una dosis eficaz) varía de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aún más preferentemente de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, y aún más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 9 mg/kg, de 0,1 a 8 mg/kg, de 0,1 a 7 mg/kg, de 0,1 a 6 mg/kg, de 0,1 a 5 mg/kg, de 0,1 a 4 mg/kg o de 0,1 a 3 mg/kg de peso corporal.

La relación molar entre el polipéptido y el componente de la lámina interna en un agente de aspectos de la divulgación está en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:50, preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:25, más preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10, aún más preferentemente de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 1:3. Las relaciones adecuadas incluyen, aunque sin limitación, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, y 1:50. La relación de masa entre el polipéptido y el componente de la lámina interna en un agente de aspectos de la divulgación está en el intervalo de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 3:10, preferentemente de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 3:5, más preferentemente de aproximadamente 15:2 a aproximadamente 3:0, aún más preferentemente aproximadamente 15:7 o aproximadamente 5:1. Se reconoce que la relación preferida entre el polipéptido y el componente de la lámina interna en un agente de la invención puede verse afectada por ciertos factores tales como, pero sin limitación, el tipo de célula diana.

El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis requerida para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos anteriores, el estado de salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Asimismo, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido o anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con una cantidad terapéuticamente eficaz del agente una vez por semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, preferentemente entre 2 a 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, y aún más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. También se apreciará que la dosis eficaz de anticuerpo, proteína o polipéptido usada para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el curso de un tratamiento particular. Pueden producirse cambios en la dosificación y resultar evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en el presente documento.

Cuando un sujeto que se somete a terapia muestra una respuesta parcial o una recidiva después de un período prolongado de remisión, se puede administrar un curso posterior de tratamiento con un agente de la invención. Por lo tanto, tras un período de tiempo sin tratamiento después de un primer período de tratamiento, que puede haber comprendido un régimen de dosificación única o un régimen de dosificación múltiple, un sujeto puede recibir uno o más períodos de tratamiento adicionales que comprenden regímenes de dosificación únicos o múltiples. Tal período de tiempo sin tratamiento entre períodos de tratamiento se denomina en el presente documento período de tiempo de interrupción. Se reconoce que la duración del período de interrupción depende del grado de respuesta tumoral logrado con cualquier período de tratamiento previo con los agentes antitumorales de la invención.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un envase, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.

Los resultados del tratamiento de un cáncer pueden analizarse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, examen físico, pruebas de laboratorio, estudios nucleares y radiográficos (es decir, tomografía computarizada y/o imágenes de resonancia magnética), ultrasonido y otros procedimientos.

Como se usa en el presente documento, "muerte celular" se refiere a la pérdida de vida celular a través de cualquier mecanismo incluyendo apoptosis, necrosis y lisis. Por "apoptosis" o "muerte celular programada" se entiende un proceso fisiológico normal que requiere una actividad metabólica regulada por la célula moribunda, caracterizada frecuentemente por contracción celular, condensación de la cromatina y/o fragmentación nuclear, pérdida de la integridad de la membrana, fragmentación del ADN y/o deterioro o formación de ampollas en las membranas plasmáticas.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1. Purificación de la saposina C recombinante

La saposina C recombinante se sobreexpresó en células de E. coli mediante el uso del sistema pET inductor de isopropil-1-tio-p-D-galactopiranósido (Qi et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:16746-16753, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad). Los polipéptidos expresados con una etiqueta His se eluyeron en columnas de níquel. Después de la diálisis, los polipéptidos se purificaron adicionalmente mediante cromatografía HPLC como sigue. Se equilibró una columna de fase inversa C4 con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % durante 10 minutos. Las proteínas se eluyeron en un gradiente lineal (0-100 %) de TFA al 0,1 % en acetonitrilo durante 60 minutos. El pico de la proteína principal se recogió y se liofilizó. La concentración de proteína se determinó como se describió previamente (Qi et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:1674616753).

Ejemplo 2. Baño de ultrasonidos de saposina C y dioleoilfosfatidilserina

La dioleoilfosfatidilserina (DOPS) se obtuvo de Avanti Polar Lipids (Alabaster AL). De veinte a treinta pmoles de DOPS en cloroformo se secaron bajo N2 y al vacío hasta formar películas lipídicas. Se añadieron de cinco a diez pmoles de polipéptido de saposina C a las películas secas y se suspendieron en 50 pl de tampón Mcllvanine (pH 4,7). A continuación, la suspensión se llevó a un volumen de 1 ml con medio de cultivo celular o solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Ausubel et al. (2002) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York, incorporados en el presente documento como referencia). La mezcla se sonicó en un baño de ultrasonidos durante aproximadamente 20 minutos. Se añadió hielo según fuera necesario para evitar el sobrecalentamiento de las muestras.

Ejemplo 3. Condiciones del cultivo tisular

Se cultivaron células de carcinoma de células escamosas (SCC) y células L5178Y en medio DEME (Gibco) suplementado con FBA al 10 %. Se cultivaron células de queratinocitos inmortalizados normales (NIK) en medio Cascade 154 al 50 % (Cascade Biologies) y queratinocitos-medio SFM al 50% (Gibco).

Ejemplo 4. Análisis ex vivo de los efectos de la saposina-C-DOPS en células SCC

Se cultivaron células de carcinoma de células escamosas (SCC) y control (células NIK) en medios descritos en otra parte del presente documento. Los NIK se utilizaron como control, ya que se ha sugerido que el SCC se desarrolla a través de un proceso de varias etapas en los queratinocitos de piel humana (Kubo et al. (2002) J. Med. Invest. 49:111-117). El medio de cultivo se retiró de las placas establecidas de NIK y células de SCC. Se añadió medio de cultivo que no contenía tratamiento, saposina C, DOPS o saposina C 8 pM DOPS 26 pM a placas establecidas de NIK y células SCC. Las células se examinaron 48-72 horas después del tratamiento. En la Figura 1 se muestran los resultados de ese experimento.

Se cultivaron células de carcinoma de células escamosas (SCC) en medios descritos en otra parte del presente documento. El medio de cultivo se retiró de las placas establecidas de células SCC. Se añadió medio de cultivo que no contenía tratamiento o un agente que comprendía saposina C 10 pM DOPS 30 pM a placas expuestas de células SCC. Las células se incubaron durante 24 horas y se analizaron mediante tinción TUNEL, electroforesis en gel de ADN genómico o ensayos de hibridación con la proteína anticoagulante, anexina V, datos no mostrados.

Ejemplo 5. Análisis ex vivo del efecto de la saposina-C-DOPS en células de linfoma murino

Se sembraron placas de cultivo de tejidos con células de linfoma L5178Y-R de ratón. Después del establecimiento de los cultivos, se eliminó el medio de cultivo y se lavaron las células. Las células se recubrieron con DEME FBA al 10 % suplementado sin fármaco, DOPS 60 pM, saposina C 20 pM o saposina C 10 pM y DOPS 30 pM. Los cultivos se incubaron durante 24-48 horas. Los cultivos se examinaron después del período de incubación. En la Figura 2 se muestran los resultados de ese experimento.

Ejemplo 6. Análisis ex vivo del efecto de la saposina-C-DOPS en células tumorales

Los ratones desnudos se mantuvieron de acuerdo con las pautas de la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati que rigen el cuidado de los ratones de laboratorio. Se inyectaron dos grupos de cinco ratones desnudos en el lomo con 2 X 106 SCC por vía subcutánea para iniciar el crecimiento del tumor. Se establecieron dos tumores en cada ratón. Se dejó que los tumores se establecieran durante 21 días. El día 21, los animales recibieron una inyección subcutánea en el sitio del tumor de diluyente PBS solo o de un agente que comprende saposina C (10 mg/kg de peso corporal) y DOPS (2 mg/kg de peso corporal). El día 27, los animales recibieron una segunda inyección subcutánea en el sitio del tumor de diluyente PBS solo o de un agente que comprende saposina C (10 mg/kg de peso corporal) y DOPS (2 mg/kg de peso corporal). Los tamaños de los tumores se midieron cada dos días con un calibre y los volúmenes se estimaron de acuerdo con la fórmula V=( n/4)LW2. Los resultados obtenidos de uno de estos experimentos se presentan en la Figura 3, panel A.

En un conjunto de experimentos separado, los ratones desnudos se mantuvieron de acuerdo con las pautas de la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati que rigen el cuidado de los ratones de laboratorio. Se inyectaron dos grupos de cinco ratones desnudos en el lomo con 2 X 106 SCC por vía subcutánea para iniciar el crecimiento del tumor. Se establecieron dos tumores en cada ratón. Se dejó que los tumores se establecieran durante 6 días. El día 6, los animales recibieron una inyección subcutánea en el sitio del tumor de diluyente PBS solo o de un agente que comprende saposina C (10 mg/kg de peso corporal) y DOPS (2 mg/kg de peso corporal). Los tamaños de los tumores se midieron cada dos días con un calibre y los volúmenes se estimaron de acuerdo con la fórmula V=(n/4)LW2. Los resultados obtenidos de uno de estos experimentos se presentan en la Figura 3, panel B.

Ejemplo 7. Efecto de la Saposina C-DOPS sobre el tejido tumoral de carcinoma de células escamosas humano

Se prepararon xenoinjertos de ratón con tumores SCC mediante métodos conocidos en la técnica. El marcador fluorescente nitrobenzoxadiazol (NBD) se unió a fosfatidilserina y se preparó una mezcla de NBD-PS y DOPS. El NBD-DOPS se utilizó para preparar un complejo NBD-PS/DOPS/Saposina C marcado con fluorescencia. Se inyectó NBD-PS/DOPS en el tumor a 0,1 mg de NBD-PS/kg de peso corporal y 2 mg de DOPS/kg de peso corporal. Se inyectó NBD-PS/DOPS/Saposina C en el tumor a 0,1 mg de NBD-PS/kg de peso corporal, 2 mg de DOPS/kg de peso corporal y 10 mg de saposina C/kg de peso corporal. Los tumores se recolectaron 24 horas después de la administración del agente. Se examinaron microcortes de los tumores para determinar la fluorescencia. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 4.

Ejemplo 8. Análisis ex vivo del efecto de la Saposina-C-DOPS en células humanas

Se cultivaron células de tejido canceroso y tejido sano humano en un medio adecuado para la línea celular. Se analizaron células del siguiente tejido canceroso y líneas celulares de tejido sano: Cáncer de mama: MCF-7, MCF-7 transfectadas con una caspasa 9 negativa dominante, MCF-7 transfectadas con un vector control, BT-549; Cabeza y cuello: SCC-25, FaDu; Melanomas: MeWo, Sk-Mel-28; Leucemias: K-562, HL60; Cáncer de cuello uterino: Hela; Cáncer de ovario: PA1, PA1 transfectadas con una caspasa 9 negativa dominante, PAl-E6; SK-OV3; Cáncer de próstata: DU145, PC3; Neuroblastomas: SK-N-SH, SK-SY-5Y, CHLA-79; Sarcoma de Ewing: 5838; Linfomas de linfocitos T; Rodu T; GCT; Cáncer de pulmón: A549, H441; Cáncer de hígado: HepG2; Mama sana: MCF-10A; y queratinocitos sanos: NIK. Se sembraron placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos (Falcon, Franklin Lakes NJ) con células a una densidad de 104 células por pocillo. Las células se sembraron en 100 pl de medio completo con o sin un agente de la invención.

Se usó la conversión de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (disponible de Sigma) en un producto formazán (18992) para evaluar la densidad celular viable. Setenta y dos horas después de cultivar las células, se añadió bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cada pocillo hasta una concentración final de 0,25 mg/ml. Las placas se incubaron a 37 °C durante 3 horas en la oscuridad. Las reacciones se terminaron mediante la adición de HCl 0,04 N en isopropanol. Las placas se mezclaron a fondo y se analizaron a 570 nm en un lector de placas micro ELISA (SpectraMax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale CA). Las curvas de crecimiento y el análisis de regresión se realizaron utilizando el software informático PharmTools Pro (The McCary Group, Elkins Park, PA).

(continuación)

Ejemplo 9. Evaluación de la IC50 de la Saposina C:DOPS

Se prepararon mezclas de saposina C y DOPS en relaciones molares de 1:7, 1:3 y 1:10. Se prepararon polipéptidos compuestos por varios fragmentos de la proteína Saposina C como se describió anteriormente (Wang et al. (2003) Arch. Biochem. & Biophys. 415:45-53, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad). Los polipéptidos de Saposina C mutantes son los siguientes: HNSC está compuesto por los restos de aminoácidos 1-40; H1 está compuesto por los restos 4-20; y H-2 está compuesto por los restos de aminoácidos 24-40.

Se cultivaron células de melanoma SK-Mel-28 humanas en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Las células se cubrieron con medio que contenía diversas concentraciones de saposina C, DOPS, HNSC:DOPs (1:3), H-1:DOPS 1:3; H-2:DOPS 1:3; o una mezcla de la Saposina C:DOPS de longitud completa a 1:7, 1:3, o 1:10. Cada tratamiento se administró a placas cuadruplicadas de células SK-Mel-28. La inhibición celular se analizó usando el ensayo de conversión de MTT descrito en otra parte del presente documento. Los datos se analizaron mediante regresión lineal fundamental utilizando el software informático PharmTools Pro (The McCary Group, Elkins Park, PA). Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicha composición un polipéptido relacionado con la saposina C y un componente de la lámina interna,

en donde el componente de la lámina interna es una fosfatidilserina seleccionada del grupo que consiste en palmitoiloleoilfosfatidilserina, palmitelaidoiloleoilfosfatidilserina, miristoleoiloleoilfosfatidilserina, y dioleoilfosfatidilserina; y

en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; y

- una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2,

en donde dicho polipéptido retiene la afinidad por la membrana plasmática.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 que promueve la muerte celular en células hiperproliferantes.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en sarcoma, neuroblastoma, carcinoma de mama, y células de carcinoma de células escamosas.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 que modela el volumen tumoral.

5. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 4, en donde la relación molar entre dicho polipéptido y dicho componente de la lámina interna está en el intervalo de 1:1 a 1:50.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, en donde la relación molar entre dicho polipéptido y dicho componente de la lámina interna está en el intervalo de 1:1 a 1:25.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 6, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano.

9. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho volumen tumoral disminuye.

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha composición se administra por vía enteral, por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, o tópica.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es un cáncer cerebral, preferentemente en donde el cáncer cerebral es glioblastoma multiforme.

12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

13. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fosfatidilserina es una dioleoilfosfatidilserina.