KR20230117190A - Pten 억제제에 의한 척수 손상의 치료 - Google Patents

Abstract

본 출원은 손상된 신경에 또는 그 근처 영역에 신경 재생량 또는 신경 퇴화 감쇠량의 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는, 신경 손상 부위에서 신경을 재생시키거나 또는 신경의 퇴화를 감쇠시키는 것을 포함하는, 척수 손상 또는 척수 손상과 연관되거나 이에 의해 야기된 병태를 치료하는 방법을 개시한다.

Description

PTEN 억제제에 의한 척수 손상의 치료

본 출원은 척수의 손상된 신경에 또는 그 근처 영역에 신경 재생량 또는 신경 퇴화 감쇠량의 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는, 신경을 재생시키거나 또는 손상된 신경의 퇴화를 감쇠시킴으로써 척수 손상 또는 척수 손상과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 12월 4일에 출원된 미국 가 특허 출원 제63/121,336호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.

성인 포유동물 신경계에서, 손상된 뉴런의 재생은 신경 손상에 대한 치유 반응에서 거의 일어나지 않는다. 성인 CNS 뉴런이 손상 후 재생되지 않는 데에는 두 가지 주요 이유가 있다 - 축삭돌기는 손상 시 분비된 세포외 억제 인자에 의한 그의 억제뿐만 아니라, 노화를 통해 급속히 감소하는 내재적 축삭돌기 성장 능력의 상실로 인해 성인 중추 신경계에서 재생되지 않는다(문헌[Schwab et al; 1996], 문헌[Goldberg et al. 2002]; 문헌[Filbin et al. 2006]; 문헌[Fitch et. al 2008]). 그러나, 신경 손상 시 분비되는 세포외 억제 분자의 제거는 생체내에서 매우 제한된 축삭돌기 재생을 촉발할 뿐이다(문헌[Yiu et. al 2006]; 문헌[Hellal et al. 2011]). 따라서, 내재적 신경 증식의 조절에 의한 축삭돌기 재생 과정의 촉진은 현재 신경 손상 치료를 위한 치료 표적의 초점이다.

PTEN(포스파타제 및 텐신 동족체) 단백질은 이중 포스파타제이며 포스파티딜이노시톨3-키나제(PI3K) 신호전달 경로를 음으로 조절함으로써 종양 억제인자로서 중요한 것으로 간주된다. PI3K 신호전달 경로는 세포 증식, 생존 및 분화뿐만 아니라 단백질 합성, 대사 및 운동성에 중요한 신호 전달 경로이다(문헌[Zhang et al. 2010]). 지질 포스파타제로서, PTEN은 PIP₃의 3번-위치를 탈인산화함으로써 포스파티딜이노시톨(3,4,5) 트라이포스페이트(PIP₃)의 포스파티딜이노시톨(4,5) 다이포스페이트(PIP₂)로의 전환을 촉매화하고, 따라서 PI3K 활성을 길항함으로써 PI3K 신호전달 경로를 억제한다. 문헌[Di Cristofano et. al 2010]. PTEN의 결실 또는 불활성화는 PI3K 활성을 향상시키고, PDK1, Akt 및 포유동물의 라파마이신 표적(mTOR)을 포함하는 PI3K 신호전달 경로의 하류 성분의 활성화를 촉진하여, 종양 형성을 유도한다(문헌[Di Cristofano et. al 2010]; 문헌[Stambolic et al. 1998]).

PTEN에 의한 PI3K 매개 신호전달의 조절은 신경계의 신경 재생 과정과도 깊은 관련이 있다. 최근 연구는 PTEN 단백질의 억제 또는 PTEN 유전자의 결실이 손상시 성인 CNS/PNS 신경의 내재적 재생 증식을 촉진함을 밝혀냈다(문헌[Park et. al 2008]; 문헌[Liu et. al 2010]; 문헌[Sun et. al 2012]; 문헌[Christie et. al 2012]). 예를 들어, 박(Park) 등은 조건부 녹아웃 마우스를 사용하여 성체 래트 망막 신경절 세포(RGC)에서 PTEN의 결실이 실제로 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로를 재활성화하여 시신경 손상 후 강력한 축삭돌기 재생을 촉진한다는 것을 발견하였다. mTOR 경로의 또 다른 음의 조절인자의 조건부 녹아웃에 의한 mTOR 경로의 재활성화가 또한 축삭돌기 재생을 유도하며, 이는 PI3K-mTOR 신호전달의 촉진이 내재적 축삭돌기 재생 능력을 회복시키는 핵심 요소일 수 있음을 가리킨다. 또한, 리우(Liu) 등은 생체내 CNS 손상 모델에서 PTEN의 조건부 결실이 실제로 PI3K 신호전달 경로를 상향-조절함으로써 CNS 손상 시 감소된 뉴런 mTOR 활성을 증가시키고, 이는 손상되지 않은 CST 축삭돌기의 향상된 보상 발아 및 척수 병변을 지나는 손상된 CST 축삭돌기의 성공적인 재생으로 이어진다고 보고하였다. PNS 손상의 경우, 시험관내 및 생체내 모두에서 PTEN의 억제는 또한 축삭돌기 증식을 증가시킨다(문헌[Christie et. al 2012]). 따라서 PI3K-mTOR 신호전달 경로를 촉진하기 위한 PTEN 억제제 개발은 손상된 신경계에서 축삭돌기 재생을 향상시키는 양호한 치료 표적이다. PTEN 억제제는 CNS 또는 PNS 손상 후 신경 재생을 위한 다른 유효 시약을 함유하는 기존 또는 신규 세포 요법과 병용되는 치료 방법으로 사용될 수 있다.

본 연구에서, 우리는 PI3K 신호전달 경로를 자극하여 신경 재생 및/또는 신경 퇴화로부터의 보호에 유효한 잠재적인 PTEN 억제제를 개발하였다. 지질 포스파타제로서 PTEN의 활성화를 위해, PTEN은 원형질막에 적절한 배향으로 위치해야 한다(문헌[Leslie et. al 2008]). 따라서 우리는 펩타이드 형태의 잠재적인 PTEN 억제제 후보를 설계하기 위해 PTEN 막 국소화의 기전을 조사하였다. TGN-1, TGN-2 및 TGN-3의 세 가지 다른 펩타이드가 잠재적 PTEN 억제제로서 설계 및 합성되었으며, 시험관내 PTEN 활성 분석을 사용하여 PTEN 활성에 대한 이들의 억제 능력을 조사하였다. 우리는 또한 뉴런 세포주를 사용하여 PI3K 신호전달 경로의 조절에 미치는 영향을 특성화하였다. 우리는 PTEN C-말단 영역의 인산화 부위를 모방하는 변형된 펩타이드인 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 실제로 시험관내 PTEN 활성 분석에서 PTEN 지질 포스파타제 활성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. TGN-1 펩타이드는 또한 PC12 세포에서 Akt 단백질의 활성화 수준을 향상시켰는데, 이는 이러한 펩타이드가 PI3K-Akt 신호전달 경로를 상향-조절하는데 유효하다는 것을 가리킨다. 뉴런 세포를 사용한 신경돌기 분석은 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 신경돌기 미세소관 구조를 향상시킴으로써 신경돌기 증식을 촉진할 뿐만 아니라 신경돌기 퇴화를 지연시킨다는 것을 보여주었다. 따라서 TGN 펩타이드는 CNS 손상 후 신경 재생을 위한 치료제로서 유용하다.

척수 손상(SCI)은 심각하거나 영구적인 장애를 유발하는 심각한 외상이다. SCI는 1차적인 기계적 손상을 유도한 다음 척수에 2차적인 손상을 일으킨다. SCI의 1차 손상은 외상 직후 실제 기계적 조직 파괴에 의해 발생한다. 2차 손상은 복잡한 세포 및 분자 과정에 의해 매개된다. SCI 환자의 치료에는 금 표준이 없다. SCI 환자들에게 다양한 세포 유형을 이용한 다양한 치료 방법이 각각 적용되고 있지만, 아직까지는 효율적인 방법이 없는 실정이다(문헌[McDonald et al. (2002)]; 문헌[Witiw et al., (2015)]; 문헌[Fakhoury (2015)]).

신경인성 방광(neurogenic bladder)(NB)은 SCI와 관련된 일반적인 건강 문제이다. 대부분의 SCI 환자는 배뇨 기능 장애와 정상 배뇨의 장애를 앓고 있다. 또한, SCI 환자는 종종 요로 감염 및 요로 결석과 같은 NB 관련 부작용을 경험한다. NB를 개선하려는 많은 시도가 있었으나; 현재 NB에 대한 유효 치료는 불가능하다(문헌[Jeong et al. (2020)]; 문헌[Nseyo et al. (2017)]; 문헌[Bragge et al. (2019)]). SCI 환자의 NB는 신경 손상에 의해 유발된다. 그리고, 손상된 신경조직의 재생을 위해 줄기세포 및 기타 생체재료를 사용한 다수의 전임상 및 임상 연구가 진행되어 왔다(문헌[Kim et al. (2020)]; 문헌[Cho et al. (2014)]; 문헌[Saheli-Pourmehr et al., (2020)]). 그러나 줄기세포 요법의 효능이 미비하여 새로운 접근법이 필요하다.

신경 재생을 위한 도전적인 요법 중 하나는 염색체 10상에서 결실된 포스파타제 및 텐신 동족체(TPEN) 억제제이다. PTEN은 중추 및 말초 신경계의 축삭돌기 재성장 조절에 대해 큰 관심을 끌었다. PTEN 억제제는 척수의 후근 신경절 뉴런, 망막 신경절 세포, 피질 뉴런 및 피질척수로에 대한 병변에 따른 신경보호 및 축삭돌기 증식을 촉진하는 데 사용되어 왔다(문헌[Christie et al., (2010)]; 문헌[Zhao et al., (2013)]). 발명자들은 배뇨 기능, 운동 기능, 및 척수에서 혈관형성 인자의 발현에 대한 PTEN 억제제의 효과를 조사하였다.

하나의 양태에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

하나의 양태에서, 본 발명은 손상된 신경에 또는 그 근처 영역에 신경 재생량 또는 신경 퇴화 감쇠량의 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 신경 손상 부위에서 신경을 재생시키거나 또는 신경의 퇴화를 감쇠시키는 방법에 관한 것이다. PTEN 억제제 펩타이드는 인산화 부위의 세린 또는 트레오닌이 인산화되도록 상기 인산화 부위가 변형된, 변형된 PTEN 펩타이드 또는 그의 단편일 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 또는 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-370, Ser-380 및/또는 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-370, Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 펩타이드는 인산화 부위 및/또는 PDZ 도메인 결합 모티프의 펩타이드 단편일 수 있다. 상기 펩타이드는 펩타이드 전달 도메인(PTD)을 추가로 포함할 수 있다. 신경 손상은 중추 신경계에 있을 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 활성을 억제하는 펩타이드에 관한 것이다. PTEN 억제제 펩타이드는 인산화 부위의 세린 또는 트레오닌이 인산화되도록 상기 인산화 부위가 변형된, 변형된 PTEN 펩타이드 또는 그의 단편일 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 또는 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-370, Ser-380 및/또는 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-370, Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 펩타이드는 인산화 부위 및/또는 PDZ 도메인 결합 모티프의 펩타이드 단편일 수 있다. 상기 펩타이드는 펩타이드 전달 도메인(PTD)을 추가로 포함할 수 있다. 신경 손상은 중추 신경계에 있을 수 있다.

더욱 또 다른 양태에서, 본 발명은 신경 세포를 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드와 접촉시키는 것을 포함하는, 신경 세포의 성장, 증식 또는 활성 증대 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 상기 신경 세포는 척수 중에 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 손상된 신경에 또는 그 근처 영역에 신경 재생량 또는 신경 퇴화 감쇠량의 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상 또는 척수 손상과 연관되거나 이에 의해 야기된 병태, 예를 들어 비제한적으로 신경인성 방광, 운동 기능 상실, 또는 근육 협응 능력 상실을 치료하는 방법에 관한 것이다. PTEN 억제제 펩타이드는 인산화 부위의 세린 또는 트레오닌이 인산화되도록 상기 인산화 부위가 변형된, 변형된 PTEN 펩타이드 또는 그의 단편일 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 또는 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-370, Ser-380 및/또는 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-370, Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치할 수 있다. 펩타이드는 인산화 부위 및/또는 PDZ 도메인 결합 모티프의 펩타이드 단편일 수 있다. 상기 펩타이드는 펩타이드 전달 도메인(PTD)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적은 본 발명의 하기 설명, 여기에 첨부된 참조 도면 및 첨부된 청구범위로부터 더욱 충분히 이해될 것이다.

본 발명은 하기 본원에 제공된 상세한 설명, 및 단지 예시로서 제공되고 따라서 본 발명을 제한하지 않는 첨부 도면으로부터 더욱 충분히 이해될 것이다.
도 1a 및 1b는 잠재적인 PTEN 억제제로서 TGN 펩타이드의 설계를 도시한다. 도 1a) PTEN C-말단 영역의 다이어그램. PTEN C-말단 영역은 C2 도메인(AA186 내지 403), 인산화 부위(AA352 내지 399) 및 PDZ 도메인 결합 모티프(400 내지 403)를 포함한다. 인산화 부위 및 PDZ 도메인 결합 모티프 함유 영역(AA352 내지 403)은 TGN 펩타이드 설계를 위한 주형으로서 사용되었다. 도 1b) TGN 펩타이드의 아미노산 서열(TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는 PTEN 인산화 부위를 모방하며, 여기서 표시된 잔기는 인산화에 의해 변형되었다. TGN-4 펩타이드는 TGN-1에 대한 스크램블드 펩타이드이고, TGN-5 펩타이드는 TGN-2에 대한 스크램블드 펩타이드이다.
도 2a 내지 2c는 TGN 펩타이드를 사용한 시험관내 PTEN 활성 분석을 도시한다. 도 2a) 말라카이트 그린 검정 키트를 사용한 시험관내 PTEN 활성 분석의 기전. C8-PIP₃은 PTEN 기질로서 사용되었고 다른 인지질(DOPC 및 DOPC)과 함께 리포솜으로서 제조되었다. C8-PIP3으로부터 PTEN에 의해 생성된 포스페이트 이온은 620 ㎚에서 포스페이트 이온-말라카이트 그린 시약 복합체의 광학 밀도를 모니터링하여 측정되었다. 도 2b) 시험관내 PTEN 활성에 대한 TGN 펩타이드의 영향. TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는 시험관내 PTEN 활성 분석을 통해 PTEN 억제 효과에 대해 조사되었다. 10 μM의 각 펩타이드를 100 ㎕의 반응 부피로 20 ng의 인간 재조합 PTEN 단백질 및 리포솜으로서 0.1 mM의 C8-PIP₃과 함께 배양하였다. TGN-4 및 TGN-5 펩타이드를 사용하여 각각 TGN-1 및 TGN-2/3 펩타이드에 대한 서열 특이성을 확인하였다. 모든 데이터는 3회 중복 실험 결과를 나타낸다. 도 2c) TGN-1 및 TGN-2 펩타이드에 대한 IC₅₀ 곡선(IC₅₀ 값은 용량 의존적 방식으로 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드를 사용한 시험관내 PTEN 활성 분석을 통해 측정되었고, Prism 5 소프트웨어를 통해 계산되었다. TGN 펩타이드의 IC₅₀ 값은 TGN-1의 경우 19.93 μM이고, TGN-2의 경우 4.83 μM이고, TGN-3의 경우 87.12 μM이다.
도 3a 내지 3c는 TGN-1 펩타이드가 생체내에서 Akt 활성화 수준을 증가시킴으로써 PI3K-Akt 신호전달을 촉진함을 도시한다. 도 3a) TGN-1을 사용하여 PTEN 활성을 차단함에 의한 Akt 활성화의 기전. PI3K 신호전달 경로에서 TGN-1의 도입은 PI3K 신호전달을 촉진하고 Akt 활성화(인산화) 수준을 촉진한다. 도 3b) PC12 세포 용해물을 사용한 웨스턴 블롯 데이터. PC12 세포를 TGN-1 펩타이드(10 μM, 100 μM) 또는 TGN-4 펩타이드(10 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 항-포스포 Akt 항체를 사용한 웨스턴 블롯 데이터는 TGN-1이 용량 의존적 방식으로 내인성 Akt 활성화 수준을 특이적으로 촉진함을 보여준다. 도 3c) PTEN 및 β-액틴의 발현 수준이 또한 양성 및 로딩 대조군으로서 모니터링되었다.
도 4a 및 4b는 신경돌기 퇴화에 대한 신경영양 효과 및 신경보호 효과를 나타내는 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드를 도시한다. 도 4a) 분화된 PC12 세포를 먼저 노코다졸(0.5 μM)로 1시간 동안 처리한 후, 추가로 72시간 동안 NGF(10 ng/㎖) 및 TGN 펩타이드(TGN-1 및 TGN-2, 100 μM/각각)를 함유하는 새로운 배지와 함께 배양하였다. 상대적인 신경돌기 안정성은 Image J 소프트웨어를 사용하여 면역형광 이미지로부터 녹색/적색 형광 신호 강도의 비율로서 계산되었다. 모든 형광 신호 강도는 녹색/적색 비율 계산을 위해 각 샘플당 적어도 3회 측정되었고 정규화되었다(배지만 = 100%). 도 4b) 분화된 PC12 세포에서 신경돌기 증식의 정량분석. PC12 세포를 NGF(50 ng/㎖)를 함유하는 분화 배지로 24시간 동안 처리한 후, TGN 펩타이드(100 μM/각각)와 추가 2일 동안 배양하였다. TGN-4 펩타이드는 TGN-1에 대한 음성 대조군으로 사용되었다. 신경돌기 정량분석을 3일차에 신경돌기 정량분석 키트(Millipore)를 사용하여 분광광도계에 의해 수행하고 정규화하였다(배지만 = 100%).
도 5는 세포막 표면에서 PTEN의 계면 활성화에 대한 가상 모델을 도시한다. PTEN은 현재 생체내에서 2개의 입체형태 상태를 갖는 것으로 여겨지며 그의 지질 포스파타제 활성을 완전히 발현하기 위해서 막 국소화에서 국소화하기 위한 입체형태 변화를 겪는 것으로 제안된다. 가용성 형태의 PTEN은 "닫힌" 입체형태를 갖는 비활성 상태에 있으며, 여기서 PTEN C-말단 영역의 인산화된 부위는 PTEN 활성 부위와 C2 도메인을 공간적으로 가려 PTEN 막 회합을 방지한다. "인산화 부위" 중의 인산화된 잔기가 탈인산화되면, PTEN의 입체형태는 "닫힌" 입체형태에서 "열린" 입체형태로 바뀐다. 이 단계에서, PTEN의 C2 도메인에 위치한 다수의 막-결합 모티프가 노출되어 막과 회합할 준비가 된다. PTEN 활성 부위의 결합 포켓은 막 표면에 있는 PIP₃ 기질에 접근하는 데에도 이용가능하다. N-말단 PIP₂ 결합 모티프를 갖는 막 표면상의 PIP₂의 결합뿐만 아니라 보조 단백질(NHERF1) 중의 PDZ 도메인에 대한 C-말단 PDZ 도메인 결합 모티프의 결합이, PTEN이 그의 지질 포스파타제 활성이 발생하는 데 필요한 적절한 위치에서 그의 세포막 표면상에 국소화된 후에 이어진다.
도 6은 PTEN 억제제를 사용한 처리 일정을 도시한다. PTEN, 포스파타제 및 텐신 동족체가 염색체 10에서 결실되었으며, 특히 TGN-2 투여는 SCI 유도 3일 후에 시작하여 14일 동안 척수 손상 부위에 2일마다 1회 및 직접 7회 투여되었다. 도면에서 언급된 TGN은 TGN-2이다.
도 7a 및 7b는 Basso, Beattie 및 Bresnahan(BBB) 운동 척도 검사 및 수평 사다리 보행 검사를 도시한다. 도 7a는 TGN-2 투여 여부에 따른 BBB 검사의 기능 회복 결과를 도시한다. 도 7b는 TGN-2 투여 여부에 따른 수평 사다리 검사의 운동 기능 및 협응 능력 분석 결과를 도시한다. 도면에서 언급된 TGN은 TGN-2이다.
도 8은 TGN-2 투여 후 방광내압 측정 결과 SCI 그룹에 비해 수축압력(CP)과 수축시간(CT)이 유의하게 증가된 배뇨 기능을 도시한다(P<0.05). 도면에서 언급된 TGN은 TGN-2이다.
도 9는 척수 손상 유도 18일 후 척수 조직의 조직학적 변화를 도시한 것으로, TGN 처리로 SCI-유도된 파괴 병변이 감소하고 손상된 조직 주변에 새로운 조직이 증가하였다.
도 10a 내지 10c는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF) 발현에 대한 TGN-2의 영향을 도시한다.

본 출원에서 단수는 단일 및 복수의 지시대상 모두를 지칭하기 위해 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 손상된 신경 또는 신경계 "근처" 세포의 주사는 손상 부위에서 신경 재생의 효과적인 결과를 초래하거나 손상된 신경 세포의 퇴화를 방지하기에 충분히 가까운, 주사 부위와 손상 영역 사이의 영역을 의미한다. 따라서, 손상된 신경에 또는 그 근처에 세포를 주사하는 것은, 손상 부위 또는 주입된 세포가 효과적인 폴리펩타이드를 발현하기에 충분히 가까운 곳을 포함하며 상기 폴리펩타이드는 신경 재생 또는 신경 퇴화 예방 결과에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 말초 신경의 경우, 특히 척수 손상에서, 세포가 손상 부위에서 누출되는 경향이 있으므로 주사는 손상 부위의 "상류"에서 이루어질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "신경돌기"는 뉴런의 세포체로부터의 임의의 돌출부를 지칭한다. 이 돌출부는 축삭돌기 또는 수상돌기일 수 있다. 이 용어는 분화가 완료되기 전에 축삭돌기와 수상돌기를 구별하기 어려울 수 있기 때문에 특히 배양 중인 세포의 미성숙 또는 발달 중인 뉴런을 말할 때 자주 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "신경의 재생"은 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)에서 신경 손상시 새로운 신경 세포, 뉴런, 아교세포, 축삭돌기, 마이엘린 또는 시냅스의 생성을 의미한다. 재생은 PTEN의 억제에 의한 PI3K-mTOR-매개된 신호전달의 활성화를 통해 복원된 고유의 신경 재생 능력에 의해 구동된다.

본원에 사용된 바와 같이, 신경 퇴화의 "감쇠" 또는 "예방"은 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)에서 신경 손상에 의해 유발되는 축삭돌기, 아교세포 또는 마이엘린 수초 구조의 퇴화를 지연시키는 것을 의미한다. "감쇠" 또는 "예방"은 PTEN 억제에 의해 활성화되는 PI3K-mTOR-매개된 신호전달과 밀접하게 관련된 신경 미세소관 구조 안정화에 의해 달성된다.

포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN)

PTEN 아미노산 서열은 하기와 같다:

.

PTEN 단백질은 현재 PI3K-Akt-mTOR 신호전달을 촉진함으로써 감소된 내재적 신경 재생 능력을 회복시켜 성인 CNS 시스템에서 손상된 신경을 재생시키는 치료 물질 개발에 인기 표적이 되고 있다(문헌[Park et. al 2008]; 문헌[Liu et. al 2010]; 문헌[Sun et. al 2012]). 신규 PTEN 억제제의 개발은 PTEN-활성 조절 분자를 개발하기 위한 좋은 전략으로 간주된다. 불행하게도, PTEN 단백질의 X-선 결정 구조(문헌[Lee et. al 1999])는, PTEN-기질 결합을 직접 차단하는 유효 PTEN 억제제를 설계하는데 중요한, PTEN-기질(PIP₃) 결합 상태에 대한 충분한 정보를 제공하기에 충분하지 않다. 대안적으로, PTEN이 그의 활성을 위해 원형질막을 표적화하는 기전은 철저한 조사하에 있다. PTEN 효소의 기질인 포스파티딜이노시톨 (3,4,5) 다이포스페이트(PIP₃)는 세포막 지질 이중층에서 발견되는 인지질의 구성원이지만, PTEN 단백질은 원래 가용성 단백질로서 생성되며 입체형태적 변화를 통한 그의 지질 포스파타제 활성을 위해서는 계면적으로 활성화된 다음, 적절한 배향으로 PTEN-막 회합되어야 한다(문헌[Das et. al 2003]; 문헌[Leslie et. al 2008]). PTEN C2 도메인에 위치한 여러 개의 하전된 아미노산 및 결합 모티프는 PTEN 단백질을 세포막 표면에 부착시키는 주요 앵커로 간주된다(문헌[Lee et. al 1999]; 문헌[Georgescu et. al 2000]; 문헌[Leslie et. al 2008]). PTEN의 지질 포스파타제 활성이 발생하기 위해서 PTEN이 세포막상에 적절하게 배향되도록 다른 결합 모이어티(moiety)를 사용하는 추가적인 결합이 또한 필요하다(문헌[Chambell et. al 2003]; 문헌[Walker et. al 2004]; 문헌[Odriozola et. al 2007]).

PTEN C-말단 영역의 구조화되지 않은 부분(AA 352-399)은 이 영역에 인산화 변형 부위로서 공지된 6개의 세린/트레오닌(Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 및 Ser-385) 잔기를 함유하기 때문에 "인산화 부위"라고 칭한다(문헌[Lee et. al 1999]; 문헌[Vazquez et. al 2001]). 이전 연구는 이 "인산화 부위"에서 이들 6개 잔기의 돌연변이 또는 결실이 더 큰 종양 억제 활성, 증대된 PTEN 막 친화성 및 감소된 단백질 안정성으로 이어진다는 것을 밝혔다(문헌[Vasquez et. al 2001]; 문헌[Das et. al 2003]; 문헌[Okahara et. al 2004]; 문헌[Rahdar et. al 2009]).

현재 PTEN 단백질은 두 가지 입체형태 상태를 가지고 있는 것으로 여겨지고 있다(도 4). "닫힌" 입체형태에서 PTEN은 "인산화 부위"를 포함하는 PTEN의 C-말단 영역이 PTEN 활성 부위 포켓뿐만 아니라 C2 도메인에 위치한 막 결합 모티프를 가려서, 세포막에 대한 PTEN 회합 및 활성 부위에 대한 PIP₃ 접근을 방지한다. 다른 한편으로, PTEN은 PTEN 활성 부위 포켓과 C2 도메인이 모두 가려지지 않고 세포막 및 그 기질인 PIP₃에 완전히 노출되는 "열린" 입체형태 상태로 계면적으로 활성화된다. 또한, "인산화 부위" 중의 이들 6개의 세린/트레오닌 잔기의 인산화 상태는 PTEN 단백질의 "닫힌" 입체형태에서 "열린" 입체형태로의 형태 변화를 직접 조절하기 때문에 PTEN 계면 활성화에 중요한 인자인 것으로 간주된다(문헌[Das et. al 2003], 문헌[Vasquez et. al 2006]; 문헌[Odriozola et. al 2007], 문헌Rahdar et. al 2009]).

현재 제안된 모델(도 5)에 따르면, 막 표면에서 PTEN의 계면 활성화에 필요한 3개의 단계가 존재한다.

1) "인산화 부위"에서 인산화된 세린/트레오닌 잔기의 탈인산화는 "닫힌" 입체형태에서 "열린" 입체형태로의 PTEN 입체형태 변화를 촉발하고, 이는 PTEN 단백질이 세포막과 회합하고 PTEN 활성 부위 포켓을 세포막상에 위치한 PIP₃ 기질에 노출될 수 있게 한다.

2) 이어서 C2 도메인 중의 다수의 막-결합 모티프는 세포막과 상호 작용하여 PTEN 단백질을 막 표면에 고정시킨다.

3) 세포막 중의 N-말단 PIP₂ 결합 부위(AA6-15)와 PIP₂ 분자 사이의 추가적인 상호작용(문헌[Walker et. al 2004])뿐만 아니라 보조 NHERF1 단백질의 PDZ 도메인과 C-말단 PDZ 도메인 결합 부위(AA400-403)와의 결합(문헌[Takahashi et. al 2006]; 문헌[Molina et. al 2010])이 또한 모두 세포막 표면상의 PTEN 배향 조절에 필요하다.

우리는 우리의 TGN 펩타이드를 도 4에 도시된 PTEN 막 국소화 모델, 특히 "인산화 부위"와 PDZ 도메인-결합 부위(AA 352-403)를 기반으로 잠재적인 PTEN 억제제로서 설계하였다. 잠재적인 PTEN 억제제로서 TGN 펩타이드의 기본 개념은 PTEN 활성 부위와 막 결합에 필요한 C2 도메인을 가림으로써 PTEN과 세포막 표면 사이의 회합을 방지하는 것이다. Ser370 및 Ser385는 카제인 키나제 II를 통해 우선적으로 인산화되기 때문에(문헌[Miller et. al 2002]), 막 국소화뿐만 아니라 포스파타제 활성이 다른 잔기가 돌연변이될 때보다 더 증가된다([Odriozola et. al 2007]). 따라서, 이들 2개 중 적어도 하나의 세린 잔기를 모든 TGN 펩타이드에 포함시켰다(TGN-1 중의 Ser370/385, TGN-2/TGN-3 중의 Ser385). 또한, 380 및 385 위치에서 인산화된 세린 잔기는 현재 "슈도-기질"의 일부로 간주되어, PTEN 활성 부위 중의 촉매 포켓이 실제 기질 PIP₃에 접근하는 것을 가린다(문헌[Odriozola et. al 2007]). 펩타이드는 모든 TGN 펩타이드에 이들 2개의 세린 잔기(Ser 380 및 Ser 385)를 포함하도록 설계되었다.

TGN-1 펩타이드 서열은 PTEN 인산화 부위의 AA 365 내지 388 영역을 모방하고 3개의 인산화된 변형된 잔기(Ser370, Ser380 및 Ser385)와 함께 4개의 세린/트레오닌 잔기(Thr366, Ser370, Ser380 및 Ser385)를 함유한다. TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)뿐만 아니라 C-말단 PDZ 도메인-결합 모티프(ITKV)를 포함하는 PTEN 단백질의 AA376-403 영역을 모방한다. 트레오닌 잔기의 인산화는 생체내에서 2차 변형을 일으키고 또한 돌연변이될 때 PTEN-막 결합 친화도를 변경하는 데 덜 유효하기 때문에, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드 둘 다 중의 오직 세린 잔기만을 인산화하여 생체내 PTEN의 인산화 부위를 모방하였다(문헌[Odriozola et. al 2007]; 문헌[Rahdar et. al 2009]). TGN-3 펩타이드에서, 2개의 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)는 비교를 위해 발린으로 대체되었다. 또한, TGN-1 및 TGN-2/3 펩타이드의 서열을 스크램블링하여 서열 특이성을 조사하였고, 이들 펩타이드를 각각 TGN-4 및 TGN-5 펩타이드로 지정하였다.

재조합 인간 PTEN 단백질 및 C8-PIP₃을 사용한 시험관내 활성 분석 및 IC₅₀ 분석은 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 용량 의존적 방식으로 시험관내 PTEN 활성을 특이적으로 억제함을 보여주었다(도 2). C8-PIP₃은 다른 인지질 분자(DOPC/DOPS)와 함께 합성된 지질 소포(세포막 지질 이중층의 모방 시스템)로서 PTEN 단백질에 도입되었다. 활성 분석 결과는 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가, PTEN 단백질과 직접 상호작용하고 기질(C8-PIP3)이 PTEN 활성 부위에 결합하는 것을 방지하기 위해 PTEN-소포 막 회합을 방해함으로써 시험관내 PTEN 활성을 억제할 수 있음을 암시하였다. 실제로, 리포솜 형태 대신 C-8 PIP3 지질만을 직접 첨가한 시험관내 PTEN 활성 분석은 PTEN 활성을 나타내지 못하였다(데이터는 표시되지 않음). TGN-2 펩타이드와 비교하여 TGN-3 펩타이드에 의한 훨씬 감소된 억제 효과는 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)에 대한 인산화 변형이 TGN-펩타이드에 의한 시험관내 PTEN 억제에 중요한 인자임을 시사한다. 또한, TGN-2 펩타이드는 TGN-1 펩타이드보다 시험관내 PTEN 활성에 대해 거의 4배 더 높은 억제 효과를 나타내었다(TGN-1에 대한 IC₅₀ 값은 19.93 μM이고 TGN-2에 대한 IC₅₀ 값은 4.83 μM이다). TGN-1과 TGN-2 펩타이드 구조의 주요 차이점은 TGN-2 펩타이드가 PDZ 도메인 결합 모티프(AA 399 내지 403)를 포함하여 PTEN C-말단 영역(AA389 내지 403)의 마지막 15개 아미노산 서열을 함유한다는 것이다. 활성 분석은 시험관내 조건에서 수행되었기 때문에, TGN-2 펩타이드에 존재하는 마지막 15개 아미노산 서열이 PTEN 단백질에 대해 더 높은 결합 친화도를 제공하여 PTEN-소포 막 회합을 보다 효율적으로 방해하거나 또는 TGN-1 펩타이드보다 더 유효하게 PTEN 활성 부위 중의 기질 결합 포켓을 가린다고 설명할 수 있다.

TGN-1 펩타이드는 또한 PTEN 활성을 차단하여 신경 세포에서 PI3K-Akt 신호전달 경로를 조절하는 데 유효하다(도 3). 내인성 또는 과발현된 PTEN을 함유하는 PC12 세포를 TGN-1과 함께 24시간 동안 배양하였으며 Akt 단백질의 활성화(인산화) 수준을 항-포스포 Akt 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다. TGN-1 펩타이드로 처리된 세포 용해물에서 Akt 단백질의 인산화 수준은 TGN-4 펩타이드 또는 DMSO로 처리된 용해물보다 훨씬 더 높았는데, 이는 TGN-1 펩타이드가 PTEN을 특이적으로 억제하여 PI3K 활성을 길항한다는 것을 가리킨다. 따라서 TGN-1 펩타이드는 PTEN 활성을 억제함으로써 PI3K-Akt 신호전달 경로를 촉진하는 데 유효하다.

미세소관 안정화는 축삭돌기 재생 능력 및 신경 분극화를 촉진하여 척수 손상을 치료하는 데 중요한 것으로 간주되기 때문에(문헌[[Sengottuvel et al 2011], 문헌[Hellal et al 2011], 문헌[Witte et al 2008]), 우리는 노코다졸을 채택하여 분화된 신경 세포에 신경 퇴화를 유도하고 TGN 펩타이드가 미세소관 안정화를 통해 신경보호 효과를 나타내는지 시험하였다. 미세소관 안정성은 α-튜불린 아세틸화 수준과 밀접한 관련이 있기 때문에(문헌[Takemura et al 1992]), 우리는 항-아세틸화된 β-튜불린 항체로 안정한 신경돌기를 면역염색하였다. 면역형광 데이터(도 4a)는 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 실제로 신경돌기 미세소관 구조를 안정화시켜 신경돌기 퇴화를 지연시킴을 입증하였다. 더욱이, TGN-1 펩타이드의 첨가는 특히 신경세포 분화 과정에서 신경돌기 증식을 촉진한다(도 4b). 따라서, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 신경영양 효과뿐만 아니라 신경돌기 퇴화에 대해 신경보호 효과를 나타낸다.

이전 연구에서, 오드리졸라(Odriozola) 등은 TGN-1 펩타이드 서열과 유사한 PTEN C-말단 인산화 부위 클러스터(AA368 내지 390)를 포함하는 합성 포스포모방 펩타이드(Cp-23, Cp-23DE)가 시험관내에서 PTEN 촉매 활성의 억제를 매개한다고 보고하였다. 또한, GFP-융합된 포스포모방 펩타이드로 형질감염된 293T 세포를 사용한 분석은 PTEN-막 회합 수준을 감소시키고 포스포-Akt 수준을 향상시킴을 입증하였다. 그러나 오드리졸라 등이 사용한 포스포모방 펩타이드는 단지 PTEN "인산화 부위"의 AA 368 내지 390 영역만을 모방하지만, 본 발명의 TGN 펩타이드에서와 같은 인산화된 세린 잔기는 함유하지 않는다. 실제로, 오드리졸라 펩타이드(Cp23)와 TGN-1 펩타이드는 거의 동일한 아미노산 서열을 공유하지만, TGN-1 펩타이드의 억제 효능은 시험관내 IC₅₀ 값을 비교한 결과 오드리졸라 펩타이드(Cp23)보다 거의 50 배 더 높았다(TGN-1에 대한 IC₅₀ 값은 19.93 μM이고 Cp23에 대한 IC₅₀ 값은 약 1033 μM이다). 또한, 오드리졸라 펩타이드(Cp23, 1033 μM)와 스크램블드 펩타이드(Cp23-Der, 945 μM) 사이의 IC₅₀ 값에는 거의 차이가 없었다. 그러나 TGN-1 펩타이드는 그의 스크램블드 펩타이드 TGN-4보다 훨씬 더 높은 억제 효과를 나타내었으며(도 2b), 이는 TGN-1 펩타이드가, 오드리졸라 펩타이드(Cp23)가 실패한 시험관내 PTEN 활성에 대한 서열-특이적 억제 효과를 나타냄을 가리킨다. 또한 TGN-2 펩타이드는 PDZ 도메인-결합 모티프를 포함하여 15개의 아미노산 잔기를 추가로 함유한다는 점에서 오드리졸라 펩타이드(Cp23)와 다르며, 이는 이미 PTEN 억제에 유효한 것으로 나타났다(TGN-2에 대한 IC₅₀ 값은 4.93 μM이다). 또한 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 N-말단 단부에 PTD(펩타이드 전달 도메인) 서열을 포함하여 이들 펩타이드가 세포에 직접 도입될 수 있는 반면, 오드리졸라 펩타이드는 GFP와 융합되어 세포내로 형질감염되어야 할 필요가 있다. 따라서, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 시험관내 및 생체내에서 유효한 PTEN 억제 능력을 갖는다.

우리는 "인산화 부위"를 포함하는 PTEN C-말단 영역을 모방하여 펩타이드를 개발하였다. TGN-1 및 TGN-2는 신경 세포에서 PTEN 활성을 차단함으로써 시험관내 PTEN 활성 및 상향-조절된 PI3K-Akt 신호전달 경로에 대해 특이적이고 유효한 억제 효과를 나타내었다. PTEN 억제에 의한 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 촉진은 CNS 손상 시 신경 재생에 유효한 것으로 공지되어 있기 때문에(문헌[Saijilafu et al 2013]), 본 발명의 펩타이드는 CNS 손상에 대한 요법제 또는 치료제로서 유용하다. TGN 펩타이드와 함께 분화된 뉴런 세포를 사용한 신경돌기 분석은 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 신경영양 효과뿐만 아니라 신경돌기 미세소관 구조를 강화하여 퇴화된 신경돌기에 대한 신경보호 효과를 명확히 나타냄을 입증하였다. 따라서, 이들 펩타이드는 CNS 손상을 비롯한 신경 손상 후 신경 재생 및 신경퇴화 진행의 지연을 위한 치료 표적이다.

펩타이드 설계

PTEN 억제제로서 본원에서 "TGN 펩타이드"로도 지칭되는 본 발명의 펩타이드는 PTEN C-말단 영역(아미노산 잔기 352 내지 403)을 주형으로 사용하여 설계되었다.

모든 TGN 펩타이드는 PTD(펩타이드 전달 도메인) 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 서열은 막 투과성을 증가시키기 위해 N-말단에 RRRRRRRR(서열번호 2)을 포함할 수 있다.

TGN 펩타이드는 서열번호 1의 PTEN 아미노산 서열의 아미노산 잔기 352 내지 403 내의 PTEN의 임의의 단편이거나, 또는 그의 서열의 일부로서 서열번호 1의 PTEN 아미노산 서열의 아미노산 잔기 352 내지 403의 일부를 포함하는 PTEN의 단편일 수 있다. 바람직하게, TGN 펩타이드는 상기 펩타이드 단편에 존재하는 세린 또는 트레오닌의 인산화를 포함한다. 바람직하게, 세린 또는 트레오닌 부위는 서열번호 1의 PTEN 단백질의 366, 370, 380, 382, 383 또는 385에 있다.

TGN 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 잔기 길이, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개 또는 적어도 40개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 세린 또는 트레오닌 잔기 또는 이들의 조합 중 적어도 하나의 인산화가 펩타이드에 포함되는 것이 바람직하다.

하나의 태양에서, TGN 펩타이드는 그의 펩타이드 길이에 의해 제한되지 않는다는 것을 인식해야 한다. 펩타이드의 적어도 일부가 아미노산 잔기 352 내지 403 내에 존재하는 것이 바람직하다.

이와 관련하여, 예시된 TGN-1 펩타이드는 3개의 인산화된 세린 잔기 VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE(서열번호 3), pS = 인산화된 세린)을 갖는 24개의 아미노산을 갖는다. PTD가 N-말단에 부착될 때, 32개의 아미노산 잔기를 갖는RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE-아미드(서열번호 4)가 나타난다.

또 다른 예시된 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기 HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV(서열번호 5)를 갖는 28개의 아미노산을 갖는 TGN-2 펩타이드이다. PTD가 N-말단에 부착될 때, 36개의 아미노산 잔기를 갖는 RRRRRRRR-HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드(서열번호 6)가 나타난다.

TGN-3 펩타이드는 TGN-2 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 변형된 잔기가 없으며, 2개의 세린 잔기가 발린 HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV(서열번호 7)로 치환되었다. PTD가 N-말단에 부착될 때, RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드(서열번호 8)가 나타난다.

TGN-4 펩타이드는 TGN-1 펩타이드 SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH(서열번호 9)의 스크램블드 펩타이드로서 설계되었다. PTD가 N-말단에 부착될 때, RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-아미드(서열번호 10)가 나타난다. 그리고, TGN-5 펩타이드는 TGN-2/TGN-3 스크램블드 펩타이드 DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI(서열번호 11)에 대해 설계되었다. PTD가 N-말단에 부착될 때, RRRRRRRR- DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-아미드(서열번호 12)가 나타난다.

화학적으로 변형된 펩타이드

폴리펩타이드 요법은 짧은 순환 반감기, 및 단백질분해적 분해 및 낮은 용해도가 문제일 수 있다. 본 발명의 생물약제의 약동학 및 약력학 특성을 개선시키기 위해, 아미노산 서열의 조작과 같은 방법을 수행하여 면역원성을 감소 또는 증가시키고 단백질분해적 절단을 감소시킬 수 있고; 면역글로불린 및 혈청 단백질, 예를 들어 알부민에 대한 펩타이드의 융합 또는 접합이 이루어질 수 있으며; 보호 및 느린 방출을 위해 본 발명의 펩타이드 및 항체와 같은 생물약제에 대한 약물 전달 비히클에의 혼입이 또한 이루어질 수 있고; 천연 또는 합성 중합체에의 접합이 또한 고려된다. 특히, 합성 중합체 접합을 위해서, peg화 또는 아실화, 예를 들어 N-아실화, S-아실화, 아미드화 등이 또한 고려된다.

신경 조직

신경 조직은 척삭의 영향 하에 배아 외배엽으로부터 유래한다. 외배엽은 두꺼워진 신경판을 형성하도록 유도되며, 이는 이후 분화되고 최종적으로 단부가 융합되어 신경관을 형성하고 이로부터 모든 중추 신경계가 유래된다. 중추신경계는 뇌, 뇌신경 및 척수로 이루어진다. 말초신경계는 신경능(neural crest)이라고 하는 신경 홈 옆의 세포에서 유래된다.

신경 조직은 복잡한 통합 연통 네트워크로 신체 전체에 분포되어 있다. 신경 세포(뉴런)는 매우 단순한 형태에서 매우 복잡한 상위 회로에 이르는 회로로 다른 뉴런과 연통한다. 뉴런은 실제 메시지 전송 및 통합을 수행하는 반면, 신경아교세포라고 하는 다른 신경 조직 세포는 뉴런의 지원, 보호, 방어 및 영양 공급을 통해 뉴런을 지원한다. 뇌에는 뉴런보다 약 10배 더 많은 신경아교 세포가 있다. 신경아교 세포는 신경 기능에 필요한 미세 환경을 만들고 때로는 신경 처리 및 활동을 지원한다. 뉴런은 흥분성 세포이다. 이는 적절하게 자극을 받으면 멀리 있는 세포에 정보를 전달하기 위해 세포막을 통해 전파될 수 있는 활동 전위가 시작될 수 있음을 의미한다. 뉴런은 자극의 수신, 전송 및 처리를 담당하는 독립적인 기능 단위이다.

일반적으로, 뉴런은 세 부분: 핵과 세포 소기관이 위치한 세포체; 환경 또는 다른 뉴런으로부터 자극을 수용하는 세포체로부터 연장되는 돌기인 수상돌기; 및 다른 세포로 신경 자극을 전달하기 위해 세포체로부터 연장되는 긴 단일 돌기인 축삭돌기로 이루어진다. 축삭돌기는 일반적으로 원위 단부에서 분지되며, 또 다른 세포에서 종결되는 각 분지에는 구근 모양의 단부가 있다. 단부 구군과 인접 세포와의 상호 작용은 시냅스라는 구조를 형성한다. 시냅스는 신호를 수신하여 전위로 변환하는 데 특화되어 있다.

인체에서 발견되는 대부분의 뉴런은 다극성이며, 이는 뉴런이 2개를 초과하는 돌기를 가짐을 의미하고, 이때 단지 하나만이 축삭돌기이고 나머지 돌기는 수상돌기이다. 망막 또는 후각 점막의 양극성 뉴런은 하나의 수상 돌기 및 세포체에서 떨어져 나오는 축삭돌기를 가지고 있다. 척수 신경절에서 발견되는 슈도단극성 뉴런은 수상돌기에 의해 포착된 감각 자극이 세포체를 통과하지 않고 축삭돌기로 직접 이동할 수 있게 한다. 뉴런은 또한 기능에 따라 분류될 수 있다. 감각 뉴런은 감각 자극의 수신 및 전송에 관여한다. 운동 뉴런은 자극을 보내 근육과 땀샘을 조절한다. 다른 뉴런인 개재뉴런(interneuron)은 기능적 네트워크의 일부로서 뉴런 사이에서 중개자 역할을 한다.

시냅스는 세포 신호를 전파하는 특수 기능 세포 연접부이다. 대부분의 시냅스는 시냅스전 말단의 소포가 시냅스전 막이 자극될 때 시냅스 간극으로 방출되는 화학적 메신저를 함유하는 화학적 시냅스이다. 화학적 메신저는 시냅스 간극을 가로질러 확산되어 시냅스후 막의 수용체에 결합한다. 이것은 세포 활동에 영향을 미치는 시냅스후 막의 분극 상태의 변화를 유도한다. 특수 유형의 시냅스는 신경근 연접부이다. 35개가 넘는 신경전달물질이 공지되어 있으며 대부분은 소분자(산화질소, 아세틸콜린), 카테콜아민(노르에피네프린, 세로토닌) 또는 신경활성 펩타이드(엔돌핀, 바소프레신)이다. 신경전달물질은 일단 사용되면 시냅스전 세포에 의한 효소 분해, 확산 또는 세포내이입에 의해 빠르게 제거된다.

일부 뉴런은 마이엘린이라는 절연 물질로 싸여 있다. 이 지질이 풍부한 물질은 아교세포(말초 신경계의 슈반 세포 및 중추 신경계의 희소돌기아교세포)에 의해 형성된다. 절연은 탈분극되어야 하는 막 표면적을 줄임으로써 더 빠른 신경 전도를 가능하게 한다. 수초화된 뉴런에서 신경 자극은 축삭돌기의 길이에 걸쳐, 하나의 수초가 없는 분절에서 또 다른 분절로 점프한다. 일부 신경 조직을 뇌의 큰 말초 신경 및 백질에서와 같이 하얗게 보이게 만드는 것은 마이엘린 수초 및 조직내 뉴런 세포체의 결여이다. 성상세포라고 불리는 다른 아교세포는 구조적 완전성, 신경 영양 및 신경 조직의 미세 환경 유지에 관여한다. 성상세포는 갭 연접을 통해 서로 직접 연통하며 국소 환경의 조절에 의해 관리 중인 뉴런의 생존에 영향을 미칠 수 있다. 뇌실막 세포는 척수와 뇌실을 둘러싸고 있으며 뇌척수액을 분비한다. 미세아교세포라고 하는 다른 작은 신경아교세포는 성인 중추신경계의 염증 및 복구와 관련된 식세포이다.

신경 조직은 전기 자극을 수신하고 전송할 수 있는 흥분성 조직이다. 중심 세포 유형을 뉴런이라고 한다. 뉴런은 일반적으로 세포체, 입력을 수신하는 수상돌기, 및 전위를 전달하는 축삭돌기를 가지고 있다.

뉴런은 감각, 운동, 분비 또는 연합 뉴런으로 분류될 수 있다. 이들은 종종 전도 속도, 직경 및 마이엘린이라고 하는 특수 지단백질 절연의 유무에 따라 분류될 수 있다. A형 섬유는 수초화되어 있으며 12 내지 120 m/초의 속도로 자극을 전도할 수 있다. B형도 또한 수초화된 섬유이지만 단지 3-5 m/초로 자극을 전달한다. C형 섬유는 수초가 없고 직경이 작고 매우 느리다(2.5 m/초). A형 섬유의 일례는 장딴지근을 자극하는 운동 뉴런이다. 자율신경 신경절이전 원심성 뉴런은 B형 섬유의 예이고 미만성 통증에 대한 정보를 전달하는 감각 뉴런은 느린 C형 섬유의 예이다.

감각 뉴런은 환경에서 특정 유형의 정보를 감지하도록 적응된다. 여기에는 압력이나 신장과 같은 것을 감지하는 기계수용기, 열수용기, 망막의 광수용기, 미뢰나 후각과 같은 화학수용기가 포함된다. 연합 뉴런 또는 개재 뉴런은 대개 척수 및 뇌에서 발견되며, 여기서 이들은 감각 구심성 뉴런을 원심성 운동 또는 분비 뉴런에 연결한다.

뉴런은 시냅스라는 구조를 통해 서로 연통한다. 축삭돌기는 다수의 작은 소포를 함유하는 하나 이상의 말단 버튼에서 종결된다. 이 작은 소포는 신경전달물질이라는 화학 물질로 채워져 있다. 노르에피네프린, 세로토닌 및 GABA와 같은 다른 화학 물질이 뉴런에 따라 사용될 수 있지만 아세틸콜린이 시냅스에서 가장 흔한 신경전달물질이다. 자극이 축삭돌기 아래로 이동하여 말단 버튼에 도달하면 소포가 신경막과 융합되고 신경전달물질이 방출된다. 그런 다음 화학 물질은 좁은 시냅스 간극을 통해 수용 뉴런의 시냅스후 막에 있는 화학 물질에 대한 특정 수용체로 확산된다.

신경전달물질과 수용체와의 상호작용은 막전위의 변화를 일으켜 새로운 자극 시냅스후 뉴런을 유도할 수 있다. 효소 아세틸콜린에스테라제는 시냅스에 존재하여 아세틸콜린을 분해하고 자극을 종결시킨다. 다른 신경전달물질은 분해되거나 시냅스전 뉴런으로 다시 흡수되어 자극을 종결시킨다.

중추 신경계에서는 다수의 뉴런이 하나의 뉴런으로 모일 수 있다. 각각의 시냅스전 뉴런이 시냅스후 뉴런과 그의 시냅스로 신경전달물질을 방출할 때, 통합되고 합산되는 국소 막 전위가 발생한다. 이러한 수신 신호는 억제성 또는 자극성일 수 있다. 합산된 막 전위가 해당 뉴런의 최소 임계값에 도달하면 활동 전위가 시작될 것이다.

활동 전위는 도약 전도에 의해 세포체로부터 한 방향으로 이동한다. 가장 빠른 뉴런은 랑비에 결절(node of Ranvier)이라고 하는 네이키드 신경세포막의 결절에 의해 분리되는 은밀한 분절로 배열된 마이엘린 수초로 덮여 있다. 도약 전도에서 전위는 결절에서 결절로 이동하여 활동 전위의 전도와 관련된 막 영역을 줄이고 전도 속도를 높인다.

신경계에서 발견되는 비-신경 세포를 신경아교 세포라고 한다. 성상세포가 가장 다수이며, 뉴런의 지탱과 영양을 제공한다. 미세아교 세포는 신경 조직 특유의 작은 식세포이다. 뇌실계와 척수의 중심관을 둘러싸고 뇌척수액을 만드는 세포를 뇌실막 세포라고 한다. 중추 신경계에서, 희소돌기아교세포는 다수 뉴런의 마이엘린 수초의 분절을 형성한다. 말초 신경계에서, 마이엘린 수초의 각 분절은 하나의 슈반 세포에 의해 만들어진다.

중추 신경계

중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 이루어진다. 뇌척수막(경질막, 지주막 및 연질막)은 두개골과 척추뼈에 의해 제공하는 보호 외에도 CNS를 보호하고 영양을 공급한다. 뇌척수액은 지주막하 공간, 척추의 중심관 및 뇌실에서 발견된다. 연질막은 가장 안쪽 층이며 신경 조직에 부착되어 있다. 연질막과 경질막 사이에는 지주막층이 있다. 질긴 섬유성 경질막은 두개골 바로 아래에 있다.

뇌는 전뇌, 중뇌 및 뇌간의 3가지 기본 영역으로 나뉠 수 있다. 전뇌에는 시상, 시상 하부, 기저핵 및 대뇌가 포함된다. 대뇌는 의식적 사고, 감각 해석, 모든 자발적인 움직임, 정신 기능 및 감정을 담당한다.

대뇌 조직은 구조적 영역과 기능적 영역으로 나뉠 수 있다. 대뇌의 표면은 이랑(능선)과 고랑(홈)으로 얽혀 있다. 피질 감각 및 운동 영역은 각각 중심 뒤이랑과 중심 고랑에 맵핑될 수 있다. 감각 영역은 시상 처리 후 투사된 신체의 반대편에서 감각 정보를 수신한다. 더 많은 감각 신경 말단을 가진 신체 부위는 더 많은 피질 감각 영역으로 표현된다. 운동 영역은 반대쪽 신체 부위의 수의적 근육 운동을 조절하지만 연합 영역은 운동 시작에 중요하다.

대뇌는 뇌의 가장 큰 부분으로 좌우 2개의 반구로 나뉘어져 있으며 여러 개의 엽을 가지고 있다. 전두엽은 운동 영역, 브로카 언어 영역, 연합 영역, 및 지능 및 행동 기능을 함유한다. 두정엽은 감각 영역과, 감각 및 청각 기능을 포함한다. 1차 시각 연합 영역은 후두엽에 위치하고 측두엽은 청각 연합, 후각 및 기억 저장 영역을 포함한다.

시상은 대뇌 피질과 뇌간 사이에 위치한다. 후각을 제외한 모든 감각 입력은 뇌의 다른 영역으로 투사되기 전에 여기에서 처리된다. 시상 하부는 시상 아래에 위치하며 내부 자극 처리 및 내부 환경 유지를 담당한다. 혈압, 체온, 심박수, 호흡, 수분 대사, 삼투압, 배고픔 및 신경 내분비 활동에 대한 매 순간 무의식적인 조절이 여기에서 처리된다. 뇌하수체 후엽에서 옥시토신과 ADH를 방출하는 신경내분비세포의 핵은 시상하부에 위치한다.

기저핵(미상핵, 구창구, 흑질, 시상하핵, 적핵)은 대뇌의 각 반구 내에 내장된 뉴런 그룹이다. 이들은 복잡한 운동 조절, 정보 처리 및 무의식적인 총체적 의도적 움직임의 조절에 관여한다.

뇌간에는 연수와 뇌교가 포함된다. 연수는 호흡, 심장 및 혈관 운동 반사의 조절을 위한 중요한 기능 영역과 중계 중추를 함유한다. 뇌교는 호흡 조절에 관여하는 호흡조절 중추를 함유한다.

소뇌는 뇌간 위에 있으며 신체의 위치, 움직임, 자세 및 평형에 대해 다른 곳에서 처리된 감각 정보를 사용한다. 움직임은 소뇌에서 개시되지 않지만 조정된 움직임에 필요하다.

말초 신경계

말초신경계는 뇌와 척수 외부에 위치한 신경, 신경절, 척수 및 뇌신경을 포함한다. 12개의 뇌신경은 뇌간에 위치한 핵에서 발생하여 자극을 전달하는 특정 위치로 이동하여 후각, 시각, 타액 분비, 심박수 및 피부 감각과 같은 다양한 자율 기능을 조절한다. 뇌신경은 종종 감각 및 운동 성분을 전달한다는 점에서 혼재되어 있지만 운동 또는 감각 섬유만을 가질 수도 있다. 하기 표에는 뇌신경과 그 기능이 나열되어 있다.

뇌신경
숫자	명칭	기능
I	후각	후각
II	시각	시력
III	동안	일부 눈 근육과 눈꺼풀의 운동 조절
IV	활차	일부 눈 근육의 운동 조절
V	3차	씹는 근육과 일부 얼굴 감각
VI	외전	일부 눈 근육의 운동 조절
VII	얼굴	안면 근육의 운동 조절, 타액 분비, 맛과 피부 감각.
VIII	청각	평형, 정적 감각 및 청력
IX	설인	타액 분비, 피부 감각, 미각 및 내장
X	미주	심장과 내장의 운동 조절, 흉부, 인두 및 복부 내장의 감각
XI	부	인두와 어깨에 대한 운동 자극
XII	설하	혀의 운동 조절, 일부 골격근, 일부 내장, 피부 및 내장의 감각

말초 신경계의 감각 부분은 다양한 유형의 수용체로부터 입력을 받아 처리하고 이를 중추 신경계로 보낸다. 감각 입력은 고유수용감각(관절과 근육의 위치 감각)과 같은 내부 소스 또는 피부의 압력 또는 열 감각과 같은 외부 소스에서 나올 수 있다. 특정 척수 신경에 의해 지배되는 피부 영역을 피부분절(dermatome)이라고 한다. 구심성 섬유는 감각 입력을 수집하고 척수 위로 이동하며, 시상에서 수렴하고, 마지막으로 대뇌의 감각 피질에서 끝난다. 감각 수용체가 더 많은 영역, 즉 손가락 끝이나 입술은 뇌의 감각 피질에서 더 큰 영역에 해당한다. 고유 감각 정보를 전달하는 섬유는 소뇌에도 분산된다. 거의 모든 감각 시스템은 자극을 시상의 일부로 전달한다. 대뇌 피질은 감각 자극의 의식적인 인식과 해석에 관여한다.

근육과 땀샘에 대한 운동 입력은 자율 및 신체 원심성 시스템을 통해 발생한다. 관절, 힘줄 및 근육의 CNS 신경 분포는 체세포 원심성 시스템을 통해 이동한다. 일부 근육 반응은 척추 반사를 통해 처리된다. 이에 대한 예는 손가락이 뜨거운 스토브에 닿았을 때 나타나는 철수 반사이다. 손가락을 떼려는 움직임은 통증 감각이 뇌에 도달하기 훨씬 전에 단순 척수 반사를 통해 발생한다. 분명히 이것은 추가 부상을 방지하기 위한 보호 기전이다. 땀샘과 평활근에 대한 운동 입력은 일반적으로 자율 시스템을 통해 발생한다.

대부분의 기관은 자율 신경계의 2개 분지 모두로부터의 입력을 수용한다. 하나의 분지는 일반적으로 흥분성이고 다른 분지는 해당 기관이나 조직에서 억제성이다. 자율신경계의 교감신경 분지는 신체가 생리적 스트레스에 대비하도록 작용한다. 교감신경 분지의 자극은 몸이 반응하여 달리거나 싸울 준비를 한다는 점에서 가속 페달을 밟는 것과 같다. 증가된 심박수, 기도 확장, 및 글리코겐 저장소로부터 글루코스의 동원과 같은 효과가 나타난다. 제1 흉추로부터 제4 요추까지 교감 신경이 생긴다. 이들은 척추를 따라 놓여 있는 쇄 신경절 중 하나에서 끝나는 짧은 신경절 이전 뉴런을 가지고 있다. 아세틸콜린은 긴 신경절이후 뉴런과의 시냅스에서 신경전달물질이고, 이어서 표적 조직으로 이동하며 여기서 노르에피네프린이 대부분의 교감 신경 끝에서 방출된다. 땀샘이나 골격근 맥관 구조와 같은 일부 교감 신경절이후 뉴런은 아세틸콜린을 방출한다.

부교감신경 분지는 CNS의 두개골 및 천골 영역에서 발생하는 뉴런을 통해 교감신경 분지의 균형을 맞추는 역할을 한다. 예를 들어, 부교감신경 자극은 기도를 수축시키고 심박수를 감소시킨다. 상기 분지는 소화, 배뇨 및 발기와 같은 휴지 활동을 조절한다. 긴 신경절이전 뉴런은 말단 기관에 가까운 시냅스에서 아세틸콜린을 방출한다. 짧은 신경절이후 뉴런은 또한 효과기 조직에서 아세틸콜린을 방출한다.

척수 손상 및 상기 손상으로 인한 병태의 치료

본 연구는 SCI 후 기능 및 분자 손상에 대한 PTEN 억제제의 효과를 입증하였다. PTEN 억제제 치료는 SCI 후 보행 능력과 협응 기능을 개선시켰다. 또한, SCI에 의해 유발된 정상적인 배뇨 행동의 소실은 PTEN 처리 후 유의하게 회복되었다. 그러나 기능 회복의 개선은 모의 그룹에서 관찰된 정상적인 기능에 도달하지 못하였다. PTEN 치료 후 손상된 척수의 조직학적 회복이 관찰되었다. 또한 NGF와 BDNF의 현저한 감소가 관찰되었으며 이러한 결과는 PTEN 억제제에 의한 신경 회복을 시사한다.

다수의 분자가 뉴런 재생에 관여하며 PTEN은 가장 효율적인 분자 중 하나로 간주된다. 이전 연구는 종양 억제인자 PTEN 녹아웃 마우스가 손상 후 중추 신경계 축삭돌기의 상당한 재성장을 보였다고 보고하였다(문헌[Park et al. (2008)]; 문헌[Liu et al., (2010)]). PI3K/Akt 경로는 새로운 축삭돌기 형성 및 재생에 중요한 역할을 하며 Akt의 과발현은 신경 재생 및 분기에 기여한다. 또한 PTEN은 Akt 활성을 감소시키므로; PTEN의 억제는 PI3K/Akt 신호전달 활성화에 의한 신경 재생을 증가시킨다(문헌[Ohtake et al., (2015)]). PTEN 억제제를 사용한 이전 연구는 경추 SCI 후 증가된 희소돌기아교세포 및 운동 기능 회복을 관찰하였다(문헌[Walker et al., (2012)]). 뇌동맥 폐쇄 후 경색과 관련된 기능 장애가 장기간 추적 관찰에서 개선되었다(문헌[Mao et al., (2013)]). 이러한 이전 연구와 유사하게, 본 연구에 사용된 PTEN 억제제는 SCI 후 동물과 비교하여 손상된 척수의 신경 재생 및 기능 개선을 유도할 수 있었다. 또한 본 연구에서는 배뇨 기능이 향상되었다. PTEN 치료는 모의 그룹에서 관찰된 정상적인 배뇨 패턴과 유사하게 배뇨를 회복하였다.

성장 인자는 조직 재생에 중요한 역할을 하며 임의의 유형의 손상 후 증가된 양의 성장 인자는 손상된 조직의 회복에 기여한다. 본 연구에서, 우리는 각 그룹의 VEGF, NGF 및 BDNF의 변화를 비교하였다. SCI 그룹에서 VEGF, NGF 및 BDNF의 현저한 과발현은 재생 과정으로 간주되었다. 우(Wu) 등(문헌[Wu et al., (2008)] 및 상(Sang) 등(문헌[Sang et al., (2018)])은 VEGF, NGF, 및 BDNF와 같은 성장 인자가 PI3K/Akt 경로를 활성화하고 신경 발생을 유도함을 보여주었다.

그러나, 운동 기능과 배뇨에 대한 기능 연구에서는 VEGF, NGF, 및 BDNF의 과발현에도 불구하고 기능 장애가 나타났다. 다른 한편으로, PTEN 억제제 처리는 SCI 동물에 비해 기능 회복을 유도하고 VEGF, NGF 및 BDNF의 발현을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 PTEN의 하향 조절이 성장 인자의 과발현 없이 PI3K/Akt 신호전달 경로에 의한 신경 재생을 유도했기 때문에 PTEN 억제제와 연관되었다.

이것은 SCI 후 운동 기능뿐만 아니라 배뇨 기능의 회복에서 PTEN 억제제의 역할을 조사한 최초의 연구이다. 그러나 몇 가지 제한이 있었다. 이 연구에서 우리는 근원 기전으로서 PI3K/Akt 신호전달 경로를 제안한다.

따라서, 본 발명은 SCI 환자의 배뇨 기능장애를 포함한 기능 장애에 대한 치료 분자로서 PTEN 억제제에 관한 것이다. 이것은 척수 손상으로 인한 운동 및 배뇨 기능의 개선 및 치료를 입증한 최초의 연구이다.

치료 조성물

하나의 실시양태에서, 본 발명은 신경퇴화를 특징으로 하는 다양한 질병의 치료에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 치료 화합물은 신경 퇴화를 억제하는 화합물을 제공함으로써 질병을 앓고 있거나 질병을 앓기 쉬운 인간 환자에게 투여될 수 있다. 특히, 상기 질병은 뇌의 신경퇴행성 질환, 특히 해마 및 대뇌 피질에서 신경 세포의 손실, 신경 전달 물질의 감소, 뇌혈관 퇴화, 척추의 압착된 신경 및/또는 인지 능력의 손실과 관련이 있다.

치료 화합물의 제형은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며 편의상 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]을 참조할 수 있다. 예를 들어, 하루에 체중 ㎏당 약 0.05 ㎍ 내지 약 20 ㎎이 투여될 수 있다. 투여량은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 수회 분할 용량을 매일 투여하거나 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 용량을 비례적으로 감소시킬 수 있다. 활성 화합물은 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비강내, 피내 또는 좌약 경로 또는 이식(예를 들어, 복강내 경로에 의해 느린 방출 분자를 사용하거나, 또는 시험관내에서 감작되고 및 수용자에게 입양 전달된 세포, 예를 들어 단핵구 또는 수상돌기 세포를 사용함으로써)과 같은 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩타이드를, 효소, 산, 및 상기 펩타이드를 불활성화시킬 수 있는 기타 천연 조건의 작용으로부터 상기 성분을 보호하는 물질로 코팅시켜야 할 수 있다.

예를 들어, 펩타이드의 낮은 친지성으로 인해, 펩타이드는 위장관에서 상기 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의해 파괴되고 위에서는 산 가수분해에 의해 파괴될 것이다. 비경구 투여 이외의 방법으로 펩타이드를 투여하기 위해서는 상기 펩타이드를 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 또는 이러한 물질과 함께 투여할 것이다. 예를 들어, 펩타이드는 보조제 중에서 투여되거나, 효소 억제제와 함께 투여되거나 또는 리포솜 중에서 투여될 수 있다. 본원에서 고려되는 보조제는 레소르시놀, 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 억제제에는 췌장 트립신 억제제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤이 포함된다. 리포솜은 수중-유중-수적형 CGF 유화액뿐만 아니라 통상적인 리포솜을 포함한다.

활성 화합물은 또한 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다.

주사용으로 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 상기 형태는 무균 상태이어야 하고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 상기 형태는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나, 분산의 경우 필요한 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테오메르살 등에 의해 일어날 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 일어날 수 있다.

멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 적절한 용매에 상기 열거된 다양한 기타 성분과 함께 혼입한 다음 필요에 따라 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조, 및 동결 건조 기법이다.

펩타이드가 상기 기재된 바와 같이 적합하게 보호되면, 활성 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여되거나, 또는 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 둘러싸이거나, 또는 정제로 압축되거나, 또는 식단의 음식에 직접 혼입될 수 있다. 경구 요법 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1중량%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 물론 조성물 및 제제의 백분율은 다양할 수 있으며 편의상 단위 중량의 약 5 내지 약 80%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 획득되는 정도이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 제제는 경구 단위 투여형이 약 0.1 ㎍ 내지 2000 ㎎의 활성 화합물을 함유하도록 제조된다.

정제, 환제, 캡슐 등은 또한 하기를 함유할 수 있다: 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산 이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 슈크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리향과 같은 풍미제를 첨가할 수 있다. 단위 투여형이 캡슐인 경우, 상기는 상기 유형의 물질에 더하여 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅제로서 존재하거나, 또는 상기 단위 투여형의 물리적 형태를 달리 변형하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 셸락, 당 또는 이들 둘 다로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 활성 화합물, 감미제로서 슈크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 풍미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위형을 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 약학적으로 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 제형에 혼입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 투여형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용되는 바와 같은 단위 투여형은 치료하고자 하는 포유동물 피험자에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 공동으로 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 사양은 (a) 활성 물질의 고유한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체 건강이 손상된 병든 상태를 갖는 살아있는 피험자에서 질병의 치료에 대해 상기와 같은 활성 물질의 배합 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다.

주요 활성 성분은 단위 투여형 중에서 적합한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 유효량으로, 편리하고 유효한 투여를 위해 배합된다. 예를 들어, 단위 투여형은 주요 활성 화합물을 0.5 ㎍ 내지 약 2000 ㎎ 범위의 양으로 함유할 수 있다. 비율로 표현하면, 활성 화합물은 일반적으로 담체 ㎖당 약 0.5 ㎍으로 존재한다. 보충 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 성분의 통상적인 투여량 및 투여 방식을 참조하여 결정된다.

전달 시스템

다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포솜 중의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내이입, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성이 공지되어 있으며 이는 본 발명의 화합물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 피부 내층(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 뇌실내 및 척수강내 주사를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계내에 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 예를 들어 Ommaya 저장소와 같은 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 폐 투여는 예를 들어, 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 포함하는 제형의 사용에 의해 또한 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는 예를 들어, 비제한적으로, 수술 중 국소 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 적용에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있으며, 상기 임플란트는 멤브레인, 예를 들어 시알라스틱 멤브레인 또는 섬유를 포함한, 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질의 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 펩타이드를 포함하는 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용하도록 주의를 기울여야 한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 조절된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 더욱 또 다른 실시양태에서, 조절된 방출 시스템은 치료 표적, 즉 뇌에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다.

조성물은 그의 투여가 수령 동물에 의해 용인될 수 있고 달리 그 동물에 대한 투여에 적합한 경우 "약리학적으로 또는 생리학적으로 허용된다"고 한다. 이러한 작용제는 투여량이 생리학적으로 유의수준인 경우, "치료 유효량"으로 투여된다고 한다. 작용제의 존재로 인해 수령 환자의 생리학에서 감지 가능한 변화가 발생하는 경우 상기 작용제는 생리학적으로 유의미하다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 수반되는 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1 - 물질 및 실험 방법

실시예 1.1

래트 부신 수질 PC12 갈색세포종 신경 세포를 ATCC(Manassas, VA)에서 구입하였다. 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 소 태아 혈청(FBS) 및 말 혈청을 포함한 세포 배양 물질을 Mediatech Inc.(Manassas, VA)에서 구입하였다. 2.5 S 신경 성장 인자를 BD Biosciences, Inc.(Bedford, MA 01730)에서 구입하였다. 뉴런 클래스 III ß-튜불린에 대한 TUJ-1 단클론 토끼 항체를 Covance Inc.(Gaithersburg, MD)에서 구입하였다. 아세틸화된 α-튜불린에 대한 단클론 마우스 항체를 Santa Cruz Biotech Inc.(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 염소 혈청, Texas Red^® 염소 항-토끼 IgG 항체, Alexa Fluor^® 488 염소 항-마우스 IgG 항체, 4'6-다이아미디노-2-페닐인돌, 다이락테이트(DAPI) 및 AlamarBlue^®를 Molecular Probes-Invitrogen(Eugene, OR)에서 구입하였다. 노코다졸을 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 신경돌기 증식 분석 키트를 Millipore(Billerica, MA)에서 구입하였다. 모든 지질을 Avanti Polar Lipids, Inc.(Alabaster, AL 35007)에서 구입하였다. 재조합 인간 PTEN 단백질 및 말라카이트 그린 포스페이트 검출 키트를 R&D Systems, Inc.(Minneapolis, MN 55413)에서 구입하였다. 인간 PTEN c-DNA를 OriGene Inc.(Rockville, MD 20850)에서 구입하였다. Lipofectamine^TM 2000 형질감염 시약을 Invitrogen^TM에서 구입하였다. 트리스-글리신 구배 미니 젤(10 내지 20%)을 Novex^TM에서 구입하였다. 모든 항체를 Santa Cruz Biotechology, Inc.(Santa Cruz, CA 95060)에서 구입하였다. 모든 다른 물질을 Fisher Scientific Inc에서 구입하였다.

실시예 1.2 - 펩타이드 설계

잠재적인 PTEN 억제제로서 TGN 펩타이드를 PTEN C-말단 영역(AA352 내지 403)을 주형으로 사용하여 설계하였다. 모든 TGN 펩타이드는 막 투과성을 증가시키기 위해 N-말단 단부에 PTD(펩타이드 전달 도메인) 서열(RRRRRRRR)을 포함한다. TGN-1 펩타이드는 3개의 인산화된 세린 잔기를 갖는 32개의 아미노산을 갖는다(MW = 4244.18 Da, 서열: RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE-아미드(서열번호 4), pS = 인산화된 세린). TGN-2 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기를 갖는 36개의 아미노산을 갖는다(MW = 4776.28 Da, 서열: HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드(서열번호 6), pS = 인산화된 세린). TGN-3 펩타이드는 TGN-2 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 변형된 잔기는 없고 2개의 세린 잔기가 발린으로 치환되었다(MW = 4640.99 Da, 서열: RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드(서열번호 8)). TGN-4 펩타이드는 TGN-1 펩타이드의 스크램블드 펩타이드(MW = 4004.19 Da, 서열 = RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-아미드(서열번호 10))로 설계되었고 TGN-5 펩타이드는 TGN-2/TGN- 3 스크램블드 펩타이드(MW = 4616.88 Da, 서열 = RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-아미드(서열번호 12))에 대해 설계되었다. 모든 펩타이드는 21^st Century Biochemicals Inc.(Marlboro, MA 01752)에서 합성되었다. 순도는 > 95%였으며 HPLC에 의해 확인되었다.

실시예 1.3 - 시험관내 PTEN 활성 분석

시험관내 PTEN 활성 분석을, PTEN 지질 포스파타제 활성을 검사하여 포스파티딜이노시톨 트라이포스페이트(PIP₃)를 포스파티딜이노시톨 다이포스페이트(PIP₂)로 전환하고 포스페이트 이온(P_i)을 생성하도록 설계하였다. 1,2-다이옥타노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-마이오-이노시톨-3,4,5-트라이포스페이트(C8-PIP₃)를 PTEN 기질로서 사용하였으며, 지질 포스파타제로서 PTEN은 계면 효소이므로 다른 인지질을 갖는 지질 소포(리포솜)로서 제조하였다. 리포솜 제조를 위해, C8-PIP₃, DOPS(1,2-다이올레오일-sn-글리세로-포스포세린) 및 DOPC(1,2-다이올레오일-sn-글리세로-포스포콜린)을 800 ㎕의 리포솜 완충제(50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, pH = 8.0)와 함께 0.1 mM의 C8-PIP₃, 0.25 mM DOPS 및 0.25 mM DOPC의 최종 농도로 혼합하였다. 이어서 지질 혼합물을 4℃에서 30분 동안 초음파 처리하여 리포솜을 생성시켰다. 초음파 처리 후 리포솜 용액을 잠시 원심분리하여 남아있는 지질을 제거하였다.

PTEN 활성 분석을 위해, 20 ng의 재조합 인간 PTEN 단백질을 40 ㎕의 완성된 리포솜 용액과 혼합하였다. PTEN 분석 완충제(1 mM Tris, 20 mM DTT 및 0.5% NP-40, pH = 8.0)를 최대 100 ㎕의 최종 부피로 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 30분 동안 37℃ 수욕에서 배양하였다. 배양 후, PTEN 단백질에 의해 생성된 무기 포스페이트 이온을 말라카이트 그린 포스페이트 검출 키트를 사용하여 검출하였다. 먼저, 각 반응 혼합물 50 또는 100 ㎕를 96-웰 플레이트로 옮기고 각각 10 또는 20 ㎕의 말라카이트 시약 A를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 다시 각 샘플에 10 또는 20 ㎕의 말라카이트 시약 B를 첨가하고 실온에서 20분간 더 배양하였다. 포스페이트 이온의 검출은 분광광도계를 사용하여 620 ㎚에서 OD(광학밀도)를 측정하여 수행하였다. 재조합 PTEN 활성에 대한 TGN 펩타이드(10 μM)의 억제 효과를 측정하기 위해, 각 TGN 펩타이드를 DMSO 용액에 1 mM 농도로 제조하고 1 ㎕의 TGN 펩타이드 용액을 재조합 PTEN 단백질, 리포솜 및 PTEN 분석 완충제와 혼합하고, 상기 프로토콜에 따라 PTEN 활성을 분석하였다.

실시예 1.4 - 시험관내 IC ₅₀ 분석

IC₅₀ 값을, 상이한 농도의 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드로 시험관내 PTEN 활성 분석을 수행하여 측정하였다. IC₅₀ 분석을 위한 TGN-1 또는 TGN-2 펩타이드의 농도 범위는 각각 0.1, 1, 10, 30, 60 및 100 μM 및 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 및 100 μM이었다. 모든 데이터는 3회 중복 실험을 나타내며 IC₅₀ 값은 Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software)에 의해 계산되었다.

실시예 1.5 - PC 12 세포 배양

PC12 래트 갈색세포종 세포를 6-웰 플레이트(0.6x10⁶ 세포/웰)에 시딩하고 7.5% FBS 및 7.5% 염소 혈청을 함유하는 DMEM 배지와 배양하였다. 세포 융합율이 60 내지 70% 정도에 도달한 후 NGF(신경 성장 인자, 50 ng/㎖)를 분화를 위해 PC12 세포에 첨가하고 5일 더 배양하였다. 이어서, DMSO 용액 중의 상이한 양의 TGN 펩타이드를 함유하는 신선한 배지를 각 웰에 첨가하고 24시간 더 배양하였다. PTEN 과발현을 위해, PC12 세포를 6-웰 플레이트(1.0x10⁶ 세포/웰)에 시딩하고 상기와 같이 NGF(50 ng/㎖)로 분화시켰다. DNA-Lipofectamine 2000 혼합물을, 먼저 인간 PTEN c-DNA 2 내지 2.5 ㎍을 Opti-MEM 500 ㎕에 첨가하여 형질감염시키려는 세포의 각 웰에 대해 제조하였다. 다음으로, 3.75-8.75 ㎕의 Lipofectamine 2000™ 시약을 상기 희석된 DNA 용액에 추가하고, 부드럽게 혼합하고 실온에서 25분 동안 배양하였다. 6웰 플레이트에서 PC12 세포의 증식 배지를 새로운 배지로 교체하고 DNA-Lipofectamine 2000 복합체 500 ㎕를 형질감염을 위해 각 웰에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 형질감염 후 24-48시간 동안 5.0% CO₂ 배양기에서 37℃에서 배양한 후 트랜스유전자 발현에 대해 분석하였다.

실시예 1.6 - PC12 세포를 사용한 신경돌기 분석

래트 부신 수질 PC12 래트 크롬친화세포종 신경 세포에 T-75 ㎠ 플라스크 중의 7.5% 소 태아 혈청(FBS), 7.5% 말 혈청(ES) 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신을 보충하고 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 유지시켰다. 세포를 플라스크로부터 부드럽게 기계적으로 탈착시킴으로써 50% 융합율에서 분할하고 분할 비율 1:7로 번식시켰다.

신경돌기 보호 분석을 위해, PC12 세포를 2.08 x 10⁵ 세포/스캐폴드(최적 시딩 밀도로서 실험적으로 결정됨)의 시딩 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하고 세포 융합율이 60 내지 70%에 도달할 때까지 24-48시간 동안 배양하였다. 이어서 PC12 세포를 NGF(50 ng/㎖)로 72-120시간 동안 분화시켰다. 신경돌기 퇴화를 모방하기 위해서, 분화된 PC12 세포를 노코다졸(0.5 μM)로 처리하였다. 37℃에서 1시간 배양 후, 노코다졸을 함유하는 기존 배지를 NGF(10 ng/㎖) 및/또는 TGN 펩타이드(최종 농도로서 100 μM)를 함유하는 새로운 배지로 교체하고 추가로 72시간 동안 배양하였다. 나머지 신경돌기는 하기에 기재된 면역형광 분석을 통해 분석되었다.

신경돌기 증식 분석을 위해, PC12 세포를 1.0 x 10⁵ 세포/웰 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 융합율이 60 내지 70%에 도달한 후, NGF(50 ng/㎖)를 첨가하여 PC12 세포의 분화를 개시시켰다. 배양 24시간 후, TGN 펩타이드(최종 농도로서 50 μM)를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 추가로 2일 동안 배양하였다. 신경돌기 상태는 하기에 기재된 신경돌기 증식 키트(Millipore)를 사용하여 분광광도계로 정량분석되었다.

실시예 1.7 - 웨스턴 블롯팅

배양 후, PC12 세포를 6-웰 플레이트로부터 수집하고 벤치탑 원심분리기로 원심분리하여 세포 펠릿을 만들었다(13,000 rpm, 실온에서 5분). 상등액을 버리고 세포 펠릿을 3 내지 500 ㎕의 1x PIPA 완충제(Invitrogen)로 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 액체 질소와 37℃ 수욕을 사용하여 동결-해동 주기(3-4회)에 의해 용해시키고, 이어서 27G 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 재현탁된 세포를 반복적으로 분무하였다. 용해된 세포를 4℃에서 20분 동안 10,000 g에서 원심분리하고 상등액을 수집하고 BCA 단백질 농축 키트(Thermo Scientific.)를 사용하여 총 단백질 농도를 분석하였다.

웨스턴 블롯을 수행하여, 항-포스포 Akt 항체를 사용하여 PC12 세포에서 내인성 Akt 단백질의 인산화 수준을 조사하였다. SDS-PAGE를 Novex^TM 구배 미니 젤(10 내지 20%)을 사용하여 수행하였다. SDS-PAGE 젤 중의 세포 용해물 샘플 및 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 다음 차단 용액(0.1% Tween-20을 함유하는 1X TBS 완충제 중의 5% 우유)과 함께 배양하였다. 항-포스포 Akt 항체를 1:500 희석하여(0.1% Tween-20을 함유하는 1X TBS 완충제) 1차 항체로서 사용하였다. HRP-접합된 항-토끼 항체를 1:8000 희석 인자로 2차 항체로서 사용하였다. 내인성 또는 과발현된 PTEN 단백질의 발현 수준을 또한 항-PTEN 항체(1:400 희석 인자)를 사용하여 조사하였다. β-액틴 발현 수준을 또한 로딩 대조용으로 분석하였다.

실시예 1.8 - 신경돌기 정량분석

전체 신경돌기의 정량분석을 위해, 우리는 분광광도계와 함께 신경돌기 증식 분석 키트(Millipore)를 사용하였다. Millicell 삽입물(EMD Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)의 밑면을 신선한 세포외 기질(ECM) 단백질(10 ㎍/㎖ 콜라겐)로 37℃에서 2시간 동안 코팅한 후, PC12 세포를 삽입물 당 접종하고, 24웰 플레이트의 각 웰에 넣었다. 세포를 부착을 위해 실온에서 15분 동안 유지시키고, 그 후 웰당 총 700 ㎕의 분화 배지를 첨가하였다(멤브레인 아래 및 위에 각각 600 ㎕ 및 100 ㎕). 신경돌기를 3일 동안 방치 연장시킨 후 삽입물을 -200℃ 메탄올로 실온에서 20분 동안 고정시키고, 이어서 신선한 PBS로 세정하였다. 이어서 삽입물을 실온에서 30분 동안 400 ㎕ 신경돌기 염색 용액에 넣고 축축한 면봉으로 세포체를 제거한 후 각 삽입물을 100 ㎕ 신경돌기 염색 추출 완충제(Millipore)에 넣었다. 마지막으로, 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 분광광도계에서 562 ㎚에서 흡광도를 판독하여 정량분석하였다.

실시예 1.9 - 면역형광

세포 배양 후, 증식 배지를 제거하고 세포를 실온에서 15분 동안 10% 포르말린으로 고정시켰다. 그 후, 세포를 PBS 중의 0.5 M 글리신 용액으로 세척하고 PBS 중의 5% 염소 혈청 및 0.2% Triton-X 용액으로 40℃에서 밤새 차단하였다. 1차 항체를 사용한 면역염색을 위해, 세포를 전체 신경돌기 염색을 위해 뉴런 클래스 III ß-튜불린에 대한 TUJ-1 단클론 토끼 항체(1:200 희석), 및 안정한 신경돌기 염색을 위해 아세틸화된 α 튜불린에 대한 단클론 마우스 항체(1:100 희석)와 40℃에서 밤새 배양하였다. 일단 세포를 1X PBS 완충제로 3회 세척한 후(10분/세척), 2차 항체 - TUJ-1 항체의 경우 Texas Red^® 염소 항 토끼 IgG(1:200 희석) 및 아세틸화된 α 튜불린 항체의 경우 Alexa Fluor^® 488 염소 항 마우스 IgG(1:2 200 희석) - 를 첨가하고 밤새 40℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 1X PBS 완충제(10분/세척) 및 1 ㎍/㎖ 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌로 3회 세척하고; 다이락테이트(DAPI)를 세포 핵 염색을 위한 두 번째 세척 단계 후에 첨가하였다. 최종 세척 후, 형광 현미경을 사용하여 검사하고자 하는 세포를 준비하였다. 여기 및 방출 파장은 Alexa Fluor® 488-IgG(녹색)의 경우 488 ㎚/519 ㎚, Texas Red® 염소 항토끼 IgG(적색)의 경우 595/615 ㎚, 및 DAPI의 경우 405/461 ㎚이다. 세포의 형광 이미지를 다양한 배율로 획득하고 "ImageJ" 이미지 처리 및 분석 프로그램(Public Domain by Wayne Rasband, NIH, Bethesda, Maryland, USA)으로 분석하였다.

실시예 2 - 결과

실시예 2.1 - PTEN 인산화 부위를 주형으로 사용하여 TGN 펩타이드를 설계하였다.

생체내에서 지질 포스파타제로서 PTEN 활성을 차단하는 것은 신경 손상 후 축삭돌기 재생에 유효한 것으로 공지되어 있다(문헌[Park et. al 2008], 문헌[Christie et. al 2012]). 우리는 세포막 표면상의 PTEN 국소화를 차단하는 잠재적인 PTEN 억제제를 설계하기 위해 PTEN-막 회합 기전을 조사하였다. 이전 연구에 따르면(문헌[Lee et. al 1999]; 문헌[Leslie et. al 2008]), PTEN 단백질은 포스파타제 도메인과 C2 도메인의 2개의 기능적 도메인을 가지고 있으며, 또한 C-말단 영역에 "인산화 부위"를 가지고 있고, 이는 인산화-탈인산화 과정을 통해 PTEN 단백질의 입체형태적 변화를 조절하는 "스위치" 역할을 한다(문헌[Das et. al 2003]; 문헌[Leslie et. al 2008]). PTEN의 완전한 지질 포스파타제 활성을 위해, PTEN-막 회합 전에 PTEN 입체형태를 변화시키기 위해 "인산화 부위에서 인산화된 세린/티로신 잔기의 탈인산화가 일어나야 한다. N-말단 PIP2 결합 모티프 및 C-말단 PDZ 도메인 결합 모티프를 통한 추가적인 결합은 완전한 PTEN 활성에 필요한 적절한 위치의 세포막상에 PTEN 단백질을 국소화한다(문헌[Walker et. al 2004]; 문헌[Molina et. al 2010]). 따라서, 우리는 PTEN "인산화 부위"와 PDZ-도메인 결합 모티프를, PTEN-막 회합을 방해함으로써 TGN 펩타이드를 잠재적인 PTEN 억제제로 설계하기 위한 주형으로서 사용하기로 결정하였다(도 1a).

TGN-1 펩타이드는 "인산화 부위"의 아미노산 서열(365-388)을 모방하고 TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는 "인산화 부위" 및 PDZ 도메인 결합 모티프(399-403)를 포함하는 C-말단 영역의 아미노산 서열(376-403)을 모방한다. "인산화 부위"의 세린 잔기에서의 인산화는 PTEN 입체형태 변화에 중요하기 때문에(문헌[Leslie et. al 2008]; 문헌[Odriozola et. al 2007]), TGN-1 펩타이드를 "인산화 부위" 내부에 인산화된 3개의 세린 잔기(Ser 370, Ser380 및 Ser385)를 포함하도록 변형시킨다. TGN-2 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)를 포함한다. TGN-3 펩타이드에서 비교를 위해 2개의 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)를 발린으로 교환하였다. TGN-4 및 TGN-5 펩타이드를 각각 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드 서열을 뒤섞도록 설계하였다. 모든 TGN 펩타이드를 또한, 세포막 투과성을 증가시키기 위해 N-말단에 펩타이드 전달 도메인(PTD)으로서 8개의 아르기닌 잔기를 포함하도록 변형시켰다(도 1b).

실시예 2.2 - TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 시험관내 PTEN 활성에 대해 특이적 억제 효과를 나타낸다.

합성된 TGN 펩타이드를, 시험관내 PTEN 활성 분석을 사용하여 PTEN 억제 효과에 대해 시험하였다. 다이-옥타노일 포스파티딜이노시톨 3,4,5 트라이포스페이트(diC8-PIP₃)를 PTEN의 기질로 선택하였고 2개의 상이한 인지질 - 다이올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) 및 다이올레오일 포스파티딜세린(DOPS)을 갖는 지질 소포(리포솜)로서 제조하였다. 지질을 리포솜 완충제와 혼합하였으며 이는 초음파 처리에 의해 리포솜으로 되었다(총 지질 농도 = 0.6 mM). 제조된 리포솜(0.1 mM의 다이-C8 PIP₃)을 실온에서 30분 동안 20 ng의 재조합 인간 PTEN 단백질과 함께 배양하여 C8-PIP3를 C8-PIP2로 전환하고 포스페이트 이온을 생성시킴으로써 PTEN 활성을 분석하였다. PTEN에 의해 생성된 포스페이트 이온을 말라카이트 그린 시약 키트를 사용하여 측정하였다(도 2a). 10 μM의 각 TGN 펩타이드를 PTEN 활성에 대한 억제 효과에 대해 조사하였다. 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드 둘 다 PTEN 활성을 유의하게 차단하였다(PTEN 활성은 양성 대조군과 비교하여 TGN-1에서 54% 및 TGN-2에서 31%로 감소되었다). 다른 한편으로, TGN-2 펩타이드는 TGN-1 또는 TGN-2(86%)에 비해 제한된 억제를 보였다. 또한, TGN-4 및 TGN-5 펩타이드 모두 PTEN 활성의 유의한 억제를 나타내지 않았으며, 이는 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드에 의한 PTEN 억제가 서열-특이적임을 나타낸다. 재조합 PTEN 단백질 및 다이C8-PIP₃ 지질 분자를 사용한 시험관내 PTEN 활성 분석은 유일하게 PTEN 활성을 나타내지 못하였다(데이터는 나타내지 않음).

TGN 펩타이드에 대한 IC₅₀ 값을 또한 용량 의존적 방식(0 내지 100 μM 범위)으로 TGN 펩타이드를 사용한 시험관내 PTEN 활성을 사용하여 측정하였다. TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드에 대해 계산된 IC₅₀ 값은 각각 19.93 μM, 87.12 μM 및 4.83 μM이었다(도 2c).

실시예 2.3 - TGN-1 펩타이드는 생체내에서 PI3K-Akt 신호전달 경로를 촉진한다.

신경 세포에서 PI3K 신호전달 경로에 대한 TGN-1 펩타이드의 효과를 PC12 래트 갈색세포종 세포주를 사용하여 측정하였다. PTEN 과발현을 위해 PTEN c-DNA로 형질감염되거나 자연 상태의 분화된 PC12 세포를 TGN-1 펩타이드(10 μM 및 100 μM) 또는 TGN-4 펩타이드(10 μM)와 함께 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 도 3a의 다이어그램에서 볼 수 있는 바와 같이, TGN-1 펩타이드가 실제로 PTEN 활성을 차단하고 PI3K 활성에 대한 PTEN의 길항 효과를 억제한다면 PI3K 신호전달 경로에서 Akt 단백질의 활성화(인산화) 수준이 증가해야 한다. 항-포스포 Akt 단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯 데이터는 TGN-1 펩타이드로 처리된 PC12 세포에서 내인성 Akt 단백질의 활성화(인산화) 수준이 TGN-1 펩타이드 용량 의존적 방식으로 증가함을 보여주었다(도 3b 및 3C). TGN-4 펩타이드 또는 DMSO로 처리된 PC12 세포는 AKT 단백질의 활성화 수준을 증가시키지 않았으며, 이는 Akt 단백질 인산화 수준의 촉진이 TGN-1 펩타이드에 의해 특이적으로 촉발되었음을 시사한다. 내인성 PTEN(도 3b) 또는 과발현된 PTEN(도 3c)의 발현 수준이 TGN 펩타이드 또는 DMSO 처리시 활성에 차이가 없음을 보여주었으므로, TGN-1 펩타이드가 PTEN 활성을 특이적으로 억제하여 PI3K 신호전달 경로에 대한 PTEN의 하향-조절 효과를 억제하고 PI3K-Akt 신호전달 경로를 촉진하는 것이 분명하다.

실시예 2.4 - TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 신경세포 배양에서 신경보호를 포함한 신경영양 효과를 나타낸다

우리는 분화된 신경 세포에서 신경돌기 퇴화에 대한 TGN 펩타이드의 효과를 조사하였다. 세포를 노코다졸과 접촉시켜 세포의 신경돌기 미세소관 역학을 방해함으로써 PC12 세포에서 신경돌기 퇴화를 유도하였다. 분화된 래트 PC12 세포를 먼저 노코다졸(0.5 μM)로 처리하고 NGF(50 ng/㎖) 및 TGN 펩타이드(100 μM)를 함유하는 신선한 배지와 함께 72시간 동안 배양하였다. 2개의 상이한 튜불린 항체(안정된 신경돌기에 대한 아세틸화 튜불린 항체 및 전체 신경돌기에 대한 TUJ-1 β-튜불린 항체)를 사용한 면역형광 분석은 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 미세소관 안정화를 통해 노코다졸-유발된 신경돌기 퇴화를 명확하게 지연시킨다는 것을 입증하였다(도 4a). 우리는 PC12 세포의 신경돌기 증식에 대한 TGN 펩타이드의 효과를 추가로 조사하였다. 분화하는 PC12 세포에 TGN 펩타이드를 첨가하면 실제로 신경돌기 발달이 촉진되었다(TGN-1에 의해 2.4배 증가 및 TGN-2에 의해 1.6배 증가, 도 4b). 종합하면, 우리의 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 퇴화로부터 성숙한 신경돌기를 보호하는 활성뿐만 아니라 신경영양 효과를 나타낸다.

실시예 3 - 척수 치료 - 물질 및 방법

실시예 3.1 - 동물 및 분류

체중 250 ± 10 g(12주령, n=30)의 성체 수컷 Sprague-Dawley 래트를 상업적 육종가(Orient Co., Seoul, Korea)로부터 입수하였다. 래트를 하기 3개의 그룹(각 그룹당 n=10 마리)으로 무작위 분류하였다: 모의-수술 그룹, 척수 손상(SCI)-유발 그룹, SCI-유도 및 TGN-2(PTEN 억제제)-처리 그룹. 실험 절차는 국립보건원(NIH)의 동물 관리 지침에 따라 수행되었으며, 경희대학교 동물 실험 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다[KHUASP[SE]-17-093].

실시예 3.2 - 척수 손상 유도 및 치료

SCI 모델을 이전에 기재된 방법(문헌[Kim et al., (2019)])에 따라 유도하였다. 래트를 수술 중 아이소플루란(30% O2 및 70% N2 중의 2% 아이소플루란, JW Pharmaceutical, Seoul, Korea) 흡입에 의해 마취시켰다. 추궁절제술을 수행하여, 경질막을 방해하지 않고 척수를 흉부 수준 T9-10으로 노출시켰다. 뉴욕 대학교 Impactor System(NYU Impactor, New York, NY, USA)을 사용하여 노출된 경막에 2.5 ㎝ 높이에서 10 g의 임팩터를 떨어뜨려 타박상을 생성시켰다. 수술 중 저체온증을 방지하기 위해 몸과 머리를 감싸는 온혈동물용 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus, Massachusetts, MA, USA)을 사용하여 수술 중 체온과 직장 온도를 36±0.5℃로 유지시켰다. 또한, 수술 후 추가로 2시간 동안 모니터링하였다. 모의 수술 그룹의 동물은 피부 절개 후 척수를 손상시키지 않은 것을 제외하고는 동일하게 처리되었다.

SCI 유도 후 3일차부터 시작하여, TGN 처리 그룹에게 TGN-2를 14일 동안 2일마다 1회씩 7회 척수 손상 부위에 직접 투여하였다(도 6).

실시예 3.3 - BBB 스케일 검사

기능 분석을 먼저 이전에 확립된 행동 검사(문헌[Basso et al., (1995)])에 따라 Basso, Beattie 및 Bresnahan(BBB) 운동 척도를 사용하여 평가하였다. SCI 유도 후 7, 11 및 15일차에 분석을 수행하였다. 실험 그룹에 맹검인 4명의 연구원이 각 피험자의 보행, 걸음걸이, 사지 운동 협응, 발 위치 및 공간, 꼬리 활동 및 신체 안정성을 소음이 없는 야외 경기장에서 5분 동안 관찰하였다.

실시예 3.4 - 수평 사다리 보행 검사

운동 기능과 협응력의 변화를 평가하기 위해서, 기존 연구 방법(문헌[Schira et al., (2012)])에 따라 수평 사다리 보행 검사를 수행하였다. 검사를 SCI 유도 15일차(6차 TGN 처리 후)에 측정하였다. 간단히 말해서, 각 실험 동물은 둥근 금속 막대 사이에 2 ㎝ 간격으로 설계된 1.5 m 길이의 사다리 막대를 건너도록 허용되었다. 사다리를 걷는 동안 동물의 뒷다리 위치가 올바른지, 앞발과 뒷발이 유기적으로 협응을 이루는지 평가하였다. 포인트 이동 불가시 최대 실수 횟수는 20이다. 실수 횟수에 따라 0 내지 1은 10점, 2 내지 5는 7점, 6 내지 9는 4점, 10 내지 20은 1점이 주어졌다.

실시예 3.5 - 세포측정법

배뇨 기능을 이전에 기재된 바와 같이 수술 18일 후에 방광내압측정에 의해 평가하였다(문헌[Ko et al., 2018]). 래트를 Zoletil 50®(10 ㎎/㎏, 복강내; Vibac Laboratories, Carros, France)로 마취시켰다. 커프가 있는 멸균 폴리에틸렌 카테터(PE50)를 방광에서 복부 정중선 절개를 통해 돔내에 삽입하고 쌈지 봉합에 의해 적소에 고정하였다. 카테터를 압력 변환기(Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)와 주사기 펌프(Harvard Apparatus)에 3-웨이 스톱코크를 통해 연결하여 방광내 압력을 기록하고 식염수를 방광에 주입하였다. 방광을 비운 후 0.5 ㎖의 식염수를 주입하여 방광내압측정을 수행하였다. 방광 및 배뇨 기능을 Labscribe 소프트웨어(iWorx/CB Science Inc., Dover, DE, USA)를 사용하여 모니터링하였다.

실시예 3.6 - 조직 표본

방광내압측정 직후, 실험 동물을 조직 수집을 위해 희생시켰다. 이전에 기재된 바와 같이 조직 표본을 준비하였다(문헌[Ko et al., (2018)]; 문헌[Kim et al., 2018]). 래트를 Zoletil 50®(10 ㎎/㎏, 복강 내; Virbac Laboratories)을 사용하여 마취시켰다. 래트를 50 mM 포스페이트-완충된 식염수(PBS)로 경심장 관류시킨 다음, pH 7.4의 100 mM 인산나트륨 완충제 중 4% 파라포름알데하이드로 관류시켰다. 척수를 제거하고 동일한 고정액에 밤새 후고정하고, 동결 보호를 위해 30% 슈크로스 용액으로 옮겼다. 동결 마이크로톰(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 일련의 40 ㎛-두께의 수평 절편을 만들었다. 척수는 손상 부위에 걸친 영역으로부터 선택되었다. 각 영역에서 평균 4개의 절편을 각각의 래트로부터 수집하였다.

실시예 3.7 - H&E 염색에 의한 조직학적 변화의 분석

H&E 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Lim et al., (2018)]). 슬라이드를 Mayer의 헤마톡실린(DAKO, Glostrup, Denmark)에 1분 동안 담갔다가 수돗물로 등명해질 때까지 세정하고, 에오신(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 20초 동안 담갔다가 다시 물로 세정하였다. 슬라이드를 하기의 용액에 두 번 담갔다: 95% 에탄올, 100% 에탄올, 50% 에탄올, 50% 자일렌 용액 및 100% 자일렌. 마지막으로, Permount®(Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 커버슬립을 올려놓았다.

H&E 염색된 슬라이드의 이미지를 광학 현미경(Olympus BX61, Tokyo, Japan)에 부착된 Image-Pro® plus 컴퓨터-지원 이미지 분석 시스템(Media Cyberbetics Inc., Silver Spring, MD, USA)으로 촬영하였다. 슬라이드의 정체를 모르는 조사관이 이미지를 평가하였다.

실시예 3.8 - 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅을 앞서 기재한 방법(문헌[Lee et al., 2020)])에 따라 수행하였다. 방광 조직을 1 mM PMSF(Sigma Aldrich, ST Louis, MO, USA)가 포함된 냉각된 RIPA 완충제(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, USA)에서 균질화한 다음 4℃에서 30분 동안 14,000rpm에서 원심분리하였다. 단백질 함량을 μ-드롭 판독기(Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)를 사용하여 측정하였다. 이어서, 30 ㎍ 단백질을 SDS-PAGE 젤상에서 분리하고 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 1차 항체에는 항-마우스 NGF 항체, 항-마우스 VEGF 항체, 항-토끼 BDNF 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)가 포함되었다.

2차 항체는 하기와 같았다: NGF, VEGF에 대한 양고추냉이 페록시다제-접합된 항-마우스 항체(1:5000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA); BDNF에 대한 항-토끼 항체(1:5000; Vector Laboratories). 양고추냉이 페록시다제(HRP)-접합된 IgG(1:2000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 및 향상된 화학발광(ECL) 검출 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 블롯 멤브레인을 검출하였다. 상대적인 단백질 발현을 비교하기 위해서, Image-Pro® 플러스 컴퓨터 지원 이미지 분석 시스템(Media Cybernetics Inc)을 사용하여 밀도측정법에 의해 상기 검출된 밴드를 계산하였다. 상대적인 정량분석을 위해서, 모의-수술 그룹의 결과를 1.00으로 설정하였다.

실시예 3.9 - 데이터 분석

데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차로 나타낸다. 그룹간 비교를 위해서, 일원 분산분석 및 Duncan의 사후검정을 수행하였으며, P-값 < 0.05는 그룹간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 간주되었다.

실시예 4 - 척수 손상으로 인한 병태에 대한 TGN-2 효과의 결과

실시예 4.1 - 기능 회복의 변화(BBB 척도 및 사다리 검사)

BBB 검사의 기능 회복을 도 7a에 나타낸다. SCI의 유도는 모의 수술 그룹에 비해 BBB 검사에서 BBB 오픈 필드 운동 점수를 감소시켰다(P<0.05). 그러나, TGN-2 처리는 BBB 오픈 필드 운동 점수 증가와 함께 SCI-유발된 기능 불균형을 개선시켰다. TGN-2 처리에 의한 개선 효과는 주사 횟수에 따라 증가하였다.

도 7b는 수평 사다리 검사를 통한 운동기능 및 협응 능력 분석 결과를 도시한다. SCI의 유도는 사다리 보행 점수를 감소시킨 반면, TGN 처리는 SCI에 의한 감소된 사다리 보행 점수를 향상시켰다. 이러한 결과는 TGN 투여가 SCI에 의해 감소된 운동 기능과 협응력을 증가시켜 SCI의 회복을 촉진한다는 것을 의미한다.

실시예 4.2 - 방광내압측정에서 배뇨 기능의 변화

방광내압측정으로부터의 배뇨 기능을 도 8에 나타낸다. SCI의 유도는 방광 수축 압력(CP), 수축 시간(CT) 및 수축간 간격(ICI)을 증가시켰다. SCI 손상 후 CP와 CT는 모의 그룹에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). SCI 그룹의 ICI는 모의 그룹에 비해 유의하게 증가하였다(P<0.05). TGN-2 투여 후 CP와 CT는 SCI 그룹에 비해 유의하게 증가하였다(P<0.05). SCI 그룹의 ICI는 SCI 그룹과 비교하여 유의하게 증가하였다(P<0.05). 모의 그룹과 비교하여, TGN-2 투여 후 CP, CT, 및 ICI에서 유의한 차이가 관찰되었다(p<0.05).

실시예 4.3 - 척수 조직의 조직학 변화

척수손상 유도 18일 후 척수 조직의 조직학적 변화 양상을 도 9에 나타낸다. 정상적인 모양의 척수 조직이 모의-수술 그룹에서 관찰되었다. SCI 그룹에서, 조직학 사진은 등쪽 영역에 완전히 파열된 병변을 보였다. 그러나, TGN-2 처리는 척수 손상으로 유발된 파괴 병변을 감소시켰고, 손상된 조직 주위에 새로운 조직이 나타나 증가하였다.

실시예 4.4 - 방광 조직에서 VEGF, NGF 및 BDNF 발현의 변화

우리는 TGN 처리가 VEGF, NGF 및 BDNF 발현에 미치는 영향을 조사하여 SCI를 개선시키는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다(도 10a 내지 10c). SCI의 유도는 척추 손상 부위 조직에서 VEGF, NGF 및 BDNF 발현을 증가시켰다(P<0.05). 그러나, TGN 처리는 SCI 유도에서 과발현되는 VEGF, NGF 및 BDNF의 발현을 억제하였다(P<0.05). 이러한 결과는 TGN의 처리가 SCI 유도에 의해 증가되는 과도한 보상 반응을 억제함을 가리킨다.

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SEQUENCE LISTING <110> Kolon TissueGene, Inc. <120> TREATMENT OF SPINAL CORD INJURY WITH PTEN INHIBITOR <130> 16891-060WO0 <140> PCT/US2021/062042 <141> 2021-12-06 <150> US 63/121,336 <151> 2020-12-04 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN amino acid sequence <400> 1 Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile 20 25 30 Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn 35 40 45 Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His 50 55 60 Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys 65 70 75 80 Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu 100 105 110 Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys 115 120 125 Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys 130 135 140 Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr 145 150 155 160 Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr 165 170 175 Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala 180 185 190 Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly 195 200 205 Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile 210 215 220 Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr 225 230 235 240 Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu 245 250 255 Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His 260 265 270 Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu 275 280 285 Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys 290 295 300 Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu 305 310 315 320 Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr 325 330 335 Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu 340 345 350 Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp 355 360 365 Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp 370 375 380 Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile 385 390 395 400 Thr Lys Val <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD (peptide transfer domain) <400> 2 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGN-1 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Ser is phosphorylated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ser is phosphorylated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Ser is phosphorylated <400> 3 Val Thr Pro Asp Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser 1 5 10 15 Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu 20 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Ser is phosphorylated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Ser is 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28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-3 <400> 7 His Tyr Arg Tyr Val Asp Thr Thr Asp Val Asp Pro Glu Asn Glu Pro 1 5 10 15 Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile Thr Lys Val 20 25 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-3 <400> 8 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Arg Tyr Val Asp Thr Thr 1 5 10 15 Asp Val Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln 20 25 30 Ile Thr Lys Val 35 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-4 <400> 9 Ser Asp Asp Glu Tyr Thr Asp Asn Pro Asp Ser Arg Tyr Val Ser Asp 1 5 10 15 Thr Pro Val Asp Thr Glu His 20 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-4 <400> 10 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Asp Asp Glu Tyr Thr Asp Asn 1 5 10 15 Pro Asp Ser Arg Tyr Val Ser Asp Thr Pro Val Asp Thr Glu His 20 25 30 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-5 <400> 11 Asp Glu His Asp Thr Glu Tyr Thr Pro Asp Tyr Arg Gln Glu Thr His 1 5 10 15 Phe Asn Ser Gln Pro Thr Asp Lys Ser Asp Val Ile 20 25 <210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD attached at the N-terminus of TGN-5 <400> 12 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Glu His Asp Thr Glu Tyr Thr 1 5 10 15 Pro Asp Tyr Arg Gln Glu Thr His Phe Asn Ser Gln Pro Thr Asp Lys 20 25 30 Ser Asp Val Ile 35

Claims (13)

1. 신경 손상 부위에서 신경을 재생시키거나 또는 신경의 퇴화를 감쇠시키는 것을 포함하는 척수 손상의 치료 방법으로서,
   손상된 신경에 또는 그 근처 영역에 신경 재생량 또는 신경 퇴화 감쇠량의 포스파타제 및 텐신 동족체(phosphatase and tensin homolog, PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   PTEN 억제제 펩타이드는, 인산화 부위의 세린 또는 트레오닌이 인산화되도록 인산화 부위가 변형된, 변형된 PTEN 펩타이드 또는 그의 단편인, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   인산화된 세린 또는 트레오닌이 Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 또는 Ser-385 위치에 위치하는, 방법.
4. 제1항에 있어서,
   인산화된 세린 또는 트레오닌이 Ser-370, Ser-380 및/또는 Ser-385 위치에 위치하는, 방법.
5. 제3항에 있어서,
   인산화된 세린 또는 트레오닌이 Ser-370, Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치하는, 방법.
6. 제3항에 있어서,
   인산화된 세린 또는 트레오닌이 Ser-380 및 Ser-385 위치에 위치하는, 방법.
7. 제1항에 있어서,
   펩타이드가, 인산화 부위 및/또는 PDZ 도메인 결합 모티프(motif)의 펩타이드 단편인, 방법.
8. 제1항에 있어서,
   펩타이드가 펩타이드 전달 도메인(peptide transfer domain, PTD)을 또한 포함하는, 방법.
9. 제1항에 있어서,
   신경 손상이 중추 신경계에 있는, 방법.
10. 신경 손상 부위에서 신경을 재생시키거나 또는 신경의 퇴화를 감쇠시키는 것을 포함하는, 척수 손상과 연관되거나 또는 이에 의해 야기된 병태의 치료 방법으로서,
    손상된 신경에 또는 그 근처 영역에 신경 재생량 또는 신경 퇴화 감쇠량의 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 지질 포스파타제 억제 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    병태가 신경인성 방광(neurogenic bladder)인, 방법.
12. 제11항에 있어서,
    병태가 운동 기능 상실인, 방법.
13. 제11항에 있어서,
    병태가 운동 협응력의 상실인, 방법.