ES2826429T3 - Síntesis de ácido desoxicólico (DCA) - Google Patents

Abstract

Método de preparación de un compuesto de fórmula 12: **(Ver fórmula)** en la que P es un grupo protector y R es alquilo, comprendiendo dicho método hacer reaccionar un compuesto de fórmula 11: **(Ver fórmula)** en la que P y R se definen como en la fórmula 12, con LiAl(OtBu)3H para proporcionar un compuesto de fórmula 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Síntesis de ácido desoxicólico (DCA)

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a un método de preparación de determinados ácidos biliares y productos intermedios de ácidos biliares. De forma específica se refiere a los métodos definidos en las reivindicaciones adjuntas. Cabe destacar que los ácidos biliares producidos mediante el método de la invención no se aíslan a partir de organismos mamíferos y microbianos que producen de forma natural estos ácidos y, por lo tanto, se encuentran libres de cualesquiera toxinas y contaminantes asociados con tales organismos. La presente invención se refiere a la síntesis de ácido desoxicólico y sales farmacéuticamente aceptables y productos intermedios del mismo.

Antecedentes de la invención

La colanología, el estudio de los ácidos biliares, y en particular la química del ácido biliar ha resultado de interés durante casi todo un siglo. A pesar de que se sabe mucho, la química del ácido biliar comporta una amplia diversidad de entidades químicas, muchas con unas propiedades sorprendentes. Para una revisión, véase, por ejemplo, Mukhopadhyay, S. y U. Maitra., Current Science 87: 1666 - 1683 (2004) (“Chemistry and biology of bile acids’’).

Los ácidos biliares se caracterizan por dos unidades de conexión, un núcleo de esteroide rígido y una cadena lateral alifática corta (véase la figura 1 de la presente solicitud). Véase, Hofmann, A. F., y col. Para una nomenclatura propuesta para los ácidos biliares, véase J. Lipid Res. 33: 599 - 604 (1992). Tanto el núcleo como la cadena lateral tienen un gran número de posibles disposiciones estéricas. El núcleo puede alterarse mediante la expansión o la contracción de anillos individuales, y la cadena lateral puede acortarse o alargarse. Además, ambas partes de la molécula de ácido biliar tienen un gran número de posibles sustituyentes polares. Pueden encontrarse presentes grupos ionizantes en el núcleo o la cadena lateral. Por último, pueden encontrarse presentes grupos de conjugación en el núcleo (por ejemplo, sulfato, glucuronato, fosfato) o en la cadena lateral (glicina o taurina u otros aminoácidos, o incluso azúcares). La estructura de la cadena lateral determina la clase del compuesto (ácidos biliares o sales biliares).

Los ácidos biliares son anfifílicos, teniendo tanto una “cara” anfifílica como una anfipática:

Hofman, A. F., News Physiol. Sci. 14: 24 - 29 (1999) (“Bile Acids: The good, the Bad, and the Ugly", en p. 25, figura 1).

Por convención, la superficie hidrófoba se denomina la “cara p” y la superficie hidrófila se denomina la “cara a”. La cara p es liposoluble y la cara a es relativamente polar, en general. Hay ácidos biliares, tales como los que tienen grupos polares (grupos hidroxilo, en ácidos biliares de origen natural) sobre la cara hidrófoba así como sobre la cara hidrófila, por ejemplo, ácido ursodesoxicólico. La naturaleza anfipática de la molécula es responsable de la formación por parte de esta de micelas mixtas con lípidos anfipáticos pero insolubles en agua, tales como la fosfatidilcolina. Los ácidos biliares no solubilizarán lípidos dietéticos en forma de micelas mixtas a menos que los ácidos biliares se encuentren por encima de una concentración crítica, que se denomina la concentración crítica de micelación.

Los ácidos biliares que se hallan en la mayor proporción en los seres humanos son el ácido quenodesoxicólico y el ácido desoxicólico. El ácido desoxicólico también se conoce como desoxicolato, ácido colanoico y 3a,12a-dihidroxi-5p-colanato. En el cuerpo humano, el ácido desoxicólico se usa en la emulsificación de grasas para la absorción en el intestino. En la investigación, el ácido desoxicólico se usa como un detergente suave para el aislamiento de proteínas asociadas a membrana. Cuando es sustancialmente puro, el ácido desoxicólico es una forma de polvo cristalino de color blanco a blanco apagado. El ácido desoxicólico es uno de los cuatro ácidos principales producidos por el hígado. Este es soluble en alcohol y ácido acético. El número CAS para el ácido desoxicólico es [83-44-3].

La eliminación rápida de la grasa corporal es un antiguo ideal, y se ha afirmado que muchas sustancias logran tales resultados, a pesar de que pocas han mostrado resultados. La “mesoterapia”, o el uso de inyectables para la eliminación de grasa, no está aceptada de forma generalizada entre los facultativos médicos debido a las preocupaciones de seguridad y de eficacia, a pesar de que se han realizado afirmaciones homeopáticas y cosméticas desde la década de 1950. La mesoterapia se concibió originalmente en Europa como un método de utilización de inyecciones cutáneas que contienen una mezcla de compuestos para el tratamiento de estados médicos y cosméticos locales. A pesar de que la mesoterapia se empleó tradicionalmente para el alivio del dolor, sus aplicaciones cosméticas, en particular la eliminación de grasas y la celulitis, han recibido recientemente atención en los Estados Unidos. Un tratamiento notificado de este tipo para una reducción de la grasa localizada, que se popularizó en Brasil y usa inyecciones de fosfatidilcolina, se ha considerado de forma errónea sinónimo de la mesoterapia. A pesar de su atractivo como una presunta inyección de “disolución de grasa”, la seguridad y la eficacia de estos tratamientos cosméticos sigue siendo ambigua para la mayor parte de los pacientes y médicos. Véase, Rotunda, A. M. y M. Kolodney, Dermatologic Surgen/ 32: 465 - 480 (2006) (“Mesotherapy and Phosphatidylcholine Injections: Historical Clarification and Review").

El documento WO 2006/133160 describe métodos de lipoescultura, por ejemplo, la reducción de un depósito de grasa, mediante la administración de un antagonista del receptor del neuropéptido Y al sitio del depósito de grasa. Kolonin M. G. y col., Nat. Med. junio 10 (6): 625 - 32 (2004), describe péptidos pro-apoptóticos selectivos de grasa que tienen unos potentes efectos de destrucción de adipocitos. Los péptidos pro-apoptóticos que se describen requieren acceso a la vasculatura para destruir.

Literatura de publicación reciente informa de que el ácido desoxicólico presenta propiedades de eliminación de grasa cuando se inyecta en depósitos grasos in vivo. Véanse los documentos WO 2005/117900 y WO 2005/112942, así como US2005/0261258; US2005/0267080; US2006/127468; y US20060154906. El desoxicolato que se inyecta en tejido graso tiene dos efectos: 1) este destruye adipocitos por medio de un mecanismo citolítico; y 2) este da lugar a un estiramiento de la piel. Ambos de estos efectos son requeridos para mediar en las correcciones estéticas deseadas (es decir, el modelado del cuerpo). Debido a que el desoxicolato que se inyecta en grasa se inactiva rápidamente mediante la exposición a una proteína y a continuación vuelve rápidamente a los contenidos intestinales, sus efectos están espacialmente restringidos. Como resultado de este efecto de atenuación que confiere seguridad clínica, por lo general las terapias de eliminación de la grasa requieren 4 -6 sesiones. Esta eliminación de la grasa localizada sin la necesidad de cirugía es beneficiosa no solo para el tratamiento terapéutico en relación con los depósitos de grasa localizada patológica (por ejemplo, dislipidemias que sobrevienen como resultado de la intervención médica en el tratamiento del VIH), sino también para una eliminación cosmética de la grasa sin el consiguiente riesgo inherente en cirugía (por ejemplo, liposucción). Véase, Rotunda y col., Dermatol. Surgery 30: 1001 - 1008 (2004) (“Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution") y Rotunda y col., J. Am. Acad. Dermatol. 2005: 973 - 978 (“Lipomas treated with subcutaneous deoxycholate injections").

Las preparaciones de ácido biliar de calidad farmacéutica se encuentran comercialmente disponibles con un coste relativamente bajo. Este bajo coste se debe al hecho de que los ácidos biliares se obtienen a partir de carcasas de animales, en particular animales grandes tales como ganado vacuno y ovino. Cabe destacar que, al igual que con todos los medicamentos a partir de fuentes animales, existe la preocupación de que los productos de ácido biliar derivados de animales puedan contener patógenos animales y otros agentes nocivos tales como toxinas y metabolitos animales o microbianos, incluyendo toxinas bacterianas tales como pirógenos.

Tales patógenos animales pueden incluir priones, que se cree que son un tipo de proteína patogénica infecciosa que puede dar lugar a enfermedades priónicas. Las enfermedades priónicas son trastornos degenerativos del sistema nervioso. Una enfermedad de este tipo, la enfermedad de las “vacas locas” (que se cree que es una variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ)), se cree que está causada por un prión presente en carne de ternera comestible procedente de ganado vacuno enfermo. La mayor parte de los casos son esporádicos con un modo desconocido de transmisión; algunos casos son heredados; y un pequeño número se ha transmitido por procedimientos médicos. La difusión de las enfermedades priónicas humanas a través del consumo de material infectado se ha implicado históricamente en el kuru y recientemente en la ECJ variante. Otras enfermedades priónicas animales (tembladera de ganado ovino, encefalopatía de visón transmisible, enfermedad consuntiva crónica de cérvidos, y encefalopatía espongiforme bovina) parecen ser, todas ellas, de transmisión lateral mediante el contacto con animales infectados o mediante el consumo de pienso infectado. La evaluación de riesgos y las predicciones de eventos futuros en relación con las enfermedades priónicas son difíciles de establecer debido a los diferentes modos de transmisión, las impredecibles barreras entre especies, la distribución variable de la infecciosidad en los tejidos y las variaciones de cepas que se hallan en algunas enfermedades.

En general, los productos animales pueden exponerse a organismos microbianos que producen pirógenos (sustancias que causan fiebre). Los contaminantes bacterianos de productos alimentarios y /o farmacéuticos también son un grave problema, tal como se pone de manifiesto por la contaminación de alimentos por E. coli enterohemorrágica. En tal contaminación se han implicado productos tales como carnes derivadas de ganado vacuno así como productos tales como manzanas, espinacas y similares. En tales casos, es la toxina producida por la bacteria (en lugar de la propia bacteria) la que produce efectos adversos en los seres humanos. Tales efectos adversos incluyen diarrea severa, insuficiencia renal, y en las situaciones extremas, la muerte. Las endotoxinas bacterianas, un tipo de pirógeno, han de excluirse sustancialmente de todas las composiciones farmacéuticas.

Los productos animales se purifican en general mediante un proceso de eliminación, es decir, en lugar de seleccionar el producto final de entre una mezcla, el producto final es el material que queda después de la exclusión de impurezas. Y, además de los restos animales potenciales tales como patógenos, otro artefacto de purificación con respecto a las fuentes animales es que el producto final sea una mezcla de uno o más ácidos biliares. Por ejemplo, las preparaciones comerciales del ácido desoxicólico contienen algo de ácido quenodesoxicólico, así como ácido cólico, que es un precursor tanto del ácido desoxicólico como del ácido quenodesoxicólico en la síntesis de ácido biliar de mamíferos. Debido a que la proporción exacta de desoxi / queno / cólico no se selecciona previamente, esto puede dar como resultado una variación de lote a lote cuando se contempla la fabricación de grandes cantidades de ácidos biliares. Tal variación de lote a lote puede ser problemática y puede ocasionar etapas adicionales en la obtención de aprobaciones reglamentarias o control de calidad, en particular en los esfuerzos para producir una composición farmacéutica. Obviamente, los productores desearían una capacidad de predicción de lote a lote en la fabricación de composiciones farmacéuticas de ácido biliar.

En la actualidad, las preocupaciones con respecto a los productos derivados de animales que contienen patógenos animales y otros agentes nocivos se han abordado al tomar como fuente animales aislados e inspeccionados. Por ejemplo, el ácido desoxicólico a partir de animales en Nueva Zelanda es una fuente de ácidos biliares para uso humano bajo los regímenes reglamentarios de EE. UU., siempre que los animales sigan permaneciendo aislados y libres por lo demás de patógenos observables.

De forma implícita, acompaña a la necesidad de tal régimen reglamentario controlado por el gobierno el reconocimiento de un riesgo intrínseco de transmisión de patógenos animales cuando se inyectan medicamentos derivados de animales. En donde no se encuentren disponibles alternativas de medicamentos no animales, el régimen reglamentario del gobierno ya no es necesario. Un ejemplo de tal alternativa (un medicamento no animal sustituyendo a un medicamento derivado de animales) y de ventajas asociadas es la insulina para uso humano. La fabricación de insulina de vacuno en los Estados Unidos se abandonó en 1998, y la insulina de cerdo para uso humano se abandonó en enero de 2006. A pesar de que puede obtenerse insulina animal a partir de rebaños que no se sepa que hayan estado sometidos a exposición a agentes que causen BSE u otros agentes patogénicos, las instalaciones o procesos de fabricación pueden exponer los ingredientes animales a animales que hayan tenido exposición a los patógenos. El riesgo de transmisión de agentes patogénicos a los seres humanos puede eliminarse con el uso de insulina que se fabrique de forma recombinante o sintética. Para los consumidores, la situación de la insulina es instructiva: cuando se encuentre libremente disponible un material sintético, el riesgo de transmisión de patógenos animales ha sido, en teoría, eliminado. Para los productores, la capacidad de producir una entidad química pura que sustancialmente se encuentre libre de material de patógenos animales es ventajosa para fines de seguridad, de calidad y reglamentarios. Además, por lo general un proceso sintético prevé un producto más reproducible que el derivado de fuentes biológicas.

En la actualidad, debido a la abundancia relativa de ácidos biliares derivados de carcasas de animales, la industria no ha tomado medida alguna ni para sintetizar ácidos biliares por medios completamente químicos ni para preparar ácidos biliares usando fitosterol o materiales de partida microbianos. Y a pesar de que se han sintetizado derivados de ácido biliar, este trabajo implicó de nuevo ácidos biliares derivados de animales como materiales de partida para la química de los esteroides, debido al bajo coste y a la inmediata disponibilidad de materiales animales. A pesar de esfuerzos históricamente activos en la investigación del fitosterol, no hay composición alguna con disponibilidad comercial inmediata de calidad farmacéutica de ácido biliar derivado de fitosterol. Véase, por ejemplo, Mukhopadhyay, S. y U. Maitra., Current Science 87: 1666 - 1683, 1670 (2004) (Observando que la síntesis total de cualquier ácido biliar no se haya realizado sujeta a una referencia de 1981, Kametani y col. J. Am. Chem. Soc. 103: 2890 (1981) (“First Total Synthesis o f (+)-Chenodeoxycholic Acid’). Los ácidos biliares microbianos, tales como los producidos por bacterias, se han usado in situ como productos bacterianos, por ejemplo, para la limpieza de derrames de petróleo en el mar. Véase, Maneerat y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 76: 679 - 683 (2004) (“Bile acids are new products of a marine bacterium, Myroides sp. Strain SM1"). Ruzena Mickova: “Reduction of 12-oxo derivatives of bile acids”, COLLECTION OF CZECHOSLOVAK CHEMICAL COMMUNICATIONS, vol. 50, 1 de enero de 1985, páginas 1239-1243 divulga un proceso de reducción que usa borohidruro de sodio en presencia de una sal de cerio.

Con el fin de alcanzar el pleno potencial del ácido desoxicólico para la eliminación de grasa, es imperativo que las preocupaciones en torno al uso de productos derivados de animales se aborden adicionalmente. Obviamente, existe una necesidad de cantidades adecuadas de ácidos biliares y composiciones relacionadas eficaces, tales como los ácidos desoxicólicos, que se sabe desde el comienzo que están libres de restos de origen animal (o restos patogénicos capaces de actuar en un animal, en particular un mamífero, y para uso humano, que tengan un efecto perjudicial sobre un ser humano), y otros agentes nocivos tales como toxinas y metabolitos animales o microbianos, incluyendo toxinas bacterianas, tales como pirógenos, para su uso como medicamentos en los seres humanos. La presente invención aborda esta preocupación mediante la provisión de métodos de preparación de composiciones de ácido biliar de forma sintética, estando los ácidos biliares resultantes libres del riesgo potencial de patógenos animales y otros agentes nocivos. Las composiciones de ácido biliar que se divulgan pueden usarse en terapia adipolítica y servirán para promover adicionalmente los esfuerzos de investigación y de desarrollo en el área de la eliminación de la grasa localizada.

Sumario de la invención

En el presente documento se proporcionan cantidades adecuadas de un ácido biliar adecuado como una composición farmacéutica definida, así como métodos para la síntesis del mismo. Los métodos y composiciones de ácidos biliares así proporcionados no se aíslan a partir de organismos mamíferos o microbianos que producen de forma natural los ácidos biliares. En un aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas de ácido desoxicóli

son libres de todos los restos de origen animal y de pirógenos mamíferos y/o bacterianos, y métodos relacionados para la producción y su uso. En otro aspecto, se proporcionan cantidades adecuados de ácidos desoxicólicos adecuados como composiciones farmacéuticas definidas que pueden usarse como composición farmacéutica inyectable para la eliminación de grasa localizada, junto con composiciones, métodos para la fabricación y métodos de uso relacionados. Los inyectados de desoxicolato definidos en la presente divulgación pueden combinarse con una molécula que causa la destrucción de la grasa mediante un mecanismo ortogonal, por ejemplo, antagonistas de NPY y/o péptidos pro-apoptóticos selectivos de grasa, para proporcionar agentes que van a usarse para crear un medio más potente para mediar en el modelado del cuerpo en menos sesiones terapéuticas. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos que se relacionan con la síntesis de ácido desoxicólico y sales farmacéuticamente aceptables del mismo y productos intermedios del mismo. El ácido desoxicólico preparado de forma sintética puede usarse en terapia adipolítica para la eliminación de grasa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un dibujo que representa la estructura de ácidos biliares, incluyendo el sistema de numeración para los carbonos del esqueleto de ácido biliar.

La figura 2 muestra la similitud en la disminución dependiente de la dosis en la supervivencia celular de los adipocitos humanos primarios tras el tratamiento con ácido desoxicólico de sodio de síntesis de la presente divulgación en comparación con desoxicolato de sodio derivado de bovino (Sigma).

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Por la totalidad de la presente divulgación, se hace referencia a diversas publicaciones, patentes y memorias descriptivas de patente publicadas mediante una cita identificativa.

Tal como se usan en el presente documento, determinadas expresiones tienen los siguientes significados definidos. Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares “un”, “una” y “el / la” incluyen referencias singulares y plurales a menos que el contexto dicte con claridad lo contrario.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresen cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, y así sucesivamente, que se usan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones han de entenderse como si estuvieran modificadas en todos los casos por la expresión “aproximadamente”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos que se exponen en la siguiente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones. Cada parámetro numérico debería interpretarse por lo menos a la luz del número de dígitos significativos notificados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo ordinarias.

La expresión “reactivo de acetilación” se refiere a un reactivo que puede añadir un grupo acetilo CH3C(O)- a una molécula.

La expresión “ácido” se refiere a un donador de protones e incluye ácidos tanto orgánicos como inorgánicos.

La expresión “alquilo” se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos saturados monovalentes que tienen de 1 a 10 átomos de carbono y preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono. Esta expresión incluye, a modo de ejemplo, grupos hidrocarbilo lineales y ramificados tales como metilo (CH3-), etilo (CH3CH2-), n-propilo (CH3CH2CH2-), isopropilo ((CH3)2CH-), n-butilo (CH3CH2CH2CH2-), isobutilo ((CH3)2CHCH2-), sec-butilo ((CH3)(CH3CH2)CH-), f-butilo ((CH3)3C-), n-pentilo (CH3CH2CH2CH2CH2-) y neopentilo ((CH3)3CCH2-).

La expresión “arilo” se refiere a un grupo carbocíclico aromático monovalente de 6 a 12 átomos de carbono que tiene un único anillo (por ejemplo, fenilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, naftilo).

La expresión “origen animal” se refiere a que se origina a partir de cualquiera de un reino (Animalia) de seres vivos incluyendo organismos multicelulares y organismos unicelulares.

La expresión “reactivo de deshidratación” se refiere a un reactivo que puede reaccionar con agua. En un aspecto, un reactivo de deshidratación puede reaccionar con agua que se retira de una molécula.

La expresión “reactivo de desulfuración” se refiere a un reactivo que puede reaccionar con un sulfuro. En un aspecto, un reactivo de desulfuración puede reaccionar con una molécula que contiene sulfuro para retirar el grupo sulfuro de la molécula.

La expresión “precursor de etano ditiol o de ditiano” se refiere a un reactivo que, con la reacción con un grupo carbonilo, formará un grupo etano ditiol o ditiano.

La expresión “grupo acetilo electrofílico” se refiere a un grupo acetilo como un electrófilo, un grupo que es atraído a electrones y tiende a aceptar electrones.

La expresión “reactivo de hidrogenación” se refiere a un reactivo que puede donar hidrógeno a una molécula.

La expresión “ácido de Lewis” se refiere a un aceptor de pares de electrones. Los ácidos de Lewis incluyen reactivos organometálicos tales como haluros de alquil aluminio (por ejemplo Et2AlCl y MeAlCh).

La expresión “origen mamífero” se refiere a que se origina a partir de cualquier organismo mamífero. La expresión “organismo mamífero” se refiere a una clase (Mammalia) de vertebrados superiores de sangre caliente (como placentarios, marsupiales o monotremas) que alimentan a sus crías con leche secretada por glándulas mamarias, tienen la piel por lo general más o menos cubierta de pelo, e incluyen los seres humanos.

La expresión “origen microbiano” se refiere a que se origina a partir de cualquier organismo microbiano. La expresión “organismo microbiano” se refiere a un dominio (Bacteria) de microorganismos unicelulares redondos, en espiral o con forma de varilla procariotas que pueden carecer de paredes celulares o son gram-positivos o gram-negativos si estos tienen paredes celulares, que con frecuencia se agregan formando colonias o que tienen motilidad por medio de flagelos, que por lo general viven en el suelo, agua, materia orgánica, o los cuerpos de plantas y animales, que son por lo general de nutrición autótrofa, saprofítica o parasitaria, y que destacan por sus efectos bioquímicos y su patogenicidad.

La expresión “reactivo de olefinación” se refiere a reactivos que reaccionan con cetonas para formar las olefinas correspondientes. La expresión “condiciones de formación de olefina” se refiere a condiciones adecuadas para llevar a cabo tales transformaciones. Los ejemplos de tales reactivos incluyen reactivos de Wittig y condiciones de olefinación de Wittig.

La expresión “agente oxidante” se refiere a un reactivo que puede aceptar electrones en una reacción de oxidación - reducción. De esta forma, puede añadirse halógeno u oxígeno a una molécula o puede retirarse hidrógeno de una molécula.

La expresión “patógeno” se refiere a un agente causante específico de una enfermedad.

“Sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales farmacéuticamente aceptables derivadas de una diversidad de contraiones orgánicos e inorgánicos que se conocen bien en la técnica e incluyen, solo a modo de ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y tetraalquilamonio. Las sales adecuadas incluyen las que se describen en P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.), Handbook of Pharmaceutical Salts Properties, Selection, and Use; 2002. Estas sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse al hacer reaccionar DCA con una base adecuada. Para fines ilustrativos, los ejemplos de tales bases incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o hidróxido de litio. Como alternativa, las sales pueden prepararse mediante la hidrólisis de ésteres de DCA con base y omitiendo cualquier ^{tratamiento ácido que condujera a} DcA.

La expresión “agente reductor” se refiere a un reactivo que puede donar electrones en una reacción de oxidación - reducción. De esta forma, pueden retirarse halógeno u oxígeno de una molécula o puede añadirse hidrógeno a una molécula.

Composiciones y métodos de uso

En diversos aspectos descritos en el presente documento, la presente divulgación proporciona composiciones (y productos intermedios útiles) para uso farmacéutico, métodos de síntesis de las mismas, y métodos de uso de las presentes composiciones farmacéuticas.

Cabe destacar que, las presentes composiciones de ácido biliar están libres de riesgos inherentes en el material obtenido a partir de materiales de partida animales, y por lo tanto no requiere las inspecciones y regulaciones detalladas de los materiales derivados de animales. En un aspecto, esta divulgación se refiere por lo tanto a composiciones de ácido biliar farmacéuticas libres de material de origen animal, tal como patógenos mamíferos, así como que están sustancialmente libres de toxinas de origen bacteriano, tal como pirógenos.

El desoxicolato de sodio es una sal biliar producida de forma natural que solubiliza lípidos dietéticos en el tracto digestivo. Se producen in vivo a través de una vía biosintética compleja que utiliza colesterol como el material de partida y que implica tanto enzimas humanas como bacterianas. La función principal del desoxicolato es ayudar en el proceso digestivo solubilizando lípidos dietéticos para facilitar la absorción. En el cuerpo, la síntesis de desoxicolato comienza con la oxidación, isomerización y reducción enzimáticas de colesterol en el hígado para formar ácido cólico, un ácido biliar estructuralmente similar a su colesterol original (Stryer L, capítulo 27: Biosynthesis of Membrane Lipids and Steroids, en Biochemistry, 1995, W. H. Freeman and Company: Nueva York. Págs. 691-707). En el hígado, luego el ácido cólico se une de forma química a uno de los dos aminoácidos (taurina o glicina) para formar los ácidos cólicos 'conjugados' (es decir, L-glicocolato y taurocolato). Estos ácidos cólicos conjugados luego se almacenan en la vesícula biliar hasta el consumo de alimentos. Después del consumo de alimentos, la disolución de bilis se libera de la vesícula biliar al intestino, en el que las moléculas de ácido cólico conjugado se someten a dos modificaciones químicas adicionales mediadas por enzimas producidas por la microbiota intestinal (Ridlon J.M., Kang D.J. y Hylemon P.B., Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria, J. Lipid Res., 47 (2): págs. 241-59 (2006)). En primer lugar, el ácido cólico conjugado se deshidroxila para formar desoxicolato conjugado. Luego, el desoxicolato conjugado se desconjuga para formar desoxicolato libre, que participa, junto con los otros ácidos biliares, en la solubilización de los lípidos dietéticos. Debido a que el desoxicolato está aguas abajo de la síntesis del ácido cólico, el ácido cólico puede ser una impureza presente en las fuentes naturales de desoxicolato.

El desoxicolato es soluble a 333 mg/ml en agua, escasamente soluble en alcohol y es incluso menos soluble en acetona y ácido acético glacial. La formación reversible de micelas puede ocurrir con concentraciones de desoxicolato de sodio por encima de las concentraciones críticas de micelas de aproximadamente 2,4 mg/ml y pH neutro (Matsuoka K, M.Y., Micelle formation of sodium deoxycholate and sodium ursodeoxycholate (parte 1), Biochim. Biophys. Acta., 1580 (2-3): págs. 189-99 (2002)). A concentraciones por encima de la concentración micelar crítica de 2,4 mg/ml, el desoxicolato formará micelas y tiene la capacidad de solubilizar células, lípidos y proteínas. En concentraciones más bajas, tal como 0,4 mg/ml (comparable al estado de ayuno), el desoxicolato se une en un 98% a la albúmina (Roda A. et al., Quantitative aspects of the interaction of bile acids with human serum albumin, J. Lipid Res., 23 (3): págs. 490­ 5 (1982)) en presencia de 26 mg/ml de albúmina (que está cerca de la concentración sérica fisiológica de 35-50 mg/m).

Las realizaciones preferidas se refieren al ácido desoxicólico (DCA) o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto o el profármaco y las composiciones y los métodos relacionados, en los que el ácido desoxicólico (DCA) es:

en las que dicho compuesto no se aísla de un organismo mamífero o microbiano que produce de forma natural DCA.

Otras realizaciones preferidas también se refieren a los estereoisómeros de DCA y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y a los productos intermedios en la síntesis del DCA y estereoisómeros y sales de los mismos y las composiciones y los métodos relacionados.

Las presentes composiciones farmacéuticas de ácido biliar están opcionalmente en forma de sal y, además, contienen opcionalmente un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, esta divulgación se refiere a un compuesto que es ácido desoxicólico (DCA) o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto o el profármaco:

en el que dicho compuesto no se aísla de un organismo mamífero o microbiano que produce de forma natural DCA y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los cationes preferidos para la preparación de sales pueden seleccionarse del grupo que consiste en sodio (Na+), potasio (K+), litio (Li+), magnesio (Mg2+), calcio (Ca2+), bario (Ba2+), estroncio (Sr2+) y amonio (NH4+). Las sales también pueden prepararse a partir de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo. Un metal alcalino puede seleccionarse entre sodio (Na+), potasio (K+) y litio (Li+). Puede seleccionarse un metal alcalinotérreo del grupo que consiste en magnesio (Mg2+), calcio (Ca2+), bario (Ba2+) y estroncio (Sr2+). Preferiblemente para su uso como composición farmacéutica para la eliminación localizada de grasa, la sal biliar es desoxicolato de sodio.

También se contemplan los profármacos de los compuestos de las realizaciones. Un profármaco es un compuesto activo o inactivo que se modifica de forma química mediante una acción fisiológica in vivo, tal como hidrólisis, metabolismo y similares, en un compuesto de las realizaciones después de la administración del profármaco a un paciente. Por ejemplo, puede prepararse un éster C1-C10 o una amida del presente ácido desoxicólico o derivados del mismo, de modo que la liberación del ácido desoxicólico o derivados del mismo se desencadena por la rotura de la membrana celular y la liberación de esterasa. Con la liberación de esterasa, el grupo protector éster se escinde de modo que la forma activa de ácido desoxicólico o derivados del mismo estén presentes en la ubicación deseada in situ. Tales ésteres C1-C10 pueden incluir opcionalmente 1-4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno; grupos alquilo tales como metilo, etilo, isopropilo, butilo, hexilo, etc., que tienen opcionalmente 1-4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno; grupos alquilfenilo que tienen un total de hasta 10 átomos de carbono, tales como un grupo bencilo o etilfenilo que tiene opcionalmente 1-4 heteroátomos en cualquier punto aceptable de sustitución; y un grupo arilo tal como un grupo fenilo. El ejemplo de amida incluye, pero no se limita a, hidroxamato. Para un análisis general de profármacos que implican ésteres, véase Svensson y Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) y Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985). La síntesis de un éster C i-C i0 o una amida del ácido desoxicólico se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, un éster puede sintetizarse mediante una reacción del ácido desoxicólico con un alcohol en presencia de un ácido mineral, en una reacción de esterificación.

Las estructuras nativas de ácido desoxicólico y ácido quenodesoxicólico se muestran a continuación. Se muestran los cuatro anillos (A, B, C, D), así como la cadena lateral del ácido carboxílico que se extiende desde el anillo D.

A cido desox ico lico

A cido quenodesoxico lico

Sin limitación, algunos de los ejemplos de ésteres, hidroxamatos e hidroxiamidas del ácido desoxicólico, así como del ácido quenodesoxicólico (CDCA) o derivados del mismo, se describen a continuación. Pueden unirse diferentes grupos funcionales al ácido desoxicólico o al ácido quenodesoxicólico mediante esterificación del grupo carboxílico en la cadena lateral de anillo D para generar profármacos. Sin limitación, algunos ejemplos de estos ésteres de cadena lateral de anillo D se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Grupos funcionales conjugados a la cadena lateral de anillo D del ácido desoxicólico y el ácido

quenodesoxicólico

La liberación del ácido desoxicólico o del ácido quenodesoxicólico y derivados de los mismos puede desencadenarse por la rotura de la membrana celular y la liberación de esterasa. Con la liberación de esterasa, el grupo protector éster puede escindirse de modo que la forma activa del ácido desoxicólico o el ácido quenodesoxicólico o derivado de los mismos esté presente en la ubicación deseada in situ.

Los profármacos de ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico y sus derivados también incluyen epímeros que pueden poseer una estereoquímica opuesta a la molécula nativa. En la tabla 2 se muestran ejemplos de estas moléculas epiméricas.

Tabla 2. Epímeros de ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico y derivados de los mismos

Puede haber una irritación local tras la inyección de una composición de ácido biliar de las presentes realizaciones y, por lo tanto, puede ser deseable administrar, de forma simultánea o in seriatim, un anestésico local. Por ejemplo, la lidocaína se usa con frecuencia en humanos y puede administrarse como una co-formulación (en el mismo recipiente e inyectada al mismo tiempo) o como co-inyección (inyectada desde un recipiente diferente). Los anestésicos tales como la lidocaína pueden administrarse mediante una preparación tópica, tal como un parche o una pomada.

Para tejidos más profundos, los anestésicos pueden inyectarse de forma más profunda en el tejido sujeto o administrarse por vía sistémica (por ejemplo, anestesia general, epidural u otros métodos conocidos).

El/los ácido(s) biliar(es) o la(s) sal(es) biliar(es) en una disolución de la divulgación pueden estar en una concentración de aproximadamente 0,001 a 10, de 0,01 a 5 o de 0,1 a 2% p/p, p/v o v/v. Preferiblemente, el/los ácido(s) biliar(es) o la(s) sal(es) biliar(es) en la disolución anterior pueden estar a una concentración de aproximadamente 0,1-5% p/p o más preferiblemente aproximadamente 1% p/p. En algunas realizaciones, la solución para disolver grasas comprende hasta 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1,0,5, 0,2, 0,05, 0,02 ó 0,01 gramos de uno o más detergentes, ácidos biliares y/o sales biliares, por ejemplo, ácido desoxicólico o sales del mismo o desoxicolato de sodio.

En realizaciones preferidas, las disoluciones en el presente documento no incluyen lípidos, fosfolípidos o fosfatidilcolina. En algunas realizaciones, las disoluciones en el presente documento incluyen hasta un 5% p/p, p/v o v/v de lípidos, fosfolípidos o fosfatidilcolina.

En algunas realizaciones, la disolución anterior puede comprender además un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: agentes antimicrobianos, vasoconstrictores, agentes antitrombóticos, agentes anticoagulantes, supresores de espuma, agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes de dispersión, agentes antidispersión, potenciadores de la penetración, esteroides, tranquilizantes, relajantes musculares y agentes antidiarreicos. En algunas realizaciones, hay una disolución en un recipiente que contiene hasta 500 ml de disolución. Dicho recipiente puede ser una jeringa o un recipiente que se puede cargar con una jeringa.

En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos comprenden además una molécula que se sabe que hace que la grasa se destruya mediante un mecanismo ortogonal. Tales moléculas incluyen antagonistas del receptor del neuropéptido Y (NPY) incluyendo, pero sin limitarse a, antagonistas del receptor NPY, como BIBP-3226 (Amgen), BIBO-3304 (Boehringer Ingleheim), BMS-192548 y AR-H040922 (Bristol-Myers Squibb ), LY-357897 (Eli Lilly), 1229U91 y GW438014S (GlaxoSmithKline), JNJ-5207787 (Johnson & Johnson), Lu-AA-44608 (Lundbeck), MK-0557 (NPY de Merck), NGD-95-1 (Neurgogen), NLX-E201 (Neurologix), CGP-71683 (Novartis), PD-160170 (Pfizer), SR-120819A, BIIE0246 y S.A.0204 (Sanofi Aventis), S-2367 (Shiongli), dihidropiridina y derivados de dihidropiridina que son antagonistas del receptor NPY, compuestos bicíclicos que son antagonistas del receptor NPY, antagonistas del receptor NPY de carbazol y compuestos tricíclicos que son antagonistas del receptor NPY. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2006/133160 y U.S. 6.313.128. También se contemplan péptidos pro-apoptóticos selectivos de grasas tales como el péptido CKGGRAKDC que se aloja en la vasculatura de grasa blanca. Véase, Kolonin M.G. y col., Nat. Med. 10 de junio (6): 625-32 (2004)).

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a métodos para reducir un depósito de grasa subcutánea en un sujeto. Tales métodos comprenden la etapa de administrar de forma local a un depósito de grasa subcutáneo en el sujeto una composición que comprende: (i) una cantidad eficaz para disolver la grasa de uno o más detergentes farmacológicamente activos, o ácido(s) biliar(es) y/o sal(es) biliar(es)), o ácido desoxicólico o una sal del mismo, o desoxicolato de sodio; (ii) un excipiente farmacéutico, veterinario o cosmético; y (iii) opcionalmente un lípido, en el que la razón del lípido y el ácido biliar o la sal biliar es de hasta 1% p/p y en el que la composición no incluye lipasa o colipasa. En algunas realizaciones, el depósito de grasa está asociado con un estado seleccionado del grupo que consiste en obesidad, síndrome de redistribución de grasa, hernia de grasa del párpado, lipomas, enfermedad de Dercum, lipodistrofia, lipodistrofia de joroba de búfalo, grasa dorsocervical, adiposidad visceral, aumento de las mamas, hiperadiposidad, grasa corporal difusa alrededor del tronco y los brazos, y depósitos de grasa asociados con la celulitis. En realizaciones preferidas, el método anterior no incluye realizar cirugía en dicho sujeto.

En un aspecto, esta divulgación se refiere a un método para la eliminación de depósitos de grasa de ubicaciones seleccionadas en un mamífero que comprende administrar al mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de DCA o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del DCA o del profármaco:

en el que dicho compuesto no se aísla de un organismo mamífero o microbiano que produce de forma natural DCA.

En una realización, los métodos de esta divulgación pueden comprender además administrar al mamífero al menos un principio activo adicional seleccionado del grupo que consiste en un antagonista del receptor del neuropéptido Y (NPY) y un péptido pro-apoptótico selectivo de grasa. En una realización, el antagonista del receptor del neuropéptido Y (NPY) se selecciona del grupo que consiste en BIBP-3226, antagonista del neuropéptido Y5 (los antagonistas del receptor NPY de Amgen), BIBO-3304 (el antagonista del receptor NPY de Boehringer Ingleheim), BMS-192548 (el antagonista del receptor NPY de Bristol-Myers Squibb), AR-H040922 (el antagonista del receptor NPY de Bristol-Myers Squibb), LY-357897 (el antagonista del receptor NPY de Eli Lilly), el antagonista del receptor NPY-Y5 de Esteve, 1229U91 (los antagonistas del receptor NPY de GlaxoSmithKline), GW438014S (los antagonistas del receptor NPY de GlaxoSmithKline), JNJ-5207787 (el antagonista del receptor NPY de Johnson & Johnson), Lu-AA-44608 (el antagonista del receptor NPY de Lundbeck), MK-0557 (el antagonista del receptor NPY de Merck), NGD -95-1 (el antagonista del receptor de NPY de Neurgogen), NLX-E201 (el antagonista del receptor NPY de Neurologix), CGP-71683 (el antagonista del receptor NPY de Novartis), PD-160170 (los antagonistas del receptor NPY de Pfizer), SR-120819A (los antagonistas del receptor NPY de Sanofi Aventis), BIIE0246 (los antagonistas del receptor NPY de Sanofi Aventis), S.A.0204 (los antagonistas del receptor NPY de Sanofi Aventis), S-2367 (el antagonista del receptor NPY de Shiongli), dihidropiridina que son antagonistas del receptor NPY, derivados de dihidropiridina que son antagonistas del receptor NPY, compuestos bicíclicos que son antagonistas del receptor NPY, antagonista del receptor NPY de carbazol y compuestos tricíclicos que son antagonistas del receptor NPY. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2006/133160 y U.S. 6.313.128. En una realización, el péptido pro-apoptótico selectivo de grasa es el péptido CKGGRAKDC que se aloja en la vasculatura de grasa blanca. Véase, Kolonin M.G. y col., Nat. Med. 10 de junio (6): 625-32 (2004)).

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a métodos para reducir el aspecto de un estado cutáneo en una región de la piel de un sujeto. Tales métodos comprenden la etapa de: administrar de forma local a dicha región de la piel una composición que comprende: (i) una cantidad eficaz para estirar la piel de uno o más detergentes farmacológicamente activos, o ácido(s) biliar(es) y/o sal(es) biliar(es), o ácido desoxicólico o una sal del mismo, o desoxicolato de sodio, (ii) un excipiente farmacéutico, veterinario o cosmético y (iii) opcionalmente un lípido. En algunas realizaciones, la etapa de administración implica administrar las composiciones en el presente documento a través de una inyección subcutánea o transdérmica. En algunas realizaciones, el estado de la piel que va a tratarse o mejorarse se selecciona del grupo que consiste en: piel flácida, envejecimiento de la piel, irregularidades de la piel y arrugas. En algunas realizaciones, la región de la piel que se está tratando es debajo del ojo, debajo del mentón, debajo del brazo, nalga, mejilla, frente, pantorrilla, espalda, muslo, tobillo o estómago.

En algunas realizaciones, las composiciones usadas para reducir el aspecto de un estado cutáneo en una región de la piel se formulan en una solución para estirar la piel. Dicha solución de estiramiento de la piel puede comprender además un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: agentes antimicrobianos, vasoconstrictores, agentes antitrombóticos, agentes anticoagulantes, supresores de espuma, agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes de dispersión, antiinflamatorios, agentes antidispersión, potenciadores de la penetración, esteroides, tranquilizantes, relajantes musculares y agentes antidiarreicos.

En realizaciones preferidas, el detergente comprende un ácido biliar seleccionado del grupo que consiste en ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido quenodesoxicólico 7-alfa-deshidroxilado, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido de dihidroxitaurina, ácido de trihidroxitaurina y conjugados de glicina de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, el detergente comprende una sal biliar que incluye un catión seleccionado del grupo que consiste en sodio (Na+), potasio (K+), litio (Li+), magnesio (Mg2+), calcio (Ca2+), bario (Ba2+), estroncio (Sr2+) y amonio (NH4+). En algunas realizaciones, el detergente comprende una sal biliar con un catión que es un metal alcalino o un metal alcalinotérreo. Preferiblemente, el metal alcalino es sodio (Na+), potasio (K+) o litio (Li+) y el metal alcalinotérreo es magnesio (Mg2+), calcio (Ca2+), bario (Ba2+) o estroncio (Sr2+). Más preferiblemente, la sal biliar es desoxicolato de sodio.

Otra realización prevé un método para emulsionar grasa en un mamífero que comprende administrar al mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que es DCA o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del DCA o el profármaco:

en la que dicho compuesto no se aísla de un organismo mamífero o microbiano que produce de forma natural DCA.

Otra realización prevé un método para solubilizar fosfatidilcolina que comprende mezclar fosfatidilcolina y una cantidad eficaz de un compuesto que es DCA o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del DCA o el profármaco,

en la que dicho compuesto no se aísla de un organismo mamífero o microbiano que produce de forma natural DCA.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a la mezcla de ácidos biliares adipo-ablativos, tales como ácido desoxicólico (DCA) con agentes que destruyen los adipocitos. En un aspecto, esta divulgación contempla un medio para mejorar los efectos estéticos de las inyecciones de desoxicolato mezclando en el inyectado de desoxicolato una molécula que causa la destrucción de la grasa mediante un mecanismo ortogonal. Los ejemplos de tales moléculas candidatas incluyen, pero no se limitan a, antagonistas del neuropéptido Y (NPY) y péptidos pro-apoptóticos selectivos de grasa, tal como se describe en el presente documento. Dado que es posible que se requiera tanto la destrucción de los adipocitos como el estiramiento de la piel para mediar los efectos deseados, los efectos de un agente con capacidad para destruir las grasas y potentes efectos de estiramiento de la piel (tal como el desoxicolato) pueden mejorarse mediante la adición de una molécula con potentes efectos de destrucción de los adipocitos. Adicionalmente, las moléculas que requieren acceso a la vasculatura para destruir (tal como determinados péptidos pro-apoptóticos que se unen a proteínas expresadas en el lado luminal de los capilares) pueden obtener acceso a estas proteínas porque el desoxicolato puede causar pérdida vascular. Por lo tanto, tales agentes pueden ser sinérgicos con el desoxicolato creando posiblemente un medio más potente para mediar en el modelado del cuerpo en menos sesiones terapéuticas.

Método de síntesis

La presente invención proporciona métodos de síntesis de los compuestos, sales y profármacos del DCA y sus productos intermedios relacionados.

La numeración de la estructura principal esteroidea tal como se usa en el presente documento sigue la convención general tal como se muestra en la figura 1.

Por consiguiente, se proporciona un método para preparar ácido desoxicólico (DCA) o un éster del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

1. (a) hacer reaccionar 9a-hidroxiandrost-4-en-3,17-diona 1 con H2 bajo unas condiciones de hidrogenación para formar el compuesto 2

2. (b) hacer reaccionar el compuesto 2 con ácido para formar el compuesto 3

3. (c) hacer reaccionar el compuesto 3 con un agente reductor para formar el compuesto 4 como una mezcla de 4 y 5

4. (d) hacer reaccionar el compuesto 4 con un reactivo de olefinación de dos carbonos bajo unas condiciones de formación de olefina para formar el compuesto 6

5. (e) convertir el compuesto 6 en un compuesto de la fórmula 7 en el que P es un grupo protector

6. (f) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula 7 con un propiolato de alquilo CHEC-C(O)OR o un acrilato de alquilo CH2=CHC(O)OR en el que R es alquilo en presencia de un ácido de Lewis para formar un compuesto de la fórmula 8 en el que P es un grupo protector, R es alquilo y la línea de trazos------es un enlace simple o doble;

7. (g) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula 8 con H2 bajo unas condiciones de hidrogenación para formar un compuesto de la fórmula 9 en el que P es un grupo protector y R es alquilo

8. (h) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula 9 con un agente oxidante para formar un compuesto de la fórmula 10 en el que P es un grupo protector y R es alquilo

9. (i) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula 10 con H2 bajo unas condiciones de hidrogenación para formar el compuesto de la fórmula 11 en el que P es un grupo protector y R es alquilo

10. (j) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula 11 con un agente reductor para formar un compuesto de la fórmula 12 en el que P es un grupo protector y R es alquilo

11. (k) exponer el compuesto de la fórmula 12 a unas condiciones de desprotección para formar un éster del mismo y opcionalmente a unas condiciones de hidrólisis adecuadas para formar ácido desoxicólico o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente divulgación también proporciona los siguientes productos intermedios que se muestran en el esquema 1 en lo sucesivo en el que P y R son tal como se ha definido en lo que antecede.

Esquema 1. Síntesis de ácido desoxicólico (DCA)

En una realización, el ácido de la parte (b) es un ácido mineral. En algunos aspectos, el ácido mineral es H2SO4. En una realización, el agente reductor de la parte (c) es LiAl(OtBu)3H.

En una realización, el reactivo de olefinación de dos carbonos de la parte (d) es un agente de Wittig tal como Ph3PCH2CH3+Br-.

En una realización, el grupo protector P del compuesto 7 - 12 es -C(O)CH3. En algunos aspectos, el compuesto 6 se expone a unas condiciones de acilación para formar 7a, tal como mediante el tratamiento de 6 con anhídrido acético y una base orgánica tal como Et3N, piridina y / o dimetilaminopiridina.

En una realización, el ácido de Lewis de la parte (f) es EtAlCh.

En una realización, el propiolato de alquilo de la parte (f) es propriolato de metilo.

En una realización, el acrilato de alquilo de la parte (f) es acrilato de metilo.

En una realización, las condiciones de hidrogenación de la parte (g) comprenden un catalizador de PtO2 o de Pd / C. En una realización, el agente oxidante de la parte (h) es CrO3.

En una realización, las condiciones de hidrogenación de la parte (i) comprenden un catalizador de Pd / C.

En una realización, el agente reductor de la parte (j) es LiAl(OtBu)3H.

En una realización, las condiciones de desprotección y de hidrólisis de la parte (k) cuando P es -C(O)CH3 comprenden hacer reaccionar el compuesto 12 con un hidróxido de tierra alcalina, un alcóxido de tierra alcalina, o una mezcla de ambos. En algunos aspectos, las condiciones de hidrólisis incluyen un tratamiento ácido para dar ácido desoxicólico. En otros aspectos, el tratamiento ácido se omite para dar la sal correspondiente.

En una realización, el hidróxido de metal alcalino es LiOH.

En una realización, pueden prepararse sales de ácido desoxicólico mediante la reacción con un alcóxido o hidróxido de metal alcalinotérreo. Las sales de ácido desoxicólico incluyen las sales de sodio (Na+), de potasio (K+) y de litio (Li+).

En una realización, se proporciona un compuesto intermedio que se selecciona del grupo que consiste en

9a-Hidroxi-5p-androstan-3,17-diona (2);

5p-Androst-9(11)-en-3,17-diona (3);

(Z)-3a-Hidroxi-5p-pregna-9(11),17(20)-dieno (6);

(z)-3a-Acetoxi-5p-pregna-9(11),17(20)-dieno (7a);

3a-Acetoxi-5p-col-9(11), 16, 22-trien-24-oato de (E)-metilo (8a);

3a-Acetoxi-5p-col-9(ll), 16-dien-24-oato de metilo (8b);

3a-Acetoxi-5p-col-9(ll)-en-12-ona-24-oato de metilo (loa); y

3a-Acetoxi-5p-colan-12-ona-24-oato de metilo (11a).

Composiciones farmacéuticas y modos de administración

Las composiciones pueden estar compuestas por un compuesto que se divulga en combinación con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes aceptables son no tóxicos, ayudan a la administración y no afectan de forma adversa al beneficio terapéutico del compuesto que se divulga. Tal excipiente puede ser cualquier excipiente sólido, líquido, semisólido o, en el caso de una composición en aerosol, gaseoso que esté generalmente disponible para un experto en la técnica.

Los excipientes farmacéuticos sólidos incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo y similares. Los excipientes líquidos y semisólidos pueden seleccionarse de glicerol, propilenglicol, agua, etanol y diversos aceites, incluyendo los de origen petrolífero, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, etc. Los portadores líquidos preferidos, particularmente para disoluciones inyectables, incluyen agua, solución salina, dextrosa acuosa y glicoles.

En general, los compuestos de las realizaciones preferidas se administrarán en una cantidad terapéuticamente eficaz mediante cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes que tienen utilidades similares. La cantidad real del compuesto de las realizaciones preferidas, es decir, el principio activo, dependerá de numerosos factores tales como la gravedad de la enfermedad a tratar, la edad y la salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto usado, la vía y forma de administración, y otros factores. El fármaco puede administrarse más de una vez al día, preferiblemente una o dos veces al día. Todos estos factores están dentro de los conocimientos del médico especialista.

La cantidad del compuesto en una formulación puede variar dentro del intervalo completo empleado por los expertos en la técnica. Las presentes composiciones en diversos aspectos tal como se describen en el presente documento pueden prepararse en las que el resto de ácido desoxicólico está en el intervalo de aproximadamente 0,5%-10% en peso por base de volumen acuoso, o en una base p/p, asumiendo la densidad del agua (es decir, una correspondencia 1:1 entre peso y volumen). En otro aspecto, las presentes realizaciones se refieren a las composiciones farmacéuticas descritas actualmente en concentraciones hasta el punto de saturación del diluyente. Puede seleccionarse el grado de viscosidad tixotrópica basándose en condiciones tales como la concentración y el pH. Véase, por ejemplo, Mukhopadhyay, S. y U. Maitra, Current Science 87: 1666-1683 (2004) en 1680.

En algunas realizaciones, la etapa de administración implica administrar las composiciones en el presente documento mediante un parche dérmico, una bomba o un depósito subdérmico. En algunas realizaciones, la etapa de administración implica administrar las composiciones en el presente documento por vía tópica o subcutánea. En realizaciones específicas, la etapa de administración implica la administración de forma local (por ejemplo, por vía subcutánea o subdérmica) a una región debajo del ojo, debajo del mentón, debajo del brazo, nalga, pantorrilla, espalda, muslo o estómago de dicho sujeto. La administración puede realizarse mediante inyección subcutánea o transdérmica.

Esquemas de síntesis

Otros ejemplos de métodos para la síntesis química completa de composiciones farmacéuticas de ácido biliar, y productos intermedios útiles, se proporcionan en lo sucesivo.

Estas descripciones y ejemplos siguientes proporcionan una alternativa a la extracción de DCA a partir de organismos mamíferos o microbianos que producen de forma natural este compuesto. Las rutas de síntesis 1 -6 se contemplan para su uso en la presente invención para sintetizar ácido desoxicólico (DCA). La ruta de síntesis 1B y los ejemplos 1-11 muestran la síntesis de DCA a partir de hidrocortisona.

1. Ruta de síntesis N° 1A a partir de Adrenosterona, por medio de 9(11)-eno u 11,12-eno

La cortisona (el compuesto 1.1) del esquema 1A (en lo sucesivo) se encuentra disponible de forma generalizada como un material completamente sintético. Esta puede escindirse de forma eficiente para formar el compuesto de cetona C17 usando clorocromato de piridinio (PCC). Esta escisión en adrenosterona (el compuesto 1.2) también puede lograrse usando HIO4 o bismutato de sodio (NaBiOa). La reacción que convierte el compuesto 1.2 en el compuesto 1.3 es un proceso químico conocido. La conversión del compuesto 1.3 en el compuesto 1.4 comporta monocetalización. Son etapas posteriores la regeneración del 3-ceto-4-eno, la reducción selectiva del 4,5-eno (H2/ P t/ DMF) para dar la configuración p C5 y la reducción selectiva del grupo carbonilo C3 a la configuración 3a deseada para dar el compuesto 1.5. La adición de un grupo protector en la conversión del compuesto 1.5 en el compuesto 1.6 y la reducción posterior del producto da el p-ol C11 (configuración axial), es decir, el compuesto 1.7, que es adecuado para una eliminación regioselectiva para dar el 9(11)-eno clave (es decir, la conversión del compuesto 1.7 en el compuesto 1.8).

El esquema de síntesis se bifurca en este punto, ya que el compuesto 1.7 puede usarse como el material de partida para la conversión o bien en el compuesto 1.8 o bien en el compuesto 1.9. La reacción de eliminación que se usa para convertir el compuesto 1.7 en el compuesto 1.8 es regioselectiva debido a la relación diaxial trans entre el grupo hidroxilo C11 y el átomo de hidrógeno de Cg. De forma similar, el modo alternativo de eliminación para dar la olefina C11-C12 isomérica del compuesto 1.9 es regioselectivo comportando una eliminación térmica cis (es decir, la conversión del compuesto 1.7 en el compuesto 1.9).

Esquema 1A. Síntesis de los dos precursores de anillo C del grupo hidroxilo C12 de DCA

La oxidación alílica del compuesto 1.8 (por medio del tratamiento con CrO3y 3,5 dimetil pirazol) da el compuesto 1.10 que contiene enona. La oxidación con perácido del compuesto 1.9 avanza de forma estereoselectiva a partir de la cara alfa del esteroide para dar el compuesto 1.11 de epóxido C11-12 (véase el esquema 1A en lo que antecede). Estas transformaciones químicas dan los dos precursores clave de la funcionalidad de grupo hidroxilo C12, en concreto, el compuesto 1.10 y el compuesto 2.1 (los esquemas 1A y 2).

Un experto en la materia apreciará que la ruta de cortisona anterior puede modificarse para comenzar en su lugar con hidrocortisona, la cual tiene el mismo esqueleto de carbono y la misma colocación relativa de átomos de oxígeno, diferenciándose la hidrocortisona de la cortisona solo en el estado de oxidación del átomo de carbono que porta oxígeno C-11. La hidrocortisona se encuentra comercialmente disponible y se conocen diversas formas de síntesis de este compuesto (Szczebara y col. Nature Biotechnology 21: 143 - 149 (Feb. de 2003)) incluyendo una síntesis química total (Woodward R. B. y col. J. Am. Chem. Soc. 74: 4223 (1952)). La cetona 1.13 se sintetiza comenzando a partir de hidrocortisona 1.12 (el esquema 1B) por medio de hidrogenolisis del enlace doble a,p-insaturado, seguido por la reducción de cetona global usando borohidruro de sodio para permitir la escisión de 1,2-diol usando NaIO4, formando de este modo la cetona C17 sobre el anillo D del sistema de anillo esteroideo. La oxidación posterior con clorocromato de piridinio (PCC) da 1.13. Tratamiento de 1.13 con K-selectride® seguido por acetilación con anhídrido acético / piridina da el alcohol protegido 1.15. La olefinación posterior de 1.15 con un reactivo de Wittig proporciona el alqueno 1.16 que a continuación se trata con propiolato de metilo y dicloruro de etil aluminio para formar el dieno 1.17. Siguiendo la hidrogenación de ambos enlaces dobles, la cetona 1.18 se reduce y el producto intermedio de alcohol resultante se elimina tras el tratamiento con SOCl2 en piridina para dar el alqueno 1.19. La oxidación alílica del alqueno 1.19 con CrO3 y la reducción del enlace doble bajo unas condiciones de hidrogenación da la cetona 1.21. La eliminación del grupo protector de acetato y la oxidación del alcohol resultante da la dicetona 1.22. La reducción de 1.22 con LiAlH(O-(Bu)3 y la hidrólisis del éster metílico da DCA.

Esquema 1B. Síntesis de DCA a partir de hidrocortisona

compuesto 1.10 se modifica para contener un sistema de anillo C apropiadamente funcionalizado idéntico al de DCA (el esquema 2). La reducción estereoselectiva del grupo carbonilo C12 da el compuesto 2.1 y la hidrogenación catalítica del enlace doble de 9(11) presente en el compuesto 2.1 da el compuesto 2.2.

Esquema 2. Introducción de un grupo hidroxilo C12 usando la ruta de oxidación alílica

El esquema 3 presenta la transformación del compuesto 1.11 que contiene epóxido en el compuesto 2.2 de a-hidroxi esteroide de C12 análogo del esquema 2.

Esquema 3. Reducción estereoselectiva de epóxido C11-C12

Tal como se ha mencionado en lo que antecede en ambas de estas rutas se forma el compuesto intermedio común 2.2.

La siguiente etapa en la síntesis de DCA es la modificación del anillo D presente en el compuesto 2.2 de tal modo que este contiene el anillo D sustituido con cadena lateral carboxílica de DCA (el esquema 4 y el esquema 5).

Esquema 4. Desprotección y reacción de Wittig

En primer lugar, se hidrolizan el cetal C17 y los grupos de silil éter C3 del compuesto 2.2. A continuación se realiza la reacción de Wittig para dar el compuesto 4.2. La conversión del compuesto 4.2 en el compuesto 5.1 se lleva a cabo por medio de una reacción eno. La reducción catalítica posterior del compuesto 5.1 y la hidrólisis del éster da DCA (el esquema 5).

Esquema 5. Reacción eno y reducción catalítica para la instalación de cadena lateral de DCA

2. Ruta de síntesis N° 2 a partir de cortisona por medio de Adrenosterona (el i-esteroide, ruta de 3,5-ciclosterol)

La cetalización selectiva de adrenosterona (el compuesto 1.2, esquema 6) en C17, la reducción de borohidruro, la mesilación y la hidrólisis tamponada da el compuesto 6.1 que contiene i-esteroide (3,5-ciclosterol). El compuesto 6.1 experimenta la formación de 9(11)-eno (la conversión del compuesto 6.1 en el compuesto 6.2, esquema 6) y la oxidación alílica (la conversión del compuesto 6.2 en el compuesto 6.3, esquema 6) seguido por la reducción del grupo carbonilo para dar el compuesto 6.4. La hidrólisis del i-esterol y la hidrogenación da el compuesto 6.5, que puede convertirse en DCA mediante métodos de síntesis que se han presentado en lo que antecede en la ruta de síntesis N° 1.

Esquema 6. Protección de sistema de anillo A-B mediante formación de i-esteroide (es decir, 3,5-ciclosterol)

La hecogenina (el compuesto 7.1, esquema 7) es un esterol vegetal que se halla abundantemente en los ñames mexicanos y otras plantas de las especies de Agave. La ventaja principal de la hecogenina como un material de partida para la síntesis de DCA es que esta posee una funcionalidad de oxígeno de C12 tal como se encuentra presente en el DCA.

La primera etapa en la ruta de síntesis comenzando a partir de la hecogenina es la reducción estereoselectiva del grupo carbonilo C12 en la hecogenina (el compuesto 7.1) a la configuración C i2-a necesaria (la conversión del compuesto 7.1 en el compuesto 7.2). A continuación el sistema de anillo 3-p-ol, 5a-AB se convierte en el sistema de anillo 3 a-ol, 5p-AB (la conversión del compuesto 7.1, en el compuesto 7.2, y en el compuesto 7.3) (el esquema 7). La bien conocida degradación de Marker (Marker, R. E., Rohrmann, E., Sterols. LXIX. Oxidation Products of Sarsasapogenin. Sarsasapogenoic Acid and Related Substances, J. Am. Chem. Soc, 61 (8): p. 2072 - 2077 (1939)) sigue la conversión del compuesto 7.2 en el compuesto 7.3 para dar el compuesto 7.4. La instalación de la cadena lateral de anillo D (el esquema 8) en el compuesto 8.2 se logra por medio de métodos que se muestran en los esquemas 4 y 5. La cetona C17 necesaria en el compuesto 8.2 se forma por ozonolisis del acetato de enol del compuesto 8.1 (el esquema 8). A continuación, el DCA se prepara a partir de 8.2 de una forma similar a la del esquema 5 usando la secuencia de olefinación y de reacción eno. En los esquemas 9 y 10 se muestran rutas alternativas comenzando a partir de la hecogenina.

Esquema 7. Introducción de grupo hidroxilo C12, modificación de anillo AB y escisión de cadena lateral Esquema 9. Ruta de ditioetano para dar 3-ceto-4-eno

Reducción estereose ec iva

Esquema 10A. Formación de DCA por medio del 3-ceto-4-eno

Las sapogeninas se derivan de la hidrólisis de los sacáridos y disacáridos unidos al grupo hidroxilo C3 de las saponinas (es decir, glicósidos de esteroides). Estos son productos vegetales de aparición generalizada. La saponina aparece en la naturaleza como una estructura de espirocetal tal como se muestra en lo sucesivo. Así mismo, el compuesto 10.3 puede formarse a partir de tigogenina, diosgenina, clorogenina, esmilagenina y hecogenina (el compuesto 7.1). Los inventores de la presente invención creen que el DCA podría sintetizarse a partir de cada una de estas, en concreto, tigogenina, diosgenina, clorogenina, esmilagenina y hecogenina (el compuesto 7.1). (Y. Mazur, N. Danieli y Franz Sondheimer, J. Am. Chem. Soc; 82, 5809 (1960)).

Debido a que los inventores de la presente invención podrían sintetizar DCA a partir de la hecogenina, estos reconocen que cualquiera de las sapogeninas anteriores podría servir de forma similar como un material de partida para la síntesis de DCA.

Esquema 10B. Ruta de síntesis a partir de saponina

5. Ruta de síntesis N° 5 a partir de estigmasterol

El estigmasterol (el compuesto 11.1) es un esterol vegetal disponible de forma generalizada. Como un material de partida para la síntesis de DCA, este presenta una ventaja ya que este contiene un sistema de anillo AB funcionalizado y un resto de cadena lateral fácilmente escindible. Este presenta una desventaja ya que carece de la funcionalidad requerida en el anillo C esencial para la síntesis de DCA.

En esta ruta de síntesis, el anillo AB de estigmasterol (el compuesto 11.1) se protege mediante la formación de iesteroide seguido por ozonolisis para dar una cadena lateral en C17 instalada y reducida al C24-oI como una forma enmascarada del grupo carboxilo (el esquema 11). Las etapas posteriores generan una posición alílica en C12 (el esquema 12). La formación de dieno de anillo B y la oxidación de acetato mercúrico son procesos conocidos y la reducción catalítica del sistema de anillo B da un producto intermedio común con rutas previas que se han descrito en lo que antecede. No obstante, en contraste con otras rutas, la cadena lateral ya se encuentra presente. La oxidación alílica (la conversión del compuesto 12.4 en el compuesto 1.20) y la reducción estereoselectiva (la conversión del compuesto 1.20 en el compuesto 1.21) seguido por etapas que se han analizado previamente, da un producto que se convierte en DCA.

Esquema 11. Ozonolisis de i-esteroide y reducción de cadena lateral

Esquema 12. Formación de trieno y oxidación alílica

12.7

Una variación de la ruta de estigmasterol usa la protección de Diels-Alder del dieno de anillo B. Esto es ventajoso debido a que esta aísla el enlace doble de 9(11) para evitar la posible interferencia durante las etapas de oxidación alílica (el esquema 13).

Esquema 13. Formación de trieno y protección de Diels-Alder del dieno de anillo B

El ergosterol (el compuesto 14.1) es un material de partida inmediatamente disponible y puede usarse para preparar DCA mediante la adaptación de los procedimientos que se exponen en la presente solicitud. La oxidación alílica ofrece una ruta simple para la funcionalidad de oxígeno de C12 (el esquema 14). Esta ruta presenta la ventaja de comenzar con el dieno de anillo B. Esta es convergente con la ruta de estigmasterol.

Esquema 14. Formación de trieno a partir de Ergosterol

Los compuestos de realizaciones preferidas pueden prepararse a partir de materiales de partida inmediatamente disponibles usando los siguientes métodos y procedimientos generales. Se apreciará que, cuando se dan unas condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), también pueden usarse otras condiciones de proceso a menos que se especifique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos o disolvente particulares que se usen, pero tales condiciones pueden determinarse por un experto en la materia mediante procedimientos de optimización de rutina.

Adicionalmente, tal como será evidente para los expertos en la materia, pueden ser necesarios grupos protectores convencionales para evitar que determinados grupos funcionales experimenten unas reacciones no deseadas. Se conocen bien en la técnica grupos protectores adecuados para diversos grupos funcionales así como condiciones adecuadas para proteger y desproteger grupos funcionales particulares. Por ejemplo, se describen numerosos grupos protectores en T. W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Tercera Edición, Wiley, Nueva York, 1999, y referencias que se citan en el mismo.

Los materiales de partida y los reactivos para las reacciones que se describen en el presente documento son compuestos generalmente conocidos o pueden prepararse mediante procedimientos conocidos o modificaciones obvias de los mismos. Por ejemplo, muchos de los materiales de partida y los reactivos se encuentran disponibles de proveedores comerciales tales como Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.), Bachem (Torrance, California, EE. UU.), Emka-Chem o Sigma (St. Louis, Misuri, EE. UU.). Otros pueden prepararse mediante procedimientos, o modificaciones obvias de los mismos, que se describen en textos de referencia convencionales tales como Reagents for Organic Synthesis de Fieser y Fieser, Volúmenes 1 - 15 (John Wiley and Sons, 1991), Chemistry of Carbon Compounds de Rodd, Volúmenes 1 -5 y Complementarios (Elsevier Science Publishers, 1989), Organic Reactions, Volúmenes 1 - 40 (John Wiley and Sons, 1991), Advanced Organic Chemistry de March, (John Wiley and Sons, 4a Edición) y Comprehensive Organic Transformations de Larock (VCH Publishers Inc., 1989).

Ejemplos

Los diversos materiales de partida, productos intermedios y compuestos de las realizaciones preferidas pueden aislarse y purificarse cuando sea apropiado usando técnicas convencionales tales como precipitación, filtración, cristalización, evaporación, destilación y cromatografía. La caracterización de estos compuestos puede realizarse usando métodos convencionales tales como mediante análisis de punto de fusión, de espectro de masas, de resonancia magnética nuclear y diversos otros análisis espectroscópicos.

En lo sucesivo se describen con más detalle unas realizaciones a modo de ejemplo de etapas para realizar la síntesis de productos en la ruta de síntesis N° 1, esquema 1B. La tabla 3 describe abreviaturas que se usan para expresar diversos compuestos / restos / aparatos / procedimiento / propiedad en los esquemas de reacción y las rutas de síntesis a modo de ejemplo que se describen en los siguientes ejemplos y por la totalidad de la memoria descriptiva.

Tabla 3

General: las manipulaciones de los materiales sensibles al oxígeno y a la humedad se realizan con matraces de dos bocas secados con llama bajo una atmósfera inerte de argón. La cromatografía en columna se realiza usando gel de sílice de SE-Make (60- 120 de malla), gel de sílice de Spectrochem (230-400 de malla) u óxido de aluminio 90-neutral. (SD-Fine Chem. Ltd., India). La cromatografía de capa fina (CCF) analítica se realizó sobre placas Merck Kieselgel 60 F254 (0,25 mm) (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ). La visualización de manchas se detectó o bien mediante lámpara de luz UV (254 nm) o bien mediante carbonización con una solución de ácido sulfúrico (5 %) y panisaldehído (3 %) en etanol.

Aparatos: el análisis de los compuestos y productos de los esquemas de reacción y las rutas de síntesis que se describen en el presente documento pueden realizarse sobre los aparatos y el equipo que se describen en lo sucesivo.

Resonancia magnética nuclear (RMN)

Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón y de carbono (RMN de 1H y RMN de 13C) se registran en un espectrómetro Varian Mercury-Gemini 200 (Rm N de 1H, 200 MHz; RMN de 13C, 50 MHz) o un Varian Mercurylnova 500 (RMN de 1H, 500 MHz; RMN de 13C, 125 MHz) (Varian, Inc., Palo Alto, CA) con resonancias de disolvente según los patrones internos (RMN de 1H, CHCh a 7,26 ppm o DMSO a 2,5 ppm y DMSO - H2O a 3,33 ppm; RMN de 13C, CDCl3 a 77,0 ppm o DMSO a 39,5 ppm). Los datos de RMN de 1H se notifican tal como sigue: desplazamiento químico (a, ppm), multiplicidad (s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuartete, a = ancho, m = multiplete), constantes de acoplamiento (Hz) e integración.

Espectroscopia infrarroja

Los espectros infrarrojos (FT-IR) se realizan en un modelo JASCO-460+ (Jasco, Inc., Easton, MD). Los espectros de masas se obtienen con un espectrómetro API-2000 de Perkin Elmer (Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA) usando modo de ES+.

Punto de fusión

Los puntos de fusión se determinaron usando un aparato de medición de punto de fusión de LAB-INDIA (Labindia Instruments Pvt. Ltd., India) y no se corrigen.

Cromatografía líquida de alta presión

Los cromatogramas de HPLC se registraron usando un modelo SHIMADZU-2010 con un detector PDA (Shimadza Corp., Japón).

Actividad óptica

Las rotaciones ópticas ([a]o) específicas se determinan empleando un JASCO-1020 a 589 nm (Jasco, Inc., Easton, MD) y no se corrigen.

Productos químicos: A menos que se haga notar lo contrario, los reactivos comercialmente disponibles se usan sin purificación. Dietil éter y THF se destilan a partir de sodio / cetilo benzofenona. DMF anhidro, DCM, pentano y hexano se obtienen mediante destilación a partir de CaH2.

Ejemplo 1

Preparación de Androstano-3,11,17-triona (1.13)

10 % de Pd / C (2,5 g, 5 % en peso) se añade a una solución de hidrocortisona (el compuesto 1.12) (50,0 g, 138,12 mmol) en DMF (250 ml). La pasta resultante se hidrogena en un aparato de Parr (50 psi, 345 kPa) durante 12 h. Tras la completa desaparición del material de partida, tal como se pone de manifiesto por CCF, la mezcla de reacción en bruto se filtra a través de un pequeño tapón de Celite, y el disolvente se retira a vacío. El producto en bruto (48,0 g) se obtiene como un sólido incoloro.

NaBH4 (2,1 g, 55,3 mmol) se añade a una solución del producto en bruto anterior (48,0 g, 131,86 mmol) en EtOH (500 ml) y CH2O2 (500 ml). Después de 1 h, se añaden acetona (50 ml) y agua (150 ml), seguido por NaIO4 (70,5 g, 329,6 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche.

Se añade agua destilada (500 ml) y la mezcla se extrae con acetato de etilo (3 x 250 ml). La capa de acetato de etilo se lava abundantemente a través de un tapón de gel de sílice y el disolvente se evapora para dar 38 g como un sólido incoloro. El producto en bruto se oxida adicionalmente sin purificación.

Se añade PCC (40,4 g, 187,5 mmol) a una solución del producto en bruto anterior en CH2Cl2 (400 ml) en 3 porciones iguales a lo largo de 30 minutos. La mezcla de reacción resultante se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 -4 h. Tras la compleción de la reacción, según la supervisión mediante CCF, la mezcla de reacción en bruto se filtra de forma secuencial a través de lechos de Celite y gel de sílice y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [59 (anchura) x 700 (longitud) mm, sílice de 60 - 120 de malla, 150 g], eluyendo con acetato de etilo / hexano (3 : 10) [fracciones de 50 ml, elución de 10 ml / min, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.13 = 0,37 y Rf para el compuesto 1.12 = 0,05 en EtOAc / hexano (1 : 1)] para proporcionar el compuesto diastereomérico 1.13 (33,0 g, 79 % de rendimiento) como un sólido incoloro.

El material en bruto obtenido se purificó por HPLC preparativa usando una columna Fenomenex Lunov C18 (250 x 30,0 mm, 10 p) y elución isocrática con CH3CN : H2O (12 : 13) con un caudal de 25 ml / min en fracciones de 15 ml. La HPLC preparativa se usa solo para purificación, pero no para análisis. La tabla 4 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 4

Ejemplo 2

3p-Hidroxi-androstano-11,17-diona (1.14)

K-selectride® (98,39 ml, 98,01 mmol, solución 1 M en THF) se añade a una solución del compuesto 1.13 (33,0 g, 109,27 mmol) en THF (330 ml) a lo largo de 15 minutos bajo una atmósfera inerte a -78 °C y se agita durante aproximadamente 3 -4 h a -78 °C. La mezcla de reacción se interrumpe con una solución de NaOH acuosa (2 M, 70 ml). La mezcla de reacción en bruto se diluye con acetato de etilo (500 ml) y la capa orgánica se lava con agua (3 x 75 ml), una solución de salmuera saturada (100 ml) y se seca sobre MgSO4 (75 g). El disolvente se retira a vacío para dar 33 g del material en bruto. El producto en bruto se somete a acetilación sin purificación.

Purificación del material en bruto

El material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [29 (anchura) x 600 (longitud) mm, sílice de 230 - 400 de malla, 200 g], eluyendo con acetato de etilo / hexano (1 : 4) [fracciones de 25 ml, elución de 5 ml / min, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.14 = 0,3 y Rf para el compuesto 1.13 = 0,37 en EtOAc/hexano (1 : 1)] para dar el compuesto 1.14. La tabla 5 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 5

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Ejemplo 3

Acetato de 3p-hidroxiandrostano-11,17-diona (1.15)

Se añade anhídrido acético (16,6 g, 162,8 mmol) a una solución del compuesto 1.14 (33,0 g, 108,55 mmol) en piridina (150 ml) a 0 °C bajo una atmósfera inerte. La mezcla de reacción resultante se agita durante la noche a temperatura ambiente. Tras la compleción de la reacción, tal como se pone de manifiesto por CCF, se retiran a vacío la piridina y el anhídrido acético restante. El residuo en bruto se diluye con acetato de etilo (500 ml) y se lava con agua (3 x 150 ml), una solución de salmuera saturada (100 ml) y se seca sobre MgSO4 (75 g). El disolvente se evapora a vacío y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [59 (anchura) x 800 (longitud) mm, sílice de 60-120 de malla, 150 g], eluyendo con acetato de etilo/hexano (1 :10 ) [fracciones de 25 ml, elución de 10 m l/m in, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.15 = 0,38 y Rf para el compuesto 1.14 = 0,1 en EtOAc / hexano (3 : 7)] para dar el compuesto 1.15 (19,0 g, 66,4 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 6 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 6

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Ejemplo 4

Acetato de (Z)-3p-hidroxi-5p-preg-17(20)-eno-11-ona (1.16)

Se añade terc-butóxido de potasio (159,28 ml, 159,2 mmol, solución 1 M en THF) a una solución de bromuro de etiltrifenilfosfonio (61,16 g, 164,8 mmol) en THF (150 ml) se añade gota a gota a lo largo de 1 h bajo una atmósfera inerte a -5 °C. La mezcla de reacción de color rosa oscuro resultante se calienta hasta 10 - 15 °C y se agita durante 1 h más a la misma temperatura. Una solución del compuesto 55 (19,0 g, 54,9 mmol) en THF (50 ml) se introduce lentamente en la suspensión de iluro de Wittig anterior a -5 °C. La solución se agita durante 10 -20 minutos más y la mezcla de reacción se deja calentar hasta temperatura ambiente lentamente. La agitación se continúa durante aproximadamente 3 - 4 h. Tras la completa desaparición del material de partida, tal como se pone de manifiesto por CCF, la mezcla de reacción se interrumpe con una solución de NH4Cl acuosa saturada (75 ml). La capa acuosa se extrae con EtOAc (2 x 150 ml) y los extractos orgánicos combinados se lavan con una solución de salmuera saturada (100 ml) y se secan sobre MgSO4 (75 g). El disolvente se retira a vacío y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [49 (anchura) x 600 (longitud) mm, sílice de 60 - 120 de malla, 300 g] eluyendo con acetato de etilo / hexano (1 : 20) [fracciones de 25 ml, elución de 10 ml / min, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.16 = 0,54 y Rf para el compuesto 1.15 = 0,06 en EtOAc/ hexano (1 : 6)] para dar el compuesto 1.16 (15,5 g, 78,8 % de rendimiento) como un líquido incoloro espeso, que solidificó lentamente después de 1 -2 días a 0 °C. La tabla 7 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 7

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Ejemplo 5

Acetato de (E)-3p-hidroxi-5p-cola-16(17),22(23)-dieno-24-oato de metilo (1.17)

Se añade propiolato de metilo (9,68 g, 114,95 mmol) a una solución del compuesto 1.16 (16,5 g, 46 mmol) en CH2O2 (220 ml) 0 °C. La mezcla de reacción se calienta hasta temperatura ambiente y se agita durante 1 h bajo una atmósfera inerte. Se introduce dicloruro de etil aluminio (17,5 g, 137,8 mmol) en la mezcla anterior a 0 °C gota a gota y la masa de reacción resultante se calienta de nuevo hasta temperatura ambiente y se agita durante la noche. Tras la compleción de la reacción, tal como se pone de manifiesto por CCF, la mezcla de reacción en bruto se interrumpe con agua helada (100 ml) y la capa acuosa se extrae con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se lava con una solución de salmuera saturada (100 ml) y se seca sobre MgSO4 (50 g). El disolvente se retira a vacío y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [49 (anchura) x 600 (longitud) mm, sílice de 60 - 120 de malla, 300 g] eluyendo con acetato de etilo / hexano (1 : 7) [fracciones de 15 ml, elución de 10 m l/m in, con supervisión mediante CCF y se detecta o bien con lámpara de luz UV (254 nm) o bien con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.17 = 0,36 y Rf para el compuesto 1.16 = 0,54 en EtOAc / hexano (1 : 6)] para dar el compuesto 1.17 (16 g, 79% de rendimiento) como un semisólido incoloro. La tabla 8 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 8

Ejemplo 6

Acetato de 3p-hidroxi-5p-colan-11-ona-24-oato de metilo (1.18)

Pd / C al 10 % (2,9 g, 20 % en peso) se añade a una solución del compuesto 1.17 (14,5 g, 32,8 mmol) en EtOAc (150 ml). La pasta resultante se hidrogena en un aparato de Parr (50 psi, 345 kPa) durante 12 h. Tras la completa desaparición del material de partida, tal como se pone de manifiesto por CCF [Rf para el compuesto 1.18 = 0,43 y Rf para el compuesto 1.17 = 0,43 en EtOAc/hexano (1 : 3); no obstante solo el compuesto 1.17 es activo a UV del cromóforo de éster conjugado], la mezcla de reacción en bruto se filtra a través de un pequeño tapón de Celite y el disolvente se retira a vacío para dar el compuesto 1.18 (14 g, 95,7 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 9 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 9

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Ejemplo 7

Acetato de 3p-hidroxi-5p-col-9(11)-eno-24-oato de metilo (1.19)

PtO2 (5,0 g, 100 % en peso) se añade a una solución de 1.18 (5,0 g, 11,2 mmol) en EtOAc (75 ml) en presencia de una cantidad catalítica de AcOH (2,0 ml). La pasta resultante se hidrogena en un aparato de Parr (70 psi, 483 kPa) durante aproximadamente 14 -16 h. Tras la compleción de la reacción, la mezcla en bruto se filtra a través de un pequeño tapón de Celite y el disolvente se retira a vacío. El producto en bruto se usa para la reacción de eliminación sin purificación adicional.

SOCl2 (1,98 g, 16,78 mmol) se introduce en una solución del material en bruto anterior en piridina (100 ml) gota a gota a 0 °C. La mezcla de reacción resultante se calienta hasta temperatura ambiente y se agita durante aproximadamente 1 h. Tras la compleción de la reacción, tal como se pone de manifiesto por CCF, la piridina se retira a vacío. El residuo en bruto se diluye con acetato de etilo (100 ml) y se lava con agua (2x50 ml), una solución de salmuera saturada (100 ml) y se seca sobre MgSO4 (40 g). El disolvente se evapora a vacío y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [49 (anchura) x 600 (longitud) mm, sílice de 60 - 120 de malla, 120 g] eluyendo con acetato de etilo / hexano (1 :10 ) [fracciones de 10 ml, elución de 5 ml / min, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.19 = 0,51 y Rf para el compuesto 1.18 = 0,22 en EtOAc/ hexano (1 : 6)] para dar el compuesto 1.19 (4,1 g, 85,4% de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 10 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 10

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Ejemplo 8

Acetato de 3p-hidroxi-5p-col-9(11)-eno-12-ona-24-oato de metilo (1.20)

CrO3 (8,0 g, 100 % en peso, 80,0 mmol) se añade a una solución del compuesto 1.19 (8,0 g, 18,6 mmol) en AcOH (150 ml). La mezcla de reacción resultante se calienta a 60 °C durante aproximadamente 24 - 36 h. Tras la completa desaparición del precursor, el ácido acético se evapora a vacío, y el material en bruto se disuelve en dietil éter (400 ml). La capa orgánica se lava con agua (2 x 100 ml), una solución de salmuera saturada (100 ml) y se seca sobre MgSO4 (40 g). El disolvente se retira a vacío y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [49 (anchura) x 600 (longitud) mm, sílice de 60 - 120 de malla, 120 g] eluyendo con acetato de etilo/hexano (1 : 5) [fracciones de 10 ml, elución de 3 ml / min, con supervisión mediante CCF y se detecta con lámpara de luz UV (254 nm); Rf para el compuesto 1.20 = 0,28 y Rf para el compuesto 1.19 = 0,61 en EtOAc/ hexano (1 : 4)] para dar el compuesto 1.20 (5 g, 60,5 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 11 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 11

Ejemplo 9

Acetato de 3p-hidroxi-5p-colano-12-ona-24-oato de metilo (1.21)

Pd / C al 10 % (30 mg, 10 % en peso) se añade a una solución del compuesto 1.20 (300 mg, 0,675 mmol) en EtOAc (30 ml). La pasta resultante se hidrogena en un aparato de Parr (50 psi, 345 kPa) durante aproximadamente 16 h. Tras la completa desaparición del material de partida mediante CCF [Rf para el compuesto 1.21 = 0,44 y Rf para el compuesto 1.20 = 0,44 en EtOAc / hexano (3 : 7); no obstante solo el compuesto 1.20 es activo a UV de su cromóforo de enona; adicionalmente, la carbonización del compuesto 1.20 es leve pero el compuesto 1.21 es brillante], la mezcla de reacción en bruto se filtró a través de un pequeño tapón de Celite y el disolvente se retira a vacío para dar el compuesto 1.21 (270 mg, 90 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 12 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 12

Ejemplo 10

5p-Cola-3,12-diona-24-oato de metilo (1.22)

NaOH (73 mg, 1,8 mmol) se añade a una solución del compuesto 2.1 (270 mg, 0,6 mmol) en MeOH (10 ml). La mezcla de reacción resultante se agita durante aproximadamente 2 h a temperatura ambiente. Tras la compleción de la reacción, tal como se pone de manifiesto por CCF, MeOH se retira a vacío y el producto en bruto se diluye con acetato de etilo (20 ml). La capa orgánica se lava con una solución de salmuera saturada (10 ml) y se seca sobre MgSO4 (5,0 g). El disolvente se retira a vacío y el material en bruto se usa en la reacción de esterificación sin purificación.

SOCl2 (0,1 ml, 1,35 mmol) se añade gota a gota a una solución del material en bruto anterior en MeOH (10 ml) 0 °C. La mezcla de reacción resultante se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. Tras la compleción de la reacción, MeOH se retira a vacío. La mezcla de reacción en bruto se diluye con EtOAc (30 ml), y la capa orgánica se lava con agua (3 x10 ml), una solución de salmuera saturada (15 ml) y se seca sobre MgSO4 (5 g). El disolvente se evapora a vacío y el producto en bruto se usa para la reacción de oxidación sin purificación.

PCC (1,0 g, 4,6 mmol) se introduce en 3 porciones iguales en una solución del éster obtenido en CH2O2 (25 ml) a lo largo de aproximadamente 5 minutos. La mezcla de reacción resultante se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 -4 h. Tras la compleción de la reacción, tal como se pone de manifiesto por CCF, la mezcla de reacción en bruto se filtra a través de un lecho de Celite. El disolvente se retira a vacío y el material en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [19 (anchura) x 400 (longitud) mm, sílice de 60 - 120 de malla, 45 g] eluyendo con acetato de etilo/hexano (1 : 6) [fracciones de 10 ml, elución de 5 m l/m in, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el compuesto 1.22 = 0,57 y Rf para el compuesto 1.21=0,71 en EtOAc / hexano (2 : 3)] para dar el compuesto 1.22 (170 mg, 70,8 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 13 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 13

Ejemplo 11

Desoxicolato de metilo (éster de 1.22)

LiAlH(O-(Bu) (332 mg, 1,3 mmol,) se introduce gota a gota en una solución del compuesto 1.22 (150 mg, 0,37 mmol) en THF (10 ml) bajo una atmósfera inerte a temperatura ambiente. Después de agitarse durante aproximadamente 4 - 5 h, la mezcla de reacción se interrumpe con HCl acuoso (2 ml, 1 N) y la mezcla en bruto se diluye con EtOAc (30 ml), se lava con agua (15 ml), una solución de salmuera saturada (10 ml) y se seca sobre MgSO4 (3 g). El disolvente se retira a vacío, y la masa en bruto se purifica mediante cromatografía en columna [29 (anchura) x 500 (longitud) mm, sílice de 230 - 400 de malla, 50 g] eluyendo con MeOH / CH2Cl2 (1 : 20) [fracciones de 5 ml, elución de 3 ml / min, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído; Rf para el éster del compuesto 1.22 = 0,42 y Rf para el compuesto 1.22 = 0,85 en MeOH / CH2O2 (1 : 9)] para dar desoxicolato de metilo (el éster del compuesto 1.22) (110 mg, 72,8 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 14 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 14

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Ejemplo 11

Ácido desoxicólico

Una solución de LiOH (23 mg, 0,55 mmol) en H2O (2,0 ml) se añade a una solución de éster de 1.22 (110 mg, 0,27 mmol) en THF (4 ml). La mezcla de reacción resultante se agita durante aproximadamente 2 - 3 h a temperatura ambiente. Tras la desaparición del éster mediante CCF [Rf para el compuesto DCA= 0,35 y Rf para el éster del compuesto 1.22 = 0,42 en MeOH /CH2Cl2 (1 : 9)], la mezcla de reacción en bruto se diluye con acetato de etilo (10 ml) y se tritura con una solución de salmuera saturada para obtener una clara separación de la capa orgánica. La capa orgánica se lavó con una solución de NH4Cl saturada (10 ml), y se secó sobre MgSO4 (3,0 g). El disolvente se retira a vacío y cualquier traza de agua se retira al azeotropar con tolueno (3 x 5 ml) para dar ácido desoxicólico (DCA) (100 mg, 94,3 % de rendimiento) como un sólido incoloro. La tabla 15 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 15

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El rendimiento de productos para los procesos a modo de ejemplo que se describen en los ejemplos 1 a 11 se describe en la tabla 16.

Ejemplo 12

9a-Hidroxi-5p-androstan-3,17-diona (2)

A una solución de 9a-hidroxiandrost-4-en-3,17-diona 1 (30,0 g, 99,3 mol) en DMF (150 ml) se añadió 10 % de Pd / C (2,1 g) y la pasta resultante se hidrogenó en un aparato de Parr (60 psi, 414 kPa) durante 12 h. Tras la completa desaparición del material de partida, tal como se pone de manifiesto por CCF, la mezcla de reacción en bruto se filtró a través de un pequeño lecho de Celite®, y el disolvente se retiró a vacío para proporcionar un sólido incoloro (30,0 g). Este sólido se combinó con acetona (90 ml.) a 0 °C y la pasta resultante se agitó durante 1 h. A continuación este se filtró, se lavó con acetona (30 ml) enfriada (0 °C) y se secó a vacío en el mismo embudo de filtración a temperatura ambiente para dar el compuesto 2 (26,0 g, 86 %). La tabla 17 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 17

Ejemplo 13

5p-Androst-9(11)-en-3,17-diona (3)

A una solución del compuesto 2 (26,0 g, 85,4 mmol) en DCM (520 ml) se añadió ácido sulfúrico concentrado (7,53 g, 76,8 mmol) a lo largo de 15 minutos bajo una atmósfera inerte a 10 °C. La temperatura se elevó hasta 25 °C y la solución resultante se agitó durante 2 h. En este punto no quedó más material de partida tal como se pone de manifiesto por CCF. La reacción se interrumpió mediante la adición de una solución de NaHCO3 acuosa al 10 % (200 ml). Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo dos veces con DCM (2 x 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron de forma secuencial con agua (100 ml) y una solución de salmuera saturada (100 ml). La fase orgánica a continuación se secó sobre Na2SO4 (75 g) y se filtró. El filtrado se evaporó a vacío para proporcionar el compuesto 3 (23,0 g, 94 %) como un sólido de color blanco apagado. Este producto se usó “tal cual” en la siguiente etapa sin purificación adicional. La tabla 18 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 18

Ejemplo 14

3a-hidroxi-5p-androst-9(11)-en-17-ona (4)

Una solución de THF de hidruro de litio y tri-ferc-butoxialuminio (1,0 M, 84,4 ml, 84,4 mmol) se añadió a una solución fría (-40 °C) del compuesto 3 (23,0 g, 80,4 mmol) en THF (230 ml) bajo una atmósfera inerte. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 2 h. En este punto se determinó que se había completado la reacción, tal como se pone de manifiesto por CCF, y la mezcla de reacción se interrumpió mediante la adición de una mezcla de HCl 1 N (200 ml) y acetato de etilo (230 ml). La mezcla de dos fases resultante se separó y la capa acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron de forma secuencial con agua (150 ml) y una solución de salmuera saturada (100 ml). La fase orgánica a continuación se secó sobre Na2SO4 (75 g) y se filtró. El filtrado se evaporó a vacío para dar el compuesto 4 (23,0 g) como un sólido de color blanco apagado. El producto en bruto anterior se usó “tal cual” en la siguiente etapa sin purificación. La tabla 19 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 19

Ejemplo 15

(Z)-3a-Hidroxi-5p-pregna-9(11),17(20)-dieno (6)

Una solución de ferc-butóxido de potasio en THF (1 M, 230 ml, 231 mmol) se añadió gota a gota a una suspensión de bromuro de etiltrifenilfosfonio (88,7 g, 239 mmol) en THF (150 ml) a lo largo de 1 h a 25 °C. La mezcla de color rojo oscuro resultante se agitó durante 1 h más a 25 °C. Una solución del compuesto 4 (23,0 g, 79,7 mmol) en THF (230 ml) se añadió lentamente a la mezcla de color rojo a 25 °C. La mezcla resultante se agitó durante 3 -4 h, punto en el que se determinó que se había completado mediante CCF. La reacción se interrumpió mediante la adición de una solución de NH4Cl acuosa saturada (75 ml). Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo tres veces con EtOAc (3 x 150 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron, se lavaron con una solución de salmuera saturada (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 (75 g) y se filtraron. El filtrado se concentró a vacío y el sólido en bruto se purificó mediante cromatografía en columna [49 mm (anchura) x 600 mm (longitud), sílice de 60 - 120 de malla, 300 g] eluyendo con acetato de etilo / hexanos (1 : 9). Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron, proporcionando el compuesto 6 (19,1 g, 80,0 %) como un sólido de color blanco. La tabla 20 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 20

Ejemplo 16

(Z)-3a-Acetoxi-5p-pregna-9(11),17(20)-dieno (7a)

El compuesto 6 (19,0 g, 63 mmol) se disolvió en CH2Cl2 (380 ml). Trietilamina (17,6 ml, 126,6 mmol), DMAP (0,772 g, 6 mmol) y anhídrido acético (8,98 ml, 94 mmol) se añadieron de forma secuencial a 25 °C bajo una atmósfera inerte de nitrógeno. La solución resultante se agitó durante 2 h a 25 °C, punto en el que se determinó mediante CCF que se había completado la reacción. La reacción se interrumpió mediante la adición de agua helada (100 ml) y las fases se separaron. La capa acuosa se extrajo tres veces con DCM (3 x 150 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron y se lavaron con una solución de salmuera saturada (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 anhidro (50 g) y se filtraron. El filtrado se concentró a vacío para dar el compuesto 7a (22,0 g, 95 % de rendimiento) como un sólido de color blanco apagado. La tabla 21 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 21

Ejemplo 17

3a-Acetoxi-5p-col-9(11), 16, 22-trien-24-oato de (E)-metilo (8a)

Dicloruro de etil aluminio (104,5 ml, 192 mmol, 1,8 M en tolueno) se añadió a una solución de propiolato de metilo (13,58 ml, 153 mmol) en DCM (100 ml) a 0 °C bajo una atmósfera inerte. La solución resultante se agitó durante 15 min y a continuación se añadió el compuesto 7a (22 g, 64,3 mmol). Después de agitar durante 20 min más a 0 °C, la temperatura se elevó hasta 25 °C y se mantuvo allí durante 18 h más. En este punto se determinó que se había completado la reacción mediante CCF, y la mezcla se vertió en agua fría (0 °C) (200 ml). Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con DCM (150 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron de forma secuencial con agua (200 ml) y una solución de salmuera saturada (100 ml). A continuación se secó sobre Na2SO4 anhidro (40 g) y se filtró. El filtrado se concentró a vacío y el sólido resultante se purificó mediante suspensión en metanol (280 ml) para proporcionar el compuesto 8a (17,5 g 68 %) como un sólido de color blanco. La tabla 22 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 22

Ejemplo 18

3a-Acetoxi-5p-col-9(11)-en-24-oato de metilo (9a)

A una solución del compuesto 8a (17,5 g, 41 mmol) en EtOAc (350 ml) se añadió PtO2 (4,37 g), y la pasta resultante se hidrogenó en un aparato de Parr (70 psi, 483 kPa) durante 14 -16 h. En este punto se determinó que se había completado la reacción mediante CCF. La mezcla se filtró a través de un pequeño tapón de Celite® y el disolvente se retiró a vacío, dando el compuesto 9a (17,0 g, 96,0 %) como un sólido de color blanco. El producto anterior se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La tabla 23 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 23

Ejemplo 19

3a-Acetoxi-5p-col-9(11), 16-dien-24-oato de metilo (8b)

Dicloruro de etil aluminio (14,2 ml, 25 mmol, 1,8 M en tolueno) se añadió a una solución de acrilato de metilo (1,89 ml, 20 mmol) en DCM (60 ml) a 0 °C bajo una atmósfera inerte. La solución resultante se agitó durante 15 min y a continuación se añadió el compuesto 7a (3 g, 8,7 mmol). Después de agitar durante 20 min más a 0 °C, la temperatura se elevó hasta 25 °C y se mantuvo allí durante 18 h más. En este punto se determinó que se había completado la reacción mediante CCF, a continuación la mezcla se vertió en agua fría (0 °C) (60 ml). Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con DCM (60 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron de forma secuencial con agua (50 ml) y una solución de salmuera saturada (100 ml). A continuación se secó sobre Na2SO4 anhidro (5 g) y se filtró. El filtrado se concentró a vacío, proporcionando el compuesto 8b (2,6 g, 70 %). La tabla 24 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 24

Ejemplo 20

3a-Acetoxi-5p-col-9(11)-en-24-oato de metilo (9a)

A una solución del compuesto 8a (3 g, 7 mmol) en EtOAc (60 ml) se añadió Pd / C al 10 % (300 mg, 10 % peso / peso), y la pasta resultante se hidrogenó en un aparato de Parr (70 psi, 483 kPa) durante 14-16 h. En este punto se determinó que se había completado la reacción mediante CCF (acetato de etilo al 10 % en hexanos). La mezcla se filtró a través de un pequeño tapón de Celite® y el disolvente se retiró a vacío, dando el compuesto 9a (2,6 g, 86 %) como un sólido de color blanco. La tabla 25 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 25

Ejemplo 21

3a-Acetoxi-5p-col-9(11)-en-12-ona-24-oato de metilo (10a)

CrO3 (17,0 g, 170 mmol) se añadió a una solución del compuesto 9a (17 g, 39,5 mmol) en AcOH (270 ml). La mezcla resultante se calentó a 50 °C durante 24 - 36 h. Tras la completa desaparición del material de partida mediante CCF, el disolvente se evaporó a vacío y el material en bruto se disolvió en acetato de etilo (400 ml) y agua (200 ml). Las dos fases se separaron y la capa orgánica se lavó dos veces con agua (2x 100 ml) y a continuación una vez con una solución de salmuera saturada (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro (40 g) y se filtró. El filtrado se concentró a vacío y el sólido resultante se purificó mediante cromatografía en columna [49 mm (anchura) x 600 mm (longitud), sílice de 60 - 120 de malla, 120 g], eluyendo con acetato de etilo / hexano (1 : 5) [fracciones de 10 ml, elución de 3 ml / min, con supervisión mediante c Cf y se detectó con lámpara de luz UV (254 nm)]. Las fracciones que contienen producto se combinaron y se concentraron a vacío para dar el compuesto 10a (8,8 g, 50% de rendimiento) como un sólido de color blanco. La tabla 26 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 26

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Pureza de ELSD| 94,6 %: Tiempo de retención = 8,68 (Inertsil ODS 3V, 250 x 4,6 mm, 5 Mm, ACN : Agua (60 : 40)

Ejemplo 22

3a-Acetoxi-5p-colan-12-ona-24-oato de metilo (11a)

Pd / C al 10 % (900 mg) se añadió a una solución del compuesto 10a (2,0 g, 4,5 mmol) en EtOAc (150 ml) y la pasta resultante se hidrogenó en un aparato de Parr (50 psi, 345 kPa) a 50 °C durante 16 h. En este punto se determinó que se había completado la reacción mediante CCF. La mezcla se filtró a través de un pequeño tapón de Celite® y el disolvente se retiró a vacío, proporcionando el compuesto 11a (1,6 g, 80 % de rendimiento) como un sólido de color blanco. La tabla 27 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 27

Ejemplo 23

3a-Acetoxi-12a-hidroxi-5p-colan-24-oato de metilo (12a)

Una solución de THF de hidruro de litio y tri-ferc-butoxialuminio (1 M, 22,4 ml, 22,4 mmol) se añadió gota a gota a una solución del compuesto 11 a (2,5 g, 5,6 mmol) en THF (25 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 4 - 5 h más, se determinó que se había completado la reacción mediante CCF. La reacción se interrumpió mediante la adición de HCl acuoso (1 M, 10 ml) y la mezcla se diluyó con EtOAc (30 ml). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó de forma secuencial con agua (15 ml) y una solución de salmuera saturada (10 ml). La fase orgánica a continuación se secó sobre Na2SO4 anhidro (3 g) y se filtró. El filtrado se concentró a vacío y el sólido resultante se purificó mediante cromatografía en columna [29 mm (anchura) x 500 mm (longitud), sílice de 60 - 120 de malla, 50 g], eluyendo con EtOAc / hexano (2 : 8) [fracciones de 5 ml, con supervisión mediante CCF con carbonización de p-anisaldehído]. Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron a vacío para proporcionar el compuesto 12a (2,3 g, 91 %) como un sólido de color blanco. La tabla 28 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 28

Ejemplo 24

Ácido desoxicólico (DCA)

Una solución de LiOH (187 mg, 4,4 mmol) en H2O (2,0 ml) se añadió a una solución del compuesto 12a (500 mg, 1,11 mmol) en THF (8 ml) y MeOH (8 ml). La mezcla resultante se agitó durante 3 -4 h a 50 °C. Tras la completa desaparición del material de partida mediante CCF, la mezcla de reacción se concentró a vacío. Una mezcla de agua (10 ml) y HCl 3 N (1 ml) se combinó y se enfrió hasta 0 °C y a continuación se añadió al producto en bruto. Después de agitar durante 1 h a 0 °C, los sólidos precipitados se filtraron y a continuación se lavaron con agua (10 ml) y hexano (20 ml). El secado a vacío a temperatura ambiente proporcionó ácido desoxicólico (DCA, 400 mg, 91 % de rendimiento) como un sólido de color blanco. La tabla 29 describe las propiedades medidas del producto.

Tabla 29

Ejemplo de referencia 25

Se incubaron adipocitos humanos primarios con concentraciones variables de desoxicolato de sodio sintético que se sintetiza usando 9-HAD como material de partida o desoxicolato de sodio derivado de bovino que se obtiene de Sigma tal como se describe en lo sucesivo.

Materiales

Adipocitos (Zen-Bio N° de cat. SA-1096)

Placas de 96 pocillos (US Scientific N° de cat. cellstar con N° 655180)

Medio RPMI libre de suero (Mediatech N° de cat. 17 - 105-CV)

Desoxicolato de sodio (DC) (Sigma N° de cat. D6750)

Glicodesoxicolato de sodio sintético (Kythera)

PBS (1 x)

Kit de ensayo MTS (Promega N° de cat. G3580)

Los adipocitos llegaron diferenciados y a una densidad de 13.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se recibieron dos placas y cada una se trató con las mismas muestras. Las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Una solución madre al 1 % de cada ácido biliar (DCA sintético y no sintético) se realizó mediante la disolución de 20 mg en 2 ml de medios (libres de suero). Usando la solución madre al 1 %, las siguientes 11 soluciones se prepararon mediante dilución: 0,005 %, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025 %, 0,03%, 0,035%, 0,04%, 0,05%, 0,06 % y 0,1 %, así como 0 % (solo medios).

Las células se lavaron 2 x con 150 pl de PBS 1 x (solución salina tamponada con fosfato) a temperatura ambiente. Se retiraron los medios y a continuación PBS de los pocillos en una placa de 96 pocillos volteando la placa y decantando el líquido en un recipiente. Después del último lavado con PBS, se añadieron 80 pl de muestra por pocillo. Cada concentración de un ácido biliar específico se añadió a 8 pocillos y se incubó durante 1 hora a 37 °C con CO2 al 5 %. Las placas a continuación se retiraron de la incubadora y la solución se decantó. Una solución de 100 pl de reactivo de MTS diluido (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna) (40 pl en 1 ml de RPMI) se añadió directamente a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % hasta que los pocillos de control (no los de ácido biliar) cambiaron de color a marrón anaranjado y a continuación se cargaron en un espectrofotómetro que analiza placas de 96 pocillos. Las muestras se realizaron con un ajuste de longitud de onda de 490 nm.

La viabilidad celular se evaluó usando un kit (MTS) de ensayo colorimétrico de Promega. Los resultados muestran una disminución dependiente de la dosis en la supervivencia celular tras el tratamiento o bien con NaDC sintético o bien con NaDC de Sigma (véase la figura 2). Ambas moléculas mostraron un comportamiento citolítico similar en este experimento, lo que indica que el NaDC sintético y el NaDC de Sigma derivado de bovino son funcionalmente idénticos en términos de su capacidad para destruir adipocitos.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Método de preparación de un compuesto de fórmula 12:

   

   en la que P es un grupo protector y R es alquilo, comprendiendo dicho método hacer reaccionar un compuesto de fórmula 11:

   

   en la que P y R se definen como en la fórmula 12, con LiAl(OtBu)3H para proporcionar un compuesto de fórmula 12.

   Método según la reivindicación 1, que comprende además exponer el compuesto de fórmula 12 a condiciones de desprotección para formar un éster del mismo.

   Método según la reivindicación 2, que comprende además exponer dicho éster a condiciones de hidrólisis adecuadas para formar ácido desoxicólico:

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.