CN106083969B - 合成胆汁酸组合物、方法和制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合成胆汁酸组合物、方法和制剂。更具体而言，本发明涉及脱氧胆酸和相关组合物，所述组合物不含任何动物源部分并且不含致热原部分。

Description

合成胆汁酸组合物、方法和制剂
本申请为申请日2008年6月18日，申请号200880019212.7，名称为“合成胆汁酸组合物、方法和制剂”的发明专利申请的分案申请。
相关申请案交叉参考
本申请案主张优先于在2007年6月19日申请的美国临时专利申请案第60/945,035号和在2007年8月20日申请的美国临时专利申请案第60/956,875号；优先于在2008年2月21日申请的美国实用新型专利申请案第12/035,339号和在2008年5月16日申请的美国实用新型专利申请案第12/153,446号；并且优先于在2008年4月25日申请的英国专利申请案第0807615.0号，每个所述专利都是全文以引用方式并入本文中。
技术领域
概括地说，本发明涉及胆汁酸和相关组合物和方法。在一方面中，本发明涉及脱氧胆酸和相关组合物、可用中间体、和其合成方法。在另一方面中，本发明涉及本发明组合物的用途和用作医药组合物的方法以及制造其的方法。重要的是，本发明胆汁酸并非自天然产生这些酸的哺乳动物和微生物分离，并且因此不含任何与所述有机体相关的毒素和污染物。在另一方面中，本发明涉及脱氧胆酸和其医药上可接受的盐和中间体的合成。
背景技术
人们对研究胆汁酸和(尤其)胆汁酸化学的胆酸学的关注已延续了大半个世纪。尽管对胆汁酸化学已了解很多，但其涉及众多种化学实体，其中许多具有惊人特性。综述可参见(例如)穆霍帕德亚,S.(Mukhopadhyay,S.)和U.麦特拉(U.Maitra.),当代科学(CurrentScience)87:1666-1683(2004)(“胆汁酸化学和生物学(Chemistry and biology of bileacids)”)，其是以引用方式并入本文中。
胆汁酸的特征在于两个连接单元，即刚性类固醇核和脂肪族短侧链(见本申请案的图1)。参见霍夫曼,A.F.(Hofmann,A.F.)等人。胆汁酸的建议名称参见脂质研究期刊(J.Lipid Res.)33:599-604(1992)。核和侧链二者具有大量可能的立体排列方式。可通过个别环的扩展或收缩来改变核，并且可使侧链缩短或延长。此外，胆酸分子的两部分都具有大量可能的极性取代基。电离基团可存于核或侧链上。最后，偶合基团可存于核上(例如硫酸根、葡萄糖醛酸酯、磷酸根)或存于侧链上(甘氨酸或牛磺酸或其它氨基酸，或甚至糖类)。侧链结构决定了化合物的种类(胆酸或胆酸盐)。
胆酸是两亲性化合物，其具有兼性和两亲性“面”，参见霍夫曼,A.F.，生理科学新闻报(News Physiol.Sci.)14:24-29(1999)(“胆汁酸：好的，坏的，和丑陋的(Bile Acids:The good,the Bad,and the Ugly)”，第25页，图1)。
通常，将疏水表面称作“β面”并且将亲水表面称作“α面”。一般来说，β面为脂溶性并且α面极性相对较强。存在多种胆汁酸，例如那些在疏水面和亲水面上具有极性基团(在天然存在的胆汁酸中为羟基)者，例如熊脱氧胆酸。分子的两亲性使得其形成具有两亲性的水不溶性脂质的混合胶粒，例如磷脂酰胆碱。除非胆汁酸超过临界浓度(称作临界胶粒化浓度)，否则胆汁酸不能溶解呈混合胶粒形式的膳食脂质。
在人体中所发现的最主要胆汁酸是鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸。脱氧胆酸也称作脱氧胆酸盐、胆烷酸、和3α,12α-二羟基-5β-胆烷酸盐。在人体中，脱氧胆酸用于乳化脂肪以供在肠中吸收。在研究中，使用脱氧胆酸作为分离膜相关蛋白的温和洗涤剂。当脱氧胆酸基本纯净时，其呈白色至灰白色晶体粉末形式。脱氧胆酸是肝脏所产生四种主要酸之一。其可溶于醇和乙酸中。脱氧胆酸的CAS号是[83-44-3]。
快速去除脂肪是古老的理想，并且人们已宣称很多物质可达成这种结果，但很少显示其真正起作用。由于安全性和效能方面的问题，“美塑疗法(Mesotherapy)”或使用注射物来去除脂肪并未被从业医师广泛接受，但自20世纪50年代以来已主张采用顺势疗法和美容疗法。欧洲首先提出了美塑疗法，其是采用含有多种治疗局部医学和美容状况的化合物的混合物的皮肤注射剂的方法。尽管在传统上采用美塑疗法来缓解疼痛，但近来在美国人们开始关注其美容应用，尤其是脂肪和蜂窝组织的去除。一种经如此报导的用于局部减少脂肪的治疗(其在巴西很受欢迎并且采用磷脂酰胆碱注射剂)被误认为与美塑疗法含义相同。尽管其因被传言为“脂肪溶解”注射而具有吸引力，但大多数患者和医师仍不明确这些美容治疗的安全性和效能。参见罗汤达,A.M.(Rotunda,A.M.)和M.卡罗尼(M.Kolodney)，皮肤外科学(Dermatologic Surgery)，32:465-480(2006)(“美塑疗法和磷脂酰胆碱注射：历史说明和回顾(Mesotherapy and Phosphatidylcholine Injections:HistoricalClarification and Review)”)。
WO 2006/133160(其包括图在内的全部内容以引用方式并入本文中)阐述脂肪雕塑方法，例如通过将神经肽Y受体拮抗剂投与脂肪储存位点来减小脂肪储存。克罗宁M.G.(Kolonin M.G.)等人，自然医学(Nat.Med.)6月10(6):625-32(2004)阐述具有有效脂肪细胞杀灭效应的脂肪选择性促凋亡肽。所述促凋亡肽需要到达脉管系统以实施杀灭。
近期公开的文献报导，当将脱氧胆酸注射至体内脂肪沉积中时，脱氧胆酸具有脂肪去除特性。参见WO 2005/117900和WO 2005/112942，以及美国专利第US2005/0261258号、美国专利第US2005/0267080号、美国专利第US2006/127468号、和美国专利第US20060154906号，所有所述专利的包括图在内的全部内容都是以引用方式并入本文中。注射至脂肪组织中的脱氧胆酸盐具有两种效应：1)其通过溶胞机制杀灭脂肪细胞；和2)其使皮肤绷紧。达成期望美容整形(即体形塑造)同时需要这两种效应。由于注射至脂肪中的脱氧胆酸盐因暴露于蛋白质中而迅速失活并且随后迅速返回肠内含物中，因此其效应在空间上受到限制。由于此衰减效应可赋予临床安全性，脂肪去除治疗通常需要4-6个疗程。此无需手术的局部脂肪去除不仅有利于病理性局部脂肪沉积(例如在治疗HIV时伴随医疗干预的血脂异常)的治疗性治疗，也有利于美容性脂肪去除，并且不存在手术(例如抽脂法)中固有的伴随风险。参见罗汤达等人，皮肤外科学，30:1001-1008(2004)(“脱氧胆酸钠的洗涤剂效应是用于局部化脂肪溶解的可注射磷脂酰胆碱调配物的主要特征(Detergent effectsof sodium deoxycholate are a major feature of an injectablephosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution)”)和罗汤达等人，美国皮肤病学会杂志(J.Am.Acad.Dermatol.)2005:973-978(“用皮下脱氧胆酸盐注射来治疗脂肪瘤(Lipomas treated with subcutaneous deoxycholate injections)”)，两个文献都是以引用方式并入本文中。
医药级胆汁酸制剂可以相对低的成本在市场上购得。此低成本是因为以下事实：胆汁酸得自动物躯体，尤其是诸如牛和绵羊等大型动物。重要的是，如同所有动物源药剂，人们担心动物源胆汁酸产物可能含有动物病原体和其它有害因子，例如动物或微生物代谢产物和毒素，包括诸如致热原等细菌性毒素。
所述动物病原体可包括朊病毒，其被视为可引发朊病毒疾病的传染性病原蛋白类型。朊病毒疾病是神经系统的变性病症。人们认为一种此等疾病，即“疯牛”病(被认为是克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)的变种)，是由存于来自病牛的食用牛肉中的朊病毒所引发。大多数病例是具有未知传播模式的散发型；某些病例是遗传型；并且少量病例是通过医疗程序传播。人类朊病毒疾病通过消耗受感染材料而蔓延在历史上与库鲁病(kuru)有关并且近年来与变种CJD有关。其它动物朊病毒疾病(绵羊瘙痒症、传染性水貂脑病、鹿类的慢性消耗性疾病、和牛海绵样脑病)似乎都是通过接触受感染动物或通过消耗受感染食物而横向传播。由于传播模式不同、种间屏障不可预测、组织中感染性的分布可变、和在某些疾病中所发现的种系变异，关于朊病毒疾病的风险评价和对未来事件的预测难于确定。
一般来说，动物产物可能会暴露于产生致热原(致发烧物质)的微生物中。如肠出血性大肠杆菌(E.coli.)对食物的污染所证实，食物和/或医药产品的细菌污染物也是一个严重问题。在所述污染中涉及诸如牛肉等产品以及诸如苹果、菠菜、和类似物等作物。在所述案例中，是细菌所产生的毒素(而非细菌自身)在人体中产生有害效应。所述有害效应包括严重腹泻、肾衰竭和在极端情况下的死亡。必须实质上除去所有医药组合物中的细菌性内毒素(一类致热原)。
动物产品一般是通过消除法来纯化，即终产物是除去杂质后的剩余材料，而非自混合物选择终产物。并且除了诸如病原体等可能的动物部分外，自动物源纯化的另一人为因素是终产物是一或多种胆汁酸的混合物。例如，脱氧胆酸的市售制剂含有某些鹅脱氧胆酸以及胆酸，胆酸在哺乳动物胆汁酸合成中是脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸二者的前体。由于未预先选定脱氧胆酸/鹅脱氧胆酸/胆酸的确切比例，在意欲大量制造胆汁酸时此可导致批次间差异。所述批次间差异可能会造成问题并且在获得监管部门批准或品质控制中、尤其在制造医药组合物的努力中可能会需要额外步骤。显然，制造者在制造胆汁酸医药组合物时需要批次间的可预测性。
目前，关于含有动物病原体和其它有害因子的动物源产品的问题已通过自经隔离并且经检查的动物获得产物来解决。例如，来自新西兰动物的脱氧胆酸是在美国管理制度下用于人体的胆汁酸来源，只要动物继续保持隔离或不含有可观察到的病原体即可。
也就是说，需要此类政府控制的管理制度以便在注射动物源药物时识别动物病原体传播的固有风险。倘若可获得非动物药物替代品，则不再需要政府管理制度。具有相关优点的所述替代品(替代动物源药物的非动物性药物)实例是人用胰岛素。美国已于1998年停止制造牛胰岛素，并且在2006年1月停止制造人用猪胰岛素。尽管可自已知尚未接触过会引发BSE的致病因子或其它致病因子的牲畜获得动物胰岛素，但制造设施或制程可能会使动物成份暴露于已接触过病原体的动物中。通过使用以重组方式或合成方式制造的胰岛素可消除致病因子传播至人类的风险。对于消费者来说，胰岛素的情形具有指导性：倘若可自由地获得合成物质，则在理论上可消除动物病原体传播的风险。对于制造者来说，若能够制造基本不含动物病原体物质的纯净化学实体则有利于达成安全、优质、和管理目的。此外，与自生物来源获得的产品相比，合成制程所提供的产品通常具有更高可重现性。
目前，由于动物躯体来源的胆汁酸相当丰富，工业尚未进步至完全以化学方式来合成胆汁酸，或使用植物甾醇或微生物起始材料来制备胆汁酸。并且尽管已合成出胆汁酸衍生物，但由于动物材料成本低并且易于获得，因此所述工作的类固醇化学仍主要使用动物源胆汁酸作为起始材料。尽管在历史上人们在植物甾醇研究中付出大量努力，但仍未开发出便于市售的植物甾醇源胆汁酸的医药级组合物。参见(例如)穆霍帕德亚,S.和U.麦特拉.，当代科学87:1666-1683,1670(2004)(应注意，根据1981年参考文献(龟谷(Kametani)等人，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)103:2890(1981)(“(+)-鹅脱氧胆酸的第一次总合成(First Total Synthesis of(+)-Chenodeoxycholic Acid)”)，此时尚未曾实施任何胆汁酸的总合成))。已使用诸如细菌等微生物所产生胆汁酸作为细菌产物在原位用于(例如)海洋溢油清除中。参见马尼拉(Maneerat)等人，实用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)76:679-683(2004)(“胆汁酸是海洋细菌香味菌属(Myroides)菌株SM1的新产物(Bile acids are new products of a mariene bacterium,Myroides sp.Strain SM1)”)。
为实现脱氧胆酸去除脂肪的全部潜力，必须进一步解决使用动物源产品的相关问题。显然，业内需要适量的已知原本就不含动物源部分(或能作用于动物、尤其哺乳动物并且在用于人类时可对人类产生有害效应的病原部分)和其它有害因子(例如动物或微生物代谢产物、毒素，包括诸如致热原等细菌性毒素)的有效胆汁酸和相关组合物(例如脱氧胆酸)以供用作人用药物。本发明通过提供以合成方式制备并且不具有动物病原体和其它有害因子的潜在风险的胆汁酸组合物来解决此问题。所揭示胆汁酸组合物可用于脂肪分解治疗并且可用于局部脂肪去除领域的进一步研究和研发性工作中。
发明内容
本文提供足量适宜胆汁酸作为所定义医药组合物，并且提供其合成方法。由此提供的胆汁酸组合物和方法并非自天然产生胆酸的哺乳动物或微生物分离。在一方面中，提供不含任何动物源部分和哺乳动物和/或细菌致热原的特定脱氧胆酸医药组合物以及相关制造方法和用途。在另一方面中，提供足量适宜脱氧胆酸作为所定义医药组合物，其可用作局部去除脂肪的可注射医药组合物，并且提供相关组合物、制造方法和使用方法。本发明所定义脱氧胆酸盐注射物可与通过正交机制消除脂肪的分子(例如NPY拮抗剂和/或脂肪选择性促凋亡肽)组合来提供可用于以较少治疗疗程和更有效方式达成体形塑造的药剂。在另一方面中，本发明提供与合成脱氧胆酸和其医药上可接受的盐相关的方法和中间体。以合成方式制备的脱氧胆酸可用于去除脂肪的脂肪分解治疗。
附图说明
图1是表现胆汁酸结构的图，其包括胆酸骨架中碳的编号系统。
图2展示用本发明合成脱氧胆酸钠处理后原代人脂细胞的细胞存活率的剂量依赖性降低相对于牛源脱氧胆酸钠(西格玛(Sigma))的相似性。
图3展示胆酸是两亲性化合物，其具有兼性和两亲性“面”。
具体实施方式
以引用方式并入
本说明书中所提及所有出版物和专利申请案都是以引用方式并入本文中，其并入程度如同明确并且单独地指明以引用方式并入每一个别出版物或专利申请案一般。
具体实施方式
定义
在整个本发明中，各个出版物、专利和公开专利说明书都是以等同引用方式来参照。此处，这些出版物、专利和所公开专利说明书的揭示内容都是以引用方式并入本发明中以更充分地阐述本发明所属技术领域的状态。
本文所用某些术语具有以下所定义含义。除非上下文明确表示其它含义，否则说明书和权利要求书中所用单数形式“一(a、an)”和“所述”包括单数和复数含义。
除非另外说明，否则说明书和权利要求书中所用表示成份数量、反应条件等的所有数值在所有情况下均应理解为受术语“约”修饰。因此，除非表明相反含义，否则以下说明书和随附权利要求书中所述数值参数都是近似值。至少应根据所报告有效数字位数并且通过采用一般舍入技术来解释每一数值参数。
术语“乙酰化试剂”是指可将乙酰基CH3C(O)-添加至分子的试剂。
术语“酸”是指质子供体并且包括有机酸和无机酸二者。
术语“烷基”是指具有1至10个碳原子并且优选地具有1至6个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。此术语包括(例如)直链和具支链烃基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)、和新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“芳基”是指具有6至12个碳原子的单价芳香族碳环基团，其具有单环(例如苯基)或多个稠环(例如萘基)。
术语“动物源”是指源自包括多细胞生物和单细胞生物的生物界(动物界)中任一种生物。
术语“脱水剂”是指可与水反应的试剂。在一方面中，脱水剂可与自分子移除的水反应。
术语“脱硫剂”是指可与硫化物反应的试剂。在一方面中，脱硫剂可与含硫化物分子反应以自分子移除硫化物基团。
术语“乙二硫醇或二噻烷前体”是指通过与羰基反应可形成乙二硫醇或二噻烷的试剂。
术语“亲电乙酰基”是指作为亲电体的乙酰基，亲电体是受电子吸引并且易于接受电子的基团。
术语“氢化剂”是指可向分子提供氢的试剂。
术语“路易斯酸(Lewis acid)”是指电子对受体。路易斯酸包括有机金属试剂，例如烷基卤化铝(例如Et2AlCl和MeAlCl2)。
术语“哺乳动物源”是指源自任何哺乳动物。术语“哺乳动物”是指以乳腺分泌的乳汁养育幼仔的温血高等脊椎动物(例如胎生动物、有袋类动物、或单孔类动物)纲(哺乳纲)，其皮肤通常或多或少经毛发覆盖，并且包括人类。
术语“微生物源”是指源自任何微生物。术语“微生物”是指圆形、螺旋形、或杆形单细胞原核微生物领域(细菌领域)，其可能缺少细胞壁或若其具有细胞壁则为革兰氏(gram)阳性或革兰氏阴性，其经常聚集成菌落或可藉助鞭毛来移动，其通常生存于土壤、水、有机物质、或植物和动物体内，其营养方式通常是自养、腐生或寄生，并且其特征在于其生化效应和致病性。
术语“烯化剂”是指与酮反应以形成对应烯烃的试剂。术语“烯烃形成条件”是指实施所述转化的适宜条件。所述试剂的实例包括魏悌希(Wittig)试剂和魏悌希烯化条件。
术语“氧化剂”是指可在氧化还原反应中接受电子的试剂。以此方式，可将卤素或氧添加至分子中或可自分子移除氢。
术语“病原体”是指疾病的具体致病因子。
“医药上可接受的盐”是指自业内熟知的各种有机和无机异荷离子衍生的医药上可接受的盐，并且包括(仅例如)钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、铵盐、和四烷基铵盐。适宜盐包括那些阐述于以下文献中者：P.海因里希斯塔尔(P.Heinrich Stahl)、卡米尔G.韦穆特(Camille G.Wermuth)(编辑)，药物盐特性、选择和应用手册(Handbook ofPharmaceutical Salts Properties,Selection,and Use)；2002。这些医药上可接受的盐可通过使DCA与适宜碱反应来制备。出于例示性目的，所述碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、或氢氧化锂。或者，所述盐可通过用碱水解DCA的酯和省略任何可产生DCA的酸处理来制备。
术语“还原剂”是指在氧化还原反应中可提供电子的试剂。以此方式，可自分子移除卤素或氧，或可将氢添加至分子中。
组合物和使用方法
在本文所述各方面中，本发明提供用于医药用途的组合物(和可用中间体)、其合成方法、和本发明医药组合物的使用方法。
重要的是，本发明胆汁酸组合物不具有自动物起始材料获得的材料中的固有风险，并且因此不需要针对动物源材料的详细检查和管控。因此在一方面中，本发明涉及不含诸如哺乳动物病原体等动物源材料，并且实质上不含诸如致热原等细菌源毒素的胆汁酸医药组合物。
脱氧胆酸钠是天然产生的胆酸盐，其可在消化道内溶解膳食脂质。其是通过复杂的生物合成途径采用胆固醇作为起始材料在体内产生，并且所述途径同时涉及人类和细菌酶二者。脱氧胆酸盐的主要功能是通过溶解膳食脂质以促进吸收来辅助消化过程。在体内，脱氧胆酸盐的生物合成始于肝脏中胆固醇的酶促氧化、异构化、和还原，从而形成胆酸，其是在结构上与其胆固醇母体类似的胆汁酸(史屈尔L(Stryer L)，第27章：膜脂和类固醇的生物合成(Biosynthesis of Membrane Lipids and Steroids)，生物化学(Biochemistry)，1995，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)：纽约，第691-707页)。然后在肝脏中，胆酸以化学方式连接两种氨基酸(牛磺酸或甘氨酸)之一而形成‘偶合’胆酸(即L-甘胆酸盐和牛磺胆酸盐)。然后这些偶合胆酸储存于胆囊中直至食用食物。食用食物后，胆汁溶液自胆囊中释放至肠中，其中偶合胆酸分子发生两次由肠道菌群所产生酶介导的额外化学修饰(李德龙J.M.(Ridlon J.M.)、康D.J.(Kang D.J.)和希尔梦P.B.(Hylemon P.B.)，人类肠细菌的胆汁酸盐生物转化(Bile salt biotransformations byhuman intestinal bacteria),脂质研究期刊,47(2)：第241-59页(2006))。首先，使偶合胆酸去羟基以形成偶合脱氧胆酸盐。然后使偶合脱氧胆酸盐去偶合以形成游离脱氧胆酸盐，其与其它胆汁酸一起参与膳食脂质的溶解。由于脱氧胆酸盐位于胆酸合成的下游，因此胆酸可能是存于脱氧胆酸盐天然来源中的杂质。
脱氧胆酸盐在水中以333mg/mL溶解，在醇中少量溶解，并且在丙酮和冰乙酸中溶解度甚至更低。可以约2.4mg/mL的临界胶粒浓度以上的脱氧胆酸钠浓度和中性pH来达成胶粒的可逆形成(松冈K,M.Y.(Matsuoka K,M.Y.)，脱氧胆酸钠和乌索脱氧胆酸钠的胶粒形成(Micelle formation of sodium deoxycholate and sodium ursodeoxycholate)(部分1)，生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta.)，1580(2-3)：第189-99页(2002))。在2.4mg/mL的临界胶粒浓度以上的浓度下，脱氧胆酸盐可形成胶粒并且能溶解细胞、脂质、和蛋白质。在诸如0.4mg/mL等较低浓度下(与禁食状态相当)和在26mg/mL白蛋白(其接近35-50mg/mL的血清生理浓度)存在下，98％脱氧胆酸盐与白蛋白结合(洛达A.(Roda A.)等人，胆汁酸与人血清白蛋白交互作用的容量现象(Quantitative aspects of theinteraction of bile acids with human serum albumin)，脂质研究期刊,23(3)：第490-5页(1982))。
优选实施例涉及脱氧胆酸(DCA)或其前药、或所述化合物或前药医药上可接受的盐、以及相关组合物和方法，其中脱氧胆酸(DCA)是：
其中所述化合物并非自天然产生DCA的哺乳动物或微生物分离。
其它优选实施例也涉及DCA的立体异构体和其医药上可接受的盐，并且涉及合成DCA和其立体异构体和盐时的中间体以及相关组合物和方法。
任选地，本发明胆汁酸医药组合物呈盐形式，并且任选地另外含有医药上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂。在一方面中，本发明涉及化合物和医药上可接受的赋形剂，所述化合物是脱氧胆酸(DCA)或其前药、或所述化合物或前药医药上可接受的盐：
其中所述化合物并非自天然产生DCA的哺乳动物或微生物分离。
盐制备的优选阳离子可选自由以下组成的群组：钠(Na+)、钾(K+)、锂(Li+)、镁(Mg2 +)、钙(Ca2+)、钡(Ba2+)、锶(Sr2+)、和铵(NH4 +)。也可自碱金属或碱土金属来制备盐。碱金属可选自钠(Na+)、钾(K+)、和锂(Li+)。碱土金属可选自由镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、钡(Ba2+)、和锶(Sr2 +)组成的群组。用作局部去除脂肪的医药组合物的优选胆酸盐是脱氧胆酸钠。
也涵盖各实施例中化合物的前药。前药是活性或非活性化合物，在将前药投与患者后其通过体内生理作用(例如水解、代谢和诸如此类)以化学方式被修饰为各实施例中的化合物。例如，可制备本发明脱氧胆酸或其衍生物的C1-C10酯或酰胺，从而通过细胞膜的破裂和酯酶的释放来触发脱氧胆酸或其衍生物的释放。伴随着酯酶的释放，酯保护基团断裂，从而使得脱氧胆酸活性形式或其衍生物原位存于期望位置。所述C1-C10酯任选地可包括1-4个选自氧、硫或氮的杂原子；任选地具有1-4个选自氧、硫或氮的杂原子的烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、己基等；在任何可接受取代点任选地具有1-4个杂原子并且总共具有最多10个碳原子的烷基苯基，例如苄基或乙基苯基；和诸如苯基等芳基。酰胺的实例包括(但不限于)异羟肟酸盐。涉及酯的前药的概述可参见斯文松(Svensson)和特内科(Tunek)，药物代谢评论(Drug Metabolism Reviews)165(1988)和班德格阿德(Bundgaard)，药物设计(Design of Prodrugs)，埃尔塞维尔科学出版社(Elsevier)(1985)，其是全文以引用方式并入本文中。脱氧胆酸的C1-C10酯或酰胺的合成为业内所熟知。例如，可在无机酸存在下于酯化反应中通过脱氧胆酸与醇的反应来合成酯。
脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸的天然结构显示如下。显示四个环(A、B、C、D)以及自D环延伸的羧酸侧链。
脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸(CDCA)或其衍生物的酯、异羟肟酸盐、和羟基酰胺的某些实例非限制性地阐述于下文中。通过D环侧链上羧基的酯化反应，不同官能团可附接至脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸上来生成前药。这些D环侧链酯的某些实例非限制性地展示于表1中。
表1.与脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸的D环侧链偶合的官能团
脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸和其衍生物的释放可通过细胞膜的破裂和酯酶的释放来触发。伴随着酯酶的释放，酯保护基团可断裂从而使得脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸的活性形式或其衍生物原位存于期望位置。
脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和其衍生物的前药也包括可能具有与天然分子相反的立体化学的差向异构体。这些差向异构体分子的实例展示于表2中。
表2.脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和其衍生物的差向异构体
注射本发明实施例的胆汁酸组合物后可能出现局部刺激，并且因此需要同时或依次投与局部麻醉剂。例如，利多卡因(lidocaine)通常用于人体中，并且可作为共调配物(存于相同容器中并且同时注射)或共注射物(自不同容器注射)来投与。诸如利多卡因等麻醉剂可通过诸如贴剂或软膏剂等局部制剂来投与。
对于较深组织来说，可将麻醉剂更深地注射至目标组织中或全身性投与(例如全身麻醉、硬膜外麻醉或其它已知方法)。
存于本发明溶液中的胆汁酸或胆汁酸盐的浓度可为约0.001-10、0.01-5、或0.1-2％(w/w、w/v、或v/v)。优选地，存于上述溶液中的胆酸或胆酸盐的浓度可为约0.1-5％w/w或更优选为约1％w/w。在某些实施例中，脂肪溶解溶液最多包含100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.05、0.02、或0.01克的一或多种洗涤剂、胆汁酸和/或胆汁酸盐，例如脱氧胆酸或其盐或脱氧胆酸钠。
在优选实施例中，本发明溶液不包括任何脂质、磷脂或磷脂酰胆碱。在某些实施例中，本发明溶液最多包括5％(w/w、w/v、或v/v)脂质、磷脂或磷脂酰胆碱。
在某些实施例中，上述溶液可另外包含选自由以下组成的群组的第二治疗药剂：抗微生物剂、血管收缩药、抗血栓药、抗凝血药、抑泡剂(suds-depressant)、消炎剂、镇痛药、分散剂、抗分散剂、渗透促进剂、类固醇、镇静剂、肌肉松弛剂、和抗腹泻药。在某些实施例中，溶液存于最多可含500mL溶液的容器中。所述容器可为注射器或可装载注射器的容器。
在某些实施例中，组合物和方法另外包含已知可通过正交机制消除脂肪的分子。所述分子包括神经肽Y(NPY)受体拮抗剂，包括(但不限于)NPY受体拮抗剂，例如BIBP-3226(阿目金(Amgen))、BIBO-3304(柏林格殷格汗(Boehringer Ingleheim))、BMS-192548和AR-H040922(百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)、LY-357897(礼来(Eli Lilly))、1229U91和GW438014S(葛兰素史克(GlaxoSmithKline))、JNJ-5207787(强生(Johnson&Johnson))、Lu-AA-44608(灵北(Lundbeck))、MK-0557(默克(Merck)NPY)、NGD-95-1(纽罗根(Neurgogen))、NLX-E201(纽罗吉科斯(Neurologix))、CGP-71683(诺华(Novartis))、PD-160170(辉瑞(Pfizer))、SR-120819A、BIIE0246、和S.A.0204(赛诺菲安万特(SanofiAventis))、S-2367(施永利(Shiongli))、作为NPY受体拮抗剂的二氢吡啶和二氢吡啶衍生物、作为NPY受体拮抗剂的二环化合物、咔唑NPY受体拮抗剂、和作为NPY受体拮抗剂的三环化合物。参见(例如)WO 2006/133160和美国专利第6,313,128号(其包括图在内的全部内容都以引用方式并入本文中)。也涵盖脂肪选择性促凋亡肽，例如寻靶至白色脂肪脉管系统的CKGGRAKDC肽。参见克罗宁M.G.等人，自然医学，6月10(6):625-32(2004)。
在一方面中，本发明涉及减少个体中皮下脂肪沉积的方法。所述方法包含向个体中的皮下脂肪沉积局部投与组合物的步骤，所述组合物包含：(i)脂肪溶解有效量的一或多种药理学活性洗涤剂或胆汁酸和/或胆汁酸盐、或脱氧胆酸或其盐、或脱氧胆酸钠；(ii)医药、兽医、或美容赋形剂；和(iii)(任选地)脂质，其中脂质与胆汁酸或胆汁酸盐的比最高为1％w/w并且其中所述组合物不包括脂肪酶或辅脂肪酶。在某些实施例中，脂肪沉积与选自由以下组成的群组的病况相关：肥胖症、脂肪再分布综合症、眼睑脂肪疝出、脂肪瘤、德尔肯氏病(Dercum's disease)、脂肪代谢障碍、水牛背部脂肪代谢障碍、颈背面脂肪、内脏脂肪过多、乳房胀大、肥胖过度、身体脂肪在躯干和臂周围扩散、和与蜂窝组织相关的脂肪沉积。在优选实施例中，上述方法不包括对所述个体实施手术。
在一方面中，本发明涉及自哺乳动物中的所选位置去除脂肪沉积的方法，其包含向有需要的哺乳动物投与治疗有效量的DCA或其前药或所述DCA或前药医药上可接受的盐：
其中所述化合物并非自天然产生DCA的哺乳动物或微生物分离。
在一实施例中，本发明方法可另外包含向哺乳动物投与至少一种选自由神经肽Y(NPY)受体拮抗剂和脂肪选择性促凋亡肽组成的群组的额外活性成份。在一实施例中，神经肽Y(NPY)受体拮抗剂选自由以下组成的群组：BIBP-3226、神经肽Y5拮抗剂(阿目金NPY受体拮抗剂)、BIBO-3304(柏林格殷格汗NPY受体拮抗剂)、BMS-192548(百时美施贵宝NPY受体拮抗剂)、AR-H040922(百时美施贵宝NPY受体拮抗剂)、LY-357897(礼来NPY受体拮抗剂)、埃斯特韦(Esteve)NPY-Y5受体拮抗剂、1229U91(葛兰素史克NPY受体拮抗剂)、GW438014S(葛兰素史克NPY受体拮抗剂)、JNJ-5207787(强生NPY受体拮抗剂)、Lu-AA-44608(灵北NPY受体拮抗剂)、MK-0557(默克NPY受体拮抗剂)、NGD-95-1(纽罗根NPY受体拮抗剂)、NLX-E201(纽罗吉科斯NPY受体拮抗剂)、CGP-71683(诺华NPY受体拮抗剂)、PD-160170(辉瑞NPY受体拮抗剂)、SR-120819A(赛诺菲安万特NPY受体拮抗剂)、BIIE0246(赛诺菲安万特NPY受体拮抗剂)、S.A.0204(赛诺菲安万特NPY受体拮抗剂)、S-2367(施永利NPY受体拮抗剂)、作为NPY受体拮抗剂的二氢吡啶、作为NPY受体拮抗剂的二氢吡啶衍生物、作为NPY受体拮抗剂的二环化合物、咔唑NPY受体拮抗剂、和作为NPY受体拮抗剂的三环化合物。参见(例如)WO 2006/133160和美国专利第6,313,128号(其包括图在内的全部内容都是以引用方式并入本文中)。在一实施例中，脂肪选择性促凋亡肽是寻靶至白色脂肪脉管系统的CKGGRAKDC肽。参见克罗宁M.G.等人，自然医学，6月10(6):625-32(2004)。
在一方面中，本发明涉及在个体皮肤区域中还原皮肤病况外观的方法。所述方法包含以下步骤：向所述皮肤区域局部投与包含以下的组合物：(i)紧肤有效量的一或多种药理学活性洗涤剂、或胆汁酸和/或胆汁酸盐、或脱氧胆酸或其盐、或脱氧胆酸钠，(ii)医药、兽医、或美容赋形剂，和(iii)(任选地)脂质。在某些实施例中，投与步骤涉及通过皮下或经皮注射递送本发明组合物。在某些实施例中，所治疗或改善的皮肤病况选自由以下组成的群组：皮肤松垂、皮肤衰老、皮肤不规则、和皱纹。在某些实施例中，所治疗皮肤区域是在眼下、颏下、臂下、臀部、颊、眉毛、小腿、背部、大腿、踝部、或腹部。
在某些实施例中，将用于在皮肤区域还原皮肤病况外观的组合物调配为紧肤溶液。所述紧肤溶液可另外包含选自由以下组成的群组的第二治疗药剂：抗微生物剂、血管收缩剂、抗血栓药、抗凝血药、抑泡剂、消炎药、镇痛药、分散剂、抗分散剂、渗透促进剂、类固醇、镇静剂、肌肉松弛剂、和抗腹泻药。
在优选实施例中，洗涤剂包含选自由以下组成的群组的胆汁酸：脱氧胆酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、7-α-去羟基鹅脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、上述胆汁酸中任一种的二羟基牛磺酸、三羟基牛磺酸和甘氨酸偶合物。在某些实施例中，洗涤剂包含具有选自由以下组成的群组的阳离子的胆汁酸盐：钠(Na+)、钾(K+)、锂(Li+)、镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、钡(Ba2+)、锶(Sr2+)、和铵(NH4+)。在某些实施例中，洗涤剂包含具有碱金属或碱土金属阳离子的胆汁酸盐。优选地，碱金属为钠(Na+)、钾(K+)、或锂(Li+)并且碱土金属为镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、钡(Ba2 +)、或锶(Sr2+)。更优选地，胆汁酸盐是脱氧胆酸钠。
另一实施例提供在哺乳动物中乳化脂肪的方法，其包含向有需要的哺乳动物投与治疗有效量的化合物，所述化合物是DCA或其前药或所述DCA或前药医药上可接受的盐：
其中所述化合物并非自天然产生DCA的哺乳动物或微生物分离。
另一实施例提供溶解磷脂酰胆碱的方法，其包含混合磷脂酰胆碱与有效量的化合物，所述化合物是DCA或其前药或所述DCA或前药医药上可接受的盐，
其中所述化合物并非自天然产生DCA的哺乳动物或微生物分离。
本发明另一方面涉及混合诸如脱氧胆酸(DCA)等脂肪-烧蚀性胆汁酸与杀灭脂肪细胞的试剂。在一方面中，本发明涵盖通过混合以正交机制消除脂肪的分子与脱氧胆酸盐注射物来增强脱氧胆酸盐注射美容效果的方式。所述候选分子的实例包括(但不限于)本文所述神经肽Y(NPY)拮抗剂和脂肪选择性促凋亡肽。由于达成期望效应需要脂肪细胞杀灭和紧肤二者，因此可通过添加具有有效脂肪细胞杀灭效应的分子来增强具有脂肪消除能力和有效紧肤效应的试剂(例如脱氧胆酸盐)的效应。此外，由于脱氧胆酸盐可导致脉管渗漏，因此需要到达脉管系统才能实施杀灭的分子(例如结合毛细血管腔面上所表达蛋白质的某些促凋亡肽)可到达这些蛋白。因此，所述试剂可与脱氧胆酸盐具有协同性，从而可能在更少治疗疗程中以更有效方式达成体形塑造。
合成方法
在其它实施例中，本发明提供合成DCA的化合物、盐、和前药以及其相关中间体的方法。
本文所用类固醇支架的编号遵循图1中所示的一般惯例。
因此，本发明提供制备脱氧胆酸(DCA)或其酯或其医药上可接受的盐的方法：
所述方法包含：
(a)在氢化条件下使9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮1与H2反应以形成化合物2
(b)使化合物2与酸反应以形成化合物3
(c)使化合物3与还原剂反应以形成化合物4，其呈4与5的混合物形式
(d)在烯烃形成条件下使化合物4与二碳烯化剂反应以形成化合物6
(e)将化合物6转化为式7化合物，其中P是保护基团
(f)在路易斯酸存在下使式7化合物与丙炔酸烷基酯CHCC(O)OR或丙烯酸烷基酯CH2＝CHC(O)OR反应(其中R是烷基)以形成式8化合物，其中P是保护基团，R是烷基，并且虚线是单键或双键；
(g)在氢化条件下使式8化合物与H2反应以形成式9化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
(h)使式9化合物与氧化剂反应以形成式10化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
(i)在氢化条件下使式10化合物与H2反应以形成式11化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
(j)使式11化合物与还原剂反应以形成式12化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
和
(k)使式12化合物暴露于去保护条件下以形成其酯，并且任选地使其暴露于适宜水解条件下以形成脱氧胆酸或其医药上可接受的盐。
本发明也提供下文方案1中所示的以下中间体，其中P和R是如上文中所定义。
方案1.合成脱氧胆酸(DCA)
在一实施例中，(a)项中的氢化条件包含Pd/C催化剂。
在一实施例中，(b)项中的酸是无机酸。在某些方面中，无机酸是H2SO4。
在一实施例中，(c)项中的还原剂是LiAl(OtBu)3H。
在一实施例中，(d)项中的二碳烯化剂是诸如Ph3PCH2CH3 +Br-等魏悌希试剂。
在一实施例中，化合物7-12的保护基团P是-C(O)CH3。在某些方面中，将化合物6暴露于酰化条件下以形成7a，例如通过用乙酸酐或诸如Et3N、吡啶和/或二甲胺基吡啶等有机碱处理6来达成。
在一实施例中，(f)项中的路易斯酸是EtAlCl2。
在一实施例中，(f)项中的丙炔酸烷基酯是丙炔酸甲酯。
在一实施例中，(f)项中的丙烯酸烷基酯是丙烯酸甲酯。
在一实施例中，(g)项中的氢化条件包含PtO2或Pd/C催化剂。
在一实施例中，(h)项中的氧化剂是CrO3。
在一实施例中，(i)项中的氢化条件包含Pd/C催化剂。
在一实施例中，(j)项中的还原剂是LiAl(OtBu)3H。
在一实施例中，当P为-C(O)CH3时，(k)项中的去保护和水解条件包含使化合物12与碱土金属氢氧化物、碱土金属醇盐、或二者的混合物反应。在某些方面中，水解条件包括酸处理以获得脱氧胆酸。在其它方面中，省略酸处理以获得对应盐。
在一实施例中，碱土金属醇盐是LiOH。
在一实施例中，脱氧胆酸的盐可通过与碱土金属醇盐或氢氧化物反应来制备。脱氧胆酸的盐包括钠(Na+)、钾(K+)、和锂(Li+)盐。
在一实施例中，提供选自由以下组成的群组的中间体化合物
9α-羟基-5β-雄甾烷-3,17-二酮(2)；
5β-雄甾-9(11)-烯-3,17-二酮(3)；
(Z)-3α-羟基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(6)；
(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(7a)；
(E)-3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16,22-三烯-24-酸甲酯(8a)；
3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16-二烯-24-酸甲酯(8b)；
3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-12-酮-24-酸甲酯(10a)；和
3α-乙酰氧基-5β-胆烷-12-酮-24-酸甲酯(11a)。
医药组合物和投与模式
组合物可包括所揭示化合物以及至少一种医药上可接受的赋形剂。可接受的赋形剂无毒性、有助于投与、并且对所揭示化合物的治疗益处无不良影响。所述赋形剂可为所属领域技术人员通常可获得的任一固体、液体、半固体或(在气溶胶组合物情况下)气体赋形剂。
固体医药赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、无水脱脂乳和诸如此类。液体和半固体剂赋形剂可选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括那些源于石油、植物或合成油者，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选液体载剂(尤其用于可注射溶液者)包括水、盐水、水性右旋糖、和二醇。
一般来说，优选实施例的化合物可通过具有类似效用的药剂的任一已接受投与模式以治疗有效量来投与。优选实施例的化合物(即活性成份)的实际量可取决于诸如以下等多种因素：欲治疗疾病的严重程度、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物的效能、投与途径和形式、和其它因素。药物可每日投与一次以上，优选地每日投与一次或两次。所有这些因素都为会诊医师所熟知。
调配物中化合物的量可在所属领域技术人员所用整个范围内变化。可制备本文所述各方面中的本发明组合物，其中以重量/水相体积计或在假定水密度(即重量与体积之间的比为1:1)时以w/w计，脱氧胆酸部分在约0.5％-10％范围内。在另一方面中，本发明实施例涉及浓度最高为稀释剂饱和点的当前所述医药组合物。可根据诸如浓度和pH等条件来选择触变粘度。参见(例如)穆霍帕德亚,S.和U.麦特拉,当代科学87:1666-1683(2004)，第1680页。
在某些实施例中，投与步骤涉及通过经皮贴剂、泵、或皮下储存来递送本发明组合物。在某些实施例中，投与步骤涉及以局部或皮下方式递送本发明组合物。在具体实施例中，投与步骤涉及局部(例如皮下或真皮下)投与至所述个体的眼下、颏下、臂下、臀部、小腿、背部、大腿、或腹部区域。可通过皮下或经皮注射来达成投与。
合成方案
下文提供完成胆汁酸医药组合物的化学合成的方法和可用中间体的其它实例。
以下这些阐述和实例提供自天然产生DCA的哺乳动物或微生物提取此化合物的替代方案。本发明中意欲使用合成途径1-6来合成脱氧胆酸(DCA)。合成途径1B和实例1-11展示自氢化可的松合成DCA。
1.始于肾上腺雄酮通过9(11)-烯或11,12-烯的第1A合成途径
方案1A(下文)的可的松(化合物1.1)广泛用作完全合成材料。可使用氯铬酸吡啶鎓(PCC)使其有效断裂以形成C17酮化合物。此生成肾上腺雄酮(化合物1.2)的断裂也可使用HIO4或铋酸钠(NaBiO3)来达成。将化合物1.2转化为化合物1.3的反应是已知化学过程。化合物1.3向化合物1.4的转化涉及单缩酮化。之后的步骤是3-酮-4-烯再生，选择性还原4,5-烯(H2/Pt/DMF)以产生C5β-构型，并且将C3羰基选择性还原为期望3α-构型以产生化合物1.5。在将化合物1.5转化为化合物1.6时添加保护基团并且随后将产物还原，从而产生C11β-醇(同轴构型)，即化合物1.7，其适合发生区域选择性消除反应而生成关键的9(11)-烯(即化合物1.7转化为化合物1.8)。
合成方案在此处分支，其中化合物1.7可用作转化为化合物1.8或化合物1.9的起始材料。由于C11羟基与C9氢原子之间存在反式双轴关系，因此用于将化合物1.7转化为化合物1.8的消除反应具有区域选择性。产生化合物1.9的异构C11-C12烯烃的替代消除模式也具有区域选择性，其涉及顺式热消除(即化合物1.7转化为化合物1.9)。
方案1A.合成DCA中C12羟基的两个C环前体
化合物1.8的烯丙位氧化(通过用CrO3和3,5二甲基吡唑处理)产生含烯酮化合物1.10。化合物1.9自类固醇的α-位向发生过酸氧化以产生C11-12环氧化物化合物1.11(参见上述方案1A)。这些化学转化产生C12羟基官能团的两个关键前体，即化合物1.10和化合物2.1(方案1A和2)。
所属领域技术人员应理解，可将上述可的松途径修改为始于氢化可的松，氢化可的松具有相同碳骨架和相同的氧原子相对布局，并且氢化可的松与可的松的差别仅在于C-11载氧碳原子的氧化状态不同。氢化可的松是在市场上购得并且此化合物的各种合成是已知的(什切尔巴(Szczebara)等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)21:143-149(Feb.2003))，其包括总化学合成(伍德沃R.B.(Woodward R.B.)等人，美国化学协会杂志74:4223(1952))。酮1.13是通过α,β-不饱和双键的氢解自氢化可的松1.12开始合成(方案1B)，之后使用硼氢化钠实施整体酮还原以使得可使用NaIO4使1,2-二醇断裂，由此在类固醇环系统的D环上形成C17酮。之后用氯铬酸吡啶鎓(PCC)氧化来产生1.13。用处理1.13，之后用乙酸酐/吡啶实施乙酰化以获得受保护醇1.15。之后用魏悌希试剂烯化1.15来提供烯烃1.16，然后用丙炔酸甲酯和乙基二氯化铝处理1.16以形成二烯1.17。在对两个双键实施氢化后，还原酮1.18，并且在用存于吡啶中的SOCl2处理后消除所得醇中间体以获得烯烃1.19。用CrO3对烯烃1.19实施烯丙位氧化并且在氢化条件下还原双键以获得酮1.21。去除乙酸根保护基团并且氧化所得醇以获得二酮1.22。用LiAlH(O-tBu)3还原1.22并且水解甲酯以获得DCA。
方案1B.自氢化可的松合成DCA
化合物1.10和2.1的进一步转化展示于方案2中。首先修饰化合物1.10以使其含有与DCA相同的经适度官能化的C环系统(方案2)。立体选择性还原C12羰基以产生化合物2.1，并且对存于化合物2.1中的9(11)双键实施催化氢化而获得化合物2.2。
方案2.使用烯丙位氧化途径引入C12α-羟基
方案3展示将含环氧化物的化合物1.11转化为方案2的类似C12α-羟基类固醇化合物2.2。
方案3.C11-C12环氧化物的立体选择性还原
如上所述，在这两种途径中形成共同中间体化合物2.2。
合成DCA的下一步骤是修饰存于化合物2.2中的D环，以使所述化合物含有DCA的经羧基侧链取代的D环(方案4和方案5)。
方案4.去保护和魏悌希反应
首先水解化合物2.2的C17缩酮和C3甲硅烷醚基。然后实施魏悌希反应以产生化合物4.2。通过烯反应实施化合物4.2向化合物5.1的转化。之后催化还原化合物5.1并水解酯来产生DCA(方案5)。
方案5.用以安装DCA侧链的烯反应和催化还原
2.始于可的松通过肾上腺雄酮的第2合成途径(异类固醇(3,5-环甾醇)途径)
肾上腺雄酮(化合物1.2，方案6)在C17的选择性缩酮化、硼氢化物还原、甲磺酰化、和缓冲水解产生含有异类固醇(3,5-环甾醇)的化合物6.1。化合物6.1发生9(11)-烯形成(化合物6.1转化为化合物6.2，方案6)和烯丙位氧化(化合物6.2转化为化合物6.3，方案6)，之后实施羰基还原以产生化合物6.4。异甾醇的水解和氢化产生化合物6.5，可通过上文第1合成途径中所示合成方法将其转化为DCA。
方案6.通过形成异类固醇(即3,5-环甾醇)来保护A-B环系统
3.始于番麻皂素(Hecogenin)的第3合成途径
番麻皂素(化合物7.1，方案7)是在墨西哥山药(Mexican yam)和其它龙舌兰属(Agave)植物中大量发现的植物甾醇。番麻皂素作为DCA合成起始材料的主要优势在于，其C12氧官能度与DCA一致。
始于番麻皂素的合成途径中的第一步骤是将番麻皂素(化合物7.1)中的C12羰基立体选择性还原为所需C12-α构型(化合物7.1转化为化合物7.2)。然后使3-β-醇、5α-AB环系统转化为3α-醇、5β-AB环系统(化合物7.1转化为化合物7.2，转化为化合物7.3)(方案7)。在化合物7.2转化为化合物7.3后，通过熟知的马克(Marker)降解(马克R.E.、罗尔曼E.(Rohrmann,E.)，萨尔萨皂苷元、萨尔萨皂苷元酸和相关物质的甾醇类LXIX.氧化产物(Sterols.LXIX.Oxidation Products of Sarsasapogenin.Sarsasapogenoic Acid andRelated Substances)，美国化学协会杂志，61(8)：第2072-2077页(1939))产生化合物7.4。可通过方案4和5中所述的方法来达成将D环侧链(方案8)安装至化合物8.2中。化合物8.2中所需的C17酮是通过臭氧分解化合物8.1的乙酸烯醇酯来形成(方案8)。然后以与方案5中类似的方式使用烯化和烯反应序列自8.2制备DCA。始于番麻皂素的替代途径展示于方案9和10中。
方案7.C12羟基的引入，AB环修饰和侧链断裂
方案8.侧链引入
方案9.二硫乙烷途径生成3-酮-4-烯
方案10A.通过3-酮-4-烯形成DCA
4.始于皂苷配基(Sapogenin)的第4合成途径
皂苷配基得自与皂苷C3羟基连接的糖和二糖的水解(即类固醇糖苷)。这些皂苷配基是广泛存在的植物产物。在自然界中皂苷是以下文所示的螺酮缩醇结构存在。化合物10.3也可自剑麻皂素(tigogenin)、薯蓣皂苷配基(diosgenin)、克洛皂苷元(chlorogenin)、异菝葜皂苷元(smilagenin)和番麻皂素(化合物7.1)形成。吾等确信DCA可自这些化合物中的每一种来合成，即剑麻皂素、薯蓣皂苷配基、克洛皂苷元、异菝葜皂苷元和番麻皂素(化合物7.1)。(Y.马祖尔(Y.Mazur)、N.达涅利(N.Danieli)和弗朗茨松徳海姆(Franz Sondheimer)，美国化学协会杂志；82,5809(1960))。
既然可自番麻皂素合成DCA，则可确定任一上述皂苷配基都同样可用作DCA合成的起始材料。
方案10B.始于皂苷的合成途径
5.始于豆甾醇的第5合成途径
豆甾醇(化合物11.1)是可自多种途径获得的植物甾醇。作为DCA合成的起始材料，其优势在于其含有官能化AB环系统和易于断裂的侧链部分。其缺点在于其C环中缺乏DCA合成所需关键官能团。
在此合成途径中，通过异类固醇形成来保护豆甾醇(化合物11.1)的AB环，之后实施臭氧分解以形成安装于C17的侧链并且将其还原为呈羧基掩蔽形式的C24-醇(方案11)。随后的步骤在C12生成烯丙型位置(方案12)。B环二烯形成和乙酸汞氧化是已知方法并且对B环系统实施催化还原以产生与上述先前途径共有的中间体。然而，与其它途径相反，侧链已经存在。实施烯丙位氧化(化合物12.4转化为化合物1.20)和立体选择性还原(化合物1.20转化为化合物1.21)，之后实施先前所述步骤，从而产生可转化为DCA的产物。
方案11.异类固醇的臭氧分解和侧链还原
方案12.三烯形成和烯丙位氧化
豆甾醇途径的变化形式使用B环二烯的狄尔斯-阿德尔(Diels-Alder)保护。此是有利的，因为其可分离9(11)双键以在烯丙位氧化步骤期间防止可能的干扰(方案13)。
方案13.三烯形成和环B二烯的狄尔斯-阿德尔保护
6.始于麦角固醇(Ergosterol)的第6合成途径
麦角固醇(化合物14.1)是易于获得的起始材料并且可用于通过本申请案中所述程序的调整形式来制备DCA。烯丙位氧化提供产生C12氧官能度的便捷途径(方案14)。此途径的优势在于始于环B二烯。其与豆甾醇途径汇聚于一点。
方案14.始于麦角固醇的三烯形成
优选实施例的化合物可使用下列一般方法和程序自易于购得的起始材料来制备。应了解，尽管给出了典型或优选制程条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)，但除非另有说明，否则也可使用其它制程条件。最佳反应条件可随所用特定反应物或溶剂而变化，但所述条件可由所属领域技术人员通过常规优化程序来确定。
此外，如所属领域技术人员所了解，可能需要习用保护基团来防止某些官能团发生不期望反应。各种官能团的适宜保护基团以及保护和去保护特定官能团的适宜条件为业内所熟知。例如，许多保护基团阐述于T.W.格林(T.W.Greene)和G.M.伍茨(G.M.Wuts)，有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第3版，威利出版社(Wiley)，纽约，1999和其中所引用参考文献中。
用于本文所述反应的起始材料和试剂通常是已知化合物或可通过已知程序或其经明显修改的形式来制备。例如，许多起始材料和试剂可自诸如奥德里奇化学(AldrichChemical)公司(密尔沃基(Milwaukee)，威斯康星州，USA)、巴赫姆(Bachem)(托伦斯(Torrance)，加利福尼亚，USA)、伊姆卡-凯姆斯(Emka-Chem)或西格玛(圣路易斯，密苏里州，USA)等供应商购得。其它起始材料和试剂可通过阐述于诸如下列等标准参考文本中的程序或其经明显修改的形式来制备：菲泽和有机合成用菲氏试剂(Fieser and Fieser'sReagents for Organic Synthesis)，第1-15卷(约翰威利父子公司(John Wiley andSons),1991)、碳化合物的罗德化学(Rodd's Chemistry of Carbon Compound)，第1-5卷和增刊(埃尔塞维尔科学出版社(Elsevier Science Publishers),1989)、有机反应(OrganicReactions)，第1-40卷(约翰威利父子公司,1991)、马氏高级有机化学(March's AdvancedOrganic Chemistry)，(约翰威利父子公司，第4版),和拉洛克系统有机化学(Larock'sComprehensive Organic Transformations)(VCH出版(VCH Publishers)公司，1989)。
实例
若适宜，可使用诸如以下等习用技术分离和纯化优选实施例的各种起始材料、中间体和化合物：沉淀、过滤、结晶、蒸发、蒸馏、和色谱。可使用诸如以下等习用方法对这些化合物实施表征：熔点法、质谱、核磁共振、和各种其它波谱分析。
在第1合成途径的方案1B中实施产物合成的步骤的实例性实施例更详细地阐述于下文中。表3阐述在以下实例和整个说明书中用于在实例性反应方案和合成途径中表达各种化合物/部分/装置/程序/特性的缩写。
表3
一般方法：氧敏感和湿度敏感材料的处理是在氩气氛下用经火焰干燥的双颈烧瓶来实施。使用SE-马克(SE-Make)硅胶(60-120目)、光谱化学(Spectrochem)硅胶(230-400目)或90中性氧化铝(SD-精细化工(SD-Fine Chem)有限公司，印度)来实施柱色谱。在默克硅胶(Kieselgel)60F254(0.25mm)板(默克公司，白宫站(Whitehouse Station)，NJ)上实施分析型薄层色谱(TLC)。通过UV光(254nm)灯或通过用存于乙醇中的硫酸(5％)和对茴香醛(3％)的溶液碳化来检测斑点显影。
装置：可在下文所述装置和设备上实施对本文所述反应方案和合成途径的化合物和产物的分析。
核磁共振(NMR)
在瓦里安水星-双子星(Varian Mercury-Gemini)200(1H NMR,200MHz；13C NMR,50MHz)或瓦里安水星-爱诺瓦(Inova)500(1H NMR,500MHz；13C NMR,125MHz)(瓦里安公司，帕罗奥图，CA)波谱仪上以溶剂共振作为内标(1H NMR，在7.26ppm处的CHCl3或在2.5ppm处的DMSO和在3.33ppm处的DMSO-H2O；13C NMR，在77.0ppm处的CDCl3或在39.5ppm处的DMSO)记录质子和碳核磁共振波谱(1H NMR和13C NMR)。1H NMR数据报告如下：化学位移(δ，ppm)，多重态(s＝单峰，d＝双峰，t＝三峰，q＝四重峰，br＝宽峰，m＝多重峰)，偶联常数(Hz)，和积分。
红外光谱
红外光谱(FT-IR)是在超市吉之岛(JASCO)-460+型(超市吉之岛公司，伊士顿，MD)上运行。质谱是以帕金埃尔默(Perkin Elmer),API-2000波谱仪(帕金埃尔默公司，沃尔瑟姆(Waltham)，MA)使用ES+模式来获得。
熔点
熔点是使用LAB-INDIA熔点测量装置(印度实验室仪器Pvt.(LabindiaInstruments Pvt.公司)，印度)来测定并且未经校正。
高压液相色谱
HPLC色谱图是使用岛津(SHIMADZU)-2010型以PDA检测器(岛津公司，日本)来记录。
光学活性
比旋光度([α]D)是使用超市吉之岛-1020(超市吉之岛公司，伊士顿，MD)在589nm处测定并且未经校正。
化学物质：除非另外说明，否则使用未经纯化的市售试剂。自二苯甲酮羰基钠蒸馏二乙醚和THF。无水DMF、DCM、戊烷和己烷是通过自CaH2蒸馏来获得。
实例1
制备雄甾烷-3,11,17-三酮(1.13)
将10％Pd/C(2.5g,5wt％)添加至存于DMF(250mL)中的氢化可的松(化合物1.12)(50.0g,138.12mmol)溶液中。在帕尔(Parr)装置(50psi)中将所得浆液氢化12h。如TLC所显示，在起始材料完全消失后，通过小型硅藻土滤塞过滤粗反应混合物并且在真空下去除溶剂。获得呈无色固体形式的粗产物(48.0g)。
将NaBH4(2.1g,55.3mmol)添加至存于EtOH(500mL)和CH2Cl2(500mL)中的上述粗产物(48.0g,131.86mmol)的溶液中。1小时后，依次添加丙酮(50mL)和水(150mL)以及NaIO4(70.5g,329.6mmol)。在室温下将混合物搅拌过夜。
添加蒸馏水(500mL)并且用乙酸乙酯(3x 250mL)萃取混合物。通过硅胶滤塞清洗乙酸乙酯层并且蒸发溶剂以获得38g呈无色固体形式的粗产物。不经纯化即进一步氧化粗产物。
经30分钟以3等份将PCC(40.4g,187.5mmol)添加至存于CH2Cl2(400mL)中的上述粗产物的溶液中。在室温下将所得反应混合物搅拌约3-4h。如TLC所监测，在反应完成后，依次通过硅藻土和硅胶过滤粗反应混合物并且通过柱色谱[59(W)x 700(L)mm，60-120目二氧化硅，150g]来纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(3:10)洗脱[每个溶离份50mL，10mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛碳化来监测；在EtOAc/己烷(1:1)中化合物1.13的Rf＝0.37并且化合物1.12的Rf＝0.05]以提供呈无色固体形式的非对映异构化合物1.13(33.0g，产率79％)。
通过制备型HPLC纯化所获得粗材料，其中使用月神(Phenomenex Lunov)C18管柱(250x 30.0mm,10μ)并且用CH3CN:H2O(12:13)以25mL/min的流速和每个溶离份15mL实施等度洗脱。制备型HPLC仅用于纯化，并不用于分析。表4阐述产物的所测得特性。
表4
实例2
3β-羟基-雄甾烷-11,17-二酮(1.14)
经15分钟于惰性气氛和-78℃下将(98.39mL，98.01mmol，存于THF中的1M溶液)添加至存于THF(330mL)中的化合物1.13(33.0g,109.27mmol)的溶液中并且在-78℃下将其搅拌约3-4h。用NaOH水溶液(2M,70mL)使反应混合物骤冷。用乙酸乙酯(500mL)稀释粗反应混合物并且用水(3x 75mL)、饱和盐水溶液(100mL)洗涤有机层并用MgSO4(75g)干燥。在真空下去除溶剂以获得33g粗材料。不经纯化即对粗产物实施乙酰化。
粗材料的纯化
通过柱色谱[29(W)x 600(L)mm,230-400目二氧化硅，200g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:4)洗脱[每个溶离份25mL，5mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛碳化来监测；在EtOAc/己烷(1:1)中化合物1.14的Rf＝0.3并且化合物1.13的Rf＝0.37]以获得化合物1.14。表5阐述产物的所测得特性。
表5
实例3
3β-羟基雄甾烷-11,17-二酮乙酸酯(1.15)
在0℃和惰性气氛下将乙酸酐(16.6g,162.8mmol)添加至存于吡啶(150mL)中的化合物1.14(33.0g,108.55mmol)的溶液中。在环境温度下将所得反应混合物搅拌过夜。如TLC所显示，在反应完成后，在真空下去除吡啶和残余乙酸酐。用乙酸乙酯(500mL)稀释粗残余物并且用水(3x 150mL)、饱和盐水溶液(100mL)洗涤并用MgSO4(75g)干燥。在真空下蒸发溶剂并且通过柱色谱[59(W)x 800(L)mm，60-120目二氧化硅，150g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:10)洗脱[每个溶离份25mL，10mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛碳化来监测；在EtOAc/己烷(3:7)中化合物1.15的Rf＝0.38并且化合物1.14的Rf＝0.1]以获得呈无色固体形式的化合物1.15(19.0g，产率66.4％)。表6阐述产物的所测得特性。
表6
实例4
(Z)-3β-羟基-5β-孕-17(20)-烯-11-酮乙酸酯(1.16)
在1h内于惰性气氛和-5℃下将叔丁醇钾(159.28mL，159.2mmol，存于THF中的1M溶液)逐滴添加至存于THF(150mL)中的乙基三苯基溴化鏻(61.16g,164.8mmol)的溶液中。使所得暗粉色反应混合物升温至10-15℃并且在相同温度下另外搅拌1h。在-5℃下将存于THF(50mL)中的化合物55(19.0g,54.9mmol)的溶液缓慢引入上述魏悌希内鎓盐悬浮液中。将溶液另外搅拌10-20分钟并且使反应混合物缓慢升温至环境温度。继续搅拌约3-4h。如TLC所显示，在起始材料完全消失后，用饱和NH4Cl水溶液(75mL)使反应混合物骤冷。用EtOAc(2x150mL)萃取水层并且用饱和盐水溶液(100mL)洗涤经合并有机萃取物并用MgSO4(75g)干燥。在真空下去除溶剂并且通过柱色谱[49(W)x 600(L)mm,60-120目二氧化硅，300g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:20)洗脱[每个溶离份25mL，10mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛碳化来监测；在EtOAc/己烷(1:6)中化合物1.16的Rf＝0.54并且化合物1.15的Rf＝0.06]以获得呈无色粘稠液体形式的化合物1.16(15.5g，产率78.8％)，其在1-2天后于0℃下缓慢固化。表7阐述产物的所测得特性。
表7
实例5
(E)-3β-羟基-5β-胆-16(17),22(23)-二烯-24-酸酯乙酸甲酯(1.17)
在0℃下将丙炔酸甲酯(9.68g,114.95mmol)添加至存于CH2Cl2(220mL)中的化合物1.16(16.5g,46mmol)的溶液中。在惰性气氛下使反应混合物升温至环境温度并且将其搅拌1h。在0℃下将乙基二氯化铝(17.5g,137.8mmol)逐滴引入上述混合物中并且使所得反应物质再次升温至环境温度并将其搅拌过夜。如TLC所显示，在反应完成后，用冰水混合物(100mL)使粗反应混合物骤冷并且用EtOAc(3x 150mL)萃取水层。用饱和盐水溶液(100mL)洗涤经合并有机层并且用MgSO4(50g)干燥。在真空下去除溶剂并且通过柱色谱[49(W)x600(L)mm,60-120目二氧化硅，300g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:7)洗脱[每个溶离份15mL，10mL/min洗脱，通过TLC来监测并且通过UV光(254nm)灯或对茴香醛碳化来检测；在EtOAc/己烷(1:6)中化合物1.17的Rf＝0.36并且化合物1.16的Rf＝0.54]以获得呈无色半固体形式的化合物1.17(16g，产率79％)。表8阐述产物的所测得特性。
表8
实例6
3β-羟基-5β-胆烷-11-酮-24-酸酯乙酸甲酯(1.18)
将10％Pd/C(2.9g,20wt％)添加至存于EtOAc(150mL)中的化合物1.17(14.5g,32.8mmol)的溶液中。在帕尔装置(50psi)中将所得浆液氢化12h。如TLC[在EtOAc/己烷(1:3)中化合物1.18的Rf＝0.43并且化合物1.17的Rf＝0.43；然而仅化合物1.17具有来自共轭酯发色团的UV活性]，在起始材料完全消失后，通过小型硅藻土滤塞过滤粗反应混合物并且在真空下去除溶剂以获得呈无色固体形式的化合物1.18(14g，产率95.7％)。表9阐述产物的所测得特性。
表9
实例7
3β-羟基-5β-胆-9(11)-烯-24-酸酯乙酸甲酯(1.19)
在催化量的AcOH(2.0mL)存在下将PtO2(5.0g,100wt％)添加至存于EtOAc(75mL)中的1.18(5.0g,11.2mmol)的溶液中。在帕尔装置(70psi)中将所得浆液氢化约14-16h。在反应完成后，通过小型硅藻土滤塞过滤粗混合物并且在真空下去除溶剂。不经进一步纯化即将粗产物用于消除反应中。
在0℃下将SOCl2(1.98g,16.78mmol)逐滴引入存于吡啶(100mL)中的上述粗材料的溶液中。使所得反应混合物升温至环境温度并且搅拌约1h。如TLC所显示，在反应完成后，在真空下去除吡啶。用乙酸乙酯(100mL)稀释粗残余物并且用水(2x 50mL)、饱和盐水溶液(100mL)洗涤并用MgSO4(40g)干燥。在真空下蒸发溶剂并且通过柱色谱[49(W)x 600(L)mm,60-120目二氧化硅，120g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:10)洗脱[每个溶离份10mL，5mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛的碳化反应监测，在EtOAc/己烷(1:6)中化合物1.19的Rf＝0.51并且化合物1.18的Rf＝0.22]以获得呈无色固体形式的化合物1.19(4.1g，产率85.4％)。表10阐述产物的所测得特性。
表10
实例8
3β-羟基-5β-胆-9(11)-烯-12-酮-24-酸酯乙酸甲酯(1.20)
将CrO3(8.0g,100wt％,80.0mmol)添加至存于AcOH(150mL)中的化合物1.19(8.0g,18.6mmol)的溶液中。在60℃下将所得反应混合物加热约24-36h。前体完全消失后，在真空下蒸发乙酸，并且使粗材料溶解于二乙醚(400mL)中。用水(2x 100mL)、饱和盐水溶液(100mL)洗涤有机层并且用MgSO4(40g)干燥。在真空下去除溶剂并且通过柱色谱[49(W)x600(L)mm,60-120目二氧化硅，120g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:5)洗脱[每个溶离份10mL，3mL/min洗脱，通过TLC监测并且用UV光(254nm)灯来检测；在EtOAc/己烷(1:4)中化合物1.20的Rf＝0.28并且化合物1.19的Rf＝0.61]以获得呈无色固体形式的化合物1.20(5g，产率60.5％)。表11阐述产物的所测得特性。
表11
实例9
3β-羟基-5β-胆烷-12-酮-24-酸酯乙酸甲酯(1.21)
将10％Pd/C(30mg,10wt％)添加至存于EtOAc(30mL)中的化合物1.20(300mg,0.675mmol)的溶液中。在帕尔装置(50psi)中将所得浆液氢化约16h。通过TLC[在EtOAc/己烷(3:7)中化合物1.21的Rf＝0.44并且化合物1.20的Rf＝0.44；然而仅化合物1.20具有来自其烯酮发色团的UV活性；此外化合物1.20的碳化微弱但化合物1.21的碳化鲜明]显示，在起始材料完全消失后，通过小型硅藻土滤塞过滤粗反应混合物并且在真空下去除溶剂以获得呈无色固体形式的化合物1.21(270mg，产率90％)。表12阐述产物的所测得特性。
表12
实例10
5β-胆-3,12-二酮-24-酸甲酯(1.22)
将NaOH(73mg,1.8mmol)添加至存于MeOH(10mL)中的化合物2.1(270mg,0.6mmol)的溶液中。在环境温度下将所得反应混合物搅拌约2h。如TLC所显示，在反应完成后，在真空下去除MeOH并且用乙酸乙酯(20mL)稀释粗产物。用饱和盐水溶液(10mL)洗涤有机层并且用MgSO4(5.0g)干燥。在真空下去除溶剂，粗材料不经纯化即用于酯化反应中。
在0℃下将SOCl2(0.1mL,1.35mmol)逐滴添加至存于MeOH(10mL)中的上述粗材料的溶液中。在环境温度下将所得反应混合物搅拌约1h。反应完成后，在真空下去除MeOH。用EtOAc(30mL)稀释粗反应混合物，并且用水(3x 10mL)、饱和盐水溶液(15mL)洗涤有机层并且用MgSO4(5g)干燥。在真空下蒸发溶剂并且不经纯化即将粗产物用于氧化反应中。
经约5分钟以3等份将PCC(1.0g,4.6mmol)引入存于CH2Cl2(25mL)中的所获得酯的溶液中。在环境温度下将所获得反应混合物搅拌约3-4h。如TLC所显示，在反应完成后，通过硅藻土垫过滤粗反应混合物。在真空下去除溶剂并且通过柱色谱[19(W)x 400(L)mm,60-120目二氧化硅，45g]纯化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1:6)洗脱[每个溶离份10mL，5mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛的碳化反应来监测，在EtOAc/己烷(2:3)中化合物1.22的Rf＝0.57并且化合物1.21的Rf＝0.71]以获得呈无色固体形式的化合物1.22(170mg，产率70.8％)。表13阐述产物的所测得特性。
表13
实例11
脱氧胆酸甲酯(1.22-酯)
在惰性气氛和环境温度下将LiAlH(O-tBu)(332mg,1.3mmol,)逐滴引入存于THF(10mL)中的化合物1.22(150mg,0.37mmol)的溶液中。搅拌约4-5小时后，用HCl水溶液(2mL,1N)使反应混合物骤冷并且用EtOAc(30mL)稀释粗混合物，将其用水(15mL)、饱和盐水溶液(10mL)洗涤并用MgSO4(3g)干燥。在真空下去除溶剂，并且通过柱色谱[29(W)x 500(L)mm,230-400目二氧化硅，50g]纯化粗物质，其中用MeOH/CH2Cl2(1:20)洗脱[每个溶离份5mL，3mL/min洗脱，通过TLC用对茴香醛碳化来监测；在MeOH/CH2Cl2(1:9)中化合物1.22-酯的Rf＝0.42并且化合物1.22的Rf＝0.85]以获得呈无色固体形式的脱氧胆酸甲酯(化合物1.22-酯)(110mg，产率72.8％)。表14阐述产物的所测得特性。
表14
实例11
脱氧胆酸
将存于H2O(2.0mL)中的LiOH(23mg,0.55mmol)溶液添加至存于THF(4mL)中的1.22-酯(110mg,0.27mmol)的溶液中。在环境温度下将所得反应混合物搅拌约2-3h。通过TLC[在MeOH/CH2Cl2(1:9)中化合物DCA的Rf＝0.35并且化合物1.22-酯的Rf＝0.42]显示，在酯消失后，用乙酸乙酯稀释粗反应混合物(10mL)并且将其与饱和盐水溶液一起研磨以获得有机层的澄清分离物。用饱和NH4Cl溶液(10mL)洗涤有机层并且用MgSO4(3.0g)干燥。在真空下去除溶剂并且通过与甲苯(3x 5mL)共沸来去除任何痕量的水以获得呈无色固体形式的脱氧胆酸(DCA)(100mg，产率94.3％)。表15阐述产物的所测得特性。
表15
实例1至11中所述实例性制程的产物的产率阐述于表16中。
表16：合成DCA制程的总产率
实例12
9α-羟基-5β-雄甾烷-3,17-二酮(2)
向存于DMF(150mL)中的9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮1(30.0g,99.3mol)的溶液中添加10％Pd/C(2.1g)并且在帕尔装置(60psi)中将所得浆液氢化12h。如TLC所显示，在起始材料完全消失后，通过小型硅藻土垫过滤粗反应混合物并且在真空下去除溶剂以提供无色固体(30.0g)。在0℃下使此固体与丙酮(90mL.)合并且将所得浆液搅拌1h。然后将其过滤，用冷(0℃)丙酮(30mL)洗涤，并且在相同过滤漏斗中于真空和室温下干燥以获得化合物2(26.0g,86％)。表17阐述产物的所测得特性。
表17
实例13
5β-雄甾-9(11)-烯-3,17-二酮(3)
经15分钟于惰性气氛和10℃下向存于DCM(520mL)中的化合物2(26.0g,85.4mmol)的溶液中添加浓硫酸(7.53g,76.8mmol)。使温度升高至25℃并且将所得溶液搅拌2h。在此时如TLC所显示，无任何起始材料残余。通过添加10％NaHCO3水溶液(200mL)终止反应。分离各层并且用DCM(2x 100毫升)将水层萃取两次。合并有机层并且依次用水(100mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤。然后用Na2SO4(75g)干燥有机相并过滤。在真空下蒸发滤液以提供呈灰白色固体形式的化合物3(23.0g,94％)。不经进一步纯化即将此产物“原样”用于下一步骤中。表18阐述产物的所测得特性。
表18
实例14
3α-羟基-5β-雄甾-9(11)-烯-17-酮(4)
在惰性气氛下将三叔丁氧基氢化铝锂(1.0M,84.4mL,84.4mmol)的THF溶液添加至存于THF(230mL)中的化合物3(23.0g,80.4mmol)的冷(-40℃)溶液中。将所得反应混合物搅拌2h。如TLC所显示，在此时确定反应完成，并且通过添加1N HCL(200mL)和乙酸乙酯(230mL)的混合物使反应混合物骤冷。分离所得二相混合物并且用乙酸乙酯(2x 100mL)将水层萃取两次。合并有机相并且依次用水(150mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤。然后用Na2SO4(75g)干燥有机相并过滤。在真空下蒸发滤液以提供呈灰白色固体形式的化合物4(23.0g)。不经进一步纯化即将上述粗产物“原样”用于下一步骤中。表19阐述产物的所测得特性。
表19
实例15
(Z)-3α-羟基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(6)
经1h在25℃下将存于THF中的叔丁醇钾溶液(1M,230mL,231mmol)逐滴添加至存于THF(150mL)中的乙基三苯基溴化鏻(88.7g,239mmol)的悬浮液中。在25℃下将所得暗红色混合物另外搅拌1h。在25℃下将存于THF(230mL)中的化合物4(23.0g,79.7mmol)的溶液缓慢添加至红色混合物中。将所得混合物搅拌3-4h，在此时通过TLC确定反应已完成。通过添加饱和NH4Cl水溶液(75mL)来终止反应。分离各相并且用EtOAc(3x 150mL)将水层萃取三次。合并有机部分，用饱和盐水溶液(100mL)洗涤，用Na2SO4(75g)干燥并过滤。在真空下浓缩滤液并且通过柱色谱[49mm(W)x 600mm(L),60-120目二氧化硅，300g]纯化粗固体，其中用乙酸乙酯/己烷(1:9)洗脱。合并含产物溶离份并且将其浓缩，此提供呈白色固体形式的化合物6(19.1g,80.0％)。表20阐述产物的所测得特性。
表20
实例16
(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(7a)
使化合物6(19.0g,63mmol)溶于CH2Cl2(380mL)中。在25℃和氮气氛下依次添加三乙胺(17.6mL,126.6mmol)、DMAP(0.772g,6mmol)和乙酸酐(8.98mL,94mmol)。在25℃下将所得溶液搅拌2h，在此时通过TLC确定反应已完成。通过添加冰水(100mL)来终止反应并且分离各相。用DCM(3x 150mL)将水层萃取三次。合并有机部分并且用饱和盐水溶液(100mL)洗涤，用无水Na2SO4(50g)干燥并过滤。在真空下浓缩滤液以获得呈灰白色固体形式的化合物7a(22.0g，产率95％)。表21阐述产物的所测得特性。
表21
实例17
(E)-3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16,22-三烯-24-酸甲酯(8a)
在0℃和惰性气氛下将乙基二氯化铝(104.5mL，192mmol，1.8M存于甲苯中)添加至存于DCM(100mL)中的丙炔酸甲酯(13.58mL,153mmol)溶液中。将所得溶液搅拌15min然后添加化合物7a(22g,64.3mmol)。在0℃下另外搅拌20min后，使温度升高至25℃并且另外保持18h。在此时通过TLC确定反应已完成，并且将混合物倾倒入冷(0℃)水(200mL)中。分离各相并用DCM(150mL)萃取水层。合并有机层并且依次用水(200mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤。然后用无水Na2SO4(40g)干燥并过滤。在真空下浓缩滤液并且通过在甲醇(280mL)中浆化来纯化所得固体以获得呈白色固体形式的化合物8a(17.5g 68％)。表22阐述产物的所测得特性。
表22
实例18
3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯(9a)
向存于EtOAc(350mL)中的化合物8a(17.5g,41mmol)的溶液中添加PtO2(4.37g)，并且在帕尔装置(70psi)中将所得浆液氢化14-16h。在此时通过TLC确定反应已完成。通过小型硅藻土滤塞过滤混合物并且在真空下去除溶剂，此可获得呈白色固体形式的化合物9a(17.0g,96.0％)。不经进一步纯化即将上述产物用于下一步骤中。表23阐述产物的所测得特性。
表23
实例19
3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16-二烯-24-酸甲酯(8b)
在0℃和惰性气氛下将乙基二氯化铝(14.2mL，25mmol，1.8M存于甲苯中)添加至存于DCM(60mL)中的丙烯酸甲酯(1.89mL,20mmol)溶液中。将所得溶液搅拌15min然后添加化合物7a(3g,8.7mmol)。在0℃下另外搅拌20min后，使温度升高至25℃并且在所述温度下另外保持18h。在此时通过TLC确定反应已完成，然后将混合物倾倒入冷(0℃)水(60mL)中。分离各相并用DCM(60mL)萃取水层。合并有机层并且依次用水(50mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤。然后用无水Na2SO4(5g)干燥并过滤。在真空下浓缩滤液，从而提供化合物8b(2.6g,70％)。表24阐述产物的所测得特性。
表24
实例20
3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯(9a)
向存于EtOAc(60mL)中的化合物8a(3g,7mmol)的溶液中添加10％Pd/C(300mg,10％wt/wt)，并且在帕尔装置(70psi)中将所得浆液氢化14-16h。在此时通过TLC(存于己烷中的10％乙酸乙酯)来确定反应已完成。通过小型硅藻土滤塞过滤混合物并且在真空下去除溶剂，此可获得呈白色固体形式的化合物9a(2.6g,86％)。表25阐述产物的所测得特性。
表25
实例21
3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-12-酮-24-酸甲酯(10a)
将CrO3(17.0g,170mmol)添加至存于AcOH(270mL)中的化合物9a(17g,39.5mmol)的溶液中。在50℃下将所得混合物加热24-36h。通过TLC所显示，在起始材料完全消失后，在真空下蒸发溶剂并且将粗材料溶于乙酸乙酯(400mL)和水(200mL)中。分离两相并且用水(2x 100mL)将有机层洗涤两次，然后用饱和盐水溶液(100mL)洗涤一次。然后将有机相用无水Na2SO4(40g)干燥并过滤。在真空下浓缩滤液并且通过柱色谱[49mm(W)x 600mm(L),60-120目二氧化硅，120g]纯化所得固体，其中用乙酸乙酯/己烷(1:5)洗脱[每个溶离份10mL，3mL/min洗脱，通过TLC监测并且用UV光(254nm)灯来检测]。合并含产物溶离份并且在真空下将其浓缩以获得呈白色固体形式的化合物10a(8.8g，产率50％)。表26阐述产物的所测得特性。
表26
实例22
3α-乙酰氧基-5β-胆烷-12-酮-24-酸甲酯(11a)
将10％Pd/C(900mg)添加至存于EtOAc(150mL)中的化合物10a(2.0g,4.5mmol)的溶液中并且于50℃下在帕尔装置(50psi)内将所得浆液氢化16h。在此时通过TLC确定反应已完成。通过小型硅藻土滤塞过滤混合物并且在真空下去除溶剂，此可提供呈白色固体形式的化合物11a(1.6g，产率80％)。表27阐述产物的所测得特性。
表27
实例23
3α-乙酰氧基-12α-羟基-5β-胆烷-24-酸甲酯(12a)
在环境温度下将三叔丁氧基氢化铝锂(1M,22.4mL,22.4mmol)的THF溶液逐滴添加至存于THF(25mL)中的化合物11a(2.5g,5.6mmol)的溶液中。另外搅拌4-5h后，通过TLC来确定反应已完成。通过添加HCL(1M,10mL)水溶液来终止反应并且用EtOAc(30mL)稀释混合物。分离各相并且依次用水(15mL)和饱和盐水溶液(10mL)洗涤有机相。然后将有机相用无水Na2SO4(3g)干燥并过滤。在真空下浓缩滤液并且通过柱色谱[29mm(W)x 500mm(L),60-120目二氧化硅，50g]纯化所得固体，其中用EtOAc/己烷(2:8)洗脱[每个溶离份5mL，通过TLC用对茴香醛碳化来监测]。合并含产物溶离份并且将其在真空下浓缩以获得呈白色固体形式的化合物12a(2.3g,91％)。表28阐述产物的所测得特性。
表28
实例24
脱氧胆酸(DCA)
将存于H2O(2.0mL)中的LiOH(187mg,4.4mmol)的溶液添加至存于THF(8mL)和MeOH(8mL)中的化合物12a(500mg,1.11mmol)的溶液中。在50℃下将所得混合物搅拌3-4h。通过TLC所显示，在起始材料完全消失后，在真空下浓缩反应混合物。合并水(10mL)与3N HCL(1mL)的混合物并且将其冷却至0℃，然后将其添加至粗产物中。在0℃下搅拌1h后，过滤所沉淀固体然后用水(10mL)和己烷(20mL)洗涤。在真空和室温下干燥获得呈白色固体形式的脱氧胆酸(DCA，400mg，产率91％)。表29阐述产物的所测得特性。
表29
实例25
将原代人脂细胞与不同浓度的使用9-HAD作为起始材料来合成的合成脱氧胆酸钠或如下所述自西格玛获得的牛源脱氧胆酸钠一起培养。
材料
脂细胞(森生物公司(Zen-Bio)cat号SA-1096)
96孔板(US科学(US Scientific)cat号施乐士达(cellstar)第655180号)
无血清RPMI培养基(联发科(Mediatech)cat号17-105-CV)
脱氧胆酸钠(DC)(西格玛cat号D6750)
合成去氧甘胆酸钠(歇拉岛(Kythera))
PBS(1x)
MTS分析试剂盒(普洛麦格(Promega)cat号G3580)
脂细胞到达分化阶段并且以13,000细胞/孔的密度存于96孔板中。获得两个板并且用相同样品处理每个板。在37℃下将细胞与5％CO2一起培养24小时。通过将20mg胆汁酸溶于2mL培养基(无血清)中来制备每种胆汁酸(合成和非合成DCA)的1％储备溶液。使用1％储备溶液通过稀释来制备以下11种溶液：0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.05％、0.06％、和0.1％、以及0％(仅培养基)。
在室温下用150μL 1x PBS(磷酸缓冲盐溶液)将细胞洗涤2x。通过将板上侧翻转并且将液体倒入容器中而自96孔板的孔中依次去除培养基和PBS。在最后一次PBS洗涤后，每孔添加80μL样品。将每种浓度的特定胆汁酸添加至8个孔中并且在37℃下与5％CO2一起培养1小时。然后将板自培养器中移出并且倒出溶液。将100μL MTS试剂(3-(4,5-二乙基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，内盐)的稀溶液(1mL RPMI中的40μL)直接添加至各孔中。在37℃下将板与5％CO2一起培养直至对照(无胆汁酸)孔变色为橙-棕色，然后将其装载至分析96孔板的分光光度计上。样品是在490nm波长设定下运行。
使用来自普洛麦格的比色分析(MTS)试剂盒来评价细胞生存力。结果展示经合成NaDC或西格玛-NaDC处理后细胞存活率的剂量依赖性降低(参见图2)。在此实验中两种分子都表现类似的溶胞行为，此表明合成NaDC和牛源西格玛-NaDC在其杀灭脂肪细胞的能力上具有相同功能。
上述实验和实例并非意欲限制本发明。应理解根据本发明原则可作出许多修改和变化。

Claims (18)

1.一种制备脱氧胆酸(DCA)或其医药上可接受的盐的方法：
所述方法包含
(a)在氢化条件下使9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮1与H2反应以形成化合物2
(b)使化合物2与酸反应以形成化合物3
(c)使化合物3与还原剂反应以形成化合物4，其呈4与5的混合物形式
(d)在烯烃形成条件下使化合物4与二碳烯化剂反应以形成化合物6
(e)将化合物6转化为式7化合物
(f)在路易斯酸(Lewis acid)存在下使所述式7化合物与R为烷基的具有式CH≡CC(O)OR的丙炔酸烷基酯或具有式CH2＝CHC(O)OR的丙烯酸烷基酯反应以形成式8化合物，其中P是保护基团，R是烷基，并且虚线是单键或双键
(g)在氢化条件下使所述式8化合物与H2反应以形成式9化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
(h)使所述式9化合物与氧化剂反应以形成式10化合物，其中P是保护基团，并且R是烷基
(i)在氢化条件下使所述式10化合物与H2反应以形成式11化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
(j)使所述式11化合物与还原剂反应以形成式12化合物，其中P是保护基团并且R是烷基
和
(k)使所述式12化合物暴露于去保护条件以形成其酯和暴露于合适的水解条件下以形成脱氧胆酸或其医药上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)项中的所述氢化条件包含Pd/C催化剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(b)项中的所述酸是无机酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(c)项中的所述还原剂是LiAl(OtBu)3H。
5.根据权利要求1所述的方法，其中(d)项中的所述二碳烯化剂是魏悌希试剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中化合物7-12的所述保护基团P是-C(O)CH3。
7.根据权利要求1所述的方法，其中(f)项中的所述路易斯酸是EtAlCl2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中(f)项中的所述丙炔酸烷基酯是丙炔酸甲酯。
9.根据权利要求1所述的方法，其中(f)项中的所述丙烯酸烷基酯是丙烯酸甲酯。
10.根据权利要求1所述的方法，其中(g)项中的所述氢化条件包含PtO2或Pd/C催化剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中(h)项中的所述氧化剂是CrO3。
12.根据权利要求1所述的方法，其中(i)项中的所述氢化条件包含Pd/C催化剂。
13.根据权利要求1所述的方法，其中(j)项中的所述还原剂是LiAl(OtBu)3H。
14.根据权利要求1所述的方法，其中当P为-C(O)CH3时，(k)项中的所述去保护和水解条件包含使化合物12与LiOH反应。
15.根据权利要求3所述的方法，其中所述无机酸为H2SO4。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述魏悌希试剂为Ph3PCH2CH3 +Br-。
17.一种制备式12化合物的方法：
其中P是保护基团并且R是烷基，所述方法包含使式11化合物
其中P和R如式12中所限定，与还原剂反应以形成式12化合物。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括在氢化条件下使式10化合物
与H2反应以形成所述式11化合物
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