ES2768782T3 - Sal de tosilato de N-r3-r(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazin-2-carboxamida - Google Patents

Abstract

Un compuesto que es una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida.

Description

DESCRIPCIÓN

Sal de tosilato de N-r3-r(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7ail]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazin-2-carboxamida

La presente invención se refiere a una sal de ácido toluensulfónico (tosilato) de N-r3-r(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazin-2-carboxamida, a composiciones farmacéuticas que comprenden la sal de tosilato, al uso de la sal de tosilato en el tratamiento de trastornos fisiológicos y a productos intermedios y procedimientos útiles en la síntesis de los mismos.

La presente invención está en el campo del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades y trastornos que implican péptido p (Abeta) amiloide, un segmento de péptido neurotóxico y altamente agregante de la proteína precursora amiloide (APP). La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a millones de pacientes en todo el mundo. En vista de los agentes aprobados actualmente en el mercado que proporcionan beneficios sólo transitorios, sintomáticos para el paciente, hay una necesidad no satisfecha en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la generación, agregación y deposición de Abeta en el cerebro. La inhibición completa o parcial de p-secretasa (enzima de escisión de la proteína precursora amiloide en el sitio p; BACE) se ha demostrado que tienen un efecto significativo en patologías relacionadas con la placa y la placa dependiente en modelos de ratón que sugieren que incluso pequeñas reducciones en los niveles de péptido Abeta podría resultar en una reducción significativa a largo plazo en la carga de placas y los déficits sinópticos, proporcionando así beneficios terapéuticos significativos, particularmente en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La Patente de Estados Unidos N.° 8,841,293 divulga ciertos inhibidores BACE para el tratamiento de trastornos mediados por péptido Abeta, tales como la enfermedad de Alzheimer y en particular, divulga por ejemplo el inhibidor de BACE N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida y la sal de clorhidrato correspondiente.

Se desean formas novedosas de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que proporcionen una mejor estabilidad en estado sólido y la estabilidad química para mejorar la utilización en la preparación y fabricación de formulaciones farmacéuticas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida. Además, la presente invención proporciona la sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que es cristalina. La presente invención además proporciona la sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][l1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que se caracteriza por un pico substancial en el espectro de difracción de rayos X, un ángulo 2-theta de 5,0° de difracción en combinación con uno o más de los picos seleccionados a partir del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulo de difracción de 0,2 grados.

La presente invención además proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente. La presente invención además proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para su uso en el tratamiento de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer en un paciente. La presente invención además proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para su uso en la inhibición BACE en un paciente. La presente invención además proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para su uso en la inhibición de la escisión mediada por BACE de la proteína precursora amiloide. La invención además proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para su uso en la inhibición de la producción de péptido Abeta.

Además, la presente invención proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para su uso en terapia, en particular para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para el tratamiento de la progresión de enfermedades cognitivas leves a la enfermedad de Alzheimer. Incluso además, la presente invención proporciona el uso de una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para el tratamiento de la progresión de enfermedades cognitivas leves a la enfermedad de Alzheimer.

Además, la invención proporciona una sal de tosilato N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que se caracteriza por un pico substancial en el espectro de difracción de rayos X, un ángulo 2-teta de 5,0° de difracción en combinación con uno o más de los picos seleccionados a partir del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulos de 0,2° grados de difracción, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente. La invención también proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que se caracteriza por un pico sustancial en el espectro de difracción de rayos X, a un ángulo de difracción 2-theta de 5,0° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulos de 0,2 grados de difracción para uso en terapia, en particular para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para el tratamiento de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer. Además, la invención proporciona una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que se caracteriza por un pico sustancial en el espectro de difracción de rayos X, a un ángulo de difracción 2-theta de 5,0° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulos de 0,2 grados de difracción, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para el tratamiento de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer.

La invención proporciona además una composición farmacéutica, que comprende la sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. La presente invención también abarca nuevos intermedios y procesos para la síntesis de la sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida.

El deterioro cognitivo leve se ha definido como una potencial fase prodrómica de la demencia asociada con la enfermedad de Alzheimer basado en la presentación clínica y en la progresión de los pacientes que presentan deterioro cognitivo leve a la demencia de Alzheimer a lo largo del tiempo. (Morris, et al, Arch Neurol., 58, 397- 405 (2001); Petersen, et al, Arch Neurol, 56, 303-308 (1999)). La expresión "tratamiento de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer" incluye ralentizar, detener o revertir la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer en un paciente.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" incluyen restringir, ralentizar, detener o revertir la progresión o la gravedad de un síntoma o trastorno existente.

Tal como se utiliza aquí, el término "paciente" se refiere a un ser humano.

La expresión "inhibición de la producción del péptido Abeta" se entiende la disminución de los niveles en vivo de péptido Abeta en un paciente.

Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de compuesto de la invención, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de la misma que, tras la administración dosis única o múltiple al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente bajo diagnóstico o tratamiento.

Una cantidad eficaz puede ser determinada fácilmente por el médico tratante, como un experto en la técnica, mediante el uso de técnicas conocidas y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. En la determinación de la cantidad eficaz para un paciente, una serie de factores son considerados por el médico encargado, incluyendo, pero no limitado a: la especie del paciente; su tamaño, edad y salud general; la enfermedad específica o trastorno que se trate; el grado de o implicación o la gravedad de la enfermedad o trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicación concomitante; y otras circunstancias relevantes.

Los compuestos de la presente invención son generalmente eficaces en un amplio intervalo de dosificación. Por ejemplo, las dosificaciones por día normalmente entran dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos dosis aún mayores se pueden emplear con efectos secundarios aceptables y por consiguiente el intervalo de dosificación anterior no se pretende que limiten el alcance de la invención de cualquier manera.

Los compuestos de la presente invención se formulan preferiblemente como composiciones farmacéuticas administradas por cualquier vía que hace que el compuesto biodisponible, incluyendo la vía oral, transdérmica y las rutas parenterales. Lo más preferiblemente, tales composiciones son para administración oral o transdérmica, con la administración oral se prefiere especialmente. Tales composiciones y procedimientos farmacéuticos para preparar la misma son bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (DB Troy, editor, 21a edición, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

La sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida es particularmente útil en los procedimientos de tratamiento de la invención, pero se prefieren ciertas formas. Los siguientes párrafos describen tales formas. Se entenderá que estas preferencias son aplicables a las composiciones farmacéuticas, los procedimientos de tratamiento y para los nuevos compuestos de la invención.

Sal de tosilato cristalina de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida que se caracteriza por un pico sustancial en el espectro de difracción de rayos X, a un ángulo de difracción 2-theta de 5,0° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados particularmente preferida.

Alguien de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida puede existir en formas tautoméricas, tal como se representa en el Esquema A. Cuando se proporcione cualquier referencia en esta solicitud a uno de los tautómeros específicos de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida, se entiende que abarca ambas formas tautoméricas y todas las mezclas de los mismos.

Esquema A

Adicionalmente, ciertos intermedios descritos en los esquemas siguientes pueden contener uno o más grupos protectores de nitrógeno. El grupo protector variable puede ser el mismo o diferente en cada caso dependiendo de las condiciones de reacción particulares y las transformaciones particulares a realizar. Las condiciones de protección y desprotección son bien conocidos por el experto en la materia y se describen en la literatura (véase, por ejemplo, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (Grupos protectores de Greene en síntesis orgánica)", cuarta edición, por Peter G.M. Wuts y Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007.

Ciertos centros estereoquímicos se han dejado sin especificar y ciertos sustituyentes han sido eliminados en los esquemas siguientes para mayor claridad y no están destinados a limitar la enseñanza de los esquemas en modo alguno. Además, isómeros individuales, enantiómeros y diastereómeros se pueden separar o resolver por un experto en la técnica en cualquier punto conveniente en la síntesis de compuestos de la invención, por procedimientos tales como técnicas de cristalización selectiva o cromatografía quiral (véase, por ejemplo, J. Jacques, etal., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions (Enantiómeros, racematos y resoluciones)", John Wiley and Sons, Inc., 1981 y E.L. Eliel y S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds (Estereoquímica de los compuestos orgánicos)", Wiley-lnterscience, 1994). Las denominaciones "isómero 1" e "isómero 2" se refieren a los compuestos que eluyen a partir de la cromatografía quiral primero y segundo, respectivamente y si la cromatografía quiral se inicia tempranamente en la síntesis, la misma designación se aplica a los intermediarios subsecuentes y ejemplos.

Ciertas abreviaturas están definidas de la siguiente manera: "acetonitrilo" se refiere a ACN; "APP" se refiere a la proteína precursora de amiloide; "CSF" se refiere al líquido cefalorraquídeo; "DCM" se refiere a diclorometano; "DIPEA" se refiere a diisopropiletilamina, N-etil-N-isopropil-propan-2-amina, o N,N-diisopropiletilamina; "DMEM" se refiere al medio de Eagle modificado por Dulbecco; "Dm F" se refiere a dimetilformamida; "DMSO" se refiere a sulfóxido de dimetilo; "EDCI" se refiere a 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; "ee" se refiere al exceso enantiomérico; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "Ex" se refiere al ejemplo; "F12" se refiere al medio F12 de Ham; "FBS" se refiere a suero bovino fetal; "FRET" se refiere a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia; "HEK" se refiere a riñón embrionario humano; "HOAc" se refiere a ácido acético; "HOBt" se refiere a hidrato de 1- hidroxilbenzotriazol; "HPLC" se refiere a cromatografía líquida de alta resolución; "IC50" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50% de la respuesta inhibidora máxima posible para ese agente; "min" se refiere a minuto o minuto; "MTBE" se refiere a metil ferc-butil éter; "PDAPP" se refiere a plaquetas derivadas de proteína precursora amiloide; "Prep" se refiere a la preparación; "RFU" se refiere a la unidad de fluorescencia relativa; "SCX" se refiere a intercambio catiónico fuerte; "Rt" se refiere a tiempo de retención; y "THF" se refiere a tetrahidrofurano.

Se entiende por un experto en la técnica que los términos "tosilato", "ácido toluensulfónico", "ácido ptoluensulfónico" y "ácido sulfónico 4-metilbenceno" se refieren al compuesto de la siguiente estructura:

Como tal, se entiende por un experto en la técnica que una referencia en este documento a cualquier de los siguientes nombres:

"La sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida";

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina -2-carboxamida; "ácido toluensulfónico";

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo [3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida"; y "ácido p-toluensulfónico"; y

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida; ácido 4-metilbenceno sulfónico"; se refiere a la sal de la siguiente estructura:

La sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida se pueden preparar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en las preparaciones y ejemplos a continuación. Además, N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida base libre y la sal de HCI correspondiente se pueden preparar por un experto ordinario en la técnica como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 8,841,293. Las etapas sintéticas específicas para cada una de las rutas descritas se pueden combinar de diferentes maneras, o junto con pasos de diferentes preparaciones para preparar compuestos de la invención. Los productos de cada etapa pueden ser recuperados por procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, incluyendo extracción, evaporación, precipitación, cromatografía, filtración, trituración, o cristalización. Los reactivos y materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto en la técnica.

Preparación 1

2-Bromo-1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona

Se añade N-bromosuccinimida (984 g, 5,53 mol) en porciones a una solución de 1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona (1000 g, 4,6 mol) y ácido p-toluensulfónico (1315 g, 7,64 mol) en DCM (7 l) a 35 °C. La mezcla se agita y se calienta a 40 °C durante 4 horas. La mezcla se enfría a 24 °C y 7% de NaHCO3 (5 l) se agrega. Las capas se separaron y la capa orgánica se lava con 10% Na2SO3 (5 l) y agua (5 l). La capa orgánica se concentra a 2-3 volúmenes para dar el compuesto del título que se usó sin purificación adicional.

Preparación alternativa 1

Se disuelve 1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona (80 g, 0,37 mol) en DCM (800 ml) y se enfría a 10 °C. El bromo (63 g, 0,39 mol) se añade lentamente durante 5 horas. Después de 30 minutos, se añade bromo adicional (3,5 g, 0,06 mol). Después de 30 minutos, la mezcla se calienta a temperatura ambiente y la capa orgánica se lava con una mezcla de NaCI acuoso (500 ml) y NaHCO3 acuoso (400 ml). La capa orgánica se lavó sucesivamente con NaHCO3 acuoso (400 ml), NaHSO3 acuoso (2 x 400 ml) y NaCI acuoso. La capa orgánica se seca (Na2SO4) y se concentró hasta un residuo. El residuo se disuelve en una mezcla de DCM (100 ml) y éter de petróleo (500 ml). La solución se enfría a -50 °C durante 0,5 horas y el sólido se recogió por filtración para dar el compuesto titulado (84 g, 77%).

1H RMN (CDCla) 84,46 (d, 2H), 7,07 (dd, 1H), 7,66 (m, 1H), 8,02 (dd, 1H).

Preparación 2

2-[Alil(bencil)amino]-1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona

Se añade 2-bromo-1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona (25,1 g, 84,8 mmol) a una solución de N-bencilprop-2-en-1-amina (15,0 g, 102 mmol) en tolueno (200 ml) y DIPEA (59 ml, 338 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla es desoxigenada de agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras que el nitrógeno subsuperficial burbujea a través de la mezcla. La reacción se calienta a 40 °C, se agitó durante 2,5 horas y luego se añade N-bencilpro-2-en-1-amina adicional (2,0 g, 13,6 mmol). La reacción se agitó a 40 °C durante 4,5 horas y después se enfría a temperatura ambiente. El material se usó sin purificación adicional. La solución se analizó por HPLC para el compuesto del título utilizando los siguientes parámetros: columna LC: Waters Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC®) C82,1 x 100 mm 1,7 pm; fase móvil A: 0,1% (vol/vol) de TFA en agua 0,2% ACN (vol/vol), preparado mediante la adición de TFA (4 ml) y ACN (10 ml) a agua (4 l), fase móvil B: 0,1% de TFA en Ac N, preparado por adición de TFA (4 ml) a ACN (4 l). Gradiente: %A = 95% a 53,1% en 10 minutos, velocidad de flujo de 0,85 ml/minuto, temperatura de la columna: 45 °C. Rt = 6,43 minutos (UV)

Preparación 3

5-Alil-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-1-[(4-metoxifenil)metil-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol

A una solución de 2-bromo-1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona (1363 g, 4,61 mol) en tolueno (10 l) se añade dialilamina (537 g, 5,53 mol) y DIPEA (2381 g, 18,42 mol). La mezcla se agita durante 4 horas a 40 °C para dar 1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-2-(dialilamino)etanona, que no está aislada. Se añade N-(4-metoxibencil)hidroxilamina (847 g, 5,53 mol) y titanio (IV) isopropóxido (1965 g, 6,91 mol) a la mezcla que contiene 1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-2-(dialilamino)etanona. La mezcla se agita a 90 °C durante 2 horas. La mezcla se enfría a 20 °C y se añaden ácido cítrico monohidrato 50% (4 l) y Na2CO3 saturado (4 l). Las capas se separaron y la acuosa se extrae con MTBE (5 l). El extracto orgánico se lavó con agua (5 l) y se filtró a través de tierra de diatomeas y se concentró a sequedad. EtOAc (10 l) y ácido oxálico (580 g) se añaden al residuo y un sólido se filtra y se añaden a 1 N NaOH (13 l). Se añade MTBE (5 l) y la mezcla se filtró a través de tierra de diatomeas. Las capas se separaron y la capa orgánica se concentra a 2 volúmenes. Se añade heptano (3 l) y la solución se enfría a 10 °C. El sólido resultante se filtró para dar el compuesto del título (1330 g, 64%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) 82,51-2,49 (m, 3H), 3,9-3,4 (m, 3H), 3,78-3,41 (m, 6H), 4,01 (m, 1H), 5,24-5,01 (m, 2H), 5,89-5,85 (m, 1H), 6,82-6,80 (m, 2H), 7,51-7,13 (m, 3H), 7,63­ 7,62 (m, 1H), 7,65-7,64 (m, 1H).

Preparación 4

Ácido oxálico relativo-(3aR,B6aS)-5-bencil-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol

Se añade N-[(4-metoxifenil)metil]hidroxilamina (15,5 g, 101 mmol) a la solución de 2-[alil(bencil)amino]-1-(5-bromo-2-fluoro-fenil)etanona en 40 °C, seguido portitanio (IV) isopropóxido (50,3 ml, 169 mmol). La mezcla se desoxigenó mediante burbujeo de nitrógeno a través del sistema durante 5 minutos. La mezcla se calienta a 90 °C con agitación durante 2 horas. La mezcla de reacción se lava con una solución de ácido cítrico (36 g, 186 mmol) en agua (36 g) y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. El carbonato de sodio (100 g, 939 mmol) se añade como una solución saturada en agua y el pH se ajusta aproximadamente a 9. La mezcla se diluye con agua y tolueno según sea necesario para separar las capas. La capa de tolueno se lava con una solución de HCI en agua (5,1 ml de HCI a 5N) diluido con agua (200 ml) seguido de agua (200 ml). La capa de tolueno se concentró hasta un aceite espeso. El aceite se disolvió en EtOAc (375 ml) y una solución de ácido oxálico (15,4 g, 169 mmol) disuelto en EtOAc (375 ml) se añade gota a gota con agitación a temperatura ambiente. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 días, se filtró y la pasta de producto se lava con EtOAc (250 ml). El sólido se seca durante la noche al vacío a 40 °C para dar el compuesto del título como una mezcla racémica cis (41,7 g, 84%). ES/MS (m/z): 498 (M+H).

Preparación 5

N-[3-[(3aR,6aS)-5-bencil-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-6a-il]-4-fluoro-fenil]-2,2,2-trifluoro-acetamida relativa

Se añadió ácido oxálico relativo-(3aR,6aS)-5-bencil-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol, (23,6 g, 40,2 mmol) a una mezcla de DCM (400 ml) y solución acuosa 5 N de NaOH (200 ml). La mezcla se agitó durante 10 minutos y luego se separan las capas. La capa orgánica se concentró para dar relativo-(3aR, 6aS)-5-bencil-6a-(5-bromo-2-fluoro- feniI)-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol (20,0 g, 40,2 mmol). Este material se añade a sulfóxido de dimetilo (360 ml), 2,2,2-trifluoroacetamida (7,8 g, 68 mmol), yoduro de sodio (10,3 g, 68,6 mmol), carbonato de potasio (9,54 g, 68,3 mmol), (1R,2R)-N,N'-dimetil-1,2-ciclohexanodiamina (4,7 g, 32 mmol) y cobre (I) yoduro (1,53 g, 8,03 mmol). La mezcla se desoxigenó mediante burbujeo de nitrógeno a través del sistema durante 10 minutos. La mezcla se calienta a 115 °C, se agitó durante 5,5 horas y se enfría a temperatura ambiente. EtOAc (250 ml) y agua (200 ml) se añadieron y la mezcla resultante se agita durante 10-15 minutos. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavan con solución de cloruro amónico 20% en peso acuoso (100 ml) seguido de una solución de cloruro de litio 20% en peso acuoso (100 ml) y agua (100 ml). La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a sequedad para dar el compuesto del título crudo en forma de una mezcla racémica cis (23,6 g, 111%). ES/MS (m/z): 530 (M+H).

Preparación 6

Relativo-3-[(3aR,6aS)-5-bencil-1-(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-6a-il]-4-fluoroanilina

Se añade relativo-N-[3-[(3aR,6aS)-5-bencil-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-6a-il]-4-fluoro-fenil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (21,0 g, 39,7 mmol) a metanol (250 ml), NaOH acuoso a 5N (105 ml) y etanol (105 ml) y la mezcla resultante se calienta a 50 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentra bajo presión reducida a 35-40 °C para eliminar el metanol y el etanol. El material se disuelve en una mezcla de MTBE (320 ml) y agua (300 ml). Las capas se separaron y la capa orgánica se lava con agua (100 ml) seguido de una mezcla de agua (400 ml) y HCI acuoso a 12 N (3,5 ml). La capa acuosa se añade a una mezcla de MTBE (400 ml), agua (100 ml) y NaOH acuoso a 5 N (25 ml) y las capas se separan. La capa acuosa se lava con MTBE (100 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío para dar el compuesto del título como una mezcla racémica cis (9,8 g, 57%). ES/MS (m/z): 435 (M+H).

Preparación 7

Relativo-N-3-[(3aR,6aS)-5-bencil-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-6a-il]-4-fluorofenil]acetamida

Se añade relativo-3-[(3aR,6aS)-5-bencil-1-(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-6a-il]-4-fluoro-anilina (9,4 g, 22 mmol) a DCM (110 ml), 4-dimetilaminopiridina (0,08 g, 0,65 mmol) y trietilamina (6,1 ml, 43 mmol) y la reacción se enfría a 0 °C. El anhídrido acético (3,4 g, 33 mmol) se añadió gota por gota a la solución. La reacción se calienta a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Agua (140 ml) se añade a la reacción y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las capas se separaron y la capa acuosa se lava con DCM (100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró para dar el compuesto del título como una mezcla racémica cis (10,1 g, 100%). ES/MS (m/z): 477 (M+H).

Preparación 8

Clorhidrato de 5-alil-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4-c]isoxazol

Se añade TFA (4L, 52,9 mol) gota a gota a una solución de 5-alil-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-1-[(4-metoxifenil)metil-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol (1990 g, 4,45 mol) en DCM (12 l) a una velocidad para mantener la temperatura por debajo de 35 °C. Después de la adición completa, la mezcla se calienta a 33-43 °C y se agita durante 6 horas. El NaOH (20%, 10 l) se añade a una velocidad para mantener la temperatura por debajo de 35 °C. Las capas se separaron y la capa orgánica se lava con agua (6 l). La solución se concentra, se añade etanol (16 l) y la mezcla se filtró a través de tierra de diatomeas. El filtrado se concentra y se agrega EtOAc (10 l). 4M de HCI en EtOAc (8 l) se añade y el sólido resultante se filtra y se seca para dar el compuesto del título (1385 g, 85,6%). ES/MS (m/z): 327,1 (M+H)

Preparación 9

[1-alil-4-amino-4-(5-bromo-2-fluoro-fenil)pirrolidin-il-3]metanol

Una solución acuosa saturada de carbonato de sodio se añade a una solución de clorhidrato de 5-alil-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4-c]isoxazol (1400 g, 3,85 mol) en DCM (7 l) para alcanzar un pH > 9. Las capas son separadas y el extracto orgánico se concentraron hasta 1,5 volúmenes. E1HOAc (1,38 l) se añade y la solución se concentró hasta 2 l. El HOAc (7 l) y polvo de zinc (2,5 k g, 38,5 mol) y la mezcla se calienta a 40­ 50 ° C y se agitó durante 3 horas. El EtOAc (9,8 l) se añade y la mezcla se filtró a través de tierra de diatomeas. La pasta del filtro se lavó con EtOAc (4 l). El filtrado se separa y el agua (7 l) se añade a las fases orgánicas combinadas. El hidróxido de amonio se añade hasta llegar a un pH > 9. Las capas se separaron y la capa orgánica se concentra a 2 l. El etanol (2,8 l) se añade y la solución se concentra a 2 l. El etanol (19 l) se añade y la mezcla se filtra a través de tierra de diatomeas para dar una solución de etanol del compuesto del título, que se usó sin purificación adicional.

Preparación 10

[(3S,4R)-1-alil-3-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4-(hidroximetil)pirrolidina-3-il] amonio; (2S,3S)-4-hidroxi-2,3-bis[(4-metilbenzoil)oxi]-4-oxo-butanoato

Se añade monohidrato del ácido di-p-toluoil-L-tartárico (1,04 k g, 2,69 mol) a una solución de [1-alil-4-amino-4-(5-bromo-2-fluoro-fenil)pirrolidina-3-il]metanol (1264 g. 3,85 mmol) en etanol (21 l). La mezcla se calienta a 65-75 °C y se agitó durante 3 horas. La mezcla se enfría a 5-10 °C, se añade una semilla de cristal de [(3S,4R)-1-alil-3-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4-(hidroximetil)pirrolidina-3-il]amonio; (2S,3S)-4-hidroxi-2,3-bis[(4-metilbenzoilo)oxi]-4-oxobutanoato (1,0 g) y la mezcla se agitó durante 3 horas. El sólido se filtró y la pasta del filtro se lava con etanol frío (1,4 l). La pasta del filtro se secó para dar el compuesto del título como un sólido blanco. Análisis quirales del segundo isómero de elución: Columna: Quiralpak iC, 4,6 mm * 250 mm * 5 pm; eluyente: 90% de hexano (0,3% de dietilamina): etanol 10% (0,3% de dietilamina); velocidad de flujo de 1,0 ml/min a 270 nm de UV confirma el enantiómero enriquecido (99% ee) enantioméricamente con Rt = 7,4 minutos, (1050 g, 38%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 82,40(s, 6H), 3,5-3,4 (m, 1H), 3,57-3,31 (m, 3H), 3,66-3,58 (m, 4H), 3,75-3,74 (m, 2H), 5,38-5,36 (m, 1H), 5,50-5,46 (m, 1H), 5,88(s, 2H), 5,97- 5,91 (m, 1H), 07,10-7,05 (m, 1H), 7,29 (d, J= 8,0 Hz, 4H), 7,53-7,51 (m, 1H), 7,80-7,78 (m, 1H), 8,01 (d, J= 8,0 Hz, 4H).

Preparación 11

Ácido di-toluensulfónico relativo-1-[3-[(3S,4R)-3-amino-4-(hidroximetil)pirrolidin-3-il]-4-fluoro-fenil]propan-2-ona

Se añade relativo-N-3-[(3aR,6aS)-5-bencil-1-[(4-metoxifenil)metil]-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-6a-il]-4-fluoro-fenil]acetamida (5,0 g, 11,0 mmol) a agua (75 ml), 10% de paladio sobre carbono (2,5 g, 23mmol), ácido ptoluensulfónico (5,0 g, 26mmol) y etanol (75 ml) y la mezcla se hidrogena en una atmósfera de hidrógeno a 50 psi a temperatura ambiente durante 20 horas. La mezcla se filtra a través de tierra de diatomeas y la almohadilla se lavó con etanol (100 ml) seguido de DCM (100 ml). El filtrado se concentró para dar el compuesto del título como una mezcla racémica cis en rendimiento bruto cuantitativo (8,1 g, > 100%). El material se usó directamente sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 268 (M+H).

Preparación 12

((3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(5-bromo-2-fluoro-fenil)pirrolidina-3-il)metanol

Se añade 1 N HCI (500 ml, 500 mmol) a una solución a 0 °C de [(3S,4R)-1-alil-3-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4-(hidroximetil)pirrolidina-3-iI]amonio; (2S,3S)-4-hidroxi-2,3-bis[(4-metilbenzoilo)oxi]-4-oxo-butanoato (100 g, 139,4 mmol) en EtOAc (500 ml). La mezcla se agitó durante 1 hora. La capa acuosa se separa y se ajusta el pH a 8 con NaOH a 1 N. La capa acuosa se extrae con EtOAc (350 ml x 2). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con agua (500 ml) y se concentró para dar el compuesto del título (40 g, 87%). Los análisis quirales del segundo isómero de elución: Columna: Quiralpak IC, 4,6 mm * 250 mm * 5 pm; eluyente: 90% de hexano (0,3% de dietilamina): etanol 10% (0,3% de dietilamina); velocidad de flujo de 1,0 ml/min a 270 nm de UV confirma el enantiómero enriquecido (99,7% ee) enantioméricamente con Rt = 7,4 minutos. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 82,78­ 2,70 (m, 5H), 3,16-3,00 (m, 3H), 3,87-3,75 (m, 1H), 3,90-3,84 (m, 1H), 5,24-5,11 (m, 2H), 5,91-5,87 (m, 1H), 6,95­ 6,91 (m, 1H), 7,35-7,32 (m, 1H), 7,67-7,65 (m, 1H).

Preparación 13

Relativo-N-[3-[(3S,4R)-3-amino-1-(5-fluoropirimidin-2-il)-4-(hidroximetil)pirrolidin-3-il]-4-fluoro-fenil]acetamida

Se añade ácido di-toluensulfónico relativo-1-[3-[(3S,4R)-3-amino-4-(hidroximetil)pirrolidina-3-il]-4-fluorofenil]propan-2-ona, (7,5 gramos, 12,3 mmol) a ACN (75 ml). Se añade 2-cloro-5-fluoropirimidina (2,44 g, 18,4 mmol) y D ip Ea (7,5 ml, 43 mmol) y la mezcla se calienta a 70 ° C durante 20 horas. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y se concentró. Se añade agua (50 ml) la mezcla se agitó durante 1 hora como se forma una suspensión espesa. La mezcla se filtró y se secó a temperatura ambiente bajo vacío para dar el compuesto del título como una mezcla racémica cis (3,0 g). La solución acuosa restante se extrae con cloroformo (3 x 20 ml), se secó sobre sulfato de sodio, se concentró a sequedad y se secó a vacío para dar el compuesto del título adicional (1, 8g), para un rendimiento total crudo (4,8 g, 110%). ES/MS (m/z): 364 (M+H).

Preparación 14

N-(((3S,4R)-1-alil-3-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4-(hidroximetil)pirrolidin-3-il)carbamatiol)benzamida

Se añade sotiocianato de benzoilo (15,0 g, 91,9 mmol) a una solución a 0 °C de ((3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(5-bromo-2-fluoro-fenil)pirrolidin-3-il)metanol (30 g, 91,1 mmol) en THF (400 ml). La solución se calienta a 25 °C y se agitó durante 1 hora para dar una solución THF del compuesto del título, que se usó sin purificación adicional.

Preparación 15

Diclorhidrato de N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida

Se añade trifenilfosfina (36,8 g, 140,3 mmol) a una solución en THF (400 ml) de N-(((3S,4R)-1-alil-3-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4-(hidroximetil)pirrolidin-3-il)carbamatiol)benzamida (91,1 mmol). Se añade azodicarboxilato de di-tbutilo (31,6 g, 137,2 mmol) en THF (100 ml). La mezcla se agita a 20-30 °C durante 2 horas. La mezcla se concentra y se añade MTBE (400 ml). La solución se filtra a través de tierra de diatomeas y la pasta se lava con MTBE (130 ml). Los filtrados se combinan y HCI a 1N en EtOAc (200 ml) se añade. La mezcla se agitó durante 2 horas y después se concentró a 500 ml. Se añade MTBE (320 ml) y la solución se filtró y se lavó con heptano (130 ml). El sólido se suspendió en EtOAc (650 ml) y se agitó a 50-60 °C durante 2 horas La suspensión caliente se filtró y el sólido se lava con EtOAc (130 ml) y heptano (130 ml). El sólido se resuspende en EtOAc (650 ml) y se agitó durante 2 horas a 50-60 ° C. La suspensión caliente se filtró y se lavó con EtOAc (130 ml) y heptano (130 ml). El sólido se secó para dar el compuesto del título como la sal de di-HCI (40 g, 80%, 99,5% ee). Análisis quirales del primer isómero de elución: columna: Quiralpak IC, 4,6 mm * 250 mm * 5 pm; eluyente: 85% de hexano (0,1 % de dietilamina): 15% de alcohol isopropílico (0,1% de dietilamina); velocidad de flujo de 1,0 ml/min a 282 nm de UV confirma el enantiómero enriquecido (99,5% ee) enantioméricamente con Rt = 12,5 minutos.

Preparación 16

N-[(4aR,7aS)-6-alil-7a-[2-fluoro-5-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]fenil]-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida

15% de carbonato de sodio (440 ml) se añade a una solución de diclorhidrato de N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (495 g, 717,88 mmol) en EtOAc (3 l) y agua (784ml). La mezcla se agita durante 1-2 horas. Las capas se separaron y la capa orgánica se filtra a través de gel de sílice (40 g) y se lavaron con EtOAc (600 ml). El filtrado se concentra en secado para dar N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida. Se añade trifluoroacetamida (136,7 g, 1,21 mol), Nal (182,5 g, 1,22 mol), tamices moleculares de 4A (342 g) y K2CO3 (170,9 g, 1,24 mol) a una solución de N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (341 g, 494,54 mmol) en d Ms O (525 ml) y 1,4-dioxano (1,025 l). Se añade trans-N,N'-dimetilciclohexano (81,6 g, 573,66 mmol) y yoduro de cobre (27,3 g, 143,34 mmol) en DMSO (500 ml) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó durante 5 minutos. La mezcla se calienta a 100 °C y se agitó durante 8 horas y se enfría a 24 °C. Se añaden agua (5,9 l) y DCM (5,9 l), la mezcla se filtra y se separan las capas. La capa orgánica se lavó con agua (5,9 l) para obtener el compuesto del título en una solución de DCM, que se usa sin purificación adicional.

Preparación 17

Relativo-N-[(4aR,7aS)-7a-5-(acetamido)-2-fluoro-fenil)-6-(5- fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-iljbenzamida

Se añade THF (30 ml) a relativo-N-[3-[(3S,4R)-3-amino-1-(5-fluoropirimidin-2-il)-4-(hidroximetil)pirrolidin-3-il]-4-fluoro-fenil]acetamida (4,1 g, 11,0 mmol). La mezcla se enfría en un baño de hielo a 0 °C y se añade isotiocianato de benzoilo (1,50 ml, 11,0 mmol). A continuación, la mezcla se deja calentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añade 1,1'-carbonildiimidazol (1,9 g, 11,0 mmol)y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la mezcla se calienta a 55 °C y se agita durante 18 horas adicionales. Se añade agua (50 ml) y la mezcla se extrae con EtOAc (50 ml). La capa acuosa se extrae con EtOAc adicional (25 ml) y se concentra en seco. El residuo bruto se purifica por cromatografía en columna ultrarrápida en gel de sílice eluyendo con 50% EtOAc en DCM, seguido de 100% EtOAc. Las fracciones apropiadas se concentraron y se secaron a vacío para dar el compuesto del título como una mezcla racémica cis (1,33 g, 26%). ES/MS (m/z): 509 (M+H).

Preparación 18

Clorhidrato de N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida

Se añade NaOH (28,7 g) y agua (2,7 l) a una solución de DCM de N-[(4aR,7aS)-6-alil-7a-[2-fluoro-5-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]fenil]-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (250 g, 494,4 mmol) y la mezcla se agita a 24 ° C durante 68 horas. Se añade HCI a 1N (3,5 l) para obtener un pH de 1-3. Las capas se separaron y la capa acuosa se lava con DCM (680 ml). DCM (4 l) se añade a la fase acuosa seguida de hidróxido de amonio 21% para obtener un pH de 8-10. Las capas se separaron y los extractos orgánicos se combinan, se filtró a través de gel de sílice (170 g) y se lavó con DCM (1,4 l). El solvente se concentra a sequedad y se diluyó con EtOAc (4 l). El HCI a 1N en EtOAc (700 ml) se añade a una temperatura por debajo de 25 °C y la mezcla se agitó durante 1 hora. La mezcla se concentra a unos 7-8 volúmenes y EtOAc (2,8 l) se agrega. El precipitado resultante se filtró y lavó con EtOAc (400 ml). El sólido se secó para dar el compuesto del título (246 g, 52%).

Preparación 19

N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluoro-fenil)-6-alil-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d](1,3]tiazin-2-il)benzamida

El anhídrido acético (23,5 g, 0,23 mol) se añade a una solución de clorhidrato de N-((4aR,7aS)-6-alil-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida, (100g, 0,153 mol) y trietilamina (54,3 g, 0,535 mol) en DCM (800 ml). Después de agitar durante 1 hora a 20 - 25 °C, se añaden NaHCO3 saturado (700 ml) y agua (600 ml). Las capas se separan para dar el compuesto del título, que se usó sin purificación adicional como una solución en DCM.

Preparación 20

N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida

Se añade trifenilfosfina (4,0 g, 0,015 mol) y ácido 1,3-dimetilbarbitúrico (15,2 g, 0,097 mol) a una solución de DCM N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluorofenil)-6-alil-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (0,153 mol). Se añade acetato de paladio (1,7 g, 7,7 mmol) y la mezcla se agita de 20 a 30 ° C durante 1 hora. Se añade 25% de hidróxido de amonio y las capas se separan. La capa orgánica se lava con HOAc (3,0 eq en 500 ml de agua) y se ajusta el pH a 8-9 con 25% de hidróxido de amonio. La capa acuosa se extrajo con DCM (2 * 500 ml). Los extractos orgánicos se combinaron y se concentraron a 3-4 volúmenes. Se añade MTBE (1 l) y la mezcla se filtra. La mezcla se concentra y se añade heptano (1 l). El sólido resultante se filtra, se recogió y se secó para dar el compuesto del título (48 g, 76%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) 82,15(s, 3H), 2,87-2,83 (m, 1H), 3,43-3,23 (m, 5H), 3,70-3,67 (m, 1H), 7,12-7,7 (m, 1H), 7,28-7,27 (m, 1H), 7,52-7,41 (m, 4H), 7,79 (m, 1H), 8,18-8,16 (m, 2H), ES/MS (m/z): 413,1 (M+H).

Preparación 21

N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida

Se añade 2-cloro-5-fluoropirimidina (28,9 g, 218 mmol) y carbonato de potasio (33,46 g, 242,1 mmol) a una solución de N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (50 g, 121,22 mmol) en DMF (100 ml). La mezcla se calienta a 80-85 °C durante 8 horas. La mezcla se enfría a 24 °C, se filtró y se lavó con DMF (100 ml). Los sólidos se suspendieron en agua (2 l) y se filtró para obtener el compuesto del título (68,5 g, 98%). LC-MS: m/z= 509,2 (M+H)+ , 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 8 ppm 1,22 (t, J= 7,28Hz, 2 H) 1,92-2,07 (m, 6 H) 2,89-3,20 (m, 2 H) 3,36-3,44 (m, 1H) 3,67 (t, J= 9,54Hz, 1H) 3,84 (br. s., 1H) 4,16 (br s,, 2H) 7,23 (br. s., 2 H) 7,35-7,61 (m, 8H) 7,77 (br. s., 2H) 7,85-8,18 (m, 4H) 8,48 (s, 4H) 10,15 (br. s., 1H) 10,46-10,59(m, 1H).

Preparación 22

(4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina

Se añade hidróxido de litio (8,6 g, 204,9 mmol) a una solución de N-((4aR,7aS)-7a-(5-acetamido-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il)benzamida (80 g, 157,3 mmol) en metanol (400 ml). La mezcla se calienta a 60-70 °C durante 4 horas. El HCI concentrado (132 g) se añade y la mezcla se agita a 55 °C durante 18 horas. La mezcla se enfría a 30 °C y se concentra para eliminar el metanol. Se añade agua y la capa acuosa se extrae con DCM (3 *) para obtener el compuesto del título como una solución acuosa de 920 g de los cuales 5,6% de la masa total es el compuesto del título que se usó sin purificación adicional.

Preparación alternativa 22

Se añade ácido sulfúrico (33,4 ml, 626,6 mmol) a una solución de (4aR,7aS)-7a-(2-fluorofenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina (45,8 g, 125,3 mmol) en TFA (626 ml). La mezcla se enfría a 0 °C y se agitó durante 20 minutos. El ácido nítrico fumante (6,2 ml, 144,1 mmol) se añade y la mezcla de reacción se calienta a 22 °C y se agitó a durante 3 horas. La mezcla de reacción se evapora y se añade MTBE (250 ml) y se evapora dos veces. El residuo se seca bajo vacío hasta un peso constante y luego se disuelve en agua (147 ml) y etanol (885 ml) y se desgasifica con burbujeo de nitrógeno durante 15 minutos. La solución se transfiere aun reactor de presión y se añade 10% Pd/C tipo de pasta de 87 l (6,6 g, 6,27 mmol). La mezcla se diluyó con etanol adicional (700 ml) y se presuriza con hidrógeno a 80 psi durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtra y luego una segunda carga de catalizador se añade de 10% Pd/C tipo de pasta de 87L (6,6 g, 6,27 mmol) y la mezcla se presuriza a 80 psi y se agitó durante 3 días en el reactor a presión. La mezcla de reacción se purga con nitrógeno y se filtró sobre tierra de diatomeas. El filtrado se evapora y el residuo se repartió entre agua (200 ml) y EtOAc (200 ml). La capa acuosa se separa, se enfría a 5 °C y se neutralizó con hidróxido de amonio 15% p/p. La capa acuosa se extrae con EtOAc (3 * 150 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para dar el compuesto del título como sólido marrón claro (47,7 g, 99% que contenía EtOAc residual). ES/MS (m/z): 363 (M+H).

Preparación 23

N-alil-N-(2,2-dimetoxietil)carbamato de bencilo

Una solución de N-(2,2-dimetoxietil)carbamato de bencilo (50 g, 208,9 mmol) en tolueno (180 ml) se trata con hidróxido de potasio sólido (51,6 g, 919,69 mmol) bajo nitrógeno. Después de 10 minutos, se añadió cloruro de benciltrietilamonio (0,8 g, 3,1 mmol). Después de otros 10 minutos se añade una solución de bromuro de alilo (33 g, 272,8 mmol) en tolueno (50 ml) gota por gota durante 10 minutos. La mezcla resultante se agitó a 50 °C durante 48 horas. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y se inactivó con agua. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró en seco para dar el compuesto del título (44 g, 75%). ES/MS (m/z): 280 (M+H).

Preparación 24

N-alil-N-(2-oxoetil)carbamato de bencilo

Una solución de N-alil-N-(2,2-dimetoxietil)carbamato de bencilo (30 g, 107 mmol) en ácido fórmico (36,8 ml, 860 mmol) y agua (4,84 ml) se agita a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se concentró y se diluyó con hexanos/EtOAc (1:2) y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con solución de salmuera hasta pH = 6 y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se evaporó para dar el compuesto del título (25 g, 99%). ES/MS (m/z): 234 (M+H).

Preparación 25

N-alil-N-[2-hidroxiiminoetil]carbamato de bencilo

Una solución de N-alil-N-(2-oxoetil)carbamato de bencilo (25 g, 107 mmol) en ACN (150 ml) se trata con clorhidrato de hidroxilamina (9,68 g, 139 mmol) y una solución de trihidrato de acetato de sodio (16 g, 117,9 mmol) en agua (75 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El ACN se evapora y la solución acuosa se extrae con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a vacío para dar el compuesto del título (24 g, 90%). ES/MS (m/e): 249 (M+H)

Preparación 26

3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-5-carboxilato de bencilo

Una solución de N-alil-N-[2-hidroxiiminoetil]carbamato de bencilo (24 g, 96,6 mmol) en DCM (338 ml) se trata gota a gota durante 10 minutos con un 5% p/p solución acuosa de hipoclorito de sodio (106,08 mmol, 143,06 ml). La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se inactivó con una solución acuosa al 40% de bisulfito de sodio (7g). La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a vacío. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice eluyendo con 5% EtOAc en hexanos para dar el compuesto del título (18 g, 75%). ES/MS (m/z): 247 (M+H).

Preparación 27

6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4-c]isoxazol-5-carboxilato de bencilo

Se añade una solución de hexanos a 1,6 M de n-butil litio (25,4 ml, 40,6 mmol) gota a gota a una solución de -78 °C de 4-bromo-1-fluoro-2-yodobenceno (12,22 g, 40,6 mmol) en THF (60 ml) para dar una solución amarilla que se agitó a -78 ° C durante 15 minutos. El boro eterato de trifluoruro (5,14 ml, 40,6 mmol) se añade a una separada solución a -78 °C de 3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4- c]isoxazol-5-carboxilato de bencilo (5 g, 20,3 mmol) en THF (60 ml) y la mezcla se agita a -78 °C durante 5 minutos. Esta solución se añade a la mezcla de organolitio a -78 °C previamente preparada mediante una cánula. La mezcla combinada se agitó durante 30 minutos a -78 ° C. La mezcla se inactivó con cloruro de amonio acuoso saturado y se calienta a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 *) y los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtró y el solvente se eliminó a vacío. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de 35 minutos de 5% a 100% de EtOAc de hexanos para dar el compuesto del título (2,27 g, 27%). ES/MS (m/z): (79Br/81Br) 421/423 (M+H).

Preparación 28

1-(benzoilcarbamatiol)-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-5-carboxilato de bencilo

Se añade isotiocianato de benzoilo (2,87 ml, 21,28 mmol) gota a gota a una solución de 6a-(5-bromo-2-fluorofenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4-c]isoxazol-5-carboxilato de bencilo (5,977 g, 14,2 mmol) en THF (95 ml) y se agitó durante la noche bajo nitrógeno. El solvente se eliminó a vacío. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de 30 minutos de 5% a 100% de EtOAc de hexanos para dar el compuesto del título (6,05 g, 73%). ES/ MS (m/z): (79Br/81Br) 584/586 (M+H).

Preparación 29

3-(benzoilcarbamatiolamino)-3-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4-(hidroximetil)pirrolidina-1-carboxilato de bencilo

Una mezcla de 1-(benzoilcarbamatiol)-6a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]isoxazol-5-carboxilato de bencilo (6,05 g, 10,4 mmol) y zinc (polvo, < 10 pm) (6,77 g, 103,5 mmol) se agita en HOAc (52 ml) a temperatura ambiente durante la noche bajo nitrógeno. La reacción se diluye con EtOAc y se filtró a través de tierra de diatomeas. El solvente se eliminó a vacío y el residuo se diluye con EtOAc, agua y bicarbonato de sodio acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 *), las capas orgánicas combinadas se combinaron y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtró y el solvente se eliminó a vacío. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de 30 minutos de 5% a 100% de EtOAc de hexanos para dar el compuesto del título (5,222 g, 86%). ES/MS (m/z): (79Br/81Br) 586/588 (M+H).

Preparación 30

2-benzamido-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-carboxilato de bencilo

Se añade 1,1'-carbonildiimidazol (2,87 g, 17,7 mmol) a una solución de 3-(benzoilcarbamatiolamina)-3-(2-fluorofenil-5-bromo)-4-(hidroximetil)pirrolidina-1-carboxilato de bencilo (5,198 g, 8,86 mmol) en THF (52 ml). La mezcla se agitó durante 1,5 horas a temperatura ambiente y después la reacción se calienta a reflujo durante la noche bajo nitrógeno. La reacción se enfría, se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc (3 *). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtró y el solvente se eliminó a vacío. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de 30 minutos de 5% a 100% de EtOAc de hexanos para dar el compuesto del título (2,93 g, 58%). ES/MS (m/z): (79Br/81Br). 568/570 (M+H).

Preparación 31

N-[7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida

Se añade yodotrimetilsilano (2,21 ml, 15,46 mmol) gota a gota a una solución a temperatura ambiente de 2-benzamido-7a-(5-bromo- 2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-carboxilato de bencilo (2,93 g, 5,15 mmol) en ACN (44 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante dos horas y el solvente se eliminó a vacío. El producto bruto se purifica con una columna SCX usando una relación 3:1 de DCM:metanol y luego 2:1 DCM:7N de amoníaco en metanol para dar el compuesto del título (2,098 g, 94%). ES/MS (m/z): (79Br/81Br) 434/436 (M+H).

Preparación 32

2-benzamido-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-carboxilato de ferc-butilo

Se añade di-t-butildicarbonato (1,16 g, 5,31 mmol) y trietilamina (1,01 ml, 7,25 mmol) a una solución de N-[7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (2,098 g, 4,83 mmol) en DCM (48 ml). La reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. El solvente se eliminó a vacío y el producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de 30 minutos de 5% a 100% de EtOAc de hexanos para dar el compuesto del título (2,556 g, 99%). ES/MS (m/z): (79Br/81Br) 534/536 (M+H).

Preparación 33

7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-carboxilato de ferc-butilo

Una solución de 2-benzamido-7a-(5-bromo-2-fluoro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-6-carboxilato de ferc-butilo (2,556 g, 4,8 mmol) y trans-N,N'-dimetil-1,2-ciclohexanodiamina (150 mg, 1,1 mmol) en etanol (50 ml) se trata con azida de sodio (933m g, 14,3 mmol). Se añaden una solución acuosa de sal sódica del ácido L-ascórbico (0,66 M, 3,2 ml, 2,1 mmol) y agua (1 ml) y la parte superior del matraz se purga con nitrógeno. La mezcla se trata con una solución acuosa de cobre (II) pentahidrato de sulfato (0,33 M, 3,2 ml, 1,1 mmol) y la mezcla se calienta inmediatamente sobre una placa caliente precalentado a 80 °C durante 1,5 horas bajo nitrógeno. Una mezcla homogénea se obtiene después del calentamiento. La reacción se enfría, se diluyó con agua con hielo y la mezcla se extrajo con EtOAc (3 *). Los extractos orgánicos se combinaron y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y el solvente se eliminó a vacío para dar el producto de azida bruta. El producto de azida bruta se combina con 10% de paladio sobre carbono (1 g) en etanol frío (150 ml) y la mezcla se purga usando vacío/nitrógeno y a continuación de vacío/hidrógeno. La mezcla se agita a temperatura ambiente bajo 30 psi de hidrógeno durante 5 horas. La reacción se ventila, se filtró a través de tierra de diatomeas y la pasta del filtro se enjuagó con DCM. El solvente se eliminó del filtrado a vacío y el producto bruto se purifica sobre gel de sílice con 50% de EtOAc en DCM para dar el compuesto del título (2,014 g, 89%). ES/MS (m/z): 471 (M+H).

Preparación 34

N-[7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida

Se añade TFA (10 ml) a una solución de 7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazina-6-carboxilato de ferc-butilo (2,013 g, 4,28 mmol) en DCM (30 ml) y la mezcla se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 4 horas. El solvente se eliminó a vacío y el producto bruto se purifica con una columna SCX usando una relación de 3:1 de DCM:metanol y luego 2:1 de DCM:7N de amoníaco en metanol para dar el compuesto del título (1,555 g, 98%). ES/MS (m/z): 371 (M+H).

Preparación 35

N-[7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida racémica

Una solución de N-[7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (705 mg, 1,90 mmol), 5-fluoro-2-cloropirimidina (1,01 g, 7,61 mmol) y DIPeA (1,66 ml, 9,52 mmol) se calientan en 1,4-dioxano (20 ml) a reflujo durante 4 horas bajo nitrógeno. La reacción se enfría, se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc (3 *). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y el solvente se eliminó a vacío para dar el producto bruto. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de 25 minutos de 5% a 100% de EtOAc de hexanos para dar el compuesto del título (590 mg, 66%). ES/MS (m/z): 467 (M+H).

Preparación 36

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida, (isómero 1)

N-[7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida racémica (1,694 g, 3,63 mmol) se purifica por HPLC quiral (Columna: Chiralcel OJ, 8*35 cm; eluyente: 90% de metanol (0,2% dimetiletilamina) y 10% de ACN; flujo de 400 ml/min a 280 nm de UV). Análisis del primer isómero de elución (columna: Chiralcel OJ-H 0,46*15 cm; eluyente: 10:90 ACN: metanol (con 0,2% dimetiletilamina); flujo: 0,6 ml/min a 280 nm de UV) confirma el enantiómero enriquecido (99 % ee) enantioméricamente con Rt = 6,70 minutos, (723 mg, 43%). ES/MS (m/z): 467 (M+H).

Preparación 37

N-[3-[(4aR,7aS)-2-benzamido-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida, isómero 1

N-[3-[(4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida, isómero 1 (0,361 g, 0,77 mmol) se disuelve en una mezcla de DCM (4ml) y DMF (0,5 ml). El ácido 5-metoxipirazina-2-carboxílico (240 mg, 1,55 mmol), HOBT (210 mg, 1,55 mmol) y EDCI (300 mg, 1,55 mmol) se añaden a la mezcla y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se añade directamente en una columna de carga de gel de sílice de 12 g y se purificó usando una columna de gel de sílice de 40g y eluyendo con un gradiente de 0-100% de EtOAc/hexanos. El producto se disolvió en EtOAc (200 ml), se lavó con NaOH a 1 N (2 * 50 ml) y con salmuera (1 * 50 ml). La purificación de gel de sílice se repite como se describió anteriormente para dar el compuesto del título (350 mg, 74%). ES/MS (m/z): 603 (M+H).

Preparación 38

5-alil-6a-(2-fluorofenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4-c]isoxazol

Etapa de reacción química de flujo: Un reactor sin fisuras 343 ml de acero inoxidable tubular (OD = 1/8 pulgada [3,175 cm]) se coloca dentro de un horno GC y se lava abundantemente con tolueno a 20 ml/min durante 20 minutos. Aplique la contrapresión de nitrógeno (720 psig) y ajuste la temperatura del GC a 210 °C. Después de que la temperatura haya alcanzado 210 °C, una solución de 2-(dialilamino)-1-(2-fluorofenil)etanona oxima (480,51 g, 1,74 mol) en tolueno (5,81 l) se bombea a través del reactor a 22,866 ml/min utilizando un par de bombas de jeringa de alta presión que trabaja en modo continuo para dar un tiempo de residencia de 15 minutos. Después de que se consumió toda la solución madre del reactor se lava con tolueno a 22,866 ml/min durante 30 minutos. La temperatura del horno GC se establece en 25 °C y la solución completa se recoge y se concentró a vacío. El solvente se evapora y el residuo de disolvió en DCM (2,5 l) y agua (5 l). El pH se ajustó a 1 con HCI y la capa acuosa se separa y se neutraliza con NaOH para ajustar el pH a 10. La capa acuosa se extrae con MTBE (3 x 2,5 l). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron en seco para dar el compuesto bruto del título (248 g, 47%) que se usó sin purificación adicional. Es /MS (m/z): 249 (M+H).

Preparación 39

1-alil-4-amino-4-(2-fluorofenil)]pirrolidin-3-il]metanol

Se añade polvo de zinc (590 g, 9 mol) a una solución de 5-alil-6a-(2-fluorofenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4-c]isoxazol (3559 g, 1,29 mol) en una mezcla de metanol (2,85 l) y cloruro de amonio solución acuosa saturada (3,56 l) y la mezcla se calienta durante 16 horas a 70 °C. La reacción se enfría a 60 °C, se diluyó con THF (2,85 l) y se filtró mientras estaba caliente sobre tierra de diatomeas. El filtrado se evapora para eliminar el solvente orgánico y la mezcla acuosa se diluye con ácido cítrico al 10% p/p solución acuosa (4 l) y EtOAc (3,5 l). La capa orgánica se separa y la capa acuosa se lava con EtOAc (2 * 2 l). La capa acuosa se neutraliza con NaOH 50% p/p para ajustar el pH a 10 y luego se extrae con EtOAc (2 * 1,5 l). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a sequedad para dar el compuesto del título bruto (299 g, 92%). ES/MS (m/z): 251 (M+H).

Preparación 40

[(3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(2-fluorofenil)pirrolidin-3-il]metanol; 2,3-bis[(4-metiIbenzoil)oxi]butanodioico

Se añade una solución de ácido di-p-toluoil-L-tartárico (348,6 g, 884 mmol) en 1-metoxi-2-propanol (1,13 l) a una solución de [(3R,4S)-1-alil-4amino-4-(2-fluorofenil)pirrolidin-3-il]metanol (225,9 g, 902 mmol), en 1-metoxi-2-propanol (1,13 l) previamente calentada a 40 °C. La reacción se enfría a 22 °C y se agitó durante 18 horas. Un sólido blanco se recoge por filtración y se lava con 1-metoxi-2-propanol (600 ml). El sólido recogido se secó para dar el compuesto del título (183,01 g, 31,8%). ES/MS (m/z): 251 (M+H).

Preparación 41

[(3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(2-fluorofenil)pirrolidin-il-3]metanol

[(3R,4S)-1-alil-4-amino-4-(2-fluorofenil)pirrolidin-3-il]metanol; ácido 2,3-bis[(4-metilbenzoilo)oxi]butanodioico (211 g, 331 mmol) se disuelve en agua (2,1 l) y EtOAc (2,3 l). Se añade HCI 35% p/p para ajustar el pH a 1. La capa acuosa se separa y se ajustó el pH a 10 con NaOH 50% p/p y se extrajo con EtOAc (2*). El pH de la capa acuosa se ajusta a 10 con NaOH acuoso y se extrajo con MTBE (3*), mientras que también se mantiene el pH de la solución acuosa a pH = 10. Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró en seco para dar el compuesto del título bruto, (73 g, 88%, 94,8% ee). El producto se analiza por cromatografía quiral: Columna AS-H, eluyente 10% de alcohol isopropílico, 2% de amina isopropilo; velocidad de flujo de 3 ml/min a 220 de UV; presión de 100 bar a 35 °C para dar el compuesto del título como el segundo isómero eluyente, Rf = 2,26 minutos. ES/MS (m/z): 251 (M+H).

Preparación 42

N-[(4aR,7aS)-6-alil-7a-(2-fluorofenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida

Una solución de [(3R-4S)-1-alil-4-amino-4-(2-fluorofenil)pirrolidin-3-il]metanol (129,7 g, 414 mmol) en THF (2,3 l) se enfría a 0 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. El isotiocianato de benzoilo (61,5 ml, 456 mmol) se añade manteniendo la temperatura por debajo de 5 °C. La reacción se calienta a temperatura ambiente durante 3 horas y se añadió 1,1-carbonildiimidazol (87,4 g, 538,9 mmol) y la reacción se agitó a 22 °C durante 1 hora seguido de calentamiento a 70 °C durante 16 horas. La mezcla de reacción se enfría a 22 °C y el solvente se evapora. El residuo se reparte en EtOAc (1 l) y agua (1 l). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrae con EtOAc (2 * 400 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron en seco para dar el compuesto del título en bruto. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc/DCM 0-40% d Cm para dar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (170 g, 99%) que contiene solvente residual. ES/MS (m/z): 396 (M+H).

Preparación 43

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-fluorofenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida

Se añade ácido benzoico, 2-mercapto-(122 g, 793 mmol), bis(dibencilidenacetona)paladio (4,15 g, 7,21 mmol) y 1,4-bis(difenilfosfino)butano (3,14 g, 7,21 mmol) a una solución de N-[(4aR,7aS)-6-alil-7a-(2-fluorofenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (178,21 g, 360 mmol) en anhidro 2-metiltetrahidrofurano (1,96 l) bajo una atmósfera de nitrógeno. La solución se desgasifica mediante vacío/ciclos de nitrógeno tres veces y luego se burbujea nitrógeno a través de la reacción durante 15 minutos. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la reacción. Cuando reacción alcanza 40 °C se elimina el burbujeo y la mezcla de reacción se agita a 40 °C durante 3 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se enfría a 22 °C y se diluyó con agua (2 l). Se añade una solución de HCI (a 5M) para ajustar el pH a 1. La capa acuosa se separó y se lavó con EtOAc adicional (2 * 800 ml). El pH de la capa acuosa se ajusta a 10 con NaOH 50% p/p y luego se extrae con EtOAc (10 l). La capa acuosa se lavó con EtOAc adicional (2 * 750ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a sequedad para dar el compuesto del título bruto en forma de sólido amarillo pálido (124,7 g, 97%). ES/MS (m/z): 356 (m H).

Preparación 44

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-fluorofenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida

Una solución de N-[(4aR,7aS)-7a-(2-fluorofenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (124,7 g, 256 mmol), DlpEA (67 ml), 5-fluoro-2-doropirimidina (29,3 ml, 307 mmol) en N-metilpirrolidona (997 ml) se calienta a 100 °C durante 16 horas. La reacción se enfría a 22 °C y se vierte en agua enfriada a 10 °C (10 l) manteniendo la temperatura por debajo de 15 °C. Un sólido crema pálido se recoge por filtración y se lavó con agua adicional. El sólido húmedo se disuelve en EtOAc (2 l) y se transfiere a un embudo separador. Se añade una solución acuosa de cloruro de sodio al 5% p/p (1 l) y la capa orgánica se separa, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y el filtrado se evapora bajo presión reducida. El producto se purifica mediante cromatografía en gel de sílice usando un gradiente de 0-40% de EtOAc/isohexano para dar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (116 g, 70%). ES/MS (m/z): 452 (M+H).

Preparación 45

(4aR,7aS)-7a-(2-fluorofenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina

Se añade hidróxido de litio (9,26 g, 386 mmol) a una mezcla de N-[(4aR,7aS)-7a-(2-fluorofenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (158,6 g, 351,6 mmol), en metanol (1,6 l). La mezcla se calienta a 70 °C durante 4 horas y después se enfría a 22 °C. La mezcla de reacción se evaporó a vacío hasta un residuo amarillo. El residuo se reparte en agua (1 l) y EtOAc (750 ml). Se añade HCI (5 M solución acuosa) para ajustar el pH a 1. La capa acuosa se separó y la capa orgánica se lavó con EtOAc (2 * 200 ml). El pH de la capa acuosa se ajusta con NaOH 50% p/p solución acuosa a pH = 10 y se extrajo con EtOAc (3 * 1 l). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para dar el compuesto del título bruto como un sólido amarillo pálido (133,3 g, 99%, que contiene 12% de EtOAc residual). ES/MS (m/z): 348 (M+H).

Preparación 46

Clorhidrato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida

Se disuelve N-[3-[(4aR,7aS)-2-benzamido-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida, isómero 1 (0,350 g, 0,58 mmol) en THF (2ml) y se añaden a continuación metanol (4ml) y etanol (4ml). Clorhidrato de O-metilhidroxilamina (495 mg, 5,81 mmol) y piridina (470 l, 5,81 mmol) se añaden a la mezcla y la reacción se calienta a 50 °C y se agitó durante la noche. El gel de sílice (-10g) se añade a la reacción y la mezcla se concentra. La muestra, secada sobre gel de sílice, se cargó en un cartucho vacío y eluyente purificado con un 0-10% del gradiente de metanol de amoniaco a 7N en DCM. El producto se purifica por segunda vez en una columna SCX usando DCM 3:1: metanol y luego DCM 2:1: a 7 N de amoníaco en metanol. El producto se purifica por última vez sobre gel de sílice con un gradiente de 0% a 10% de metanol de amoniaco a 7N en DCM para dar la base libre del compuesto del título. Este material se disuelve en DCM (5ml) y el HCI a 1M en éter dietílico (0,20 ml, 660 mmol) se añade. El solvente se eliminó a vacío para dar el compuesto del título (71m g, 23%). ES/MS (m/z): 498 (M+H).

Difracción de rayos X de polvo (XRD)

Los patrones de XRD de los sólidos cristalinos se obtienen en un difractómetro de rayos X de polvo Bruker Endeavor D4, equipado con una fuente CuKa A = 1,54060 A) y un detector de Vantec, operando a 35 kV y 50 mA. La muestra se explora entre los 4 y 40° en 20, con un tamaño de paso de 0,009° en 20 y una velocidad de barrido de 0,5 segundos/etapa y con 0,6 mm de divergencia, 5,28 antidispersorfijo y 9,5 mm ranuras del detector. El polvo seco se envasa en un soporte de muestra de cuarzo y se obtiene una superficie lisa usando un portaobjetos de vidrio. Los patrones de difracción de la forma cristalina se recogen a temperatura ambiente y humedad relativa. Es bien conocido en la técnica cristalográfica que, para cualquier forma cristalina dada, las intensidades relativas de los picos de difracción pueden variar debido a la orientación preferida resultante de factores tales como la morfología cristalina y el hábito. Donde los efectos de orientación preferida están presentes, las intensidades de pico se alteran, pero las posiciones de los picos característicos del polimorfo se mantienen sin cambios. Véase, por ejemplo, La Farmacopea de los Estados Unidos #23, Formulario Nacional #18, páginas 1843-1844, 1995. Además, también es bien conocido en la técnica cristalográfica que para cualquier forma cristalina dada las posiciones de los picos angulares pueden variar ligeramente. Por ejemplo, posiciones de los picos pueden desplazarse debido a una variación en la temperatura o humedad en la cual una muestra es analizada, el desplazamiento de la muestra, o la presencia o ausencia de un patrón interno. En el presente caso, una variabilidad de la posición del pico de ± 0,2 en 20 tendrá en cuenta estas variaciones potenciales sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma de cristal indicado. La confirmación de una forma cristalina puede hacerse en base a cualquier combinación única de distinguir picos (en unidades de ° 20), usualmente los picos más prominentes. Los patrones de difracción de la forma cristalina, recogidos a temperatura ambiente y la humedad relativa, se ajustan sobre la base en NIST 675 de picos estándar a 8,853 y 26,774 grados de 2-theta.

Preparación 47

Forma cristalina 2 de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d1[1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida (hidratada)

Cloruro de oxalilo (888 pI, 10,2 mmol) se añadió a una solución de ácido 5-metoxipirazina-2-carboxílico (1,6 g, 10,2 mmol) en ACN (53 ml) y DMF (848 pI). Después de 15 minutos, se añade la solución recién preparada a una solución de (4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina (2,65 g, 7,3 mmol) en una mezcla de agua (53 ml) y etanol (53 ml) previamente calentado a 50 °C. La mezcla de reacción se agita a 50 °C durante una hora, se enfría a 22 °C y después se agitó durante la noche a esta temperatura. El solvente orgánico se evaporó a vacío y la mezcla acuosa se trata con NaOH 50% p/p en solución acuosa para ajustar el pH= 10. Una crema pálido sólido se aisló y se lavó con agua adicional. El sólido se diluye con alcohol isopropílico (2*) y el solvente se evapora. El material en bruto se purifica por cromatografía en gel de sílice usando un gradiente de metanol amoníaco (a 2N) / DCM. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinan y el solvente se evapora para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino (1,9 g, 52%). ES/MS (m/z): 499 (M+H).

Preparación alternativa de la Forma cristalina 2 de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-Tetrah¡drop¡rrolo[3.4-d1[1.31t¡az¡n-7a-¡l1-4-fluoro-fenil1-5-metox¡-p¡raz¡na-2-carboxam¡da (hidratada)

Se añade ACN (500 ml) a DMF (19,2 ml, 248,9 mmol). El cloruro de oxalilo (39,3 g, 309,63 mmol) seguido de 5-metoxipirazina- 2-carboxílico (46,0 g, 298,4 mmol) se añade a la solución de DMF/ACN. En un matraz separado, la solución acuosa de (4aR,7aS)-7a-(5-amino-2-fluoro-fenil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-am¡na (56,8 g, 156,75 mmol) se añade a ACN (500 ml) y el pH se ajusta a 9 con hidróxido de amonio (95 ml). Esta mezcla se calienta luego a 50-55 °C. Se añade gota a gota la solución de cloruro de oxalilo y la mezcla se agita durante 3 horas. El pH se ajusta a 8-9 con hidróxido de amonio. El precipitado resultante se filtra, se lava con agua y se secó para obtener el compuesto del título (123 g). El sólido se suspendió en acetona (250 ml) durante 1,5 horas y se filtró. La pasta húmeda se lava con acetona para obtener el compuesto del título (110g con 90,5% de pureza por HPLC). El THF (1 l) y carbón activado (9 g) se añaden al sólido y la mezcla se calienta a reflujo durante la noche. La mezcla se filtra a través de tierra de diatomeas y se lava con THF (150 ml). La solución orgánica se concentra a 10 volúmenes y se calienta a 60 °C. Se añade agua (430 ml) y la mezcla se agita a 60 °C durante 8 horas. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y se agitó durante 10 horas. El sólido resultante se filtra, se lava con THF/agua (7:6) y se seca para dar el compuesto del título (69 g, 88%) LC-MS: (m/z) 499 (M+H), pureza: 98,3%. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2,99-3,07 (m, 2H) 3,07-3,14 (m, 1H) 3,58- 3,67 (m, 1H) 3,68­ 3,76 (m, 1H) 3,76-3,84 (m, 1H)4,02(s, 3H) 4,07 (d, J= 10,92 Hz, 1H) 6,08 (s, 2H) 7,19 (dd, J= 11,98, 8,72Hz, 1H) 7,78- 7,89 (m, 2H) 8,41(s, 1H) 8,44(s, 2H) 8,88 (s, 1H) 10,60 (s, 1H).

Procedimiento general para la preparación de la Forma cristalina 2 de N-r3-r(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluoro-fenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida (hidratada)

La suspensión de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-¡l]-4-fIuoro-fenN]-5-metoxi-p¡raz¡na-2-carboxam¡da en THF aproximadamente a 23 °C a una concentración de aproximadamente 71 mg/ml de solvente. La suspensión se calienta con agitación a la disolución que se produce en alrededor de 60 °C a aproximadamente 63 °C. Se añade agua a la solución caliente para proporcionar una relación de solvente de THF:agua de aproximadamente 95:5. Cristales de semilla de la forma 2 de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluoro-fenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida se añaden (alrededor del 3% peso de la carga). La suspensión fina resultante se mantuvo aproximadamente a 60 °C y aproximadamente a 63 °C durante unos 20 minutos. seguido de la adición de aproximadamente 5.3 a aproximadamente 5.5 volúmenes de agua por encima de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 horas dando como resultado una relación de solvente de THF:agua de aproximadamente 69:31. La suspensión se mantiene entonces a aproximadamente 60 °C a aproximadamente 63 °C durante unos 30 minutos y después se enfría a aproximadamente 23 °C durante aproximadamente 1 hora y después se agitó durante aproximadamente 8-12 horas. La suspensión se filtra a continuación. se enjuaga con un poco de THF:agua (35:65) y se secó durante aproximadamente 8-12 horas a vacío reducido a aproximadamente 40 °C para proporcionar la Forma cristalina 2 de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluoro-fenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida deseada la cual es hidratada.

Una muestra preparada de la Forma cristalina 2 de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluoro-fenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida se caracteriza por un patrón de XRD usando radiación CuKa que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la Tabla 1 a continuación. Específicamente. el patrón contiene un pico a 11.8° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 18.6°. 19.3° y 26.7°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0.2 grados.

T l 1: Pi ifr i n r X lv l F rm ri lin 2

La Forma cristalina 2 de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amíno-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluoro-fenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida es la forma cristalina estable a temperatura ambiente y a humedad relativa mayor que aproximadamente 15%.

Preparación 48

Forma cristalina 3 de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-¡l1-4-fluoro-fenil1-5-metox¡-p¡raz¡na-2-carboxam¡da.

Una bandeja de análisis termo gravimétrico se carga con N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluorofenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida y se calienta a aproximadamente 170 °C y se mantiene a 170 °C durante aproximadamente 5 minutos. La mezcla se enfría a temperatura ambiente para proporcionar el compuesto del título.

Preparación alternativa de la forma cristalina 3 de N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrah¡drop¡rrolo[3.4-d1[1.31t¡az¡n-7a-¡l1-4-fluoro-fenil1-5-metox¡-p¡raz¡ne-2-carboxam¡da.

N-[3-[(4aR.7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4.4a.5.7-tetrahidropirrolo[3.4-d1[1.31tiazin-7a-il1-4-fluoro-fenil1-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida (121 mg) se combina con ACN (5 ml) en un frasco y se calienta en una placa de agitación a 90 °C. Después de unos 30 minutos, la mayor parte del sólido se disuelve, proporcionando una solución turbia. Se añaden semillas de la Forma 3 y la muestra se agita durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 90 °C. El calentamiento se retira y la mezcla se agita para proporcionar un sólido de color blanco brillante. El sólido es aislado por filtración al vacío, se seca bajo una corriente de aire durante aproximadamente 10 minutos y luego bajo vacío reducido a aproximadamente 80 °C durante aproximadamente 8 a 12 horas para proporcionar el compuesto del título.

Una muestra preparada de la Forma cristalina 3 de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida se caracteriza por un patrón de XRD usando radiación CuKa como que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la tabla 2 a continuación. Específicamente, el patrón contiene un pico a 15,7° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 18,1°, 27,0° y 19,7°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Tabla 2: Picos de difracción de Rayos X de polvo de la Forma cristalina 3

Ejemplo 1

N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida; ácido toluensulfónico

La Forma cristalina 2 de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropinmidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]- 4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida hidratada (149,15 mg) se añadió a acetato de etilo (2 ml). La muestra se agita a 1000 rpm a una temperatura de 80 °C. Se añade ácido p-toluensulfónico (70 mg disueltos en acetato de etilo (1 ml)) a la solución en agitación y se agitó durante la noche a 80 °C para producir una suspensión de un sólido blanco que se aísla por filtración al vacío para proporcionar el compuesto del título.

Preparación alternativa A de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida; ácido toluensulfónico

Se añade N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida (9,5 g, 19 mmol) y ácido p-toluensulfónico (3,80 g, 19,8 mmol) a tetrahidrofurano (31 ml), agua (7,9 ml) y 2-propanol (8,6 ml). La solución se calienta a 40 °C. A la solución caliente se añadió 2-propanol (200,0 ml) durante 3 horas aproximadamente. La mezcla es sembrada poco después del inicio de la adición de 2-propanol con una porción del compuesto del título (500 mg, 0,75 mmol). Después de que la adición de solvente se completa, la mezcla se enfría a aproximadamente 20 °C durante 1-3 horas. La mezcla se calienta a partir de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C durante un tiempo objetivo de 2 horas. La temperatura se mantiene a 55 °C durante 1 hora y después se enfría a aproximadamente 20 °C durante aproximadamente 4 horas. La suspensión se agitó durante al menos 10 horas a aproximadamente 20 °C. La suspensión se filtró y la pasta húmeda se lavó con agua (57 ml). El producto se secó a vacío a 45 °C durante al menos 10 horas para dar el compuesto del título (10,4 g, 81 %). ES/MS (m/z): 500 (M+H).

Preparación alternativa B de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida: ácido toluensulfónico

Se suspende N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida hidratada (20,7 g) en 170 rpm en 60:40 THF:H2O (85 ml) en un matraz de bola de 500 ml de cuello equipado con un burbujeador de nitrógeno, motor mecánico IKA®/agitador unido al eje del vidrio con una hoja de plátano de teflón y un termopar conectado a un controlador J-KEM programable de temperatura. El ácido p-toluensulfónico monohidrato (7,6 g, 1,03 eq) se disuelve en una mezcla de 60:40 THF:H2O (20ml) y la solución se añadió todo de una vez a la agitación N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida suspendida a 23 °C, lo que lleva casi inmediatamente a una solución de tono rojizo claro. La velocidad de agitación se aumenta luego a 200 rpm como a más de 15 minutos, agua (22 ml) se añade a la solución, el cual es luego sembrado con N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida ácido toluensulfónico (750 mg, 3% en peso de carga de semillas) y se agita a 23 °C durante otros 15 minutos. Alrededor de 6 horas, agua (226 ml, del solvente total de 353 ml, o 13,6 vol., relación del solvente final de 17,5:82,5 THF:H2O) se añade a la suspensión, que luego se agitó durante la noche (22 horas) a 23 °C. La suspensión se filtra a través de vacío, se enjuagó con 15:85 de THF:H2O (2*20 ml), después a la izquierda al vacío durante 20 minutos, mientras que las grietas que se forman en la pasta húmeda producto son cerradas presionando manualmente. Los sólidos húmedos se secan a 40 °C bajo vacío durante aproximadamente 72 horas para dar el compuesto del título como un sólido cristalino blanco (24,07 g, 90,0% en peso).

La N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluorofenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida cristalina; ácido toluensulfónico se caracteriza por un patrón de XRD usando radiación CuKa como el que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la tabla 3 a continuación, y en particular, que tiene picos en ángulo de difracción 2-theta de 5,0° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Tabla 3: Picos de difracción de rayos X de polvo del Ejemplo 1 cristalino

Se ha encontrado que la humedad relativa por debajo del 15%, la forma 1 cristalina de la base libre de N-{3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]-4-fluoro-fenil}-5-metoxipirazina-2-carboxamida está presente, mientras que por encima de aproximadamente 15% de humedad relativa, la Forma cristalina 2 de N-{3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]-4-fluoro-fenil}-5-metoxipirazina-2-carboxamida predomina. Tal inestabilidad física es indeseable, en particular para una sustancia farmacéutica o medicamento producto farmacéutico, ambos de los cuales están sujetos a controles reglamentarios con respecto a las formas en estado sólido. En contraste con las formas cristalinas de la base libre, la sal de tosilato posee mejorado la estabilidad física en una amplia gama de humedades relativas (5-95%). Como tal, la sal de tosilato de N-{3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]-4-fluoro-fenil}-5-metoxipirazina-2-carboxamida esencialmente evita las transformaciones de fase dependientes de humedad asociados con las formas cristalinas de base libre correspondiente. Además, la sal de tosilato de N-{3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]-4-fluoro-fenil}-5-metoxipirazina-2-carboxamida se encontró que tenía una cantidad sustancialmente inferior de solvente retenido en el cristal de alrededor de 1,3% en comparación con aproximadamente 7,7% de solvente retenido para la sal de HCI de N-{3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]-4-fluoro-fenil}-5-metoxipirazina-2-carboxamida. El aumento de la probabilidad de la base libre al someterse a las transiciones de fase durante el almacenamiento a largo plazo puede dar lugar a la variabilidad en las propiedades, tales como la solubilidad o velocidad de disolución, lo que puede comprometer el rendimiento del producto farmacológico. También plantea el riesgo adicional de colapso de la(s) estructura(s) de cristal para una forma amorfa o acumulación de defectos y el trastorno, lo que podría conducir a la inestabilidad química y la reducción de la vida útil del producto farmacéutico.

Procedimientos de ensayo in vitro:

Para ensayos celulares y enzimáticos in vitro, los compuestos de ensayo se preparan en DMSO para formar una solución madre a 10 mM. La solución madre se diluye en serie en DMSO para obtener una curva de dilución de diez puntos con concentraciones de compuesto final que van a partir de 10 mM hasta 0,05 nM en una placa de fondo redondo de 96 pocillos antes de realizar la enzimática in vitro y ensayos de células enteras.

Ensayos de inhibición de proteasa in vitro:

Expresión de BACE1 humana

La BACE1 humana (número de acceso: AF190725) se clonó a partir del ADNc de cerebro total por RT-PCR. Las secuencias de nucleótidos correspondientes a secuencias de aminoácidos #1 a 460 son insertados en el polipéptido IgG-i(Fc) humano que codifica el ADNc (Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)). Esta proteína de fusión de BACE1 (desde 1 hasta 460) y Fe humana, llamada huBACE1:Fc, se construye en el vector pJB02. La BACE1 humana (1-460): Fe (huBAcE1:Fe) se expresa de forma transitoria en células HEK293. Los 250 |jg de ADNc de cada constructo se mezclan con Fugene 6 y se añade a 1 litro de células HEK293. Cuatro días después de la transfección, los medios acondicionados se cosechan para la purificación.

Purificación de huBACE1:Fc

huBACE1:Fc se purifica mediante cromatografía de proteína A. La enzima se almacenó a -80 °C en pequeñas alícuotas.

Ensayo FRET BACE1

Las diluciones en serie de compuestos de ensayo se preparan como se ha descrito anteriormente. Los compuestos se diluyen 20* en el tampón KH2PO4. Diez j l de cada dilución se añaden a cada pocillo en la fila A a H de una proteína baja correspondiente unida a la placa de color negro que contiene la mezcla de reacción (25 j l de 50 mM KH2PO4, de pH 4,6, 1 mM Triton® X-100, 1 mg/ml Albúmina de Suero Bovino y 15 jM de sustrato de FRET) (véase Yang, et. al., J. Neuroquímica, 91(6) 1249-59 (2004)). El contenido se mezcla bien en un agitador de placas durante 10 minutos. Se añaden 15 j l de doscientos jM de BACE1 humana (1-460):Fc (Ver Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)) en el amortiguador KH2PO4 a la placa que contiene compuestos de sustrato y de prueba para iniciar la reacción. La RFU de la mezcla en el tiempo 0 se registra en excitación de 355 nm de longitud de onda y la longitud de onda de emisión de 460 nm, después de un breve mezclado en un agitador de placas. La placa de reacción se cubrió con papel de aluminio y se mantuvo en un horno humidificado en oscuridad a temperatura ambiente durante 16 a 24 h. La RFU al final de la incubación se registra con los mismos ajustes de excitación y emisión usados en el tiempo 0. La diferencia del RFU en el tiempo 0 y el final de incubación es representativa de la actividad de BACE1 bajo el tratamiento con el compuesto. Las Diferencias RFU se representan gráficamente frente a la concentración del inhibidor y una curva está equipado con una ecuación logística de cuatro parámetros para obtener el EC50y los valores de IC50. (Ver Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)).

El compuesto de la preparación 46 se ensaya esencialmente como se describe arriba y exhibió una BACE1 IC50 de 0,615 nM (± 0,101, n= 5) [Media ± SEM; SEM = error estándar de la media]. Estos datos demuestran que el compuesto de la preparación 46 inhibe la actividad de la enzima recombinante purificada BACE1 in vitro.

Ensayo neuronal primario PDAPP

Un ensayo de células enteras de confirmación también se ejecuta en cultivos primarios de neuronas generadas a partir de embriones de ratones transgénicos PDAPP. Las neuronas corticales primarias se preparan a partir de embriones PDAPP embriónicos de día 16 y cultivados en placas de 96 pocillos (15 * 104 células/pocillo en DMEM/F12 (1:1) más 10% de FBS). Después de 2 días in vitro, los medios de cultivo se reemplazan con suero DMEM/F12 libre (1:1) suplemento que contiene B27 y 2 jM (final) del Ara-C (Sigma, C1768). Al día 5 in vitro, las neuronas se incuban a 37 °C durante 24 horas en presencia/ausencia de inhibidores (diluido en DMSO) a la concentración deseada. Al final de la incubación, se analizaron los medios condicionados para la evidencia de la actividad de beta-secretasa, por ejemplo, mediante el análisis de péptidos Abeta. El total de péptidos Abeta (Abeta 1-x) se mide mediante un intercalador ELISA, utilizando el monoclonal 266 como anticuerpo de captura y 3D6 biotinilado como anticuerpo de informes. Alternativamente, Abeta 1-40 y 1-42 péptidos Abeta se miden por un intercalador ELISA, utilizando un monoclonal 2G3 como anticuerpo de captura para Abeta 1-40 y monoclonal 21F12 como anticuerpo de captura para Abeta 1-42. Ambos de ELISA Abeta 1-40 y Abeta 1-42 utilizan biotinilado 3D6 como el anticuerpo de informes. La concentración de Abeta liberado en el medio acondicionado después del tratamiento compuesto corresponde a la actividad de BACE1 bajo tales condiciones. La curva de inhibición de 10 puntos se traza y equipado con la ecuación logística de cuatro parámetros para obtener los valores de la EC50 y de IC50 para el efecto reductor de Abeta. El compuesto de la preparación 46 se ensaya esencialmente como se describe anteriormente y exhibe la siguiente actividad para efecto reductor de Abeta.

Tabla 4

Media ± SEM; SEM= error estándar de la media

Esos datos demuestran que el compuesto de Preparación 46 inhibe la producción de Abeta en las células en enteras.

Inhibición in vivo de beta-secretasa

Varios modelos de animales, incluyendo ratón, cobaya, perro y mono, se pueden usar para la detección de la inhibición de la actividad de beta-secretasa in vivo después de tratamiento con compuesto. Los animales utilizados en la presente invención pueden ser de tipo salvaje, transgénicos, o de los animales de genes agónicos. Por ejemplo, el modelo de ratón PDAPP, preparado como se describe en Games et al., Nature 373, 523-527 (1995) y otros animales agónicos no transgénico o del gen son útiles para analizar la inhibición in vivo de producción Abeta y sAPPbeta en presencia de compuestos inhibidores. En general, de 2 a 12 meses de edad ratones PDAPP, los ratones agónicos de genes o animales no transgénicos se administran compuesto formulado en vehículos, tales como aceite de maíz, ciclodextrano, amortiguadores de fosfato, PHARMASOLVE®, u otros vehículos adecuados. Una de las veinticuatro horas siguientes a la administración del compuesto, los animales son sacrificados y el cerebro, así como el líquido cefalorraquídeo y el plasma, se extraen para el análisis de fragmentos de Abetas, C99 y sAPP. (Véase May, etal., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

Para los estudios estándares de farmacología in vivo, los animales se dosifican con varias concentraciones de compuesto y se compararon con un grupo control tratado con vehículo dosificado al mismo tiempo. Para algunos estudios del curso de tiempo, el tejido cerebral, plasma, líquido cefalorraquídeo o se obtiene de los animales seleccionados, comenzando en el tiempo 0 para establecer una línea de base. Compuesto o vehículo apropiado se administra a otros grupos y se sacrificaron en diversos momentos después de la dosificación. El tejido cerebral, plasma, líquido cefalorraquídeo o se obtiene de los animales seleccionados y se analizaron para la presencia de productos de escisión de APP, incluyendo péptidos Abeta, sAPPbeta y otros fragmentos de APP, por ejemplo, mediante ensayos ELISA específicos de intercalación. Al final del período de ensayo, los animales son sacrificados y los tejidos del cerebro, plasma o líquido cefalorraquídeo se analizan para la presencia de péptidos Abeta, C99 y sAPPbeta, según corresponda. Los tejidos cerebrales de APP animales transgénicos también pueden ser analizados por la cantidad de placas de beta-amiloide siguientes tratamiento con compuesto. "Abeta 1-x péptido" como se usa aquí, se refiere a la suma de las especies de Abeta que empiezan con el resto 1 y que termina con un extremo C-terminal mayor que 28. Este residuo detecta la mayoría de las especies de Abeta y a menudo se llama "Abeta Total".

Animales (PDAPP o de otro ratones transgénicos o no transgénicos APP) administrados un compuesto inhibidor puede demostrar la reducción de Abeta o sAPPbeta en los tejidos cerebrales, plasma o líquido cefalorraquídeo y la disminución de las placas de beta amiloide en el tejido cerebral, en comparación con los controles tratados con vehículo o tiempo de controles cero. Para la preparación 46, tres horas después de la administración de 0,3, 1, o 3 mg/kg de dosis oral del compuesto, los niveles de péptido Abeta 1-x se reducen aproximadamente el 31%, 39% y 61% en el hipocampo del cerebro y aproximadamente el 28%, 42% y 64% en la corteza cerebral, respectivamente en comparación con los ratones tratados con vehículo.

Dada la actividad de la preparación 46 en contra de la enzima BACE in vitro, estos efectos reductores de Abeta son consistentes con la inhibición de BACE in vivo y demuestran además la penetración en el SNC de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que es una sal de tosilato de N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluoro-fenil]-5-metoxi-pirazina-2-carboxamida.

2. La sal de tosilato de acuerdo con la reivindicación 1, que es cristalina.

3. La sal de tosilato de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que está caracterizada porque tiene un pico sustancial en el espectro de difracción de rayos X, a un ángulo de difracción 2-theta de 5,0° en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 19,6°, 13,8° y 18,5°; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

4. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en terapia.

5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer.

7. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.