KR20180134401A - 예를 들어 알츠하이머병을 치료하기 위한 선택적 BACE1 억제제로서 N-[3-[2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 및 그의 (4aR,5S,7aS) 이성질체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예를 들어 알츠하이머병 및 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하기 위한 선택적 BACE1 억제제로서 N-[3-[2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드, 즉 화학식 I의 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염 및 특히 그의 (4aR,5S,7aS) 이성질체를 제공한다.

Description

예를 들어 알츠하이머병을 치료하기 위한 선택적 BACE1 억제제로서 N-[3-[2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 및 그의 (4aR,5S,7aS) 이성질체

본 발명은 신규 테트라히드로푸로옥사진 화합물, 선택적 BACE1 억제제로서의 그의 용도, 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물, 이러한 화합물을 생리학적 장애를 치료하는데 사용하는 방법, 및 이러한 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 알츠하이머병, 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 신경독성 및 고도의 응집성 펩티드 절편인 아밀로이드 β (A베타) 펩티드를 수반하는 다른 질환 및 장애의 치료 분야에 있다. 알츠하이머병은 전세계적으로 수백만명의 환자에게 영향을 미치는 파괴적인 신경변성 장애이다. 질환을 중단, 둔화, 또는 역전시키기보다는 환자에게 단지 일시적, 징후적 이익을 제공하는 시판되는 현재 승인된 작용제의 관점에서, 알츠하이머병의 치료에 있어서 상당한 미충족 필요가 있다.

알츠하이머병은 뇌에서의 A베타의 생성, 응집, 및 침착을 특징으로 한다. β-세크레타제 (β-부위 아밀로이드 전구체 단백질-절단 효소; BACE)의 완전 또는 부분 억제는 마우스 모델에서 플라크-관련 및 플라크-의존성 병리상태에 대해 유의한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 A베타 펩티드 수준에서의 작은 감소도 플라크 부담 및 시냅스 결손에서 장기간 유의한 감소를 생성할 수 있으며, 따라서 유의한 치료 이익을 특히 알츠하이머병의 치료에서 제공한다는 것을 시사한다. 또한, BACE1 및 BACE2로 지칭되는 2개의 BACE 상동체가 확인되었고, BACE1이 알츠하이머병의 발생에 있어 임상적으로 가장 중요하다고 여겨진다. BACE1은 주로 뉴런에서 발현되는 한편 BACE2는 주로 주변부에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [D. Oehlrich, Bioorg. Med. Chem. Lett., 24, 2033-2045 (2014)] 참조). 또한, BACE2는 색소 세포-특이적 멜라닌세포 단백질의 프로세싱에서 역할을 하는 것으로 확인되었기 때문에 색소침착에 중요할 수도 있다 (문헌 [L. Rochin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110(26), 10658-10663 (2013)] 참조). 중추 신경계 (CNS) 침투를 갖는 BACE 억제제, 특히 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적인 억제제가 A베타 펩티드-매개 장애, 예컨대 알츠하이머병에 대한 치료를 제공하는 것이 요망된다.

미국 특허 번호 9,079,914는 A베타 단백질에 의해 유발되는 특정 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머-유형 치매를 치료하는데 유용한 BACE1 억제 효과를 갖는 특정 융합된 아미노디히드로-옥사진 유도체를 개시한다. 또한 미국 특허 번호 8,940,734는 BACE1 억제 활성을 보유하는 특정 융합된 아미노디히드로티아진 유도체를 개시하며, 이는 A베타 펩티드에 의해 유발되는 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머 유형 치매에 대한 유용한 치료제로서 추가로 개시된다.

본 발명은 BACE1의 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적인 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 CNS에 침투하는 특정 신규 화합물을 제공한다. 본 발명은, 예를 들어, BACE2보다 BACE1에 대해 선택적인 억제를 통해, 개선된 부작용 프로파일에 대한 잠재력을 갖는 특정 신규 화합물을 또한 제공한다.

따라서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명은 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 BACE를 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 BACE를 억제하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질의 BACE-매개 절단을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 아밀로이드 전구체 단백질의 BACE-매개 절단을 억제하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 A베타 펩티드의 생산을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, A베타 펩티드의 생산을 억제하는 방법을 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 특히 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한 또는 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 예방에 사용하기 위한 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한 게다가, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명은 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 화학식 I 및 Ia의 화합물의 합성을 위한 신규 중간체 및 방법을 또한 포괄한다.

경도 인지 장애는 임상 제시 및 경도 인지 장애를 나타내는 환자의 시간에 따른 알츠하이머 치매로의 진행에 기초하여 알츠하이머병과 연관된 치매의 잠재적인 전구기로서 정의된 바 있다. (Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). 용어 "경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 예방하는"은 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 억제, 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료하는 것"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "환자"는 인간을 지칭한다.

용어 "A베타 펩티드의 생산의 억제"는 환자에서 A베타 펩티드의 생체내 수준을 감소시키는 것을 의미하는 것으로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은, 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시에, 진단 또는 치료 하에 있는 환자에서 목적하는 효과를 제공하는, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다.

유효량은 공지된 기술을 사용함으로써 및 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자로서의 담당 진단자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자를 위한 유효량을 결정하는데 있어서, 환자의 종; 그의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 침범된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 침범 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정한 화합물; 투여 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특징; 선택되는 용량 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 담당 진단자에 의해 고려된다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상적으로 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중의 범위 내에 속한다. 일부 경우에 상기 언급된 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 보다 적절할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 보다 큰 용량이 허용되는 부작용을 가지며 사용될 수 있으며, 따라서 상기 투여량 범위는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 경구 및 경피 경로를 포함하는, 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, Editor, 22^nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012] 참조).

화학식 I 및 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 특히 본 발명의 치료 방법에 유용하지만, 특정 기, 치환기 및 배위가 바람직하다. 하기 단락은 이러한 바람직한 기, 치환기, 및 배위를 기재한다. 이들 바람직한 것은 본 발명의 치료 방법 및 신규 화합물 둘 다에 적용가능한 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 추가의 화합물은

및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

융합된 비시클릭 고리가 시스 배위에 있는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 바람직하다. 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 위치 4a의 수소가 하기 반응식 A에 제시된 바와 같이 위치 7a의 치환된 페닐에 대해 시스 배위에 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 위치 4a, 5, 및 7a에 대한 바람직한 상대 배위가 반응식 A에 또한 제시되며, 여기서 위치 5의 1,1-디플루오로에틸 치환기는 위치 4a의 수소 및 위치 7a의 치환된 페닐에 대해 시스 배위에 있다:

반응식 A

본 발명은 모든 개별 거울상이성질체 및 부분입체이성질체뿐만 아니라, 라세미체를 포함하는, 상기 화합물의 거울상이성질체의 혼합물을 고려하지만, 아래에 제시된 바와 같은 절대 배위를 갖는 화합물이 특히 바람직하다:

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드, 및 그의 제약상 허용되는 염; 및

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트.

X선 회절 스펙트럼에서, 0.2도의 회절각에 대한 허용오차로 9.8°, 28.0° 및 14.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합하여 4.9°의 회절각 2-세타에서의 실질적 피크를 특징으로 하는 N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트의 결정질 형태가 추가로 바람직하다.

아래 반응식 B에 도시된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 화합물이 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원에서 본 발명의 화합물의 특정 호변이성질체 중 하나에 대한 임의의 언급이 주어지는 경우에, 이는 호변이성질체 형태 둘 다 및 그의 모든 혼합물을 포괄하는 것으로 이해된다.

반응식 B

추가적으로, 하기 제조예에 기재된 특정 중간체는 1종 이상의 질소 보호기를 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이 보호기는 특정한 반응 조건 및 수행되는 특정한 변환에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).

개별 이성질체, 거울상이성질체, 또는 부분입체이성질체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본 발명의 화합물의 합성에서의 임의의 편리한 지점에서, 방법 예컨대 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피에 의해 분리되거나 분할될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen,"Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조).

본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 염, 예컨대 히드로클로라이드 염은 예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 조건 하에 적합한 용매 예컨대 디에틸 에테르 중에서 본 발명의 화합물의 적절한 유리 염기, 및 적절한 제약상 허용되는 산 예컨대 염산, p-톨루엔술폰산, 또는 말론산의 반응에 의해 형성될 수 있다. 추가적으로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호와 동시에 일어날 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); 및 Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)]을 참조한다.

특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "APP"는 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "AUC"는 곡선하 면적을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "CDI"는 1,1'-카르보닐디이미다졸을 지칭하고; "cDNA"는 상보적 데옥시리보핵산을 지칭하고; "CSF"는 뇌척수액을 지칭하고; "DCC"는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드를 지칭하고; "데옥소-플루오르(Deoxo-Fluor)®"는 비스(2-메톡시에틸)아미노황 트리플루오라이드를 지칭하고; "DIC"는 1,3-디이소프로필카르보디이미드를 지칭하고; "DMAP"는 4-디메틸아미노피리딘을 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "EBSS"는 얼 평형 염 용액을 지칭하고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "ELISA"는 효소-연결된 면역흡착 검정을 지칭하고; "F12"는 햄 F12 배지를 지칭하고; "FBS"는 태아 소 혈청을 지칭하고; "Fc"는 결정화가능 단편을 지칭하고; "플루오리드(FLUOLEAD)™"는 4-tert-부틸-2,6-디메틸페닐황 트리플루오라이드를 지칭하고; "FRET"는 형광 공명 에너지 전달을 지칭하고; "HATU"는 (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HBTU"는 (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)(디메틸아미노)-N,N-디메틸메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "HF-피리딘"은 히드로겐 플루오라이드 피리딘 또는 올라 시약 또는 폴리(피리딘 플루오라이드)를 지칭하고; "HOAt"는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸을 지칭하고; "HOBT"는 1-히드록실벤조트리아졸 수화물을 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 작용제의 농도를 지칭하고; "IgG₁"은 이뮤노글로불린-유사 도메인 Fc-감마 수용체를 지칭하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하고; "p.o."는 경구 투여를 지칭하고; "PyBOP"는 (벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)를 지칭하고; "PyBrOP"는 브로모-트리스-피롤리디노 포스포늄헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "RFU"는 상대 형광 단위를 지칭하고; "RT-PCR"은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "SDS-PAGE"는 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 지칭하고; "SFC"는 초임계 크로마토그래피를 지칭하고; "T3P®"는 프로필포스폰산 무수물을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "TEMPO"는 (2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-일)옥실을 지칭하고; "TMEM"은 막횡단 단백질을 지칭하고; "트리스"는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 지칭하고; "트리틸"은 화학식 (Ph)₃C- 기를 지칭하고, 여기서 Ph는 페닐 기를 지칭하고; "엑스탈플루오르-E(XtalFluor-E)® 또는 DAST 디플루오로술피늄 염"은 (디에틸아미노)디플루오로술포늄 테트라플루오로보레이트 또는 N,N-디에틸-S,S-디플루오로술필이미늄 테트라플루오로보레이트를 지칭하고; 및 "엑스탈플루오르-M(XtalFluor-M)® 또는 모르포-DAST 디플루오로술피늄 염"은 디플루오로(모르폴리노)술포늄 테트라플루오로보레이트 또는 디플루오로-4-모르폴리닐술포늄 테트라플루오로보레이트를 지칭한다.

본 발명의 화합물 또는 그의 염은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 그 중 일부는 아래 반응식, 제조예, 및 실시예에 예시되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기재된 각 경로에 대한 특정한 합성 단계가 상이한 방식으로 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다는 것을 인지한다. 아래 반응식에서의 각 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 포함하는, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 아래 반응식에서, 달리 나타내지 않는 한 모든 치환기는, 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 하기 반응식, 제조예, 및 실시예가 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다.

반응식 1

반응식 1, 단계 A에서, 트리메틸술포늄 아이오다이드를 유기 염기, 예컨대 n-부틸리튬으로 약 -50℃의 온도에서 용매, 예컨대 THF 중에서 처리한다. 적합한 보호기, 예컨대 트리틸 기로 보호되는 보호된 옥시메틸 옥시란을 이어서 염기성 용액에 -10℃에서 첨가하고 약 2시간 동안 교반되도록 하여 반응식 1, 단계 A의 보호된 생성물을 수득한다. "PG"는 아미노 기 또는 산소 기를 위해 개발된 보호기 예컨대 카르바메이트, 아미드 또는 에테르이다. 이러한 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지 및 인지되어 있다. 대안적으로, (2S)-부트-2-엔-1,2-디올과 같은 디올을 1개의 히드록시 상에서 용매 예컨대 디클로로메탄 중 트리페닐메틸 클로라이드 및 유기 염기 예컨대 DMAP 및 트리에틸아민을 사용하여 선택적으로 보호하여, 반응식 1, 단계 A의 보호된 생성물을 수득할 수 있다. 단계 A의 보호된 생성물을 용매 예컨대 톨루엔 및 수성 무기 염기 예컨대 수산화나트륨 중에서 테트라-N-부틸암모늄 술페이트 또는 다른 4급 암모늄 염 상 이동 촉매를 사용하여 α-할로에스테르 예컨대 tert-부톡시 브로모아세테이트와 대략 실온에서 반응시켜 반응식 1, 단계 B의 화합물을 수득한다. 이러한 알킬화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적으로 염기 예컨대 오일 중 60% 수소화나트륨을 용매 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 또는 THF와 0 내지 100℃ 범위의 온도에서 사용하여 단계 B의 보호된 생성물을 수득할 수 있다. tert-부톡시 카르보닐 아세테이트를 2-단계 절차를 걸쳐 옥심으로 전환시킨다. 환원제 예컨대 헥산 중 이소부틸알루미늄 히드라이드를 약 -70℃의 온도에서 적가하고 이어서 수성 산 예컨대 염산을 약 -60℃의 온도에서 적가한다. 후처리를 유기 추출로 달성하여 중간체 물질을 수득한다. 이 물질을 유기 용매 예컨대 디클로로메탄 중에 용해시키고 아세트산나트륨에 이어 히드록실아민 히드로클로라이드로 처리하여 단계 C의 옥심 생성물을 수득한다. 반응식 1, 단계 C의 옥심 생성물을 차아염소산나트륨 또는 대안적 산화제 예컨대 N-클로로숙신이미드의 수용액을 사용하는 것과 같은 여러 방법에 의해 용매 예컨대 tert-부틸 메틸 에테르, 톨루엔, 디클로로메탄 또는 크실렌 중에서 약 10-15℃의 온도에서 또는 가열하면서 3+2 고리화시켜 단계 D의 비시클릭 4,5-디히드로이속사졸 생성물로 전환시킬 수 있다. 2-플루오로-5-브로모 페닐 기를 디히드로이속사졸에 유기금속 시약을 생성함으로써 첨가할 수 있다. 유기금속 시약은 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도-벤젠으로부터 시약 예컨대 n-부틸리튬 또는 이소프로필마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 착물과의 할로겐-금속 교환 및 약 -78℃ 내지 15℃ 범위의 온도에서 용매 예컨대 THF 중에서의 적가를 사용하여 생성할 수 있다. 루이스 산 예컨대 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트를 이어서 첨가하여 반응식 1, 단계 E의 생성물을 수득한다.

반응식 2

대안적으로 반응식 2에서, 반응식 1, 단계 A의 보호된 생성물을 용매 예컨대 톨루엔 중에서 4-(2-클로로아세틸)모르폴리노 및 염기 예컨대 테트라부틸 암모늄 히드로겐 술페이트로 약 5℃의 온도에서 처리하여 반응식 2, 단계 A의 생성물을 수득할 수 있다. 모르폴리노 기는 이어서 반응식 2, 단계 B에서 이탈기로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 반응식 2, 단계 A의 생성물을 이소프로필 마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 착물 및 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도벤젠으로부터 계내에서 제조할 수 있는 적절한 그리냐르 시약으로 처리하거나 또는 적절한 그리냐르 시약이 이용가능하다면, 시약을 직접적으로 반응식 2, 단계 A의 생성물에 약 5℃의 온도에서 첨가하여 반응식 2, 단계 B의 생성물을 수득할 수 있다. 카르보닐 아세테이트를 히드록실아민 히드로클로라이드 및 아세트산나트륨을 사용하여 약 50℃로 가열하면서 옥심으로 전환시켜 반응식 2, 단계 C의 생성물을 수득할 수 있다. 반응식 2, 단계 C의 옥심 생성물은 이어서 용매 예컨대 톨루엔 중에서 히드로퀴논을 사용하고 환류 하에 가열하여 반응식 2, 단계 D의 생성물 (반응식 1, 단계 E와 동일한 생성물)로 전환시킬 수 있다. 반응식 2, 단계 D의 아민 생성물은 유기 염기 예컨대 DMAP 및 피리딘을 용매 예컨대 디클로로메탄 중에서 약 0-5℃의 온도에서 사용하여, 아세틸 클로라이드를 사용하여 아세틸로 보호하여 반응식 2, 단계 E의 생성물을 수득할 수 있다. 반응식 2, 단계 E의 생성물은 이어서 아래에 논의되는 바와 같이 반응식 3, 단계 A의 생성물로 전환시킬 수 있다.

반응식 3

반응식 2, 단계 E의 생성물을 히드록시에서 산성 조건을 사용하여, 예컨대 용매 예컨대 메탄올 및 디클로로메탄 중 p-톨루엔술폰산 1수화물 또는 포름산을 첨가하여 선택적으로 탈보호하여 반응식 3, 단계 A의 생성물을 수득할 수 있다. 대안적 경로에서, 반응식 2, 단계 D의 화합물의 이속사졸 질소를 아세틸 기로 보호할 수 있고 히드록시 메틸의 보호기를 2-단계 절차에서 제거할 수 있다. 예를 들어, 반응식 2, 단계 D의 화합물을 유기 염기 예컨대 DMAP 및 피리딘으로 용매 예컨대 디클로로메탄 중에서 처리하고 아세틸 클로라이드를 첨가한다. 온도를 약 10℃ 아래로 유지하고 이어서 대략 실온에서 교반되도록 한다. 반응물을 물로 희석하고 용매 예컨대 디클로로메탄으로 추출한다. 유기 추출물을 수성 산 예컨대 1 N 염산으로 세척하고 수성부를 용매 예컨대 디클로로메탄에 이어 수성 세척으로 다시 추출한다. 유기 용매를 부분적으로 제거할 수 있고, 용매 예컨대 디클로로메탄 및 메탄올 중 산 예컨대 포름산 또는 p-톨루엔술폰산 1수화물을 첨가하여 히드록시 메틸을 탈보호시킬 수 있다. 혼합물을 히드록시의 탈보호가 완료될 때까지 실온에서 교반하거나 약 40℃의 온도로 가열하여 반응식 3, 단계 A의 화합물을 수득할 수 있다. 산화제 예컨대 2-아이오독시벤조산 (IBX)을 0-22℃의 온도에서 용매 예컨대 DMSO 중에서 사용하거나 또는 약 5-25℃의 온도에서 교반하면서 용매 예컨대 아세토니트릴 또는 아세토니트릴 및 물 중 (디아세톡시아이오도)벤젠을 조금씩 또는 모두 한 번에 첨가하여 반응식 3, 단계 A의 히드록시 메틸 생성물을 반응식 3, 단계 B의 카르복실산 생성물로 산화시켜 반응식 3, 단계 B의 생성물을 수득할 수 있다. 바람직한 경우에 TEMPO를 또한 산화에서 촉매로서 사용할 수 있다. 반응식 3, 단계 C에서 커플링제 예컨대 CDI를 용매 예컨대 디클로로메탄과 함께 조금씩 첨가하거나 한 번에 첨가하여 사용하고, -20℃로 냉각시키고, 약 1시간 동안 교반하고, N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드를 조금씩 또는 모두 한 번에 첨가하여 웨인렙 아미드를 제조할 수 있다. 또한 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민을 사용하여 반응을 촉진할 수 있다. CDI 및 N,O-디메틸히드록실아민의 추가의 첨가를 완전한 반응이 관찰될 때까지 첨가하여 반응식 3, 단계 C의 웨인렙 아미드 생성물을 수득할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 커플링제는 카르보디이미드 예컨대 DCC, DIC 또는 EDCI, 또는 비-친핵성 음이온의 다른 우로늄 또는 포스포늄 염, 예컨대 HATU, HBTU, PyBOP, 및 PyBrOP를 포함한다. 반응식 3, 단계 D의 케톤은 웨인렙 아미드로부터, 용매 예컨대 THF 중 유기금속 시약 예컨대 그리냐르 시약 또는 유기리튬 시약을 사용하여 형성할 수 있다. 적절한 그리냐르 시약을 용매 예컨대 에테르 또는 2-메틸테트라히드로푸란 중의 용액으로서 웨인렙 아미드에 약 -78℃ 내지 0℃의 온도에서 첨가하여 반응식 3, 단계 D의 케톤을 수득할 수 있다. 단계 D의 케톤을 엑스탈플루오르-M®에 용매 예컨대 디클로로메탄 중 약 -78℃ 내지 실온에서 첨가한 다음 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 적가하여 케톤을 디플루오로-메틸 기로 전환시켜 반응식 3, 단계 E의 화합물을 수득할 수 있다. 대안적으로, 플루오린화 시약 예컨대 엑스탈플루오르-M®을 반응식 3, 단계 D의 케톤 생성물에 약 -20℃ 내지 10℃의 온도에서 조금씩 첨가한 다음 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 적가하여 반응식 3, 단계 E의 생성물을 수득할 수 있다. 용매 예컨대 디클로로메탄 중 데옥소-플루오르® 및 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트를 약 2시간 동안 교반하면서 사용한 다음 반응식 3, 단계 D의 케톤 및 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 첨가하는 또 다른 대안적 절차로 반응식 3, 단계 E의 생성물을 수득한다. 관련 기술분야에 널리 공지된, 사용할 수 있는 다른 플루오린화제는 디에틸아미노황 트리플루오라이드 (또한 "DAST"로도 지칭됨) 및 첨가제 예컨대 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드의 존재 하의 엑스탈플루오르-E® 또는 첨가제 예컨대 HF-피리딘을 사용하는 플루오리드™이다. 아세틸 테트라히드로이속사졸을 관련 기술분야에 널리 공지된 산성 조건 하에 예컨대 염산을 사용하고 약 100℃로 가열하여 탈보호시킴으로써 반응식 3, 단계 F의 생성물을 수득할 수 있다. 비시클릭 테트라히드로이속사졸을 반응식 1, 단계 F에 기재된 절차와 유사한 방식으로 아세트산 중에서 아연으로 처리하여 반응식 3, 단계 G의 개환 생성물을 형성할 수 있다. 반응식 3, 단계 H의 옥사진 생성물은 용매 예컨대 에탄올 중 브로민화시아노겐을 사용하고 약 85℃로 가열하여 단계 H의 아미노 옥사진 고리 생성물을 형성함으로써 제조할 수 있다. 아이오딘화구리 (I), L-히드록시프롤린, 무기 염기 예컨대 탄산칼륨 및 질소 기체를 수산화암모늄과 함께 사용하여 페닐의 5-브로모를 아미노 기로 대체하여 반응식 3, 단계 I의 생성물을 수득할 수 있다.

반응식 4

반응식 4, 단계 A에서, 반응식 3, 단계 I의 아닐린 생성물을 관련 기술분야에 널리 공지된 커플링 조건을 이용하여 헤테로방향족 카르복실산과 커플링시킬 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 카르복실산 및 아민의 반응으로부터 발생하는 아미드 형성을 위한 다수의 방법 및 시약이 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 커플링 시약 및 아민 염기 예컨대 디이소프로필에틸아민 또는 트리에틸아민의 존재 하에 적절한 산과의 적절한 아닐린의 반응은, 반응식 4, 단계 A, 화학식 I의 화합물을 제공할 것이다. 커플링 시약은 카르보디이미드 예컨대 DCC, DIC, EDCI, 및 방향족 옥심 예컨대 HOBt 및 HOAt를 포함한다. 추가적으로, 비-친핵성 음이온의 우로늄 또는 포스포늄 염 예컨대 HBTU, HATU, PyBOP, 및 PyBrOP 또는 시클릭 인산 무수물 예컨대 T3P®을 보다 전통적인 커플링 시약 대신 사용할 수 있다. 첨가제 예컨대 DMAP를 사용하여 반응을 증진시킬 수 있다. 대안적으로, 적절한 방향족 산 클로라이드를 염기 예컨대 트리에틸아민 또는 피리딘의 존재 하에 사용하여 아닐린 아민을 아실화하여 화학식 Ia의 화합물을 수득할 수 있다.

반응식 5

대안적으로 반응식 5, 단계 A에서, 2-단계, 원 포트 반응으로 반응식 3, 단계 G의 아민 생성물을 보호할 수 있고 옥사진 고리를 형성할 수 있다. 아민을 용매 예컨대 디클로로메탄 또는 THF 중 벤조일 이소티오시아네이트와 약 5℃ 내지 실온의 온도에서 반응시켜 단계 A의 중간체 화합물을 수득할 수 있다. 조 혼합물을 약 10℃로 냉각시키고, DMSO를 첨가한 다음 클로로트리메틸실란을 천천히 첨가함으로써 옥사진 고리를 형성하여, 단계 B의 생성물을 수득할 수 있다. 수산화나트륨 (50%) 및 표백제를 사용하여 반응 혼합물로부터의 기체를 제거할 수 있다. 용매 예컨대 1,4-디옥산 중 5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 건조제 예컨대 4Å 분자체, 무기 염기 예컨대 탄산칼륨, 및 아이오딘화나트륨을 사용하여 브로마이드를 목적하는 아미드로 전환시킬 수 있다. 용액을 통해 약 30분 동안 질소 버블링할 수 있다. 아이오딘화구리 (I) 및 디아민 또는 관련 리간드 예컨대 트랜스, 라세미-N1,N2-디메틸시클로헥산-1,2-디아민을 첨가하고, 반응이 완료될 때까지 또는 최대 7일까지 혼합물을 약 100-110℃로 가열하여 반응식 5, 단계 B의 아미드 생성물을 수득할 수 있다. 유기 염기 예컨대 피리딘, 용매 예컨대 에탄올, 및 용매 예컨대 THF 및 에탄올 중 O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드를 사용하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 조건을 사용하여 옥사진 아민을 탈보호하여 화학식 Ia의 화합물을 제공할 수 있다.

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

제조예 1

(2S)-1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올

반응식 1, 단계 A: THF (1264 mL) 중 트리메틸술포늄 아이오다이드 (193.5 g, 948.2 mmol)를 주위 온도에서 75분 동안 교반하였다. 혼합물을 -50℃로 냉각시키고 n-부틸리튬 (헥산 중 2.5 mol/L, 379 mL, 948.2 mmol)을 캐뉼라를 통해, 30분의 기간에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 서서히 -30℃로 가온되도록 하고 60분 동안 교반하였다. 온도를 -10℃ 아래로 유지하면서, (2S)-2-트리틸옥시메틸 옥시란 (100 g, 316.1 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 완전한 첨가 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 염화암모늄에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 메틸 t-부틸 에테르: 헥산 (10-15% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 표제 화합물 (56.22 g, 54%)을 수득하였다. ES/MS m/z 353 (M+Na).

대안적 제조예 1

(2S)-1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올

반응식 2, 단계 A 출발 물질: 트리페닐메틸 클로라이드 (287 g, 947.1 mmol), DMAP (7.71 g, 63.1 mmol) 및 트리에틸아민 (140 g, 1383.5 mmol)을 디클로로메탄 (850 mL) 중 (2S)-부트-2-엔-1,2-디올 (문헌 [JACS, 1999, 121, 8649]에서와 같이 제조됨) (64.5 g, 631 mmol)의 용액에 첨가하였다. 24시간 동안 24℃에서 교반하였다. 1 N 수성 시트르산 (425 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 추출물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 메탄올 (900 mL)을 첨가하고 5℃로 1시간 동안 냉각시켰다. 여과에 의해 고체를 수집하고 5℃ 메탄올 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 폐기하고 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 톨루엔 (800 mL)을 첨가하고 268 g의 질량으로 농축시켜 톨루엔의 48 wt% 용액 중 표제 화합물 (129 g, 67%)을 수득하였다.

제조예 2

1-모르폴리노-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논

반응식 2, 단계 A: 테트라부틸 암모늄 히드로겐 술페이트 (83.2 g, 245.0 mmol) 및 4-(2-클로로아세틸)모르폴린 (638.50 g, 3902.7 mmol)을 0 내지 5℃인 톨루엔 (5800 mL) 중 1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올 (832.4 g, 2519 mmol)의 용액에 첨가하였다. 물 (1041 mL) 중 수산화나트륨 (1008.0 g, 25.202 mol)을 첨가하였다. 19시간 동안 0 내지 5℃에서 교반하였다. 물 (2500 mL) 및 톨루엔 (2500 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 추출물을 물 (2 x 3500 mL)로 세척하였다. 유기 추출물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 톨루엔 (2500 mL)을 잔류물에 첨가하고 이어서 n-헵탄 (7500 mL)을 천천히 첨가하였다. 16시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고 n-헵탄 (1200 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (1075.7 g, 98%)을 수득하였다.

제조예 3

1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논

반응식 2, 단계 B: THF 중 이소프로필 마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 착물 (3079 mL, 2000 mmol)의 1.3 M 용액을 톨루엔 (2500 mL) 중 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도벤젠 (673.2 g, 2237.5 mmol)의 용액에 반응 온도를 5℃ 아래로 유지하는 속도로 첨가하였다. 1시간 동안 교반하였다. 생성된 그리냐르 용액 (5150 mL)을 톨루엔 (5000 mL) 중 1-모르폴리노-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 (500 g, 1093 mmol)의 용액에 반응 온도를 5℃ 아래로 유지하는 속도로 첨가하였다. 온도를 5℃ 아래로 유지하면서 3시간 동안 교반하였다. 추가의 제조된 그리냐르 용액 (429 mL)을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 1 N 수성 시트르산 용액 (5000 mL)을 온도를 5℃ 아래로 유지하는 속도로 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 추출물을 물 (5000 mL)로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 메탄올 (2000 mL)을 잔류물에 첨가하고 농축시켜 표제 화합물을 잔류물 (793 g, 73.4% 효력, 83%)로서 수득하였다.

제조예 4

1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 옥심

반응식 2, 단계 C: 히드록실아민 히드로클로라이드 (98.3 g)를 메탄올 (3800 mL) 중 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 (450 g, 707 mmol) 및 아세트산나트륨 (174 g)에 첨가하였다. 용액을 50℃로 2시간 동안 가열하였다. 24℃로 냉각시키고 농축시켰다. 물 (1000 mL) 및 톨루엔 (1500 mL)을 잔류물에 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 상을 톨루엔 (500 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 물 (2 x 400 mL)로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 잔류물 (567 g, 61.4% 효력, 88%)로서 수득하였다.

제조예 5

tert-부틸 2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세테이트

반응식 1, 단계 B: (2S)-1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올 (74.67 g, 226.0 mmol)을 톨루엔 (376 mL) 중 테트라-N-부틸암모늄 술페이트 (13.26 g, 22.6 mmol)의 용액에 첨가하였다. 물 (119 mL) 중 수산화나트륨 (50 질량%)에 이어 tert-부틸-2-브로모아세테이트 (110.20 g, 565.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 물에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (77.86 g, 77%)을 수득하였다. ES/MS m/z 467 (M+Na).

제조예 6

(1E)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세트알데히드 옥심

반응식 1, 단계 C: 디클로로메탄 (582.2 mL) 중 tert-부틸 2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세테이트 (77.66 g, 174.7 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 헥산 중 디이소부틸알루미늄 히드라이드의 용액 (1 mol/L, 174.7 mL)을 35분의 기간에 걸쳐 적가하고 온도를 -70℃ 아래로 유지하였다. -78℃에서 5시간 동안 교반하였다. 온도를 -60℃ 아래로 유지하면서, 물 중 염산 (2 mol/L, 192.1 mL)을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응물을 서서히 주위 온도로 가온되도록 하고 60분 동안 교반하였다. 유기 추출물을 분리하고 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 아세트산나트륨 (28.66 g, 349.3 mmol)에 이어 히드록실아민 히드로클로라이드 (18.21 g, 262.0 mmol)를 첨가하였다. 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 물에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (68.38 g, 101%)을 수득하였다. ES/MS m/z 386 (M-H).

제조예 7

(3aR,4S)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸

반응식 1, 단계 D: tert-부틸 메틸 에테르 (717 mL) 중 (1E)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세트알데히드 옥심 (55.57 g, 143.4 mmol)의 용액을 5℃로 냉각시켰다. 온도를 10℃ 아래로 유지하면서, 차아염소산나트륨 (물 중 5%, 591 mL, 430.2 mmol)을 적가하였다. 10℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 15℃로 가온되도록 하였다. 15℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 상을 분리하고, 유기 상을 5% 소듐 히드로겐 술파이트 용액 및 염수로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 50% 메틸 tert-부틸 에테르/디클로로메탄: 헥산 (20-27% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (35.84 g, 65%)을 수득하였다. ES/MS m/z 408 (M+Na).

제조예 8

(3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸

반응식 1, 단계 E: THF (144.5 mL) 및 톨루엔 (1445 mL) 중 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도-벤젠 (86.94 g, 288.9 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 온도를 -70℃ 아래로 유지하면서, n-부틸리튬 (헥산 중 2.5 M, 120 mL, 288.9 mmol)을 적가하였다. 30분 동안 -78℃에서 교반하였다. 온도를 -70℃ 아래로 유지하면서, 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트 (36.5 mL, 288.9 mmol)를 적가하였다. 용액을 30분 동안 -78℃에서 교반하였다. 온도를 -65℃ 아래로 유지하면서, THF (482 mL) 중 (3aR,4S)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (55.69 g, 144.5 mmol)의 용액을 반응물에, 30분의 기간에 걸쳐 적가하였다. -78℃에서 90분 동안 교반하였다. 온도를 -60℃ 아래로 유지하면서, 포화 염화암모늄을 급속하게 첨가하였다. 염수에 붓고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 10-15% 디에틸 에테르:헥산 (0-70% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (36.52 g, 45%)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 560/562 [M+H].

대안적 제조예 8

반응식 2, 단계 D: 톨루엔 (4000 mL) 중 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 옥심 (458 g, 502 mmol) 및 히드로퀴논 (56.3g 511 mmol)의 용액을 환류 하에 질소 하에 27시간 동안 가열하였다. 용액을 24℃로 냉각시키고 수성 탄산나트륨 (800 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 상을 톨루엔 (300 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 물 (2 x 500 mL)로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 이소프로필 알콜 (1500 mL)을 첨가하고 환류 하에 가열하였다. 24℃로 냉각시키고 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (212 g, 75%)을 수득하였다.

제조예 9

1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논

반응식 2, 단계 E: 내부 온도를 5℃ 아래로 유지하면서, 아세틸 클로라이드 (35.56 g, 503.9 mmol)를 디클로로메탄 (720 mL) 중 (3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (235.3 g, 420 mmol), DMAP (5.13 g, 42.0 mmol), 및 피리딘 (66.45 g, 840.1 mmol)의 용액에 질소 하에 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 이어서 물 (300 mL) 및 1 M 황산 (300 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고 층이 분리되도록 하였다. 유기 추출물을 수집하고 포화 탄산나트륨 (500 mL) 및 물 (500 mL)로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (235 g, 93%)을 회색 고체로서 수득하였다.

제조예 10

1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(히드록시메틸)테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-1-일]에타논

반응식 3, 단계 A: 20 L 재킷 반응기에서 내부 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 아세틸 클로라이드 (290 mL, 4075 mmol)를 디클로로메탄 (10 L) 중 (3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (1996 g, 3384 mmol), DMAP (56.0 g, 458 mmol), 피리딘 (500 mL, 6180 mmol)의 용액에 질소 하에 첨가하였다. 완전한 첨가 (1시간) 후 20℃로 가온하고 밤새 교반하였다. 반응이 불완전하다면, 아세틸 클로라이드, DMAP, 피리딘, 및 디클로로메탄을 완전한 반응이 관찰될 때까지 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 물 (5 L)을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 10℃에서 30분 동안 교반하고 층이 분리되도록 하였다. 유기 추출물을 수집하고 수성부를 디클로로메탄 (1 L)으로 세척하였다. 합한 유기 추출물을 1 N 수성 염산 (2 x 4 L)으로 세척하고, 수성부를 디클로로메탄 (2 x 1 L)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 (4 L)로 세척하고 용매를 감압 하에 제거하고 대략 5 L의 총 부피를 수득하였다. 90% 포름산 (1800 mL)을 첨가하고 혼합물을 주위 온도에서 3일 동안 정치시켰다. 40℃로 2시간 동안 가온하고 이어서 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올 (4 L)로 희석하고 포화 수성 탄산나트륨 (3 L)을 천천히 첨가하였다. 고체 탄산나트륨 (375 g)을 첨가하여 pH를 8-9로 조정하였다. 45℃에서 1시간 동안 교반하고 이어서 주위 온도로 냉각시켰다. 메탄올 (4 x 500 mL)로 세척하며 고체를 여과에 의해 제거하고, 이어서 2 N 수성 수산화나트륨 (100 mL)으로 처리하고 주위 온도에서 1시간 동안 정치시켰다. 메탄올 (2 x 100 mL)로 세척하며, 고체를 여과에 의해 제거하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 (5 L) 및 물 (2 L) 사이에 분배하였다. 수성부를 에틸 아세테이트 (2 L)로 추출하고 합한 유기 추출물을 염수 (2 x 1 L)로 세척하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 메틸 tert-부틸 에테르 (2.5 L)를 첨가하고 증발 건조시켰다. 메틸 tert-부틸 에테르 (4 L)를 첨가하고 65℃에서 1시간 동안 교반하고 주위 온도로 냉각시키고 메틸 tert-부틸 에테르 (3 x 500 mL)로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 진공 하에 베이지색 고체로 건조시켰다. 톨루엔 (7.5 L) 중 이 고체가 110℃로 완전히 용해될 때까지 가열하고, 18℃로 1시간에 걸쳐 냉각시키고, 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 40℃로 가온하고 침전물이 형성되면, 18℃로 1회 더 냉각시켰다. 45분 동안 교반하고 이어서 톨루엔 (2 x 500 mL)으로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (443.1 g, 36%, LCMS에 의한 95% 순도)을 수득하였다. 여과물을 진공 하에 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 이소헥산 중 20% 내지 100% 에틸 아세테이트로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (2 L) 중 분획을 함유하는 생성물을 60℃에서 30분 동안 슬러리화하고, 주위 온도로 냉각시키고, 메틸 tert-부틸 에테르 (2 x 200 mL)로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 베이지색 결정질 고체 (304 g, 24%, LCMS에 의한 88% 순도)로서 수득하였다. 여과물을 진공 하에 잔류물로 증발시켰다. 잔류물을 이소헥산 중 20% 내지 100% 에틸 아세테이트로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (57.8 g, 5%, LCMS에 의한 88% 순도)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 360.0/362.0 [M+H].

대안적 제조예 10

반응식 3, 단계 A: 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (69 g, 114.5 mmol)을 p-톨루엔술포산 1수화물 (2.2 g, 11.45 mmol), 디클로로메탄 (280 mL) 및 메탄올 (700 mL)의 15℃ 용액에 첨가하였다. 18시간 동안 교반하고 이어서 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (350 mL)으로 희석하고 1 M 수성 탄산나트륨 (140 mL) 및 물 (140 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 층을 감압 하에 증발시켰다. 톨루엔 (350 mL)을 잔류물에 첨가하고 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 10-15℃로 10℃/시간의 속도로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 톨루엔 (70 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (30 g, 65%)을 회색 고체로서 수득하였다.

제조예 11

(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-카르복실산

반응식 3, 단계 B: 20 L 재킷 반응기에서 물 (2 L)을 아세토니트릴 (4.5 L) 중 1-[(4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (804.9 g, 2177 mmol), TEMPO (40.0 g, 251 mmol)의 현탁액에 첨가하고 5℃의 내부 온도로 냉각시켰다. (디아세톡시아이오도)벤젠 (1693 g, 4993.43 mmol)을 조금씩 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응기 냉각을 사용하여 발열을 제어하고 이어서 20℃에서 LCMS가 완전한 반응을 나타낼 때까지 유지하였다. 내부 온도를 25℃ 아래로 유지하면서, 물 (300 mL) 중 중아황산나트륨 (70 g, 672.68 mmol)의 현탁액을 주위 온도에서 천천히 첨가하였다. 30분 동안 교반하고 이어서 5℃로 냉각시켰다. 물 (2 L)을 첨가하고, 이어서 내부 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 47 wt% 수성 수산화나트륨 (780 mL)을 1시간의 기간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (2 L) 및 이소헥산 (5 L)을 첨가하고, 격렬히 교반하고 층을 분리하였다. 2상 유기 층을 물 (1 L)로 추출하고 합한 수성부를 메틸 tert-부틸 에테르 (2.5L)로 세척하였다. 수성 추출물을 5℃로 냉각시키고 내부 온도를 약 5℃로 유지하면서 37% 염산 (1.4 L)을 30분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (5 L)를 첨가하고, 층을 분리하고 유기부를 염수 (3 x 1 L)로 세척하였다. 합한 수성 추출물을 에틸 아세테이트 (2.5 L)로 추출하고, 합한 유기부를 염수 (1 L)로 세척하고, 이어서 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 유기부를 헵탄 (2.5 L)으로 희석하고 감압 하에 증발 건조시켰다. 메틸 tert-부틸 에테르 (1.5 L) 및 헵탄 (1.5 L)을 첨가하고 증발 건조시켰다. 헵탄 (2.5 L)을 첨가하고 2회 증발 건조시켰다. 헵탄 (500 mL) 및 메틸 tert-부틸 에테르 (500 mL)를 첨가하고 40℃에서 30분 동안 교반하고 이어서 헵탄/메틸 tert-부틸 에테르 (1:1, 1 L)에 이어 메틸 tert-부틸 에테르 (3 x 300 mL)로 세척하며, 침전물을 여과에 의해 수집하고 공기 건조시켜 표제 화합물을 베이지색 결정질 고체 (779 g, 91%)로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 374.0/376.0 [M+H], [α]²⁰ _D -19.0 ° (c 1.004, 클로로포름).

대안적 제조예 11

반응식 3, 단계 B: 물 (150 mL) 및 아세토니트릴 (150 mL)을 1-[(4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (30 g, 73.3 mmol), TEMPO (1.14 g, 7.30 mmol) 및 (디아세톡시아이오도)벤젠 (51.9 g, 161 mmol)에 첨가하였다. 15℃로 냉각시키고 2시간 동안 교반하였다. 물 (150 mL) 중 티오황산나트륨 (21 g) 및 탄산칼륨 (22 g)을 주위 온도에서 천천히 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 이어서 메틸 tert-부틸 에테르 (150 mL)를 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층의 pH를 2-3으로 진한 황산을 사용하여 조정하였다. 에틸 아세테이트 (150 mL)를 첨가하고 층을 분리하였다. 유기 층을 감압 하에 증발 건조시켰다. n-헵탄 (90 mL)을 첨가하고 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 15℃로 냉각시키고 이어서 n-헵탄 (90 mL)으로 세척하며, 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (27 g, 98%)로서 수득하였다.

제조예 12

(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-N-메톡시-N-메틸테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-4-카르복스아미드

반응식 3, 단계 C: 10 L 재킷 반응기에서, 디클로로메탄 (7.0 L) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-카르복실산 (771 g, 2019 mmol)의 용액을 0℃로 질소 하에 냉각시키고 CDI (400 g, 2421 mmol)를 조금씩 40분에 걸쳐 첨가하였다. 반응기 재킷을 -20℃로 냉각시키고 1시간 동안 교반하고 이어서 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (260.0 g, 2612 mmol)를 조금씩 약 30분에 걸쳐 첨가하였다. -20℃에서 1시간 동안, 0℃에서 2시간 동안, 및 10℃에서 7시간 동안 교반하였다. CDI (175 g, 1058 mmol)를 첨가하고 10℃에서 밤새 교반하였다. 추가의 CDI (180 g, 1088 mmol)를 10℃에서 첨가하고 1시간 동안 교반하고 이어서 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (140 g, 1407 mmol)를 첨가하고 10℃에서 교반을 계속하였다. 반응이 불완전하다면, CDI에 이어 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드를 완전한 반응이 관찰될 때까지 추가로 충전시킬 수 있다. 반응 혼합물을 5℃로 냉각시키고 1 N 수성 염산 (5 L)에 이어 2 N 수성 염산 (5 L)으로 세척하였다. 합한 수용액을 디클로로메탄 (1 L)으로 추출하고, 유기 추출물을 합하고 물 (2.5 L), 1 N 수성 수산화나트륨 (2.5 L), 및 물 (2.5 L)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (3 L)를 첨가하고 감압 하에 증발시켰다. 추가의 메틸 tert-부틸 에테르 (2 L)를 첨가하고 50℃에서 1시간 동안 교반하고, 25℃로 냉각시키고 30분 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 메틸 tert-부틸 에테르 (2 x 500 mL)로 세척하고 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (760 g, 88%)을 백색 고체로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 417.0/419.0 [M+H].

대안적 제조예 12

반응식 3, 단계 C: N,N-디메틸포름아미드 (135 mL) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-카르복실산 (27g, 70.7 mmol)의 용액을 0℃로 질소 하에 냉각시키고 CDI (14.9 g, 91.9 mmol)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 이어서 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (9.0 g, 92 mmol) 및 트리에틸아민 (14.3 g, 141 mmol)을 첨가하였다. 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 0.5 M 수성 황산 (675 mL)을 첨가하였다. 1시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 메틸 tert-부틸 에테르 (90 mL) 중에서 1시간 동안 슬러리화하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 메틸 tert-부틸 에테르 (30 mL)로 세척하였다. 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (23 g, 78%)을 고체로서 수득하였다.

제조예 13

1-[(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-일]에타논

반응식 3, 단계 D: 20 L 재킷 반응기에서, THF (10 L) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-N-메톡시-N-메틸테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-4-카르복스아미드 (654.0 g, 1536 mmol)의 용액을 -60℃로 냉각시키고 내부 온도를 -40℃ 아래로 유지하면서, 2-메틸테트라히드로푸란 (660 mL, 2110 mmol) 중 메틸마그네슘 브로마이드의 3.2 M 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 -40℃에서 30분 동안 교반하고 이어서 -50℃로 냉각시키고 내부 온도를 -38℃ 아래로 유지하면서 THF (2 L) 중 1 N 수성 염산 (2 L)의 용액을 첨가하였다. 온도를 10℃로 증가시키고 에틸 아세테이트 (5 L) 및 물 (1 L)을 첨가하고, 교반하고 내부 온도가 5℃에 도달하도록 하고 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (1 L)로 추출하고 유기 추출물을 합하였다. 유기 추출물을 물 (2 L)로 세척하고 수성 층을 에틸 아세테이트 (1 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 염수 (3 x 2 L)로 세척하고 이어서 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 잔류물로 증발시켰다. 시클로헥산 (2.5 L)을 첨가하고, 60℃에서 1시간 동안 이어서 20℃에서 30분 동안 교반하고, 시클로헥산 (500 mL)으로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (565 g, 99%)로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 372.0/374.0 [M+H], [α]²⁰ _D -58.0 ° (c 1.000, 클로로포름).

대안적 제조예 13

반응식 3, 단계 D: THF (60 mL) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-N-메톡시-N-메틸테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-4-카르복스아미드 (4.0 g, 9.59 mmol)의 용액을 -5℃로 냉각시키고 내부 온도를 -5 내지 0℃로 유지하면서, 2-메틸테트라히드로푸란 (5.0 mL, 15 mmol) 중 메틸마그네슘 브로마이드의 3.0 M 용액을 적가하였다. 반응 혼합물 -5 내지 0℃에서 60분 동안 교반하고 이어서 포화 염화암모늄 (20 mL)의 용액을 첨가하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (40 mL)를 첨가하고, 내부 온도가 5℃에 도달하도록 하고 층을 분리하였다. 유기 층을 감압 하에 잔류물로 증발시켰다. n-헵탄 (50 mL)을 첨가하고, 교반하고, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 고체 (3.0 g, 77%)로서 수득하였다.

제조예 14

1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-1-일]에타논

반응식 3, 단계 E: 1-[(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-일]에타논 (5.08 g, 13.6 mmol)을 단일 부분으로 무수 디클로로메탄 (100 mL) 중 엑스탈플루오르-M® (10.02 g, 39.18 mmol)의 교반 현탁액에 0-5℃에서 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (4.5 mL, 27 mmol)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 8시간 동안 교반하고 이어서 주위 온도로 가온하고 밤새 교반하였다. 포화 수성 탄산나트륨 (100 mL)을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 층을 분리하고 수성부를 디클로로메탄 (2 x 50 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 포화 수성 중탄산나트륨 (100 mL), 2 N 수성 염산 (2 x 100 mL), 및 염수 (100 mL)로 세척하였다. 담갈색 고체로 증발 건조시키고 메틸 tert-부틸 에테르 (300 mL) 중에 60℃에서 용해시켰다. 고온 용액을 여과하고 여과물을 증발시켜 갈색 고체 (5.3 g, 81%, LCMS에 의한 82% 순도)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 393.8/395.8 [M+H].

대안적 제조예 14

반응식 3, 단계 E: 엑스탈플루오르-M® (1.21 kg, 4.73 mol)을 여러 부분으로 무수 디클로로메탄 (5 L) 중 1-[(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-일]에타논 (565 g, 1.51 mol)의 교반 용액에 -14℃에서 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (550 g, 3.34 mol)를 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 -10℃에서 대략 10시간 동안 교반하고 이어서 주위 온도로 가온하고 밤새 교반하였다. 내부 온도를 10℃ 아래로 유지하면서, 50% 수성 수산화나트륨 (750 mL)을 천천히 첨가하고, 이어서 물 (1.5 L) 및 포화 수성 탄산수소나트륨 (1 L)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 층을 분리하고 수성부를 디클로로메탄 (1 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 염수 (3 L), 2 N 수성 염산 (5 L), 및 염수 (3 L)로 세척하였다. 증발시켜 잔류물을 수득하고 이소-헥산 중 50-100% 디클로로메탄에 이어 디클로로메탄 중 10% 메틸 tert-부틸 에테르로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 분말 (467 g, 73%, LCMS에 의한 94% 순도)로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 393.8/395.8 [M+H].

제조예 15

(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-푸로[3,4-c]이속사졸

반응식 3, 단계 F: 10 L 재킷 반응기에서 37 wt% 수성 염산 (1.3 L, 16 mol)을 1,4-디옥산 (5 L) 중 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-1-일]에타논 (570 g, 1.45 mol)의 용액에 첨가하고 100℃에서 대략 3시간 동안 또는 LCMS가 완전한 반응을 나타낼 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고, 물 (1 L)로 희석하고 내부 온도를 20℃ 아래로 유지하면서, 50 wt% 수성 수산화나트륨 용액 (800 mL) 및 물 (1 L)의 혼합물을 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (2.5 L)를 첨가하고 격렬히 교반한 후에, 층을 분리하고 유기 상을 염수 (2 L), 추가의 염수 (1 L), 및 물 (1 L)로 세척하였다. 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축 건조시켜 잔류물을 수득하였다. 시클로헥산 (2.5 L)을 첨가하고 증발 건조시키고 이어서 반복하여 표제 화합물을 갈색 오일 (527 g, 89%, LCMS에 의한 86% 순도)로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 351.8/353.8 [M+H].

제조예 16

[(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올

반응식 3, 단계 G: 아연 분말 (6.0 g, 92 mmol)을 아세트산 (100 mL) 중 (3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-푸로[3,4-c]이속사졸 (5.06 g, 13.4 mmol)의 용액에 주위 온도에서 첨가하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL) 및 물 (300 mL)로 희석하고 탄산나트륨 (97 g, 915 mmol)을 첨가하면서 격렬히 교반하였다. 층을 분리하고 유기 층을 염수 (2 x 200 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 이소헥산 중 0% 내지 100% 메틸 tert-부틸 에테르로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 왁스상 고체 (4.67 g, 89%, LCMS에 의한 90% 순도)로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 354.0/356.0 [M+H].

대안적 제조예 16

반응식 3, 단계 G: 아연 분말 (200 g, 3.06 mol)을 조금씩 아세트산 (2 L) 및 물 (2 L) 중 (3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-푸로[3,4-c]이속사졸 (304 g, 75% 순도, 647 mmol)의 용액에 20℃에서 첨가하고 이어서 40℃로 가온하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 물 (2 L)로 희석하고 탄산나트륨 (4 kg, 43.4 mol)을 첨가하면서 격렬히 교반하고 이어서 pH 8-9로 추가의 탄산나트륨을 사용하여 조정하였다. 에틸 아세테이트 (5 L) 및 물 (2.5 L)을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 2:1 아세토니트릴/물로 세척하며 규조토를 통해 여과하였다. 층을 분리하고, 수성부를 에틸 아세테이트 (2 x 2.5 L)로 추출하고 합한 유기 추출물을 염수 (2 x 2.5 L)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 SFC, 칼럼: 키랄팩 AD-H (5), 50 x 250 mm; 용리액: 12% 에탄올 (0.2% 디에틸메틸아민)/CO₂; 유량: UV 220 nm에서 340 g/분에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (197.7 g, 84%)로서 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 354.0/356.0 [M+H], [α]²⁰ _D -6.93 ° (c 0.678, 클로로포름).

제조예 17

(4aR,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-2-아민

반응식 3, 단계 H: [(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올 (1.51 g, 4.24 mmol)을 에탄올 (22.3 mL) 중에 용해시킨 다음, 브로민화시아노겐 (1.30 mL, 6.50 mmol, 아세토니트릴 중 5 M 용액)을 첨가하였다. 생성된 용액을 예열된 85℃ 오일 조에 넣었다. 85℃에서 10시간 동안 교반하였다. 주위 온도로 냉각시킨 다음, 포화 중탄산나트륨을 첨가하였다. 상을 분리하고, 에틸 아세테이트 및 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (1.41 g, 87%)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 379/381 [M+H].

제조예 18

(4aR,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-2-아민

반응식 3, 단계 I: 아이오딘화구리 (I) (0.71 g, 3.74 mmol), L-히드록시프롤린 (0.99 g, 7.50 mmol), 탄산칼륨 (1.56 g, 11.20 mmol) 및 (4aR,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-2-아민 (1.42 g, 3.72 mmol)을 DMSO (20 mL) 중에 용해시켰다. 표면 아래에서 10분 동안 질소 기체 버블링하였다. 수산화암모늄 (물 중 29% wt/wt 용액, 3.0 mL, 20 mmol)을 첨가하고, 14시간 동안 85℃로 가열하였다. 주위 온도로 냉각시키고, 포화 중탄산나트륨을 첨가하였다. 상을 분리하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. [메탄올 중 7 N NH₃]:디클로로메탄의 1-10% 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 표제 화합물 (0.72 g, 58%)을 수득하였다. ES/MS m/z 316 [M+H].

제조예 19

5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드

5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복실산 (67.5 g, 353 mmol)을 1,4-디옥산 (700 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 티오닐 클로라이드 (80 mL, 1090 mmol)를 용액에 천천히 첨가한 다음, 65℃의 내부 온도로 가온하고, 19시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 1,4-디옥산으로 총 부피 400 mL로 희석하였다. 이 용액을 5℃로 냉각시킨 물 중 수산화암모늄 (35 wt%, 1.6 L) 교반 용액에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 여과에 의해 침전물을 수집하고, 물 (3 x 250 mL), 이소헥산 (3 x 250 mL)으로 세척하고, 진공 하에 50℃에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (58.37 g, 86%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 191.0 (M+H).

제조예 20

N-[(4aR,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]옥사진-2-일]벤즈아미드

반응식 5, 단계 A: [(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올 (580 g, 1621 mmol)을 디클로로메탄 (5 L) 중에 18℃에서 질소 하에 용해시키고, 벤조일 이소티오시아네이트 (345 g, 2114 mmol)를 첨가하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고, 진한 50% w/w 수산화나트륨 (250 mL, 3 당량) 및 표백제 (4 L, ~2당량)를 함유하는 스크러버를 부착하여 반응 혼합물로부터 기체를 도출하였다. DMSO (150 mL, 2110 mmol)를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 클로로트리메틸실란 (250 mL, 1930 mmol)을 천천히 첨가하고, 10℃에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (3 L) 중 탄산나트륨 (500 g, 4717.52 mmol)의 용액을 첨가하고, 30분 동안 교반한 다음, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 (2 L)로 세척하고, 수성 층을 디클로로메탄 (2.5 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 잔류물로 증발시켰다. 잔류물을 메탄올 (4 L)로 희석하고, 용액을 40℃에서 1시간 동안 교반하고, 규조토 (500 g)를 통해 여과하고, 메탄올 (4 x 500 mL)로 세척하였다. 잔류물로 증발시키고, 아세토니트릴 (3 L)을 첨가하였다. 용액을 40℃에서 1시간 동안 교반하고, 규조토 (500 g)를 통해 여과하고, 아세토니트릴 (4 x 500 mL)로 세척한 다음, 여과물을 증발시켜 갈색 발포체를 수득하였다. 이소헥산 중 0 내지 30% 에틸 아세테이트로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제하여 표제 화합물 (860 g, 87% 순도)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 483.0/485.0 [M+H].

제조예 21

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-벤즈아미도-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드

반응식 5, 단계 B: 무수 1,4-디옥산 (1.4 L)을 N-[(4aR,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]옥사진-2-일]벤즈아미드 (135.3 g, 87% 순도, 243.6 mmol), 4Å 분자체 (21.6 g), 5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드 (61.21 g, 318.6 mmol), 미분된 탄산칼륨 (61.5 g, 445 mmol), 및 아이오딘화나트륨 (62.0 g, 413.6 mmol)에 함께 첨가하고, 반응 혼합물을 통해 30분 동안 질소 버블링하였다. 트랜스-N,N'-디메틸시클로헥산-1,2-디아민 (12 mL, 76.1 mmol) 및 아이오딘화구리 (I) (9.3 g, 49 mmol)를 첨가하고, 용액을 통해 10분 동안 질소 버블링을 계속하였다. 혼합물을 교반하고, 질소 하에 7일 동안 109℃의 내부 온도로 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 반응 혼합물을 포화 수성 염화암모늄 (1 L)으로 희석하였다. 3시간 동안 교반하고, 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 포화 수성 염화암모늄 (500 mL) 및 에틸 아세테이트 (4 x 250 mL)로 세척하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 포화 수성 염화암모늄 (500 mL)으로 세척하고, 물 (300 mL) 중 진한 수산화암모늄 용액 (200 mL)으로 2회 세척하였다. 유기 층을 증발 건조시키고, 톨루엔 (1 L)을 첨가하고, 잔류물로 증발시켰다. 이소프로판올 (500 L)을 첨가하고, 증발 건조시켰다. 이소프로판올 (1.5 L)을 첨가하고, 70℃에서 30분 동안 교반하고, 밤새 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 이소프로판올 (2 x 200 mL)로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 베이지색 고체 (103.6 g, 70%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 593.2 (M+H), [α]²⁰ _D -208.43 (c 0.5, 클로로포름).

실시예 1

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드.

반응식 4, 단계 A: 5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복실산 (0.040 g, 0.21 mmol)을 아세토니트릴 (2 mL) 중에 용해시키고, 이어서 옥살릴 클로라이드 (14.7 μL, 0.16 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (1 방울)를 첨가하였다. 주위 온도에서 질소 하에 1시간 동안 교반하였다. 감압 하에 농축시키고, 아세토니트릴 (2 mL)로 재구성하고, 다음에 기재된 50℃ 용액에 첨가하였다. 별개의 용기에, (4aR,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-2-아민 (0.040 g, 0.13 mmol), 에탄올 (2 mL), 및 물 (2 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 가열하고, 1시간 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 상을 분리하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 메탄올 중 7 N NH₃:디클로로메탄의 0-2% 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 표제 화합물 (0.052 g, 81%)을 수득하였다. ES/MS m/z 489 [M+H].

대안적 제조 실시예 1

반응식 5, 단계 C: 에탄올 (600 mL) 중 N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-벤즈아미도-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 (103.6 g, 169.6 mmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (35.54 g, 425.5 mmol) 및 피리딘 (70 mL, 865 mmol)의 교반 현탁액에 디클로로메탄 (500 mL)을 첨가하였다. 주위 온도에서 46시간 동안 교반하고, 잔류물로 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (1 L) 중에 용해시키고, 5 N 수성 염산 (500 mL)을 첨가하고, 10분 동안 교반하고, 포화 수성 염화나트륨 (600 mL) 및 헵탄 (1 L)을 첨가하였다. 추가로 15분 동안 교반하고, 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 포화 수성 염화나트륨 (4 x 200 mL) 및 디클로로메탄/헵탄 (1:1, 4 x 200 mL)으로 세척하여 습윤 베이지색 고체 (143 g)를 조 표제 화합물로서 수득하였다. 이 물질에, 에틸 아세테이트 (1 L), 및 포화 수성 탄산수소나트륨 (500 mL) 중 이전에 본질적으로 동일하게 제조된 표제 화합물 (19.8 g, 91% 순도, 37.0 mmol)을 첨가하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 30분 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트 (500 mL)로 추출하였다. 유기 층을 포화 수성 염화나트륨 용액 (2 x 200 mL)으로 세척하고, 증발 건조시켜 베이지색 고체를 수득하였다. 잔류물을 메탄올 (1 L) 중에 60℃에서 교반하면서 용해시키고, 물 (1 L)을 10분에 걸쳐 천천히 첨가한 다음, 현탁액을 교반하고, 밤새 주위 온도로 냉각되게 하였다. 결정을 여과에 의해 수집하고, 메탄올/물 (1:1, 2 x 300 mL)로 세척하였다. 이어서 고체를 메탄올/물 (1:1, 1 L) 중 주위 온도에서 2시간 동안 교반하고, 침전물을 여과에 의해 수집하고, 메탄올/물 (1:1, 2 x 100 mL)로 세척하였다. 고체를 진공 하에 45℃에서 건조시켜 표제 화합물을 담베이지색 분말 (88.8 g)로서 수득하였다. ES/MS m/z 593.2 (M+H), [α]²⁰ _D +81.54 (c 1.0, 클로로포름).

실시예 1A

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 (1 g, 2.048 mmol)를 에탄올 (10 mL)과 함께 교반하였다. 현탁액을 60℃로 가열하고, 추가의 에탄올 (10 mL)을 조금씩 첨가하였다. 용액을 15분에 걸쳐 90℃로 가열하여 투명한 용액을 수득하였다. 에탄올 (1 mL) 중 p-톨루엔술폰산 1수화물 (400 mg, 2.082 mmol)을 첨가하고, 용기를 에탄올 (1 mL)로 세정하였다. 용액을 표제 화합물 (약 5 mg)로 시딩하였다. 용액을 1시간에 걸쳐 실온으로 냉각시키고, 10℃에서 15분 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과하고, 고체를 에탄올 (2x2 mL)로 세척하고, 진공 하에 45분 동안 건조시켜 표제 화합물 (0.972 g, 1.47 mmol)을 수득하였다.

실시예 1A의 X-선 분말 회절 (XRD)

결정질 고체의 XRD 패턴을 CuKa 공급원 λ = 1.54060 Å 및 반텍(Vantec) 검출기가 구비되어 있으며, 35 kV 및 50 mA에서 작동하는 브루커 D4 엔데버(Bruker D4 Endeavor) X-선 분말 회절계 상에서 수득한다. 샘플을 0.009°(2θ)의 스텝 크기, 및 0.5초/스텝의 스캔 속도로, 및 0.6 mm 발산, 5.28 고정된 산란방지, 및 9.5 mm 검출기 슬릿으로 4 내지 40°(2θ)를 스캔한다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고, 평활면을 유리 슬라이드를 사용하여 수득한다. 결정 형태 회절 패턴을 주위 온도 및 상대 습도에서 수집한다. 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 회절 피크의 상대 강도가 요인 예컨대 결정 형태 및 습성으로부터 생성된 바람직한 배향으로 인해 달라질 수 있다는 것은 결정학 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 또한, 임의의 주어진 결정 형태의 경우에 각도 피크 위치는 약간 달라질 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도에서의 변동, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동할 수 있다. 본 경우에, ± 0.2 (2θ)의 피크 위치 변동성은 나타낸 결정 형태의 명백한 확인을 방해하지 않으면서 이러한 잠재적 변동을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 구별되는 피크 (° 2θ의 단위), 전형적으로 보다 우세한 피크의 임의의 고유한 조합에 기초하여 수행될 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집한 결정 형태 회절 패턴을 8.853 및 26.774도 2-세타에서의 NIST 675 표준 피크에 기초하여 조정하였다.

결정질 N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트의 제조된 샘플은 CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴에 의해 하기 표 1에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것, 및 특히 0.2도의 회절각에 대한 허용오차로 9.8°, 28.0° 및 14.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합하여 4.9°에서의 피크를 갖는 것을 특징으로 한다.

표 1: 실시예 1A의 X선 분말 회절 피크

시험관내 검정 절차:

BACE2보다 BACE1에 대한 선택성을 평가하기 위해, 시험 화합물을 아래에 기재된 바와 같이 BACE1 및 BACE2에 대한 특이적 기질을 사용하여 FRET 검정에서 평가한다. 시험관내 효소 및 세포 검정을 위해, 시험 화합물을 DMSO 중에서 제조하여 10 mM 원액을 제조한다. 원액을 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 10 μM 내지 0.05 nM 범위의 최종 화합물 농도로 DMSO 중에서 연속적으로 희석하여 10-포인트 희석 곡선을 수득한 후에, 시험관내 효소 및 전세포 검정을 수행한다.

시험관내 프로테아제 억제 검정:

huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc의 발현.

인간 BACE1 (수탁 번호: AF190725) 및 인간 BACE2 (수탁 번호: AF204944)를 총 뇌 cDNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝한다. 아미노산 서열 #1 내지 460에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 인간 IgG₁ (Fc) 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA에 삽입한다 (Vassar et al., Science, 286, 735-742 (1999)). huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc로 각각 명명되는, BACE1(1-460) 또는 BACE2(1-460) 및 인간 Fc의 이러한 융합 단백질을 pJB02 벡터에 구축한다. 인간 BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc) 및 인간 BACE2(1-460):Fc (huBACE2:Fc)를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시킨다. 각 구축물의 cDNA (250 μg)를 퓨젠(Fugene) 6과 혼합하고, 1 리터 HEK293 세포에 첨가한다. 형질감염 4일 후에, 조건화 배지를 정제를 위해 수거한다. huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc를 아래에 기재된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제한다. 효소를 -80℃에서 소량의 분취물로 저장한다. (문헌 [Yang, et al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)] 참조).

huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc의 정제.

huBACE1:Fc 또는 huBACE2:Fc cDNA로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293 세포의 조건화 배지를 수집한다. 세포 파편을 0.22 μm 멸균 필터를 통해 조건화 배지를 여과함으로써 제거한다. 단백질 A-아가로스 (5 ml) (베드 부피)를 조건화 배지 (4 리터)에 첨가한다. 이 혼합물을 완만하게 밤새 4℃에서 교반한다. 단백질 A-아가로스 수지를 수집하고 저압 크로마토그래피 칼럼에 패킹한다. 칼럼을 20x 베드 부피의 PBS로 시간당 20 ml의 유량으로 세척한다. 결합된 huBACE1:Fc 또는 huBACE2:Fc 단백질을 50 mM 아세트산, pH 3.6으로, 시간당 20 ml의 유량으로 용리한다. 용리액의 분획 (1 ml)을 즉시 아세트산암모늄 (0.5 ml, 200 mM), pH 6.5로 중화시킨다. 최종 생성물의 순도를 4-20% 트리스-글리신 SDS-PAGE에서 전기영동에 의해 평가한다. 효소를 -80℃에서 소량의 분취물로 저장한다.

BACE1 FRET 검정

시험 화합물의 일련의 희석액을 상기 기재된 바와 같이 제조한다. 화합물을 KH₂PO₄ 완충제 중에서 추가로 20x 희석한다. 각 희석액 (10 μL)을 반응 혼합물 (25 μL의 50 mM KH₂PO₄, pH 4.6, 1 mM 트리톤(TRITON)® X-100, 1 mg/mL BSA, 및 15 μM의 APP의 서열에 기초한 FRET 기질)을 함유하는 상응하는 저 단백질 결합 흑색 플레이트의 A열 내지 H열의 각 웰에 첨가한다 (문헌 [Yang, et al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)] 참조). 내용물을 플레이트 진탕기 상에서 10분 동안 잘 혼합한다. 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트에 KH₂PO₄ 완충제 중 인간 BACE1(1-460):Fc (200 pM, 15 μL) (문헌 [Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조)를 첨가하여 반응을 개시시킨다. 플레이트 진탕기 상에서 간단히 혼합한 후, 시간 0에서의 혼합물의 RFU를 여기 파장 355 nm 및 방출 파장 460 nm에서 기록한다. 반응 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 습윤 오븐에서 실온에서 16 내지 24시간 동안 유지한다. 인큐베이션 말미의 RFU를 시간 0에서 사용된 동일한 여기 및 방출 설정에서 기록한다. 시간 0 및 인큐베이션 말미의 RFU의 차이는 화합물 처리 하에서의 BACE1의 활성을 나타낸다. RFU 차이를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고 곡선을 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 핏팅하여 IC₅₀ 값을 수득한다. (May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되며 11.9 nM ± 3.5, n=12 (평균 ± 평균의 표준 편차)의 BACE1에 대한 IC₅₀을 나타낸다. 이러한 데이터는 실시예 1의 화합물이 시험관내 정제된 재조합 BACE1 효소 활성을 억제한다는 것을 입증한다.

BACE2 TMEM27 FRET 검정

시험 화합물의 일련의 희석액을 상기 기재된 바와 같이 제조한다. 화합물을 KH₂PO₄ 완충제 중에서 추가로 20x 희석한다. 각 희석액 (10 μL)을 반응 혼합물 (25 μL의 50 mM KH₂PO₄, pH 4.6, 1 mM 트리톤® X-100, 1 mg/mL BSA, 및 5 μM의 TMEM FRET 기질) (답실-QTLEFLKIPS-LucY, WO 2010063640 A1))을 함유하는 상응하는 저 단백질 결합 흑색 플레이트의 A열 내지 H열의 각 웰에 첨가한다. 이어서 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트에 KH₂PO₄ 완충제 중 15 μL의 20 μM 인간 BACE2 (1-460):Fc (문헌 [Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조)를 첨가하여 반응을 개시시킨다. 내용물을 플레이트 진탕기 상에서 10분 동안 잘 혼합한다. 시간 0에서의 혼합물의 RFU를 여기 파장 430 nm 및 방출 파장 535 nm에서 기록한다. 반응 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 습윤 오븐에서 실온에서 16 내지 24시간 동안 유지한다. 인큐베이션 말미의 RFU를 시간 0에서 사용된 동일한 여기 및 방출 설정에서 기록한다. 시간 0 및 인큐베이션 말미의 RFU의 차이는 화합물 처리 하에서의 BACE2의 활성을 나타낸다. RFU 차이를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고 곡선을 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 핏팅하여 IC₅₀ 값을 수득한다. (May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되며 602 nM ± 37.4, n=6 (평균 ± 평균의 표준 편차)의 BACE2 IC₅₀을 나타낸다. BACE2 (TMEM27 LucY FRET 검정)에 대한 BACE1 (FRET IC₅₀ 효소 검정)의 비는 대략 50-배이며, 이는 BACE1 효소를 억제하는 것에 대한 기능적 선택성을 나타낸다. 상기 제시된 데이터는 실시예 1의 화합물이 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적임을 입증한다.

SH-SY5YAPP695Wt 전세포 검정

BACE1 활성의 억제의 측정을 위한 통상적인 전세포 검정은 인간 APP695Wt cDNA를 안정하게 발현하는 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y (ATCC 수탁 번호 CRL2266)를 이용한다. 세포는 상용적으로 계대 수 6까지 사용하고 이어서 폐기한다.

SH-SY5YAPP695Wt 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에서 200 μL 배양 배지 (50% MEM/EBSS 및 햄 F12, 1x 각 피루브산나트륨, 비필수 아미노산 및 10% FBS를 함유하는 NaHCO₃) 중에서 5.0x10⁴개 세포/웰로 플레이팅한다. 다음 날, 배지를 세포로부터 제거하고, 신선한 배지를 첨가하고 이어서 37℃에서 24시간 동안 목적하는 농도 범위의 시험 화합물의 존재/부재 하에 인큐베이션한다.

인큐베이션의 말미에, 조건화 배지를 특이적 샌드위치 ELISA에 의한 A베타 펩티드 1-40 및 1-42의 분석에 의해 베타-세크레타제 활성의 증명에 대해 분석한다. A베타의 이들 특이적 이소형을 측정하기 위해, 모노클로날 2G3을 A베타 1-40에 대한 포획 항체로서 및 모노클로날 21F12를 A베타 1-42에 대한 포획 항체로서 사용한다. A베타 1-40 및 A베타 1-42 ELISA는 둘 다 비오티닐화 3D6을 리포팅 항체로서 사용한다 (항체의 설명을 위해, 문헌 [Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)] 참조). 화합물 처리 후 조건화 배지 중에서 방출된 A베타의 농도는 이러한 조건 하에서의 BACE1의 활성에 상응한다. 10-포인트 억제 곡선을 플롯팅하고 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 핏팅하여 A베타-저하 효과에 대한 IC₅₀ 값을 수득한다.

실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되며 SH-SY5YAPP695Wt A-베타 (1-40) ELISA에 대해 1.03 nM ± 0.58, n=4의 IC₅₀ 및 SH-SY5YAPP695Wt A-베타 (1-42) ELISA에 대해 1.28 nM ± 1.09, n=4의 IC₅₀을 나타낸다 (평균 ± 평균의 표준 편차). 상기 제시된 데이터는 실시예 1의 화합물이 전세포 검정에서 BACE1을 억제한다는 것을 입증한다.

베타-세크레타제의 생체내 억제

마우스, 기니 피그, 개, 및 원숭이를 포함한 여러 동물 모델을 사용하여 화합물 처리 후의 생체내 베타-세크레타제 활성의 억제에 대해 스크리닝할 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 캐뉼라삽입된 비글 개 모델에서 중심 약리학 연구를 수행한다. 이러한 모델에서, 수컷 비글 개 코호트에 요추골 영역에 캐뉼라를 이식하고, 경추를 향해 상향 관통시킨다. 이 모델에서 척추 카테터에 부착된 피하 요추 포트를 통해 단일 48-72시간 연구 기간에 걸쳐 다수의 CSF가 수집되게 한다. 캐뉼라가 특허로 남아 있는 한, 동일한 코호트의 개에서 추가의 CSF 약리학 연구를 수행할 수 있다. 혈액 샘플을 처리하여 혈장을 수득한 다음, 시험 화합물 및 A베타 CSF 농도의 결정이 가능하도록 혈장 및 CSF 샘플을 분취한다.

이러한 연구에서, 6마리의 수컷 비글 개에게 1.0 mg/kg 실시예 1을 0.5 M, 포스페이트 완충제 (pH=2.0) 제제로 p.o. 투여하고, 혈액 (0.5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 및 48시간) 및 CSF (3, 6, 9, 24, 및 48시간)를 수집한다. 혈장 및 CSF 화합물 농도를 LC/MS/MS 방법에 의해 결정한다. 혈장 및 CSF를 또한 A베타 1-x에 대해 분석한다. 본원에 사용된 "A베타 1-x"는 잔기 1에서 시작되어 잔기 28 초과의 C-말단에서 종결되는 A베타 종 전부를 지칭한다. 이는 대부분의 A베타 종을 검출하고 종종 "총 A베타"로 불린다. 총 A베타 펩티드 (A베타 1-x) 수준을 모노클로날 266을 포획 항체로서 및 비오티닐화 3D6을 리포팅 항체로서 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 측정한다. (문헌 [May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)] 참조).

실시예 1의 경구 투여 후 48시간의 투여-후 기간 내내 A베타 1-x의 혈장 수준에서 강건한 변화 (최저점에서 최대 80% 감소)가 관찰된다. CSF A베타 1-x 수준은 1.0 mg/kg 실시예 1을 경구 투여하고 각각 24 및 48시간 후, 기준선 대비 대략 65-55 %만큼 감소한다. 7,960 nM*시간의 총 혈장 AUC 노출이 달성된다. 혈장 중 화합물의 유리 분획을 평형 투석 (Zamek-Gliszczynki, et al. J Pharm Sci. 2011 Jun; 100(6): 2498-507)에 의해 결정하고, 이러한 값을 사용하여 총 측정된 값으로부터 유리 약물 혈장 농도를 유도한다. 실시예 1의 경우 CSF AUC 대 유리 혈장 AUC의 비는 0.17이고, 이는 이러한 화합물이 개에서 CNS로부터 부분적으로 제외되지만, CSF 구획에서 강건한 A베타 저하를 유도하는데 충분하다는 것을 나타낸다.

시험관내 BACE1 효소에 대한 실시예 1의 화합물의 활성을 고려하면 이들 A베타-저하 효과는 생체내 BACE1 억제와 일치하고, 추가로 실시예 1의 화합물의 CNS 침투를 입증한다.

이들 연구는 본 발명의 화합물이 BACE1을 억제하고, 따라서, 말초 및 중추 구획에서 A베타 수준을 감소시키는데 유용하다는 것을 보여준다.

Claims (14)

1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
   

   
2. 제1항에 있어서, 위치 4a의 수소가 위치 7a의 치환된 페닐에 대해 시스 배위에 있는 것인 화합물 또는 염.
   

   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 위치 5의 1,1-디플루오로에틸이 위치 4a의 수소 및 위치 7a의 치환된 페닐에 대해 시스 배위에 있는 것인 화합물 또는 염.
   

   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드인 화합물 또는 그의 염.
5. 제4항에 있어서, N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]옥사진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트인 염.
6. 제5항에 있어서, 결정질인 염.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, X선 회절 스펙트럼에서, 0.2도의 회절각에 대한 허용오차로 9.8°, 28.0°, 및 14.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합하여 4.9°의 회절각 2-세타에서의 실질적 피크를 특징으로 하는 염.
8. 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법.
9. 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는 방법.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물을 제조하는 방법.