CN109121412A

CN109121412A - N-[3-[2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺及其(4aR,5S,7aS)异构体作为选择性BACE1抑制剂用于治疗如阿尔茨海默病的用途

Info

Publication number: CN109121412A
Application number: CN201780024110.3A
Authority: CN
Inventors: D·A·科茨; E·J·亨布雷
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2019-01-01
Also published as: EP3458461A1; CA3025129A1; WO2017200863A1; US20190106434A1; MX2018013934A; BR112018070372A2; AU2017268154A1; IL262421A; JP2019514987A; TW201805291A; AU2017268154B2; KR20180134401A; TWI675034B

Abstract

本发明提供了N‑[3‑[2‑氨基‑5‑(1,1‑二氟乙基)‑4,4a,5,7‑四氢呋喃并[3,4‑d][1,3]噁嗪‑7a‑基]‑4‑氟‑苯基]‑5‑(三氟甲基)吡啶‑2‑甲酰胺，即式I化合物及其药学上可接受的盐，特别是其(4aR,5S,7aS)异构体，这些化合物作为BACE1选择性抑制剂，可以用于治疗如阿尔茨海默病和轻度认知障碍向阿尔茨海默病的发展。

Description

N-[3-[2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3, 4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2- 甲酰胺及其(4aR,5S,7aS)异构体作为选择性BACE1抑制剂用于治疗如阿尔茨海默病的用途

本发明涉及新的四氢呋喃并噁嗪化合物，它们作为选择性BACE1抑制剂的用途，本发明还涉及含有这些化合物的药物组合物、使用该化合物治疗生理疾病的方法以及在合成该化合物中使用的中间体和方法。

本发明涉及治疗阿尔茨海默氏病和与淀粉样蛋白β(淀粉状蛋白质(Abeta))肽的其它疾病和病症的领域，所述肽是淀粉样前体蛋白(APP)的神经毒性和高度聚集的肽片段。阿尔茨海默病是一种破坏性的神经退行性疾病，影响着全世界数百万患者。鉴于市场上目前批准的药物仅能为患者提供短暂的对症益处而非治愈、延缓或逆转该疾病，因此在治疗阿尔茨海默病方面存在显著的未满足的需求。

阿尔茨海默病的特征在于淀粉状蛋白质在大脑中产生、聚集和沉积。已经显示，完全或部分抑制β-分泌酶(β-位点淀粉样蛋白前体蛋白切割酶；BACE)对小鼠模型中斑块相关和斑块依赖性病理学具有显着影响，这表明即使淀粉状蛋白质肽水平的微小降低也可能导致斑块负荷和突触缺陷的长期显著减少，从而提供有效的治疗益处，特别是在阿尔茨海默病的治疗中。此外，已经鉴定了两种BACE同源物，称为BACE1和BACE2，据信BACE1对于阿尔茨海默病的发展在临床上是最重要的。BACE1主要在神经元中表达，而BACE2主要在外周表达(参见D.Oehlrich,Bioorg.Med.Chem.Lett.,24,2033-2045(2014))。此外，BACE2可能对色素沉着很重要，因为它已被确定为在色素细胞特异性黑素细胞蛋白的加工处理中起作用(参见L.Rochin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110(26),10658-10663(2013))。希望具有中枢神经系统(CNS)渗透性的BACE抑制剂、特别是对BACE1的选择性超过对BACE2的选择性的抑制剂能够对淀粉状蛋白质肽介导的疾病(例如阿尔茨海默病)提供治疗。

美国专利号9,079,914公开了某些具有BACE1抑制作用的稠合氨基二氢-噁嗪衍生物，其可用于治疗由淀粉状蛋白质引起的某些神经变性疾病，例如阿尔茨海默型痴呆。此外，美国专利号8,940,734公开了某些具有BACE1抑制活性的稠合氨基二氢噻嗪衍生物，并进一步公开了用于淀粉状蛋白质肽引起的神经变性疾病(如阿尔茨海默氏型痴呆)的有用治疗药物。

本发明提供了作为BACE1抑制剂的某些新化合物。此外，本发明提供某些新化合物，它们对BACE1抑制的选择性超过对BACE2抑制的选择性。此外，本发明提供了某些能够穿透CNS的新化合物。本发明还提供某些新化合物，其具有改善副作用特性的潜力，例如，通过选择性抑制BACE1而不是BACE2。

因此，本发明提供了式I化合物或其药学上可接受的盐：

此外，本发明提供了式Ia化合物或其药学上可接受的盐：

本发明还提供了在需要此类治疗的患者中治疗阿尔茨海默病的方法，包括给予所述患者有效量的式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐。

本发明还提供了在需要此类治疗的患者中治疗轻度认知障碍向阿尔茨海默病的发展的方法，包括给予所述患者有效量的式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐。

本发明还提供抑制患者BACE的方法，包括给予需要此类治疗的患者有效量的式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供抑制BACE介导的淀粉样蛋白前体蛋白裂解的方法，包括给予需要此类治疗的患者有效量的式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供抑制淀粉状蛋白质肽产生的方法，包括给予需要此类治疗的患者有效量的式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐。

此外，本发明提供了用于治疗的式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐，特别是用于治疗阿尔茨海默病，或者用于预防轻度认知障碍向阿尔茨海默病的发展。此外，本发明还提供了式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐在生产用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

本发明还提供药物组合物，其包含式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐以及一或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明还提供了制备药物组合物的方法，包括将式I或Ia化合物或其药学上可接受的盐与一或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。本发明还包括用于合成式I和Ia化合物的新的中间体和方法。

轻度认知障碍被定义为与阿尔茨海默病相关的痴呆的潜在有前驱症状的阶段，其基于临床表现和患者表现出的随时间由轻度认知障碍向阿尔茨海默痴呆的进展。(Morris等,Arch.Neurol.,58,397-405(2001)；Petersen等,Arch.Neurol.,56,303-308(1999))。术语“预防轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病”包括抑制、延缓、停止或逆转患者中轻度认知障碍向阿尔茨海默病的发展。

如本文所用，术语“治疗”(包括名词和动词)包括抑制、延缓、停止或逆转现有症状或病症的进展或严重性。

如本文所用，术语“患者”是指人。

术语“抑制淀粉状蛋白质肽的产生”被认为是指患者体内淀粉状蛋白质肽水平的降低。

如本文所用，术语“有效量”是指本发明化合物或其药学上可接受的盐的量或剂量，当以单剂量或多剂量向患者给药后，其在诊断或治疗的患者中提供需要的效果。

作为本领域技术人员，通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果，主治诊断医师可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量时，主治诊断医师会考虑许多因素，包括但不限于：患者的物种；其体积、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的程度或损害或严重性；个体患者的反应；给予的特定化合物；给药方式；施用的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；相伴药物的使用以及其它相关情况。

本发明化合物通常在很宽的剂量范围内有效。例如，每天的剂量范围通常为约0.01至约20mg/kg体重。在某些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能绰绰有余，而在其他情况下，可以使用更大的剂量且具有可接受的副作用，因此上述剂量范围不应当以任何方式限制本发明的范围。

优选将本发明化合物配制成药物组合物，所述药物组合物可以通过使化合物生物可利用的任何途径给药，包括口服和透皮途径。最优选，此类组合物用于口服给药。此类药物组合物及其制备方法是本领域众所周知的。(参见,例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践),L.V.Allen编辑,第22版,Pharmaceutical Press,2012)。

式I和Ia化合物或其药学上可接受的盐特别适用于本发明的治疗方法，但优选某些基团、取代基和构型。下面的段落描述了这些优选的基团、取代基和构型。应当理解，这些优选适用于治疗方法和本发明的新化合物。

本发明的其它化合物包括下式化合物及其药学上可接受的盐：

优选其中稠合双环为顺式构型的式I化合物或其药学上可接受的盐。例如，本领域普通技术人员应当理解，如下面流程A所示，位置4a的氢相对于位置7a的取代的苯基呈顺式构型。另外，位置4a、5和7a的优选相对构型也如流程A中所示，其中位置5的1,1-二氟乙基取代基相对于位置4a的氢和位置7a的取代的苯基呈顺式构型：

流程A

尽管本发明包括所有单一对映异构体和非对映异构体以及所述化合物的对映异构体的混合物(包括外消旋体)，但特别优选具有如下所述绝对构型的化合物：

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺及其药学上可接受的盐；和

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺4-甲基苯磺酸盐。

还优选N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺4-甲基苯磺酸盐的晶型特征在于在衍射角2-θ的4.9°处X射线衍射光谱中具有显著峰(substantial peak)，同时还包括选自9.8°、28.0°和14.7°的一或多个峰，衍射角的公差为0.2度。

本领域普通技术人员应当理解，本发明的化合物可以以互变异构形式存在，如下面流程B中所述。当在本申请中提及本发明化合物的一种特定互变异构体时，应当理解为其包括互变异构形式及其所有混合物。

流程B

此外，下面制备中描述的某些中间体可以包括一或多个氮保护基团。应当理解，保护基团可以如本领域技术人员所理解的那样加以改变，这取决于具体的反应条件和待进行的特定转化。保护和去保护条件是本领域技术人员所熟知的，在文献中也有描述(参见例如“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(Greene氏有机合成中的保护基团)”，第四版，Peter GM Wuts和Theodora W.Greene，John Wiley and Sons，Inc.2007)。

本领域普通技术人员可以通过选择性结晶技术或手性色谱等方法，在本发明化合物合成中的任何方便点分离或拆分单一异构体、对映异构体和非对映异构体。(参见例如，J.Jacques等,"Enantiomers,Racemates,and Resolutions(对映体、外消旋体和拆分),John Wiley and Sons,Inc.,1981；E.L.Eliel和S.H.Wilen,“Stereochemistry ofOrganic Compounds(有机化合物立体化学))”,Wiley-Interscience,1994)。

本发明化合物的药学上可接受的盐(例如盐酸盐)可以通过例如本发明化合物的适当的游离碱和适当的药学上可接受的酸(如盐酸、对-甲苯磺酸或丙二酸)在本领域熟知的标准条件下在适当的溶剂(如乙醚)中反应形成。另外，此类盐的形成可以在氮保护基脱保护时同时发生。此类盐的形成是本领域熟知和理解的。参见，例如，Gould,P.L.,“Saltselection for basic drugs(碱性药物的盐选择),”International Journal ofPharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等，“Salt Selection and OptimizationProcedures for Pharmaceutical New Chemical Entities(药用新化学实体的盐选择和优化方法),”Organic Process Research and Development,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等,“Pharmaceutical Salts(药用盐),”Journal of Pharmaceutical Sciences,66:1-19,(1977)。

某些缩写定义如下：“APP”是指淀粉样蛋白前体蛋白；“AUC”是指曲线下面积；“BSA”是指牛血清白蛋白；“CDI”是指1,1'-羰基二咪唑；“cDNA”指互补脱氧核糖核酸；“CSF”是指脑脊液；“DCC”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“Deoxo-”是指双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫；“DIC”是指1,3-二异丙基碳二亚胺；“DMAP”是指4-二甲基氨基吡啶；“DMSO”是指二甲基亚砜；“EBSS”是指Earle氏平衡盐溶液；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“ELISA”是指酶联免疫吸附法；“F12”指的是Ham氏F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“Fc”是指可结晶的片段；“FLUOLEAD^TM”是指4-叔丁基-2,6-二甲基苯基三氟化硫；“FRET”是指荧光共振能量转移；“HATU”是指(二甲基氨基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲基亚胺鎓六氟磷酸盐；“HBTU”是指(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基氨基)-N,N-二甲基甲基亚胺鎓六氟磷酸盐；“HEK”指人胚肾；“HF-吡啶”是指氟化氢吡啶或Olah氏试剂或聚(吡啶氟化物)；“HOAt”是指1-羟基-7-氮杂苯并三唑；“HOBT”是指1-羟基苯并三唑水合物；“IC₅₀”是指对该药物能够产生50％最大抑制响应的药物浓度；“IgG₁”指免疫球蛋白样结构域Fc-γ受体；“MEM”是指最低必需培养基；“PBS”是指磷酸盐缓冲的盐水；“p.o.”是指口服给药；“PyBOP”是指(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)；“PyBrOP”是指三-吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐；“RFU”是指相对荧光单位；“RT-PCR”是指逆转录聚合酶链反应；“SDS-PAGE”是指十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；“SFC”是指超临界色谱；是指丙基膦酸酐；“THF”是指四氢呋喃；“TEMPO”是指(2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-基)氧基；“TMEM”指跨膜蛋白；“Tris”是指三(羟甲基)氨基甲烷；“三苯甲基”是指式(Ph)₃C-的基团，其中Ph是指苯基；“XtalFluor-或DAST二氟硫鎓盐(sulfinium)”是指(二乙基氨基)二氟锍鎓四氟硼酸盐或N,N-二乙基-S,S-二氟硫鎓(sulfiliminium)四氟硼酸盐；和“XtalFluor-或morpho-DAST二氟亚硫鎓盐”是指二氟(吗啉代)锍鎓四氟硼酸盐或二氟-4-吗啉基锍鎓四氟硼酸盐。

本发明化合物或其盐可以通过本领域技术人员已知的各种方法制备，其中一些方法在下面的流程、制备和实施例中进行了说明。本领域技术人员应当知道，所描述的每种路线的具体合成步骤可以以不同方式组合，或者与来自不同流程的步骤组合，以制备本发明化合物或其盐。以下流程中每个步骤的产物可通过本领域熟知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶方法。在下面的流程中，除非另有说明，否则所有取代基如前文所定义。试剂和原料对于本领域技术人员而言是容易获得的。在不限制本发明范围的情况下，提供以下流程、制备和实施例以进一步说明本发明。

流程1

在流程1步骤A中，在约-50℃的温度下，用有机碱例如正丁基锂在溶剂例如THF中处理三甲基锍碘化物。然后于-10℃，将用适当的保护基团(例如三苯基甲基)保护的被保护的氧基甲基环氧乙烷加入碱性溶液中并搅拌约2小时，得到流程1步骤A的被保护产物。“PG”为保护基团，用于氨基或氧基的保护，例如氨基甲酸酯、酰胺或醚。此类保护基团在本领域中是众所周知的。或者，可以采用三苯基甲基氯和有机碱(例如DMAP和三乙胺)在溶剂(例如二氯甲烷)中选择性地在二醇例如(2S)-丁-2-烯-1,2-二醇的一个羟基上保护，获得流程1步骤A的被保护的产品。于约室温下，使用四-N-丁基硫酸铵或其它季铵盐相转移催化剂，在溶剂如甲苯和无机碱水溶液如氢氧化钠中，使步骤A的保护产物与α-卤代酯如叔丁氧基溴乙酸酯反应，得到流程1步骤B的化合物。此类烷基化反应是本领域熟知的。或者，可以采用碱如60％的氢化钠油溶液和溶剂如N,N-二甲基甲酰胺或THF于0-100℃的温度范围，得到步骤B的保护产物。叔丁氧基羰基乙酸酯可以通过两步法转化为肟。在约-70℃的温度下，滴加还原剂(如异丁基铝氢化物的己烷溶液)，然后在约-60℃的温度下滴加酸水溶液如盐酸。通过有机萃取完成处理，得到中间体产物。将该产物溶于有机溶剂如二氯甲烷中，用乙酸钠处理，然后用盐酸羟胺处理，得到步骤C的肟产物。流程1步骤C的肟产物可以转化为步骤D的双环4,5-二氢异噁唑产物，这可以通过多种方法进行的3+2环化反应进行，例如，于约10-15℃或加热情况下，采用次氯酸钠水溶液或其他氧化剂如N-氯代琥珀酰亚胺在溶剂(如叔丁基甲基醚、甲苯、二氯甲烷或二甲苯)中进行。通过产生有机金属试剂，可以将2-氟-5-溴苯基加入到二氢异噁唑中。有机金属试剂可以如下获得：采用卤素-金属交换方法，由4-溴-1-氟-2-碘-苯，使用试剂如正丁基锂或异丙基氯化镁氯化锂复合物，于约-78℃至15℃在溶剂如THF中滴加。然后加入路易斯酸如三氟化硼乙醚合物，得到流程1步骤E的产物。

流程2

或者在流程2中，可以在溶剂如甲苯中于约5℃，将流程1步骤A的保护产物用4-(2-氯乙酰基)吗啉代(4-(2-chloroacetyl)morpholino)和碱如四丁基硫酸氢铵处理，得到流程2步骤A的产物。吗啉代基团可以在流程2步骤B中用作离去基团。例如，流程2步骤A的产物可以用适当的格氏试剂处理，该试剂可以通过异丙基氯化镁氯化锂复合物和4-溴-1-氟-2-碘苯原位制备，或者如果有适当的格氏试剂，可以将试剂于约5℃直接加入到流程2步骤A的产物中，得到流程2步骤B的产物。加热至约50℃，可以用盐酸羟胺和乙酸钠将羰基乙酸酯转化为肟，得到流程2步骤C的产物。然后采用对苯二酚在溶剂如甲苯中加热回流，可以将流程2步骤C的肟产物转化为流程2步骤D的产物(与流程1步骤E相同的产物)。采用有机碱如DMAP和吡啶、在溶剂如二氯甲烷中、于约0-5℃，流程2步骤D的胺产物可以采用乙酰氯的乙酰基保护，得到流程2步骤E的产物。然后可以将流程2步骤E的产物转化为如下所述的流程3步骤A的产物。

流程3

流程2步骤E的产物可以采用酸性条件在羟基上选择性脱保护，例如在溶剂如甲醇和二氯甲烷中加入对甲苯磺酸一水合物或甲酸，得到流程3步骤A的产物。在替代路线中，流程2步骤D的化合物的异噁唑氮可以用乙酰基保护，羟甲基的保护基团可以用两步法除去。例如，流程2步骤D的化合物用有机碱(如DMAP和吡啶)在溶剂(如二氯甲烷)中处理，加入乙酰氯。将温度保持在约10℃以下，然后在约室温下搅拌。将反应物用水稀释，用溶剂如二氯甲烷萃取。有机萃取液用含酸溶液(如1N盐酸)洗涤，水相再用溶剂如二氯甲烷萃取，然后用水洗涤。有机溶剂可以部分除去，可以加入在溶剂(如二氯甲烷和甲醇)中的酸(如甲酸或对甲苯磺酸一水合物)以使得羟甲基脱保护。可以将混合物在室温下搅拌或加热至约40℃直至羟基的脱保护完成，得到流程3步骤A的化合物。流程3步骤A的羟甲基产物可以于0-22℃在溶剂如DMSO中采用氧化剂(如2-碘氧基苯甲酸(IBX))氧化成流程3步骤B的羧酸产物，或者于约5-25℃、在溶剂(如乙腈或乙腈和水)中分次或一次性全部加入(二乙酰氧基碘)苯，同时搅拌，得到流程3步骤B的产物。如果优选的话，也可以使用TEMPO作为氧化催化剂。Weinreb酰胺可以在流程3步骤C中制备，其中偶联剂如CDI分批加入或一次性加入，使用溶剂如二氯甲烷，冷却至-20℃并搅拌约1小时，分次或一次性全部加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐。也可以采用有机碱如三乙胺以促进反应。可以进一步加入CDI和N,O-二甲基羟胺直至观察到反应完全，得到流程3步骤C的Weinreb酰胺产物。可以使用的其它偶联剂包括碳二亚胺如DCC、DIC或EDCI或其它非亲核阴离子的脲鎓盐或鏻盐，例如HATU、HBTU、PyBOP和PyBrOP。流程3步骤D的酮可以由Weinreb酰胺形成，在溶剂如THF中使用有机金属试剂如格氏试剂或有机锂试剂进行。适当的格氏试剂可以作为在溶剂(如醚或2-甲基四氢呋喃)中的溶液于约-78℃至0℃加入到Weinreb酰胺中，得到流程3步骤D的酮。通过于约-78℃至室温下在溶剂如二氯甲烷中，将该酮加入到XtalFluor-中，可以将步骤D的酮转化为二氟甲基，然后滴加三乙胺三氢氟酸盐，得到流程3步骤E的化合物。或者，于约-20℃至10℃，可以将氟化试剂(XtalFluor-)分次加入到流程3步骤D的酮产物中，然后滴加三乙胺三氢氟酸盐(trihydrofluoride)，得到流程3步骤E的产物。另一种替代方法为，在溶剂如二氯甲烷中使用Deoxo-和三氟化乙醚合物，搅拌约2小时，随后加入流程3步骤D的酮和三乙胺三氢氟酸盐，得到流程3步骤E的产物。可以使用的本领域公知的其它氟化剂为二乙氨基三氟化硫(也称为“DAST”)和含有添加剂(例如三乙胺三氢氟酸盐)的XtalFluor-或采用添加剂如HF-吡啶的FLUOLEAD^TM。乙酰基四氢异噁唑可在本领域熟知的酸性条件下脱保护，例如使用盐酸并加热至约100℃，得到流程3步骤F的产物。双环四氢异噁唑可以采用乙酸中的锌处理，形成流程3步骤G的开环产物，其方式类似于流程1步骤F中描述的方法。流程3步骤H的噁嗪产物可以使用溴化氰在溶剂如乙醇中并加热至约85℃制备，形成步骤H的氨基噁嗪环产物。使用碘化铜(I)、L-羟基脯氨酸、无机碱如碳酸钾和氮气与氢氧化铵，可以用氨基取代苯基的5-溴，得到流程3步骤I的产物。

流程4

在流程4步骤A中，可以利用本领域熟知的偶联条件，使得流程3步骤I的苯胺产物与杂芳族羧酸偶联。本领域技术人员应当认识到，存在许多通过羧酸和胺的反应而形成酰胺的方法和试剂。例如，在偶联剂和胺碱(如二异丙基乙胺或三乙胺)存在下，使适当的苯胺与适当的酸反应，得到流程4步骤A的式I化合物。偶联剂包括碳二亚胺(如DCC、DIC、EDCI)和芳族肟类(如HOBt和HOAt)。另外，可以使用非亲核阴离子的脲鎓盐或鏻盐(例如HBTU、HATU、PyBOP和PyBrOP)或环磷酸酐(例如)代替更传统的偶联剂。添加剂例如DMAP可用于增强反应。或者，可以在碱如三乙胺或吡啶存在下，使用适当的芳族酰氯使得苯胺酰化，得到式Ia化合物。

流程5

或者，在流程5步骤A中，可以保护流程3步骤G的胺产物，在两步一锅法反应中形成噁嗪环。在溶剂(如二氯甲烷或THF)中于约5℃至室温的温度下，可以使得胺与异硫氰酸苯甲酰酯反应，得到步骤A的中间体化合物。通过将粗品混合物冷却至约10℃，加入DMSO，然后缓慢加入氯代三甲基硅烷，可以形成噁嗪环，得到步骤B的产物。可以采用氢氧化钠(50％)和漂白剂从反应混合物中除去气体。可以采用5-(三氟甲基)吡啶酰胺、干燥剂如分子筛、无机碱如碳酸钾和碘化钠在溶剂如1,4-二氧六环中，将该溴化物转化成需要的酰胺。可以将氮气鼓泡通过溶液约30分钟。加入碘化铜(I)和二胺或相关配体(如反式外消旋-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺)，将混合物加热至约100-110℃直至反应完成或至多7天，得到流程5步骤B的酰胺产物。噁嗪胺可以通过本领域技术人员已知的条件采用有机碱如吡啶、溶剂如乙醇和O-甲基羟胺盐酸盐在溶剂(例如THF和乙醇)中脱保护，得到式Ia化合物。

以下制备和实施例进一步说明了本发明。

制备1

(2S)-1-三苯甲基氧基丁-3-烯-2-醇

流程1步骤A：将三甲基碘化锍(193.5g,948.2mmol)在THF(1264mL)于室温下搅拌75分钟。将混合物冷却至-50℃，30分钟内通过套管加入正丁基锂(2.5mol/L的己烷溶液,379mL,948.2mmol)。将反应物逐渐温热至-30℃，搅拌60分钟。分次加入(2S)-2-三苯甲基氧基甲基环氧乙烷(100g,316.1mmol)，保持温度低于-10℃。加入完成后，使得反应混合物温热至室温，搅拌2小时。将反应物倒入饱和的氯化铵中，分相，水相用乙酸乙酯萃取。合并有机层，经硫酸镁干燥。过滤并减压浓缩，获得残留物。残留物通过硅胶色谱纯化，采用甲基叔丁基醚:己烷(10-15％梯度)洗脱，获得目标化合物(56.22g,54％)。ES/MS m/z 353(M+Na)。

替代制备1

(2S)-1-三苯甲基氧基丁-3-烯-2-醇

流程2步骤A原料：将三苯基甲基氯(287g,947.1mmol)、DMAP(7.71g,63.1mmol)和三乙胺(140g,1383.5mmol)加至(2S)-丁-2-烯-1,2-二醇(根据JACS,1999,121,8649制备)(64.5g,631mmol)的二氯甲烷(850mL)溶液中。于24℃搅拌24小时。加入1N柠檬酸水溶液(425mL)。分层，将有机萃取液减压浓缩至干。加入甲醇(900mL)，冷却至5℃1小时。过滤收集固体，用5℃甲醇(50mL)洗涤。弃去固体，将母液减压浓缩至干。加入甲苯(800mL)，浓缩至重量为268g，获得目标化合物(129g,67％)，为48wt％的甲苯溶液。

制备2

1-吗啉代-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酮

流程2步骤A：将四丁基硫酸氢铵(83.2g,245.0mmol)和4-(2-氯代乙酰基)吗啉(638.50g,3902.7mmol)加至0-5℃的1-三苯甲基氧基丁-3-烯-2-醇(832.4g,2519mmol)的甲苯(5800mL)溶液中。加入氢氧化钠(1008.0g,25.202mol)的水(1041mL)溶液。于0-5℃搅拌19小时。加入水(2500mL)和甲苯(2500mL)。分层，用水(2×3500mL)洗涤有机萃取液。将有机萃取液减压浓缩至干。向残留物中加入甲苯(2500mL)，然后缓慢加入正-庚烷(7500mL)。搅拌16小时。过滤收集获得的固体，用正-庚烷(1200mL)洗涤。真空干燥固体，获得目标化合物(1075.7g,98％)。

制备3

1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酮

流程2步骤B：将1.3M异丙基氯化镁氯化锂复合物(3079mL,2000mmol)的THF溶液加至4-溴-1-氟-2-碘苯(673.2g,2237.5mmol)的甲苯(2500mL)溶液中，加入的速度应当保持反应温度低于5℃。搅拌1小时。将获得的格林溶液(5150mL)加至1-吗啉代-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酮(500g,1093mmol)的甲苯(5000mL)溶液中，加入的速度应当保持反应温度低于5℃。搅拌3小时，保持温度低于5℃。加入额外制备的格林溶液(429mL)，搅拌1小时。加入1N柠檬酸水溶液(5000mL)，加入的速度应当保持温度低于5℃。分层，用水(5000mL)洗涤有机萃取液。将溶液减压浓缩至干。向残留物中加入甲醇(2000mL)，浓缩获得为残留物的目标化合物(793g,73.4％效力(potency),83％)。

制备4

1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酮肟

流程2步骤C：将盐酸羟胺(98.3g)加至1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酮(450g,707mmol)和乙酸钠(174g)的甲醇(3800mL)溶液中。将溶液加热至50℃2小时。冷却至24℃并浓缩。向残留物中加入水(1000mL)和甲苯(1500mL)。分层，用甲苯(500mL)萃取水相。合并有机萃取液，用水(2×400mL)洗涤。将溶液减压浓缩，获得为残留物的目标化合物(567g,61.4％效力,88％)。

制备5

2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酸叔丁基酯

流程1步骤B：将(2S)-1-三苯甲基氧基丁-3-烯-2-醇(74.67g,226.0mmol)加至四-N-丁基硫酸铵(13.26g,22.6mmol)的甲苯(376mL)溶液中。加入氢氧化钠(50％重量)的水(119mL)溶液，随后加入2-溴乙酸叔丁基酯(110.20g,565.0mmol)。于室温下搅拌反应混合物18小时。倒入水中，分离相，用乙酸乙酯萃取水相。合并有机层，经硫酸镁干燥。过滤混合物并减压浓缩，获得目标化合物(77.86g,77％)。ES/MS m/z 467(M+Na)。

制备6

(1E)-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙醛肟

流程1步骤C：将2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酸叔丁基酯(77.66g,174.7mmol)的二氯甲烷(582.2mL)溶液冷却至-78℃。35分钟内滴加二异丁基氢化铝的己烷溶液(1mol/L,174.7mL)，保持温度低于-70℃。于-78℃搅拌5小时。向反应混合物中滴加盐酸水溶液(2mol/L,192.1mL)，保持温度低于-60℃。将反应物逐渐温热至室温，搅拌60分钟。分离有机萃取物，用饱和的碳酸氢钠洗涤。将溶液用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，获得粗品。将残留物溶于二氯甲烷。加入乙酸钠(28.66g,349.3mmol)，随后加入盐酸羟胺(18.21g,262.0mmol)。于室温下搅拌18小时。倒入水中，分离相，用二氯甲烷萃取水相。合并有机层，经硫酸镁干燥。过滤混合物并减压浓缩，获得目标化合物(68.38g,101％)。ES/MSm/z 386(M-H)。

制备7

(3aR,4S)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑

流程1步骤D：将(1E)-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙醛肟(55.57g,143.4mmol)的叔-丁基甲醚(717mL)溶液冷却至5℃。滴加次氯酸钠(5％的水溶液,591mL,430.2mmol)，保持温度低于10℃。于10℃搅拌30分钟。使得反应物温热至15℃。于15℃搅拌18小时。用乙酸乙酯稀释反应混合物，用饱和的碳酸氢钠洗涤。分离相，有机相用5％亚硫酸氢钠溶液和盐水洗涤并干燥。将溶液经硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，获得残留物。残留物通过硅胶色谱纯化，采用50％甲基叔-丁基醚/二氯甲烷:己烷(20-27％梯度)洗脱，获得目标化合物(35.84g,65％)。ES/MS m/z 408(M+Na)。

制备8

(3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑

流程1步骤E：将4-溴-1-氟-2-碘-苯(86.94g,288.9mmol)的THF(144.5mL)溶液和甲苯(1445mL)冷却至-78℃。滴加正丁基锂(2.5M的己烷溶液,120mL,288.9mmol)，保持温度低于-70℃。于-78℃搅拌30分钟。滴加三氟化硼乙醚合物(36.5mL,288.9mmol)，保持温度低于-70℃。将溶液于-78℃搅拌30分钟。30分钟内，将(3aR,4S)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑(55.69g,144.5mmol)的THF(482mL)溶液滴加至反应物中，保持温度低于-65℃。于-78℃搅拌90分钟。快速加入饱和的氯化铵，保持温度低于-60℃。倒入盐水中，水相用乙酸乙酯萃取。合并有机萃取液，经硫酸镁干燥。过滤并减压浓缩，获得残留物。残留物通过硅胶色谱纯化，采用10-15％乙醚:己烷(0-70％梯度)洗脱，获得目标化合物(36.52g,45％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)560/562[M+H]。

替代制备8

流程2步骤D：将1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲基氧基甲基)烯丙氧基]乙酮肟(458g,502mmol)和对苯二酚(56.3g 511mmol)的甲苯(4000mL)溶液在氮气环境中加热至回流27小时。将溶液冷却至24℃，加入碳酸钠水溶液(800mL)。分层，水相用甲苯(300mL)萃取。合并有机萃取液，用水(2×500mL)洗涤。将溶液减压浓缩，获得残留物。加入异丙醇(1500mL)并加热至回流。冷却至24℃，过滤收集固体。将固体真空干燥，获得目标化合物(212g,75％)。

制备9

1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-1-基]乙酮

流程2步骤E：在氮气环境中，将乙酰氯(35.56g,503.9mmol)加至(3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑(235.3g,420mmol)、DMAP(5.13g,42.0mmol)和吡啶(66.45g,840.1mmol)的二氯甲烷(720mL)溶液中，保持内部温度低于5℃。搅拌1小时，然后加入水(300mL)和1M硫酸(300mL)。搅拌混合物10分钟，使各层分离。收集有机萃取液，用饱和的碳酸钠(500mL)和水(500mL)洗涤。用硫酸镁干燥溶液。过滤并减压浓缩，得到目标化合物(235g，93％)，为灰色固体。

制备10

1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羟基甲基)四氢-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮

流程3步骤A：在20L夹套反应器中，在氮气环境中，将乙酰氯(290mL,4075mmol)加至(3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑(1996g,3384mmol)、DMAP(56.0g,458mmol)、吡啶(500mL,6180mmol)的二氯甲烷(10L)溶液中，保持内部温度低于10℃。加入完成后(1小时)，温热至20℃并搅拌过夜。如果反应不完全，加入乙酰氯、DMAP、吡啶和二氯甲烷，直至观察到反应完全。将反应混合物冷却至0℃，缓慢加入水(5L)，于10℃将反应混合物搅拌30分钟，分离各层。收集有机萃取液，用二氯甲烷(1L)洗涤水相。用1N盐酸水溶液(2×4L)洗涤合并的有机萃取液，用二氯甲烷(2×1L)萃取水相。合并的有机萃取液用水(4L)洗涤，减压除去溶剂，得到总体积约为5L。加入90％甲酸(1800mL)，将混合物在室温下放置3天。温热至40℃2小时，然后减压除去溶剂。用甲醇(4L)稀释残留物，缓慢加入饱和的碳酸钠水溶液(3L)。加入固体碳酸钠(375g)将pH调节至8-9。于45℃搅拌1小时，然后冷却至室温。过滤除去固体，用甲醇(4×500mL)洗涤，然后用2N氢氧化钠水溶液(100mL)处理，于室温下静置1小时。过滤除去固体，用甲醇(2×100mL)洗涤。减压蒸发溶剂，将残留物在乙酸乙酯(5L)和水(2L)之间分配。用乙酸乙酯(2L)萃取水相，用盐水(2×1L)洗涤合并的有机萃取物。减压除去溶剂，加入甲基叔丁基醚(2.5L)，蒸发至干。加入甲基叔丁基醚(4L)，于65℃搅拌1小时，冷却至室温，过滤收集固体，用甲基叔丁基醚(3×500mL)洗涤。真空干燥成米色固体。将该固体在甲苯(7.5L)中加热至110℃直至完全溶解，在1小时内冷却至18℃，于该温度下搅拌1小时。温热至40℃，当形成沉淀时，再次冷却至18℃。搅拌45分钟，然后通过过滤收集固体，用甲苯(2×500mL)洗涤。真空干燥固体，得到目标化合物(443.1g，36％，LCMS纯度95％)。真空蒸发滤液，得到粗品。残留物通过硅胶快速色谱纯化，用20％-100％乙酸乙酯的异己烷溶液洗脱。将含有产物的组分在甲基叔丁基醚(2L)中于60℃浆化30分钟，冷却至室温，通过过滤收集固体，用甲基叔丁基醚(2×200mL)洗涤。真空干燥固体，得到目标化合物，为米色结晶固体(304g，24％，LCMS纯度88％)。真空蒸发滤液至残留物。残留物通过硅胶快速色谱纯化，用20％-100％乙酸乙酯的异己烷溶液洗脱，得到目标化合物(57.8g,5％,LCMS纯度88％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)360.0/362.0[M+H]。

替代制备10

流程3步骤A：将1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲基氧基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-1-基]乙酮(69g,114.5mmol)加至15℃的对-甲苯磺酸一水合物(2.2g,11.45mmol)、二氯甲烷(280mL)和甲醇(700mL)的溶液中。搅拌18小时，然后减压除去溶剂。残留物用二氯甲烷(350mL)稀释，加入1M碳酸钠水溶液(140mL)和水(140mL)。分离各层，减压蒸发有机层。向残留物中加入甲苯(350mL)并加热回流1小时。以10℃/小时的速率冷却至10-15℃。过滤收集固体，用甲苯(70mL)洗涤。真空干燥固体，得到目标化合物(30g，65％)，为灰色固体。

制备11

(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-4-甲酸

流程3步骤B：在20L夹套反应器中，将水(2L)加至1-[(4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-1-基]乙酮(804.9g,2177mmol)、TEMPO(40.0g,251mmol)在乙腈(4.5L)中的悬浮液中，冷却至内部温度5℃。在30分钟内分次加入(二乙酰氧基碘)苯(1693g，4993.43mmol)。使用反应器冷却控制放热，然后保持在20℃直至LCMS显示反应完全。在室温下缓慢加入亚硫酸氢钠(70g，672.68mmol)在水(300mL)中的悬浮液，保持内部温度低于25℃。搅拌30分钟，然后冷却至5℃。加入水(2L)，然后在1小时内缓慢加入47wt％氢氧化钠水溶液(780mL)，保持内部温度低于10℃。加入乙酸乙酯(2L)和异己烷(5L)，剧烈搅拌并分层。用水(1L)萃取双相有机层，用甲基叔丁基醚(2.5L)洗涤合并的水溶液。将含水萃取物冷却至5℃，在30分钟内缓慢加入37％盐酸(1.4L)，保持内部温度约5℃。加入乙酸乙酯(5L)，分层，用盐水(3×1L)洗涤有机物。用乙酸乙酯(2.5L)萃取合并的含水萃取物，用盐水(1L)洗涤合并的有机物，然后用硫酸钠干燥并过滤。用庚烷(2.5L)稀释有机物，减压蒸发至干。加入甲基叔丁基醚(1.5L)和庚烷(1.5L)，蒸发至干。加入庚烷(2.5L)，蒸发至干两次。加入庚烷(500mL)和甲基叔丁基醚(500mL)，于40℃搅拌30分钟，然后通过过滤收集沉淀物，用庚烷/甲基叔丁基醚(1:1,1L)洗涤，然后用甲基叔丁基醚(3×300mL)洗涤，空气干燥，得到目标化合物，为米色结晶固体(779g,91％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)374.0/376.0[M+H],[α]²⁰ _D-19.0°(c 1.004,氯仿)。

替代制备11

流程3步骤B：将水(150mL)和乙腈(150mL)加至1-[(4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟基甲基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-1-基]乙酮(30g,73.3mmol)、TEMPO(1.14g,7.30mmol)和(二乙酰氧基碘)苯(51.9g,161mmol)的溶液中。冷却至15℃，搅拌2小时。在室温下缓慢加入硫代硫酸钠(21g)和碳酸钾(22g)的水(150mL)溶液。搅拌1小时，然后加入甲基叔丁基醚(150mL)。分离各层，用浓硫酸将水层的pH调节至2-3。加入乙酸乙酯(150mL)并分层。减压蒸发有机层至干。加入正庚烷(90mL)并加热回流1小时。冷却至15℃，然后通过过滤收集沉淀物，用正庚烷(90mL)洗涤。真空干燥，得到目标化合物，为白色固体(27g,98％)。

制备12

(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基四氢-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-4-甲酰胺

流程3步骤C：在10L夹套反应器中，在氮气环境中，将(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-4-甲酸(771g,2019mmol)的二氯甲烷(7.0L)溶液冷却至0℃，40分钟内分次加入CDI(400g,2421mmol)。将反应器夹套冷却至-20℃并搅拌1小时，然后在约30分钟内分次加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐(260.0g，2612mmol)。于-20℃搅拌1小时，于0℃搅拌2小时，于10℃搅拌7小时。加入CDI(175g，1058mmol)，于10℃搅拌过夜。于10℃再加入CDI(180g，1088mmol)并搅拌1小时，然后加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐(140g，1407mmol)，继续在10℃下搅拌。如果反应不完全，可以进一步加入CDI，然后加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐直至观察到完全反应。将反应混合物冷却至5℃，用1N盐酸水溶液(5L)洗涤，然后用2N盐酸水溶液(5L)洗涤。用二氯甲烷(1L)萃取合并的水溶液，合并有机萃取液，用水(2.5L)、1N氢氧化钠水溶液(2.5L)和水(2.5L)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，减压蒸发得到残留物。加入甲基叔丁基醚(3L)并减压蒸发。再加入甲基叔丁基醚(2L)并于50℃搅拌1小时，冷却至25℃，搅拌30分钟。过滤收集获得的固体，用甲基叔丁基醚(2×500mL)洗涤并真空干燥，得到目标化合物(760g，88％)，为白色固体。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)417.0/419.0[M+H]。

替代制备12

流程3步骤C：在氮气环境中，将(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-4-甲酸(27g,70.7mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(135mL)溶液冷却至0℃，加入CDI(14.9g,91.9mmol)。搅拌1小时，然后加入N,O-二甲基盐酸羟胺(9.0g,92mmol)和三乙胺(14.3g,141mmol)。于15℃搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃，加入0.5M硫酸水溶液(675mL)。搅拌1小时。过滤收集获得的固体。将固体在甲基叔-丁基醚(90mL)中浆化1小时。过滤收集固体，用甲基叔-丁基醚(30mL)洗涤。真空干燥，获得固体目标化合物(23g,78％)。

制备13

1-[(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-4-基]乙酮

流程3步骤D：在20L夹套反应器中，将(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基四氢-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-4-甲酰胺(654.0g,1536mmol)的THF(10L)溶液冷却至-60℃，滴加3.2M甲基溴化镁的2-甲基四氢呋喃溶液(660mL,2110mmol)，同时保持内部温度低于-40℃。将反应混合物于-40℃搅拌30分钟，然后冷却至-50℃，加入1N盐酸水溶液(2L)的THF(2L)溶液，保持内部温度低于-38℃。将温度升至10℃，加入乙酸乙酯(5L)和水(1L)，搅拌并使内部温度达到5℃，分层。用乙酸乙酯(1L)萃取水层，合并有机萃取物。用水(2L)洗涤有机萃取物，用乙酸乙酯(1L)萃取水层。合并有机萃取物，用盐水(3×2L)洗涤，然后用硫酸镁干燥，过滤，减压蒸发得到残留物。加入环己烷(2.5L)，于60℃搅拌1小时，然后于20℃搅拌30分钟，过滤收集固体，用环己烷(500mL)洗涤。真空干燥固体，得到目标化合物，为白色固体(565g,99％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)372.0/374.0[M+H],[α]²⁰ _D-58.0°(c 1.000,氯仿)。

替代制备13

流程3步骤D：将(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基四氢-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-4-甲酰胺(4.0g,9.59mmol)的THF(60mL)溶液冷却至-5℃，滴加3.0M甲基溴化镁的2-甲基四氢呋喃溶液(5.0mL，15mmol)，同时保持内部温度在-5和0℃之间。将反应混合物在-5和0℃之间搅拌60分钟，然后加入饱和氯化铵溶液(20mL)。加入甲基叔丁基醚(40mL)，使内部温度达到5℃并分层。减压蒸发有机层至残留物。加入正庚烷(50mL)，搅拌，过滤收集固体。真空干燥固体，得到固体目标化合物(3.0g,77％)。

制备14

1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(1,1-二氟乙基)四氢-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮

流程3步骤E：于0-5℃将1-[(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-4-基]乙酮(5.08g,13.6mmol)一次性加至搅拌的XtalFluor-(10.02g,39.18mmol)的无水二氯甲烷(100mL)悬浮液中。将混合物搅拌10分钟,在10分钟内滴加三乙胺三氢氟酸盐(4.5mL，27mmol)。将反应混合物在冰浴中搅拌8小时，然后温热至室温，搅拌过夜。加入饱和的碳酸钠水溶液(100mL)，搅拌1小时。分离各层，用二氯甲烷(2×50mL)萃取水层。合并有机萃取物，用饱和的碳酸氢钠水溶液(100mL)、2N盐酸水溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤。蒸发至干，得到浅棕色固体，于60℃溶于甲基叔丁基醚(300mL)中。过滤热溶液并蒸发滤液，得到棕色固体(5.3g，81％，LCMS纯度82％)，其无需进一步纯化即可使用。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)393.8/395.8[M+H]。

替代制备14

流程3步骤E：于-14℃将XtalFluor-(1.21kg,4.73mol)分次加至搅拌的1-[(3aR,4S,6aS)-1-乙酰基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢呋喃并[3,4-c]异噁唑-4-基]乙酮(565g,1.51mol)的无水二氯甲烷(5L)溶液中。将混合物搅拌10分钟，20分钟内滴加三乙胺三氢氟酸盐(550g,3.34mol)。将反应混合物于-10℃搅拌约10小时，然后温热至室温，搅拌过夜。缓慢加入50％氢氧化钠水溶液(750mL)，保持内部温度低于10℃，然后加入水(1.5L)和饱和的碳酸氢钠水溶液(1L)，搅拌30分钟。分离各层，用二氯甲烷(1L)萃取水层。合并有机萃取物，用盐水(3L)、2N盐酸水溶液(5L)和盐水(3L)洗涤。蒸发得到残留物，通过硅胶色谱纯化，用50-100％二氯甲烷的异己烷溶液洗脱，然后用10％甲基叔丁基醚的二氯甲烷溶液洗脱，得到目标化合物，为白色粉末(467g，73％，LCMS纯度94％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)393.8/395.8[M+H]。

制备15

(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(1,1-二氟乙基)-3,3a,4,6-四氢-1H-呋喃并[3,4-c]异噁唑

流程3步骤F：在10L夹套反应器中，将37wt％盐酸水溶液(1.3L,16mol)加至1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(1,1-二氟乙基)四氢-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮(570g,1.45mol)的1,4-二氧六环(5L)溶液中，于100℃搅拌约3小时或直至LCMS显示反应完全。将反应混合物冷却至10℃，用水(1L)稀释，缓慢加入50wt％氢氧化钠水溶液(800mL)和水(1L)的混合物，保持内部温度低于20℃。加入乙酸乙酯(2.5L)并剧烈搅拌，然后分离各层，用盐水(2L)、另外的盐水(1L)和水(1L)洗涤有机相。用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩至干，得到残留物。加入环己烷(2.5L)，蒸发至干，然后重复，得到目标化合物，为棕色油状物(527g，89％，LCMS纯度86％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)351.8/353.8[M+H]。

制备16

[(2S,3R,4S)-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)-2-(1,1-二氟乙基)四氢呋喃-3-基]甲醇

流程3步骤G：于室温下，将锌粉(6.0g,92mmol)加至(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(1,1-二氟乙基)-3,3a,4,6-四氢-1H-呋喃并[3,4-c]异噁唑(5.06g,13.4mmol)的乙酸(100mL)溶液中，搅拌过夜。用乙酸乙酯(200mL)和水(300mL)稀释混合物并剧烈搅拌，同时加入碳酸钠(97g,915mmol)。分层，与盐水(2×200mL)洗涤有机层，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩，获得残留物。残留物通过硅胶色谱纯化，用0％-100％甲基叔-丁基醚的异己烷溶液洗脱，获得为蜡状固体的目标化合物(4.67g,89％,90％purity by LCMS)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)354.0/356.0[M+H]。

替代制备16

流程3步骤G：于20℃将锌粉(200g,3.06mol)分次加至(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(1,1-二氟乙基)-3,3a,4,6-四氢-1H-呋喃并[3,4-c]异噁唑(304g,75％纯度,647mmol)的乙酸(2L)和水(2L)的溶液中，然后温热至40℃，搅拌过夜。将混合物用水稀释(2L)，剧烈搅拌，同时加入碳酸钠(4kg，43.4mol)，然后用另外的碳酸钠调节至pH 8-9。加入乙酸乙酯(5L)和水(2.5L)，搅拌30分钟，通过硅藻土过滤，用2:1的乙腈/水洗涤。分层，用乙酸乙酯(2×2.5L)萃取水层，用盐水(2×2.5L)洗涤合并的有机萃取物，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到残留物。残留物用SFC柱纯化：Chiralpak AD-H(5)，50×250mm；洗脱液：12％乙醇(在CO₂中含有0.2％二乙基甲胺)；流速：340g/分钟，UV 220nm检测，得到目标化合物，为白色固体(197.7g,84％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)354.0/356.0[M+H],[α]²⁰ _D-6.93°(c0.678,氯仿)。

制备17

(4aR,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-2-胺

流程3步骤H：将[(2S,3R,4S)-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)-2-(1,1-二氟乙基)四氢呋喃-3-基]甲醇(1.51g,4.24mmol)溶于乙醇(22.3mL)，然后加入溴化氰(1.30mL,6.50mmol,5M的乙腈溶液)。将获得的溶液置于预热的85℃油浴中。于85℃搅拌10小时。冷却至室温，然后加入饱和的碳酸氢钠。分离各相，用乙酸乙酯和二氯甲烷萃取。用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，过滤，减压浓缩，得到目标化合物(1.41g,87％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)379/381[M+H]。

制备18

(4aR,5S,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-2-胺

流程3步骤I：将碘化铜(I)(0.71g,3.74mmol)、L-羟基脯氨酸(0.99g,7.50mmol)、碳酸钾(1.56g,11.20mmol)和(4aR,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-2-胺(1.42g,3.72mmol)溶于DMSO(20mL)。将氮气鼓泡通过表面10分钟。加入氢氧化铵(29％wt/wt水溶液，3.0mL，20mmol)，加热至85℃14小时。冷却至室温，加入饱和的碳酸氢钠。分离各相，用二氯甲烷萃取。合并有机萃取物，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶色谱法纯化，用1-10％梯度的[7N NH₃的甲醇溶液]:二氯甲烷洗脱，得到目标化合物(0.72g,58％)。ES/MS m/z 316[M+H].

制备19

5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺

将5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酸(67.5g,353mmol)溶于1,4-二氧六环(700mL)，于室温下搅拌。向该溶液中缓慢加入亚硫酰氯(80mL,1090mmol)，然后内部温度温热至65℃，搅拌19小时。蒸发反应混合物至干，用1,4-二氧六环稀释至总体积为400mL。将该溶液加入冷却至5℃的搅拌的氢氧化铵水溶液(35wt％，1.6L)中，搅拌1小时。过滤收集沉淀物，用水(3×250mL)、异己烷(3×250mL)洗涤，于50℃真空干燥，得到目标化合物，为白色固体(58.37g,86％)。ES/MS m/z 191.0(M+H)。

制备20

N-[(4aR,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4a,5,7,7a-四氢-4H-呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-2-基]苯甲酰胺

流程5步骤A：于18℃、氮气环境中，将[(2S,3R,4S)-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)-2-(1,1-二氟乙基)四氢呋喃-3-基]甲醇(580g,1621mmol)溶于二氯甲烷(5L)，加入异硫氰酸苯甲酰基酯(345g,2114mmol)，搅拌过夜。将反应混合物冷却至10℃，连接含有浓度为50％w/w氢氧化钠(250mL，3eq)和漂白剂(4L，～2eq)的洗涤器，从反应混合物中吸取气体。向反应混合物中加入DMSO(150mL，2110mmol)，然后缓慢加入氯代三甲基硅烷(250mL，1930mmol)，于10℃搅拌1小时。加入碳酸钠(500g，4717.52mmol)的水(3L)溶液，搅拌30分钟，然后分层。用水(2L)洗涤有机层，用二氯甲烷(2.5L)萃取水层。合并有机萃取物，蒸发成残留物。用甲醇(4L)稀释残留物，于40℃搅拌溶液1小时，通过硅藻土(500g)过滤，用甲醇(4×500mL)洗涤。蒸发至残留物，加入乙腈(3L)。将溶液于40℃搅拌1小时，通过硅藻土(500g)过滤，用乙腈(4×500mL)洗涤，然后蒸发滤液，得到棕色泡沫状物。粗品产物通过硅胶色谱纯化，用0-30％乙酸乙酯的异己烷溶液洗脱，得到目标化合物(860g,纯度87％)。ES/MS m/z(⁷⁹Br/⁸¹Br)483.0/485.0[M+H]。

制备21

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-苯甲酰氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺

流程5步骤B：将无水1,4-二氧六环(1.4L)加至N-[(4aR,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4a,5,7,7a-四氢-4H-呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-2-基]苯甲酰胺(135.3g,纯度87％,243.6mmol)、分子筛(21.6g)、5-(三氟甲基)吡啶酰胺(61.21g,318.6mmol)、碳酸钾细粉(61.5g,445mmol)和碘化钠(62.0g,413.6mmol)中，将氮气鼓泡通过反应混合物30分钟。加入-N,N’-二甲基环己烷-1,2-二胺(12mL,76.1mmol)和碘化铜(I)(9.3g,49mmol)，继续将氮气鼓泡通过该溶液10分钟。搅拌混合物，在氮气下加热至内部温度109℃7天。将反应混合物冷却至室温，用饱和的氯化铵水溶液(1L)稀释反应混合物。搅拌3小时，通过硅藻土过滤。用饱和的氯化铵水溶液(500mL)和乙酸乙酯(4×250mL)洗涤滤液。分离各层，用饱和的氯化铵水溶液(500mL)洗涤有机层，用浓氢氧化铵(200mL)的水(300mL)溶液洗涤两次。蒸发有机层至干，加入甲苯(1L)，蒸发至残留物。加入异丙醇(500L)，蒸发至干。加入异丙醇(1.5L)，于70℃搅拌30分钟，冷却至室温过夜。过滤收集固体，用异丙醇(2×200mL)洗涤。真空干燥固体，得到目标化合物，为米色固体(103.6g,70％)。ES/MS m/z593.2(M+H),[α]²⁰D-208.43(c 0.5,氯仿)。

实施例1

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺

流程4步骤A：将5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酸(0.040g,0.21mmol)溶于乙腈(2mL)，然后加入草酰氯(14.7μL,0.16mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(1滴)。于室温下、氮气环境中搅拌1小时。减压浓缩，采用乙腈(2mL)重构，加至下面所述的50℃溶液中。在分离容器中，加入(4aR,5S,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-2-胺(0.040g,0.13mmol)、乙醇(2mL)和水(2mL)。将混合物加热至50℃，搅拌1小时。加入饱和的碳酸氢钠、乙酸乙酯，分离相。用乙酸乙酯萃取水相。合并有机萃取液，经硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，获得残留物。残留物采用硅胶色谱纯化，采用0-2％梯度的7NNH₃的甲醇:二氯甲烷洗脱，获得目标化合物(0.052g,81％)。ES/MS m/z 489[M+H]。

替代制备实施例1

流程5步骤C：将二氯甲烷(500mL)加至搅拌的N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-苯甲酰氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺(103.6g,169.6mmol)、O-甲基盐酸羟胺(35.54g,425.5mmol)和吡啶(70mL,865mmol)的乙醇(600mL)悬浮液。于室温下搅拌46小时，蒸发至残留物。将残留物溶于二氯甲烷(1L)中，加入5N盐酸水溶液(500mL)，搅拌10分钟，加入饱和的氯化钠水溶液(600mL)和庚烷(1L)。再搅拌15分钟，过滤收集获得的沉淀，用饱和的氯化钠水溶液(4×200mL)和二氯甲烷/庚烷(1:1,4×200mL)洗涤，得到湿的米色固体(143g)，为粗品目标化合物。向该物质中加入在乙酸乙酯(1L)和饱和的碳酸氢钠水溶液(500mL)中的以基本上相同的方法预先制备的目标化合物(19.8g，纯度91％，37.0mmol)。搅拌30分钟直至所有固体溶解。分离各层，用乙酸乙酯(500mL)萃取水层。用饱和的氯化钠水溶液(2×200mL)洗涤有机物，蒸发至干，得到米色固体。将残留物于60℃搅拌溶解在甲醇(1L)中，在10分钟内缓慢加入水(1L)，然后搅拌悬浮液，使其冷却至室温过夜。过滤收集晶体，用甲醇/水(1:1,2×300mL)洗涤。然后于室温下将固体在甲醇/水(1:1,1L)中搅拌2小时，过滤收集沉淀物，用甲醇/水(1:1,2×100mL)洗涤。于45℃真空干燥固体，得到目标化合物，为浅米色粉末(88.8g)。ES/MS m/z 593.2(M+H),[α]²⁰ _D+81.54(c 1.0,氯仿)。

实施例1A

N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺4-甲基苯磺酸盐

将N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺(1g,2.048mmol)与乙醇(10mL)一起搅拌。将悬浮液加热至60℃，分次加入乙醇(10mL)。在15分钟内将溶液加热至90℃，得到澄清溶液。加入对甲苯磺酸一水合物(400mg，2.082mmol)的乙醇(1mL)溶液，用乙醇(1mL)冲洗容器。将溶液用目标化合物(约5mg)种晶。将溶液在1小时内冷却至室温，于10℃搅拌15分钟。过滤获得的沉淀物，用乙醇(2×2mL)洗涤固体，真空干燥45分钟，得到目标化合物(0.972g,1.47mmol)。

实施例1A的X-射线粉末衍射(XRD)

结晶固体的XRD图谱在Bruker D4Endeavor X射线粉末衍射仪上获得，其配备有CuKa和Vantec检测器，以35kV和50mA操作。样品以2θ在4-40°之间扫描，2θ步幅为0.009°，扫描速率为0.5秒/步，具有0.6mm发散、5.28固定防散射和9.5mm检测器狭缝。将干粉填充在石英样品架上，使用载玻片获得光滑的表面。于环境温度和相对湿度下收集晶形衍射图谱。在结晶学领域中众所周知的是，对于任何给定的晶形，衍射峰的相对强度可能由于例如晶体形态和习性等因素导致的优选取向而变化。在存在优选取向的影响的情况下，峰值强度发生改变，但多晶型物的特征峰位置不变。参见，例如，美国药典第23版,国家处方集(The United States Pharmacopeia#23，National Formulary#18)，第1843-1844页,1995。此外，在结晶学领域中众所周知，对于任何给定的晶形，角峰位置(angular peakpositions)可略微变化。例如，峰位置可能由于分析样品时的温度或湿度的变化、样品移动或内标的存在与否而移位。在本发明中，2θ中±0.2的峰位置变化将考虑这些潜在的变化而不妨碍所指示的晶形的明确识别。可以根据特征峰的任何独特组合(以°2θ为单位)来确认晶形，通常是更显著的峰。在环境温度和相对湿度下收集的晶形衍射图谱根据在8.853和26.774度2θ处的NIST 675标准峰调节。

制备的结晶样品N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺4-甲基苯磺酸盐的特征在于在采用CuKa辐射获得的XRD图谱上具有如下表1中所述的衍射峰(2-θ值)，特别是具有4.9°的峰以及一或多个选自9.8°、28.0°和14.7°的峰的组合；具有0.2度的衍射角公差。

表1：实施例1A的X-射线粉末衍射峰

体外试验方法

为了评估BACE1相对于BACE2的选择性，采用如下所述的BACE1和BACE2的特异性底物在FRET分析中评估试验化合物。对于体外酶和细胞试验，在DMSO中制备试验化合物，得到10mM储备液。在进行体外酶和全细胞试验之前，在96孔圆底板中将储备液在DMSO中连续稀释以获得十点稀释曲线，最终化合物浓度范围为10μM至0.05nM。

体外蛋白酶抑制试验：

huBACE1:Fc和huBACE2:Fc的表达

通过RT-PCR从全脑cDNA克隆人BACE1(登录号：AF190725)和人BACE2(登录号：AF204944)。将对应于氨基酸序列#1至460的核苷酸序列插入编码人IgG1(Fc)多肽的cDNA中(Vassar等,Science,286,735-742(1999))。在pJB02载体中构建BACE1(1-460)或BACE2(1-460)与人Fc的融合蛋白，分别命名为huBACE1:Fc和huBACE2:Fc。人BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)和人BACE2(1-460):Fc(huBACE2:Fc)在HEK293细胞中瞬时表达。将每种构建体的cDNA(250μg)与Fugene 6混合并加入1升HEK293细胞中。转染后4天，收获条件培养基(conditioned media)用于纯化。huBACE1:Fc和huBACE2:Fc通过如下所述的蛋白A色谱纯化。将酶以小等分试样储存于-80℃。(参见Yang等,J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。

huBACE1:Fc和huBACE2:Fc的纯化

收集采用huBACE1:Fc或huBACE2:Fc cDNA瞬时转染的HEK293细胞的条件培养基。通过0.22μm无菌滤器过滤条件培养基除去细胞碎片。将蛋白A-琼脂糖(5ml)(床体积)加入条件培养基(4升)中。将该混合物于4℃轻柔搅拌过夜。收集蛋白A-琼脂糖树脂，填充到低压色谱柱中。用20×床体积的PBS以每小时20ml的流速洗涤该柱。结合的huBACE1:Fc或huBACE2:Fc蛋白用pH 3.6的50mM乙酸洗脱，流速为20ml/小时。立即用pH6.5的乙酸铵(0.5ml，200mM)中和洗脱液的组分(1ml)。通过在4-20％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE中的电泳评估最终产物的纯度。将酶以小等分试样储存于-80℃。

BACE1FRET试验

如上所述制备试验化合物的系列稀释液。将化合物在KH₂PO₄缓冲液中进一步稀释20倍。将每种稀释液(10μL)加入到含有反应混合物的相应的低蛋白质结合黑色板的A至H行的每个孔中(25μL的50m KH₂PO₄,pH4.6，1mMX-100，1mg/mL BSA和基于APP序列的15μM的FRET底物)(参见Yang等,J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。将内容物在板振荡器上充分混合10分钟。将在KH₂PO₄缓冲液中的BACE1(1-460):Fc(15μL的200pM)(参见Vasser等,Science,286,735-741(1999))加入到含有底物和试验化合物的板中从而引发反应。在板振荡器上短暂混合后，在激发波长355nm和发射波长460nm处记录时间为0的混合物的RFU。用铝箔覆盖反应板，于室温下保持在黑暗潮湿的烘箱中16至24小时。用与时间为0时使用的相同激发和发射设定记录温育结束时的RFU。时间为0和温育结束时RFU的差异代表化合物处理下BACE1的活性。将RFU差异相对于抑制剂浓度作图，使用四参数逻辑方程拟合曲线，获得IC₅₀值。(May等,Journal of Neuroscience,31,16507-16516(2011))。

基本上如上所述测试实施例1的化合物，其BACE1的IC₅₀为11.9nM+3.5,n＝12(平均值+平均值的标准差)。该数据表明实施例1的化合物能够在体外抑制纯化的重组BACE1酶活性。

BACE2 TMEM27 FRET试验

如上所述制备试验化合物的系列稀释液。将化合物在KH₂PO₄缓冲液中进一步稀释20倍。将每种稀释液(10μL)加入到含有反应混合物的相应的低蛋白质结合黑色板的A至H行的每个孔中(25μL的50m KH₂PO₄,pH4.6，1mMX-100，1mg/mL BSA和5μM的TMEMFRET底物)(dabcyl-QTLEFLKIPS-LucY,WO 2010063640A1))。然后将在KH₂PO₄缓冲液中的15μL的20μM BACE2(1-460):Fc(参见Vasser等,Science,286,735-741(1999))加入到含有底物和试验化合物的板中从而引发反应。将内容物在板振荡器上充分混合10分钟。在激发波长430nm和发射波长535nm处记录时间为0的混合物的RFU。用铝箔覆盖反应板，于室温下保持在黑暗潮湿的烘箱中16至24小时。用与时间为0时使用的相同激发和发射设定记录温育结束时的RFU。时间为0和温育结束时RFU的差异代表化合物处理下BACE2的活性。将RFU差异相对于抑制剂浓度作图，使用四参数逻辑方程拟合曲线，获得IC₅₀值。(May等,Journal ofNeuroscience,31,16507-16516(2011))。

根据基本上如上述的方法测定实施例1的化合物，显示BACE2的IC₅₀为602nM+37.4,n＝6(平均值+平均值的标准差)。BACE1(FRET IC₅₀酶试验)与BACE2(TMEM27 LucY FRET试验)的比例约为50倍，这表明了对抑制BACE1酶的功能选择性。上述数据表明，实施例1化合物对BACE1的选择性超过BACE2。

SH-SY5Y APP695Wt全细胞分析

用于测定BACE1活性抑制的常规全细胞试验利用稳定表达人APP695Wt cDNA的人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y(ATCC保藏号CRL2266)。常规使用细胞直至第6代，然后丢弃。

将SH-SY5YAPP695Wt细胞以5.0×10⁴个细胞/孔接种于在200μL培养基(50％MEM/EBSS和Ham氏F12,1×，丙酮酸钠，非必需氨基酸和NaHCO₃，含10％FBS(Ham’s F12.1×eachsodium pyruvate,non-essential amino acids and NaHCO₃containing 10％FBS))中涂板在96孔组织培养板中。第二天，从细胞中除去培养基，加入新鲜培养基，然后在存在/不存在所需浓度范围的试验化合物的情况下于37℃温育24小时。

在温育结束时，通过特异性夹心法ELISA分析淀粉状蛋白质肽1-40和1-42，分析条件培养基用作β-分泌酶活性的证据。为了测定淀粉状蛋白质的这些特定同种型，采用单克隆2G3作为淀粉状蛋白质1-40的捕获抗体，单克隆21F12作为淀粉状蛋白质1-42的捕获抗体。淀粉状蛋白质1-40和淀粉状蛋白质1-42ELISA均使用生物素化的3D6作为报告抗体(用于抗体的描述，参见Johnson-Wood等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,1550-1555(1997))。化合物处理后在条件培养基中释放的淀粉状蛋白质浓度与在这种条件下BACE1的活性一致。绘制10点抑制曲线，采用四参数逻辑方程拟合，获得降低淀粉状蛋白质作用的IC₅₀值。

基本上如上所述测试实施例1的化合物，其SH-SY5YAPP695Wt淀粉状蛋白质(A-beta)(1-40)ELISA的IC₅₀为1.03nM±0.58,n＝4，其SH-SY5YAPP695Wt淀粉状蛋白质(A-beta)(1-42)ELISA的IC₅₀为1.28nM±1.09,n＝4(平均值+平均值的标准差)。上述数据表明实施例1的化合物能够在全细胞分析中抑制BACE1。

β-分泌酶的体内抑制

多种动物模型，包括小鼠、豚鼠、狗和猴，可用于筛选化合物处理后体内β-分泌酶活性的抑制。在此，我们在插管比格犬模型中进行中心药理学研究。在该模型中，一组雄性比格犬在腰椎区域植入插管并向颈椎穿线。该模型使得在单一48-72小时的研究期间通过连接到脊柱导管的皮下腰部端口进行多次CSF收集。只要插管保持开放状态(remainspatent)，可以在同一组狗中进行额外的CSF药理学研究。处理血液样品以获得血浆，然后等分血浆和CSF样品以测定试验化合物和淀粉状蛋白质CSF浓度。

在该研究中，六只雄性比格犬采用在0.5M磷酸盐缓冲液(pH＝2.0)中的1.0mg/kg实施例1制剂口服给药，收集血液(0.5、1、2、3、6、9、12、24和48小时)和CSF(3、6、9、24和48小时)。通过LC/MS/MS方法测定血浆和CSF化合物浓度。还分析了血浆和CSF的淀粉状蛋白质1-x。本文中使用的“淀粉状蛋白质1-x”是指以残基1开始并且以大于残基28的C-末端结束的淀粉状蛋白质种类的总和。其能够检测大多数淀粉状蛋白质种类，通常称为“总淀粉状蛋白质”。通过夹心ELISA法测定总淀粉状蛋白质肽(淀粉状蛋白质1-x)水平，采用单克隆266作为捕获抗体，采用生物素化的3D6作为报告抗体。(参见May等,Journal of Neuroscience,31,16507-16516(2011))。

在给药后48小时期间，观察口服给予实施例1后淀粉状蛋白质1-x血浆水平的稳健变化(在最低点降低高达80％)。在口服给予1.0mg/kg实施例1后，CSF淀粉状蛋白质1-x水平分别在24和48小时时相对于基线降低了约65-55％。完成7,960nM*小时的总血浆AUC暴露。通过平衡透析确定血浆中化合物的游离部分(Zamek-Gliszczynki等，J PharmSci.2011Jun；100(6):2498-507)，该值用于从总测量值中得到游离药物血浆浓度。实施例1的CSF AUC与游离血浆AUC的比值为0.17，表明该化合物部分从狗CNS中排除，但足以在CSF隔室中诱导明显的淀粉状蛋白质降低。

考虑到实施例1化合物在体外对BACE1酶的活性，这些降低淀粉状蛋白质的作用与体内BACE1抑制一致，进一步证明实施例1化合物的CNS渗透。

这些研究表明，本发明的化合物能够抑制BACE1，因此可用于降低外周和中央室中的淀粉状蛋白质水平。

Claims

1.下式化合物或其药学上可接受的盐：

2.权利要求1的化合物或盐，其中4a位的氢相对于7a位的取代的苯基呈顺式构型：

3.权利要求1或权利要求2的化合物或盐，其中5位的1,1-二氟乙基相对于4a位的氢和7a位的取代的苯基呈顺式构型：

4.权利要求1-3中任一项的化合物或其盐，其中所述化合物为N-[3-(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺。

5.权利要求4的盐，其为N-[3-[(4aR,5S,7aS)-2-氨基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氢呋喃并[3,4-d][1,3]噁嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-甲酰胺4-甲基苯磺酸盐。

6.权利要求4的盐，其为结晶。

7.权利要求5或权利要求6的盐，其特征在于在X射线衍射光谱中，在衍射角2θ的4.9°处具有显著峰，同时还包括选自9.8°、28.0°和14.7°的一或多个峰，衍射角的公差为0.2度。

8.在需要此类治疗的患者中治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括给予所述患者有效量的权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐。

9.在需要此类治疗的患者中治疗轻度认知障碍向阿尔茨海默病的发展的方法，该方法包括给予所述患者有效量的权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐。

10.权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗。

11.权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗阿尔茨海默病。

12.权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗轻度认知障碍向阿尔茨海默病的发展。

13.药用组合物，该药用组合物包含权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐以及一或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

14.制备药用组合物的方法，该方法包括将权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐与一或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。