CN106661054B

CN106661054B - 作为bace抑制剂的四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪衍生物

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Publication number: CN106661054B
Application number: CN201580049355.2A
Authority: CN
Inventors: D.A.科亚茨; P.G.罗萨达
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CL2017000565A1; HRP20190961T1; WO2016043996A1; AU2015318256B2; AP2017009781A0; PL3194408T3; RS58756B1; EA201790238A1; MA39432B1; KR101915419B1; SV2017005392A; SI3194408T1; EP3194408A1; DOP2017000070A; JP6353977B2; TWI570127B; CO2017001927A2; ZA201700823B; PE20170674A1; CY1121709T1

Abstract

本发明提供了式I的化合物∶

Description

作为BACE抑制剂的四氢吡咯并[3,4-D][1,3]噻嗪衍生物

本发明涉及新的结晶的BACE抑制剂、含有所述结晶的BACE抑制剂的药物组合物、使用所述结晶的BACE抑制剂来治疗生理失调的方法以及用于合成它的中间体和方法。

本发明涉及阿尔茨海默氏病及其它与淀粉样β(Abeta)肽、淀粉样前体蛋白(APP)的神经毒性和高度聚集肽片段有关的疾病和病症的领域。阿尔茨海默氏病是在世界范围内影响数百万患者的破坏性的神经变性病症。由于目前批准的上市药剂对于患者只有暂时的症状性益处，所以，在阿尔茨海默氏病的治疗方面，还存在显著的未满足的需要。

阿尔茨海默氏病的特点在于：在脑中形成、聚集和沉积Abeta。在小鼠模型中，已经证明，完全或部分抑制β-分泌酶(β位点淀粉样前体蛋白裂解酶；BACE)，对于斑块相关和斑块依赖性病变具有显著的效果，这说明，即使少量降低Abeta肽水平，也可以导致斑块负荷以及突触缺陷的长期明显减少，由此提供显著的治疗益处，尤其是治疗阿尔茨海默氏病。

美国专利US 8,158,620公开了具有BACE抑制活性的稠合的氨基二氢噻嗪衍生物，并且进一步公开了作为Aβ肽所引起的神经变性疾病的有效治疗剂，例如，阿尔海默氏类型的痴呆。另外，J. Neuroscience，31(46)，16507-16516页(2011)公开了(S)-4-(2,4-二氟-5-嘧啶-5-基-苯基)-4-甲基-5,6-二氢-4H-[1,3]噻嗪-2-基胺，它是口服给予的CNS活性的BACE抑制剂。

需要BACE抑制剂的结晶形式使得药学制剂容易制备，并提供稳定性提高的药物组合物。

相应地，本发明提供了式I的化合物∶

式I

它是晶体。

本发明还提供了治疗患者的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的晶体形式的式I化合物。本发明进一步提供了防止患者的轻微认知损害发展成为阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的晶体形式的式I化合物。本发明还提供了抑制患者的BACE的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的晶体形式的式I化合物。本发明还提供了抑制BACE介导的淀粉样前体蛋白断裂的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的晶体形式的式I化合物。本发明进一步提供了抑制Abeta肽产生的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的晶体形式的式I化合物。

此外，本发明提供了用于治疗的晶体形式的式I化合物，尤其是用于治疗阿尔茨海默氏病，或用于防止轻微的认知损害发展成为阿尔茨海默氏病。再此外，本发明提供了晶体形式的式I化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗阿尔茨海默氏病，或用于防止轻微的认知损害发展成为阿尔茨海默氏病。

本发明进一步提供了含有晶体形式的式I化合物以及一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明还包括合成晶体形式的式I化合物的新的中间体和方法。

轻微认知损害定义为：基于临床表现和表现为轻度认知损害的患者随时间推移向阿尔茨海默氏痴呆的进展，与阿尔茨海默氏病相关的痴呆的潜在的有前驱症状的阶段(Morris等人，Arch. Neurol., 58, 397-405(2001); Petersen等人，Arch. Neurol., 56,303-308(1999))。术语“防止轻微认知损害发展成为阿尔茨海默氏病”包括减缓、阻滞或逆转患者的轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展。

本文使用的术语“治疗”包括限制、减缓、终止或逆转所存在的症状或病症的进展或严重程度。

本文使用的术语“患者”是指人。

术语“抑制Abeta肽的产生”是指降低患者的体内Abeta肽的水平。

本文使用的术语“有效量”是指本发明化合物或其可药用盐的数量或剂量，当给予患者单或多剂量时，这种数量或剂量能够为诊断或治疗中的患者提供预期效果。

作为本领域技术人员，诊断医生通过利用已知的技术，并且观察在类似情况下所获得的结果，可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量的过程中，诊断医生会考虑大量因素，包括但不限于∶患者的种类；它的体量、年龄和常规健康情况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的复杂度或严重程度；个体患者的响应；给予的具体化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；使用的伴随药物；及其它相关的情况。

本发明的化合物通常在很宽的剂量范围内是有效的。例如，日剂量通常在大约0.01至大约20 mg/kg体重范围内。在有些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是更合适的，而在其它情况下，在副作用可接受的条件下，可以使用更大的剂量，因此，上述剂量范围不是打算以任何方式限制本发明的范围。

优选，将本发明的化合物配制为药物组合物，通过能够使化合物生物可利用的任何途径给予，包括口服、透皮和肠胃外途径。最优选，口服或透皮给予这样的组合物，尤其优选口服。这样的药物组合物和其制备方法在本领域为大家所熟知(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(D.B. Troy, Editor, 21st Edition,Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。

晶体形式的式I化合物尤其在本发明的治疗方法中是有效的，但优选某些形式。下列段落描述这种形式。可以理解，这些优选形式适用于本发明的治疗方法和新的化合物两者。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式1；

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2；

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2，其特点在于：在X射线衍射谱中，在11.8°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度；

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式3；和

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式3，其特点在于：在X射线衍射谱中，在15.7°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自18.1°、27.0°和19.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度，是优选的。

特别优选N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2。

尤其优选N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2，其特点在于：在X射线衍射谱中，在11.8°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

本领域普通技术人员可以理解，本发明的化合物可以存在互变异构形式，如反应路线A所述。当本申请给出本发明化合物的任何一个具体互变异构体时，应该理解为，它包括互变异构形式和其所有的混合物。

反应路线A

另外，下面反应路线所描述的某些中间体可以包含一个或多个氮保护基。可变的保护基在每次出现时可以相同或不同，这取决于具体反应条件和所进行的具体转化。技术人员熟知保护和脱保护条件，并且在文献中进行了描述(参见，例如，“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, 第四版, Peter G.M. Wuts 和 TheodoraW. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。

为了清楚起见，未指明某些立体化学核心，并且下列反应路线删除了某些取代基，但并没有以任何方式限制反应路线内容的意图。此外，在合成本发明化合物的过程中，在任何方便的点，本领域普通技术人员可以利用(例如)选择结晶技术或手性色谱方法分离或拆分单一异构体、对映体和非对映体(参见，例如，J. Jacques等人，"Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 和 E.L. Eliel和 S.H. Wilen, “Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience,1994)。名称“异构体1”和“异构体2”是指分别从手性色谱第一个和第二个洗脱的化合物，如果在合成的早期开始手性色谱，则同样的名称用于随后的中间体和实施例。

某些缩写定义如下∶“APP”是指淀粉样前体蛋白；“CSF”是指脑脊液；“DCM”是指二氯甲烷；“DIPEA”是指二异丙基乙胺或N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺；“DMEM”是指Dulbecco's改进的Eagle's培养基；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“ee”是指对映体过量；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Ex”是指实施例；“F12”是指Ham's F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“FRET”是指荧光共振能量转移；“HEK”是指人胚肾；“HOAc”是指乙酸；“HOBt”是指1-羟基苯并三唑水合物；“HPLC”是指高效液相色谱；“IC50”是指可以产生对该试剂可能的最大抑制响应的50%时的试剂浓度；“min”是指分钟；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“PDAPP“是指血小板衍生的淀粉样前体蛋白；“Prep”是指制备；“RFU”是指相对荧光单位；“SCX”是指强阳离子交换；“Rt”是指保留时间；“THF”是指四氢呋喃。

本发明的化合物可以用本领域已知的各种方法制备，在下面的制备例和实施例中，举例说明了其中一些方法。所描述的每个途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或与各种制备方法的步骤结合，制备本发明的化合物。可以使用本领域众所周知的常规方法，回收每个步骤的产物，包括提取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨或结晶。对本领域普通技术人员来说，很容易得到试剂和起始原料。

制备例1

2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙烷-1-酮

在35℃，将N-溴代琥珀酰亚胺(984g，5.53mol)逐份加入到1-(5-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(1000 g，4.6mol)和对甲苯磺酸(1315 g，7.64mol)的DCM(7 L)溶液中。搅拌该混合物，并加热到40℃。将该混合物冷却至24℃，并加入7% NaHCO₃(5 L)。分离各层，并用10% Na₂SO₃(5 L)和水(5 L)洗涤有机层。将有机层浓缩至1/2-1/3体积，得到标题化合物，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例2

5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧苯甲基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑

向2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙烷-1-酮(1363 g，4.61 mol)的甲苯(10 L)溶液中加入二烯丙基胺(537 g，5.53 mol)和DIPEA(2381 g，18.42 mol)。将该混合物在40℃搅拌4小时，得到1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙烷-1-酮，不用分离。将N-(4-甲氧苯甲基)羟胺(847g，5.53mol)和Ti(OiPr)₄(1965 g，6.91 mol)加入到含有粗品1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙烷-1-酮的混合物中。将该混合物在90℃下搅拌2小时。将该混合物冷却至20℃，并加入50%柠檬酸一水合物(4 L)和饱和Na₂CO₃(4 L)。分离各层，并将水层用MTBE(5 L)提取。用水(5 L)洗涤有机提取物，通过硅藻土过滤，并浓缩至干。将EtOAc(10 L)和草酸(580g)加入到残余物中，滤出固体，并加入到1N NaOH(13 L)中。加入MTBE(5 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。分离各层，并将有机层浓缩至1/2体积。加入庚烷(3 L)，并将该溶液冷却至10℃。将得到的固体滤出，得到标题化合物(1330 g，64%)。¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H),3.78-3.41(m, 6H),4.01(m, 1H),5.24-5.01(m, 2H),5.89-5.85(m, 1H),6.82-6.80(m, 2H),7.51-7.13(m, 3H),7.63-7.62(m,1H),7.65-7.64(m, 1H)。

制备例3

5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑盐酸盐

将三氟乙酸(4 L，52.9 mol)逐滴加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧苯甲基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑(1990 g，4.45 mol)的DCM(12 L)溶液中，加入速度应保持温度低于35℃。加入完成之后，将该混合物升温至33-43℃，并搅拌6小时。加入NaOH(20%，10 L)，加入速度应保持温度低于35℃。分离各层，并将有机层用水(6 L)洗涤。浓缩该溶液，加入乙醇(16 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。浓缩滤液，并加入EtOAc(10L)。加入4M HCl/EtOAc(8 L)，并滤出所得到的固体，干燥，得到标题化合物(1385 g，85.6%)。ES m/z 327.1(M+1)。

制备例4

(1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇

将饱和碳酸钠水溶液加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑盐酸盐(1400g，3.85 mol)的DCM(7 L)溶液中，达到pH>9。分离各层，并将有机提取物浓缩至2/3体积。加入乙酸(1.38 L)，并将该溶液浓缩至2 L。加入乙酸(7 L)和锌粉(2.5 kg，38.5 mol)，将该混合物加热至40-50℃，并搅拌3小时。加入EtOAc(9.8L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。将滤饼用EtOAc(4 L)洗涤。分离滤液，并将水(7 L)加入到合并的有机物中。加入氢氧化铵，达到pH≥9。分离各层，并将有机层浓缩至2 L。加入乙醇(2.8 L)，并将该溶液浓缩至2 L。加入乙醇(19 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤，得到标题化合物的乙醇溶液，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例5

[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐

将二-对甲苯酰-L-酒石酸一水合物(1.04 kg，2.69 mol)加入到(1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(1264 g，3.85 mmol)的乙醇(21 L)溶液中。将该混合物加热至65-75℃，并搅拌3小时。将该混合物冷却至5-10℃，加入[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐(1.0 g)的晶种，并将该混合物搅拌3小时。滤出固体，并将滤饼用冷乙醇(1.4 L)洗涤。干燥滤饼，得到标题化合物的白色固体。第二个洗脱的异构体的手性分析∶柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，在UV 270 nm，确证了对映体富含(99% ee)的对映体，Rt=7.4分钟(1050g，38%)。¹H NMR(400 MHz, CD₃OD)δ2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H),3.57-3.31(m, 3H),3.66-3.58(m, 4H),3.75-3.74(m, 2H),5.38-5.36(m, 1H),5.50-5.46(m, 1H),5.88(s, 2H),5.97-5.91(m, 1H),7.10-7.05(m, 1H),7.29(d, J=8.0 Hz, 4H),7.53-7.51(m, 1H),7.80-7.78(m, 1H),8.01(d, J=8.0 Hz, 4H)。

制备例6

((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇

将1N HCl(500 ml，500 mmol)加入到0℃的[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐(100 g，139.4 mmol)的EtOAc(500 ml)溶液中。将该混合物搅拌1小时。分离水层，并用1N NaOH将pH值调节至8。将水层用EtOAc(350 ml×2)提取。合并有机层，用水(500ml)洗涤，浓缩，得到标题化合物(40g，87%)。第二个洗脱的异构体的手性分析∶柱∶ICChiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 270 nm证明了对映体富集(99.7% ee)的对映体，Rt=7.4分钟。¹HNMR(400 MHz, CDCl₃)δ2.78-2.70(m, 5H),3.16-3.00(m, 3H),3.87-3.75(m, 1H),3.90-3.84(m, 1H),5.24-5.11(m, 2H),5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H),7.35-7.32(m,1H),7.67-7.65(m, 1H)。

制备例7

N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺

将苯甲酰异硫氰酸酯(15.0 g，91.9 mmol)加入到0℃的((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(30 g，91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。将该溶液升温至25℃，并搅拌1小时，得到标题化合物的THF溶液，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例8

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二盐酸盐

将三苯基膦(36.8 g，140.3 mmol)加入到N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。加入偶氮二甲酸二叔丁基酯(31.6 g，137.2 mmol)/THF(100 ml)。将该混合物在20-30℃下搅拌2小时。浓缩该混合物，并加入MTBE(400 ml)。通过硅藻土过滤该溶液，并将滤饼用MTBE(130 ml)洗涤。将滤液合并，并加入1N HCl/EtOAc(200 ml)。将该混合物搅拌2小时，而后浓缩至500 ml。加入MTBE(320 ml)，并过滤该溶液，并用庚烷(130 ml)洗涤。使固体在EtOAc(650 ml)中形成浆液，并在50-60℃下搅拌2小时。将热浆液过滤，并将固体用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗涤。使固体在EtOAc(650 ml)中再形成浆液，并在50-60℃下搅拌2小时。将热浆液过滤，并用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗涤。将固体干燥，得到标题化合物的二-HCl盐(40 g，80%，99.5% ee)。第一个洗脱的异构体的手性分析∶柱∶ICChiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶85%己烷(0.1%二乙胺)∶15%异丙醇(0.1%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 282 nm证明了对映体富集(99.5% ee)的对映体，Rt=12.5分钟。

制备例9

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将15%碳酸钠(440 ml)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二盐酸盐(495 g，717.88mmol)的EtOAc(3 L)和水(784 ml)溶液中。将该混合物搅拌1-2小时。分离各层，通过硅胶(40 g)过滤有机层，并用EtOAc(600 ml)洗涤。将滤液浓缩至干，得到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺。将三氟乙酰胺(136.7 g，1.21mol)、NaI(182.5 g，1.22mol)、4Å分子筛(342g)和K₂CO₃(170.9g，1.24mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(341 g，494.54mmol)的DMSO(525 ml)和1,4-二噁烷(1.025 L)溶液中。将反式-N,N'-二甲基环己烷(81.6 g，573.66 mmol)和碘化亚铜(27.3 g，143.34 mmol)/DMSO(500 ml)加入到该反应混合物中。将该混合物搅拌5分钟。将该混合物升温至100℃，搅拌8小时，并冷却至24℃。加入水(5.9 L)和DCM(5.9 L)，过滤该混合物，并分离各层。将有机层用水(5.9 L)洗涤，获得标题化合物的DCM溶液，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例10

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺盐酸盐

将氢氧化钠(28.7 g)和水(2.7 L)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(250 g，494.4mmol)的DCM溶液中，并将该混合物在24℃下搅拌68小时。加入1N HCl(3.5 L)，获得1-3的pH值。分离各层，并将水层用DCM(680 ml)洗涤。将DCM(4 L)加入到该水溶液中，而后加入21%氢氧化铵，获得8-10的pH值。分离各层，将有机提取物合并，通过硅胶(170 g)过滤，并用DCM(1.4 L)洗涤。将溶剂浓缩至干，并用EtOAc(4 L)稀释。在低于25℃的温度下，加入1N HCl/EtOAc(700 ml)，并将该混合物搅拌1小时。将该混合物浓缩至大约1/7-1/8体积，并加入EtOAc(2.8 L)。将得到的沉淀滤出，并用EtOAc(400 ml)洗涤。将固体干燥，得到标题化合物(246 g，52%)。

制备例11

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将乙酸酐(23.5g，0.23 mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺盐酸盐(100 g，0.153mol)和三乙胺(54.3g，0.535 mol)的DCM(800ml)溶液中。在20-25℃下搅拌1小时之后，加入饱和NaHCO₃(700 ml)和水(600 ml)。分离各层，得到标题化合物的DCM溶液，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例12

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将三苯基膦(4.0g，0.015 mol)和1,3-二甲基巴比妥酸(15.2 g，0.097 mol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(0.153 mol)的DCM溶液中。加入乙酸钯(1.7g，7.7 mmol)，并将该混合物在20至30℃下搅拌1小时。加入25%氢氧化铵，并分离各层。用HOAc(3.0当量，在500 ml水中)洗涤有机层，并用25%氢氧化铵将pH值调节至8-9。将水层用DCM(2× 500ml)提取。将有机提取物合并，并浓缩至1/3-1/4体积。加入MTBE(1 L)，并将该混合物过滤。浓缩该混合物，并加入庚烷(1 L)。滤出所得到的固体，收集，并干燥，得到标题化合物(48g，76%)。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 2.15(s, 3H),2.87-2.83(m, 1H),3.43-3.23(m, 5H),3.70-3.67(m, 1H),7.12-7.07(m, 1H),7.28-7.27(m, 1H),7.52-7.41(m, 4H),7.79(m,1H),8.18-8.16(m, 2H)。ES m/z 413.1(M+1)。

制备例13

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将2-氯-5-氟嘧啶(28.9 g，218 mmol)和碳酸钾(33.46 g，242.1 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(50 g，121.22 mmol)的DMF(100 ml)溶液中。将该混合物加热至80-85℃，保持8小时。将该混合物冷却至24℃，过滤，并用DMF(100 ml)洗涤。使固体在水(2 L)中形成浆液，过滤，获得标题化合物(68.5g，98%)。LC-MS: m/z=509.2(M+1)+, ¹H NMR(400 MHz, d₆-DMSO) δ ppm 1.22(t, J=7.28 Hz, 2 H)1.92-2.07(m, 6 H)2.89-3.20(m, 2 H)3.36-3.44(m, 1 H)3.67(t, J=9.54 Hz, 1 H)3.84(br. s., 1 H)4.16(br. s., 2 H)7.23(br.s., 2 H)7.35-7.61(m, 8 H)7.77(br. s., 2 H)7.85-8.18(m, 4 H)8.48(s, 4 H)10.15(br. s., 1 H)10.46-10.59(m, 1 H)。

制备例14

(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将氢氧化锂(8.6 g，204.9 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(80 g，157.3 mmol)的甲醇(400 ml)溶液中。将该混合物加热至60-70℃，保持4小时。加入浓HCl(132 g)，并将该混合物在55℃下搅拌18小时。将该混合物冷却至30℃，并浓缩，除去甲醇。加入水，并将水层用DCM(3×)提取，获得标题化合物的920 g的水溶液，其中，总质量的5.6%是标题化合物，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例15

N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯

在氮气氛围中，将N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯(50 g，208.9 mmol)的甲苯(180 ml)溶液用固体氢氧化钾(51.6 g，919.69 mmol)处理。10分钟之后，加入苄基三乙基氯化铵(0.8 g，3.1 mmol)。再经过10分钟之后，用10分钟逐滴加入烯丙基溴(33 g，272.8 mmol)的甲苯(50 ml)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。将该混合物冷却至室温，并用水淬灭。分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩至干，得到标题化合物(44 g，75%)。ES/MS(m/e): 280(M+H)。

制备例16

N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯

将N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯(30 g，107 mmol)的甲酸(36.8 ml，860 mmol)和水(4.84 ml)溶液在室温下搅拌过夜。浓缩该混合物，并用己烷/EtOAc(1:2)和水稀释。分离有机层，用盐水溶液洗涤，直到pH=6为止，并用硫酸钠干燥。蒸发溶剂，得到标题化合物(25g，99%)。ES/MS(m/e): 234(M+H)。

制备例17

N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基乙基]氨基甲酸苄基酯

将N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯(25 g，107 mmol)的乙腈(150 ml)溶液用盐酸羟胺(9.68 g，139 mmol)和三水乙酸钠(16 g，117.9 mmol)水溶液(75 ml)处理。将该混合物在室温下搅拌过夜。蒸发乙腈，并将该水溶液用EtOAc提取。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩，得到标题化合物(24 g，90%)。ES/MS(m/e): 249(M+H)。

制备例18

3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯

用10分钟，将N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基乙基]氨基甲酸苄基酯(24 g，96.6mmol)的DCM(338 ml)溶液用5% w/w次氯酸钠水溶液(106.08 mmol，143.06 ml)逐滴处理。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将该反应用40%亚硫酸氢钠(7 g)水溶液淬灭。分离有机层，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。用硅胶纯化粗品，用5% EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(18 g，75%)。ES/MS(m/e): 247(M+H)。

制备例19

6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯

将1.6M正丁基锂己烷溶液(25.4 ml，40.6 mmol)逐滴加入到-78℃的4-溴-1-氟-2-碘苯(12.22 g，40.6 mmol)的THF(60 ml)溶液中，得到黄色溶液，并将其在-78℃下搅拌15分钟。

将三氟化硼醚合物(5.14 ml，40.6 mmol)加入到单独的-78℃的3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(5 g，20.3 mmol)的THF(60 ml)溶液中，并将该混合物在-78℃下搅拌5分钟。将此溶液通过小管加入到先前制备的-78℃的有机锂混合物中。将合并的混合物在-78℃下搅拌30分钟。将该混合物用饱和氯化铵水溶液淬灭，并升温至室温。将该混合物用EtOAc(3×)提取，将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过35分钟，得到标题化合物(2.27g，27%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)421/423(M+H)。

制备例20

1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯

将苯甲酰异硫氰酸酯(2.87 ml，21.28 mmol)逐滴加入到6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(5.977 g，14.2 mmol)的THF(95ml)溶液中，并在氮气氛围中搅拌过夜。真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(6.05 g，73%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)584/586(M+H)。

制备例21

3-(苯甲酰硫代氨基甲酰基氨基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄基酯

在室温下，在氮气氛围中，将1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(6.05 g 10.4 mmol)和锌(粉末，<10微米)(6.77 g，103.5 mmol)的混合物在乙酸(52 ml)中搅拌过夜。将该反应用EtOAc稀释，并通过硅藻土过滤。真空除去溶剂，并将残余物用EtOAc、水和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。将该混合物用EtOAc(3×)提取，将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(5.222 g，86%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)586/588(M+H)。

制备例22

2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯

将1,1'-羰二咪唑(2.87 g，17.7 mmol)加入到3-(苯甲酰硫代氨基甲酰基氨基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄基酯(5.198 g，8.86 mmol)的THF(52ml)溶液中。将该混合物在室温下搅拌1.5小时，而后将该反应在氮气氛围中、在回流下加热过夜。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(2.93 g，58%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)568/570(M+H)。

制备例23

N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将碘代三甲基甲硅烷(2.21 ml，15.46 mmol)逐滴加入到室温的2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯(2.93 g，5.15 mmol)的乙腈(44 ml)溶液中。在室温下搅拌该反应两个小时，并真空除去溶剂。用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到标题化合物(2.098 g，94%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)434/436(M+H)。

制备例24

2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯

将二碳酸二叔丁基酯(1.16 g，5.31 mmol)和三乙胺(1.01 ml，7.25 mmol)加入到N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.098 g，4.83 mmol)的DCM(48 ml)溶液中。将该反应在室温下、在氮气氛围中搅拌1小时。真空除去溶剂，用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(2.556 g，99%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)534/536(M+H)。

制备例25

7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯

将2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.556 g，4.8 mmol)和反式-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(150 mg，1.1mmol)的乙醇(50 ml)溶液用叠氮化钠(933 mg，14.3 mmol)处理。加入L-抗坏血酸钠盐的水溶液(0.66M，3.2 ml，2.1 mmol)和水(1 ml)，并将烧瓶的顶部用氮气吹扫。将该混合物用硫酸铜(II)五水合物的水溶液(0.33M，3.2 ml，1.1 mmol)处理，并在80℃下，在氮气氛围中，将该混合物立即在预热的加热板上加热1.5小时。一旦加热，获得均匀混合物。冷却该反应，用冰水稀释，并将该混合物用EtOAc(3×)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得到粗品叠氮化物。将该粗品叠氮化物与10%钯/炭(1 g)/冷乙醇(150 ml)混合，并使用真空/氮气，而后真空/氢气，吹扫该混合物。将该混合物在室温下、在30 psi的氢气氛围中搅拌5小时。排出反应物，通过硅藻土过滤，并将滤饼用DCM冲洗。从滤液中真空除去溶剂，并将粗品用硅胶纯化，使用50% EtOAc/DCM，得到标题化合物(2.014 g，89%)。ES/MS(m/e): 471(M+H)。

制备例26

N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将三氟乙酸(10 ml)加入到7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.013 g，4.28 mmol)的DCM(30 ml)溶液中，并将该混合物在室温下、在氮气氛围中搅拌4小时。真空除去溶剂，用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到标题化合物(1.555 g，98%)。ES/MS(m/e): 371(M+H)。

制备例27

N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮气氛围中，将N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(705 mg，1.90 mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(1.01 g,7.61 mmol)和DIPEA(1.66 ml，9.52 mmol)在1,4-二噁烷(20 ml)中加热至回流，保持4小时。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂，得到粗品。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，经过25分钟，得到标题化合物(590 mg，66%)。ES/MS(m/e): 467(M+H)。

制备例28

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(异构体1)

将外消旋的N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(1.694 g，3.63 mmol)用手性HPLC纯化(柱∶Chiralcel OJ，8 x 35 cm；洗脱液∶90%甲醇(0.2%二甲基乙胺)和10%乙腈；流速400 ml/min，UV 280 nm)。第一个洗脱的异构体的分析(柱∶Chiralcel OJ-H，0.46 x 15 cm；洗脱液∶10∶90的乙腈∶甲醇(含有0.2%二甲基乙胺)；流速∶0.6 ml/min，UV 280 nm)证明了对映体富集(99% ee)的对映体，Rt=6.70分钟(723 mg，43%)。ES/MS(m/e): 467(M+H)。

制备例29

N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(异构体1)

将N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.361 g，0.77 mmol，异构体1)溶于DCM(4 ml)和DMF(0.5 ml)的混合物中。将5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(240 mg，1.55 mmol)、HOBT(210 mg，1.55 mmol)和EDCI(300 mg，1.55 mmol)加入到该混合物中，并将该混合物在室温下搅拌过夜。将反应溶液直接加到12g硅胶装载的柱上，使用40 g硅胶柱纯化，用0-100%的EtOAc/己烷的梯度进行洗脱。将产物溶于EtOAc(200 ml)中，用1N NaOH(2×50 ml)和盐水(1×50ml)洗涤。重复上述硅胶纯化，得到标题化合物(350 mg，74%)。ES/MS(m/e): 603(M+H)。

制备例30

5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑

流动化学反应步骤∶将343 ml无缝不锈钢管式反应器(O.D=1/8英寸)放在GC炉内部，并以20 ml/min的速度用甲苯冲洗20分钟。施加氮气背压(720 psig)，并将GC的温度设定在210℃。温度达到210℃之后，使用一对以连续方式工作的高压注射泵，使2-(二烯丙基氨基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟(480.51 g，1.74mol)的甲苯(5.81 L)溶液以22.866 ml/min的速度泵送通过反应器，产生停留时间15分钟。消耗了所有储备溶液之后，将反应器以22.866ml/min的速度用甲苯冲洗30分钟。GC炉的温度设置在25℃，收集全部溶液，并真空浓缩。蒸发溶剂，并将残余物溶于二氯甲烷(2.5 L)和水(5 L)中。用盐酸将pH值调节至1，分离水层，并用氢氧化钠中和，将pH值调节至10。用MTBE(3×2.5 L)提取水层。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物(248 g，47%)，其不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/e): 249(M+1)。

制备例31

1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

将锌粉(590 g，9 mol)加入到5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑(3559 g，1.29 mol)的溶液(在甲醇(2.85 L)和饱和氯化铵水溶液(3.56L)的混合物中)中，并将该混合物在70℃下加热16小时。将该反应冷却至60℃，用THF(2.85L)稀释，趁热时在硅藻土上过滤。蒸发滤液，除去有机溶剂，并将该水性混合物用10% w/w枸橼酸水溶液(4 L)和EtOAc(3.5 L)稀释。分离有机层，并将水层用EtOAc(2×2 L)洗涤。将水层用50% w/w氢氧化钠中和，将pH值调节至10，而后用EtOAc(2×1.5 L)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物(299 g，92%)。ES/MS(m/e): 251(M+1)。

制备例32

[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸

将二-对甲苯酰-L-酒石酸(348.6 g，884 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液加入到预先在40℃加热的[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(225.9 g，902 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液中。将该反应冷却至22℃，并搅拌18小时。过滤收集白色固体，并用1-甲氧基-2-丙醇(600ml)洗涤。将收集的固体干燥，得到标题化合物(183.01 g，31.8%)。ES/MS(m/e): 251(M+1)。

制备例33

[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸(211 g，331 mmol)溶于水(2.1L)和EtOAc(2.3L)中。加入35% w/w盐酸，将pH值调节至1。分离水层，用50% w/w氢氧化钠将pH值调节至10，并用EtOAc(2×)提取。将水层的pH值用NaOH水溶液调节至10，并用MTBE(3×)提取，同时保持该水溶液的pH值=10。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至干，得到粗品标题化合物(73 g，88%，94.8%ee)。用手性色谱分析产物∶柱∶AS-H，洗脱液∶10%异丙醇、2%异丙胺；流速∶3 ml/min，UV 220；压力∶100 bar，在35℃下以第二个洗脱的异构体得到标题化合物，Rf=2.26分钟。ES/MS(m/e): 251(M+1)。

制备例34

N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮气氛围中，在0℃，将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(129.7 g，414 mmol)的THF(2.3L)溶液冷却。加入苯甲酰异硫氰酸酯(61.5 ml，456mmol)，保持温度低于5℃。用3小时将该反应升温至室温，加入1,1'-羰二咪唑(87.4 g，538.9 mmol)，并将该反应在22℃下搅拌1小时，而后在70℃下加热16小时。将该反应混合物冷却至22℃，并蒸发溶剂。将残余物在EtOAc(1L)和水(1L)中分配。分离有机层，并将水层用EtOAc(2×400 ml)提取。将有机物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物。用硅胶色谱纯化粗品，用EtOAc/DCM(0-40% DCM)的梯度进行洗脱，得到标题化合物的浅黄色固体(170 g，99%)，其含有残余溶剂。ES/MS(m/e): 396(M+1)。

制备例35

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮气氛围中，将苯甲酸、2-巯基-(122 g，793 mmol)、二(二亚苄基丙酮)钯(4.15g，7.21 mmol)和1,4-二(二苯基膦基)丁烷(3.14 g，7.21 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(178.21g，360 mmol)的无水2-甲基四氢呋喃(1.96 L)溶液中。通过真空/氮气循环三次，将该溶液脱气，而后向该反应中鼓入氮气15分钟。将该反应混合物加热至40℃，同时向该反应中鼓入氮气。当反应达到40℃时，停止鼓入氮气，并在氮气氛围中，将该反应混合物在40℃下搅拌3小时。将该反应冷却至22℃，并用水(2 L)稀释。加入HCl(5M)溶液，将pH值调节至1。分离水层，并用额外的EtOAc(2×800 ml)洗涤。将水层的pH值用50% w/w氢氧化钠调节至10，而后用EtOAc(10L)提取。用额外的EtOAc(2×750mL)洗涤水层。将有机提取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物的浅黄色固体(124.7 g，97%)。ES/MS(m/e): 356(M+1)。

制备例36

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(124.7 g，256 mmol)、DIPEA(67ml)、5-氟-2-氯嘧啶(29.3 ml，307 mmol)的N-甲基吡咯烷酮(997 ml)溶液加热至100℃，保持16小时。将该反应冷却至22℃，并倒入10℃冷水(10 L)中，保持温度低于15℃。过滤收集淡色的膏状固体，并用额外的水洗涤。将湿的固体溶于EtOAc(2 L)中，并转入分液漏斗中。加入5% w/w氯化钠水溶液(1 L)，分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发滤液。用硅胶色谱纯化产物，使用0-40%的EtOAc/异己烷的梯度，得到标题化合物的浅黄色固体(116 g，70%)。ES/MS(m/e): 452(M+1)。

制备例37

(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将氢氧化锂(9.26 g，386 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(158.6 g，351.6mmol)的甲醇(1.6 L)混合物中。将该混合物在70℃下加热4小时，而后冷却至22℃。真空蒸发该反应混合物，得到黄色残余物。将残余物在水(1L)和EtOAc(750 ml)中分配。加入HCl(5M水溶液)，将pH值调节至1。分离水层，并将有机层用EtOAc(2×200 ml)洗涤。将水层的pH值用50% w/w氢氧化钠水溶液调节至pH=10，并用EtOAc(3×1L)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，得到粗品标题化合物的浅黄色固体(133.3 g，99%，含有12%残余的EtOAc)。ES/MS(m/e): 348(M+1)。

制备例38

(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将硫酸(33.4 ml，626.6 mmol)加入到(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(45.8 g，125.3 mmol)的三氟乙酸(626 ml)溶液中。将该混合物冷却至0℃，并搅拌20分钟。加入发烟硝酸(6.2 mL，144.1mmol)，将该反应混合物升温至22℃，并搅拌3小时。蒸发该反应混合物，加入MTBE(250 ml)，并蒸发两次。将残余物真空干燥至恒重，而后溶于水(147 ml)和乙醇(885 ml)中，并鼓入氮气15分钟，进行脱气。将该溶液转入压力反应器中，并加入87L类型的10% Pd/C糊状物(6.6g，6.27 mmol)。将该混合物用额外的乙醇(700 ml)稀释，并在80 psi下用氢气加压16小时。过滤该反应混合物，而后将第二个催化剂进料加入87L糊状物型态的10% Pd/C(6.6 g，6.27mmol)，并在压力反应器中，将该混合物加压到80 psi，搅拌3天。用氮气吹扫该反应混合物，并用硅藻土过滤。蒸发滤液，并将残余物在水(200ml)和EtOAc(200 ml)之间分配。分离水层，冷却至5℃，并用15% w/w氢氧化铵中和。将水层用EtOAc(3×150 ml)提取。将有机物合并，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，得到标题化合物的浅棕色固体(47.7 g，99%，含有残余的EtOAc)。ES/MS(m/e): 363(M+1)。

实施例1

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺盐酸盐

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(0.350 g，0.58 mmol，异构体1)溶于THF(2 ml)中，而后加入甲醇(4 ml)和乙醇(4 ml)。将O-甲基羟胺盐酸盐(495mg，5.81 mmol)和吡啶(470µl，5.81 mmol)加入到该混合物中，将该反应升温至50℃，并搅拌过夜。将硅胶(～10 g)加入到该反应中，并浓缩该混合物。将在硅胶上干燥的样品装载到空柱上，纯化，用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度进行洗脱。在SCX柱上再次纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇。最后一次用硅胶纯化该产物，使用0%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.20 ml，660µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(71 mg，23%)。ES/MS(m/e):498(M+H)。

X射线粉末衍射(XRD)

在配备有CuKa源(λ= 1.54060Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪(在35 kV和50 mA下操作)上获得结晶固体的XRD图。在4和40°(2θ)之间扫描样品，步长为0.009°(2θ)，扫描速率为0.5秒/步长，发散度0.6 mm，5.28固定的防散射，检测器狭缝为9.5 mm。将干粉填装到石英样品座上，并使用载玻片获得光滑表面。在环境温度和相对湿度下收集结晶形式的衍射图。结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的结晶形式，衍射峰的相对强度可能由于例如晶体形态和特性等因素引起的优先取向而改变。如果存在优先取向的效果，峰强度改变，但多晶型物的特征峰位置没有变化。参见，例如，The UnitedStates Pharmacopeia #23, National Formulary #18, 第1843-1844页, 1995。此外，结晶学领域还众所周知的是，对于任何得到的结晶形态，有角度的峰位置可能轻微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度变化、样品替换、或存在或不存在内标，峰位置可能移动。在本发明的情况下，±0.2(2θ)的峰位置的变化性将会考虑到这些可能的变化，不会妨碍明确鉴别所指明的结晶形式。基于特征峰(单位°2θ)的任何独特组合，典型地是更突出的峰，可以确定结晶形式。基于NIST 675标准峰(在8.853和26.774度2θ)，调节在环境温度和相对湿度下收集的结晶形式的衍射图。

实施例1a

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式1

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(201 mg，403.20 µmoles)与4ml乙酸丁酯混合，并在120℃搅拌板上搅拌。大约5分钟之后，固体溶解，得到清澈的无色溶液。然后，将样品冷却至室温，从溶液中沉淀出白色固体。然后，在室温下，使样品成浆10分钟，得到白色固体的浓浆液。通过真空过滤，将白色固体分离，并在空气流中干燥5分钟。将得到的白色固体饼放在称量瓶(tared vial)中，放在60℃的真空烘箱中度过周末，提供标题化合物(110 mg)。在室温和小于大约15%的相对湿度下，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式1是稳定的结晶形式。

实施例1b

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2(水合物)

将草酰氯(888 µl，10.2 mmol)加入到5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(1.6 g，10.2 mmol)的乙腈(53 ml)和DMF(848µl)溶液中。15分钟之后，将该新制备的溶液加入到(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(2.65 g，7.3 mmol)的溶液(在水(53 ml)和乙醇(53 ml)的混合物中，预先在50℃下加热)中。将该反应混合物在50℃下搅拌一个小时，冷却至22℃，而后在此温度下搅拌过夜。真空蒸发有机溶剂，并将该水性混合物用50% w/w的氢氧化钠水溶液处理，调节pH=10。分离淡色的膏状固体，并用额外的水洗涤。用异丙醇(2×)稀释固体，并将溶剂蒸发。用硅胶色谱纯化粗品，使用氨化的甲醇(2N)/二氯甲烷的梯度。将含有目标产物的级分合并，蒸发溶剂，得到标题化合物的灰白色固体(1.9 g，52%)。ES/MS(m/e): 499(M+1)。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d] [1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2(水合物)的另一个制备例

将乙腈(500 ml)加入到DMF(19.2 ml，248.9 mmol)中。将草酰氯(39.3 g，309.63mmol)加入到该DMF/乙腈溶液中，而后加入5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(46.0g，298.4 mmol)。在单独的烧瓶中，将(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(56.8 g，156.75 mmol)的水溶液加入到乙腈(500 ml)中，并用氢氧化铵(95 ml)将pH值调节至9。然后，将该混合物加热到50-55℃。逐滴加入草酰氯溶液，并将该混合物搅拌3小时。将pH值用氢氧化铵调节至8-9。滤出所得到的沉淀，用水洗涤，干燥，获得标题化合物(123 g)。使固体在丙酮(250 ml)中形成浆液，保持1.5小时，并过滤。用丙酮洗涤湿滤饼，获得标题化合物(110g，HPLC纯度90.5%)。将THF(1 L)和活性炭(9g)加入到固体中，并将该混合物加热至回流过夜。通过硅藻土过滤该混合物，并用THF(150ml)洗涤。浓缩有机溶液至1/10体积，并加热到60℃。加入水(430 ml)，并将该混合物在60℃下搅拌8小时。将该混合物冷却至室温，并搅拌10小时。滤出所得到的固体，用THF/水(7:6)洗涤，干燥，得到标题化合物(69 g，88%)。LC-MS: m/z=499(M+1)，纯度∶98.3%。¹H NMR(400MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 2.99-3.07(m, 2 H)3.07-3.14(m, 1 H)3.58-3.67(m, 1 H)3.68-3.76(m, 1 H)3.76-3.84(m, 1 H)4.02(s, 3 H)4.07(d, J=10.92 Hz, 1 H)6.08(s, 2 H)7.19(dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H)7.78-7.89(m, 2 H)8.41(s, 1 H)8.44(s, 2 H)8.88(s, 1 H)10.60(s, 1 H)。

制备N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4- d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2(水合物)的一般方法

在大约23℃，使N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺在THF中形成浆液，浓度为大约71 mg/ml溶剂。在搅拌下，加热该浆液，在大约60℃至大约63℃出现溶解。将水加入到该热溶液中，提供大约95∶5的THF∶水溶剂比例。加入N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2的晶种(大约3重量%负载)。将得到的稀浆液在大约60℃至大约63℃下保持大约20分钟，而后，用大约2至大约4小时加入大约5.3至大约5.5体积的水，形成大约69∶31的THF∶水溶剂比例。然后，将该浆液在大约60℃至大约63℃下保持大约30分钟，而后用大约1小时冷却至大约23℃，而后搅拌大约8-12小时。然后，过滤该浆液，用THF∶水(35∶65)轻轻地冲洗，并在大约40℃，真空干燥大约8-12小时，提供需要的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2，它是水合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2的制备样品的特点在于：使用CuKa辐射的XRD图具有下面表1所述的衍射峰(2θ值)。具体地说，该图包括处于11.8°的峰，以及一个或多个选自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

表1∶实施例1b的结晶形式2的X射线粉末衍射峰

在室温和高于大约15%的相对湿度下，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2是稳定的结晶形式。

实施例1c

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式3

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺加入到热重分析盘中，加热至大约170℃，并在170℃下保持大约5分钟。冷却至室温，提供标题化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式3的另一个制备例

在管瓶中，将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(121 mg)与乙腈(5ml)混合，并在90℃搅拌板上加热。大约30分钟之后，大部分固体溶解，提供浑浊的溶液。加入结晶形式3的晶种，并将该样品在大约90℃下搅拌大约1小时。去除加热，搅拌该混合物，提供亮白色固体。通过真空过滤分离固体，在空气流中干燥大约10分钟，而后在大约80℃下抽真空大约8至12小时，提供标题化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式3的制备样品的特点在于：使用CuKa辐射的XRD图具有下面表2所述的衍射峰(2θ值)。具体地说，该图包括处于15.7°的峰，以及一个或多个选自18.1°、27.0°和19.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

表2∶实施例1c的结晶形式3的X射线粉末衍射峰

体外试验方法∶

对于体外酶和细胞试验，在DMSO中制备试验化合物，形成10 mM储备溶液。将储备溶液在DMSO中连续稀释，获得十点稀释曲线，在96孔圆底板中，最终化合物浓度范围是10mM至0.05nM，而后进行体外酶和全细胞试验。

体外蛋白酶抑制试验∶

人类BACE1的表达

利用RT-PCR，由整个脑cDNA克隆人类BACE1(登录号∶AF190725)。将氨基酸序列#1至460所对应的核苷酸序列插入到编码人类IgG₁(Fc)多肽的cDNA中(Vasser等人，Science,286, 735-741(1999))。将BACE1(1-460)和人类Fc的融合蛋白(名称为huBACE1:Fc)构建到pJB02载体中。在HEK293细胞中短暂地表达人类BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)。将250 μg的各构成的cDNA与Fugene 6混合，并加入到1升HEK293细胞中。转染之后四天，采集条件培养基，进行纯化。

huBACE1:Fc的纯化

用蛋白A色谱纯化huBACE1:Fc。在少量的等分样品中，将酶在-80℃下储存。

BACE1 FRET试验

如上所述，制备试验化合物的系列稀释物。将化合物在KH₂PO₄缓冲液中进一步稀释20×。在相应的低蛋白结合的黑色板的A排至H排上，将10μL的每个稀释物加入到每个孔中，所述黑色板含有反应混合物(25μL的50mM KH₂PO₄，pH4.6，1mM TRITON® X-100，1mg/ml牛血清白蛋白，以及15μM的FRET底物)(参见，Yang等人，J. Neurochemistry, 91(6)1249-59(2004))。在板振荡器上，将内含物充分混合10分钟。将在KH₂PO₄缓冲液中的15μL的二百pM人类BACE1(1-460):Fc(参见，Vasser等人，Science，286，735-741(1999))加入到含有底物和试验化合物的板中，使反应开始。在板振荡器上简略混合之后，在激发波长355 nm和发射波长460 nm下，记录时间0时的混合物的RFU。用铝箔覆盖反应板，并在室温下、在黑暗的湿润烘箱中保持16至24小时。记录培养结束时的RFU，激发和发射设置与时间0所使用的相同。时间0时的RFU与培养结束时的RFU的差值代表在化合物处理条件下的BACE1的活性。将RFU差值相对于抑制剂浓度作图，并将曲线与四参数逻辑斯谛方程拟合，获得EC₅₀值和IC₅₀值(参见，Sinha等人，Nature, 402, 537-540(2000))。

基本上如上所述，检验实施例1的化合物，并且具有0.615 nM的BACE1 IC₅₀值(±0.101，n=5)[平均值±SEM；SEM=平均值的标准误差。这些数据表明，实施例1的化合物体外抑制纯的重组BACE1酶活性。

PDAPP原代神经元试验

在PDAPP转基因胚胎期的小鼠中产生的原代神经元培养物中，还进行验证性的全细胞试验。由胚胎期的16天PDAPP胚胎，制备原代皮层神经元，并在96孔板中培养(15 x 10⁴个细胞/孔，在DMEM/F12(1:1)+10% FBS中)。体外2天之后，用不含血清的DMEM/F12(1:1)(含有B27添加物和2µM(最终)Ara-C(Sigma，C1768))替换培养基。体外第5天，在存在/不存在希望浓度的抑制剂(在DMSO中稀释)的条件下，将神经元在37℃下培养24小时。培养结束时，分析条件培养基对于β-分泌酶活性的证据，例如，分析Abeta肽。使用单克隆的266作为捕获抗体，生物素化的3D6作为报道抗体，利用夹心ELISA测定全部Abeta肽(Abeta₁-x)。另外，使用单克隆2G3作为对于Abeta1-40的捕获抗体，单克隆21F12作为对于Abeta1-42的捕获抗体，通过夹心ELISA，测定Abeta 1-40和Abeta 1-42肽。Abeta1-40和Abeta1-42 ELISA使用生物素化的3D6作为报道抗体。在这种条件下，化合物处理之后，条件培养基释放的Abeta的浓度与BACE1的活性对应。绘制10点抑制曲线，并且与四参数逻辑斯谛方程拟合，获得Abeta降低效果的EC₅₀值和IC₅₀值。基本上如上所述，检验实施例1的化合物，对于Abeta降低效果显示出下列活性∶

表3

平均值±SEM；SEM=平均值的标准误差

这些数据表明，实施例1的化合物在全细胞中抑制Abeta的产生。

体内抑制β-分泌酶

一些动物模型，包括小鼠、豚鼠、狗和猴子的模型，可以用于筛选化合物处理之后的体内β-分泌酶活性抑制作用。本发明使用的动物可以是野生型、转基因或基因敲除的动物。例如，按照Games等人在Nature 373(523-527(1995))中所述制备的PDAPP小鼠模型，以及其它非转基因的或基因敲除动物，可用于分析在抑制化合物存在下体内抑制Abeta和sAPPbeta的产生。通常，给予2至12个月大的PDAPP小鼠、基因敲除小鼠或非转基因动物配制在赋形剂中的化合物，赋形剂可以是，例如，玉米油、环糊精(cyclodextran)、磷酸盐缓冲液、PHARMASOLVE®或其它合适的赋形剂。给予化合物之后一至二十四小时，将动物杀死，取出脑以及脑脊液和血浆，用于分析Abetas、C99和sAPP片段(参见，May等人，Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516(2011))。

对于标准体内药理学研究，给动物服用各种浓度的化合物，并与同时给药的赋形剂处理的对照组进行比较。对于一些时程研究，从选择的动物中获得脑组织、血浆或脑脊液，从时间0开始，形成基线。给予其它组化合物或合适的赋形剂，并在给药之后的各个时间，将动物杀死。从选择的动物中获得脑组织、血浆或脑脊液，分析APP断裂产物的出现，包括Abeta肽、sAPPbeta及其它APP片段，例如，利用特定的夹心ELISA试验。在试验结束时，将动物杀死，根据情况，分析脑组织、血浆或脑脊液中出现的Abeta肽、C99和sAPPbeta。在化合物处理之后，还可以分析APP转基因动物的脑组织中的β-淀粉样蛋白斑块的数量。本文使用的“Abeta 1-x肽”是指从残基1开始和以残基28以上的C末端结尾的Abeta种类的总和。这可以检测大部分Abeta种类，并且通常称为“全部Abeta”。

与赋形剂处理的对照物或零时对照物相比较，给予抑制化合物的动物(PDAPP或其它APP转基因的或非转基因小鼠)，可以显示出Abeta或sAPPbeta在脑组织、血浆或脑脊液中的降低，以及β淀粉样蛋白斑块在脑组织中的减小。对于实施例1，给予0.3、1或3 mg/kg口服剂量的化合物之后3小时，相比于赋形剂处理的小鼠，Abeta_1-x肽在脑海马中的水平分别降低大约31%、39%和61%，在大脑皮质中分别降低大约28%、42%和64%。

考虑到实施例1针对BACE酶的体外活性，这些Abeta降低效果与体内BACE抑制一致，并且进一步证明了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的CNS渗透性。

这些研究表明，本发明的化合物抑制BACE，并因此用于降低Abeta水平。

Claims

1.下式的化合物∶

它是晶体，

其中该晶体是水合物，且其特点在于：在X射线衍射谱中在11.8°的衍射角2θ处具有实质的峰，以及具有选自18.6°、19.3°和26.7°的峰，衍射角的容许误差为0.2度；

或

其中该晶体的特点在于：在X射线衍射谱中在15.7°的衍射角2θ处具有实质的峰，以及具有选自18.1°、27.0°和19.7°的峰，衍射角的容许误差为0.2度。

2.权利要求1的晶体化合物在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

3.权利要求1的晶体化合物在制备用于防止轻微认知损害发展成为阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

4.按照权利要求1的晶体化合物，用于治疗。

5.按照权利要求1的晶体化合物，用于治疗阿尔茨海默氏病。

6.按照权利要求1的晶体化合物，用于防止轻微认知损害发展成为阿尔茨海默氏病。

7.药物组合物，其含有按照权利要求1的晶体化合物以及一或多种可药用载体。

8.按照权利要求7的药物组合物，其中所述可药用载体包括稀释剂。