UA119987C2 - ПОХІДНА ТЕТРАГІДРОПІРОЛО[3,4-d][1,3]ТІАЗИНУ ЯК ІНГІБІТОР BACE - Google Patents

Abstract

Цей винахід стосується сполуки Формули І: , Формула І яка є кристалічною. Ця сполука Формули (І) є корисною в лікуванні хвороби Альцгеймера (інгібітор ВАСЕ).

Description

Цей винахід стосується нових кристалічних інгібіторів ВАСЕ, фармацевтичних композицій, які містять ці кристалічні інгібітори ВАСЕ, способів застосування кристалічних інгібіторів ВАСЕ для лікування фізіологічних розладів, а також проміжних хімічних сполук і процесів, придатних для їх синтезу.

Цей винахід стосується лікування хвороби Альцгеймера та інших захворювань і розладів, пов'язаних з В-амілоїдним (Абеїа) пептидом, нейротоксичним і високоагрегаційним пептидним сегментом білка попередника амілоїду (АРР). Хвороба Альцгеймера являє собою руйнівний нейродегенеративний розлад, яким уражено мільйони пацієнтів у всьому світі. Приймаючи до уваги, що поширені на ринку схвалені лікарські препарати забезпечують лише тимчасові, симптоматичні поліпшення для пацієнта, існує значна незадоволена потреба в лікуванні хвороби Альцгеймера.

Хвороба Альцгеймера характеризується утворенням, агрегацією і осадженням бета- амілоїдного білка в головному мозку. Було показано, що повне або часткове пригнічення бета- секретази (фермент, який розщеплює ДВ-сайт білка-попередника амілоїду; ВАСЕ) справляє істотний вплив на пов'язані з бляшками і залежні від бляшок патології на мишачих моделях, що дозволяє висунути припущення про те, що навіть незначне зниження рівня В-амілоїдного пептиду може призвести до довготривалого значного зниження навантаження бляшками і синаптичних дефіцитів із забезпеченням тим самим значних терапевтичних переваг, зокрема, при лікуванні хвороби Альцгеймера.

У патенті США 8,158,620 розкриті конденсовані амінодигідротіазинові похідні, які мають

ВАСЕ-пригнічувальну активність і які розкриті як корисні терапевтичні агенти для нейродегенеративного захворювання, спричиненого рВ-амілоїдним пептидом, такого як деменція альцгеймерівського типу. Крім того, у У. Мешигозсіепсе, 31(46), сторінки 16507-16516 (2011), розкритий /(5)-4-(2,4-дифтор-5-піримідин-5-ілфеніл)-4-метил-5,6б-дигідро-4Н-ГП1,З|гіазин-2-іламін як ЦНеО-активний інгібітор ВАСЕ, який вводять перорально.

Кристалічні форми інгібіторів ВАСЕ є бажаними для забезпечення легкості приготування фармацевтичних композицій і для приготування фармацевтичних композицій з поліпшеною стабільністю.

Відповідно, цим винаходом запропонована сполука Формули - М 5

С Жя

М м мно о Е

Формула

М са М су ном

Зо яка є кристалічною.

Цим винаходом запропонований спосіб лікування хвороби Альцгеймера у пацієнта, що включає введення пацієнту, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки

Формули І, яка є кристалічною. Крім того, цим винаходом запропонований спосіб запобігання прогресуванню помірного когнітивного порушення у хворобу Альцгеймера у пацієнта, який включає введення пацієнту, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки

Формули І, яка є кристалічною. Цим винаходом також запропонований спосіб пригнічування

ВАСЕ у пацієнта, який включає введення пацієнту, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки Формули І, яка є кристалічною. Цим винаходом запропонований спосіб пригнічування опосередковуваного ВАСЕ розщеплення білка- попередника амілоїду, який включає введення пацієнту, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки

Формули І, яка є кристалічною. Крім того, цим винаходом запропонований спосіб пригнічування продукування пептиду Абеїа, який включає введення пацієнту, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки Формули І, яка є кристалічною.

Крім того, цим винаходом запропонована сполука Формули І, яка є кристалічною, для застосування в терапії, зокрема, для лікування хвороби Альцгеймера або для запобігання прогресуванню помірного когнітивного порушення у хворобу Альцгеймера. На додаток до цього, цим винаходом запропоноване використання сполуки Формули І, яка є кристалічною, для виготовлення лікарського засобу для лікування хвороби Альцгеймера або для запобігання прогресуванню помірного когнітивного порушення у хворобу Альцгеймера.

Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, яка містить сполуку Формули І, яка є кристалічною, з одним або декількома фармацевтично прийнятним(-и) носієм(-ями), розріджувачем(-ами) або наповнювачем(-ами). Цей винахід також охоплює нові проміжні хімічні сполуки і процеси синтезу сполуки Формули Ї, яка є кристалічною.

Помірне когнітивне порушення визначається як потенційна продромальна фаза деменції, пов'язаної з хворобою Альцгеймера, на основі клінічних проявів і прогресування у пацієнтів, які проявляють помірне когнітивне порушення, у хворобу Альцгеймера з плином часу. (Могтів, еї аї., Агсп. Мешгої., 58, 397-405 (2001); Реїегзеп, єї аї., Ат й. Меигої!., 56, 303-308 (1999)). Термін "запобігання прогресуванню помірного когнітивного порушення у хворобу Альцгеймера" означає уповільнення, зупинення або звертання прогресування помірного когнітивного порушенння у хворобу Альцгеймера у пацієнта.

У значенні, вживаному у цьому описі, терміни "лікування" або "лікувати" означають стримування, уповільнення, зупинення, зменшення чи звертання прогресування або тяжкості існуючого симптому або розладу.

У значенні, вживаному у цьому описі, термін "пацієнт" означає людину.

Термін "пригнічення продукування бета-амілоїдного пептиду" означає зниження рівнів бета- амілоїдного пептиду у пацієнта іп мімо.

У значенні, вживаному у цьому описі, термін "ефективна кількість" означає кількість або дозу сполуки за цим винаходом або її фармацевтично прийнятної солі, яка, при одноразовому або багаторазовому введенні пацієнту, забезпечує бажаний вплив на пацієнта при діагностуванні або лікуванні.

Ефективна кількість може бути легко визначена лікарем, який ставить діагноз, як фахівцем в цій галузі, шляхом використання відомих методик і вивчення результатів, одержаних за аналогічних обставин. При визначенні ефективної кількості для пацієнта лікарем, який ставить діагноз, до уваги приймається низка факторів, в тому числі, але не обмежуючись ними: біологічний вид пацієнта; його розмір, вік і загальний стан здоров'я; конкретне наявне захворювання або розлад; ступінь ураження або тяжкість захворювання чи розладу; реакція окремого пацієнта; конкретна введена сполука; спосіб введення; характеристики біодоступності введеного препарату; вибрана схема приймання лікарського засобу; використання супутнього лікарського засобу; та інші відповідні обставини.

Сполуки за цим винаходом є, в цілому, ефективними в широкому діапазоні доз. Наприклад, добові дози зазвичай знаходяться в діапазоні від приблизно 0,01 мг/кг ваги тіла до приблизно 20 мг/кг ваги тіла. У деяких випадках рівні доз нижче нижньої межі вищевказаного діапазону можуть бути більш ніж достатніми, тоді як в інших випадках можуть бути використані ще більш високі дози з прийнятними побічними ефектами, і, відповідно, вищевказаний діапазон доз не призначений для будь-якого обмеження обсягу цього винаходу.

Сполукам за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, надають форму фармацевтичних композицій, які вводять будь-яким шляхом, який забезпечує біологічну доступність, в тому числі оральним, трансдермальним та парентеральним шляхами. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, такі композиції є призначеними для перорального або черезшкірного введення, причому особливу перевагу віддають пероральному введенню. Такі фармацевтичні композиції і способи їх одержання добре відомі в цій галузі. (Дивись, наприклад, Кетіпдіоп: Тпе Зсіеєпсе апа Ргасіїсе ої Рпагптасу (О.В. Тгоу, Еайог, 2151

Еайоп, І ірріпсой, УМШіатв в УМІКіпо, 2006).

Кристалічні сполуки Формули | є особливо придатними для способів лікування за цим винаходом, але деяким формам віддається перевага. Далі наведено опис таких форм. Слід розуміти, що ці переваги стосуються як способів лікування, так і нових сполук за цим винаходом.

Кристалічна Форма 1 /М-ІЗ3-МК4ав, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду;

Кристалічна Форма 2 М-ІЗ-К4авВ, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду;

Кристалічна Форма 2 М-ІЗ-К4авВ, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду, яка характеризується значним піком в спектрі дифракції рентгенівських променів, при куті дифракції 2-тета 11,87, в комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 18,67, 19,37 ії 26,7", з допуском на кути дифракції 0,2 градуса.

Кристалічна Форма 3 М-ІЗ-МК4авВ, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду; та

Кристалічній Формі 3 М-ІЗ-К(4аВ, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду, яка характеризується значним піком в спектрі дифракції рентгенівських променів, при куті дифракції 60 2-тета 15,7", в комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають

18,17, 27,07 ї 19,7", з допуском на кути дифракції 0,2 градуса, віддається перевага.

Кристалічній формі 2 М-ІЗ3-МК4айвВ, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторопіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду віддається більша перевага.

Кристалічній формі 2 М-ІЗ3-МК4айвВ, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторопіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамиду, яка характеризується значним піком в спектрі дифракції рентгенівських променів, при куті дифракції 2-тета 11,87, в комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 18,67, 19,37 і 26,7", з допуском на кути дифракції 0,2 градуса, віддається особлива перевага.

Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що сполуки за цим винаходом можуть існувати в таутомерних формах, як показано на Схемі А. У разі будь-якого посилання в цьому описі на один з конкретних таутомерів сполуки за цим винаходом, слід розуміти, що ним охоплюються як таутомерні форми, так і всі їх суміші.

СхемаА -М -М 8 5 в М дедаФфі Ян м" сМмНнео -е- А - ----х Е о й є о

М - М са М су шо і5 НнзСО М З

На додаток до цього, деякі проміжні хімічні сполуки, описані в наведених нижче схемах, можуть містити одну або декілька азотзахисних груп. Замінювана захисна група може бути однаковою або різною в кожному випадку, залежно від конкретних умов реакції і конкретного перетворення, яке має бути здійснено. Умови приєднання і відщеплення захисних груп добре відомі фахівцю, і описані в літературі (дивись, наприклад, "сгеепе"5 Ргоїесіїме Сптоирз іп Огдапіс

Зупіпезів", Гоиип Еайіоп, Бу Реїег С.М. М/ців5 апа Тнеодога МУ. Стеєпе, доп УміІеу апа 5опв, Іпс. 2007).

Деякі стереохімічні центри були залишені невизначеними і деякі замісники були усунені в наведених нижче схемах заради ясності, що не є призначеним для будь-якого обмеження ідей цих схем. Крім того, окремі ізомери, енантіомери та діастереоізомери можуть бути відокремлені або розділені фахівцем в цій галузі в будь-який зручний момент часу у процесі синтезу сполук за цим винаходом такими методами, як селективна кристалізація або хіральна хроматографія (дивись, наприклад, 9. дУасдиев, еї а!., "Епапітегв5, Касетаїйез, апа КезоїІшіопв", дУопп Уміеу апа зоп5, Іпс., 1981, та Е.С. ЄЕїе! апа 5.Н. УмМіеп, " З(егеоспетізігу ої Огдапіс Сотроипав", Уміеу-

Зо Іп(егзсіепсе, 1994). Позначення "ізомер 1" ї "ізомер 2" означають сполуки, які елююються при здійсненні хірального хроматографування першою та другою, відповідно, і, якщо хіральна хроматографія ініціюється на початку синтезу, те ж саме позначення застосовується до подальших проміжних хімічних сполук і прикладів.

Деякі абревіатури визначені так, як наведено нижче: "АРР" означає білок-попередник амілоїда; "СЕ" означає цереброспінальну рідину; "ОСМ" означає дихлорметан; "ОІРЕА" означає діїзопропілетиламін або /М-етил-М-ізопропіллропан-2-амін; "ОМЕМ" означає модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла; "ОМЕ" означає диметилформамід; "ОМ5О" означає диметилсульфоксид; "ЕЮОСІ" означає /1-(З-диметиламінопропіл)-3- етилкарбодіїміду гідрохлорид; "ее" означає енантіомерний надлишок; "ЕОАс" означає етилацетат; "Прикл." означає приклад; "Е12" означає середовище Нат Е12; "ЕВ5" означає ембріональну бичачу сироватку; "ЕКЕТ" означає флуоресцентне резонансне перенесення енергії; "НЕК" означає лінію клітин нирок людського зародку; "НОАс" означає оцтову кислоту; "НОВ" означає 1-гідроксибензотриазол гідрат; "НРІ С" означає рідинну хроматографію високої ефективності; "ІСвоє- означає концентрацію агента, що спричинює 50 906 максимальної реакції пригнічення, можливої для цього агента; "хв" означає хвилину або хвилини; "МТВЕ" означає метил-трет-бутиловий ефір; "РОАРР" означає тромбоцитарний білок-попередник амілоїда; "Ргер" означає препаративну методику; "КРИ" означає відносну одиницю флуоресценції; "ЗСХ" означає хроматографію з сильною катіонообмінню смолою; "Кі" означає час утримування; "ЗЕС" означає надкритичну рідинну хроматографію; "ЗЕМ" означає середню квадратичну помилку середнього; "ТНЕ" означає тетрагідрофуран.

Сполуки за цим винаходом можна одержати із застосуванням різноманітних методів, відомих в цій галузі, деякі з яких пояснені наведеними нижче Препаративними методиками та

Прикладами. Специфічні стадії синтезу для кожного з описаних шляхів можуть бути скомбіновані у різні шляхи або поєднані зі стадіями з різних препаративних методик для одержання сполук за цим винаходом. Продукти кожної стадії можуть виділятись традиційними методами, добре відомими в цій галузі, в тому числі екстракцією, випарюванням, осадженням, хроматографуванням, фільтрацією, розтиранням або кристалізацією. Вказані реактиви і вихідні матеріали є легкодоступними для фахівця у цій галузі.

Преперативна методика 1 2-бром-1-(5-бром-2-фторфеніл)етан-1-он

ЕЕ О со

Вг

М-бромсукцинімід (984 г, 5,53 моль) порціями додають до розчину 1-(5-бром-2- фторфеніл)етан-1-ону (1000 г, 4,6 моль) і п-толуолсульфокислоти (1315 г, 7,64 моль) в ОСМ (7 л) при температурі 35"С. Суміш перемішують, і нагрівають до температури 40 "с. Суміш охолоджують до температури 24 "С, і додають 7 95 розчин МансСоОз (5 л). Шари розділяють, і органічний шар промивають 1095 розчином Маг5Оз (5 л) і водою (5 л). Органічний шар концентрують до 2-3 об'ємів для одержання вказаної в заголовку сполуки, яку використовують без подальшої очистки.

Препаративна методика 2 5-аліл-ба-(5-бром-2-фторфеніл)-1-(4-метоксибензил)гексагідро-1Н-піролої|3,4-с|ізоксазол

М

В

Е що

ВГ

До розчину 2-бром-1-(5-бром-2-фторфеніл)етан-1-ону (1363 г, 4,61 моль) в толуолі (10 л) додають діаліламін (537 г, 5,53 моль) і ОІРЕА (2381 г, 18,42 моль). Суміш перемішують протягом 4 год. при температурі 40 "С, та одержують 1-(5-бром-2-фторфеніл)-2-(діаліламіно)етан-1-он, який не виділяють. До одержаної суміші, яка містить неочищений 1-(5-бром-2-фторфеніл)-2- (діаліламіно)етан-1-он, додають М-(4-метоксибензил)гідроксиламін (847 г, 5,53 моль) і Ті(ОіРг)4 (1965 г, 6,91 моль). Суміш перемішують при температурі 90 "С протягом 2 год. Суміш охолоджують до температури 20 "С, і додають 5095 моногідрат лимонної кислоти (4 л) і насичений розчин МагбОз (4 л). Шари розділяють, і водний шар екстрагують МТВЕ (5 л).

Органічний екстракт промивають водою (5 л), фільтрують через діатомову землю, і концентрують досуха. До залишку додають ЕАс (10 л) і щавлеву кислоту (580 г), тверду

Зо речовину відфільтровують, і додають до Ін розчину Масон (13 л). Додають МТВЕ (5 л), ії суміш фільтрують через діатомову землю. Шари розділяють, і органічний шар концентрують до 2 об'ємів. Додають гептан (3 л), і одержаний розчин охолоджують до температури 10 "с.

Одержану тверду речовину відфільтровують, та одержують вказану в заголовку сполуку (1330 г, 64 95). "Н ЯМР(400 МГц, СОСІ») 6: 2,51-2,49(т, ЗН), 3,09-3,04(т, ЗН), 3,78-3,41(т, 6Н), 4,01(т, 1Н), 5,24-5,01(т, 2Н), 5,89-5,685(т, 1Н), 6,82-6,80(т, 2Н), 7,51-7,13(т, ЗН), 7,63-7,62(т, 1Н), 7,65- 7 ва(т, 1Н).

Препаративна методика З

Б-аліл-ба-(5-бром-2-фторфеніл)гексагідро-1Н-піролої|3,4-с|ізоксазолу гідрохлорид -/" |; - М й Я но

Вг

Трифтороцтову кислоту (4 л, 52,9 моль) краплями додають до розчину 5-аліл-ба-(5-бром-2- фторфеніл)-1-(4-метоксибензил)гексагідро-1 Н-піроло|3,4-сіізоксазолу (1990 г, 4,45 моль) в ОСМ (12 л) зі швидкістю, яка забезпечує підтримання температури нижче 35 "С. Після завершення додавання, суміш нагрівають до температури 33-43 "С, і перемішують протягом 6 год. Розчин

Маон (20 95, 10 л) додають зі швидкістю, яка забезпечує підтримання температури нижче 35 "С.

Шари розділяють, і органічний шар промивають водою (б л). Розчин концентрують, додають етанол (16 л), і одержану суміш фільтрують через діатомову землю. Фільтрат концентрують, і додають ЕЮАс (10 л). Додають 4М НСІ в ЕЮАс (8 л), і одержану в результаті тверду речовину відфільтровують, і сушать для одержання вказаної в заголовку сполуки (1385 г, 85,6 95). Е5 т/7 327 1 (Мат)

Препаративна методика 4 (1-аліл-4-аміно-4-(5-бром-2-фторфеніл)піролідин-3-іл)уметанол он - -- Мне

Е

Вг

Насичений водний розчин карбонату натрію додають до розчину 5-аліл-ба-(5-бром-2- фторфеніл)гексагідро-1Н-піроло!/З3,4-сіізоксазолу гідрохлориду (1400 г, 3,85 моль) в ОСМ (7 л) для доведення рН»9. Шари розділяють, і органічний екстракт концентрують до 1,5 об'ємів.

Додають оцтову кислоту (1,38 л), і одержаний розчин концентрують до 2 л. Додають оцтову кислоту (7 л) і цинковий порошок (2,5 кг, 38,5 моль), одержану суміш нагрівають до температури 40-50 "С, і перемішують протягом З год. Додають Е(ОАс (9,8 л), і одержану суміш фільтрують через діатомову землю. Відфільтрований осад промивають ЕОАсС (4 л). Фільтрат відділяють, і до об'єднаних органічних шарів додають воду (7 л). Додають гідроксид амонію для досягнення рнагЗ9. Шари розділяють, і органічний шар концентрують до 2 л. Додають етанол (2,8 л), і розчин концентрують до 2 л. Додають етанол (19 л), і одержану суміш фільтрують через діатомову землю, та одержують розчин вказаної в заголовку сполуки в етанолі, який використовують без подальшої очистки.

Препаративна методика 5 (35, 48)-1-аліл-3-(5-бром-2-фторфеніл)-4-(гідроксиметил)піролідин-З-іл|амоній; (25, 35)-4- гідрокси-2,3-біс((4-метилбензоїл)окси|-4-оксобутаноат уд ого жо о 9,0

Вг

Моногідрат ди-п-толуоїл-І -винної кислоти (1,04 кг, 2,69 моль) додають до розчину (1-аліл-4- аміно-4-(5-бром-2-фторфеніл)піролідин-3-ілуметанолу (1264 г, 3,85 ммоль) в етанолі (21 л).

Суміш нагрівають до температури 65-75 "С, і перемішують протягом З год. Суміш охолоджують до температури 5-10 "С, додають затравний кристал |(35, 4К)-1-аліл-3-(5-бром-2-фторфеніл)-4- (гідроксиметил)піролідин-3-іл|Іамонію; (25, 35)-4-гідрокси-2,3-біс|(4-метилбензоїл)окси|-4- оксобутаноату (1,0 г), і одержану суміш перемішують протягом З год. Тверду речовину

Зо відфільтровують, і відфільтрований осад промивають холодним етанолом (1,4 л).

Відфільтрований осад сушать, та одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору. Хіральний кількісний аналіз другого елюйованого ізомеру (колонка: ІС

СпігаІрак, 4,6 мм"250 мм"5 мкм; елюент: 90 Фо гексану (0,3 9о діетиламіну):10 96 етанолу (0,3 95 діеєтиламіну); швидкість потоку 1,0 мл/хв при УФ 270 нм) підтверджує наявність енантіомерно збагаченого (99 95 ее) енантіомера з Е-7,4 хв, (1050 г, 38 95). "Н ЯМР(400 МГц, СОзОр) б: 2,40(5, 6Н), 3,05-3,04(т, 1Н), 3,57-3,31(т, ЗН), 3,66-3,58(т, 4Н), 3,75-3,74(т, 2Н), 5,38-5,36(т, 1Н), 5,50-5,46(т, 1Н), 5,88(5, 2Н), 5,97-5,91(т, 1Н), 7,10-7,05(т, 1Н), 7,29(а, 9У-8,0 Гу, 4Н), 7,53- 7,51(т, 1Н), 7,80-7,78(т, 1Н), 8,01(а, 9-8,0 Гц, 4Н).

Препаративна методика 6 (ЗВ, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(5-бром-2-фторфеніл)піролідин-3-іл)уметанол он х ше мно

Е

Вг

ТІн розчин НСІ (500 мл, 500 ммоль) додають до розчину |(35, 4К)-1-аліл-3-(5-бром-2- фторфеніл)-4-(гідроксиметил)піролідин-3-ілІіамонію; (25, 35)-4-гідрокси-2,3-біс|(4- метилбензоїл)окси|-4-оксобутаноату (100 г, 139, ммоль) в ЕЮАс (500 мл), який має температуру 0 "С. Суміш перемішують протягом 1 год. Водний шар відокремлюють, і рн доводять до 8 1н розчином Маон. Водний шар екстрагують ЕЮАс (350 мл х2). Органічні шари об'єднують, промивають водою (500 мл), і концентрують до одержання вказаної в заголовку сполуки (40 г, 87 95). Хіральний кількісний аналіз другого елюйованого ізомеру (колонка: ІС

СпігаІрак, 4,6 мм"250 мм"5 мкм; елюент: 90 Фо гексану (0,3 9о діетиламіну):10 96 етанолу (0,3 95 діетиламіну); швидкість потоку 1,0 мл/хв при УФ 270 нм) підтверджує наявність енантіомерно збагаченого (99,7 95 еє) енантіомера з Б-7,4 хв. "Н ЯМР(400 МГц, СОСІ» б: 2,78-2,70(т, 5Н), 3,16-3,00(т, ЗН), 3,87-3,75(т, 1Н), 3,90-3,684(т, 1Н), 5,24-5511(т, 2Н), 5,91-5,87(т, 1Н), 6,95- 6,91(т, 1Н), 7,35-7,32(т, 1Н), 7,67-7,65 (т, 1Н).

Препаративна методика 7

М-((35, 48)-1-аліл-3-(5-бром-2-фторфеніл)-4-(гідроксиметил)піролідин-3- іл)укарбамотіоїл)бензамід он м 5 ж Б0

Око

Е н н

ВГ

Бензоїлізотіоціанат (15,0 г, 91,9 ммоль) додають до розчину ((ЗК, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(5- бром-2-фторфеніл)піролідин-З-іл)уметанолу (30 г, 91,1 ммоль) в ТНЕ (400 мл), який має температуру 0 "С. Одержаний розчин нагрівають до температури 25 "С, і перемішують протягом 1 год. для одержання розчину вказаної в заголовку сполуки в ТНЕ, який використовують без подальшої очистки.

Препаративна методика 8

Мм-(4ав, Ттавз)-6-аліл-7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4 да, 5,6,7,7а-гексагідропіролої3,4- «1,3 гіазин-2-іл)убензаміду дигідрохлорид

М З і) пуд шо

Е н

Вг гне

Трифенілфосфін (36,8 г, 140,3 ммоль) додають до розчину М-((35, 48)-1-аліл-3-(5-бром-2- фторфеніл)-4-(гідроксиметил)піролідин-3-ілукарбамотіоїл/бензаміду (91,1 ммоль) у ТНЕ (400 мл). Додають розчин ди-трет-бутилазодікарбоксилату (31,6 г, 137,2 ммоль) в ТНЕ (100 мл).

Зо Одержану суміш перемішують при температурі 20-30 "С протягом 2 год. Суміш концентрують, і додають МТВЕ (400 мл). Одержаний розчин фільтрують через діатомову землю, і відфільтрований осад промивають МТВЕ (130 мл). Фільтрати об'єднують, і додають 1н розчин

НСІ в ЕІЮАс (200 мл). Суміш перемішують протягом 2 год., після чого концентрують до об'єму 500 мл. Додають МТВЕ (320 мл), одержаний розчин фільтрують, і промивають гептаном (130 мл). Тверду речовину суспендують в ЕОАс (650 мл), і перемішують при температурі 50-60 С протягом 2 год. Гарячу суспензію фільтрують, твердий продукт промивають ЕІОАс (130 мл) і гептаном (130 мл). Тверду речовину ресуспендують в ЕОАс (650 мл), і перемішують протягом 2 год. при температурі 50-60 "С. Гарячу суспензію фільтрують, і промивають ЕЮАс (130 мл) і гептаном (130 мл). Тверду речовину сушать, та одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді подвійної хлористоводневої солі (40 г, 80 95, 99,5 95 еє). Хіральний кількісний аналіз першого елюйованого ізомеру (колонка: ІС СпігаІрак, 4,6 мм"250 мм"5 мкм; елюент: 85 95 гексан (0,1 до діетиламіну):15 95 ізопропілового спирту (0,1 9о діетиламіну); швидкість потоку 1,0 мл/хв при УФ 282 нм) підтверджує наявність енантіомерно збагаченого (99,5 95 ее) енантіомера з

Ве12,5 хв.

Препаративна методика 9

Мм-(4ав, Ттавз)-6-аліл-7а-(2-фтор-5-(2,2,2-трифторацетамідо)феніл)-4 да, 5,6,7,7а- гексагідропіроло|3,4-4111,3)гіазин-2-іл)бензамід не пе Ме М до Бе и хх - ї Коди

Ї ї - кет» ато, 15 95 розчин карбонату натрію (440 мл) додають до розчину М-(4ав, 7аб5)-6-аліл-7а-(5-бром- 2-фторфеніл)-4,4а, 5,6,7,7а-гексагідропіроло|3,4-4111,3)тіазин-2-іл)бензаміда дигідрохлориду (495 г, 717,88 ммоль) в ЕОАс (З л) і воді (784 мл). Одержану суміш перемішують протягом 1-2 год. Шари розділяють, органічний шар фільтрують через силікагель (40 г), ії промивають ЕЮАс (600 мл). Фільтрат концентрують досуха, і одержують М-((4аВ, 7авб5)-6-аліл-7а-(5-бром-2- фторфеніл)-4,4а, 5,6,7,7а-гексагідропіроло|3,4-4111,3)гіазин-2-іл)/бензамід. До розчину М-(4ав,

Ттав5)-6-аліл-7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4 да, 5,6,7,7а-гексагідропіроло|3,4-4)11,3гіазин-2- іл)бензаміду (341 г, 494,54 ммоль) в 0М5О (525 мл) і 1,4-діоксані (1,025 л) додають трифторацетамід (136,7 г, 1,21 моль), Маї (182,5 г, 1,22 моль), 4 А молекулярні сита (342 г) |і

К»бОз (170,9 г, 1,24 моль). До цієї реакційної суміші додають розчин транс-М, М'- диметилциклогексану (81,6 г, 573,66 ммоль), і йодиду міді (27,3 г, 143,34 ммоль) в ОМ5О (500 мл). Суміш перемішують протягом 5 хв. Суміш нагрівають до температури 100 "С, перемішують протягом 8 год., і охолоджують до температури 24 "С. Додають воду (5,9 л) і ОСМ (5,9 л), суміш фільтрують, і шари розділяють. Органічний шар промивають водою (5,9 л), та одержують розчин вказаної в заголовку сполуки в ОСМ, який використовують без подальшої очистки.

Препаративна методика 10

Мм-(4ав, Ттав5)-6-аліл-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-4 да, 5,6,7,7а-гексагідропіроло!|З,4- 911,3 гіазин-2-іл)бензаміду гідрохлорид не о

Е н мно

НОЇ

До розчину М-((4айВ, 7аб5)-6-аліл-7а-(2-фтор-5-(2,2,2-трифторацетамідо)феніл)-4 да, 5,6,7,7а- гексагідропіролої3,4-4111,3)гіазин-2-іл)бензаміду (250 г, 494,4 ммоль) в ОСМ додають гідроксид натрію (28,7 г) і воду (2,7 л), і одержану суміш перемішують при температурі 242С протягом 68 год. Додають ін розчин НСІ (3,5 л) для доведення рН до 1-3. Шари розділяють, і водний шар

Зо промивають ОСМ (680 мл). До водного розчину додають спочатку ОСМ (4 л), а потім 21 95 розчин гідроксиду амонію для доведення рН до 8-10. Шари розділяють, і органічні екстракти об'єднують, фільтрують через силікагель (170 г), і промивають ЮОСМ (1,4 л). Розчинник концентрують досуха, і розбавляють ЕОАсС (4 л). 1Ін розчин НСІ в ЕІОАс (700 мл) додають при температурі нижче 25"С, і суміш перемішують протягом 1 год. Суміш концентрують до приблизно 7-8 об'ємів, і додають ЕІАс (2,8 л). Одержаний осад фільтрують, і промивають

ЕОАс (400 мл). Тверду речовину сушать, та одержують вказану в заголовку сполуку. (246 г, 52 об).

Препаративна методика 11

Мм-(4ав, тав5)-7а-(5-ацетамідо-2-фторфеніл)-6-аліл-4 да, 5,6,7,7а-гексагідропіроло!|З,4- «1,3 гіазин-2-іл)бензамід

З в);

М

Е ; Н

Мн ост

Оцтовий ангідрид (23,5 г, 0,23 моль) додають до розчину М-(4ав, 7аб5)-6-аліл-7а-(5-аміно-2- фторфеніл)-4,4а, 5,6,7,7а-гексагідропіроло|3,4-4111,3)гіазин-2-іл)бензаміду гідрохлориду (100 г, 0,153 моль) і триетиламіну (54,3 г, 0,535 моль) в ОСМ (800 мл). Після перемішування протягом 1 год. при температурі 20-25 "С додають насичений розчин МансСоз (700 мл) і воду (600 мл).

Шари розділяють, та одержують вказану в заголовку сполуку, яку використовують без додаткового очищення у вигляді розчину в ОСМ.

Препаративна методика 12

М-(4ав, 7авб5)-7а-(5-ацетамідо-2-фторфеніл)-4,4а, 5,6,7,7а-гексагідропіролоЇ3,4-411И1,3|гіазин- 2-іл)бензамід

НМ АХ 9

Х де

Е н

МН осв

До розчину Мм-(4ан, Ттавбз)-7а-(5-ацетамідо-2-фторфеніл)-6-аліл-4 да, 5,6,7,7а- гексагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-2-іл)бензаміду (0,153 моль) в ОСМ додають трифенілфосфін (4,0 г, 0,015 моль) їі 1,3-диметилбарбітурову кислоту (15,2 г, 0,097 моль). Додають ацетат паладію (1,7 г, 7,7 ммоль), і одержану суміш перемішують при температурі від 20 "С до 30" протягом 1 год. Додають 2595 гідроксиду амонію, і шари розділяють. Органічний шар промивають НОАс (3,0 екв в 500 мл води), і рН доводять до 8-9 за допомогою 25 95 розчину гідроксиду амонію. Водний шар екстрагують ОСМ (2х500 мл). Органічні екстракти об'єднують, і концентрують до 3-4 об'ємів. Додають МТВЕ (1 л), і суміш фільтрують. Суміш концентрують, і додають гептан (1 л). Одержану тверду речовину фільтрують, збирають, сушать, та одержують вказану в заголовку сполуку (48 г, 76 95). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») 0: 2,15 (5, ЗН), 2,87-2,83(т, 1Н), 3,43-3,23(т, 5Н), 3,70-3,67(т, 1Н), 7,12-7,07 (т, 1Н), 7,28-7,27 (т, 1Н), 7,52-7,А1(т, 4Н), 7,79(т, 1Н), 8,18-8,16(т, 2Н). Е5 т/2 4131 (М-н1).

Препаративна методика 13

Мм-(4ав, тав5)-7а-(5-ацетамідо-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,6,7,7а- гексагідропіролої3,4-4111,3)гіазин-2-іл)бензамід

М

6 ді | Я

Е н н бу і)

До розчину М-(4авВ, 7авб5)-7а-(5-ацетамідо-2-фторфеніл)-4,4а, 5,6,7,7а-гексагідропіролоїЇ3,4- «1,3 гіазин-2-іл/бензаміду (50 г, 121,22 ммоль) в ЮОМЕ (100 мл) додають 2-хлор-5-

Зо фторпіримідин (28,9 г, 218 ммоль) і карбонат калію (33,46 г, 242,1 ммоль). Суміш нагрівають до температури 80-85 "С протягом 8 год. Суміш охолоджують до температури 24 "С, фільтрують, і промивають ЮМЕ (100 мл). Тверді речовини суспендують у воді (2 л), і фільтрують для одержання вказаної в заголовку сполуки (68,5 г, 98 965). І! С-М5: т/2-509,2 (М--1)--, "Н ЯМР (400

МГц, ав-ЮМ5О) б ррт 1,22 (І, 9-728 Гц, 2 Н) 1,92-2,07 (т, 6 Н) 2,89-3,20 (т, 2 Н) 3,36-3,44 (т, 1

Н) 3,67 (І, У-9,54 Гу, 1 Н) 3,84 (Бг. 5., 1 Н) 4,16 (ру. 5., 2 Н) 7,23 (Брг. 5., 2 Н) 7,35-7,61 (т, 8 Н) 7,77 (г. 5., 2 Н) 7,85-8,18 (т, 4 Н) 8,48 (5, 4 Н) 10,15 (Бі. 5., 1 Н) 10,46-10,59 (т, 1 Н).

Препаративна методика 14 (4абв, тавз)-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,6,7,7а-

гексагідропіролої3,4-4|11,3)гіазин-2-амін

М даже - М м'сМмн,

Е мно

Гідроксид літію (8,6 г, 204,9 ммоль) додають до розчину М-((4аВ, 7аб)-7а-(5-ацетамідо-2- фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4, да, 5,6,7,7а-гексагідропіроло|3,4-4)11,3гіазин-2- 5 іл/бензаміду (80 г, 157,3 ммоль) в метанолі (400 мл). Суміш нагрівають до температури 60-70 С протягом 4 год. Додають концентровану НСІ (132 г), і одержану суміш перемішують при температурі 55 "С протягом 18 год. Суміш охолоджують до температури 30 "С, і концентрують для видалення метанолу. Додають воду, і водний шар екстрагують ОСМ (Зх) для одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді водного розчину (920 г), 5,6 95 від загальної маси якого становить вказана в заголовку сполука, яку використовують без додаткового очищення.

Препаративна методика 15

Бензил-М-аліл-М-(2,2-диметоксіетилукарбамат (9: о; оби сг її на

Розчин бензил-М-(2,2-диметоксіетил)укарбамату (50 г, 208,9 ммоль) в толуолі (180 мл) обробляють твердим гідроксидом калію (51,6 г, 919,69 ммоль) в атмосфері азоту. Через 10 хв додають бензилтриєетиламонійхлорид (0,8 г, 3,1 ммоль). Ще через 10 хв краплями протягом 10 хв додають розчин алілброміду (33 г, 272,8 ммоль) в толуолі (50 мл). Одержану суміш перемішують при температурі 50 С протягом 48 год. Суміш охолоджують до кімнатної температури, і гасять водою. Органічний шар відокремлюють, промивають розсолом, сушать над сульфатом магнію, і концентрують досуха для одержання вказаної в заголовку сполуки (44 г, 75 96). ЕБ/М5 (т/е): 280 (М.-Н).

Препаративна методика 16

Бензил-М-аліл-М-(2-оксоетил)карбамат 6) в) оХие

З н

Розчин бензил-М-аліл-М-(2,2-диметоксіетил)карбамату (30 г, 107 ммоль) в мурашиній кислоті (36,8 мл, 860 ммоль) і воді (4,84 мл) перемішують при кімнатній температурі протягом ночі.

Суміш концентрують, і розбавляють сумішшю гексани/Е(ОАс (1:22) і води. Органічний шар відокремлюють, промивають розсолом до рнН-б, і сушать над сульфатом натрію. Розчинник випарюють для одержання вказаної в заголовку сполуки (25 г, 99 95). ЕБ/М5 (т/е): 234 (М.Н).

Зо Препаративна методика 17

Бензил-М-аліл-М-(2-гідроксиіміноетилікарбамат в)

Оу он сг

Розчин бензил-М-аліл-М-(2-оксоетил)укарбамату (25 г, 107 ммоль) в ацетонітрилі (150 мл) обробляють гідрохлоридом гідроксиламіну (9,68 г, 139 ммоль) і розчином тригідрату ацетату натрію (16 г, 117,9 ммоль) у воді (75 мл). Суміш перемішують при кімнатній температурі протягом ночі. Ацетонітрил випарюють, і водний розчин екстрагують ЕАбс. Органічний шар відокремлюють, сушать над сульфатом магнію, і концентрують у вакуумі до одержання вказаної в заголовку сполуки (24 г, 90 95). ЕБ/М5 (т/е): 249 (М.Н).

Препаративна методика 18

Бензил-3,За, 4 б-тетрагідропіроло|З3,4-с|ізоксазол-5-карбоксилат о а; о М

Розчин бензил-М-аліл-М-(2-гідроксіїміноетилІкарбамату (24 г, 96,6 ммоль) в ОСМ (338 мл) обробляють шляхом додавання краплями протягом 10 хв 5595 (мас.) водного розчину гіпохлориту натрію (106,08 ммоль, 143,06 мл). Одержану суміш перемішують при кімнатній температурі протягом ночі. Реакцію переривають 40 95 водним розчином бісульфіту натрію (7 г).

Органічний шар відокремлюють, сушать над сульфатом магнію, і концентрують у вакуумі.

Неочищений продукт очищають на силікагелі шляхом елюювання 595 ЕЮАсС в гексанах до одержання вказаної в заголовку сполуки (18 г, 75 90). ЕБ/М5 (т/е): 247 (МАН).

Препаративна методика 19

Бензил-ба-(5-бром-2-фторфеніл)-3,За, 4,6-тетрагідро-1 Н-піроло|З,4-с|ізоксазол-5- карбоксилат в) у-м |е (о; М й Не

Вг 1,6 М розчин п-бутиллітію в гексанах (25,4 мл, 40,6 ммоль) краплями додають до розчину 4- бром-1-фтор-2-йодбензолу (12,22 г, 40,6 ммоль) в ТНЕ (60 мл), який має температуру -78 "С, та одержують розчин жовтого кольору, який перемішують при температурі -78 "С протягом 15 хв.

Ефірат трифториду бору (5,14 мл, 40,6 ммоль) додають до окремого розчину бензил-3,За, 4,6- тетрагідропіроло|З3,4-с|зоксазол-5-карбоксилату (5 г, 20,3 ммоль) в ТНЕ (60 мл), який має температуру -78 "С, і суміш перемішують при температурі -78 "С протягом 5 хв. Цей розчин через канюлю додають до заздалегідь приготованої літійорганічної суміші, яка має температуру -78 "С. Об'єднану суміш перемішують протягом 30 хв при температурі -78 "С. Суміш гасять насиченим водним розчином хлориду амонію, і нагрівають до кімнатної температури. Суміш екстрагують ЕЇОАс (Зх), і органічні екстракти об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і розчинник видаляють іп масио. Неочищений продукт очищають на силікагелі шляхом елюювання з градієнтом від 595 до 10095 ЕОАсС в гексанах протягом 35 хв, та одержують вказану в заголовку сполуку (2,27 г, 27 Ус). ЕБ/М5 (т/е): ("Ві/Вг) 421/423 (МН).

Препаративна методика 20

Бензил-1-(бензоїлкарбамотіоїл)-ба-(5-бром-2-фторфеніл)-3,За, 4,6-тетрагідропіроло!|З,4- сізоксазол-5-карбоксилат (о) ід ФЕНИ гі У 5 о

Вг

Бензоїлізотіоціанат (2,87 мл, 21,28 ммоль) краплями додають до розчину бензил-ба-(5- бром-2-фторфеніл)-3,За, 4,6-тетрагідро-1Н-піролої|3,4-с|ізоксазол-5-карбоксилату (5,977 г, 14,2 ммоль) в ТНЕ (95 мл), і перемішують протягом ночі в атмосфері азоту. Розчинник видаляють іп масцо. Неочищений продукт очищають на силікагелі шляхом елюювання з градієнтом від 5 95 до 10095 ЕТАс в гексанах протягом 30 хв, та одержують вказану в заголовку сполуку (6,05 г, 73 96). ЕБ/М5 (т/еє): (7ВІ/'Вг) 584/586 (М--Н).

Препаративна методика 21

Бензил-3-(бензоїлкарбамотіоїламіно)-3-(5-бром-2-фторфеніл)-4-(гідроксиметил)піролідин-1- карбоксилат он о я ще о М й Е У (в)

Вг

Суміш бензил-1-(бензоїлкарбамотіоїл)-ба-(5-бром-2-фторфеніл)-3,За, 4,6- тетрагідропіроло|3,4-с|ізоксазол-5-карбоксилату (6,05 г, 10,4 ммоль) і цинкового пилу («10 мкм) (6,77 г, 103,5 ммоль) перемішують в оцтовій кислоті (52 мл) при кімнатній температурі протягом 5 ночі в атмосфері азоту. Реакційну суміш розбавляють ЕОАс, і фільтрують через діатомову землю. Розчинник видаляють іп масо, і залишок розбавляють ЕАсС, водою і насиченим водним розчином бікарбонату натрію. Суміш екстрагують ЕІОАсС (Зх), об'єднані органічні шари об'єднують, і сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і розчинник видаляють іп масио.

Неочищений продукт очищають на силікагелі шляхом елюювання з градієнтом від 5 95 до 100 Фо

ЕКОАсС в гексанах протягом 30 хв для одержання вказаної в заголовку сполуки (5,222 г, 86 95).

ЕБ/М5 (т/е): (Вг/"'Вг) 586/588 (МНН).

Препаративна методика 22

Бензил-2-бензамід-7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-410П1,3)гіазин-6- карбоксилат

У м в о о ис о Й

Вг 1,1-карбонілдімідазол (2,87 г, 17,7 ммоль) додають до розчину бензил-3- (бензоїлкарбамотіоїламіно)-3-(5-бром-2-фторфеніл)-4-(гідроксиметил)піролідин-1-карбоксилату (5,198 г, 8,86 ммоль) в ТНЕ (52 мл). Суміш перемішують протягом 1,5 год. при кімнатній температурі, після чого реакційну суміш нагрівають до кипіння, і кип'ятять зі зворотним холодильником протягом ночі в атмосфері азоту. Реакційну суміш охолоджують, розбавляють водою, і екстрагують Е(ОАс (Зх). Органічні шари об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і розчинник видаляють іп масио. Неочищений продукт очищають на силікагелі шляхом елюювання з градієнтом від 595 до 10095 ЕТОАс в гексанах протягом 30 хв до одержання вказаної в заголовку сполуки (2,93 г, 58 Ус). ЕБ/М5 (т/е): ("Ві/'Вг) 568/570 (М'-Н).

Препаративна методика 23

М-(7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4а, 5,6, 7-тетрагідро-4Н-піролоЇ3,4-4111,3|гіазин-2-іл|Ісензамід нм З ж0 йо

Ен

Вг

Йодотриметилсилан (2,21 мл, 15,46 ммоль) краплями додають до розчину бензил-2- бензамід-7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-41(11,3)гіазин-6-карбоксилату

Зо (2,93 г, 5,15 ммоль) в ацетонітрилі (44 мл), який має кімнатну температуру. Реакційну суміш перемішують при кімнатній температурі протягом двох годин, і розчинник видаляють іп масио.

Неочищений продукт очищають на колонці 5СХ з використанням спочатку суміші дихлорметан:метанол (3:1), а потім суміші дихлорметан:7н розчин аміаку в метанолі (271), та одержують вказану в заголовку сполуку (2,098 г, 94 95). ЕБ/М5 (т/е): (Вг/"Вг) 434/436 (М.Н).

Препаративна методика 24 трет-бутил-2-бензамідо-7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4 да, 5,7-тетрагідропіролоЇ3,4-411И1,3|гіазин- б-карбоксилат

Кк з о

Зо со

Ен

Вг

До розчину М-(7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4а, 5,6,7-тетрагідро-4Н-піроло|3,4-4111,3)гіазин-2- іл|Сензаміду (2,098 г, 4,83 ммоль) в ОСМ (48 мл) додають ди-трет-бутилдикарбонат (1,16 г, 5,31 ммоль) і триетиламін (1,01 мл, 7,25 ммоль). Реакційну суміш перемішують протягом 1 год. при кімнатній температурі в атмосфері азоту. Розчинник видаляють іп масио, і неочищений продукт очищають на силікагелі шляхом елюювання з градієнтом від 5 95 до 100 95 ЕЮАсС в гексанах протягом 30 хв, та одержують вказану в заголовку сполуку (2,556 г, 99965). ЕБ/М5 (т/е):(7Вг/8'Вг) 534/536 (М.Н).

Препаративна методика 25 трет-бутил-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-2-бензамідо-4 да, 5,7-тетрагідропіроло!|З,4- «1,3 гіазин-6-карбоксилат у вк в о --о ка

ЕН но

Розчин / трет-бутил-2-бензамідо-7а-(5-бром-2-фторфеніл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4- «1,3 гіазин-6-карбоксилату (2,556 г, 4,8 ммоль) і транс-М, М'-диметил-1 2-циклогександіаміну (150 мг, 1,1 ммоль) в етанолі (50 мл) обробляють азидом натрію (933 мг, 14,3 ммоль). Додають водний розчин натрієвої солі І -аскорбінової кислоти (0,66 М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) та воду (1 мл), і верхню частину колби продувають азотом. Суміш обробляють водним розчином пентагідрату сульфату міді (І) (0,33 М, 3,2 мл, 1,1 ммоль), і суміш негайно нагрівають на заздалегідь розігрітій нагрівальної плиті при температурі 80 "С протягом 1,5 год. в атмосфері азоту. При нагріванні одержують однорідну суміш. Реакційну суміш охолоджують, розбавляють талою водою, і одержану суміш екстрагують ЕІЮАс (Зх). Органічні екстракти об'єднують, і сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і розчинник видаляють іп масио до одержання неочищеного азидного продукту. Неочищений азидний продукт об'єднують з 10 95 паладієм на вугіллі (1 г) в холодному етанолі (150 мл), і суміш продувають із використанням циклу вакуум/азот, й потім циклу вакуум/водень. Суміш перемішують при кімнатній температурі в атмосфері водню (тиск водню-30 фунт/кв. дюйм (0,2068 МПа)) протягом 5 год. Реакційну суміш випускають, фільтрують через діатомову землю, і відфільтрований осад промивають ОСМ. Розчинник видаляють з фільтрату іп масисо, і неочищений продукт очищають на силікагелі 50 95 розчином

ЕЮАс в ОСМ до одержання вказаної в заголовку сполуки (2,014 г, 89 95). ЕБ/М5 (т/є): 471 (МН).

Зо Препаративна методика 26

М-(7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-4а, 5,6,7-тетрагідро-4Н-піроло|3,4-4111,3)гіазин-2-іл|сензамід з «'160 ня

КЗ !

ЕН ном

Трифтороцтову кислоту (10 мл) додають до розчину трет-бутил-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-2- бензамідо-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4111,3|гіазин-б6-карбоксилату (2,013 г, 4,28 ммоль) в

ОСМ (30 мл), і суміш перемішують при кімнатній температурі в атмосфері азоту протягом 4 год.

Розчинник видаляють іп масио, і неочищений продукт очищають на колонці 5СХ з використанням спочатку суміші ОСМ:метанол (3:1), а потім суміші ОСМ:7н розчин аміаку в метанолі (2:11), та одержують вказану в заголовку сполуку (1,555 г, 98 95). ЕБ/М5 (т/е): 371 (МН).

Препаративна методика 27

М-І7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4, да, 5,7-тетрагідропіроло!|3,4- 911,3) гіазин-2-іл|Сензамід -М 5 2о дидаФфі

М ММ

Ен

НОМ

Розчин М-І7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-4а, 5,6,7-тетрагідро-4Н-піролої3,4-4|11,3|гіазин-2-

іл|Сензаміду (705 мг, 1,90 ммоль), 5-фтор-2-хлорпіримідину (1,01 г, 7,61 ммоль) та ПІРЕА (1,66 мл, 9,52 ммоль) нагрівають в 1,4-діоксані (20 мл) до кипіння, та кип'ятять зі зворотним холодильником протягом 4 год. в атмосфері азоту. Реакційну суміш охолоджують, розбавляють водою, і екстрагують ЕІОАс (Зх). Органічні шари об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і розчинник видаляють іп масо для одержання неочищеного продукту.

Неочищений продукт очищають на силікагелі градієнтом від 5 95 до 100 95 ЕАс в гексанах протягом 25 хв, та одержують вказану в заголовку сполуку (590 мг, 66 95). ЕБ/М5 (т/є): 467 (МН).

Препаративна методика 28

Мм-К4ав, Ттавбз)-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7- тетрагідропіроло|3,4-41(1,3|гіазин-2-іл|бензамід, (ізомер 1) -М в о - )-м

ЖК ди 7

Ен

НОМ

Рацемічний М-(7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7- тетрагідропіроло|3,4-41(1,3|гіазин-2-іл|ІбСензамід (1,694 г, 3,63 ммоль) очищують хіральною високоефективною рідинною хроматографією (колонка: СПігаІсеІ 0, 8х35 см, елюент: 90 95 розчин метанолу (0,2 956 диметилетиламіну) і 10 95 ацетонітрилу; швидкість потоку 400 мл/хв при

УФ 280 нм). Аналіз першого елюйованого ізомеру (колонка: СпПігаІсеІ 0У-Н 0,46х15 см; елюент: 10:90 ацетонітрил:метанол (з 0,2 95 диметилетиламіну); швидкість потоку: 0,6 мл/хв при УФ 280 нм) підтверджує наявність енантіомерно збагаченого (99 95 еє) енантіомеру з Кі-6,70 хв, (723 мг, 43 95). ЕБ/М5 (п/е): 467 (МН).

Препаративна методика 29

М-ІЗ-К4ан, Ттав5)-2-бензамідо-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло!|З,4- «1,3 гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід, (ізомер 1) вени /; дова

Е Н

Мн

Фе

М Осн

Мм-К4ав, тавз)-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7- тетрагідропіроло|3,4-41(1,3|гіазин-2-іл|Ібсензамід (0,361 г, 0,77 ммоль, ізомер 1) розчиняють у суміші ОСМ (4 мл) і ОМЕ (0,5 мл). До цієї суміші додають 5-метоксипіразин-2-карбонову кислоту (240 мг, 1,55 ммоль), НОВІ (210 мг, 1,55 ммоль) та ЕОСІ (300 мг, 1,55 ммоль), і одержану суміш перемішують протягом ночі при кімнатній температурі. Реакційний розчин вміщують

Зо безпосередньо у 12 г силікагелеву завантажувальну колонку, і очищають з використанням 40 г силікагелевої колонки шляхом елюювання з градієнтом 0-10095 ЕАс/гексани. Продукт розчиняють в ЕІОАс (200 мл), промивають Ін розчином Маон (2х50 мл) і розсолом (1х50 мл).

Очищення на силікагелі повторюють, як описано вище, до одержання вказаної в заголовку сполуки (350 мг, 74 95). ЕБ/М5 (тп/е): 603 (М'-Н).

Препаративна методика 30

Б5-аліл-ба-(2-фторфеніл)-3,За, 4 б-тетрагідро-1Н-піроло!|3,4-с|ізоксазол

М (в); шу ДІ М

Е

Хімічна реакція в потоці: 343 мл безшовний трубчастий реактор з нержавіючої сталі (зовнішній діаметр - 1/8 дюйма (3,175 мм)) розміщають всередині газово-конвекційної сушарки, і промивають толуолом зі швидкістю 20 мл/хв протягом 20 хв. Прикладають протитиск азоту (720 фунтів на квадратний дюйм (4964,22 КПа)), і температуру газово-конвекційної сушарки встановлюють на 210 "С. Після того, як температура досягне 210 "С, через реактор зі швидкістю 22,866 мл/хв прокачують розчин 2-(діаліламіно)-1-(2-фторфеніл)етаноноксиму (480,51 г, 1,74 моль) в толуолі (5,81 л) із застосуванням пари шприц-насосів високого тиску, які працюють в безперервному режимі для забезпечення часу перебування 15 хв. Після вичерпання всього маткового розчину, реактор протягом 30 хв промивають толуолом при швидкості 22,866 мл/хв.

Температуру газово-конвекційної сушарки встановлюють на 25 "С, весь розчин збирають, і концентрують під вакуумом. Розчинник випарюють, і залишок розчиняють в метиленхлориді (2,5 л) і воді (5 л). Значення рН доводять до 1 за допомогою хлористоводневої кислоти, водний шар відокремлюють, і нейтралізують гідроксидом натрію для доведення рН до 10. Водний шар екстрагують МТВЕ (З3х2,5 л). Органічні екстракти об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, випарюють насухо, та одержують вказану в заголовку неочищену сполуку (248 г, 47 95), яку використовують без подальшої очистки. ЕБ/М5 (т/е): 249 (М «- 1).

Препаративна методика 31 1-аліл-4-аміно-4-(2-фторфеніл)піролідин-3-іл|метанол он -/ дн,

Е

Цинковий пил (590 г, 9 моль) додають до розчину 5-аліл-ба-(2-фторфеніл)-3,За, 4,6- тетрагідро-1Н-піроло!|З3,4-с|ізоксазолу (3559 г, 1,29 моль) в суміші метанолу (2,85 л) і насиченого водного розчину хлориду амонію (3,56 л). Одержану суміш гріють протягом 16 год. при температурі 70 "С. Реакційну суміш охолоджують до температури 60 "С, розбавляють ТНЕ (2,85 л), і фільтрують в гарячому стані через діатомову землю. Фільтрат випарюють для видалення органічного розчинника, і водну суміш розбавляють 10 95 (мас.) водним розчином лимонної кислоти (4 л) і ЕІЮАс (3,5 л). Органічний шар відокремлюють, і водний шар промивають ЕЮАсС (2х2 л). Водний шар нейтралізують 50 95 (мас.) розчином гідроксиду натрію для доведення рн до 10, після чого екстрагують ЕАс (2х1,5 л). Органічні екстракти об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і випарюють насухо для одержання вказаної в заголовку неочищеної сполуки (299 г, 92 96). ЕБ/М5 (т/е): 251 (М ях 1).

Препаративна методика 32

ЗА, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(2-фторфеніл)піролідин-3-іл|метанол; 2,3-біс((4- метилбензоїл)окси|бутандіоєва кислота он но (о) й й уча 07 /9 шт 6) ої

Коо)

Розчин ди-п-толуоїл-І -винної кислоти (348,6 г, 884 ммоль) в 1-метокси-2-пропанолі (1,13 л) додають до заздалегідь нагрітого до температури 40 "С розчину |(ЗК, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(2- фторфеніл)піролідин-3-іліметанолу (225,9 г, 902 ммоль) в 1-метокси-2-пропанолі (1,13 л).

Реакційну суміш охолоджують до температури 22 "С, і перемішують протягом 18 год. Тверду речовину білого кольору відфільтровують, і промивають 1-метокси-2-пропанолом (600 мл).

Зібрану тверду речовину сушать, та одержують вказану в заголовку сполуку (183,01 г, 31,8 95).

ЕЗ/М5 (т/е): 251 (М я 1).

Препаративна методика 33

МКЗВ, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(2-фторфеніл)піролідин-3-іл)іметанол он со до --

ЗА, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(2-фторфеніл)піролідин-3-іл|метанол; 2,3-біс((4-

метилбензоїл)окси|бутандіоєву кислоту (211 г, 331 ммоль) розчиняють у воді (2,1 л) і ЕІ6Ас (2,3 л). 355956 (мас.) розчин соляної кислоти додають до доведення рН до 1. Водний шар відокремлюють, рН доводять до 10 за допомогою 50 95 (мас.) розчину гідроксиду натрію, і екстрагують ЕІОАс (2х). рН водного шару доводять до 10 водним розчином Маон, і екстрагують

МТВЕ (Зх), підтримуючи рН водного розчину на рівні 10. Органічні екстракти об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують насухо, щоб одержати вказану в заголовку неочищену сполуку (73 г, 88 95, 94,8 95 еє). Продукт аналізують хіральною хроматографією:

Колонка А5-Н, елюент 10 95 ізопропіловий спирт, 2 95 ізопропіламін; швидкість потоку З мл/хв при УФ 220 нм; тиск 100 бар (10 МПа) при температурі 35 "С для одержання вказаної в заголовку сполуки як другого елюйованого ізомеру, Ке-2,26 хв. ЕБ/М5 (т/еє): 251 (М'н1).

Препаративна методика 34

Мм-К4ав, Ттав5)-6-аліл-7а-(2-фторфеніл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4111,3)гіазин-2- іл|Сензамід

М 5 6) ш-е/ ско

Е Н

Розчин |(ЗК, 45)-1-аліл-4-аміно-4-(2-фторфеніл)піролідин-3-іл|метанолу (129,7 г, 414 ммоль) в ТНЕ (2,3 л) охолоджують при температурі 0"С в атмосфері азоту. Додають бензоїлізотіоціанат (61,5 мл, 456 ммоль), підтримуючи температуру нижче 5 "С. Реакційну суміш нагрівають до кімнатної температури протягом З год., додають 1,1'-карбонілдіїмідазол (87,4 г, 538,9 ммоль), і реакційну суміш перемішують при температурі 22"С протягом 1 год. з подальшим нагріванням при температурі 70 "С протягом 16 год. Реакційну суміш охолоджують до температури 22 "С, і розчинник випарюють. Залишок розподіляють в ЕОАсС (1 л) і воді (1 л).

Органічний шар відокремлюють, і водний шар екстрагують ЕЮАс (2х400 мл). Органічні шари об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, випарюють насухо, та одержують вказану в заголовку неочищену сполуку. Вказаний неочищений продукт очищають хроматографією на силікагелі шляхом елюювання з градієнтом ЕЮАсС/ОСМ від 0 95 до 40 95

ОСМ до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини блідо-жовтого кольору (170 г, 99 95), що містить залишковий розчинник. Е5Б/М5 (п/е): 396 (М їх 1).

Препаративна методика 35

Мм-К4анв, 7абз)-7а-(2-фторфеніл)-4а, 5,6,7-тетрагідро-4Н-піролоЇ3,4-4101,3)гіазин-2-іл|Ісензамід нм 5 Б о жо

Е Н

Зо 2-меркаптобензойну кислоту (122 г, 793 ммоль), біс(дибензиліденацетон)паладій (4,15 г, 7,21 ммоль) і 1,4-бісбідифенілфосфіно)бутан (3,14 г, 7,21 ммоль) додають до розчину М-К(4анв,

Ттав5)-6-аліл-7а-(2-фторфеніл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-41(11,3)гіазин-2-іл|сСензаміду (178,21 г, 360 ммоль) в безводному 2-метилтетрагідрофурані (1,96 л) в атмосфері азоту. Розчин дегазують трьома циклами вакуум-азот, і потім барботують азот через реакційну суміш протягом 15 хв. Реакційну суміш нагрівають до температури 40 "С з одночасним барботуванням азоту через реакційну суміш. При досягненні реакційною сумішшю температури 40"сС барботування припиняють, і реакційну суміш перемішують при температурі 40 "С протягом З год. у атмосфері азоту. Реакційну суміш охолоджують до температури 22 "С, і розбавляють водою (2 л). Додають розчин (5 М) НСІ для доведення рН до 1. Водний шар відокремлюють, і промивають додатковою кількістю Е(ОАс (2х800 мл). Значення рН водного шару доводять до 10 за допомогою 50 95 (мас.) розчину гідроксиду натрію, після чого екстрагують ЕАс (10 л).

Водний шар промивають додатковою кількістю ЕЮАс (2х750 мл). Органічні екстракти об'єднують, промивають розсолом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і випарюють насухо для одержання вказаної в заголовку неочищеної сполуки у вигляді твердої речовини блідо-жовтого кольору (124,7 г, 97 905). ЕБ/М5 (т/е): 356 (М--1).

Препаративна методика 36

М-К4ав, /7аб5)-7а-(-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4- 911,3) гіазин-2-іл|Сензамід

-М в іо в- уп

Х б ня Ї

Е Н

Розчин М-(4авВ, 7аб5)-7а-(2-фторфеніл)-4а, 5,6,7-тетрагідро-4Н-піроло|3,4-410П1,3)гіазин-2- іл|ІСензаміду (124,7 г, 256 ммоль), ОІРЕА (67 мл), 5-фтор-2-хлорпіримідину (29,3 мл, 307 ммоль) в М-метилпіролідоні (997 мл) нагрівають до температури 100 "С протягом 16 год. Реакційну суміш охолоджують до температури 22 "С, і виливають в охолоджену воду при температурі "С (10 л), підтримуючи температуру нижче 15 "С. Тверду речовину блідо-кремового кольору відфільтровують, і промивають додатковою кількістю води. Вологу тверду речовину розчиняють в ЕОАс (2 л), і переносять в ділильну лійку. Додають 5 95 (мас.) водний розчин хлориду натрію (1 л), органічний шар відокремлюють, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і фільтрат 10 випарюють при зниженому тиску. Продукт очищають хроматографуванням на силікагелі з використанням градієнта від 0 95 до 40 95 ЕОАс/ізогексан, та одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини блідо-жовтого кольору (116 г, 70 95). ЕБ/М5 (т/е): 452(М Ж 1).

Препаративна методика 37 (4абв, Ттав5)-7а-(2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло!|3,4-

ФІИ1,3)гіазин-2-амін ту в

Е Дп-М в Же но

Е

До суміші Мм-К4ан, тавб5)-7а-(2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7- тетрагідропіроло|3,4-41(1,3|гіазин-2-іл|ІбСензаміду (158,6 г, 351, ммоль) в метанолі (1,6 л) додають гідроксид літію (9,26 г, 386 ммоль). Суміш гріють при температурі 70 "С протягом 4 год., після чого охолоджують до температури 22 "С. Реакційну суміш випарюють у вакуумі до одержання залишку жовтого кольору. Залишок розподіляють у воді (1 л) і ЕІЮАс (750 мл). НСІ (5

М водний розчин) додають для доведення рН до 1. Водний шар відокремлюють, і органічний шар промивають ЕІЮАс (2х200 мл). Значення рН водного шару доводять за допомогою 50 95 (мас.) водного розчину гідроксиду натрію до рН-10, і екстрагують ЕЮАс (Зх1 л). Органічні екстракти об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і упарюють при зниженому тиску до одержання вказаної в заголовку неочищеної сполуки у вигляді твердої речовини блідо- жовтого кольору (133,3 г, 99 95, яка містить 12 95 залишкового ЕЮАсС). ЕБ/М5 (т/е): 348 (М--1).

Препаративна методика 38

Зо (дав, 7аб5)-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,д4а, 5,7-тетрагідропіроло!|3,4- 91,3 )гіазин-2-амін т. 5

Е ДАМ в ее

Е мно

До розчину (дак, таз)-7а-(2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4, да, 5,7- тетрагідропіролоїЇ3,4-4111,3|гіазин-2-аміну (45,8 г, 125,3 ммоль) в трифтороцтовій кислоті (626 мл) додають сірчану кислоту (33,4 мл, 626,6 ммоль). Суміш охолоджують до температури 0 "С, і перемішують протягом 20 хв. Додають димлячу азотну кислоту (6,2 мл, 144,1 ммоль), реакційну суміш нагрівають до температури 22 "С, і перемішують протягом З год. Реакційну суміш упарюють, додають МТВЕ (250 мл), і упларюють ще раз. Залишок сушать у вакуумі до постійної маси, потім розчиняють у воді (147 мл) та етанолі (885 мл), і знегажують шляхом барботування азоту протягом 15 хв. Розчин переносять в реактор високого тиску, і додають 10 95 пасти Ра/С типу 871 (6,6 г, 6,27 ммоль). Суміш розбавляють додатковою кількістю етанолу (700 мл), і витримують під підвищеним тиском водню (80 фунтів на квадратний дюйм (0,552 МПа)) протягом 16 год. Реакційну суміш фільтрують, потім додають другу порцію каталізатора - 10 95 пасту Ра/С типу 871. (6,6 г, 6,27 ммоль), одержану суміш витримують під підвищеним тиском (80 фунтів на квадратний дюйм (0,552 МПа)), і перемішують протягом З діб в реакторі високого тиску. Реакційну суміш продувають азотом, і фільтрують через діатомову землю. Фільтрат випарюють, і залишок розподіляють між водою (200 мл) і ЕЮАс (200 мл). Водний шар відокремлюють, охолоджують до температури 5 "С, і нейтралізують 15 95 (мас.) розчином гідроксиду амонію. Водний шар екстрагують ЕАс (3х150 мл). Органічні шари об'єднують, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і упларюють при зниженому тиску до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини світло-коричневого кольору (47,7 г, 99 95, яка містить залишковий ЕІОАсС). ЕБ/М5 (т/еє): 363 (М'н1).

Приклад 1

М-ІЗ3-К4ав, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-411И1,3|гіазин-

Та-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду гідрохлорид -М в 0 н-а -0 у М мб мно о Е

М с М є у чу

НнзСОо М

М-ІЗ-К4ан, Ттав5)-2-бензамідо-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло!|З,4- «1,3 гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід (0,350 г, 0,58 ммоль, ізомер 1) розчиняють у ТНЕ (2 мл), після чого додають метанол (4 мл) і етанол (4 мл). До цієї суміші додають О-метилгідроксиламіну гідрохлорид (495 мг, 5,81 ммоль) та піридин (470 мкл, 5,81 ммоль), реакційну суміш нагрівають до температури 50 "С, і перемішують протягом ночі. До реакційної суміші додають силікагель (410 г), і суміш концентрують. Зразок, висушений на силікагелі, завантажують у порожній картридж, і очищають шляхом елюювання з градієнтом 0- 1095 7н розчину аміаку в метанолі в ОСМ. Продукт вдруге очищають на колонці ЗСХ з використанням спочатку суміші ОСМ:метанол (3:71), а потім суміші ОСМ:7н розчин аміаку в метанолі (2:1). Суміш остаточно очищають на силікагелі градієнтом 0-10 9о 7н розчину аміаку в метанолі в ОСМ, та одержують вільну основу вказаної в заголовку сполуки. Цей матеріал розчиняють у ОСМ (5 мл), і додають 1 М розчин хлориду водню в діеєтиловому ефірі (0,20 мл, 660 мкмоль). Розчинник видаляють іп масио, та одержують вказану в заголовку сполуку (71 мг, 23 9о). ЕБ/М5 (т/еє): 498 (МАН).

Порошкова рентгенографія (ХКО)

Порошкові рентгенограми кристалічних твердих речовин одержують за допомогою порошкового рентгенівського дифрактометру Вгикег 04 Епдеамог, спорядженого джерелом

Сика (А-1,54060 А) і детектором Мапіес, що працює при 35 кВ і 50 мА. Зразок сканують у межах 429-402 28 з величинію кроку, що дорівнює 0,009" 28, при швидкості сканування 0,5 с/крок, з 0,6 мм розходженням, фіксованим рівнем антирозсіювання 5,28 мм та 9,5 мм діафрагмами детектору. Сухим порошком наповнюють кварцовий тримач зразку, і гладеньку поверхню одержують, використовуючи предметне скло. Порошкові рентгенограми кристалічної форми збирають при температурі і відносній вологості навколишнього середовища. З кристалографії добре відомо, що, для будь-якої даної кристалічної форми, відносна інтенсивність дифракційних піків може змінюватись через переважну орієнтацію, що є наслідком факторів таких, як морфологія і форма кристалу. Коли наявні впливи переважної орієнтації, інтенсивність піків змінюється, однак позиції характеристичних піків поліморфних модифікацій залишаються незмінними. Дивись, наприклад, Те Опіей 5(аге5 РПаптасореїа 523, Майопа! Боптшагу 418, радез 1843-1844, 1995. Окрім того, в кристалографії також добре відомо, що, для будь-якої даної кристалічної форми, кутові положення піків можуть дещо змінюватись. Наприклад, положення піків можуть зсуватись унаслідок змін температури або вологості, при яких аналізують зразок, зміщення зразку або наявності чи відсутності внутрішнього стандарту. У цьому випадку, змінність положення піків ї-0,2 20 буде враховувати потенційні зміни без перешкоджання ооднозначній ідентифікації вказаної кристалічної форми. Підтвердження кристалічної форми може бути здійснено на основі будь-якої унікальної комбінації відмінних піків (в градусах 26), зазвичай найбільш виділених піків. Порошкові рентгенограми кристалічної форми, зібрані при температурі і відносній вологості навколишнього середовища, коригуються на основі стандартних піків МІЗТ 675 при 8,853 і 26,774 градуса 2-тета.

Приклад Та

Кристалічна Форма 1 /М-ІЗ3-МК4ав, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду

- М г - -н АХ м7 мн, о Е

М с М су у н'СОоМ

М-ІЗ3-К4ав, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-411И1,3|гіазин-

Та-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід (201 мг, 403,20 мкмоль) змішують з 4 мл бутилацетату, і перемішують на мішалці з підігрівом при температурі 120 "С. Тверда речовина розчиняється через приблизно 5 хв, та утворює прозорий безбарвний розчин. Потім зразок охолоджують до кімнатної температури, і з розчину в осад випадає тверда речовина білого кольору. Після цього зразок суспендують при кімнатній температурі протягом 10 хв, та одержують густу суспензію твердої речовини білого кольору. Цю тверду речовину білого кольору виділяють шляхом вакуумної фільтрації, і сушать в потоці повітря протягом 5 хв.

Одержаний відфільтрований осад твердої речовини білого кольору поміщають у флаконі з визначеною масою у вакуумну піч при температурі 60 "С протягом уїк-енду, та одержують вказану в заголовку сполуку (110 мг). Кристалічна Форма 1 М-ІЗ-К4ав, 7авб5)-2-аміно-6-(5- фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4|П1,3|гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл!/|-5- метоксипіразин-2-карбоксаміду являє собою стабільну кристалічну форму при кімнатній температурі і відносній вологості, яка становить меньше ніж приблизно 15 95.

Приклад 16

Кристалічна Форма 2 М-ІЗ-К4авВ, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇЗ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду (гідратованого)

До розчину 5-метоксипіразин-2-карбонової кислоти (1,6 г, 10,2 ммоль) в ацетонітрилі (53 мл) і ОМЕ (848 мкл) додають оксалілхлорид (888 мкл, 10,2 ммоль). Через 15 хв свіжоприготовлений розчин додають до заздалегідь нагрітого до температури 50 "С розчину (4акК, 7авз)-7а-(5-аміно- 2-фторфеніл)-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіролої|3,4-4|11,3|гіазин-2-аміну (2,65 г, 7,3 ммоль) в суміші води (53 мл) і етанолу (53 мл). Реакційну суміш перемішують при температурі 50 "С впродовж однієї години, охолоджують до температури 22 "С, після чого при цій температурі перемішують протягом ночі. Органічний розчинник випарюють у вакуумі, і одержану водну суміш обробляють 5095 (мас. водним розчином гідроксиду натрію для доведення рН до 10. Тверду речовину блідо-кремового кольору відокремлюють, і промивають додатковою кількістю води. Цю тверду речовину розбавляють ізопропіловим спиртом (2х), і

Зо розчинник випарюють. Неочищений матеріал очищають хроматографією на силікагелі з використанням градієнту насичений аміаком метанол (2н)у/уметиленхлорид. Фракції, що містять цільовий продукт, об'єднують, і розчинник випарюють до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (1,9 г, 52 Ус). ЕБ/М5 (т/еє): 499 (Ма1).

Альтернативний спосіб одержання кристалічної Форми 2 М-ІЗ-К4ав, 7авб5)-2-аміно-6-(5- фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4|П1,3|гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл!/|-5- метоксипіразин-2-карбоксамиду (гідратованого)

В диметилформамід (19,2 мл, 248,9 ммоль) додають ацетонітрил (500 мл). В одержаний розчин диметилформамід/ацетонітрил додають спочатку оксалілхлорид (39,3 г, 309,63 ммоль), і потім додають 5-метоксипіразін-2-карбонову кислоту (46,0 г, 298,4 ммоль). В окремій колбі, в ацетонітрил (500 мл) додають водний розчин (4аК, 7авбз)-7а-(5-аміно-2-фторфеніл)-6-(5- фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіролої|3,4-4|П1,3)гіазин-2-аміна (56,8 г, 156,75 ммоль), і рН гідроксидом амонію (95 мл) доводять до 9. Потім цю суміш нагрівають до температури 50- 55"С. Краплями додають розчин оксалілхлориду, і суміш перемішують протягом З год.

Значення рН гідроксидом амонію доводять до 8-9. Одержаний осад відфільтровують, промивають водою, і сушать для одержання вказаної в заголовку сполуки (123 г). Тверду речовину суспендують в ацетоні (250 мл) протягом 1,5 год., і фільтрують. Вологий відфільтрований осад промивають ацетоном, та одержують вказану в заголовку сполуку (110 г з 90,5 956 чистотою за даними ВЕРХ.) До твердої речовини додають ТНЕ (1 л) та активоване вугілля (9 г), і суміш нагрівають до кипіння, та кип'ятять зі зворотним холодильником протягом ночі. Суміш фільтрують через діатомову землю, і промивають ТНЕ (150 мл). Органічний розчин концентрують до 10 об'ємів, і нагрівають до температури 60 "С. Додають воду (430 мл), і одержану суміш перемішують при температурі 60 "С протягом 8 год. Суміш охолоджують до кімнатної температури, і перемішують протягом 10 год. Одержану тверду речовину відфільтровують, промивають ТНЕ/водою (7:6), і сушать для одержання вказаної в заголовку сполуки (69 г, 88 95). І С-М5: т/2-499 (М'-1), чистота: 98,3 95. "Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-дв) б ррт 2,99-3,07 (т, 2 Н) 3,07-3,14 (т, 1 Н) 3,58-3,67 (т, 1 Н) 3,68-3,76 (т, 1 Н) 3,76-3,84 (т, 1 Н) 4,02 (5, З Н) 4,07 (й, 9У-10,92 Гц, 1 Н) 6,08 (5, 2 Н) 7,19 (ад, 9У-11,98, 8,72 Гу, 1 Н) 7,78-7,89 (т, 2 Н) 8,41 (5, 1 Н) 8,44 (5, 2 Н) 8,88 (5, 1 Н) 10.60 (5, 1 Н).

Загальна методика одержання кристалічної Форми 2 М-ІЗ-М(4авВ, 7аб)-2-аміно-6-(5- фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-41(1,3)тіазин-7а-іл|-А-фторфеніл|-5- метоксипіразин-2-карбоксаміду (гідратованого)

М-ІЗ3-К4ав, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-411И1,3|гіазин-

Та-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід суспендують в ТНЕ при температурі приблизно 23 "С з концентрацією приблизно 71 мг/мл розчинника. Суспензію нагрівають при перемішуванні до розчинення, яке відбувається при температурі від приблизно 60 "С до приблизно 63 "С. У гарячий розчин додають воду для забезпечення співвідношення ТНЕ:водний розчинник приблизно 95:5. Додають затравні кристали Форми 2 М-ІЗ-К4ав, 7аб5)-2-аміно-6-(5- фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4|П1,3|гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл!/|-5- метоксипіразин-2-карбоксаміду (порція приблизно З 95 (мас.)). Одержану розбавлену суспензію витримують при температурі від приблизно 60 "С до приблизно 63 "С протягом приблизно 20 хв з додаванням після цього від приблизно 5,3 об'єму до приблизно 5,5 об'єму води протягом від приблизно 2 год. до приблизно 4 год., та одержують відношення ТНЕ:водний розчинник приблизно 69:31. Потім суспензію витримують при температурі від приблизно 60 "С до приблизно 63 "С протягом приблизно 30 хв, після чого охолоджують до температури приблизно 23 С протягом приблизно 1 год., а потім перемішують протягом приблизно 8-12 год. Після цього суспензію фільтрують, злегка промивають сумішшю ТНЕ:вода (35:65), і сушать протягом приблизно 8-12 год. при зниженому тиску при температурі приблизно 40 "С для одержання бажаної кристалічної Форми 2 М-ІЗ-К(4авВ, 7аб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду, яку гідратують.

Одержаний зразок кристалічної Форми 2 М-ІЗ-К4ав, 7а5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-

Зо 4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4111,З)гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду характеризується порошковою рентгенограмою, одержаною з використанням джерела випромінювання СиКа як такий, що має дифракційні піки (значення 2-тета), наведені нижче у

Таблиці 1. Зокрема, рентгенограма має пік при 11,8" у комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 18,6", 19,37 та 26,7" з допуском на кути дифракції 0,27.

Таблиця 1:

Піки порошкової рентгенограми кристалічної Форми 2 сполуки Прикладу 1р 2-тета")-0,27 пис ши: п ПО НС Ж ОО 8 111111112241111111111111111111111111166 8 1111181981Ї1111111111111111111111111148

Кристалічна Форма 2 М-ІЗ-К4авВ, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду являє собою стабільну кристалічну форму при кімнатній температурі і відносній вологості, яка становить більше ніж приблизно 15 95.

Приклад 1с

Кристалічна Форма 3 М-ІЗ-МК4авВ, 7авб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду

М-ІЗ3-К4ав, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-411И1,3|гіазин-

Та-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду завантажують у тигель для термогравіметричного аналізу, нагрівають до температури приблизно 170 "С, і витримують при температурі приблизно 170 С протягом приблизно 5 хв. Охолоджують до кімнатної температури, та одержують вказану в заголовку сполуку.

Альтернативний спосіб одержання кристалічної Форми 3 М-ІЗ-К4ав, 7авб5)-2-аміно-6-(5- фторпіримідин-2-іл)-4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4|П1,3|гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл!/|-5- метоксипіразин-2-карбоксаміду

М-ІЗ3-К4ав, 7ав5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-411И1,3|гіазин-

Та-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксамід (121 мг) об'єднують у посудині з ацетонітрилом (5 мл), і нагрівають на нагрітій до 90 "С плиті мішалки. Приблизно через 30 хв більша частина твердої речовини розчиняється, утворюючи каламутний розчин. Додають затравні кристали Форми 3, і зразок перемішують протягом приблизно 1 год. при температурі приблизно 90 "С. Нагрівання припиняють, і суміш перемішують до одержання твердої речовини яскраво-білого кольору. Цю тверду речовину виділяють шляхом вакуумної фільтрації, сушать спочатку в потоці повітря протягом приблизно 10 хв, потім при зниженому тиску при температурі приблизно 80 С протягом від приблизно до приблизно 12 год., та одержують вказану в заголовку сполуку.

Одержаний зразок кристалічної Форми З М-ІЗ-К4ав, 7а5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)- 4 да, 5,7-тетрагідропіроло|3,4-4111,З)гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду характеризується порошковою рентгенограмою, одержаною з використанням джерела випромінювання СиКа як такий, що має дифракційні піки (значення 2-тета), наведені нижче у

Таблиці 2. Зокрема, рентгенограма має пік при 15,72 у поєднанні з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 18,12, 27,02 та 19,72, з допуском на кути дифракції 0,27.

Таблиця 2

Піки порошкової рентгенограми кристалічної Форми З сполуки Прикладу 1с 2-тета")--0,27 (Уо найінтенсивнішого піку) 6 77771118 71111150 8 52111710 98 11111041

Методики дослідження іп міїго:

Для ферментативних і клітинних досліджень іп міго досліджувані сполуки готують в ОМ5О для одержання 10 мМ маточного розчину. Перед проведенням ферментативних і цілоклітинних досліджень іп міго, цей маточний розчин послідовно розбавляють ЮОМ5БО для одержання

Зо десятиточкової кривої розведення з кінцевою концентрацією сполук в межах від 10 мМ до 0,05

НМ в 96-лунковому планшеті з круглим дном.

Дослідження пригнічення протеаз іп міїго:

Експресія людського ВАСЕ1

Людську ВАСЕ1 (номер депонування АЕ190725) клонують з тотальної мозкової кДНК за допомогою КТ-РСК. Нуклеотидні послідовності, що відповідають амінокислотним послідовностям від Мо 1 до Мо 460, вставляють в кКДНК, що кодує поліпептид Ес-фрагмента людського Ід (Дивись Маззег, еї аї!., Зсіепсе, 286, 735-741 (1999)). Цей злитий білок ВАСЕТ1 (1- 460) і людського Ес, названий пивВАСЕЇ1:Рс, вбудовують у вектор р)ВО2. Людська ВАСЕЇ1 (1- 460):Ес (пиВвВАСЕТ:Ес) тимчасово експресується в клітинах НЕК293. 250 мкг кКДНК кожної генно- інженерної конструкції змішують з Еидепе 6, і додають до 1 л клітин НЕК293. Через чотири доби після трансфекції кондиціоновані середовища збирають для очищення.

Очищення пиВАСЕТ: Ес. пиВАСЕТ:Рс очищають хроматографією з використанням сорбентів на основі іммобілізованого протеїна А. Фермент зберігають при температурі -802С у вигляді невеликих аліквот.

ЕВЕТ-аналіз ВАСЕ1

Послідовні розведення досліджуваних сполук одержують, як описано вище. Сполуки додатково розбавляють 20х в буфері КНгРО»х. Десять мкл кожного розведення додають в кожну лунку рядку від А до Н відповідного чорного планшету для низького зв'язування білка, яка містить реакційну суміш (25 мкл 50 мМ розчину КНеРО», рнН 4,6, 1 мМ розчин ТКІТОМ? Х-100, 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну і 15 мкМ розчин субстрату ЕКЕТ) (дивись Мапо, егаї.,

У. Мепигоспетівігу, 91(6) 1249-59 (2004)). Вміст добре перемішують на планшетному шейкері протягом 10 хв. Для ініціювання реакції на планшет, що містить субстрат і досліджувані сполуки, додають п'ятнадцять мкл 200 пМ розчину людської ВАСЕТ (1-460):Ес (дивись Маззег, еї аї.,

Зсіепсе, 286, 735-741 (1999)) в буфері КНоРО». Після нетривалого перемішування на планшетному шейкері, КЕРІ суміші в момент часу 0 записують при довжині хвилі збудження 355 нм ії довжині хвилі емісії 460 нм. Реакційний планшет вкривають алюмінієвою фольгою, і витримують в темному зволожувальному термостаті при кімнатній температурі протягом періоду часу тривалістю від 16 год. до 24 год. КРИ в кінці інкубації реєструють з тими ж параметрами збудження і емісії, що були використані на момент часу 0. Різниця КЕРІ на момент часу 0 і в кінці інкубації є репрезентативною для активності ВАСЕ1 за умов обробки вказаними сполуками. Різниці КРО наносять на графік у зіставленні з пригнічувальною концентрацією, і криву підганяють за допомогою чотирипараметричного логістичного рівняння для одержання значень ЕсСово та ІСво. (Дивись 5іппа, єї аї., Маїиге, 402, 537-540 (2000)).

Сполуку Прикладу 1 випробують по суті як описано вище, і вона демонструє ІСз5о ВАСЕТ, яка дорівнює 0,615 нМ (0,101, п-5) (Середнє -5ЕМ; ЗЕМ - середня квадратична помилка середнього|Ї. Ці дані показують, що сполука прикладу 1 пригнічує активність очищеного рекомбінантного фаременту ВАСЕЇ іп міїго.

Дослідження первинних РОАРР-нейронів

Підтверджувальне цілоклітинне дослідження також здійснюють на первинних культурах

Зо нейронів, одержаних з ембріонів трансгенних мишей лінії РОАРР. Первинні кортикальні нейрони одержують з 16-денних ембріонів лінії РОАРР, і культивують в 96-лункових планшетах (15х107 клітин/лунку в середовищі ОМЕМ/Е12 (1:1) плюс 10 95 ЕВ5). Після 2 діб іп міго, культуральне середовище замінюють на безсироваткове середовище ОМЕМ/Е12 (1:1), що містить домішку

В27 і 2 мкМ (кінцева концентрація) розчин Ага-С (компанія бЗідта, С1768). На 5-у добу іп міїго, нейрони інкубують при температурі 372С протягом 24 год. у присутності/за відсутності інгібіторів (розведених в ОМ5О) в необхідній концентрації. Наприкінці інкубації кондиціоновані середовища аналізують на наявність активності бета-секретази, наприклад, за допомогою кількісного аналізу бета-амілоїдних пептидів. Загальну кількість бета-амілоїдних пептидів (Абеїа 1-х) визначають сендвіч-ЕГІ5А, використовуючи моноклональне антитіло 266, як іммобілізоване антитіло, а біотиніловане антитіло 306, як репортерне антитіло. Альтернативно бета-амілоїдні пептиди 1-40 та 1-42 визначають сендвіч-ЕГІЗА, використовуючи моноклональне антитіло 203, як іммобілізоване антитіло для бета амілоїдного пептиду 1-40, і моноклональне антитіло 21212, як іммобілізоване антитіло для бета-амілоїдного пептиду 1-42. При проведенні ЕГІЗА як для бета-амілоїдного пептиду 1-40, так і для бета-амілоїдного пептиду 1-42, біотиніловане антитіло 306 використовують як репортерне антитіло. Концентрація бета-амілоїдного пептиду, вивільненого в кондиціоноване середовище після обробки сполукою, відповідає активності

ВАСЕЇ1 за таких умов. Накреслюють 10-точкову криву інгибування, і підганяють її за допомогою чотирипараметричного логістичного рівняння для визначення значень ЕСбзо та ІСво для ефекту зниження бета-амілоїдного пептиду. Сполука Прикладу 1 була випробувана по суті як описано вище, і продемонструвала наведену нижче активність щодо впливу на зниження рівня бета- амілоїдного пептиду:

Таблиця З п РОАРР Нейронів А-беїа (1-40) ЕПБА| /ОАРР Нейронів Агреїа (1-42) риклад ІСво (НМ) ЕПІЗА

ІСво (НМ)

Середнє «ЗЕМ; ЗЕМ - середня квадратична помилка середнього

Ці дані показують, що сполука за Прикладом 1 пригнічує продукування бета-амілоїдного пептиду в цілих клітинах.

Іп мімо пригнічення бета-секретази

Декілька тваринних моделей, у тому числі моделей з використанням мишей, морських свинок, собак і мавп, можуть бути використані для скринінгу щодо пригнічення активності бета- секретази іп мімо після обробки сполуками. Тварини, використані в цьому винаході, можуть бути тваринами дикого типу, трансгенні або з нокаутованим геном. Наприклад, підготовлені, як описано у Ссатез еї аї., Маїшге 373, 523-527 (1995), моделі з мишами лінії РОАРР, та іншими нетрансгенними тваринами або тваринами з нокаутованим геном, можуть бути корисними для дослідження іп мімо пригнічування продукування бета-амілоїдного пептиду та 5АРРБеїа в присутності пригнічувальних сполук. Загалом, 2-12-місячним мишам лінії РОАРР, мишам з нокаутованим геном або нетрансгенним тваринам вводять сполуку в носіях, таких як кукурудзяна олія, ціклодекстран, фосфатні буфера, РНАЕМАБОЇ МЕ" або інші придатні носії.

Через 1-24 години після введення сполуки тварин вмертвлюють, і їх головний мозок, а також спинномозкову рідину і плазму, відокремлюють для кількісного аналізу фрагментів бета- амілоїдних пептидів, С99 і 5АРР. (Дивись Мау, єї аї., Уоштаї ої Мешигозсієпсе, 31, 16507-16516 (2011)).

Для стандартних іп мімо фармакологічних досліджень тваринам вводять різні концентрації сполуки, і порівнюють з контрольною групою, обробленою носієм в той самий час. Для деяких досліджень у часовому перебігу, перебігу від обраних вибраних тварин, розпочинаючи з моменту часу 0, одержують тканини мозку, плазму або спинномозкову рідину для встановлення базового рівня. Сполуку або відповідний носій вводять тваринам інших груп, і забивають їх в різні моменти часу після введення дози. З вибраних тварин одержують мозкову тканину, плазму або спинномозкову рідину, і аналізують на присутність продуктів розщеплення АРР, у тому числі бета-амілоїдних пептидів, ЗАРРбеїа та інших фрагментів АРР, наприклад, шляхом досліджень із застосуванням специфічного сендвіч-ЕГІЗА. Наприкінці експериментального періоду тварин забивають, і тканини мозку, плазму або спинномозкову рідину досліджують на присутність бета- амілоїдних пептидів, С99 і 5АРРрбеїа, у разі потреби. Тканини мозку АРР-трансгенних тварин також можуть бути досліджені на кількість бета-амілоїдних бляшок після обробки сполукою.

Зо Термін "пептид Абеїа 1-х" у значенні, вживаному у цьому описі, означає суму різновидів Абейа, які починаються з залишку 1 і закінчуються С-кінцевим залишком, більшим ніж залишок 28. Цей термін визначає більшість різновидів Абеїа, і його часто називають "загальним Абеїа".

У тварин (РОАРР або інші АРР-трансгенні або нетрансгенні миші), яким була введена пригнічуюча сполука, може спостерігатись зменшення рівня бета-амілоїдного білка або 5АРРреїа в тканинах мозку, плазмі або спинномозковій рідині і зниження кількості бета- амілоїдних бляшок в тканині головного мозку, у порівнянні з обробленими носієм контрольними тваринами або контрольними тваринами нульового моменту часу. Для сполуки Прикладу 1, через З год. після введення пероральним шляхом дози (0,3 мг/кг, 1 мг/кг або З мг/кг) цієї сполуки, рівні пептиду Абейа 1-х зменшуються приблизно на 3195, 3995 і 61 95 в гіпокампі головного мозку, і приблизно на 2895, 42 95 і 6495 в корі головного мозку, відповідно, в порівнянні з мишами, обробленими носієм.

Приймаючи до уваги активність сполуки Прикладу 1 проти ферменту ВАСЕ іп міїго, ці впливи на зниження Абеїа співпадають з пригнічуванням ВАСЕ іп мімо, і додатково демонструють проникнення М-ІЗ-К4аВ, 7авб)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4,4а, 5,7-тетрагідропіролоїЇ3,4- «1,3 гіазин-7а-іл|-4-фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду до ЦНС.

Результати цих досліджень показують, що сполуки за цим винаходом пригнічують ВАСЕ і, таким чином, є придатними для зниження рівнів Арена.

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Сполука формули -М аф Е М М М МН, Е (в) М - М Н що НС М , яка являє собою кристалічну Форму 2 М-І3-К4ак,7аб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 4а,5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду, яка характеризується значним піком в спектрі дифракції рентгенівських променів, при куті дифракції 2-тета 11,87, в комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 18,67, 19,37 та 26,7", з допуском на кути дифракції 0,2".

2. Сполука формули -М еф Е М М М Мн, Е (в) М - М Н КУ нео М яка являє собою кристалічну Форму З М-І3-К4ак,7аб5)-2-аміно-6-(5-фторпіримідин-2-іл)-4 4а,5,7- тетрагідропіролоЇ3,4-4111,3)гіазин-7а-іл|І-4--фторфеніл|-5-метоксипіразин-2-карбоксаміду, яка характеризується значним піком в спектрі дифракції рентгенівських променів, при куті дифракції 2-тета 15,7", в комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 18,17, 27,07 та 19,7", з допуском на кути дифракції 0,27.

3. Спосіб лікування хвороби Альцгеймера у пацієнта, що включає введення пацієнту, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки за будь-яким з пп. 1-2.

4. Спосіб запобігання прогресуванню помірного когнітивного порушення у хворобу Альцгеймера у пацієнта, що включає введення пацієнту, який потребує цього, ефективної кількості сполуки за будь-яким з пп. 1-2.

5. Сполука за будь-яким з пп. 1-2 для застосування в терапії.

6. Сполука за будь-яким з пп. 1-2 для застосування в лікуванні хвороби Альцгеймера.

7. Сполука за будь-яким з пп. 1-2 для застосування при запобіганні прогресуванню помірного когнітивного порушення у хворобу Альцгеймера. Зо

8. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за будь-яким з пп. 1-2 з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, розріджувачами або наповнювачами.