EA031330B1 - ТОЗИЛАТНАЯ СОЛЬ N-[3-[(4aR,7aS)-2-АМИНО-6-(5-ФТОРПИРИМИДИН-2-ИЛ)-4,4a,5,7-ТЕТРАГИДРОПИРРОЛО[3,4-d][1,3]ТИАЗИН-7a-ИЛ]-4-ФТОРФЕНИЛ]-5-МЕТОКСИПИРАЗИН-2-КАРБОКСАМИДА - Google Patents

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида.

Description

Настоящее изобретение относится к соли Н-[3-[(4аК,7а8)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида и толуолсульфоновой кислоты (тозилатной соли), к фармацевтическим композициям, содержащим указанную тозилатную соль, к способам применения указанной тозилатной соли для лечения физиологических нарушений, и к промежуточным соединениям и способам, которые можно применять для ее синтеза.

Настоящее изобретение относится к области лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с β-амилоидным пептидом (А-бета, АР) нейротоксичным, обладающим высокой склонностью к агрегации фрагментом белка-предшественника амилоида (АРР). Болезнь Альцгеймера представляет собой инвалидизирующее нейродегенеративное заболевание, которым страдают миллионы пациентов по всему миру. Ввиду того, что в настоящее время одобренные средства, присутствующие на рынке, дают пациентам только временные, симптоматические улучшения, существует значительная неудовлетворенная потребность в средствах лечения болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера характеризуется образованием, агрегацией и отложением бета-амилоида в головном мозге. Было показано, что полное или частичное ингибирование β-секретазы (фермента, расщепляющего белок-предшественник амилоида по β-сайту, BACE) оказывает значительное влияние на патологии, связанные с бляшками и зависимые от бляшек, в моделях на мышах, что позволяет предположить, что даже небольшое снижение уровней бета-амилоида может привести к значительному долговременному снижению количества бляшек и синаптической недостаточности, обеспечивая таким образом значительные благоприятные терапевтические эффекты, в частности, при лечении болезни Альцгеймера.

В патенте США № 8841293 раскрыто несколько ингибиторов BACE для лечения нарушений, опосредуемых бета-амилоидным пептидом, таких как болезнь Альцгеймера, и, в частности, раскрыт например, ингибитор BACE N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид и соответствующая гидрохлоридная соль.

Для повышения эффективности применения в получении и изготовлении фармацевтических препаратов желательно получить новые формы N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, обладающие улучшенными стабильностью твердого состояния и химической стабильностью. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида. Дополнительно согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, имеющая кристаллическую форму. Далее согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][ 1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида, которая характеризуется основным пиком на спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°, при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тозилатной соли N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тозилатной соли N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Согласно настоящему изобретению также предложен способ ингибирования BACE у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тозилатной соли N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Согласно настоящему изобретению также предложен способ ингибирования опосредуемого BACE расщепления белка-предшественника амилоида, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тозилатной соли N[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ ингибирования образования бета-амилоидного пептида, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тозилатной соли N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][ 1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида.

Далее согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5

- 1 031330 метоксипиразин-2-карбоксамида для применения в терапии, в частности, для лечения болезни Альцгеймера или для лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера. Также согласно настоящему изобретению предложено применение тозилатной соли N-[3-[(4aR,7aS)-2амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида для изготовления лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера или для лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества тозилатной соли N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-б][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, которая характеризуется основным пиком на спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранных из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°; при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°. Также согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, которая характеризуется основным пиком на спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°; при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°, для применения в терапии, в частности, для лечения болезни Альцгеймера или для лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера. Далее, согласно настоящему изобретению предложена тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, которая характеризуется основным пиком на спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°; при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°, для изготовления лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера или для лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений при болезни Альцгеймера.

Также согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая тозилатную соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Настоящее изобретение также включает новые промежуточные соединения и способы синтеза тозилатной соли N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида.

Умеренное когнитивное нарушение определяется как продромальная фаза деменции, связанной с болезнью Альцгеймера, на основании клинической картины и того, что у пациентов с умеренным когнитивным нарушением оно со временем прогрессирует в деменцию Альцгеймера (Morris с соавт. Arch. Neurol, 58, 397-405 (2001); Petersen с соавт., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). Термин лечение прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера включает замедление, прекращение или обращение прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера у пациента.

В настоящем тексте термины лечение или лечить включает ограничение, замедление, остановку или обращение вспять прогрессирования или тяжести существующего симптома или нарушения.

В настоящем тексте термин пациент относится к человеку.

Термин ингибирование образования бета-амилоидного пептида используется для обозначения снижения in vivo уровней бета-амилоидного пептида у пациента.

В настоящем тексте термин эффективное количество относится к количеству или дозе соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, которое, после введения пациенту одной дозы или нескольких доз, обеспечивает желаемый эффект у пациента, проходящего диагностику или лечение.

Лицо, осуществляющее диагностику, такое как специалист в данной области, сможет легко определить эффективное количество с использованием известных методик и путем изучения результатов, полученных в аналогичных обстоятельствах. При определении эффективного количества для пациента, лицо, осуществляющее диагностику, учитывает ряд факторов, включающих, но не ограниченных перечисленными: вид, к которому принадлежит пациент, его размер, возраст и общее состояние здоровья, конкретное заболевание или присутствующее заболевание, степень или поражение или тяжесть заболевания или нарушения, конкретное вводимое соединение, путь введения, характеристики биодоступности вводимого препарата и другие значимые обстоятельства.

Соединения согласно настоящему изобретению в целом эффективны в широком диапазоне дозировок. Например, дневные дозировки обычно лежат в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг массы тела. В некоторых случаях, уровни дозировки ниже нижнего предела указанного диапазона могут быть более чем адекватными, а в других случаях еще более высокие дозы могут применяться с приемлемыми побочными эффектами, и, соответственно, указанный диапазон дозировок нико

- 2 031330 им образом не предполагает ограничения объема настоящего изобретения.

Соединения согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте представлены в форме фармацевтических композиций, которые вводят любым путем, обеспечивающим биодоступность соединения, включая пероральный, трансдермальный и парентеральный пути. В наиболее предпочтительном варианте такие композиции предназначены для перорального или трансдермального введения, причем трансдермальное введение является особенно предпочтительным. Такие фармацевтические композиции и способы их применения хорошо известны в данной области, (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (под ред. D.B. Troy, 21-e издание, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида особенно полезна для способов лечения согласно настоящему изобретению, однако некоторые формы являются предпочтительными. В нижеследующих абзацах описаны такие формы. Понятно, что эти предпочтения относятся к фармацевтическим композициям, способам лечения и к новым соединениям согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительной является кристаллическая тозилатная соль N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, которая характеризуется основным пиком на спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°, при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2.

Для специалиста в данной области понятно, что N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4a,5,7-теΊрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид может существовать в таутомерных формах, как показано на схеме А. Следует понимать, что любое приведенное в настоящей заявке указание одного конкретного таутомера N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида охватывает обе таутомерные формы и все их смеси.

Кроме того, некоторые промежуточные вещества, описанные в нижеследующих схемах, могут содержать одну или более защитных групп, защищающих азот. Защитные группы для амина, которые можно варьировать, могут в каждом случае или положении быть одинаковыми или разными в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных превращений, которые нужно осуществить. Условия введения и удаления защиты хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (см., например, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, четвертое издание, авторы Peter G.M. Wuts и Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

В целях ясности в нижеследующих схемах не уточнены некоторые стереохимические центры и опущены некоторые заместители, которые не предполагают ограничения информации, приведенной на схемах. Кроме того, специалист сможет разделить отдельные изомеры, энантиомеры и диастереомеры на любом удобном этапе синтеза соединений согласно настоящему изобретению такими способами как методики селективной кристаллизации или хиральной хроматографии (см., например, J. Jacques, с соавт., Enantiomerss, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981 и E.L. Eliel, S.H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, Wiley-Interscience, 1994). Обозначения изомер 1 и изомер 2 относятся к соединениям, элюируемым при хиральной хроматографии первым и вторым, соответственно, и, в случаях когда хиральную хроматографию начинают на ранних этапах синтеза, такое же обозначение используют для получаемых далее промежуточных соединений и примеров соединений.

Ниже приведены определения некоторых сокращений: ACN относится к ацетонитрилу; АРР относится к белку-предшественнику амилоида; ЦСЖ относится к цереброспинальной жидкости; ДХМ относится к дихлорметану; DIPEA относится к диизопропилэтиламину, Х-этин-Х-изопропин-пропан-Замину или Ν,Ν-диизопропилэтиламину; DMEM относится к среде Дульбекко в модификации Игла; ДМФА относится к диметилформамиду; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; EDCI относится к гидрохлориду 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида; э.и. относится к энантиомерному избытку; EtOAc относится к этилацетату; Ех (Прим.) относится к примеру; F12 относится к среде Хэма F12; ФБС относится к фетальной бычьей сыворотке; FRET относится к резонансному переносу энергии флуоресценции; HEK относится к почке эмбриона человека; HOAc относится к уксусной кислоте; HOBt относится к гидрату 1-гидроксилбензотриазола; ВЭЖХ относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; IC₅₀ относится к концентрации агента, которая обеспечивает 50% максимальной реакции ингибирования, возможной для этого агента; мин относится к минуте или ми

- 3 031330 нутам; МТВЕ относится к метил-трет-бутиловому эфиру; PDAPP относится к тромбоцитарному белку-предшественнику амилоида; преп. относится к получению; RFU относится к относительной единице флуоресценции; SCX относится к сильному катионообмену; R_t относится к времени удерживания; ТГФ относится к тетрагидрофурану.

Для среднего специалиста в данной области понятно, что термины тозилат, толуолсульфоновая кислота, n-толуолсульфоновая кислота и 4-метилбензолсульфоновая кислота относятся к соединению следующей структуры:

o=s=o он

Соответственно, для специалиста в данной области понятно, что любое из следующих названий: тозилатная соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида,

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, толуолсульфоновая кислота,

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, п-толуолсульфоновая кислота и

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид+ 4-метилбензолсульфоновая кислота, относится к соли следующей структуры:

Тозилатную соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида можно получить с использованием различных процедур, известных в данной области, некоторые из которых показаны ниже в приведенных ниже примерах получения и примерах. Дополнительно, специалист в данной области сможет получить N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид в форме свободного основания и соответствующую соль HCl, как описано в патенте США № 8841293. Конкретные этапы синтеза для каждого из описанных путей можно различным образом объединять или применять вместе с этапами других примеров получения для получения соединений согласно настоящему изобретению. Продукты каждого этапа могут быть выделены обычными способами, известными в данной области, включая экстракцию, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрацию, растирание или кристаллизацию. Реагенты и исходные материалы легкодоступны для среднего специалиста в данной области.

Пример получения 1.

2-Бром-1-(5-бром-2-фторфенил)этанон

F О

Вг

N-Бромсукцинимид (984 г, 5,53 моль) добавляют порциями к раствору 1-(5-бром-2фторфенил)этанона (1000 г, 4,6 моль) и п-толуолсульфоновой кислоты (1315 г, 7,64 моль) в ДХМ (7 л) при 35°C. Эту смесь перемешивают и нагревают до 40°C в течение 4 ч. Эту смесь охлаждают до 24°C и добавляют 7% NaHCO₃ (5 л). Слои разделяют, органический слой промывают 10% Na₂SO₃ (5 л) и водой (5 л). Органический слой концентрируют до 2-3 объемов, в результате чего получают указанное в заголовке соединение, которое применяют без дальнейшей очистки.

Альтернативный синтез 1.

1-(5-Бром-2-фторфенил)этанон (80 г, 0,37 моль) растворяют в ДХМ (800 мл) и охлаждают до 10°C. Медленно в течение 5 ч добавляют бром (63 г, 0,39 моль). Через 30 мин добавляют дополнительное количество брома (3,5 г, 0,06 моль). Через 30 мин смесь нагревают до комнатной температуры, органический слой промывают смесью водного раствора NaCl (500 мл) и водного раствора NaHCO₃ (400 мл). Органический слой промывают последовательно водным раствором NaHCO3 (400 мл), водным раствором NaHSO₃ (2x400 мл) и водным раствором NaCl. Органический слой сушат (Na₂SO₄) и концентрируют с

- 4 031330 получением остатка. Остаток растворяют в смеси ДХМ (100 мл) и петролейного эфира (500 мл). Этот раствор охлаждают до -50°C в течение 0,5 ч и собирают твердое вещество фильтрацией, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (84 г, 77%).

¹Н ЯМР (CDCl₃) δ 4,46 (d, 2H), 7,07 (dd, 1H), 7,66 (m, 1H), 8,02 (dd, 1H).

Пример получения 2.

2-[Аллил(бензил)амино]-1 -(5-бром-2-фторфенил)этанон

Вг

2-Бром-1-(5-бром-2-фторфенил)этанон (25,1 г, 84,8 ммоль) добавляют к раствору №бензилпроп-2ен-1-амина (15,0 г, 102 ммоль) в толуоле (200 мл) и DIPEA (59 мл, 338 ммоль) при комнатной температуре. Эту смесь дезоксигенируют путем перемешивания при комнатной температуре в течение 10 мин, барботируя смесь азотом под поверхностью. Реакционную смесь нагревают до 40°C, перемешивают в течение 2,5 ч, а затем добавляют еще №бензилпро-2-ен-1-амин (2,0 г, 13,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 40°C в течение 4,5 ч, а затем охлаждают до комнатной температуры. Этот материал применяют без дальнейшей очистки. Этот раствор исследуют методом ВЭЖХ на присутствие указанного в заголовке соединения с использованием следующих параметров: колонка для ЖХ: колонка для сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC®) Waters Acquity С 8 2,1x100 мм 1,7 мкм; подвижная фаза А: 0,1% (об./об.) ТФУК в воде, 0,2% ацетонитрил (ACN) (об./об.), полученная путем добавления ТФУК (4 мл) и ацетонитрила (ACN) (10 мл) в воду (4 л), подвижная фаза В: 0,1% ТФУК в ацетонитриле (ACN), полученная путем добавления ТФУК (4 мл) к ацетонитрилу (ACN) (4 л). Градиент: % А = 95 до 53,1% в течение 10 мин, скорость потока 0,85 мл/мин, температура колонки: 45°C. R_t = 6,43 мин (УФ).

Пример получения 3.

5-Аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1-(4-метоксифенил)метил-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4с]изоксазол

К раствору 2-бром-1-(5-бром-2-фторфенил)этанона (1363 г, 4,61 моль) в толуоле (10 л) добавляют диаллиламин (537 г, 5,53 моль) и DIPEA (2381 г, 18,42 моль). Эту смесь перемешивают в течение 4 ч при 40°C, в результате чего получают 1-(5-бром-2-фторфенил)-2-(диаллиламино)этанон, который не выделяют. К этой смеси, содержащей неочищенный 1-(5-бром-2-фторфенил)-2-(диаллиламино)этанон, добавляют №(4-метоксибензил)гидроксиламин (847 г, 5,53 моль) и изопропоксид титана(^) (1965 г, 6,91 моль). Эту смесь перемешивают при 90°C в течение 2 ч. Эту смесь охлаждают до 20°C и добавляют 50% моногидрат лимонной кислоты (4 л) и насыщенный Na2CO3 (4 л). Слои разделяют и водный слой экстрагируют метил-трет-бутиловым эфиром (5 л). Органический экстракт промывают водой (5 л), фильтруют через диатомит и концентрируют досуха. К остатку добавляют EtOAc (10 л) и щавелевую кислоту (580 г), фильтруют твердое вещество и добавляют к 1н. раствору NaOH (13 л). Добавляют мутил-третбутиловый эфир (МТВЕ) (5 л) и фильтруют через диатомит. Слои разделяют, органический слой концентрируют до 2 объемов. Добавляют гептан (3 л) и охлаждают раствор до 10°C. Полученное твердое вещество фильтруют, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (1330 г, 64%).

'[ I ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 2,51-2,49 (m, 3H), 3,09-3,04 (m, 3H), 3,78-3,41 (m, 6H), 4,01 (m, 1H), 5,24-5,01 (m, 2H), 5,89-5,85 (m, 1H), 6,82-6,80 (m, 2H), 7,51-7,13 (m, 3H), 7,63-7,62 (m, 1H), 7,65-7,64 (m, 1H).

Пример получения 4.

(3aR,6aS)-5-Бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол (относительная конфигурация), щавелевая кислота о

№[(4-Метоксифенил)метил]гидроксиламин (15,5 г, 101 ммоль) добавляют к раствору 2[аллил(бензил)амино]-1-(5-бром-2-фторфенил)этанона при 40°C, после чего добавляют изопропоксид

- 5 031330 титана(1У) (50,3 мл, 169 ммоль). Эту смесь дезоксигенируют путем барботирования азота через систему в течение 5 мин. Эту смесь нагревают до 90 °C при перемешивании в течение 2 ч. Реакционную смесь промывают раствором лимонной кислоты (36 г, 186 ммоль) в воде (36 г) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляют карбонат натрия (100 г, 939 ммоль) в виде насыщенного раствора в воде и доводят pH до приблизительно 9. Эту смесь разбавляют водой и толуолом для разделения слоев. Слой в толуоле промывают раствором HCl в воде (5,1 мл 5н. раствора HCl), разбавляют водой (200 мл), а затем водой (200 мл). Слой в толуоле концентрируют с получением густого масла. Масло растворяют в EtOAc (375 мл) и добавляют по каплям раствор щавелевой кислоты (15,4 г, 169 ммоль), растворенной в EtOAc (375 мл), при перемешивании при комнатной температуре. Эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 дней, фильтруют и промывают собранный на фильтре продукт этилацетатом (250 мл). Твердое вещество сушат в течение ночи под вакуумом при 40 °C, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде цис-рацемической смеси (41,7 г, 84%). Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 498 (M+H).

Пример получения 5.

N-[3-[(3aR,6aS)-5-Бензил-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол6а-ил]-4-фторфенил]-2,2,2-трифторацетамид (относительная конфигурация)

O^CF₃ (3aR,6aS)-5-Бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3а,4,6тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол (относительная конфигурация), щавелевая кислота (23,6 г, 40,2 ммоль), добавляют к смеси ДХМ (400 мл) и 5н. водного раствора NaOH (200 мл). Эту смесь перемешивают в течение 10 мин, а затем разделяют слои. Органический слой концентрируют, в результате чего получают (3aR,6aS)-5-бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол (относительная конфигурация) (20,0 г, 40,2 ммоль). Этот материал добавляют к диметилсульфоксиду (360 мл), 2,2,2-трифторацетамиду (7,8 г, 68 ммоль), йодиду натрия (10,3 г, 68,6 ммоль), карбонату калия (9,54 г, 68,3 ммоль), (1R,2R)-N,N'-диметил-1,2-циклогександиамину (4,7 г, 32 ммоль) и йодиду меди([) (1,53 г, 8,03 ммоль). Эту смесь дезоксигенируют путем барботирования азота через систему в течение 10 мин. Эту смесь нагревают до 115°C, перемешивают в течение 5,5 ч и охлаждают до комнатной температуры. Добавляют EtOAc (250 мл) и воду (200 мл) и перемешивают полученную смесь в течение 10-15 мин. Разделяют слои и осуществляют обратную экстракцию водного слоя этилацетатом (200 мл). Объединенные органические слои промывают раствором хлорида аммония в воде (20 мас.%, 100 мл), затем водным 20 мас.% раствором хлорида лития (100 мл) и водой (100 мл). Органический слой сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют досуха, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение в виде рацемической цис-смеси (23,6 г, 111%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 530 (M+H).

Пример получения 6.

3-[(3aR,6aS)-5-Бензил-1-(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-6аил]-4-фтор-анилин (относительная конфигурация)

N-[3-[(3aR,6aS)-5-Бензил-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол6а-ил]-4-фторфенил]-2,2,2-трифтор-ацетамид (относительная конфигурация) (21,0 г, 39,7 ммоль) добавляют к метанолу (250 мл), 5н. водному раствору NaOH (105 мл) и этанолу (105 мл) и нагревают полученную смесь до 50°C в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении при 3540°C для удаления метанола и этанола. Этот материал растворяют в смеси метил-трет-бутилового эфира (320 мл) и воды (300 мл). Слои разделяют, органический слой промывают водой (100 мл), а затем смесью воды (400 мл) и 12н. водного раствора HCl (3,5 мл). Водный слой добавляют к смеси метил-третбутилового эфира (400 мл), воды (100 мл) и 5н. водного раствора NaOH (25 мл) и разделяют слои. Водный слой промывают метил-трет-бутиловым эфиром (100 мл). Органические слои объединяют, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют под вакуумом, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде рацемической цис-смеси (9,8 г, 57%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 435 (M+H).

Пример получения 7.

N-3-[(3aR,6aS)-5-Бензил-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-6aил]-4-фторфенил]ацетамид (относительная конфигурация)

- 6 031330

3-[(3aR,6aS)-5-Бензил-1 -(4-метоксифенил)метил]-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с] изоксазол-6аил]-4-фтор-анилин (относительная конфигурация) (9,4 г, 22 ммоль) добавляют к ДХМ (110 мл), 4диметиламинопиридину (0,08 г, 0,65 ммоль) и триэтиламину (6,1 мл, 43 ммоль) и охлаждают реакционную смесь до 0°C. К раствору по каплям добавляют уксусный ангидрид (3,4 г, 33 ммоль). Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 2 ч. Добавляют к реакционной смеси воду (140 мл) и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 10 мин. Разделяют слои, промывают водный слой дихлорметаном (100 мл). Объединенные органические слои сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде рацемической цис-смеси (10,1 г, 100%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 477 (M+H).

Пример получения 8.

Гидрохлорид 5-аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидро-1H-пирроло[3,4-с]изоксазола

ТФУК (4 л, 52,9 моль) добавляют по каплям к раствору 5-аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1-[(4метоксифенил)метил-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазола (1990 г, 4,45 моль) в ДХМ (12 л) с такой скоростью, чтобы температура была все время ниже 35°C. После завершения добавления смесь нагревают до 33-43°C и перемешивают в течение 6 ч. Добавляют NaOH (20%, 10 л) с такой скоростью, чтобы температура была все время ниже 35°C. Слои разделяют, органический слой промывают водой (6 л). Этот раствор концентрируют, добавляют этанол (16 л) и фильтруют через диатомит. Фильтрат концентрируют и добавляют EtOAc (10 л). Добавляют 4 М HCl в EtOAc (8 л), фильтруют полученное твердое вещество и сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (1385 г, 85,6%). Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 327,1 (M+H).

Пример получения 9.

[1 - Аллил-4-амино-4-(5 -бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол

Насыщенный водный раствор карбоната натрия добавляют к раствору 5-гидрохлорида аллил-6а-(5бром-2-фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидро-1H-пирроло[3,4-с]изоксазола (1400 г, 3,85 моль) в ДХМ (7 л) до достижения pH >9. Разделяют слои и концентрируют органический экстракт до 1,5 объемов. Добавляют надуксусную кислоту (НОАс, 1,38 л) и концентрируют раствор до 2 л. Добавляют надуксусную кислоту (НОАс, 7 л) и порошок цинка (2,5 кг, 38,5 моль), нагревают смесь до 40-50°C и перемешивают в течение 3 ч. Добавляют EtOAc (9,8 л) и фильтруют через диатомит.

Остаток на фильтре промывают этилацетатом (4 л). Фильтрат отделяют и добавляют воду (7 л) к объединенным органическим веществам. Добавляют гидроксид аммония до достижения pH >9. Слои разделяют, органический слой концентрируют до объема 2 л. Добавляют этанол (2,8 л) и концентрируют раствор до 2 д. Добавляют этанол (19 л) и фильтруют раствор через диатомит, в результате чего получают раствор в этаноле указанного в заголовке соединения, который применяют без дальнейшей очистки.

Пример получения 10.

[(3S,4R)-1-Аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]аммоний; (2S,3S)-4гидрокси-2,3-бис-[(4-метилбензоил)окси]-4-оксо-бутаноат

- 7 031330

Моногидрат ди-п-толуолил-Ь-винной кислоты (1,04 кг, 2,69 моль) добавляют к раствору [1-аллил-4амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола (1264 г. 3,85 ммоль) в этаноле (21 л). Эту смесь нагревают до 65-75°C и перемешивают в течение 3 ч. Эту смесь охлаждают до 5-10°C, добавляют затравочный кристалл [(3 S,4R)- 1-аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3ил]аммония; (2S,3S)-4-гидрокси-2,3-бис-[(4-метилбензоил)окси]-4-оксо-бутаноата (1,0 г) и перемешивают смесь в течение 3 ч. Твердое вещество фильтруют и промывают осадок на фильтре холодным этанолом (1,4 л). Осадок на фильтре сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в форме белого твердого вещества. Хиральный анализ второго изомера: Колонка (IC Chiralpak, 4,6 ммх250 ммх5 мкм; элюент: 90% гексан (0,3% диэтиламин): 10% этанол (0,3% диэтиламин); скорость потока 1,0 мл/мин при УФ 270 нм) подтверждает энантиомерно обогащенный (99% ее) энантиомер при R_t = 7,4 мин, (1050 г, 38%).

¹H ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 2,40 (s, 6H), 3,05-3,04 (m, 1H), 3,57-3,31 (m, 3H), 3,66-3,58 (m, 4H), 3,75-3,74 (m, 2H), 5,38-5,36 (m, 1H), 5,50-5,46 (m, 1H), 5,88 (s, 2H), 5,97-5,91 (m, 1H), 7,10-7,05 (m, 1h), 7,29 (d, J=8,0 Гц, 4H), 7,53-7,51 (m, 1H), 7,80-7,78 (m, 1H), 8,01 (d, J=8,0 Гц, 4H).

Пример получения 11.

1-[3-[(3S,4R)-3-Амино-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]-4-фторфенил]пропан-2-он (относительная конфигурация), дитолуолсульфоновая кислота

N-3-[(3aR,6aS)-5-бензил-1-[(4-метоксифенил)метил]-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-6аил]-4-фторфенил]ацетамид (относительная конфигурация) (5,0 г, 11,0 ммоль) добавляют к воде (75 мл), 10% палладию на угле (2,5 г, 23 ммоль), n-толуолсульфоновой кислоте (5,0 г, 26 ммоль) и этанолу (75 мл) и гидрогенируют смесь в атмосфере азота при давлении 50 фунтов/кв.дюйм при комнатной температуре в течение 20 ч. Эту смесь фильтруют через диатомит и промывают фильтр этанолом (100 мл), а затем ДХМ (100 мл). Фильтрат концентрируют, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде рацемической цис-смеси с количественным выходом неочищенного вещества (8,1 г, >100%). Этот материал применяют непосредственно без дальнейшей очистки. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 268 (M+H).

Пример получения 12.

((3R,4S)-1-Аллил-4-амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил)метанол

1н. HCl (500 мл, 500 ммоль) добавляют к имеющему температуру 0°C раствору [(3S,4R)-1-аллил-3(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]аммония (2S,3S)-4-гидрокси-2,3-бис-[(4метилбензоил)окси]-4-оксо-бутаноата (100 г, 139,4 ммоль) в EtOAc (500 мл). Эту смесь перемешивают в течение 1 ч. Водный слой отделяют и доводят pH до 8 при помощи 1н. раствора NaOH. Водный слой экстрагируют этилацетатом (350 млх2). Органические слои объединяют, промывают водой (500 мл) и концентрируют, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (40 г, 87%). Хиральный анализ второго изомера: Колонка: IC Chiralpak, 4,6 ммх250 ммх5 мкм; элюент: 90% гексан (0,3% диэтиламин): 10% этанол (0,3% диэтиламин); скорость потока 1,0 мл/мин при УФ 270 нм) подтверждает энан

- 8 031330 тиомерно обогащенный (99,7% энантиомерного избытка) энантиомер с R_t = 7,4 мин.

ΊI ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 2,78-2,70 (m, 5H), 3,16-3,00 (m, 3H), 3,87-3,75 (m, 1H), 3,90-3,84 (m, 1H), 5,24-5,11 (m, 2H), 5,91-5,87 (m, 1H), 6,95-6,91 (m, 1H), 7,35-7,32 (m, 1H), 7,67-7,65 (m, 1H).

Пример получения 13.

N-[3-[(3 S,4R)-3-амино-1 -(5-фторпиримидин-2-ил )-4-(гидроксиметил)пирролидин-3 -ил]-4фторфенил] ацетамид (относительная конфигурация)

1-[3-[(3S,4R)-3-амино-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]-4-фторфенил]пропан-2-он (относительная конфигурация), дитолуолсульфоновую кислоту (7,5 грамм, 12,3 ммоль) добавляют к ацетонитрилу (ACN) (75 мл). Добавляют 2-хлор-5-фторпиримидин (2,44 г, 18,4 ммоль) и DIPEA (7,5 мл, 43 ммоль) и нагревают смесь до 70°C в течение 20 ч. Эту смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Добавляют воду (50 мл), смесь перемешивают в течение 1 ч. В процессе перемешивания образуется суспензия. Смесь фильтруют и сушат при комнатной температуре под вакуумом, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде рацемической цис-смеси (3,0 г). Оставшийся водный раствор экстрагируют хлороформом (3x20 мл), сушат над сульфатом натрия, концентрируют досуха и сушат под вакуумом, в результате чего получают дополнительное количество указанного в заголовке соединения (1,8 г), общий выход неочищенного соединения (4,8 г, 110%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 364 (M+H).

Пример получения 14.

N-(((3S,4R)-1-Аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3ил)карбамотиоил)бензамид он

Бензоилизотиоцианат (15,0 г, 91,9 ммоль) добавляют и имеющему температуру 0°C раствору ((3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил)метанола (30 г, 91,1 ммоль) в ТГФ (400 мл). Этот раствор нагревают до 25°C и перемешивают в течение 1 ч, в результате чего получают раствор в ТГФ указанного в заголовке соединения, который применяют без дальнейшей очистки.

Пример получения 15.

N-((4aR,7aS)-6-Аллил-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил)бензамид, дигидрохлорид

Трифенилфосфин (36,8 г, 140,3 ммоль) добавляют к раствору ТГФ (400 мл) N-(((3S,4R)-1-аллил-3(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил)карбамотиоил)бензамида (91,1 ммоль). Добавляют ди-Сбутил азодикарбоксилат (31,6 г, 137,2 ммоль) в ТГФ (100 мл). Эту смесь перемешивают при 20-30°C в течение 2 ч. Смесь концентрируют и добавляют МТВЕ (400 мл). Этот раствор фильтруют через диатомит и промывают осадок на фильтре метил-трет-бутиловым эфиром (130 мл). Фильтраты объединяют и добавляют 1 н. HCl в EtOAc (200 мл). Эту смесь перемешивают в течение 2 ч, а затем концентрируют до объема 500 мл. Добавляют МТВЕ (320 мл), фильтруют раствор и промывают гептаном (130 мл). Твердое вещество суспендируют в EtOAc (650 мл) и перемешивают при 50-60°C в течение 2 ч. Горячую суспензию фильтруют и промывают этилацетатом (130 мл) и гептаном (130 мл). Твердое вещество снова суспендируют в EtOAc (650 мл) и перемешивают в течение 2 ч при 50-60°C. Горячую суспензию фильтруют и промывают этилацетатом (130 мл) и гептаном (130 мл). Твердое вещество сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде соли дигидрохлорида (40 г, 80%, 99,5% энантиомерный избыток). Хиральный анализ элюируемого первым изомера (колонка: IC Chiralpak, 4,6 ммх250 ммх5 мкм; элюент: 85% гексан (0,1% диэтиламин): 15% изопропиловый спирт (0,1% диэтиламин); скорость потока 1,0 мл/мин при УФ (282 нм)) подтверждает энантиомерно обогащенный (99,5%

- 9 031330 энантиомерный избыток) энантиомер с R_t = 12,5 мин.

Пример получения 16.

N-[(4aR,7aS)-6-Аллил-7a-[2-фтор-5-[(2,2,2-трифторацетил)амино]фенил]-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

15% Карбонат натрия (440 мл) добавляют к раствору N-((4aR,7aS)-6-аллил-7a-(5-бром-2фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамида, дигидрохлорида (495 г, 717,88 ммоль) в EtOAc (3 л) и воды (784 мл). Эту смесь перемешивают в течение 1-2 ч. Слои разделяют, органический слой фильтруют через силикагель (40 г) и промывают этилацетатом (600 мл). Фильтрат концентрируют досуха, в результате чего получают N-((4aR,7aS)-6-аллил-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамид. Трифторацетамид (136,7 г, 1,21 моль), NaI (182,5 г, 1,22 моль), 4 А молекулярные сита (342 г) и K₂CO₃ (170,9 г, 1,24 моль) добавляют к раствору N((4aR,7aS)-6-аллил-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил)бензамида (341 г, 494,54 ммоль) в ДМСО (525 мл) и 1,4-диоксане (1,025 л). К реакционной смеси добавляют транс-№,№-диметилциклогексан (81,6 г, 573,66 ммоль) и йодид меди (27,3 г, 143,34 ммоль) в ДМСО (500 мл). Эту смесь перемешивают в течение 5 мин. Эту смесь нагревают до 100°C, перемешивают в течение 8 ч и охлаждают до 24°C. Добавляют воду (5,9 л) и ДХМ (5,9 л), смесь фильтруют и разделяют слои. Органический слой промывают водой (5,9 л), в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде раствора в ДХМ, которое применяют без дальнейшей очистки.

Пример получения 17.

N-[(4aR,7aS)-7a-5-(Ацетамидо)-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (относительная конфигурация)

оА

ТГФ (30 мл) добавляют к N-[3-[(3S,4R)-3-амино-1-(5-фторпиримидин-2-ил)-4(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]-4-фторфенил]ацетамиду (относительная конфигурация) (4,1 г, 11,0 ммоль). Эту смесь охлаждают в ванне со льдом до 0°C и добавляют бензоилизотиоцианат (1,50 мл, 11,0 ммоль). Затем этой смеси дают нагреться до комнатной температуры в течение 30 мин. Добавляют 1,1'карбонилдиимидазол (1,9 г, 11,0 ммоль) и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем эту смесь нагревают до 55°C и перемешивают еще 18 ч. Добавляют воду (50 мл) и экстрагируют смесь этилацетатом (50 мл). Водный слой экстрагируют дополнительным количеством EtOAc (25 мл) и концентрируют досуха. Сырой остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле, используя для элюирования 50% ДХМ в EtOAc, а затем 100% EtOAc. Соответствующие фракции концентрируют и сушат под вакуумом, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде рацемической цис-смеси (1,33 г, 26%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 509 (M+H).

Пример получения 18.

N-((4aR,7aS)-6-Аллил-7a-(5-амино-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил)бензамид, гидрохлорид

NaOH (28,7 г) и воду (2,7 л) добавляют к раствору в ДХМ N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7a-[2-фтор-5-[(2,2,2трифторацетил)амино]фенил]-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (250 г, 494,4 ммоль) и перемешивают смесь при 24°C в течение 68 ч. Добавляют 1н. HCl (3,5 л) до достижения pH 1-3. Разделяют слои и промывают водный слой дихлорметаном (680 мл). К водному слою добавляют ДХМ (4 л), а затем 21% гидроксид аммония, в результате чего получают pH 8-10. Разделяют слои, органические экстракты объединяют, фильтруют через силикагель (170 г) и промывают дихлорметаном (1,4 л). Растворитель концентрируют досуха и разбавляют этилацетатом (4 л). Добавляют 1 н. HCl в EtOAc (700 мл) при температуре ниже 25°C и перемешивают смесь в течение 1 ч. Эту смесь концентрируют до приблизи

- 10 031330 тельно 7-8 объемов и добавляют EtOAc (2,8 л). Полученный осадок фильтруют и промывают этилацетатом (400 мл). Твердое вещество сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (246 г, 52%).

Пример получения 19.

N-((4aR,7aS)-7a-(5-Ацетамидо-2-фторфенил)-6-аллил-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин2-ил)бензамид

Уксусный ангидрид (23,5 г, 0,23 моль) добавляют к раствору гидрохлорида N-((4aR,7aS)-6-аллил7a-(5-амино-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (100 г, 0,153 моль) и триэтиламина (54,3 г, 0,535 моль) в ДХМ (800 мл). После перемешивания в течение 1 ч при 2025°C, добавляют насыщенный NaHCO₃ (700 мл) и воду (600 мл). Слои разделяют, в результате чего получают указанное в заголовке соединение, которое применяют без дальнейшей очистки в форме раствора в ДХМ.

Пример получения 20.

N-((4aR,7aS)-7a-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил)бензамид

Трифенилфосфин (4,0 г, 0,015 моль) и 1,3-диметилбарбитуровую кислоту (15,2 г, 0,097 моль) добавляют к раствору ДХМ N-((4aR,7aS)-7a-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-6-аллил-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (0,153 моль). Добавляют ацетат палладия (1,7 г, 7,7 ммоль) и перемешивают смесь при температуре от 20 до 30°C в течение 1 ч. Добавляют 25% гидроксид аммония и разделяют слои. Органический слой промывают надуксусной кислотой (НОАс, 3,0 экв. в 500 мл воды) и доводят pH до 8-9 при помощи 25% гидроксида аммония. Водный слой экстрагируют дихлорметаном (2x500 мл). Органические экстракты объединяют и концентрируют до 3-4 объемов. Добавляют метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ) (1 л) и фильтруют. Эту смесь концентрируют и добавляют гептан (1 л). Полученное твердое вещество фильтруют, собирают и сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (48 г, 76%).

Щ ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 2,15 (s, 3H), 2,87-2,83 (m, 1H), 3,43-3,23 (m, 5H), 3,70-3,67 (m, 1H), 7,127,07 (m, 1H), 7,28-7,27 (m, 1H), 7,52-7,41 (m, 4H), 7,79 (m, 1H), 8,18-8,16 (m, 2H).

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 413,1 (M+H).

Пример получения 21.

N-((4aR,7aS)-7a-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил)бензамид

2-Хлор-5-фторпиримидин (28,9 г, 218 ммоль) и карбонат калия (33,46 г, 242,1 ммоль) добавляют к раствору N-((4aR,7aS)-7a-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил)бензамида (50 г, 121,22 ммоль) в ДМФА (100 мл). Эту смесь нагревают до 80-85°C в течение 8 ч. Смесь охлаждают до 24°C, фильтруют, и промывают диметилформамидом (ДМФА, 100 мл). Твердые вещества суспендируют в воде (2 л) и фильтруют, в результате чего получают указанное в заголовке соединение(68,5 г, 98%). ЖХ-МС: m/z=509,2 (M+H)⁺.

'll ЯМР (400 МГц, d₆-ДМСО) δ ppm 1,22 (t, J= 7,28 Гц, 2H), 1,92-2,07 (m, 6H), 2,89-3,20 (m, 2H), 3,36-3,44 (m, 1H), 3,67 (t, J=9,54 Гц, 1h), 3,84 (br. s., 1H), 4,16 (br. s., 2H), 7,23 (br. s., 2H), 7,35 -7,61 (m, 8H), 7,77 (br. s., 2H), 7,85-8,18 (m, 4H), 8,48 (s, 4H), 10,15 (br. s., 1H), 10,46-10,59 (m, 1H).

Пример получения 22.

(4aR,7aS)-7a-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4- 11 031330

d][1,3] тиазин-2-амин

Гидроксид лития (8,6 г, 204,9 ммоль) добавляют к раствору N-((4aR,7aS)-7a-(5-an,eTaMugo-2фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4Ш][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (80 г, 157,3 ммоль) в метаноле (400 мл). Эту смесь нагревают до 60-70°C в течение 4 ч. Добавляют концентрированную HCl (132 г) и перемешивают смесь при 55°C в течение 18 ч. Эту смесь охлаждают до 30°C и концентрируют, чтобы удалить метанол. Добавляют воду и экстрагируют водный слой дихлорметаном (3 х), в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде 920 г водного раствора, где 5,6% общей массы составляет указанное в заголовке соединение, которое применяют без дальнейшей очистки.

Альтернативный синтез 22.

Серную кислоту (33,4 мл, 626,6 ммоль) добавляют к раствору (4aR,7aS)-7a-(2-фтoрфeнил)-6-(5фтoрпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тeтрaгидрoпиррoлo[3,4-d][1,3]тиaзин-2-aминa (45,8 г, 125,3 ммоль) в ТФУК (626 мл). Эту смесь охлаждают до 0°C и перемешивают в течение 20 мин. Добавляют дымящуюся азотную кислоту (6,2 мл, 144,1 ммоль), нагревают реакционную смесь до 22°C и перемешивают в течение 3 ч. Реакционную смесь выпаривают, добавляют метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ) (250 мл) и дважды выпаривают. Остаток сушат под вакуумом до достижения постоянной массы, а затем растворяют в воде (147 мл) и этаноле (885 мл) и дегазируют путем барботирования азотом в течение 15 мин. Этот раствор переносят в реактор под давлением и добавляют 10% Pd/C, пастообразный, 87 л (6,6 г, 6,27 ммоль). Эту смесь разбавляют дополнительным количеством этанола (700 мл) и создают избыточное давление водорода 80 фунтов/кв.дюйм в течение 16 ч. Реакционную смесь фильтруют, а затем добавляют вторую порцию катализатора - 87 л 10% пастообразного Pd/C (6,6 г, 6,27 ммоль), доводят давление в сосуде со смесью до 80 фунтов/кв.дюйм и перемешивают в течение 3 дней в реакторе под давлением. Реакционную смесь продувают азотом и фильтруют на диатомите. Фильтрат выпаривают и разделяют остаток между водой (200 мл) и EtOAc (200 мл). Водный слой отделяют, охлаждают до 5°C и нейтрализуют гидроксидом аммония (15% мас./мас.). Водный слой экстрагируют этилацетатом (3х150 мл). Органические вещества объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают при пониженном давлении, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде светло-коричневого твердого вещества (47,7 г, 99% с остаточными количествами EtOAc). Macc-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 363 (M+H).

Пример получения 23.

Бензил-№аллил-№(2,2-диметоксиэтил)карбамат

Раствор бензил-№(2,2-диметоксиэтил)карбамата (50 г, 208,9 ммоль) в толуоле (180 мл) обрабатывают твердым гидроксидом калия (51,6 г, 919,69 ммоль) в атмосфере азота. Через 10 мин добавляют хлорид бензилтриэтиламмония (0,8 г, 3,1 ммоль). Еще через 10 мин по каплям добавляют раствор аллилбромида (33 г, 272,8 ммоль) в толуоле (50 мл) в течение 10 мин. Полученную смесь перемешивают при 50°C в течение 48 ч. Эту смесь охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют водой. Органический слой отделяют, промывают солевым раствором, сушат над сульфатом магния и концентрируют досуха, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (44 г, 75%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 280 (M+H).

Пример получения 24.

Бензил-№аллил-№(2-оксоэтил)карбамат

О

Раствор бензил-№аллил-№(2,2-диметоксиэтил)карбамата (30 г, 107 ммоль) в муравьиной кислоте (36,8 мл, 860 ммоль) и воде (4,84 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Эту смесь концентрируют и разбавляют смесью гексаны/EtOAc (1:2) и водой. Органический слой отделяют, промывают солевым раствором до достижения pH 6 и сушат над сульфатом натрия. Растворитель выпаривают, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (25 г, 99%). Масс-спектрометрия с

- 12 031330

ионизацией электрораспылением: (m/z): 234 (M+H).

Пример получения 25.

Бензил-Х-аллил-№[2-гидроксииминоэтил]карбамат

Раствор бензил-Х-аллил-№(2-оксоэтил)карбамата (25 г, 107 ммоль) в ацетонитриле (ACN) (150 мл) обрабатывают гидрохлоридом гидроксиламина (9,68 г, 139 ммоль) и раствором тригидрата ацетата натрия (16 г, 117,9 ммоль) в воде (75 мл). Эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Выпаривают ацетонитрил (ACN) и экстрагируют водный раствор этилацетатом. Органический слой отделяют, сушат над сульфатом магния и концентрируют под вакуумом, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (24 г, 90%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/e): 249 (M+H).

Пример получения 26.

Бензил-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

Раствор бензил-Х-аллил-№[2-гидроксииминоэтил]карбамата (24 г, 96,6 ммоль) в ДХМ (338 мл) обрабатывают по каплям в течение 10 мин 5% (мас./мас.) водным раствором гипохлорита натрия (106,08 ммоль, 143,06 мл). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасят 40% водным раствором бисульфита натрия (7 г). Органический слой отделяют, сушат над сульфатом магния и концентрируют под вакуумом. Неочищенный продукт очищают на силикагеле, используя для элюирования 5% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (18 г, 75%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 247 (M+H).

Пример получения 27.

Бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидро-1H-пирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

1,6 М раствор н-бутиллития в гексанах (25,4 мл, 40,6 ммоль) добавляют по каплям к имеющему температуру -78°C раствору 4-бром-1-фтор-2-йодобензола (12,22 г, 40,6 ммоль) в ТГФ (60 мл), в результате чего получают желтый раствор, который перемешивают при -78°C в течение 15 мин.

Добавляют этерат трифторида бора (5,14 мл, 40,6 ммоль), что обеспечивает отделение раствора бензил-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата при -78°C (5 г, 20,3 ммоль) в ТГФ (60 мл) и перемешивают смесь при -78°C в течение 5 мин. Этот раствор добавляют к полученной ранее литийорганической смеси при -78°C через канюлю. Объединенную смесь перемешивают в течение 30 мин при -78°C. Эту смесь нейтрализуют насыщенным водным раствором хлорида аммония и нагревают до комнатной температуры. Эту смесь экстрагируют этилацетатом (3 х), объединяют органические экстракты, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и удаляют растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищают на силикагеле с использованием 35-минутного градиента от 5 до 100% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (2,27 г, 27%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 421/423 (M+H).

Пример получения 28.

Бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4с]изоксазол-5-карбоксилат

Бензоилизотиоцианат (2,87 мл, 21,28 ммоль) добавляют по каплям к раствору бензил-6а-(5-бром-2фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидро-1H-пирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (5,977 г, 14,2 ммоль) в ТГФ (95 мл) и перемешивают в течение ночи в атмосфере азота. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт очищают на силикагеле с использованием 30-минутного градиента от 5 до 100% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (6,05 г, 73%). Масс- 13 031330 спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 584/586 (M+H).

Пример получения 29.

Бензил-3-(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1карбоксилат он

Смесь бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4с]изоксазол-5-карбоксилата (6,05 г 10,4 ммоль) и цинка (порошок, <10 микрон) (6,77 г, 103,5 ммоль) перемешивают в надуксусной кислоте (НОАс, 52 мл) при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом и фильтруют через диатомит. Растворитель удаляют под вакуумом, а остаток разбавляют этилацетатом, водой и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагируют этилацетатом (3х), объединенные органические слои объединяют и сушат над сульфатом натрия, фильтруют и удаляют растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищают на силикагеле с использованием 30-минутного градиента от 5 до 100% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (5,222 г, 86%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 586/588 (M+H).

Пример получения 30.

Бензил-2-бензамидо-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6карбоксилат

1,1'-Карбонилдиимидазол (2,87 г, 17,7 ммоль) добавляют к раствору бензил-3(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (5,198 г, 8,86 ммоль) в ТГФ (52 мл). Эту смесь перемешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре, а затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение ночи в атмосфере азота.

Реакционную смесь охлаждают, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (3 х). Органические слои объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и удаляют растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищают на силикагеле с использованием 30-минутного градиента от 5 до 100% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (2,93 г, 58%). Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br). 568/570 (M+H).

Пример получения 31.

N-[7a-(5-Бром-2-фторфенил)-4a,5,6,7-тетрагидро-4H-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Йодотриметилсилан (2,21 мл, 15,46 ммоль) добавляют по каплям к имеющему комнатную температуру раствору бензил-2-бензамидо-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,93 г, 5,15 ммоль) в ацетонитриле (ACN) (44 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч и удаляют растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищают на колонке с сильным катионообменным наполнителем с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол, затем смеси 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (2,098 г, 94%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 434/436 (M+H).

Пример получения 32.

трет-Бутил 2-бензамидо-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6карбоксилат

Ди-трет-бутилдикарбонат (1,16 г, 5,31 ммоль) и триэтиламин (1,01 мл, 7,25 ммоль) добавляют к раствору N-[7a-(5-бром-2-фторфенил)-4a,5,6,7-тетрагидро-4H-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида

- 14 031330 (2,098 г, 4,83 ммоль) в ДХМ (48 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Растворитель удаляют под вакуумом и очищают неочищенный продукт на силикагеле с использованием 30-минутного градиента от 5 до 100% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (2,556 г, 99%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 534/536 (M+H).

Пример получения 33. трет-Бутил-7a-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6карбоксилат

Раствор трет-бутил-2-бензамидо-7a-(5-бром-2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,556 г, 4,8 ммоль) и транс-Ы)№-диметил-1,2-циклогександиамина (150 мг, 1,1 ммоль) в этаноле (50 мл) обрабатывают азидом натрия (933 мг, 14,3 ммоль). Добавляют водный раствор натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,66 М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воду (1 мл) и продувают верхнюю часть колбы азотом. Эту смесь обрабатывают водным раствором петнагидрата сульфата меди(П) (0,33 М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и сразу нагревают смесь на предварительно нагретой до 80°C плите в течение 1,5 ч в атмосфере азота. После нагревания получают гомогенную смесь. Реакционную смесь охлаждают, разбавляют ледяной водой и экстрагируют смесь этилацетатом (3 х). Органические экстракты объединяют и сушат над сульфатом натрия, фильтруют и удаляют растворитель под вакуумом, в результате чего получают неочищенный азидный продукт. Неочищенный азидный продукт смешивают с 10% палладием на угле (1 г) в холодном этаноле (150 мл) и продувают смесь, используя циклы вакуум/азот, а затем вакуум/водород. Смесь перемешивают при комнатной температуре при давлении водорода 30 фунтов/кв.дюйм в течение 5 ч. Реакционную смесь освобождают от газов, фильтруют через диатомит и споласкивают остаток на фильтре дихлорметаном. Удаляют растворитель из фильтрата под вакуумом и очищают неочищенный продукт на силикагеле с использованием 50% EtOAc в ДХМ, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (2,014 г, 89%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 471 (M+H).

Пример получения 34.

N-[7a-(5-Амино-2-фторфенил)-4a,5,6,7-тетрагидро-4H-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

ТФУК (10 мл) добавляют к раствору трет-бутил-7a-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,013 г, 4,28 ммоль) в ДХМ (30 мл) и перемешивают смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 4 ч. Растворитель удаляют под вакуумом и очищают неочищенный продукт на колонке с сильным катионообменным наполнителем с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол, а затем 2:1 ДХМ:7н. раствор аммиака в метаноле, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (1,555 г, 98%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 371 (M+H).

Пример получения 35.

Рацемический N-[7a-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор N-[7a-(5-амино-2-фторфенил)-4a,5,6,7-тетрагидро-4H-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил]бензамида (705 мг, 1,90 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (1,01 г, 7,61 ммоль) и DIPEA (1,66 мл, 9,52 ммоль) нагревают в 1,4-диоксане (20 мл) с обратным холодильником в течение 4 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждают, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (3 х). Органические слои объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и удаляют растворитель под вакуумом, в результате чего получают неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищают на силикагеле с применением 25-минутного градиента от 5 до 100% EtOAc в гексанах, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (590 мг, 66%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 467

- 15 031330 (M+H).

Пример получения 36.

Х-[(4аК,7а8)-7а-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4-4][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (изомер 1)

Рацемический Х-[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (1,694 г, 3,63 ммоль) очищают хиральной ВЭЖХ (колонка: Chiralcel OJ, 8x35 см; элюент: 90% метанол (0,2% диметилэтиламин) и 10% ацетонитрил (ACN); поток 400 мл/мин, 280 нм УФ-излучение). Анализ элюируемого первым изомера (колонка: Chi ralcel OJ-H 0,46x15 см; элюент: 10:90 ацетонитрил (ACN):метанол (с 0,2% диметилэтиламина); поток: 0,6 мл/мин, 280 нм УФ-излучение) подтверждает энантиомерно обогащенный (99% энантиомерный избыток) энантиомер с R_t = 6,70 мин, (723 мг, 43%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 467 (M+H).

Пример получения 37.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, изомер 1

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил]бензамид, изомер 1 (0,361 г, 0,77 ммоль) растворяют в смеси ДХМ (4 мл) и ДМФА (0,5 мл). К этой смеси добавляют 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (240 мг, 1,55 ммоль), гидроксибензотриазол (210 мг, 1,55 ммоль) и EDCI (300 мг, 1,55 ммоль) и перемешивают смесь в течение ночи при комнатной температуре. Реакционный раствор добавляют сразу на загрузочную 12 г силикагелевую колонку и очищают с использованием 40 силикагелевой колонки, используя для элюирования градиент 0-100% EtOAc/гексаны. Продукт растворяют в EtOAc (200 мл), промывают 1н. раствором NaOH (2x50 мл) и солевым раствором (1x50 мл). Повторяют очистку силикагелем по описанной выше процедуре, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (350 мг, 74%). Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 603 (M+H).

Пример получения 38.

5-Аллил-6а-(2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-Ш-пирроло[3,4-с]изоксазол о ν'

N

Этап химической реакции в потоке: 343-мл бесшовный трубчатый реактор из нержавеющей стали (внешний диаметр =1/8 дюйма) помещают внутрь печи для газовой хроматографии и промывают толуолом при скорости потока 20 мл/мин в течение 20 мин. Прикладывают обратное давление азота (720 фунтов/кв.дюйм относительно атмосферного давления) и выставляют температуру печи на 210°C. После достижения температуры 210°C через реактор прокачивают раствор 2-(диаллиламино)-1-(2фторфенил)этаноноксима (480,51 г, 1,74 моль) в толуоле (5,81 л) со скоростью 22,866 мл/мин с использованием пары шприцев-инжекторов для хроматографии высокого давления, работающих в непрерывном режиме, обеспечивая таким образом время обработки, равное 15 мин. После поглощения всего исходного раствора реактор промывают толуолом при скорости потока 22,866 мл/мин в течение 30 мин. Выставляют температуру в печи для газовой хроматографии на 25°C, собирают весь раствор и концентрируют под вакуумом. Растворитель выпаривают и растворяют остаток в ДХМ (2,5 л) и воде (5 л). Доводят pH до 1 при помощи HCl, отделяют водный слой и нейтрализуют при помощи NaOH, доводя pH до 10. Водный слой экстрагируют метил-трет-бутиловым эфиром (3x2,5 л). Органические экстракты объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают досуха, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение (248 г, 47%), которое применяют без дальнейшей очистки. Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 249 (M+H).

- 16 031330

Пример получения 39.

1-Аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол

к раствору 5-аллил-6а-(2-фторфенил)-3,3a,4,6Порошок цинка (590 г, 9 моль) добавляют тетрагидро-Ш-пирроло[3,4-с]изоксазола (3559 г, 1,29 моль) в насыщенном водном растворе (3,56 л) смеси метанола (2,85 л) и хлорида аммония и нагревают смесь в течение 16 ч при 70°C. Реакционную смесь охлаждают до 60°C, разбавляют в ТГФ (2,85 л) и фильтруют горячей на диатомите. Фильтрат выпаривают для удаления органического растворителя и разбавляют водную смесь водным раствором лимонной кислоты 10% (масс./масс.) (4 л) и EtOAc (3,5 л). Отделяют органический слой и промывают водный слой этилацетатом (2x2 л). Водный слой нейтрализуют, используя NaOH 50% (мас./мас.) для того чтобы довести pH до 10, а затем экстрагируют этилацетатом (2x1,5 л). Органические экстракты объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают досуха, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение (299 г, 92%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 251 (M+H).

Пример получения 40 [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол; 2,3-бис-[(4-метилбензоил)окси] бутандиовая кислота

Раствор ди-п-то.луо.ли.л-1 .-винной кислоты (348,6 г, 884 ммоль) в 1-метокси-2-пропаноле (1,13 л) добавляют к раствору [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола (225,9 г, 902 ммоль) в 1-метокси-2-пропаноле (1,13 л), предварительно нагретому до 40°C. Реакционную смесь охлаждают до 22°C и перемешивают в течение 18 ч. Собирают фильтрацией белое твердое вещество и промывают 1-метокси-2-пропанолом (600 мл). Собранное твердое вещество сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (183,01 г, 31,8%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 251 (M+H).

Пример получения 41.

[(3R,4S)-1-Аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол

[(3R,4S)-1-Аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол; 2,3-бис-[(4метилбензоил)окси]бутандиовую кислоту (211 г, 331 ммоль) растворяют в воде (2,1 л) и добавляют EtOAc (2,3 л). HCl 35% (мас./мас.) до достижения pH 1. Водный слой отделяют, доводят pH до 10 при помощи NaOH (50% мас./мас.) и экстрагируют этилацетатом (2x). pH водного слоя доводят до 10 водным раствором NaOH и экстрагируют метил-трет-бутиловым эфиром (3x), одновременно поддерживая pH водного раствора на уровне pH 10. Органические экстракты объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют досуха, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение, (73 г, 88%, 94,8% энантиомерный избыток). Продукт исследуют методом хиральной хроматографии: колонка AS-H, элюент - 10% изопропиловый спирт, 2% изопропил амин; скорость потока 3 мл/мин, 220нм УФ; давление 100 бар при 35°C, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде изомера, элюируемого вторым, R_f = 2,26 мин. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 251 (M+H).

Пример получения 42.

N-[(4aR,7aS)-6-Аллил-7a-(2-фторфенил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил]бензамид

Раствор [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола (129,7 г, 414 ммоль)

- 17 031330 в ТГФ (2,3л) охлаждают при 0°C в атмосфере азота. Добавляют бензоилизотиоцианат (61,5 мл, 456 ммоль), поддерживая температуру ниже 5°C. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры в течение 3 ч, добавляют 1,1'-карбонилдиимидазол (87,4 г, 538,9 ммоль) и перемешивают реакционную смесь при 22°C в течение 1 ч с последующим нагреванием при 70°C в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждают до 22°C и выпаривают растворитель. Остаток разделяют в EtOAc (1 л) и воде (1 л). Органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют этилацетатом (2x400 мл). Органические вещества объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют, и выпаривают досуха, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя для элюирования градиент EtOAc / ДХМ от 0-40% ДХМ, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого твердого вещества (170 г, 99%), содержащего остаточные количества растворителя. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 396 (M+H).

Пример получения 43.

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-Фторфенил)-4a,5,6,7-теΊрагидро-4H-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Бензойную кислоту, 2-меркапто- (122 г, 793 ммоль), бис(дибензилиденацетон)палладий (4,15 г, 7,21 ммоль) и 1,4-бис-(дифенилфосфино)бутан (3,14 г, 7,21 ммоль) добавляют к раствору N-[(4aR,7aS)-6аллил-7a-(2-фторфенил)-4,4a,5,7-теΊрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (178,21 г, 360 ммоль) в безводном 2-метилтетрагидрофуране (1,96 л) в атмосфере азота. Этот раствор дегазируют, используя три цикла вакуум/ азот, а затем барботируют реакционную смесь азотом в течение 15 мин. Реакционную смесь нагревают до 40°C, барботируя реакционную смесь азотом. Когда температура реакционной смеси достигает 40°C, барботирпование прекращают и перемешивают реакционную смесь при 40°C в течение 3 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждают до 22°C и разбавляют водной. (2 л). Добавляют раствор HCl (5 М) до достижения pH 1. Водный слой отделяют и промывают дополнительным количеством EtOAc (2x800 мл). pH водного слоя доводят до 10 при помощи 50% (мас./мас.) NaOH, а затем экстрагируют этилацетатом (10 л). Водный слой промывают дополнительным количеством EtOAc (2x750 мл). Органические экстракты объединяют, промывают солевым раствором, сушат над сульфатом натрия, фильтруют, и выпаривают досуха, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого твердого вещества (124,7 г, 97%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 356 (M+H).

Пример получения 44.

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-Фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор N-[(4aR,7aS)-7a-(2-фторфенил)-4a,5,6,7-теΊрагидро-4H-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил]бензамида (124,7 г, 256 ммоль), DIPEA (67 мл), 5-фтор-2-хлорпиримидина (29,3 мл, 307 ммоль) в Nметилпирролидоне (997 мл) нагревают до 100°C в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждают до 22°C и вливают в охлажденную до 10°C воду (10 л), поддерживая температуру ниже 15°C. Бледно-кремовое твердое вещество собирают фильтрацией и промывают дополнительным количеством воды. Влажное твердое вещество растворяют в EtOAc (2 л) и переносят в делительную воронку. Добавляют водный раствор(1 л) хлорида натрия (5% мас./мас.), органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют, фильтрат выпаривают при пониженном давлении. Продукт очищают хроматографией на силикагеле с использованием градиента 0-40% EtOAc/изогексан, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого твердого вещества (116 г, 70%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 452 (M+H).

Пример получения 45.

(4aR,7aS)-7a-(2-Фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-2-амин

Гидроксид лития (9,26 г, 386 ммоль) добавляют к смеси N-[(4aR,7aS)-7a-(2-фторфенил)-6-(5

- 18 031330 фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (158,6 г, 351,6 ммоль) в метаноле (1,6 л). Эту смесь нагревают при 70°C в течение 4 ч, а затем охлаждают до 22°C. Реакционную смесь выпаривают под вакуумом с получением желтого остатка. Остаток разделяют в воде (1 л) и EtOAc (750 мл). Добавляют HCl (5 М водный раствор) до достижения pH 1. Водный слой отделяют, органический слой промывают этилацетатом (2x200 мл). pH водного слоя доводят 50% (мас./мас.) водным раствором NaOH до pH 10 и экстрагируют этилацетатом (3x1 л). Органические экстракты объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают при пониженном давлении, в результате чего получают неочищенное указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого твердого вещества (133,3 г, 99%, содержащее 12% остаточного EtOAc). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 348 (M+H).

Пример получения 46.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида гидрохлорид.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, изомер 1 (0,350 г, 0,58 ммоль) растворяют в ТГФ (2 мл), а затем добавляют метанол (4 мл) и этанол (4 мл). К этой смеси добавляют Ометилгидроксиламина гидрохлорид (495 мг, 5,81 ммоль) и пиридин (470 мкл, 5,81 ммоль), нагревают реакционную смесь до 50°C и перемешивают в течение ночи. Добавляют в реакционную смесь силикагель (~10 г) и концентрируют смесь. Образец, высушенный на силикагеле, загружают на пустой картридж и очищают, используя для элюирования градиент 0-10% 7н. раствора аммиака в метаноле в ДХМ. Продукт очищают второй раз на колонке для сильной катионообменной хроматографии (SCX) с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол, а затем 2:1 ДХМ:7 N аммиак в метаноле. Последнюю очистку продукта проводят на силикагеле с градиентом от 0 до 10% 7н. раствора аммиака в метаноле в ДХМ, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в форме свободного основания. Этот материал растворяют в ДХМ (5 мл) и 1 М добавляют раствор HCl в диэтиловом эфире (0,20 мл, 660 мкмоль). Растворитель удаляют под вакуумом, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (71 мг, 23%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 498 (M+H).

Рентгеновская дифракция (XRD).

Рентгеновские дифрактограммы кристаллических твердых веществ получают на дифрактометре для рентгеновской порошковой дифрактометрии Bruker D4 Endeavor, оборудованном CuKa источником с λ = 1,54060 А и детектором Vantec с рабочими настройками 35 кВ и 50 мА. Образец сканируют в диапазоне значений 28 от 4 и 40°, с шагом для значений 28, равным 0,009°, и скоростью сканирования 0,5 секунд/шаг и с расхождением 0,6 мм, фиксированным 5,28 антирассеивателем и 9,5 мм щелями детектора. Сухой порошок утрамбовывают на кварцевом держателе образца и выравнивают поверхность при помощи предметного стекла. Дифрактограммы кристаллических форм снимают при температуре и влажности окружающей среды. В области кристаллографии хорошо известно, что значения относительной интенсивности пиков дифракции могут варьировать в зависимости от предпочтительной ориентации, обуславливаемой такими факторами как морфология и габитус кристалла. В тех случаях, где имеют место эффекты предпочтительной ориентации, интенсивность пиков меняется, но положения характеристических пиков полиморфов остается неизменным. См., например, национальный формуляр Фармакопеи США The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, с. 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой конкретной кристаллической формы, угловые положения пиков могут немного варьировать. Например, положения пиков могут сдвигаться из-за изменений температуры или влажности, при которых исследуют образец, смещения образца или присутствия или отсутствия внутреннего стандарта. В настоящем случае допуск ±0,2 для значений 28 позволяет учесть эти возможные вариации, и при этом не препятствует однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Кристаллическую форму можно подтвердить на основании любой уникальной комбинации характеристических пиков (в единицах ° 2Θ), обычно - более выраженных пиков. Дифрактограммы кристаллических формы, полученные при температуре и влажности окружающей среды, корректируют в соответствии со стандартными пиками по стандарту NIST 675 при значениях 2-тета 8,853 26,774.

Пример получения 47.

Кристаллическая форма 2N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида (гидратированного).

- 19 031330

Оксалилхлорид (888 мкл, 10,2 ммоль) добавляют к раствору 5-метоксипиразин-2-карбоновой кислоты (1,6 г, 10,2 ммоль) в ацетонитриле (ACN) (53 мл) и ДМФА (848 мкл). Через 15 мин свежеприготовленный раствор добавляют к раствору (4аК,7а8)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-амина (2,65 г, 7,3 ммоль) в смеси воды (53 мл) и этанола (53 мл), предварительно нагретой при 50°C. Реакционную смесь перемешивают при 50°C в течение одного часа, охлаждают до 22°C, а затем перемешивают в течение ночи при этой температуре. Органический растворитель выпаривают под вакуумом, обрабатывают водную смесь водным 50% (мас./мас.) раствором NaOH для доведения до pH 10. Выделяют бледно-кремовое твердое вещество и промывают дополнительным количеством воды. Твердое вещество разбавляют изопропиловым спиртом (2х) и выпаривают растворитель. Неочищенный материал очищают хроматографией на силикагеле с использованием градиента метанола с аммиаком (2 н) / ДХМ. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и выпаривают растворитель, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде беловатого твердого вещества (1,9 г, 52%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 499 (M+H).

Альтернативный пример получения кристаллической формы 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида (гидратированного).

Ацетонитрил (ACN) (500 мл) добавляют к ДМФА (19,2 мл, 248,9 ммоль). К раствору ДМФА/ацетонитрил (ACN) добавляют оксалилхлорид (39,3 г, 309,63 ммоль), а затем 5-метоксипиразин2-карбоновую кислоту (46,0 г, 298,4 ммоль). В отдельной колбе добавляют водный раствор (4aR,7aS)-7a(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-амина (56,8 г, 156,75 ммоль) к ацетонитрилу (ACN) (500 мл) и доводят pH до 9 гидроксидом аммония (95 мл). Затем эту смесь нагревают до 50 - 55°C. Добавляют раствор оксалилхлорида и перемешивают смесь в течение 3 ч. pH доводят до 8-9 гидроксидом аммония. Полученный осадок фильтруют, промывают водой и сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (123 г). Твердое вещество суспендируют в ацетоне (250 мл) в течение 1,5 ч и фильтруют. Влажный осадок на фильтре промывают ацетоном, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (110 г с 90,5% чистотой, определенной методом ВЭЖХ). К твердому веществу добавляют ТГФ (1 л) и активированный уголь (9 г) и нагревают смесь с обратным холодильником в течение ночи. Эту смесь фильтруют через диатомит и промывают тетрагидрофураном (150 мл). Органический раствор концентрируют до 10 объемов и нагревают до 60°C. Добавляют воду (430 мл) и перемешивают смесь при 60°C в течение 8 ч. Эту смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение 10 ч. Полученное твердое вещество фильтруют, промывают смесью ТГФ/вода (7:6) и сушат, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (69 г, 88%) ЖХ-МС :(m/z) 499 (M+H), чистота: 98,3%.

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-de) δ ppm 2,99-3,07 (m, 2H), 3,07-3,14 (m, 1H), 3,58-3,67 (m, 1H), 3,68-3,76 (m, 1H), 3,76-3,84 (m, 1H), 4,02 (s, 3 1H), 4,07 (d, J=10,92 Гц, 1H), 6,08 (s, 2H), 7,19 (dd, J=11,98, 8,72 Гц, 1H), 7,78-7,89 (m, 2H), 8,41 (s, 1H), 8,44 (s, 2H), 8,88 (s, 1H), 10,60 (s, 1H).

Общая процедура для получения кристаллической формы 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида (гидратированного).

Суспендируйте N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида в ТГФ при температуре приблизительно 23°C в концентрации приблизительно 71 мг/мл растворителя. Нагревайте суспензию при перемешивании до растворения, которое происходит при температуре от приблизительно 60°C до приблизительно 63°C. Добавьте к горячему раствору воду, чтобы получить соотношение ТГФ:вода в растворителе приблизительно 95:5. Добавьте затравочные кристаллы формы 2 N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида (загрузка приблизительно 3 % по масса). Полученную жидкую суспензию выдерживают при температуре от приблизительно 60°C до приблизительно 63°C в течение приблизительно 20 мин, после чего добавляют от приблизительно 5,3 до приблизительно 5,5 объемов воды в течение от приблизительно 2 до приблизительно 4 ч, в результате сего получают соотношение ТГФ:вода в растворителе приблизительно 69:31. Затем суспензию выдерживают при температуре от приблизительно 60°C до приблизительно 63°C в течение приблизительно 30 мин, а затем охлаждают до приблизительно 23°C в течение приблизительно 1 ч, а затем перемешивают в течение приблизительно 8-12 ч. Затем суспензию фильтруют, слегка промывают смесью ТГФ:вода (35:65) и сушат в течение приблизительно 8-12 ч под пониженным вакуумом при температуре приблизительно 40°C, в результате чего получают желаемую кристаллическую форму 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2карбоксамида, которая гидратирована.

Полученный образец кристаллической формы 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид

- 20 031330 характеризуется рентгеновской дифрактограммой, полученной использованием CuKa излучения, имеющей пики дифракции (значения 2-тета), описанные в табл. 1. В частности, дифрактограмма содержит пик при 11,8° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6, 19,3 и 26,7°; при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°.

Таблица 1

Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллической формы 2

Пик	Угол (2-тета °) +/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от пика с наибольшей интенсивностью)
1	11,8	100,0
2	18,6	71,4
3	19,3	45,5
4	26,7	41,9
5	20,6	27,3
6	9,0	19,0
7	24,8	18,5
8	22,4	15,5
9	31,9	14,3
10	10,6	11,2

Кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида является стабильной кристаллической формой при комнатной температуре и относительной влажности выше приблизительно 15%.

Пример получения 48.

Кристаллическая форма 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида.

В тигель для термогравиметрического анализа помещают N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамид и нагревают до приблизительно 170°C и выдерживают при 170°C в течение приблизительно 5 мин. Эту смесь охлаждают до комнатной температуры, в результате чего получают указанное в заголовке соединение.

Альтернативный пример получения кристаллической формы 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (121 мг) смешивают с ацетонитрилом (ACN) (5 мл) в сосуде и нагревают на плите смесителя, имеющей температуру 90°C. Приблизительно через 30 мин большая часть твердого вещества растворяется, в результате чего получается мутный раствор. Добавляют затравку формы 3 и перемешивают образец в течение приблизительно 1 ч при температуре приблизительно 90°C. Нагревание прекращают и перемешивают смесь с получением ярко-белого твердого вещества. Твердое вещество выделяют путем вакуумной фильтрации, сушат потоком воздуха в течение приблизительно 10 мин, а затем помещают в пониженном вакууме при приблизительно 80°C на приблизительно 8-12 ч, в результате чего получают указанное в заголовке соединение.

Полученный образец кристаллической формы 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2карбоксамида характеризуюется рентгеновской дифрактограммой, полученной использованием CuKa излучения, имеющей пики дифракции (значения 2-тета), описанные в табл. 2. В частности, дифрактограмма содержит пик при 15,7° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,1, 27,0 и 19,7°; при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°.

- 21 031330

Таблица 2

Пики порошковой рентгеновской дифракции кристаллической формы 3

Пик	Угол (2-тета °) +/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от пика с наибольшей
		интенсивностью)
1	15,7	100,0
2	18,1	98,5
3	27,0	80,2
4	19,7	75,4
5	25,3	75,2
6	18,7	50,0
7	17,3	49,7
8	5,2	44,0
9	10,4	41,7
10	11,9	37,7

Пример 1.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, толуолсульфоновая кислота

Кристаллическую форму 2 гидратированного N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида (149,15 мг) добавляют к этилацетату (2 мл). Образец перемешивают при 1000 об/мин при температуре 80°C. К перемешиваемому раствору добавляют п-толуолсульфоновую кислоту (70 мг, растворенную в этилацетате (1 мл)) и перемешивают его в течение ночи при 80°C с получением суспензии белого твердого вещества, которое выделяют путем вакуумной фильтрации, в результате чего получают указанное в заголовке соединение.

Альтернативный пример А получения N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, толуолсульфоновой кислоты.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (9,5 г, 19 ммоль) и n-толуолсульфоновую кислоту (3,80 г, 19,8 ммоль) добавляют к тетрагидрофурану (31 мл), воде (7,9 мл) и 2-пропанолу (8,6 мл). Этот раствор нагревают до 40°C. К теплому раствору в течение примерно 3 ч добавляют 2-пропанол (200,0 мл). В эту смесь через небольшое время после начала добавления 2-пропанола в качестве затравки вносят порцию указанного в заголовке соединения (500 мг, 0,75 ммоль). После завершения добавления растворителя смесь охлаждают до приблизительно 20°C в течение 1-3 ч. Эту смесь нагревают с приблизительно 20°C до приблизительно 55 °C в течение целевого периода 2 ч. Температуру поддерживают на уровне 55°C в течение 1 ч, а затем охлаждают до приблизительно 20°C в течение приблизительно 4 ч. Суспензию перемешивают в течение по меньшей мере 10 ч при температуре приблизительно 20°C. Суспензию фильтруют и промывают влажный остаток на фильтре водой (57 мл). Продукт сушат под вакуумом при 45°C в течение по меньшей мере 10 ч, в результате чего получают указанное в заголовке соединение (10,4 г, 81%). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением: (m/z): 500 (M+H).

Альтернативный пример В получения N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, толуолсульфоновой кислоты.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид в форме гидрата (20,7 г) суспендируют при 170 об/мин в смеси 60:40 ТГФЛ^ (85 мл) в трехгорлой круглодонной колбе объемом 500 мл, оборудованной барботером для азота, механическим приводом/мешалкой IKA®, соединенной со стеклянным валом с изогнутой тефлоновой лопастью и термопарой, соединенной с программируемым контроллером температуры J-KEM®. Моногидрат п-толуолсульфоновой кислоты (7,6 г, 1,03 экв.) растворяют в смеси 60:40 ТГФЛ^ (20 мл) и добавляют весь раствор одной порцией к перемешиваемой суспензии N-[3-[(4aR,7aS)2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]5-метоксипиразин-2-карбоксамида при 23°C, в результате чего практически немедленно образуется прозрачный красно-коричневый раствор. Затем скорость перемешивания увеличивают на 200 об/мин на 15 мин, добавляют к раствору воду (22 мл), после этого вносят в раствор затравку N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино

- 22 031330

6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида, толуолсульфоновой кислоты (количество затравки 750 мг, 3 мас.%), и затем перемешивают при 23°C ч течение еще 15 мин. Через 6 ч к суспензии добавляют воду (226 мл, общий объем растворителя 353 мл; или 13,6 об., до конечного соотношения растворителей 17,5:82,5 ТГФ:11₂O, после чего суспензию перемешивают в течение ночи (22 ч) при 23°C. Суспензию фильтруют с использованием вакуума, промывают смесью 15:85 ТГФ:H2O (2x20 мл), затем оставляют под вакуумом на 20 мин, вручную прессуя влажный осадок, чтобы закрывать образующиеся трещины. Влажные твердые вещества сушат при 40°C под вакуумом в течение приблизительно 72 ч, в результате чего получают указанное в заголовке соединение в виде белого кристаллического твердого вещества (24,07 г, 90,0 мас.%).

Кристаллический N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, толуолсульфоновая кислота, характеризуется рентгеновской дифрактограммой, полученной использованием CuKa излучения, имеющей пики дифракции (значения 2-тета), описанные в табл. 3, и, в частности, имеющей пики при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°, при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°.

Таблица 3

Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического соединения примера X1

Пик	Угол (2-тета°), /- 0,2°	относительная интенсивность (% от пика с наибольшей интенсивностью)
1	5,0	100,0
2	13,4	22,9
3	13,8	37,3
4	14,4	20,2
5	15,3	28,8
6	17,5	25,9
7	18,5	30,7
8	19,6	45,8
9	20,4	17,7
10	25,6	30,1

Было обнаружено, что при относительной влажности ниже приблизительно 15% присутствует кристаллическая форма 1 свободного основания N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)4a,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4H)-ил]-4-фторфенил}-5-метоксипиразин-2карбоксамида, а при относительной влажности выше приблизительно 15% преобладает кристаллическая форма 2 N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4a,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-7а(4H)-ил]-4-фторфенил }-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Такая физическая нестабильность нежелательна, особенно для фармацевтического лекарственного вещества или лекарственного продукта, поскольку и то и другое является объектом нормативного регулирования в отношении твердых форм. В отличие от кристаллических форм свободного состояния, тозилатная соль обладает улучшенной стабильностью в широком диапазоне значений относительной влажности (5-95%). Соответственно, тозилатная соль N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4a,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-7а(4H)-ил]-4-фторфенил}-5-метоксипиразин-2-карбоксамида практически не подвержена зависящим от влажности фазовым превращениям, присущим соответствующим формам свободного основания. Кроме того, было обнаружено, что тозилатная соль N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4a,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4H)-ил]-4-фторфенил}-5метоксипиразин-2-карбоксамида содержит существенно меньше остаточного растворителя в кристаллах: приблизительно 1,3% по сравнению с 7,7% остаточного растворителя в соли N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6(5-фторпиримидин-2-ил)-4a,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4H)-ил]-4-фторфенил}-5метоксипиразин-2-карбоксамида с HCl. Повышенная склонность свободного основания претерпевать фазовые переходы в ходе продолжительного хранения может обуславливать изменения свойств, таких как растворимость или скорость растворения, что может отрицательно сказываться на качестве лекарственного продукта. Также она обуславливает дополнительный риск разрушения кристаллической структуры (структур) до аморфной формы или накопления дефектов и неупорядоченности, что может привести к химической нестабильности и уменьшению срока хранения лекарственного продукта.

Процедуры in vitro исследования.

Для ферментативных и клеточных in vitro тестов готовят препараты исследуемых соединений в ДМСО таким образом, чтобы получить 10 мМ исходный раствор. Затем готовят серийные разведения этого стокового раствора в ДМСО с получением кривой разведения из десяти точек, соответствующих конечным концентрациям соединения в диапазоне от 10 мМ до 0,05 нМ в 96-луночном круглодонном планшете, после чего проводят основанные на in vitro тесты с применением ферментов и цельных клеток.

Исследования ингибирования протеазы in vitro.

- 23 031330

Экспрессия человеческой BACE1.

Человеческую BACE1 (номер доступа: AF190725) клонируют из тотальной кДНК головного мозга методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR). Нуклеотидные последовательности, соответствующие аминокислотным последовательностям №1- 460 встраивают в кДНК, кодирующую человеческий полипептид IgG₁ (Fc) (Vasser с соавт., Science, 286, 735-741 (1999)). Этот слитый белок человеческой BACE1(1-460) и человеческого Fc, названный huBACE1:Fc, встраивают в вектор pJB02. Слитый белок человеческая BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc) временно экспрессируется в клетках HEK293. 250 мкг кДНК каждого конструкта смешивают с реагентом Fugene 6 и добавляют к 1 литру HEK293. Через четыре дня после трансфекции кондиционированную среду собирают для очистки.

Очистка huBACE1 :Fc.

huBACE1:Fc очищают путем хроматографии с белком А. Фермент хранят при -80°C в маленьких аликвотах.

Анализ BACE1 методом резонансного переноса энергии флюоресценции (FRET).

Готовят серийные разведения исследуемых соединений как описано выше. Затем соединения разбавляют 20х в калий-фосфатном буфере (KH₂PO₄). По 10 мкл каждого разведения добавляют в каждую лунку ряда от А до Н соответствующего черного планшета с низким связыванием белков, содержащего реакционную смесь (25 мкм 50 мМ KH₂PO₄, pH 4,6, 1 мМ TRITON® Х-100, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 15 мкм субстрата) (см. Yang, с соавт., J. Neurochemistry, 91(6), 1249-59 (2004)). Содержимое хорошо перемешивают на планшетном шейкере в течение 10 мин. В планшет, содержащий субстрат и исследуемые соединения, добавляют 15 мкл 200 пМ слитого белка человеческая BACE1(1460):Fc (см. Vasser с соавт., Science, 286, 735-741 (1999)) в KH₂PO₄ буфере, чтобы инициировать реакцию. Регистрируют значение RFU (относительных единиц флуоресценции) смеси в момент времени 0 при длине волны возбуждения 355 460 нм после непродолжительного перемешивания на планшетном шейкере. Планшет с реакционной смесью накрывают алюминиевой фольгой и держат в темной печи с увлажнением при комнатной температуре в течение от 16 до 24 ч. Регистрируют значение RFU в конце инкубации с теми же настройками возбуждения и испускания, которые использовали в момент 0. Разница в значениях RFU в момент времени 0 и в конце инкубации представляет активность BACE1 при обработке соединением. Строят график разницы RFU от концентрации ингибитора и аппроксимируют кривую с использованием четырехпараметрического логистического уравнения, в результате чего получают значения EC₅₀ и IC₅₀. (см. Sinha, с соавт., Nature, 402, 537-540 (2000)).

Соединение из примера получения 46 исследуют по существу как описано выше и оно демонстрирует значение IC₅₀ в отношении BACE1, равное 0,615 нМ (± 0,101, n=5) [Среднее, SEM; SEM = стандартная ошибка среднего]. Эти результаты демонстрируют, что соединение из примера получения 46 ингибирует активность очищенного рекомбинантного фермента t BACE1 in vitro.

Тест с первичными нейронами PDAPP.

Также в целях проверки проводят анализ на цельных клетках с использованием культур первичных нейронов, полученных из эмбрионов трансгенных мышей PDAPP. Первичные нейроны коры получают из эмбрионов PDAPP на 16 день развития и культивируют в 96-луночных планшетах (15х10⁴ клеток/лунку в DMEM/F12 (1:1) плюс 10% ФБС). Через 2 дня in vitro культуральную среду заменяют на бессывороточную среду DMEM/F12 (1:1), содержащую добавку В27 и 2 мкМ (конечное содержание) Ara-C (Sigma, C1768). В день 5 в условиях in vitro нейроны инкубируют при 37°C в течение 24 ч в присутствии/в отсутствие ингибиторов (разбавленных в ДМСО) при желаемых концентрациях. В конце инкубации исследуют кондиционированную среду на следы активности бета-секретазы, например, путем исследования пептидов АР. Измеряют общее содержание пептидов АР (1х АР) методом твердофазного ИФА (ELISA, модификация сэндвич), с использованием моноклонального антитела 266 в качестве иммобилизирующего антитела и биотинилированного 3D6 в качестве репортерного антитела. В альтернативном варианте измеряют пептиды, АР 1-40 и АР 1-42 методом твердофазного ИФА (ELISA, модификация сэндвич) с использованием 2G3 в качестве иммобилизирующего антитела для АР 1-40 и моноклонального 21F12 в качестве иммобилизирующего антитела для АР 1-42. В обоих ИФА-анализах: и на АР 1-40, и на АР 1-42, в качестве репортерного антитела применяют биотинилированное 3D6. Концентрация АР, высвобождаемого в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности BACE1 в таких условиях. Строят 10-точечную кривую ингибирования и аппроксимируют с использованием четырехпараметрического логистического уравнения, после чего определяют значения EC₅₀ и IC₅₀ для эффекта снижения уровня АР. Соединение из примера получения 46 исследуют по существу, как описано выше, и оно демонстрирует следующую активность для эффекта снижения уровня АР.

- 24 031330

Таблица 4

Пример получения	IC50 (нМ) в отношении Абета (140) нейронов, определенная методом твердофазного ИФА	IC50 (нМ) в отношении Абета (1-42) нейронов, определенная методом твердофазного ИФА
46	0,275 (± 0,176, п=4)	0,228 (± 0,244, п=3)

Среднее ± SEM;

SEM = стандартная ошибка среднего.

Эти данные показывают, что соединение из примера получения 46 ингибирует образование бетаамилоида в цельных клетках.

Ингибирование бета-секретазы in vivo.

Несколько животных моделей, включая мышей, морских свинок, собак и обезьян, можно применять для скрининга ингибирования активности бета-секретазы in vivo после введения соединения. Животные, применяемые в этом изобретении, могут являться животными дикого типа, трансгенными животными или животными с нокаутом генов. Например, модельных мышей PDAPP, подготовленную как описано у Games с соавт., Nature 373, 523-527 (1995), и другие нетрансгенные животные или животные с нокаутом генов, можно применять для исследования ингибирования образования Аβ и sAPPβ in vivo в присутствии ингибирующих соединений. Обычно мышам PDAPP в возрасте от 2 до 12, животным с нокаутом генов или нетрансгенным животным вводят соединения, представленные в носителях, таких как кукурузное масло, циклодекстран, фосфатные буферы, PHARMASOLVE® или другие подходящие носители. Через 1-24 ч после введения животных умерщвляют и извлекают головной мозг, а также плазму и цереброспинальную жидкость для анализа Аβ-пептидов, фрагментов sAPP и С99 (см. May, с соавт., Journal of Neuroscience, 31. 16507-16516 (2011)).

Для стандартных фармакологических исследований in vivo животным вводят различные концентрации соединения и сравнивают с контрольной группой, получавшей нейтральную среду одновременно с группой исследования. Для некоторых продолжительных исследований у выбранных животных берут образцы ткани мозга, плазмы или цереброспинальной жидкости, начиная с момента 0, используемого для определения базового уровня. Другим группам вводят соединение или соответствующую нейтральную среду и умерщвляют животных в различные моменты времени после введения. У выбранных животных берут ткань головного мозга, плазму или цереброспинальную жидкость и исследуют их на присутствие продуктов расщепления белка-предшественника бета-амилоида (АРР), включая бета-амилоидные пептиды, sAPPβ и другие фрагменты АРР, например, с использованием специфичных твердофазных иммуноферментных анализов в модификации сэндвич. В конце периода исследования животных умерщвляют и исследуют ткани мозга, плазму крови или цереброспинальную жидкость на присутствие бетаамилоидных пептидов С99 и sAPPβ, в зависимости от того, что исследуют. Также можно исследовать количество бета-амилоидных бляшек в тканях мозга животных с трансгеном после лечения соединением. 1-х бета-амилоидный пептид в настоящем документе относится к совокупности вариантов бетаамилоида, которые начинаются с остатка 1 и заканчиваются С-концом на остатке с номером больше 28. Это определение включает большинство вариантов амилоида-бета и часто называется общим бетаамилоидом.

Животные (трансгенные, несущие ген PDAPP или другой ген АРР, или нетрансгенные мыши), которым вводят ингибирующее соединение, могут продемонстрировать снижение Аβ или sAPPβ в тканях головного мозга, плазме или цереброспинальной жидкости и уменьшение бета-амилоидных бляшек в ткани мозга, по сравнению с контролями, получавшими нейтральную среду или контролями в момент времени ноль. В случае соединения из примера получения 46 через три часа после перорального введения соединения в дозе 0,3, 1 или 3 мг/кг уровни 1-го Аβ пептида снижаются приблизительно на 31, 39 и 61% в гиппокампе головного мозга и приблизительно на 28, 42 и 64% в коре головного мозга, соответственно, по сравнению с мышами, получавшими нейтральный носитель.

На основании активности соединения из примера получения 46 в отношении BACE in vitro эти эффекты по снижению бета-амилоида согласуются с ингибированием BACE in vivo и дополнительно демонстрируют проникновение N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида в ЦНС.

- 25 031330

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, представляющее собой тозилатную соль N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5- фторпиримидин-2-ил)-4,4a,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][ 1,3]тиазин-7a-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида.
2. 2. Тозилатная соль по п.1, которая является кристаллической.
3. 3. Тозилатная соль по любому из пп.1 или 2, которая характеризуется основным пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 2-тета, равном 5,0°, в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 19,6, 13,8 и 18,5°, при погрешности для углов дифракции, составляющей 0,2°.
4. 4. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
5. 5. Способ лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
6. 6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для лечения болезни Альцгеймера.
7. 7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для лечения прогрессирования умеренных когнитивных нарушений в болезнь Альцгеймера.
8. 8. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая соединение по любому из пп.1-3 с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.