CN107108657B

CN107108657B - 一种化合物的甲苯磺酸盐

Info

Publication number: CN107108657B
Application number: CN201680005234.2A
Authority: CN
Inventors: D.A.科茨; C.D.沃尔芬格尔
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: RS59730B1; MX2017009713A; DK3250575T3; US20170368071A1; EP3250575B1; ZA201703937B; CL2017001899A1; JP2019142902A; SG11201706038PA; SI3250575T1; EP3250575A1; ECSP17048768A; CA2969475C; GT201700166A; SV2017005478A; HUE048029T2; TN2017000332A1; ES2768782T3; IL252754A0; PH12017501356A1

Abstract

本发明提供了N‑[3‑[(4aR,7aS)‑2‑氨基‑6‑(5‑氟嘧啶‑2‑基)‑4,4a,5,7‑四氢吡咯并[3,4‑d][1,3]噻嗪‑7a‑基]‑4‑氟‑苯基]‑5‑甲氧基‑吡嗪‑2‑甲酰胺的甲苯磺酸盐。

Description

一种化合物的甲苯磺酸盐

本发明涉及N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐、含有所述甲苯磺酸盐的药物组合物、使用所述甲苯磺酸盐来治疗生理病症的方法以及合成它所使用的中间体和方法。

本发明是治疗与淀粉样β(Abeta)肽（淀粉样前体蛋白(APP)的神经毒性和高度聚集性肽片段）有关的阿尔茨海默氏病及其它疾病和病症的领域。阿尔茨海默氏病是在世界范围内影响数百万患者的毁灭性神经变性病症。由于目前批准的上市药剂对于患者只有暂时的症状性益处，所以，在阿尔茨海默氏病的治疗方面，还存在显著的未满足的需要。

阿尔茨海默氏病的特点在于：在脑中形成、聚集和沉积Abeta。在小鼠模型中，已经显示，完全或部分抑制β-分泌酶(β位点淀粉样前体蛋白裂解酶；BACE)对于斑块相关的和斑块依赖性病变具有显著效果，表明即使Abeta肽水平降低很少，也可以使斑块负荷以及突触缺陷的长期明显减少，由此提供显著的治疗益处，尤其是在阿尔茨海默氏病的治疗中。

美国专利No. 8,841,293公开了用于治疗Abeta肽介导的病症（例如，阿尔茨海默氏病）的某些BACE抑制剂，尤其是，例如，公开了BACE抑制剂N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺以及相应的盐酸盐。

需要的是N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的新的形式，它提供了改进的固态稳定性和化学稳定性，以在药物制剂的制备和生产过程中提高可利用性。相应地，本发明提供了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。另外，本发明提供了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，其是晶体。本发明进一步提供了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，其特征在于：在X射线衍射谱中，在5.0°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自19.6°、13.8°和18.5°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

本发明还提供了治疗患者的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。本发明进一步提供了治疗患者的轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。本发明还提供了抑制患者的BACE的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。本发明还提供了抑制BACE介导的淀粉样前体蛋白断裂的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。本发明进一步提供了抑制产生Abeta肽的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。

此外，本发明提供了用于治疗，尤其是用于治疗阿尔茨海默氏病，或治疗轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐。进一步的，本发明提供了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗阿尔茨海默氏病，或用于治疗轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展。

另外，本发明提供了治疗患者的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者治疗有效量的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，其特点在于：在X射线衍射谱中，在5.0°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自19.6°、13.8°和18.5°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。本发明还提供了用于治疗、尤其是用于治疗阿尔茨海默氏病、或治疗轻微认知损害发展为阿尔茨海默氏病的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，其特点在于：在X射线衍射谱中，在5.0°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自19.6°、13.8°和18.5°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。进一步的，本发明提供了用于制备药物的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，其特点在于：在X射线衍射谱中，在5.0°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自19.6°、13.8°和18.5°的峰，衍射角的容许误差为0.2度，所述药物用于治疗阿尔茨海默氏病，或用于治疗轻微认知损害发展为阿尔茨海默氏病。

本发明进一步提供了药物组合物，其含有N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，以及一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。本发明还包括合成N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐的新的中间体和方法。

轻微认知损害定义为：基于临床表现并基于患者显示出随着时间推移由轻微认知损害向阿尔茨海默氏痴呆的进展，与阿尔茨海默氏病相关的痴呆的潜在初期阶段(Morris等人，Arch. Neurol., 58, 397-405(2001); Petersen等人，Arch. Neurol., 56, 303-308(1999))。术语“治疗轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展”包括减缓、抑制或逆转患者的轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展。

本文使用的术语“治疗”包括限制、减缓、终止或逆转所存在的症状或病症的发展或严重程度。

本文使用的术语“患者”是指人。

术语“抑制Abeta肽的产生”是指降低患者的Abeta肽的体内水平。

本文使用的术语“有效量”是指本发明化合物或其可药用盐的数量或剂量，当给予患者单或多剂量时，这种数量或剂量能够为诊断或治疗中的患者提供预期效果。

作为本领域技术人员，主治诊断医生通过利用已知的技术，并且观察在类似情况下所获得的结果，可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量的过程中，主治诊断医生会考虑大量因素，包括但不限于∶患者的种类；它的体量、年龄和常规健康情况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度、或复杂或严重程度；个体患者的响应；给予的具体化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；伴随药物的使用；及其它相关的情况。

本发明的化合物通常在很宽的剂量范围内是有效的。例如，日剂量通常在大约0.01至大约20 mg/kg体重范围内。在有些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是更合适的，而在其它情况下，在副作用可接受的条件下，可以使用更大的剂量，因此，上述剂量范围不是打算以任何方式限制本发明的范围。

优选，将本发明的化合物配制为药物组合物，通过能够产生化合物生物利用率的任何途径给予，包括口服、透皮和肠胃外途径。最优选，口服或透皮给予这种组合物，尤其优选口服。这种药物组合物和其制备方法在本领域是众所周知的。(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(D.B. Troy, Editor, 21st Edition,Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。

在本发明的治疗方法中，尤其使用N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，但优选某些形式。下列段落描述这种形式。可以理解，这些优选形式适用于本发明的药物组合物、治疗方法和新的化合物。

尤其优选，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶体甲苯磺酸盐，其特征在于：在X射线衍射谱中，在5.0°的衍射角2θ处存在实质的峰，还具有一个或多个选自19.6°、13.8°和18.5°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

本领域普通技术人员可以理解，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺可以存在互变异构形式，如反应路线A所述。当本申请给出N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的任何一个具体互变异构体时，应当理解其包括这两种互变异构形式和其所有的混合物。

反应路线A

。

另外，下面反应路线所描述的某些中间体可以包含一个或多个氮保护基。可变的保护基在每次出现时可以相同或不同，这取决于具体反应条件和所进行的具体转化。技术人员熟知保护和脱保护条件，并且在文献中进行了描述(参见，例如，“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Fourth Edition, by Peter G.M. Wutsand Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。

为了清楚起见，未指明某些立体化学核心，并且下列反应路线删除了某些取代基，但并没有以任何方式限制反应路线内容的意思。此外，在利用(例如)选择结晶技术或手性色谱方法合成本发明化合物的过程中，在任何方便的点，本领域普通技术人员可以分离或拆分单一异构体、对映体和非对映体(参见，例如，J. Jacques等人，"Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Elieland S.H. Wilen,” Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience,1994)。名称“异构体1”和“异构体2”是指分别从手性色谱中第一个和第二个洗脱的化合物，如果在合成的早期开始手性色谱，则同样的名称用于随后的中间体和实施例。

某些缩写定义如下∶ “乙腈”是指ACN；“APP”是指淀粉样前体蛋白；“CSF”是指脑脊液；“DCM”是指二氯甲烷；“DIPEA”是指二异丙基乙胺、N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺或N,N-二异丙基乙胺；“DMEM”是指Dulbecco's改进的Eagle's培养基；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐； “ee”是指对映体过量；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Ex”是指实施例；“F12”是指Ham's F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“FRET”是指荧光共振能量转移；“HEK”是指人胚肾；“HOAc”是指乙酸；“HOBt”是指1-羟基苯并三唑水合物；“HPLC”是指高效液相色谱；“IC₅₀”是指产生药剂可能的最大抑制响应的50%时的药剂浓度；“min”是指分钟；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“PDAPP”是指血小板衍生的淀粉样前体蛋白；“Prep”是指制备；“RFU”是指相对荧光单位；“SCX”是指强阳离子交换；“R_t”是指保留时间；和“THF”是指四氢呋喃。

本领域普通技术人员可以理解，术语“甲苯磺酸盐”、“甲苯磺酸”、“对甲苯磺酸”和“4-甲苯磺酸”指的是下列结构的化合物∶

。

因此，本领域普通技术人员可以理解，本文中，下列名称中的任何一个名称∶

“N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐”；

“N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；甲苯磺酸”；

“N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；对甲苯磺酸”；和

“N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；4-甲苯磺酸”；是指下列结构的盐∶

。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐可以利用本领域已知的各种方法制备，在下面制备例和实施例中举例说明了其中一些方法。另外，本领域普通技术人员可以制备N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺游离碱和相应的HCl盐，如美国专利8,841,293所述。所描述的每个途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或与来自不同制备方法的步骤相结合，制备本发明的化合物。可以使用本领域众所周知的常规方法，回收每个步骤的产物，包括提取、蒸发、沉淀、层析、过滤、研磨或结晶。对本领域普通技术人员来说，试剂和起始原料很容易得到。

制备例1

2-溴-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮

在35℃，将N-溴代琥珀酰亚胺(984g，5.53mol)逐份加入到1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(1000 g，4.6mol)和对甲苯磺酸(1315 g，7.64mol)的DCM(7 L)溶液中。搅拌该混合物，并加热到40℃，保持4小时。将该混合物冷却至24℃，并加入7% NaHCO₃(5 L)。分离各层，并用10% Na₂SO₃(5 L)和水(5 L)洗涤有机层。将有机层浓缩至1/2-1/3体积，得到标题化合物，其不经进一步纯化而使用。

另一个制备例1

将1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(80 g，0.37 mol)溶于DCM(800 mL)中，并冷却至10℃。用5小时慢慢地加入溴(63 g，0.39 mol)。30分钟之后，再加入溴(3.5 g，0.06mol)。30分钟之后，将该混合物升温至室温，并用NaCl水溶液(500 mL)和NaHCO₃水溶液(400 mL)的混合物洗涤有机层。将有机层依次用NaHCO₃水溶液(400 mL)、NaHSO₃水溶液(2×400 mL)和NaCl水溶液洗涤。干燥(Na₂SO₄)有机层并浓缩得到残余物。将残余物溶于DCM(100 mL)和石油醚(500 mL)的混合物中。将该溶液冷却至-50℃下0.5小时，过滤收集固体，得到标题化合物(84 g，77%)。¹H NMR(CDCl₃)δ 4.46(d, 2H), 7.07(dd, 1H), 7.66(m, 1H), 8.02(dd,1H)。

制备例2

2-[烯丙基(苄基)氨基]-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮

在室温下，将2-溴-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(25.1 g，84.8 mmol)加入到N-苄基丙-2-烯-1-胺(15.0 g，102 mmol)的甲苯(200 mL)和DIPEA(59 mL，338 mmol)溶液中。在室温下，通过搅拌，将该混合物除氧10分钟，同时，在液面下向该混合物中鼓入氮气。将该反应加热至40℃，搅拌2.5小时，而后再加入N-苄基丙-2-烯-1-胺(2.0 g，13.6 mmol)。将该反应在40℃下搅拌4.5小时，而后冷却至室温。得到的物质不用进一步纯化，直接使用。使用下列参数，通过HPLC分析溶液中的标题化合物∶LC柱∶Waters Acquity超高效液相色谱(UPLC^®)，C 82.1×100 mm，1.7µm；流动相A∶0.1%(vol/vol)TFA/水+ 0.2% ACN(vol/vol)，通过向水(4 L)中加入TFA(4 mL)和ACN(10 mL)来制备，流动相B∶0.1% TFA/ACN，通过向ACN(4 L)中加入TFA(4 mL)来制备。梯度∶%A=95%至53.1%，10分钟，流速：0.85 mL/分钟，柱温∶45℃。R_t=6.43分钟(UV)。

制备例3

5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑

向2-溴-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(1363 g，4.61 mol)的甲苯(10 L)溶液中加入二烯丙基胺(537 g，5.53 mol)和DIPEA(2381 g，18.42 mol)。在40℃，将该混合物搅拌4小时，得到1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮，没有将其分离。将N-(4-甲氧基苄基)羟胺(847g，5.53mol)和异丙醇钛(IV)(1965 g，6.91 mol)加入到含有粗品1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮的混合物中。将该混合物在90℃下搅拌2小时。将该混合物冷却至20℃，并加入50%柠檬酸一水合物(4 L)和饱和Na₂CO₃(4 L)。分离各层，并将水溶液用MTBE(5 L)提取。用水(5 L)洗涤有机提取物，通过硅藻土过滤，并浓缩至干。将EtOAc(10L)和草酸(580g)加入到残余物中，滤出固体，并加入到1N NaOH(13 L)中。加入MTBE(5 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。分离各层，并将有机层浓缩至1/2体积。加入庚烷(3 L)，并将该溶液冷却至10℃。将得到的固体滤出，得到标题化合物(1330 g，64%)。¹H NMR(400MHz, CDCl₃)δ2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H),3.78-3.41(m, 6H),4.01(m, 1H),5.24-5.01(m, 2H),5.89-5.85(m, 1H),6.82-6.80(m, 2H),7.51-7.13(m, 3H),7.63-7.62(m, 1H),7.65-7.64(m, 1H)。

制备例4

相对-(3aR,6aS)-5-苄基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑，草酸

在40℃，将N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羟胺(15.5 g，101 mmol)加入到2-[烯丙基(苄基)氨基]-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮溶液中，而后加入异丙醇钛(IV)(50.3 mL，169mmol)。向该系统中鼓入氮气5分钟，将该混合物除氧。在搅拌下，将该混合物加热至90℃，保持2小时。将该反应混合物用柠檬酸(36 g，186 mmol)的水(36 g)溶液洗涤，并在室温下搅拌30分钟。加入碳酸钠(100 g，939 mmol)饱和水溶液，并将pH值调节至大约9。根据需要将该混合物用水和甲苯稀释，并分离各层。将甲苯层用以水(200 mL)稀释的HCl水溶液(5.1mL的5N HCl)洗涤，而后用水(200 mL)洗涤。浓缩甲苯层，得到稠油。将该油溶于EtOAc(375mL)中，并在室温下，在搅拌下，逐滴加入溶于EtOAc(375 mL)中的草酸(15.4 g，169 mmol)溶液。将该混合物在室温下搅拌2天，过滤，并将产物滤饼用EtOAc(250 mL)洗涤。在40℃，真空干燥固体过夜，得到标题化合物的顺式外消旋混合物(41.7 g，84%)。ES/MS(m/z): 498(M+H)。

制备例5

相对N-[3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]-2,2,2-三氟-乙酰胺

将相对-(3aR,6aS)-5-苄基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑，草酸(23.6 g，40.2 mmol)加入到DCM(400 mL)和5NNaOH水溶液(200 mL)的混合物中。搅拌该混合物10分钟，而后分离各层。浓缩有机层，得到相对-(3aR,6aS)-5-苄基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑(20.0 g，40.2 mmol)。将该物质加入到二甲亚砜(360 mL)、2,2,2-三氟乙酰胺(7.8 g，68 mmol)、碘化钠(10.3 g，68.6 mmol)、碳酸钾(9.54 g，68.3 mmol)、(1R,2R)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(4.7 g，32 mmol)和碘化亚铜(1.53 g，8.03 mmol)中。向该系统中鼓入氮气10分钟，将该混合物除氧。将该混合物加热至115℃，搅拌5.5小时，并冷却至室温。加入EtOAc(250 mL)和水(200 mL)，并将得到的混合物搅拌10-15分钟。分离各层，并将水层用EtOAc(200 ml)反萃取。将合并的有机层用20 wt%氯化铵水溶液(100 mL)洗涤，而后用20 wt%氯化锂水溶液(100 mL)和水(100 mL)洗涤。用硫酸镁干燥有机层，过滤，浓缩至干，得到粗品标题化合物的外消旋的顺式混合物(23.6 g，111%)。ES/MS(m/z):530(M+H)。

制备例6

相对-3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-6a-基]-4-氟-苯胺

将相对N-[3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]-2,2,2-三氟-乙酰胺(21.0 g，39.7 mmol)加入到甲醇(250 mL)、5N NaOH水溶液(105 mL)和乙醇(105 mL)中，并将得到的混合物加热至50℃，保持2小时。在35-40℃，减压浓缩该反应混合物，除去甲醇和乙醇。将该物质溶于MTBE(320mL)和水(300 mL)的混合物中。分离各层，用水(100 mL)洗涤有机层，而后用水(400 mL)和12N HCl水溶液(3.5 mL)的混合物洗涤。将水层加入到MTBE(400 mL)、水(100 mL)和5NNaOH水溶液(25 mL)的混合物中，并分离各层。用MTBE(100 mL)洗涤水层。合并有机层，用硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物的外消旋的顺式混合物(9.8 g，57%)。ES/MS(m/z): 435(M+H)。

制备例7

相对-N-3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]乙酰胺

将相对-3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-6a-基]-4-氟-苯胺(9.4 g，22 mmol)加入到DCM(110 mL)、4-二甲基氨基吡啶(0.08 g，0.65 mmol)和三乙胺(6.1 mL，43 mmol)中，并将该反应冷却至0℃。将乙酸酐(3.4 g，33 mmol)逐滴加入到该溶液中。将该反应升温至室温，并搅拌2小时。将水(140 mL)加入到该反应中，并将该混合物在室温下搅拌10分钟。分离各层，并将水层用DCM(100 ml)洗涤。用硫酸镁干燥合并的有机层，过滤，浓缩，得到标题化合物的外消旋的顺式混合物(10.1 g，100%)。ES/MS(m/z): 477(M+H)。

制备例8

5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑盐酸盐

将TFA(4 L，52.9 mol)逐滴加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑(1990 g，4.45 mol)的DCM(12 L)溶液中，加入速度应该使温度低于35℃。加入完成之后，将该混合物升温至33-43℃，并搅拌6小时。加入NaOH(20%，10 L)，加入速度应保持温度低于35℃。分离各层，并将有机层用水(6 L)洗涤。浓缩该溶液，加入乙醇(16 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。浓缩滤液，并加入EtOAc(10 L)。加入4M HCl的EtOAc(8 L)溶液，并滤出所得到的固体，干燥，得到标题化合物(1385 g，85.6%)。ES/MS(m/z):327.1(M+H)。

制备例9

[1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

将饱和碳酸钠水溶液加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑盐酸盐(1400g，3.85 mol)的DCM(7 L)溶液中，达到pH>9。分离各层，并将有机提取物浓缩至2/3体积。加入HOAc(1.38 L)，并将该溶液浓缩至2 L。加入HOAc(7 L)和锌粉(2.5 kg，38.5 mol)，将该混合物加热至40-50℃，并搅拌3小时。加入EtOAc(9.8 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。将滤饼用EtOAc(4 L)洗涤。分离滤液，并将水(7L)加入到合并的有机物中。加入氢氧化铵，达到pH≥9。分离各层，并将有机层浓缩至2 L。加入乙醇(2.8 L)，并将该溶液浓缩至2 L。加入乙醇(19 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤，得到标题化合物的乙醇溶液，其不经进一步纯化而使用。

制备例10

[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐

将二-对甲苯酰-L-酒石酸一水合物(1.04 kg，2.69 mol)加入到[1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(1264 g，3.85 mmol)的乙醇(21 L)溶液中。将该混合物加热至65-75℃，并搅拌3小时。将该混合物冷却至5-10℃，加入[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐(1.0 g)的晶种，并将该混合物搅拌3小时。滤出固体，并将滤饼用冷乙醇(1.4 L)洗涤。干燥滤饼，得到标题化合物，为白色固体。第二个洗脱的异构体的手性分析∶色谱柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 270 nm证明了对映体富集(99% ee)的对映体，R_t=7.4分钟(1050g，38%)。¹H NMR(400 MHz, CD₃OD)δ2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m,1H),3.57-3.31(m, 3H),3.66-3.58(m, 4H),3.75-3.74(m, 2H),5.38-5.36(m, 1H),5.50-5.46(m, 1H),5.88(s, 2H),5.97-5.91(m, 1H),7.10-7.05(m, 1H),7.29(d, J=8.0 Hz,4H),7.53-7.51(m, 1H),7.80-7.78(m, 1H),8.01(d, J=8.0 Hz, 4H)。

制备例11

相对-1-[3-[(3S,4R)-3-氨基-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]-4-氟-苯基]丙-2-酮，二甲苯磺酸

将相对-N-3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]乙酰胺(5.0 g，11.0 mmol)加入到水(75 mL)、10%碳载钯(2.5 g，23 mmol)、对甲苯磺酸(5.0 g，26 mmol)和乙醇(75 mL)中，并将该混合物在50psi氢气氛围中、在室温下氢化20小时。通过硅藻土过滤该混合物，并将垫用乙醇(100 mL)洗涤，而后用DCM(100 mL)洗涤。浓缩滤液，以定量的粗品产率得到标题化合物的外消旋的顺式混合物(8.1 g，>100%)。该物质不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/z): 268(M+H)。

制备例12

((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯烷-3-基)甲醇

将1N HCl(500 ml，500 mmol)加入到0℃的[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐(100 g，139.4 mmol)的EtOAc(500 ml)溶液中。将该混合物搅拌1小时。分离水层，并用1N NaOH将pH值调节至8。将水层用EtOAc(350 ml×2)提取。合并有机层，用水(500ml)洗涤，浓缩，得到标题化合物(40g，87%)。第二个洗脱的异构体的手性分析∶色谱柱∶ICChiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 270 nm证明了对映体富集(99.7% ee)的对映体，R_t=7.4分钟。¹HNMR(400 MHz, CDCl₃)δ2.78-2.70(m, 5H),3.16-3.00(m, 3H),3.87-3.75(m, 1H),3.90-3.84(m, 1H),5.24-5.11(m, 2H),5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H),7.35-7.32(m,1H),7.67-7.65(m, 1H)。

制备例13

相对-N-[3-[(3S,4R)-3-氨基-1-(5-氟嘧啶-2-基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]-4-氟-苯基]乙酰胺

将相对-1-[3-[(3S,4R)-3-氨基-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]-4-氟-苯基]丙-2-酮，二甲苯磺酸(7.5克，12.3 mmol)加入到ACN(75 mL)中。加入2-氯-5-氟嘧啶(2.44 g，18.4mmol)和DIPEA(7.5 mL，43 mmol)，并将该混合物加热至70℃，保持20小时。将该混合物冷却至室温，并浓缩。加入水(50 mL)，将该混合物搅拌1小时成浆状。过滤该混合物，在室温下真空干燥，得到标题化合物的外消旋的顺式混合物(3.0 g)。用氯仿(3×20 mL)提取残留的水溶液，用硫酸钠干燥，浓缩至干，真空干燥，得到额外的标题化合物(1.8 g)，总的粗品产率(4.8 g，110%)。ES/MS(m/z): 364(M+H)。

制备例14

N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺

将苯甲酰异硫氰酸酯(15.0 g，91.9 mmol)加入到0℃的((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(30 g，91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。将该溶液升温至25℃，并搅拌1小时，得到标题化合物的THF溶液，其不用进一步纯化，直接使用。

制备例15

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺，二盐酸盐

将三苯基膦(36.8 g，140.3 mmol)加入到N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。加入THF(100 ml)中的偶氮二甲酸二叔丁基酯(31.6 g，137.2 mmol)。将该混合物在20-30℃下搅拌2小时。浓缩该混合物，并加入MTBE(400 ml)。通过硅藻土过滤该溶液，并将滤饼用MTBE(130 ml)洗涤。将滤液合并，并加入在EtOAc(200 ml)中的1N HCl。将该混合物搅拌2小时，而后浓缩至500 ml。加入MTBE(320 ml)，并过滤该溶液，并用庚烷(130 ml)洗涤。使固体在EtOAc(650 ml)中形成浆液，并在50-60℃下搅拌2小时。将热浆液过滤，并将固体用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗涤。使固体在EtOAc(650 ml)中再形成浆液，并在50-60℃下搅拌2小时。将热浆液过滤，并用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗涤。将固体干燥，得到标题化合物的二-HCl盐(40 g，80%，99.5% ee)。第一个洗脱的异构体的手性分析∶色谱柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶85%己烷(0.1%二乙胺)∶15%异丙醇(0.1%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 282 nm证明了对映体富集(99.5% ee)的对映体，R_t=12.5分钟。

制备例16

N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-[2-氟-5-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]苯基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将15%碳酸钠(440 ml)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二盐酸盐(495 g，717.88 mmol)的EtOAc(3 L)和水(784 ml)溶液中。将该混合物搅拌1-2小时。分离各层，通过硅胶(40 g)过滤有机层，并用EtOAc(600 ml)洗涤。将滤液浓缩至干，得到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺。将三氟乙酰胺(136.7 g，1.21mol)、NaI(182.5 g，1.22mol)、4A分子筛(342g)和K₂CO₃(170.9g，1.24mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(341 g，494.54mmol)的DMSO(525 ml)和1,4-二噁烷(1.025 L)溶液中。将反式-N,N'-二甲基环己烷(81.6 g，573.66 mmol)和DMSO(500 ml)中的碘化亚铜(27.3 g，143.34 mmol)加入到该反应混合物中。将该混合物搅拌5分钟。将该混合物升温至100℃，搅拌8小时，并冷却至24℃。加入水(5.9 L)和DCM(5.9 L)，过滤该混合物，并分离各层。将有机层用水(5.9 L)洗涤，获得标题化合物的DCM溶液，其不经进一步纯化而使用。

制备例17

相对-N-[(4aR,7aS)-7a-5-(乙酰胺基)-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将THF(30 mL)加入到相对-N-[3-[(3S,4R)-3-氨基-1-(5-氟嘧啶-2-基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]-4-氟-苯基]乙酰胺(4.1 g，11.0 mmol)中。将该混合物在冰浴中冷却至0℃，并加入苯甲酰异硫氰酸酯(1.50 mL，11.0 mmol)。然后，用30分钟将该混合物升温至室温。加入1,1'-羰基二咪唑(1.9 g，11.0 mmol)，并将该混合物在室温下搅拌2小时。然后，将该混合物加热到55℃，并再搅拌18小时。加入水(50 mL)，并将该混合物用EtOAc(50 mL)提取。用额外的EtOAc(25 mL)提取水层，并浓缩至干。用硅胶快速柱色谱纯化粗品残余物，用50% DCM/EtOAc洗脱，而后用100% EtOAc洗脱。将合适的级分浓缩，并真空干燥，得到标题化合物的外消旋的顺式混合物(1.33 g，26%)。ES/MS(m/z): 509(M+H)。

制备例18

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺，盐酸盐

将NaOH(28.7 g)和水(2.7 L)加入到N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-[2-氟-5-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]苯基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(250 g，494.4 mmol)的DCM溶液中，并将该混合物在24℃下搅拌68小时。加入1N HCl(3.5L)，获得1-3的pH值。分离各层，并将水层用DCM(680 ml)洗涤。将DCM(4 L)加入到该水溶液中，而后加入21%的氢氧化铵，获得8-10的pH值。分离各层，将有机提取物合并，通过硅胶(170 g)过滤，并用DCM(1.4 L)洗涤。将溶剂浓缩至干，并用EtOAc(4 L)稀释。在低于25℃的温度下，加入EtOAc(700 ml)中的1N HCl，并将该混合物搅拌1小时。将该混合物浓缩至大约1/8-1/7体积，并加入EtOAc(2.8 L)。将得到的沉淀滤出，并用EtOAc(400 ml)洗涤。将固体干燥，得到标题化合物(246 g，52%)。

制备例19

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟-苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将乙酸酐(23.5g，0.23 mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺，盐酸盐(100 g，0.153mol)和三乙胺(54.3g，0.535 mol)的DCM(800ml)溶液中。在20-25℃下搅拌1小时之后，加入饱和NaHCO₃(700 ml)和水(600 ml)。分离各层，得到标题化合物的DCM溶液，其不经进一步纯化而使用。

制备例20

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将三苯基膦(4.0g，0.015 mol)和1,3-二甲基巴比妥酸(15.2 g，0.097 mol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟-苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(0.153 mol)的DCM溶液中。加入乙酸钯(1.7g，7.7 mmol)，并将该混合物在20至30℃下搅拌1小时。加入25%氢氧化铵，并分离各层。用HOAc(3.0当量，在500ml水中)洗涤有机层，并用25%氢氧化铵将pH值调节至8-9。将水层用DCM(2× 500 ml)提取。将有机提取物合并，并浓缩至1/4-1/3体积。加入MTBE(1 L)，并将该混合物过滤。浓缩该混合物，并加入庚烷(1 L)。滤出所得到的固体，收集，并干燥，得到标题化合物(48 g，76%)。¹HNMR(400 MHz, CDCl₃)δ2.15(s, 3H),2.87-2.83(m, 1H),3.43-3.23(m, 5H),3.70-3.67(m, 1H),7.12-7.07(m, 1H),7.28-7.27(m, 1H),7.52-7.41(m, 4H),7.79(m, 1H),8.18-8.16(m, 2H),ES/MS(m/z): 413.1(M+H)。

制备例21

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

将2-氯-5-氟嘧啶(28.9 g，218 mmol)和碳酸钾(33.46 g，242.1 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(50 g，121.22 mmol)的DMF(100 mL)溶液中。将该混合物加热至80-85℃，保持8小时。将该混合物冷却至24℃，过滤，并用DMF(100 ml)洗涤。将该固体在水(2 L)中打浆，过滤，获得标题化合物(68.5g，98%)。LC-MS: m/z=509.2(M+H)⁺, ¹H NMR(400 MHz, d₆-DMSO) δppm 1.22(t, J=7.28 Hz, 2 H)1.92-2.07(m, 6 H)2.89-3.20(m, 2 H)3.36-3.44(m, 1 H)3.67(t, J=9.54 Hz, 1 H)3.84(br. s., 1 H)4.16(br. s., 2 H)7.23(br. s.,2 H)7.35-7.61(m, 8 H)7.77(br. s., 2 H)7.85-8.18(m, 4 H)8.48(s, 4 H)10.15(br.s., 1 H)10.46-10.59(m, 1 H)。

制备例22

(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将氢氧化锂(8.6 g，204.9 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(80 g，157.3 mmol)的甲醇(400 mL)溶液中。将该混合物加热至60-70℃，保持4小时。加入浓HCl(132 g)，并将该混合物在55℃下搅拌18小时。将该混合物冷却至30℃，并浓缩，除去甲醇。加入水，并将水层用DCM(3×)提取，获得标题化合物的920 g的水溶液，其中，总质量的5.6%是标题化合物，其不经进一步纯化而使用。

另一个制备例22

将硫酸(33.4 mL，626.6 mmol)加入到(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(45.8 g，125,3 mmol)的TFA(626mL)溶液中。将该混合物冷却至0℃，并搅拌20分钟。加入发烟硝酸(6.2 mL，144.1 mmol)，将该反应混合物升温至22℃，并搅拌3小时。蒸发该反应混合物，加入MTBE(250 ml)，并蒸发两次。将残余物真空干燥至恒重，而后溶于水(147 ml)和乙醇(885 ml)中，并鼓入氮气15分钟，进行脱气。将该溶液转入压力反应器中，并加入类型87L的10% Pd/C糊状物(6.6 g，6.27mmol)。将该混合物用额外的乙醇(700 ml)稀释，并在80 psi下用氢气加压16小时。过滤该反应混合物，而后将第二个催化剂进料加入类型87L的10% Pd/C糊状物(6.6 g，6.27mmol)，并在压力反应器中，将该混合物加压到80 psi，搅拌3天。用氮气吹扫该反应混合物，并用硅藻土过滤。蒸发滤液，并将残余物在水(200ml)和EtOAc(200 ml)之间分配。分离水层，冷却至5℃，并用15% w/w氢氧化铵中和。将水层用EtOAc(3×150 ml)提取。将有机物合并，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，得到标题化合物，为浅棕色固体(47.7 g，99%，含有残余的EtOAc)。ES/MS(m/z): 363(M+H)。

制备例23

N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯

在氮气氛围中，将N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯(50 g，208.9 mmol)的甲苯(180 ml)溶液用固体氢氧化钾(51.6 g，919.69 mmol)处理。10分钟之后，加入苄基三乙基氯化铵(0.8 g，3.1 mmol)。再经过10分钟之后，用10分钟逐滴加入烯丙基溴(33 g，272.8 mmol)的甲苯(50 ml)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。将该混合物冷却至室温，并用水淬灭。分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩至干，得到标题化合物(44 g，75%)。ES/MS(m/z): 280(M+H)。

制备例24

N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯

将N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯(30 g，107 mmol)的甲酸(36.8 ml，860 mmol)和水(4.84 ml)溶液在室温下搅拌过夜。浓缩该混合物，并用己烷/EtOAc(1:2)和水稀释。分离有机层，用饱和盐水洗涤，直到pH=6为止，并用硫酸钠干燥。蒸发溶剂，得到标题化合物(25g，99%)。ES/MS(m/z): 234(M+H)。

制备例25

N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基乙基]氨基甲酸苄基酯

将N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯(25 g，107 mmol)的ACN(150 ml)溶液用盐酸羟胺(9.68 g，139 mmol)和三水乙酸钠(16 g，117.9 mmol)水溶液(75 ml)处理。将该混合物在室温下搅拌过夜。蒸发ACN，并将该水溶液用EtOAc提取。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩，得到标题化合物(24 g，90%)。ES/MS(m/e): 249(M+H)。

制备例26

3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯

用10分钟，将N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基乙基]氨基甲酸苄基酯(24 g，96.6mmol)的DCM(338 ml)溶液用5% w/w次氯酸钠水溶液(106.08 mmol，143.06 ml)逐滴处理。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将该反应用40%亚硫酸氢钠(7 g)水溶液淬灭。分离有机层，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。用硅胶纯化粗品，用5% EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(18 g，75 %)。ES/MS(m/z): 247(M+H)。

制备例27

6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯

将1.6M正丁基锂的己烷溶液(25.4 ml，40.6 mmol)逐滴加入到-78℃的4-溴-1-氟-2-碘苯(12.22 g，40.6 mmol)的THF(60 ml)溶液中，得到黄色溶液，并在-78℃下搅拌15分钟。将三氟化硼醚合物(5.14 ml，40.6 mmol)加入到单独的-78℃的3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(5 g，20.3 mmol)的THF(60 ml)溶液中，并将该混合物在-78℃下搅拌5分钟。将此溶液通过小管加入到先前制备的-78℃的有机锂混合物中。将合并的混合物在-78℃下搅拌30分钟。将该混合物用饱和氯化铵水溶液淬灭，并升温至室温。将该混合物用EtOAc(3×)提取，将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过35分钟，得到标题化合物(2.27 g，27%)。ES/MS(m/z):(⁷⁹Br/⁸¹Br)421/423(M+H)。

制备例28

1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯

将苯甲酰异硫氰酸酯(2.87 ml，21.28 mmol)逐滴加入到6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(5.977 g，14.2 mmol)的THF(95ml)溶液中，并在氮气氛围中搅拌过夜。真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(6.05 g，73%)。ES/MS(m/z):(⁷⁹Br/⁸¹Br)584/586(M+H)。

制备例29

3-(苯甲酰硫代氨基甲酰基氨基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄基酯

在室温下，在氮气氛围中，将1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(6.05 g 10.4 mmol)和锌(粉末，<10微米)(6.77 g，103.5 mmol)的混合物在HOAc(52 ml)中搅拌过夜。将该反应用EtOAc稀释，并通过硅藻土过滤。真空除去溶剂，并将残余物用EtOAc、水和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。将该混合物用EtOAc(3×)提取，将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(5.222 g，86%)。ES/MS(m/z):(⁷⁹Br/⁸¹Br)586/588(M+H)。

制备例30

2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯

将1,1'-羰基二咪唑(2.87 g，17.7 mmol)加入到3-(苯甲酰硫代氨基甲酰基氨基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄基酯(5.198 g，8.86 mmol)的THF(52 ml)溶液中。将该混合物在室温下搅拌1.5小时，而后将该反应在氮气氛围中、在回流下加热过夜。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(2.93 g，58%)。ES/MS(m/z):(⁷⁹Br/⁸¹Br)568/570(M+H)。

制备例31

N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将碘代三甲硅烷(2.21 ml，15.46 mmol)逐滴加入到室温的2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯(2.93 g，5.15mmol)的ACN(44 ml)溶液中。在室温下搅拌该反应两个小时，并真空除去溶剂。用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后2∶1的DCM∶7N的甲醇中的氨，得到标题化合物(2.098 g，94%)。ES/MS(m/z):(⁷⁹Br/⁸¹Br)434/436(M+H)。

制备例32

2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯

将二碳酸二叔丁基酯(1.16 g，5.31 mmol)和三乙胺(1.01 ml，7.25 mmol)加入到N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.098 g，4.83 mmol)的DCM(48 ml)溶液中。将该反应在室温下、在氮气氛围中搅拌1小时。真空除去溶剂，用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(2.556 g，99%)。ES/MS(m/z):(⁷⁹Br/⁸¹Br)534/536(M+H)。

制备例33

7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯

将2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.556 g，4.8 mmol)和反式-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(150 mg，1.1mmol)的乙醇(50 ml)溶液用叠氮化钠(933 mg，14.3 mmol)处理。加入L-抗坏血酸钠盐的水溶液(0.66M，3.2 ml，2.1 mmol)和水(1 ml)，并将烧瓶的顶部用氮气吹扫。将该混合物用硫酸铜(II)五水合物的水溶液(0.33M，3.2 ml，1.1 mmol)处理，并在80℃下，在氮气氛围中，将该混合物立即在预热的加热板上加热1.5小时。通过加热，获得均匀混合物。冷却该反应，用冰水稀释，并将该混合物用EtOAc(3×)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得到粗品叠氮化物产物。将该粗品叠氮化物产物与冷乙醇(150 ml)中的10%钯/碳(1 g)混合，并使用真空/氮气，而后真空/氢气，吹扫该混合物。将该混合物在室温下、在30 psi的氢气氛围中搅拌5小时。排出反应物，通过硅藻土过滤，并将滤饼用DCM冲洗。从滤液中真空除去溶剂，并将粗品用硅胶纯化，使用50% EtOAc/DCM，得到标题化合物(2.014g，89%)。ES/MS(m/z): 471(M+H)。

制备例34

N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将TFA(10 ml)加入到7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.013 g，4.28 mmol)的DCM(30 ml)溶液中，并将该混合物在室温下、在氮气氛围中搅拌4小时。真空除去溶剂，用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N的甲醇中的氨，得到标题化合物(1.555 g，98%)。ES/MS(m/z): 371(M+H)。

制备例35

外消旋的N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮气氛围中，将N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(705 mg，1.90 mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(1.01 g,7.61 mmol)和DIPEA(1.66 ml，9.52 mmol) 的1,4-二噁烷(20 ml)溶液加热至回流，保持4小时。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂，得到粗品。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，经过25分钟，得到标题化合物(590 mg，66%)。ES/MS(m/z): 467(M+H)。

制备例36

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(异构体1)

将外消旋的N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(1.694 g，3.63 mmol)用手性HPLC纯化(色谱柱∶Chiralcel OJ，8 x 35 cm；洗脱液∶90%甲醇(0.2%二甲基乙胺)和10% ACN；流速400 ml/min，UV 280 nm)。第一个洗脱的异构体的分析(色谱柱∶Chiralcel OJ-H，0.46 x 15 cm；洗脱液∶10∶90的ACN∶甲醇(含有0.2%二甲基乙胺)；流速∶0.6 ml/min，UV 280 nm)证明了对映体富集(99% ee)的对映体，Rt=6.70分钟(723 mg，43%)。ES/MS(m/z): 467(M+H)。

制备例37

N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺，异构体1

将N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺，异构体1 (0.361 g，0.77 mmol)溶于DCM(4 ml)和DMF(0.5 ml)的混合物中。将5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(240 mg，1.55 mmol)、HOBT(210 mg，1.55 mmol)和EDCI(300 mg，1.55 mmol)加入到该混合物中，并将该混合物在室温下搅拌过夜。将反应溶液直接加到12g硅胶装载的柱上，使用40 g硅胶柱纯化，用0-100%的EtOAc/己烷的梯度进行洗脱。将产物溶于EtOAc(200 ml)中，用1N NaOH(2×50 ml)和盐水(1×50ml)洗涤。重复上述硅胶纯化，得到标题化合物(350 mg，74%)。ES/MS(m/z): 603(M+H)。

制备例38

5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑

流动化学反应步骤∶将343 ml无缝不锈钢管式反应器(OD=1/8英寸)放在GC烘箱内部，并以20 ml/min的速度用甲苯冲洗20分钟。施加氮气背压(720 psig)，并将GC的温度设定在210℃。温度达到210℃之后，使用一对以连续方式工作的高压注射泵，使2-(二烯丙基氨基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟(480.51 g，1.74mol)的甲苯(5.81 L)溶液以22.866 ml/min的速度泵送通过反应器以使停留时间为15分钟。消耗了所有储备溶液之后，将反应器以22.866 ml/min的速度用甲苯冲洗30分钟。GC烘箱的温度设置在25℃，收集全部溶液，并真空浓缩。蒸发溶剂，并将残余物溶于DCM(2.5 L)和水(5 L)中。用HCl将pH值调节至1，分离水层，并用NaOH中和，将pH值调节至10。用MTBE(3×2.5 L)提取水层。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物(248 g，47%)，其不经进一步纯化而使用。ES/MS(m/z): 249(M+H)。

制备例39

1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

将锌粉(590 g，9 mol)加入到5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑(3559 g，1.29 mol)的溶液(在甲醇(2.85 L)和饱和氯化铵水溶液(3.56L)的混合物中)中，并将该混合物在70℃下加热16小时。将该反应冷却至60℃，用THF(2.85L)稀释，趁热过滤通过硅藻土。蒸发滤液，除去有机溶剂，并将该水性混合物用10% w/w柠檬酸水溶液(4 L)和EtOAc(3.5 L)稀释。分离有机层，并将水层用EtOAc(2×2 L)洗涤。将水层用50% w/w NaOH中和以将pH值调节至10，而后用EtOAc(2×1.5 L)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物(299 g，92%)。ES/MS(m/z): 251(M+H)。

制备例40

[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸

将二-对甲苯酰-L-酒石酸(348.6 g，884 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液加入到预先在40℃加热的[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(225.9 g，902 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液中。将该反应冷却至22℃，并搅拌18小时。过滤收集白色固体，并用1-甲氧基-2-丙醇(600ml)洗涤。将收集的固体干燥，得到标题化合物(183.01 g，31.8%)。ES/MS(m/z): 251(M+H)。

制备例41

[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸(211 g，331 mmol)溶于水(2.1l)和EtOAc(2.3l)中。加入35% w/wHCl以将pH值调节至1。分离水层，用50% w/w NaOH将pH值调节至10，并用EtOAc(2×)提取。将水层的pH值用NaOH水溶液调节至10，并用MTBE(3×)提取，同时保持该水溶液的pH值=10。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至干，得到粗品标题化合物(73 g，88%，94.8%ee)。用手性色谱分析产物∶色谱柱∶AS-H，洗脱液∶10%异丙醇、2%异丙胺；流速∶3 ml/min，UV 220；压力∶100 bar，在35℃下，得到标题化合物，为第二个洗脱的异构体，R_f=2.26分钟。ES/MS(m/z): 251(M+H)。

制备例42

N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮气氛围中，在0℃，将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(129.7 g，414 mmol)的THF(2,3L)溶液冷却。加入苯甲酰异硫氰酸酯(61.5 ml，456mmol)，保持温度低于5℃。用3小时将该反应升温至室温，加入1,1'-羰基二咪唑(87.4 g，538.9 mmol)，并将该反应在22℃下搅拌1小时，而后在70℃下加热16小时。将该反应混合物冷却至22℃，并蒸发溶剂。将残余物在EtOAc(1L)和水(1L)中分配。分离有机层，并将水层用EtOAc(2×400 ml)提取。将有机物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物。用硅胶色谱纯化粗品，用EtOAc/DCM(0-40% DCM)的梯度进行洗脱，得到标题化合物，为浅黄色固体(170 g，99%)，其含有残余溶剂。ES/MS(m/z): 396(M+H)。

制备例43

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮气氛围中，将2-巯基-苯甲酸(122 g，793 mmol)、二(二亚苄基丙酮)钯(4.15g，7.21 mmol)和1,4-二(二苯基膦基)丁烷(3.14 g，7.21 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(178.21g，360 mmol)的无水2-甲基四氢呋喃(1.96 L)溶液中。通过真空/氮气循环三次，将该溶液脱气，而后向该反应中鼓入氮气15分钟。将该反应混合物加热至40℃，同时向该反应中鼓入氮气。当反应达到40℃时，停止鼓入氮气，并在氮气氛围中，将该反应混合物在40℃下搅拌3小时。将该反应冷却至22℃，并用水(2 L)稀释。加入HCl(5M)溶液，以将pH值调节至1。分离水层，并用额外的EtOAc(2×800 ml)洗涤。将水层的pH值用50% w/w NaOH调节至10，而后用EtOAc(10L)提取。用额外的EtOAc(2×750mL)洗涤水层。将有机提取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物，为浅黄色固体(124.7 g，97%)。ES/MS(m/z): 356(M+H)。

制备例44

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(124.7 g，256 mmol)、DIPEA(67ml)、5-氟-2-氯嘧啶(29.3 ml，307 mmol)的N-甲基吡咯烷酮(997 ml)溶液加热至100℃，保持16小时。将该反应冷却至22℃，并倒入10℃的冷水(10 L)中，保持温度低于15℃。过滤收集淡色的膏状固体，并用额外的水洗涤。将湿润的固体溶于EtOAc(2 L)中，并转入分离漏斗中。加入5% w/w氯化钠水溶液(1 L)，分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发滤液。用硅胶色谱纯化产物，使用0-40%的EtOAc/异己烷的梯度，得到标题化合物，为浅黄色固体(116 g，70%)。ES/MS(m/z): 452(M+H)。

制备例45

(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将氢氧化锂(9.26 g，386 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(158.6 g，351.6mmol)的甲醇(1.6 L)混合物中。将该混合物在70℃下加热4小时，而后冷却至22℃。真空蒸发该反应混合物，得到黄色残余物。将残余物在水(1L)和EtOAc(750 ml)中分配。加入HCl(5M水溶液)以将pH值调节至1。分离水层，并将有机层用EtOAc(2×200 ml)洗涤。将水层的pH值用50% w/w NaOH水溶液调节至pH=10，并用EtOAc(3×1L)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，得到粗品标题化合物，为浅黄色固体(133.3 g，99%，含有12%残余的EtOAc)。ES/MS(m/z): 348(M+H)。

制备例46

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺盐酸盐

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺，异构体1 (0.350 g，0.58 mmol)溶于THF(2 ml)中，而后加入甲醇(4 ml)和乙醇(4 ml)。将O-甲基羟胺盐酸盐(495 mg，5.81 mmol)和吡啶(470 µl，5.81 mmol)加入到该混合物中，将该反应升温至50℃，并搅拌过夜。将硅胶(～10 g)加入到该反应中，并浓缩该混合物。将在硅胶上干燥的样品装载到空柱上，纯化，用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度进行洗脱。在SCX柱上再次纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N的甲醇中的氨。最后用硅胶纯化该产物，使用0%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M HCl/乙醚(0.20 ml，660µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(71 mg，23%)。ES/MS(m/z): 498(M+H)。

X射线粉末衍射(XRD)

在配备有CuKa源(λ= 1.54060 Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪(在35 kV和50 mA下操作)上获得结晶固体的XRD图。在4和40°(2θ)之间扫描样品，步长为0.009°(2θ)，扫描速率为0.5秒/步长，散射0.6 mm， 5.28固定的防散射，检测器狭缝为9.5 mm。将干粉填装到石英样品座上，并使用载玻片获得光滑表面。在环境温度和相对湿度下收集晶型的衍射图。结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的晶型，衍射峰的相对强度可能由于例如晶体形态和习性等因素引起的择优取向而改变。如果存在择优取向的效果，峰强度发生改变，但多晶型物的特征峰位置没有变化。参见，例如，The UnitedStates Pharmacopeia #23, National Formulary #18, 第 1843-1844页, 1995。此外，结晶学领域还众所周知的是，对于任何给定的结晶形态，有角度的峰位置可能稍有不同。例如，由于分析样品时的温度或湿度变化、样品位移、或存在或不存在内标，峰位置可能移动。在本发明的情况下，±0.2(2θ)的峰位置变化性将会考虑到这些可能的变化，不会妨碍明确鉴别所指明的晶型。基于特征峰(单位：°2θ) ，典型地是更突出的峰的任何独特组合，可以确定晶型。基于NIST 675标准峰(在8.853和26.774度2θ)，调节在环境温度和相对湿度下收集的晶型的衍射图。

制备例47

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2(水合物)

将草酰氯(888 µl，10.2 mmol)加入到5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(1.6 g，10.2 mmol)的ACN(53 ml)和DMF(848 µl)溶液中。15分钟之后，将该新制备的溶液加入到预先在50℃下加热的(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(2.65 g，7.3 mmol) 在水(53 ml)和乙醇(53 ml)的混合物中的溶液中。将该反应混合物在50℃下搅拌一个小时，冷却至22℃，而后在此温度下搅拌过夜。真空蒸发有机溶剂，并将该混合物水溶液用50% w/w的NaOH水溶液处理以调节pH=10。分离淡色的膏状固体，并用额外的水洗涤。用异丙醇(2×)稀释固体，并将溶剂蒸发。用硅胶色谱纯化粗品，使用氨化的甲醇(2N)/DCM的梯度。将含有目标产物的级分合并，蒸发溶剂，得到标题化合物，为灰白色固体(1.9 g，52%)。ES/MS(m/z): 499(M+H)。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d] [1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2(水合物)的另一个制备例

将ACN(500 ml)加入到DMF(19.2 ml，248.9 mmol)中。将草酰氯(39.3 g，309.63mmol)加入到该DMF/ACN溶液中，而后加入5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(46.0g，298.4 mmol)。在单独的烧瓶中，将(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(56.8 g，156.75 mmol)的水溶液加入到ACN(500 ml)中，并用氢氧化铵(95 ml)将pH值调节至9。然后，将该混合物加热到50-55℃。逐滴加入草酰氯溶液，并将该混合物搅拌3小时。将pH值用氢氧化铵调节至8-9。滤出所得到的沉淀，用水洗涤，干燥，获得标题化合物(123 g)。使固体在丙酮(250 ml)中打浆1.5小时，并过滤。用丙酮洗涤湿滤饼，获得标题化合物(110g，HPLC纯度90.5%)。将THF(1 L)和活性碳(9 g)加入到固体中，并将该混合物加热至回流过夜。通过硅藻土过滤该混合物，并用THF(150 ml)洗涤。浓缩有机溶液至1/10体积，并加热到60℃。加入水(430 ml)，并将该混合物在60℃下搅拌8小时。将该混合物冷却至室温，并搅拌10小时。滤出所得到的固体，用THF/水(7:6)洗涤，干燥，得到标题化合物(69 g，88%)。LC-MS:(m/z)499(M+H)，纯度∶98.3%。¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆)δ ppm 2.99-3.07(m, 2 H)3.07-3.14(m, 1 H)3.58-3.67(m, 1 H)3.68-3.76(m, 1 H)3.76-3.84(m, 1 H)4.02(s, 3 H)4.07(d, J=10.92 Hz, 1 H)6.08(s, 2 H)7.19(dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H)7.78-7.89(m, 2 H)8.41(s, 1 H)8.44(s, 2 H)8.88(s, 1 H)10.60(s, 1 H)。

制备N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4- d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2(水合物)的一般方法

在大约23℃，使N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺在THF中形成浆液，浓度为大约71 mg/ml溶剂。在搅拌下，加热该浆液，在大约60℃至大约63℃出现溶解。将水加入到该热溶液中以提供大约95∶5的THF∶水的溶剂比例。加入N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2的晶种(大约3重量%的载量)。将得到的稀浆液在大约60℃至大约63℃下保持大约20分钟，而后，用大约2至大约4小时加入大约5.3至大约5.5体积的水，形成大约69∶31的THF∶水溶剂比例。然后，将该浆液在大约60℃至大约63℃下保持大约30分钟，而后用大约1小时冷却至大约23℃，而后搅拌大约8-12小时。然后，过滤该浆液，用THF∶水(35∶65)轻轻地冲洗，并在大约40℃，真空干燥大约8-12小时，提供目标N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2，它是水合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2的制备样品的特点在于：使用CuKa发射的XRD图具有下面表1所述的衍射峰(2θ值)。具体地说，该图包括处于11.8°的峰，以及一个或多个选自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

表1∶晶型2的X射线粉末衍射峰

在室温和高于大约15%的相对湿度下，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型2是稳定的晶型。

制备例48

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d] [1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型3

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺加入到热重分析盘中，加热至大约170℃，并在170℃下保持大约5分钟。将该混合物冷却至室温，提供标题化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d] [1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型3的另一个制备例

在管瓶中，将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(121 mg)与ACN(5ml)混合，并在90℃磁力搅拌器上加热。大约30分钟之后，大部分固体溶解，提供浑浊的溶液。加入晶型3的晶种，并将该样品在大约90℃下搅拌大约1小时。去除加热，搅拌该混合物，提供亮白色固体。通过真空过滤分离固体，在空气流中干燥大约10分钟，而后在大约80℃下抽真空大约8至12小时，提供标题化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的晶型3的制备样品的特点在于：使用CuKa发射的XRD图具有下面表2所述的衍射峰(2θ值)。具体地说，该图包括处于15.7°的峰，以及一个或多个选自18.1°、27.0°和19.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

表2∶晶型3的X射线粉末衍射峰

实施例1

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；甲苯磺酸

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺水合物的晶型2(149.15 mg)加入到乙酸乙酯(2 mL)中。将样品在80℃的温度下在1000 rpm下搅拌。将对甲苯磺酸(70 mg溶于乙酸乙酯(1 mL)中)加入到该搅拌溶液中，并在80℃搅拌过夜以制备白色固体的浆液，将其真空过滤分离，提供标题化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；甲苯磺酸的另一个制备例A

将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(9.5 g，19 mmol)和对甲苯磺酸(3.80 g，19.8 mmol)加入到四氢呋喃(31 mL)、水(7.9 mL)和2-丙醇(8.6 mL)中。将该溶液加热至40℃。用大约3小时向该温热溶液中加入2-丙醇(200.0 mL)。开始加入2-丙醇之后不久，用一部分标题化合物(500 mg，0.75 mmol)作为该混合物的晶种。完全加入溶剂之后，用1-3小时将该混合物冷却至大约20℃。用2小时的目标时间，将该混合物从大约20℃加热至大约55℃。将温度在55℃下保持1小时，而后用大约4小时冷却至大约20℃。将该浆液在大约20℃下搅拌至少10小时。过滤该浆液，并将湿滤饼用水(57 mL)洗涤。将产物在45℃下真空干燥至少10小时，得到标题化合物(10.4 g，81%)。ES/MS(m/z): 500(M+H)。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；甲苯磺酸的另一个制备例B

在配备有氮气鼓泡器、连接至具有特氟隆香蕉形桨叶的玻璃转轴的IKA^®机械马达/搅拌器和连接至可编程J-KEM^®温度控制器的热电偶的500 mL三颈圆底烧瓶中，在60:40THF:H₂O(85 mL)中，在170 rpm下，将N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺水合物(20.7 g)打浆。在23℃，将对甲苯磺酸一水合物(7.6 g，1.03 eq)溶于60:40的THF:H₂O(20mL)的混合物中，并将该溶液立即全部加入到搅拌的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺浆液中，几乎立即得到透明的淡红褐色溶液。然后，将搅拌速率升至200 rpm，经过15分钟，将水(22 mL)加入到该溶液中，然后用N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺甲苯磺酸(750 mg，3 wt%晶种载量)作晶种，然后在23℃下进一步搅拌15分钟。经过6小时，将水(226 mL，溶剂总共353 mL；或13.6 vol，THF:H₂O的最终溶剂比例为17.5:82.5)加入到该浆液中，然后在23℃下搅拌过夜(22小时)。将浆液真空过滤，用15:85的THF:H₂O ( 2×20 mL)冲洗，然后保持真空20分钟，同时将产品湿滤饼中形成的裂缝人工压实。将湿固体在40℃下真空干燥大约72小时，得到标题化合物的白色结晶固体(24.07 g，90.0 wt%)。

晶体N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；甲苯磺酸的特征在于：在使用CuKa发射的X射线衍射谱中具有下面表3所述的衍射峰(2θ值)，尤其是在5.0°的衍射角2θ处具有峰，还具有一个或多个选自19.6°、13.8°和18.5°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。

表3∶晶体实施例1的X射线粉末衍射峰

已经发现，在低于大约15%的相对湿度下，存在N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺的游离碱的晶型1，而在高于大约15%相对湿度下，N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺的晶型2占优势。这种物理不稳定性是不合乎需要的，尤其对于药物实体或药品产品来说，它们两个都受到关于固态形式的监管控制。与游离碱的结晶形式对比，甲苯磺酸盐在很宽的相对湿度范围内(5-95%)的物理稳定性更高。因此，N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐基本上避免了与相应的晶体游离碱形式相关的湿度依赖性相转变。进一步的，与N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺的HCl盐的大约7.7%溶剂保留相比，N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐被发现在晶体中保留的溶剂量更低，大约为1.3%。在长期保存期间游离碱进行相变的增加的可能性，可能导致性能改变，例如，溶解度或溶出速率改变，这会危害药物产品的性能。还会造成晶体结构坍塌为非晶态或缺陷和无序的累积的额外的风险，这可能导致化学不稳定性，以及减少药物产品的贮存期限。

体外试验方法∶

对于体外酶和细胞试验，在DMSO中制备试验化合物，形成10 mM储备溶液。在96孔圆底板中，将储备溶液在DMSO中顺序稀释，获得十点稀释曲线，最终化合物浓度范围是10mM至0.05nM，而后进行体外酶和全细胞试验。

体外蛋白酶抑制试验∶

人类BACE1的表达

利用RT-PCR，由全脑cDNA克隆人类BACE1(保藏号∶AF190725)。将对应于氨基酸序列#1至460的核苷酸序列插入到编码人类IgG1(Fc)多肽的cDNA中 (Vasser等人，Science,286, 735-741(1999))。将BACE1(1-460)和人类Fc的融合蛋白(名称为huBACE1:Fc)构建到pJB02载体中。在HEK293细胞中临时表达人类BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)。将各个构建体的250 μg cDNA与Fugene 6混合，并加入到1升HEK293细胞中。转染之后四天，采集条件培养基，进行纯化。

huBACE1:Fc的纯化

用蛋白A色谱纯化huBACE1:Fc。以小的等分样品将酶在-80℃下储存。

BACE1 FRET试验

如上所述，制备试验化合物的系列稀释物。将化合物在KH₂PO₄缓冲剂中进一步稀释20×。在相应的低蛋白结合的黑色板的A排至H排上，将10μL的每个稀释物加入到每个孔中，所述黑色板含有反应混合物(25μL的50mM KH₂PO₄，pH4.6，1mM TRITON® X-100，1mg/ml牛血清白蛋白，以及15μM的FRET底物)(参见，Yang等人，J. Neurochemistry, 91(6)1249-59(2004))。在板振荡器上用10分钟将内容物混合均匀。将在KH₂PO₄缓冲剂中的15μL的二百pM人类BACE1(1-460):Fc(参见，Vasser等人，Science，286，735-741(1999))加入到含有底物和试验化合物的板中，使反应开始。在板振荡器上简略混合之后，在激发波长355 nm和发射波长460 nm下，记录时间0时的混合物的RFU。用铝箔覆盖反应板，并在室温下、在黑色的湿润烘箱中保持16至24小时。记录培养结束时的RFU，激发和发射设置与时间0所使用的相同。时间0时的RFU与培养结束时的RFU的差值代表在化合物处理条件下的BACE1的活性。将RFU差值相对于抑制剂浓度作图，并将曲线用四参数逻辑斯谛（logistic）方程拟合，获得EC₅₀值和IC₅₀值(参见，Sinha等人，Nature, 402, 537-540(2000))。

基本上如上所述，试验制备例46的化合物，并且表现出0.615 nM的BACE1 IC₅₀值(+0.101，n=5)[平均值+SEM；SEM=平均值的标准误差]。这些数据表明，制备例46的化合物体外抑制纯的重组BACE1酶活性。

PDAPP原代神经元试验

还在PDAPP转基因胚胎期的小鼠中产生的原代神经元培养物中，进行验证性的全细胞试验。由胚胎期的16天PDAPP胚胎，制备原代皮层神经元，并在96孔板中培养(15 x 10⁴个细胞/孔，在DMEM/F12(1:1)加上10% FBS中)。体外2天之后，用不含血清的DMEM/F12(1:1)(含有B27添加物和2µM(最终)Ara-C(Sigma，C1768))替换培养基。体外第5天，在存在/不存在目标浓度的抑制剂(在DMSO中稀释)的条件下，将神经元在37℃下培养24小时。培养结束时，分析条件培养基对于β-分泌酶活性的证据，例如，通过分析Abeta肽。使用单克隆的266作为捕获抗体，生物素化的3D6作为报道抗体，利用夹心ELISA测定总的Abeta肽(Abeta1-x)。或者，使用单克隆2G3作为Abeta1-40的捕获抗体，和单克隆21F12作为Abeta1-42的捕获抗体，通过夹心ELISA，测定Abeta 1-40和Abeta 1-42肽。Abeta1-40和Abeta1-42 ELISA使用生物素化的3D6作为报道抗体。在这种条件下，化合物处理之后，在条件培养基中释放的Abeta的浓度与BACE1的活性对应。绘制10点抑制曲线，并且用四参数逻辑斯谛方程拟合，获得Abeta降低效果的EC₅₀值和IC₅₀值。基本上如上所述，试验制备例46的化合物，对于Abeta降低效果显示出下列活性∶

表4

平均值+SEM；SEM=平均值的标准误差

这些数据表明，制备例46的化合物在全细胞中抑制Abeta的产生。

β-分泌酶的体内抑制

一些动物模型，包括小鼠、豚鼠、狗和猴子的模型，可以用于筛选化合物处理之后的β-分泌酶活性的体内抑制。本发明使用的动物可以是野生型、转基因或基因敲除的动物。例如，按照Games等人在Nature 373，523-527(1995)中所述制备的PDAPP小鼠模型，以及其它非转基因的或基因敲除动物，用于分析在抑制化合物存在下Abeta和sAPPbeta的产生的体内抑制。通常，给予2至12个月大的PDAPP小鼠、基因敲除小鼠或非转基因动物配制在赋形剂中的化合物，赋形剂可以是，例如玉米油、环糊精(cyclodextran)、磷酸盐缓冲剂、PHARMASOLVE®或其它合适的赋形剂。给予化合物之后一至二十四小时，将动物处死，取出脑以及脑脊液和血浆，用于分析Abetas、C99和sAPP片段(参见，May等人，Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516(2011))。

对于标准体内药理学研究，给动物服用各种浓度的化合物，并与同时给药的赋形剂处理的对照组进行比较。对于一些时程研究，从选择的动物中获得脑组织、血浆或脑脊液，从时间0开始，确立基线。给予其它组化合物或合适的赋形剂，并在给药之后的各个时间，将动物处死。从选择的动物中获得脑组织、血浆或脑脊液，分析APP断裂产物的存在，包括Abeta肽、sAPPbeta及其它APP片段，例如，利用特定的夹心ELISA试验。在试验的最后阶段，将动物处死，根据情况，分析脑组织、血浆或脑脊液中出现的Abeta肽、C99和sAPPbeta。在化合物处理之后，还可以分析APP转基因动物的脑组织中的β-淀粉样蛋白斑块的数量。本文使用的“Abeta 1-x肽”是指从残基1开始和以残基28以上的C末端结尾的Abeta种类的总和。这可以检测大部分Abeta种类，并且通常称为“总的Abeta”。

与赋形剂处理的对照物或零时对照物相比较，给予抑制化合物的动物(PDAPP或其它APP转基因的或非转基因小鼠)，可以显示出Abeta或sAPPbeta在脑组织、血浆或脑脊液中的降低，以及β淀粉样蛋白斑块在脑组织中的减小。对于制备例46，给予0.3、1或3 mg/kg口服剂量的化合物之后3小时，相比于赋形剂处理的小鼠，Abeta1-x肽在脑海马中的水平分别降低大约31%、39%和61%，在大脑皮质中分别降低大约28%、42%和64%。

考虑到制备例46对BACE酶的体外活性，这些Abeta降低效果与体内BACE抑制一致，并且进一步证明了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的CNS渗透性。

Claims

1.一种化合物，它是N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的甲苯磺酸盐，它是晶体，

其特征在于：在X射线衍射谱中，在5.0°的衍射角2θ处具有实质的峰，以及具有如下表中所示的X射线粉末衍射峰；衍射角的容许误差为0.2度：

。

2.按照权利要求1的化合物在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

3.按照权利要求1的化合物在制备用于治疗轻微认知损害向阿尔茨海默氏病的发展的药物中的用途。

4.一种药物组合物，其含有按照权利要求1的化合物以及一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。