KR101950129B1

KR101950129B1 - N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염

Info

Publication number: KR101950129B1
Application number: KR1020177020943A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 앤드류 코티스; 크레이그 다니엘 울판젤
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2019-02-19
Also published as: RS59730B1; MX2017009713A; DK3250575T3; US20170368071A1; EP3250575B1; ZA201703937B; CL2017001899A1; JP2019142902A; SG11201706038PA; SI3250575T1; EP3250575A1; ECSP17048768A; CA2969475C; GT201700166A; SV2017005478A; HUE048029T2; TN2017000332A1; ES2768782T3; IL252754A0; PH12017501356A1

Abstract

본 발명은 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다.

Description

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염 {TOSYLATE SALT OF N-[3-[(4AR,7AS)-2-AMINO-6-(5-FLUOROPYRIMIDIN-2-YL)-4,4A,5,7-TETRAHYDROPYRROLO[3,4-D][1,3]THIAZIN-7A-YL]-4-FLUORO-PHENYL]-5-METHOXY-PYRAZINE-2-CARBOXAMIDE}

본 발명은 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 톨루엔술폰산 (토실레이트) 염, 상기 토실레이트 염을 포함하는 제약 조성물, 생리학적 장애를 치료하기 위해 상기 토실레이트 염을 사용하는 방법, 및 그의 합성에 유용한 중간체 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 알츠하이머병, 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 신경독성 및 고도의 응집성 펩티드 절편인 아밀로이드 β (A베타) 펩티드를 수반하는 다른 질환 및 장애의 치료 분야에 있다. 알츠하이머병은 전세계적으로 수백만명의 환자에게 영향을 미치는 파괴적인 신경변성 장애이다. 환자에게 단지 일시적, 징후적 이익을 제공하는 시판되는 현재 승인된 작용제의 관점에서, 알츠하이머병의 치료에 있어서 상당한 미충족 필요가 존재한다.

알츠하이머병은 뇌에서의 A베타의 생성, 응집, 및 침착을 특징으로 한다. β-세크레타제 (β-부위 아밀로이드 전구체 단백질-절단 효소; BACE)의 완전 또는 부분 억제는, 심지어 A베타 펩티드 수준의 작은 감소에서도 플라크 부담 및 시냅스 결손에 있어서 장기간 유의한 감소를 생성할 수 있음을 시사하며, 따라서 특히 알츠하이머병의 치료에 유의한 치료 이익을 제공하여, 마우스 모델에서 플라크-관련 및 플라크-의존성 병리상태에 대한 유의한 효과를 갖는 것으로 제시된 바 있다.

미국 특허 번호 8,841,293은 A베타 펩티드-매개 장애, 예컨대 알츠하이머병의 치료를 위한 특정 BACE 억제제를 개시하고, 특히, 예를 들어 BACE 억제제 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 및 상응하는 히드로클로라이드 염을 개시한다.

제약 제제의 제조 및 제작에서의 증진된 이용을 위해 개선된 고체 상태 안정성 및 화학적 안정성을 제공하는 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 신규 형태가 바람직하다. 따라서, 본 발명은 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 결정질인 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다. 본 발명은 추가로 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 19.6°, 13.8°, 및 18.5°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 5.0°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 BACE를 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 BACE를 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 아밀로이드 전구체 단백질의 BACE-매개 절단을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 투여하는 것을 포함하는, 아밀로이드 전구체 단백질의 BACE-매개 절단을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 A베타 펩티드의 생산을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 투여하는 것을 포함하는, A베타 펩티드의 생산을 억제하는 방법을 제공한다.

게다가, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 위한 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 알츠하이머병의 치료 또는 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 19.6°, 13.8° 및 18.5°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 5.0°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 유효량의 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 위한 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 19.6°, 13.8° 및 18.5°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 5.0°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 또는 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 19.6°, 13.8° 및 18.5°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 5.0°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 제공한다.

본 발명은 추가로 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염의 합성을 위한 신규 중간체 및 방법을 포괄한다.

경도 인지 장애는 임상 제시를 기반으로 및 경도 인지 장애를 나타내는 환자의 시간에 따른 알츠하이머 치매로의 진행을 기반으로 하여 알츠하이머병과 연관된 치매의 잠재적 전구기로서 정의된 바 있다. (Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). 용어 "경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료"는 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 둔화, 저지, 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된, 용어 "치료하는" 또는 "치료하는 것"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된, 용어 "환자"는 인간을 지칭한다.

용어 "A베타 펩티드의 생산의 억제"는 환자에서 A베타 펩티드의 생체내 수준을 감소시키는 것을 의미하는 것으로 여겨진다.

본원에 사용된, 용어 "유효량"은, 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시에, 진단 또는 치료 하에 있는 환자에서 목적하는 효과를 제공하는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다.

유효량은 공지된 기술을 사용함으로써 및 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자로서의 담당 진단자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자를 위한 유효량을 결정하는데 있어서, 환자의 종; 그의 크기, 연령 및 전반적 건강; 수반된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 침범도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정한 화합물; 투여 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특징; 선택되는 용량 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 환경을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 담당 진단자에 의해 고려된다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상적으로 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중의 범위 내에 속한다. 일부 경우에 상기 언급된 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 보다 적절할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 보다 큰 용량이 허용되는 부작용과 함께 이용될 수 있으며, 따라서 상기 투여량 범위는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 화합물을 생체이용가능하게 하는 경구, 경피, 및 비경구 경로를 포함한 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여 또는 경피 투여를 위한 것이며, 경구 투여가 특히 바람직하다. 이러한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)] 참조).

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염은 특히 본 발명의 치료 방법에 유용하나, 특정 형태가 바람직하다. 하기 단락은 이러한 형태를 기재한다. 이들 바람직한 것은 본 발명의 제약 조성물, 치료 방법, 및 신규 화합물에 적용가능한 것으로 이해될 것이다.

0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 19.6°, 13.8° 및 18.5°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 5.0°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 결정질 토실레이트 염이 특히 바람직하다.

반응식 A에 도시된 바와 같이, N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드가 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 본 출원에서 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 구체적인 호변이성질체 중 1종에 대한 임의의 언급이 주어진 경우에, 호변이성질체 형태 둘 다 및 그의 모든 혼합물을 포괄하는 것으로 이해된다.

<반응식 A>

추가로, 하기 반응식에 기재된 특정 중간체는 1개 이상의 질소 보호기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 각 경우에, 수행될 특정한 반응 조건 및 특정한 변환에 따라 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).

명확성을 위해 하기 반응식에서 특정 입체화학적 중심은 명시되지 않았고, 특정 치환기는 제거되었으며, 이는 어떠한 방식으로도 반응식의 교시를 제한하도록 의도되지 않는다. 게다가, 개별 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체는 본 발명의 화합물의 합성에서의 임의의 편리한 포인트에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 분리되거나 또는 분해될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 명칭 "이성질체 1" 및 "이성질체 2"는 키랄 크로마토그래피로부터 각각 제1 및 제2 용리되는 화합물을 지칭하고, 키랄 크로마토그래피를 합성에서 초기에 개시하는 경우에, 동일한 명칭이 후속 중간체 및 실시예에 대해 적용된다.

특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "ACN"은 "아세토니트릴"을 지칭하고; "APP"는 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "CSF"는 뇌척수액을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고, "DIPEA"는 디이소프로필에틸아민, N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민, 또는 N,N-디이소프로필에틸아민을 지칭하고, "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "ee"는 거울상이성질체 과잉률을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "Ex"는 실시예를 지칭하고; "F12"는 햄(Ham) F12 배지를 지칭하고; "FBS"는 태아 소 혈청을 지칭하고; "FRET"는 형광 공명 에너지 전달을 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "HOAc"는 아세트산을 지칭하고; HOBt"는 1-히드록시벤조트리아졸 수화물을 지칭하고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "IC₅₀"은 해당 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 작용제의 농도를 지칭하고; "min"은 분을 지칭하고; "MTBE"는 메틸 tert-부틸 에테르를 지칭하고; "PDAPP"는 혈소판 유래 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "Prep"는 제조예를 지칭하고; "RFU"는 상대 형광 단위를 지칭하고; "SCX"는 강한 양이온 교환을 지칭하고; "R_t"는 체류 시간을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭한다.

용어 "토실레이트", "톨루엔술폰산", "p-톨루엔술폰산", 및 "4-메틸벤젠 술폰산"이 하기 구조의 화합물을 지칭한다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다:

이와 같이, 임의의 하기 명칭에 대한 본원에서의 지칭:

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염";

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 톨루엔술폰산";

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; p-톨루엔술폰산"; 및

"N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 4-메틸벤젠 술폰산"이 하기 구조의 염을 지칭한다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다:

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염은 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 또한, N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 유리 염기 및 상응하는 HCl 염은 미국 특허 번호 8,841,293에 기재된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 본 발명의 화합물을 제조하기 위해 상이한 방식으로, 또는 상이한 제조예로부터의 단계와 함께 조합될 수 있다. 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리, 또는 결정화를 포함한 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.

제조예 1

2-브로모-1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논

N-브로모숙신이미드 (984 g, 5.53 mol)를 35℃에서 DCM (7 L) 중 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논 (1000 g, 4.6 mol) 및 p-톨루엔술폰산 (1315 g, 7.64 mol)의 용액에 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 40℃로 4시간 동안 가열하였다. 혼합물을 24℃로 냉각시키고, 7% NaHCO₃ (5 L)을 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 10% Na₂SO₃ (5 L) 및 물 (5 L)로 세척하였다. 유기 층을 2-3 부피로 농축시켜 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

대안적 제조예 1

1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논 (80 g, 0.37 mol)을 DCM (800 mL) 중에 용해시키고, 10℃로 냉각시켰다. 브로민 (63 g, 0.39 mol)을 5시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 30분 후, 추가의 브로민 (3.5 g, 0.06 mol)을 첨가하였다. 30분 후, 혼합물을 실온으로 가온하고, 유기 층을 수성 NaCl (500 mL) 및 수성 NaHCO₃ (400 mL)의 혼합물로 세척하였다. 유기 층을 수성 NaHCO₃ (400 mL), 수성 NaHSO₃ (2x400 mL), 및 수성 NaCl로 연속적으로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고 (Na₂SO₄), 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 DCM (100 mL) 및 석유 에테르 (500 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 용액을 -50℃로 0.5시간 동안 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 수집하여 표제 화합물 (84 g, 77%)을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 4.46 (d, 2H), 7.07 (dd, 1H), 7.66 (m, 1H), 8.02 (dd, 1H).

제조예 2

2-[알릴(벤질)아미노]-1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논

2-브로모-1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논 (25.1 g, 84.8 mmol)을 실온에서 톨루엔 (200 mL) 중 N-벤질프로프-2-엔-1-아민 (15.0 g, 102 mmol) 및 DIPEA (59 mL, 338 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하여 탈산소화하면서 혼합물을 통해 표면하 질소 살포하였다. 반응물을 40℃로 가열하고, 2.5시간 동안 교반한 다음, 추가의 N-벤질프로프-2-엔-1-아민 (2.0 g, 13.6 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 4.5시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 물질을 추가 정제 없이 사용하였다. 용액을 표제 화합물을 위해 하기 파라미터를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다: LC 칼럼: 워터스 액퀴티 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC®) C 8 2.1 x 100 mm 1.7 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% (부피/부피) TFA + 0.2% ACN (부피/부피), TFA (4 mL) 및 ACN (10 mL)을 물 (4 L)에 첨가하여 제조됨, 이동상 B: ACN 중 0.1% TFA, TFA (4 mL)를 ACN (4 L)에 첨가하여 제조됨. 구배: %A = 10분에 걸쳐 95%에서 53.1%, 유량 0.85 mL/분, 칼럼 온도: 45℃. R_t = 6.43분 (UV)

제조예 3

5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-1-[(4-메톡시페닐)메틸-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸

톨루엔 (10 L) 중 2-브로모-1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논 (1363 g, 4.61 mol)의 용액에 디알릴아민 (537 g, 5.53 mol) 및 DIPEA (2381 g, 18.42 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하여, 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-(디알릴아미노)에타논을 수득하였으며, 이를 단리시키지 않았다. N-(4-메톡시벤질)히드록실아민 (847 g, 5.53 mol) 및 티타늄 (IV) 이소프로폭시드 (1965 g, 6.91 mol)를 조 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-(디알릴아미노)에타논을 함유하는 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 50% 시트르산 1수화물 (4 L) 및 포화 Na₂CO₃ (4 L)을 첨가하였다. 층을 분리하고, 수층을 MTBE (5 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 물 (5 L)로 세척하고, 규조토를 통해 여과하고, 농축 건조시켰다. EtOAc (10 L) 및 옥살산 (580 g)을 잔류물에 첨가하고, 고체를 여과하고, 1 N NaOH (13 L)에 첨가하였다. MTBE (5 L)를 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 2 부피로 농축시켰다. 헵탄 (3 L)을 첨가하고, 용액을 10℃로 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과하여 표제 화합물 (1330 g, 64%)을 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H), 3.78-3.41(m, 6H), 4.01(m, 1H), 5.24-5.01(m, 2H), 5.89-5.85(m, 1H), 6.82-6.80(m, 2H), 7.51-7.13(m, 3H), 7.63-7.62(m, 1H), 7.65-7.64(m, 1H).

제조예 4

상대-(3aR,6aS)-5-벤질-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸, 옥살산

N-[(4-메톡시페닐)메틸]히드록실아민 (15.5 g, 101 mmol)을 40℃에서 2-[알릴(벤질)아미노]-1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)에타논의 용액에 첨가하고, 이어서 티타늄 (IV) 이소프로폭시드 (50.3 mL, 169 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 시스템을 통해 5분 동안 질소 살포하여 탈산소화하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하면서 90℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 물 (36 g) 중 시트르산 (36 g, 186 mmol)의 용액으로 세척하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 탄산나트륨 (100 g, 939 mmol)을 물 중 포화 용액으로서 첨가하고, pH를 대략 9로 조정하였다. 혼합물을 필요에 따라 물 및 톨루엔으로 희석하여 층을 분리하였다. 톨루엔 층을 물 (200 mL)로 희석된 물 중 HCl의 용액 (5 N HCl 5.1 mL)으로 세척하고, 이어서 물 (200 mL)로 세척하였다. 톨루엔 층을 농후한 오일로 농축시켰다. 오일을 EtOAc (375 mL) 중에 용해시키고, EtOAc (375 mL) 중 용해된 옥살산 (15.4 g, 169 mmol)의 용액을 실온에서 교반하면서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반하고, 여과하고, 생성물 케이크를 EtOAc (250 mL)로 세척하였다. 고체를 진공 하에 40℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 시스 라세미 혼합물 (41.7 g, 84%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 498 (M+H).

제조예 5

상대 N-[3-[(3aR,6aS)-5-벤질-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-6a-일]-4-플루오로-페닐]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드

상대-(3aR,6aS)-5-벤질-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸, 옥살산 (23.6 g, 40.2 mmol)을 DCM (400 mL) 및 5 N NaOH 수용액 (200 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 층을 분리하였다. 유기 층을 농축시켜 상대-(3aR,6aS)-5-벤질-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸 (20.0 g, 40.2 mmol)을 수득하였다. 이 물질을 디메틸 술폭시드 (360 mL), 2,2,2-트리플루오로아세트아미드 (7.8 g, 68 mmol), 아이오딘화나트륨 (10.3 g, 68.6 mmol), 탄산칼륨 (9.54 g, 68.3 mmol), (1R,2R)-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 (4.7 g, 32 mmol), 및 아이오딘화구리 (I) (1.53 g, 8.03 mmol)에 첨가하였다. 혼합물을 시스템을 통해 10분 동안 질소 살포하여 탈산소화하였다. 혼합물을 115℃로 가열하고, 5.5시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시켰다. EtOAc (250 mL) 및 물 (200 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 10-15분 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (200 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 층을 염화암모늄 용액 20 중량% 수성 (100 mL)에 이어서 염화리튬 용액 20 중량% 수성 (100 mL) 및 물 (100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 조 표제 화합물을 라세미 시스 혼합물 (23.6 g, 111%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 530 (M+H).

제조예 6

상대-3-[(3aR,6aS)-5-벤질-1-(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-6a-일]-4-플루오로-아닐린

상대 N-[3-[(3aR,6aS)-5-벤질-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-6a-일]-4-플루오로-페닐]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (21.0 g, 39.7 mmol)를 메탄올 (250 mL), 5 N 수성 NaOH (105 mL), 및 에탄올 (105 mL)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 50℃로 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 35-40℃에서 농축시켜 메탄올 및 에탄올을 제거하였다. 물질을 MTBE (320 mL) 및 물 (300 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 층을 분리하고, 유기 층을 물 (100 mL)에 이어서 물 (400 mL) 및 12 N 수성 HCl (3.5 mL)의 혼합물로 세척하였다. 수성 층을 MTBE (400 mL), 물 (100 mL), 및 5 N 수성 NaOH (25 mL)의 혼합물에 첨가하고, 층을 분리하였다. 수성 층을 MTBE (100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 합하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 표제 화합물을 라세미 시스 혼합물 (9.8 g, 57%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 435 (M+H).

제조예 7

상대-N-3-[(3aR,6aS)-5-벤질-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-6a-일]-4-플루오로-페닐]아세트아미드

상대-3-[(3aR,6aS)-5-벤질-1-(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-6a-일]-4-플루오로-아닐린 (9.4 g, 22 mmol)을 DCM (110 mL), 4-디메틸아미노피리딘 (0.08 g, 0.65 mmol), 및 트리에틸아민 (6.1 mL, 43 mmol)에 첨가하고, 반응물을 0℃로 냉각시켰다. 아세트산 무수물 (3.4 g, 33 mmol)을 용액에 적가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 물 (140 mL)을 반응물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (100 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 라세미 시스 혼합물 (10.1 g, 100%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 477 (M+H).

제조예 8

5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 히드로클로라이드

TFA (4 L, 52.9 mol)를 DCM (12 L) 중 5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-1-[(4-메톡시페닐)메틸-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸 (1990 g, 4.45 mol)의 용액에 35℃ 미만의 온도를 유지하도록 하는 속도로 적가하였다. 첨가가 완결된 후, 혼합물을 33-43℃로 가온하고, 6시간 동안 교반하였다. NaOH (20%, 10 L)를 35℃ 미만의 온도를 유지하도록 하는 속도로 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 물 (6 L)로 세척하였다. 용액을 농축시키고, 에탄올 (16 L)을 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시키고, EtOAc (10 L)를 첨가하였다. EtOAc 중 4 M HCl (8 L)을 첨가하고, 생성된 고체를 여과하고, 건조시켜 표제 화합물 (1385 g, 85.6%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 327.1 (M+H)

제조예 9

[1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로-페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

탄산나트륨의 포화 수용액을 DCM (7 L) 중 5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 히드로클로라이드 (1400 g, 3.85 mol)의 용액에 첨가하여 pH>9에 이르도록 하였다. 층을 분리하고, 유기 추출물을 1.5 부피로 농축시켰다. HOAc (1.38 L)를 첨가하고, 용액을 2 L로 농축시켰다. HOAc (7 L) 및 아연 분말 (2.5 kg, 38.5 mol)을 첨가하고, 혼합물을 40-50℃로 가열하고, 3시간 동안 교반하였다. EtOAc (9.8L)를 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 EtOAc (4 L)로 세척하였다. 여과물을 분리하고, 물 (7 L)을 합한 유기부에 첨가하였다. 수산화암모늄을 첨가하여 pH ≥9에 이르도록 하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 2 L로 농축시켰다. 에탄올 (2.8 L)을 첨가하고, 용액을 2 L로 농축시켰다. 에탄올 (19 L)을 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하여 표제 화합물의 에탄올 용액을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 10

[(3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]암모늄;(2S,3S)-4-히드록시-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]-4-옥소-부타노에이트

디-p-톨루오일-L-타르타르산 1수화물 (1.04 kg, 2.69 mol)을 에탄올 (21 L) 중 [1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로-페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (1264 g, 3.85 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 65-75℃로 가열하고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 5-10℃로 냉각시키고, 시드 결정을 [(3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]암모늄;(2S,3S)-4-히드록시-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]-4-옥소-부타노에이트 (1.0 g)에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 필터 케이크를 차가운 에탄올 (1.4 L)로 세척하였다. 필터 케이크를 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다. 제2 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: IC 키랄팩, 4.6 mm * 250 mm * 5 μm; 용리액: 90% 헥산 (0.3% 디에틸아민): 10% 에탄올 (0.3% 디에틸아민); UV 270 nm, 유량 1.0 mL/분에서 R_t = 7.4분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99% ee) 거울상이성질체 (1050 g, 38% 포함)를 확인하였다.

¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ 2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H), 3.57-3.31(m, 3H), 3.66-3.58(m, 4H), 3.75-3.74(m, 2H), 5.38-5.36(m, 1H), 5.50-5.46(m, 1H), 5.88(s, 2H), 5.97-5.91(m, 1H), 7.10-7.05(m, 1H), 7.29(d, J=8.0 Hz, 4H), 7.53-7.51(m, 1H), 7.80-7.78(m, 1H), 8.01(d, J=8.0 Hz, 4H).

제조예 11

상대-1-[3-[(3S,4R)-3-아미노-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]-4-플루오로-페닐]프로판-2-온, 디-톨루엔술폰산

상대-N-3-[(3aR,6aS)-5-벤질-1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-6a-일]-4-플루오로-페닐]아세트아미드 (5.0 g, 11.0 mmol)를 물 (75 mL), 탄소 상 10% 팔라듐 (2.5 g, 23 mmol), p-톨루엔술폰산 (5.0 g, 26 mmol), 및 에탄올 (75 mL)에 첨가하고, 혼합물을 50 psi 수소 분위기 하에 실온에서 20시간 동안 수소화시켰다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, 패드를 에탄올 (100 mL)로 세척하고, 이어서 DCM (100 mL)으로 세척하였다. 여과물을 농축시켜 정량적 조 수율로 표제 화합물을 라세미 시스 혼합물 (8.1 g, >100%)로서 수득하였다. 물질을 직접 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/z): 268 (M+H).

제조예 12

((3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로-페닐)피롤리딘-3-일)메탄올

1 N HCl (500 mL, 500 mmol)을 EtOAc (500 mL) 중 [(3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]암모늄;(2S,3S)-4-히드록시-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]-4-옥소-부타노에이트 (100 g, 139.4 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 수성 층을 분리하고, pH를 1 N NaOH를 사용하여 8로 조정하였다. 수성 층을 EtOAc (350 mL x 2)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 (500 mL)로 세척하고, 농축시켜 표제 화합물 (40 g, 87%)을 수득하였다. 제2 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: IC 키랄팩, 4.6 mm * 250 mm * 5 μm; 용리액: 90% 헥산 (0.3% 디에틸아민): 10% 에탄올 (0.3% 디에틸아민); UV 270 nm, 유량 1.0 mL/분에서 R_t = 7.4분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99.7% ee) 거울상이성질체를 확인하였다.

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 2.78-2.70(m, 5H), 3.16-3.00(m, 3H), 3.87-3.75(m, 1H), 3.90-3.84(m, 1H), 5.24-5.11(m, 2H), 5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H), 7.35-7.32(m, 1H), 7.67- 7.65 (m, 1H).

제조예 13

상대-N-[3-[(3S,4R)-3-아미노-1-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]-4-플루오로-페닐]아세트아미드

상대-1-[3-[(3S,4R)-3-아미노-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]-4-플루오로-페닐]프로판-2-온, 디 톨루엔술폰산 (7.5 g, 12.3 mmol)을 ACN (75 mL)에 첨가하였다. 2-클로로-5-플루오로피리미딘 (2.44 g, 18.4 mmol) 및 DIPEA (7.5 mL, 43 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 70℃로 20시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 농축시켰다. 물 (50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 슬러리 형태로서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 진공 하에 실온에서 건조시켜 표제 화합물을 라세미 시스 혼합물 (3.0 g)로서 수득하였다. 나머지 수용액을 클로로포름 (3 x 20 mL)으로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시키고, 진공 하에 건조시켜 총 조 수율 (4.8 g, 110%)에 대한 추가의 표제 화합물 (1.8 g)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 364 (M+H).

제조예 14

N-(((3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드

벤조일 이소티오시아네이트 (15.0 g, 91.9 mmol)를 THF (400 mL) 중 ((3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로-페닐)피롤리딘-3-일)메탄올 (30 g, 91.1 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 용액을 25℃로 가온하고, 1시간 동안 교반하여 표제 화합물의 THF 용액을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 15

N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드, 디히드로클로라이드

트리페닐포스핀 (36.8 g, 140.3 mmol)을 N-(((3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (91.1 mmol)의 THF (400 mL) 용액에 첨가하였다. THF (100 mL) 중 디-t-부틸 아조디카르복실레이트 (31.6 g, 137.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20-30℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, MTBE (400 mL)를 첨가하였다. 용액을 규조토를 통해 여과하고, 케이크를 MTBE (130 mL)로 세척하였다. 여과물을 합하고, EtOAc 중 1 N HCl (200 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 500 mL까지 농축시켰다. MTBE (320 mL)를 첨가하고, 용액을 여과하고, 헵탄 (130 mL)으로 세척하였다. 고체를 EtOAc (650 mL) 중 슬러리화시키고, 50-60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 뜨거운 슬러리를 여과하고, 고체를 EtOAc (130 mL) 및 헵탄 (130 mL)으로 세척하였다. 고체를 EtOAc (650 mL) 중 재슬러리화시키고, 50-60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 뜨거운 슬러리를 여과하고, EtOAc (130 mL) 및 헵탄 (130 mL)으로 세척하였다. 고체를 건조시켜 표제 화합물을 디-HCl 염 (40 g, 80%, 99.5% ee)으로서 수득하였다. 제1 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: IC 키랄팩, 4.6 mm * 250 mm * 5 μm; 용리액: 85% 헥산 (0.1% 디에틸아민): 15% 이소프로필 알콜 (0.1% 디에틸아민); UV 282 nm, 유량 1.0 mL/분에서 R_t = 12.5분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99.5% ee) 거울상이성질체를 확인하였다.

제조예 16

N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-[2-플루오로-5-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]페닐]-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

15% 탄산나트륨 (440 mL)을 EtOAc (3 L) 및 물 (784 mL) 중 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드, 디히드로클로라이드 (495 g, 717.88 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1-2시간 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 실리카 겔 (40 g)을 통해 여과하고, EtOAc (600 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축 건조시켜 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드를 수득하였다. 트리플루오로아세트아미드 (136.7 g, 1.21 mol), NaI (182.5 g, 1.22 mol), 4 A 분자체 (342 g), 및 K₂CO₃ (170.9 g, 1.24 mol)을 DMSO (525 mL) 및 1,4-디옥산 (1.025 L) 중 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (341 g, 494.54 mmol)의 용액에 첨가하였다. DMSO (500 mL) 중 트랜스-N,N'-디메틸시클로헥산 (81.6 g, 573.66 mmol) 및 아이오딘화구리 (27.3 g, 143.34 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 100℃로 가온하고, 8시간 동안 교반하고, 24℃로 냉각시켰다. 물 (5.9 L) 및 DCM (5.9 l)을 첨가하고, 혼합물을 여과하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 (5.9 L)로 세척하여 DCM의 용액 중 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 17

상대-N-[(4aR,7aS)-7a-5-(아세트아미도)-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

THF (30 mL)를 상대-N-[3-[(3S,4R)-3-아미노-1-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]-4-플루오로-페닐]아세트아미드 (4.1 g, 11.0 mmol)에 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 0℃까지 냉각시키고, 벤조일 이소티오시아네이트 (1.50 mL, 11.0 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 30분에 걸쳐 실온으로 가온하도록 하였다. 1,1'-카르보닐디이미다졸 (1.9 g, 11.0 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 55℃로 가열하고, 추가로 18시간 동안 교반하였다. 물 (50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 추출하였다. 수성 층을 추가의 EtOAc (25 mL)로 추출하고, 농축 건조시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 EtOAc 중 50% DCM에 이어서 100% EtOAc로 용리시켜 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 라세미 시스 혼합물 (1.33 g, 26%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 509 (M+H).

제조예 18

N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드, 히드로클로라이드

NaOH (28.7 g) 및 물 (2.7 L)을 N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-[2-플루오로-5-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]페닐]-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드의 DCM 용액 (250 g, 494.4 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 24℃에서 68시간 동안 교반하였다. 1 N HCl (3.5 L)을 첨가하여 1-3의 pH를 수득하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (680 mL)으로 세척하였다. DCM (4 L)을 수성에 이어서 21% 수산화암모늄에 첨가하여 8-10의 pH를 수득하였다. 층을 분리하고, 유기 추출물을 합하고, 실리카 겔 (170 g)을 통해 여과하고, DCM (1.4 L)으로 세척하였다. 용매를 농축 건조시키고, EtOAc (4 L)로 희석하였다. EtOAc 중 1 N HCl (700 mL)을 25℃ 미만의 온도에서 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 약 7-8 부피로 농축시키고, EtOAc (2.8 L)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 여과하고, EtOAc (400 mL)로 세척하였다. 고체를 건조시켜 표제 화합물 (246 g, 52%)을 수득하였다.

제조예 19

N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로-페닐)-6-알릴-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

아세트산 무수물 (23.5g, 0.23 mol)을 DCM (800 mL) 중 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드, 히드로클로라이드 (100 g, 0.153 mol) 및 트리에틸아민 (54.3 g, 0.535 mol)의 용액에 첨가하였다. 20 - 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 포화 NaHCO₃ (700 mL) 및 물 (600 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하여 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 DCM 중 용액으로서 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 20

N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

트리페닐포스핀 (4.0g, 0.015 mol) 및 1,3-디메틸바르비투르산 (15.2 g, 0.097 mol)을 N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로-페닐)-6-알릴-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드의 DCM 용액 (0.153 mol)에 첨가하였다. 아세트산팔라듐 (1.7g, 7.7 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 내지 30℃에서 1시간 동안 교반하였다. 25% 수산화암모늄을 첨가하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 HOAc (물 500 mL 중 3.0 당량)로 세척하고, pH를 25% 수산화암모늄을 사용하여 8-9로 조정하였다. 수성 층을 DCM (2 x 500 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 3-4 부피로 농축시켰다. MTBE (1 L)를 첨가하고, 혼합물을 여과하였다. 혼합물을 농축시키고, 헵탄 (1 L)을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과하고, 수집하고, 건조시켜 표제 화합물 (48 g, 76%)을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 2.15 (s, 3H), 2.87-2.83(m, 1H), 3.43-3.23(m, 5H), 3.70-3.67(m, 1H), 7.12-7.07 (m, 1H), 7.28-7.27 (m, 1H), 7.52-7.41(m, 4H), 7.79(m, 1H), 8.18-8.16(m, 2H), ES/MS (m/z): 413.1 (M+H).

제조예 21

N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

2-클로로-5-플루오로피리미딘 (28.9 g, 218 mmol) 및 탄산칼륨 (33.46 g, 242.1 mmol)을 DMF (100 mL) 중 N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (50 g, 121.22 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 80-85℃로 8시간 동안 가열하였다. 혼합물을 24℃로 냉각시키고, 여과하고, DMF (100 mL)로 세척하였다. 고체를 물 (2 L)로 슬러리화하고, 여과하여 표제 화합물 (68.5g, 98%)을 수득하였다.

LC-MS: m/z=509.2 (M+H)⁺, ¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ ppm 1.22 (t, J = 7.28 Hz, 2 H) 1.92 - 2.07 (m, 6 H) 2.89 - 3.20 (m, 2 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.67 (t, J=9.54 Hz, 1 H) 3.84 (br. s., 1 H) 4.16 (br. s., 2 H) 7.23 (br. s., 2 H) 7.35 - 7.61 (m, 8 H) 7.77 (br. s., 2 H) 7.85 - 8.18 (m, 4 H) 8.48 (s, 4 H) 10.15 (br. s., 1 H) 10.46 - 10.59 (m, 1 H).

제조예 22

(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민

수산화리튬 (8.6 g, 204.9 mmol)을 메탄올 (400 mL) 중 N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (80 g, 157.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 60-70℃로 4시간 동안 가열하였다. 진한 HCl (132 g)을 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 30℃로 냉각시키고, 농축시켜 메탄올을 제거하였다. 물을 첨가하고, 수성 층을 DCM (3 x)으로 추출하여 표제 화합물을 총 질량의 5.6%가 표제 화합물인 920 g의 수용액으로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

대안적 제조예 22

황산 (33.4 ml, 626.6 mmol)을 TFA (626 mL) 중 (4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (45.8 g, 125,3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하였다. 발연 질산 (6.2 mL, 144.1 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 22℃로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, MTBE (250 mL)를 첨가하고, 2회 증발시켰다. 잔류물을 진공 하에 일정한 중량으로 건조시킨 다음, 물 (147 mL) 및 에탄올 (885 mL) 중에 용해시키고, 15분 동안 질소를 버블링하여 탈기하였다. 용액을 압력 반응기로 옮기고, 10% Pd/C 페이스트 유형 87 L (6.6 g, 6.27 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 추가의 에탄올 (700 mL)로 희석하고, 80 psi에서 수소로 16시간 동안 가압하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 제2 촉매 충전량을 10% Pd/C 페이스트 유형 87 L (6.6 g, 6.27 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 80 psi로 가압하고, 압력 반응기에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 질소로 퍼징하고, 규조토 상에서 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 물 (200ml)과 EtOAc (200 ml) 사이에 분배하였다. 수성 층을 분리하고, 5℃로 냉각시키고, 수산화암모늄 15% w/w로 중화시켰다. 수성 층을 EtOAc (3 x 150 mL)로 추출하였다. 유기부를 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 표제 화합물을 담갈색 고체 (47.7 g, 99%, 잔류 EtOAc 함유)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 363 (M+H).

제조예 23

벤질 N-알릴-N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트

톨루엔 (180 mL) 중 벤질 N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트 (50 g, 208.9 mmol)의 용액을 질소 하에 고체 수산화칼륨 (51.6 g, 919.69 mmol)으로 처리하였다. 10분 후, 벤질트리에틸암모늄 클로라이드 (0.8 g, 3.1 mmol)를 첨가하였다. 추가로 10분 후, 톨루엔 (50 mL) 중 알릴 브로마이드 (33 g, 272.8 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (44 g, 75%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 280 (M+H).

제조예 24

벤질 N-알릴-N-(2-옥소에틸)카르바메이트

포름산 (36.8 mL, 860 mmol) 및 물 (4.84 mL) 중 벤질 N-알릴-N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트 (30 g, 107 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 헥산/EtOAc (1:2) 및 물로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 염수 용액으로 pH=6까지 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜 표제 화합물 (25 g, 99%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 234 (M+H).

제조예 25

벤질 N-알릴-N-[2-히드록시이미노에틸]카르바메이트

ACN (150 mL) 중 벤질 N-알릴-N-(2-옥소에틸)카르바메이트 (25 g, 107 mmol)의 용액을 물 (75 mL) 중 히드록실아민 히드로클로라이드 (9.68 g, 139 mmol) 및 아세트산나트륨 3수화물 (16 g, 117.9 mmol)의 용액으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. ACN을 증발시키고, 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (24 g, 90%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 249 (M+H).

제조예 26

벤질 3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트

DCM (338 mL) 중 벤질 N-알릴-N-[2-히드록시이미노에틸]카르바메이트 (24 g, 96.6 mmol)의 용액을 차아염소산나트륨 (106.08 mmol, 143.06 mL)의 5% w/w 수용액으로 10분에 걸쳐 적가 처리하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 중아황산나트륨 (7 g)의 40% 수용액으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5% EtOAc로 용리시켜 정제하여 표제 화합물 (18 g, 75%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 247 (M+H).

제조예 27

벤질 6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트

n-부틸 리튬의 1.6 M 헥산 용액 (25.4 mL, 40.6 mmol)을 THF (60 mL) 중 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도벤젠 (12.22 g, 40.6 mmol)의 -78℃ 용액에 적가하여 황색 용액을 수득하였으며, 이를 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. 삼플루오린화붕소 에테레이트 (5.14 mL, 40.6 mmol)를 THF (60 mL) 중 벤질 3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트 (5 g, 20.3 mmol)의 별개의 -78℃ 용액에 첨가하고, 혼합물을 -78℃에서 5분 동안 교반하였다. 이 용액을 사전에 제조된 -78℃ 유기리튬 혼합물에 캐뉼라를 통해 첨가하였다. 합한 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 포화 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 실온으로 가온하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하고, 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 35분 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.27 g, 27%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 421/423 (M+H).

제조예 28

벤질 1-(벤조일카르바모티오일)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트

벤조일 이소티오시아네이트 (2.87 mL, 21.28 mmol)를 THF (95 mL) 중 벤질 6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트 (5.977 g, 14.2 mmol)의 용액에 적가하고, 질소 하에 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 30분 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 구배로 정제하여 표제 화합물 (6.05 g, 73%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 584/586 (M+H).

제조예 29

벤질 3-(벤조일카르바모티오일아미노)-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트

벤질 1-(벤조일카르바모티오일)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트 (6.05 g 10.4 mmol) 및 아연 (분진, <10 마이크로미터) (6.77 g, 103.5 mmol)의 혼합물을 HOAc (52 mL) 중에서 질소 하에 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc로 희석하고, 규조토를 통해 여과하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc, 물, 및 포화 수성 중탄산나트륨으로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하고, 합한 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 30분 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 구배로 정제하여 표제 화합물 (5.222 g, 86%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 586/588 (M+H).

제조예 30

벤질 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

1,1'-카르보닐디이미다졸 (2.87 g, 17.7 mmol)을 THF (52 mL) 중 벤질 3-(벤조일카르바모티오일아미노)-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (5.198 g, 8.86 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 다음, 반응물을 환류 하에 질소 하에 밤새 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 물로 희석하고, EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 30분 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.93 g, 58%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br). 568/570 (M+H).

제조예 31

N-[7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

아이오도트리메틸실란 (2.21 mL, 15.46 mmol)을 ACN (44 mL) 중 벤질 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (2.93 g, 5.15 mmol)의 실온 용액에 적가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 SCX 칼럼에 의해 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (2.098 g, 94%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 434/436 (M+H).

제조예 32

tert-부틸 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

디-t-부틸디카르보네이트 (1.16 g, 5.31 mmol) 및 트리에틸아민 (1.01 mL, 7.25 mmol)을 DCM (48 mL) 중 N-[7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (2.098 g, 4.83 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서 30분 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.556 g, 99%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 534/536 (M+H).

제조예 33

tert-부틸 7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

에탄올 (50 mL) 중 tert-부틸 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (2.556 g, 4.8 mmol) 및 트랜스-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 (150 mg, 1.1 mmol)의 용액을 아지드화나트륨 (933 mg, 14.3 mmol)으로 처리하였다. L-아스코르브산 나트륨 염 (0.66 M, 3.2 mL, 2.1 mmol) 및 물 (1 mL)의 수용액을 첨가하고, 플라스크의 상단을 질소로 퍼징하였다. 혼합물을 구리(II)술페이트 5수화물 (0.33 M, 3.2 mL, 1.1 mmol)의 수용액으로 처리하고, 혼합물을 즉시 예열된 핫플레이트 상에서 질소 하에 80℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 균질 혼합물을 가열 시 수득하였다. 반응물을 냉각시키고, 빙수로 희석하고, 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 아지드 생성물을 수득하였다. 조 아지드 생성물을 차가운 에탄올 (150 mL) 중 탄소 상 10% 팔라듐 (1 g)과 합하고, 혼합물을 진공/질소에 이어서 진공/수소를 사용하여 퍼징하였다. 혼합물을 30 psi의 수소 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 배출하고, 규조토를 통해 여과하고, 필터 케이크를 DCM으로 헹구었다. 용매를 여과물로부터 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서 DCM 중 50% EtOAc로 정제하여 표제 화합물 (2.014 g, 89%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 471 (M+H).

제조예 34

N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

TFA (10 mL)를 DCM (30 mL) 중 tert-부틸 7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (2.013 g, 4.28 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 SCX 칼럼에 의해 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (1.555 g, 98%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 371 (M+H).

제조예 35

라세미 N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (705 mg, 1.90 mmol), 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (1.01 g, 7.61 mmol), 및 DIPEA (1.66 mL, 9.52 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 (20 mL) 중에서 가열하여 4시간 동안 질소 하에 환류시켰다. 반응물을 냉각시키고, 물로 희석하고, EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 25분 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 구배로 정제하여 표제 화합물 (590 mg, 66%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 467 (M+H).

제조예 36

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드, (이성질체 1)

라세미 N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (1.694 g, 3.63 mmol)를 키랄 HPLC (칼럼: 키랄셀 OJ, 8 x 35 cm; 용리액: 90% 메탄올 (0.2% 디메틸에틸아민) 및 10% ACN; 유량 400 mL/분, UV 280 nm)에 의해 정제하였다. 제1 용리 이성질체의 분석 (칼럼: 키랄셀 OJ-H 0.46 x 15 cm; 용리액: 10:90 ACN:메탄올 (0.2% 디메틸에틸아민); 유량: 0.6 mL/분, UV 280 nm)에서 R_t = 6.70분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99% ee) 거울상이성질체 (723 mg, 43%)를 확인하였다. ES/MS (m/z): 467 (M+H).

제조예 37

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드, 이성질체 1

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드, 이성질체 1 (0.361 g, 0.77 mmol)을 DCM (4 mL) 및 DMF (0.5 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (240 mg, 1.55 mmol), HOBT (210 mg, 1.55 mmol) 및 EDCI (300 mg, 1.55 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 12 g 실리카 겔 로딩 칼럼 상에 직접 첨가하고, 40 g 실리카 겔 칼럼을 사용하여 0-100% EtOAc/헥산 구배로 용리시켜 정제하였다. 생성물을 EtOAc (200 mL) 중에 용해시키고, 1 N NaOH (2 x 50 mL)로, 및 염수 (1 x 50 mL)로 세척하였다. 실리카 겔 정제를 상기 기재된 바와 같이 반복하여 표제 화합물 (350 mg, 74%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 603 (M+H).

제조예 38

5-알릴-6a-(2-플루오로페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸

유동 화학 반응 단계: 343-ml 심리스 스테인레스강 관형 반응기 (OD=1/8 인치)를 GC 오븐 내부에 두고, 20 mL/분으로 20분 동안 톨루엔으로 플러싱하였다. 질소 (720 psig)의 배압을 적용하고, GC의 온도를 210℃로 설정하였다. 온도가 210℃에 도달된 후, 톨루엔 (5.81 L) 중 2-(디알릴아미노)-1-(2-플루오로페닐)에타논 옥심 (480.51 g, 1.74 mol)의 용액을 연속 모드로 작업하는 한 쌍의 고압 시린지 펌프를 사용하여 22.866 mL/분으로 반응기를 통해 펌핑하여 15분의 체류 시간을 제공하였다. 모든 원액이 소모된 후에 반응기를 22.866 mL/분으로 30분 동안 톨루엔으로 플러싱하였다. GC 오븐의 온도를 25℃로 설정하고, 전체 용액을 수집하고, 진공 하에 농축시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 DCM (2.5 L) 및 물 (5 L) 중에 용해시켰다. pH를 HCl을 사용하여 1로 조정하고, 수성 층을 분리하고, NaOH로 중화시켜 pH를 10으로 조정하였다. 수성 층을 MTBE (3 x 2.5 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물 (248 g, 47%)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/z): 249 (M+H).

제조예 39

1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

아연 분진 (590 g, 9 mol)을 메탄올 (2.85 L) 및 염화암모늄 포화 수용액 (3.56 L)의 혼합물 중 5-알릴-6a-(2-플루오로페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 (3559 g, 1.29 mol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응물을 60℃로 냉각시키고, THF (2.85 L)로 희석하고, 규조토 상에서 뜨거운 상태로 여과하였다. 여과물을 증발시켜 유기 용매를 제거하고, 수성 혼합물을 시트르산 10% w/w 수용액 (4 L) 및 EtOAc (3.5 L)로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 2 L)로 세척하였다. 수성 층을 NaOH 50% w/w로 중화시켜 pH를 10으로 조정한 다음, EtOAc (2 x 1.5 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물 (299 g, 92%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 251 (M+H).

제조예 40

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올; 2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산

1-메톡시-2-프로판올 (1.13 L) 중 디-p-톨루오일-L-타르타르산 (348.6 g, 884 mmol)의 용액을 사전에 40℃로 가열된 1-메톡시-2-프로판올 (1.13 L) 중 [(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (225.9 g, 902 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 22℃로 냉각시키고, 18시간 동안 교반하였다. 백색 고체를 여과에 의해 수집하고, 1-메톡시-2-프로판올 (600 ml)로 세척하였다. 수집된 고체를 건조시켜 표제 화합물 (183.01 g, 31.8%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 251 (M+H).

제조예 41

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올;2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산 (211 g, 331 mmol)을 물 (2.1 L) 및 EtOAc (2.3 L) 중에 용해시켰다. HCl 35% w/w를 첨가하여 pH를 1로 조정하였다. 수성 층을 분리하고, pH를 NaOH 50% w/w를 사용하여 10으로 조정하고, EtOAc (2x)로 추출하였다. 수성 층의 pH를 수성 NaOH를 사용하여 10으로 조정하고, 또한 수용액의 pH를 pH=10로 유지하면서 MTBE (3x)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 조 표제 화합물 (73 g, 88%, 94.8% ee)을 수득하였다. 생성물을 키랄 크로마토그래피: 칼럼 AS-H, 용리액 10% 이소프로필 알콜, 2% 이소프로필 아민; 유량 3 mL/분, UV 220; 35℃에서 100 bar의 압력에 의해 분석하여 표제 화합물을 R_f = 2.26분의 제2 용리 이성질체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 251 (M+H).

제조예 42

N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(2-플루오로페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

THF (2,3L) 중 [(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (129.7 g, 414 mmol)의 용액을 질소 분위기 하에 0℃에서 냉각시켰다. 벤조일 이소티오시아네이트 (61.5 mL, 456 mmol)를 5℃ 미만의 온도를 유지하면서 첨가하였다. 반응물을 3시간에 걸쳐 실온으로 가온하고, 1,1'-카르보닐디이미다졸 (87.4 g, 538.9 mmol)을 첨가하고, 반응물을 22℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 22℃로 냉각시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc (1 L) 및 물 (1 L)로 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 400 mL)로 추출하였다. 유기부를 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-40% DCM으로부터의 EtOAc / DCM의 구배로 용리시켜 정제하여 표제 화합물을 잔류 용매를 함유하는 연황색 고체 (170 g, 99%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 396 (M+H).

제조예 43

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

벤조산, 2-메르캅토- (122 g, 793 mmol), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐 (4.15 g, 7.21 mmol), 및 1,4-비스(디페닐포스피노)부탄 (3.14 g, 7.21 mmol)을 무수 2-메틸테트라히드로푸란 (1.96 L) 중 N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(2-플루오로페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (178.21 g, 360 mmol)의 용액에 질소 분위기 하에 첨가하였다. 용액을 진공 / 질소 사이클 3회에 의해 탈기한 다음, 질소를 반응물을 통해 15분 동안 버블링하였다. 반응물을 통해 버블링하면서 반응 혼합물을 40℃로 가열하였다. 반응물이 40℃에 도달하면, 버블링을 제거하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 22℃로 냉각시키고, 물 (2 L)로 희석하였다. HCl (5 M) 용액을 첨가하여 pH를 1로 조정하였다. 수성 층을 분리하고, 추가의 EtOAc (2 x 800 mL)로 세척하였다. 수성 층의 pH를 NaOH 50% w/w를 사용하여 10으로 조정한 다음, EtOAc (10 L)로 추출하였다. 수성 층을 추가의 EtOAc (2 x 750 mL)로 세척하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물을 연황색 고체 (124.7 g, 97%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 356 (M+H).

제조예 44

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

N-메틸피롤리돈 (997 mL) 중 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (124.7 g, 256 mmol), DIPEA (67 mL), 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (29.3 ml, 307 mmol)의 용액을 100℃로 16시간 동안 가열하였다. 반응물을 22℃로 냉각시키고, 15℃ 미만의 온도를 유지하면서 10℃로 냉각된 물 (10 L)에 주입하였다. 연한 크림색 고체를 여과에 의해 수집하고, 추가의 물로 세척하였다. 습윤 고체를 EtOAc (2 L) 중에 용해시키고, 분리기 깔때기로 옮겼다. 염화나트륨 수용액 5% w/w (1 L)를 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 감압 하에 증발시켰다. 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-40% EtOAc/이소헥산의 구배를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 연황색 고체 (116 g, 70%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 452 (M+H).

제조예 45

(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민

수산화리튬 (9.26 g, 386 mmol)을 메탄올 (1.6 L) 중 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (158.6 g, 351.6 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열한 다음, 22℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켜 황색 잔류물이 되도록 하였다. 잔류물을 물 (1 L) 및 EtOAc (750 mL)로 분배하였다. HCl (5 M 수용액)을 첨가하여 pH를 1로 조정하였다. 수성 층을 분리하고, 유기 층을 EtOAc (2 x 200 mL)로 세척하였다. 수성 층의 pH를 NaOH 50% w/w 수용액을 사용하여 pH=10으로 조정하고, EtOAc (3 x 1 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 조 표제 화합물을 연황색 고체 (133.3 g, 99%, 12% 잔류 EtOAc 함유)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 348 (M+H).

제조예 46

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 히드로클로라이드.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드, 이성질체 1 (0.350 g, 0.58 mmol)을 THF (2 mL)에 중에 용해시킨 다음, 메탄올 (4 mL) 및 에탄올 (4 mL)을 첨가하였다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (495 mg, 5.81 mmol) 및 피리딘 (470 μL, 5.81 mmol)을 혼합물에 첨가하고, 반응물을 50℃로 가온하고, 밤새 교반하였다. 실리카 겔 (~10 g)을 반응물에 첨가하고, 혼합물을 농축시켰다. 실리카 겔 상에서 건조시킨 샘플을 비어있는 카트리지 상에 로딩하고, DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0-10% 구배로 용리시켜 정제하였다. 생성물을 재차 SCX 칼럼 상에서 3:1 DCM:메탄올에 이어서 2:1 DCM:메탄올 중 7 N 암모니아를 사용하여 정제하였다. 생성물을 마지막으로 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0%에서 10% 구배로 정제하여 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다. 이 물질을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M HCl (0.20 mL, 660 μmol)을 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (71 mg, 23%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 498 (M+H).

X선 분말 회절 (XRD)

결정질 고체의 XRD 패턴을 CuKa 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 반텍 검출기가 구비되고 35 kV 및 50 mA에서 작동하는 브루커 D4 엔데버 X선 분말 회절계 상에서 수득하였다. 샘플을 2θ에서의 0.009°의 스텝 크기 및 0.5초/스텝의 스캔 속도, 및 0.6 mm 발산, 5.28 고정된 산란방지 슬릿, 및 9.5 mm 검출기 슬릿을 사용하여 2θ에서의 4 내지 40°를 스캔하였다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고, 평활면을 유리 슬라이드를 사용하여 수득하였다. 결정 형태 회절 패턴을 주위 온도 및 상대 습도에서 수집하였다. 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 회절 피크의 상대 강도가 결정 형태 및 습성과 같은 요인으로부터 생성된 바람직한 배향으로 인해 변할 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 게다가, 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 각도 피크 위치는 약간 변할 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변동, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동될 수 있다. 본 경우에, 2θ에서의 ± 0.2의 피크 위치 변동성은 나타낸 결정 형태의 명백한 확인을 저해하지 않으면서 이러한 잠재적 변동을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 특징적인 피크 (° 2θ의 단위), 전형적으로 보다 현저한 피크의 임의의 고유한 조합을 기준으로 수행될 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴을 8.853 및 26.774 도 2-세타에서의 NIST 675 표준 피크를 기준으로 하여 조정하였다.

제조예 47

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (수화됨)

옥살릴 클로라이드 (888 μL, 10.2 mmol)를 ACN (53 mL) 및 DMF (848 μL) 중 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (1.6 g, 10.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 15분 후, 새로이 제조된 용액을 사전에 50℃로 가열된 물 (53 mL) 및 에탄올 (53 mL)의 혼합물 중 (4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (2.65 g, 7.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하고, 22℃로 냉각시킨 다음, 이 온도에서 밤새 교반하였다. 유기 용매를 진공 하에 증발시키고, 수성 혼합물을 NaOH 50% w/w 수용액으로 처리하여 pH= 10으로 조정하였다. 연한 크림색 고체를 단리시키고, 추가의 물로 세척하였다. 고체를 이소프로필 알콜 (2x)로 희석하고, 용매를 증발시켰다. 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 암모니아화 메탄올 (2 N) / DCM의 구배를 사용하여 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체 (1.9 g, 52%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 499 (M+H).

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (수화됨)의 대안적 제조

ACN (500 mL)을 DMF (19.2 mL, 248.9 mmol)에 첨가하였다. 옥살릴 클로라이드 (39.3 g, 309.63 mmol)에 이어서 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (46.0 g, 298.4 mmol)을 DMF/ACN 용액에 첨가하였다. 분리형 플라스크에서, (4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (56.8 g, 156.75 mmol)의 수용액을 ACN (500 mL)에 첨가하고, pH를 수산화암모늄 (95 mL)을 사용하여 9로 조정하였다. 이어서, 이 혼합물을 50-55℃로 가열하였다. 옥살릴 클로라이드 용액을 적가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. pH를 수산화암모늄을 사용하여 8-9로 조정하였다. 생성된 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물 (123 g)을 수득하였다. 고체를 아세톤 (250 mL) 중 1.5시간 동안 슬러리화시키고, 여과하였다. 습윤 케이크를 아세톤으로 세척하여 표제 화합물 (110 g, 90.5% 순도, HPLC에 의함)을 수득하였다. THF (1 L) 및 활성탄 (9 g)을 고체에 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, THF (150 mL)로 세척하였다. 유기 용액을 10 부피로 농축시키고, 60℃로 가열하였다. 물 (430 mL)을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 10시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, THF/물 (7:6)로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물 (69 g, 88%)을 수득하였다.

LC-MS: (m/z) 499 (M+H), 순도: 98.3%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.99 - 3.07 (m, 2 H) 3.07 - 3.14 (m, 1 H) 3.58 - 3.67 (m, 1 H) 3.68 - 3.76 (m, 1 H) 3.76 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 (s, 3 H) 4.07 (d, J=10.92 Hz, 1 H) 6.08 (s, 2 H) 7.19 (dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H) 7.78 - 7.89 (m, 2 H) 8.41 (s, 1 H) 8.44 (s, 2 H) 8.88 (s, 1 H) 10.60 (s, 1 H).

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (수화됨)의 제조를 위한 일반적 절차

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드를 THF 중에 약 23℃에서 약 71 mg/mL 용매 농도로 슬러리화하였다. 슬러리를 용해하도록 (약 60℃ 내지 약 63℃에서 일어남) 교반하면서 가열하였다. 물을 뜨거운 용액에 첨가하여 약 95:5의 THF:물 용매 비를 수득하였다. 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 시드 결정 (약 3 중량% 로딩량)을 첨가하였다. 생성된 묽은 슬러리를 약 60℃ 내지 약 63℃에서 약 20분 동안 유지한 다음, 약 5.3 내지 약 5.5 부피의 물을 약 2 내지 약 4시간에 걸쳐 첨가하여 약 69:31의 THF:물 용매 비를 생성하였다. 이어서, 슬러리를 약 60℃ 내지 약 63℃에서 약 30분 동안 유지시킨 다음, 약 23℃에서 약 1시간에 걸쳐 냉각시킨 다음, 약 8-12시간 동안 교반하였다. 이어서, 슬러리를 여과하고, THF:물 (35:65)로 약하게 헹구고, 감소된 진공 하에 약 40℃에서 약 8-12시간 동안 건조시켜 목적 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드를 수득하였으며, 이를 수화시켰다.

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 제조된 샘플을 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 하기 표 1에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로 특징화하였다. 구체적으로, 패턴은 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 18.6°, 19.3°, 및 26.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 11.8°에서의 피크를 함유하였다.

표 1: 결정질 형태 2의 X선 분말 회절 피크.

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드는 실온 및 약 15% 초과의 상대 습도에서 안정한 결정 형태이다.

제조예 48

결정질 형태 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드.

열중량측정 분석 팬에 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드를 로딩하고, 약 170℃로 가열하고, 170℃에서 약 5분 동안 유지하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시켜 표제 화합물을 수득하였다.

결정질 형태 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 대안적 제조.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (121 mg)를 ACN (5 mL)과 바이알에서 합하고, 90℃의 교반 플레이트 상에서 가열하였다. 약 30분 후에, 대부분의 고체가 용해되어, 탁한 용액을 수득하였다. 형태 3 시드를 첨가하고, 샘플을 약 90℃에서 약 1시간 동안 교반하였다. 가열을 제거하고, 혼합물을 교반하여 밝은 백색 고체를 수득하였다. 고체를 진공 여과에 의해 단리시키고, 공기 스트림 하에 약 10분 동안, 이어서 감소된 진공 하에 약 80℃에서 약 8 내지 12시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.

결정질 형태 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 제조된 샘플을 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 하기 표 2에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로 특징화하였다. 구체적으로, 패턴은 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 18.1°, 27.0°, 및 19.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 15.7°에서의 피크를 함유하였다.

표 2: 결정질 형태 3의 X선 분말 회절 피크.

실시예 1

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 톨루엔술폰산

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 수화물 (149.15 mg)을 에틸 아세테이트 (2 mL)에 첨가하였다. 샘플을 80℃의 온도에서 1000 rpm에서 교반하였다. p-톨루엔술폰산 (에틸 아세테이트 (1 mL) 중 용해된 70 mg)을 교반하는 용액에 첨가하고, 이것을 80℃에서 밤새 교반하여 백색 고체 슬러리를 수득하였으며, 이를 진공 여과에 의해 단리시켜 표제 화합물을 수득하였다.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 톨루엔술폰산의 대안적 제조 A

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (9.5 g, 19 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (3.80 g, 19.8 mmol)을 테트라히드로푸란 (31 mL), 물 (7.9 mL), 및 2-프로판올 (8.6 mL)에 첨가하였다. 용액을 40℃로 가열하였다. 따뜻한 용액에 2-프로판올 (200.0 mL)을 대략 3시간에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 2-프로판올 첨가 시작 직후에 표제 화합물 (500 mg, 0.75 mmol)의 일부로 시딩하였다. 용매 첨가가 완결된 후, 혼합물을 1-3시간에 걸쳐 대략 20℃로 냉각시켰다. 혼합물을 2시간의 표적 시간에 걸쳐 대략 20℃에서 대략 55℃로 가열하였다. 온도를 55℃에서 1시간 동안 유지한 다음, 대략 4시간에 걸쳐 약 20℃로 냉각시켰다. 슬러리를 대략 20℃에서 적어도 10시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 습윤 케이크를 물 (57 mL)로 세척하였다. 생성물을 진공 하에 45℃에서 적어도 10시간 동안 건조시켜 표제 화합물 (10.4 g, 81%)을 수득하였다. ES/MS (m/z): 500 (M+H).

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 톨루엔술폰산의 대안적 제조 B

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 수화물 (20.7 g)을 질소 버블러, 테플론 바나나 블레이드를 갖는 유리 샤프트에 부착된 IKA® 기계적 모터/교반기, 및 프로그램가능한 J-KEM® 온도 제어기에 연결된 열전쌍이 구비된 500 mL 3구 둥근 바닥 플라스크 중 60:40 THF:H₂O (85 mL)에 170 rpm으로 슬러리화하였다. p-톨루엔술폰산 1수화물 (7.6 g, 1.03 당량)을 60:40 THF:H₂O의 혼합물 (20 mL) 중에 용해시키고, 용액을 23℃에서의 교반 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 슬러리에 모두 한 번에 첨가하여, 거의 즉시 투명한 적색빛 황갈색 용액을 수득하였다. 이어서, 교반 속도를 15분에 걸쳐 200 rpm으로 증가시키고, 물 (22 mL)을 용액에 첨가하고, 이어서 이를 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 톨루엔술폰산 (750 mg, 3 중량% 시드 로딩)으로 시딩하고, 23℃에서 추가로 15분 동안 교반하였다. 6시간에 걸쳐, 물 (226 mL, 총 용매 353 mL; 또는 13.6 vol., 최종 용매 비 17.5:82.5 THF:H₂O)을 슬러리에 첨가하고, 이어서 이를 23℃에서 밤새 (22시간) 교반하였다. 슬러리를 진공을 통해 여과하고, 15:85 THF:H₂O (2x20 mL)으로 헹구고, 진공 하에 20분 동안 정치시키면서 생성물 습윤 케이크에 형성되는 균열을 수동으로 가압 폐쇄하였다. 습윤 고체를 진공 하에 40℃에서 약 72시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 백색 결정질 고체 (24.07 g, 90.0 중량%)로서 수득하였다.

결정질 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 톨루엔술폰산을 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 하기 표 3에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값), 및 특히 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 19.6°, 13.8° 및 18.5°로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합된 5.0°의 회절각 2-세타에서 피크를 갖는 것으로 특징화하였다.

표 3: 결정질 실시예 1의 X선 분말 회절 피크

약 15% 미만의 상대 습도에서는, N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐}-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 유리 염기의 결정질 형태 1이 존재하고, 반면에 약 15% 초과의 상대 습도에서는, N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐}-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 결정질 형태 2가 우세하다는 것이 밝혀진 바 있다. 이러한 물리적 불안정성은 특히 제약 약물 물질 또는 약물 제품에 대해 바람직하지 않으며, 이들 둘 다가 고체 상태 형태에 관한 조절적 제어를 받는다. 유리 염기의 결정질 형태와 달리, 토실레이트 염은 광범위한 상대 습도 (5-95%)에 걸쳐 개선된 물리적 안정성을 갖는다. 이와 같이, N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐}-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염은 상응하는 결정질 유리 염기 형태와 연관된 습도 의존성 상 변환을 본질적으로 회피한다. 게다가, N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐}-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염은 N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐}-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 HCl 염의 경우에 보유된 약 7.7% 용매와 비교 시 약 1.3%의, 결정에 보유된 용매의 실질적으로 보다 낮은 양을 갖는 것으로 밝혀졌다. 유리 염기가 장기간 저장 동안 상 전이를 겪을 증가된 가능성은 약물 제품의 성능을 손상시킬 수 있는 특성, 예컨대 용해도 또는 용해 속도로 이어질 수 있다. 이는 또한 무정형 형태로의 결정 구조(들)의 붕괴 또는 결함 및 장애의 축적의 추가의 위험을 초래하며, 이는 약물 제품의 화학적 불안정성 및 감소된 저장 수명으로 이어질 수 있다.

시험관내 검정 절차:

시험관내 효소 및 세포 검정을 위해, 시험 화합물을 DMSO 중에서 제조하여 10 mM 원액을 만들었다. 원액을 DMSO 중에서 연속적으로 희석하여 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 10 mM 내지 0.05 nM 범위의 최종 화합물 농도로 10-포인트 희석 곡선을 산출한 후에, 시험관내 효소 및 전세포 검정을 수행하였다.

시험관내 프로테아제 억제 검정:

인간 BACE1의 발현

인간 BACE1 (수탁 번호: AF190725)을 총 뇌 cDNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 아미노산 서열 #1 내지 460에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 인간 IgG₁ (Fc) 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA에 삽입하였다 (Vasser et al., Science, 286, 735-741 (1999)). huBACE1:Fc로 명명되는 BACE1(1-460) 및 인간 Fc의 이러한 융합 단백질을 pJB02 벡터에 구축하였다. 인간 BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc)를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현하였다. 각 구축물의 cDNA 250 μg을 퓨젠(Fugene) 6과 혼합하고, 1 리터 HEK293 세포에 첨가하였다. 형질감염 4일 후에, 조건화 배지를 정제를 위해 수확하였다.

huBACE1:Fc의 정제.

huBACE1:Fc를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 효소를 작은 분취량으로 -80℃에서 보관하였다.

BACE1 FRET 검정

시험 화합물의 일련의 희석액을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 화합물을 KH₂PO₄ 완충제 중에서 20x 추가 희석하였다. 10 μL의 각 희석액을 반응 혼합물 (25 μL의 50 mM KH₂PO₄, pH 4.6, 1 mM 트리톤(TRITON)® X-100, 1 mg/mL 소 혈청 알부민, 및 15 μM의 FRET 기질)을 함유하는 상응하는 저 단백질 결합 흑색 플레이트의 A열 내지 H열의 각 웰에 첨가하였다 (문헌 [Yang, et al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)] 참조). 내용물을 플레이트 진탕기 상에서 10분 동안 잘 혼합하였다. KH₂PO₄ 완충제 중 200 pM 인간 BACE1(1-460):Fc (문헌 [Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조) 15 μL을 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트에 첨가하여 반응을 개시하였다. 플레이트 진탕기 상에서 간단히 혼합한 후, 시간 0에서의 혼합물의 RFU를 여기 파장 355 nm 및 방출 파장 460 nm에서 기록하였다. 반응 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 어둡고 습한 오븐에서 실온에서 16 내지 24시간 동안 유지하였다. 인큐베이션의 종료 시 RFU를 시간 0에 사용된 동일한 여기 및 방출 설정으로 기록하였다. 시간 0 및 인큐베이션의 종료 시 RFU의 차이는 화합물 처리 하에서의 BACE1의 활성을 나타내었다. RFU 차이를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고, 곡선을 4-파라미터 로지스틱 방정식에 대입하여, EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 구하였다. (문헌 [Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)] 참조).

제조예 46의 화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였으며, 0.615 nM (± 0.101, n=5) [평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차]의 BACE1 IC₅₀을 나타내었다. 이러한 데이터는 제조예 46의 화합물이 시험관내 정제된 재조합 BACE1 효소 활성을 억제한다는 것을 입증한다.

PDAPP 1차 뉴런 검정

확진 전세포 검정을 또한 PDAPP 트랜스제닉 배아 마우스로부터 생성된 1차 뉴런 배양물에서 수행하였다. 1차 피질 뉴런을 배아의 제16일 PDAPP 배아로부터 제조하고, 96 웰 플레이트 (DMEM/F12 (1:1) 플러스 10% FBS 중 15 x 10⁴개 세포/웰)에서 배양하였다. 시험관내에서 2일 후, 배양 배지를 B27 보충물 및 2 μM (최종)의 아라-C(Ara-C) (시그마(Sigma), C1768)를 함유하는 무혈청 DMEM/F12 (1:1)로 대체하였다. 시험관내 제5일에, 뉴런을 목적하는 농도의 억제제 (DMSO 중에 희석됨)의 존재/부재 하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 시, 조건화 배지를, 예를 들어 A베타 펩티드의 분석에 의해 베타-세크레타제 활성의 증명을 위해 분석하였다. 총 A베타 펩티드 (A베타 1-x)를 포획 항체로서 모노클로날 266 및 리포팅 항체로서 비오티닐화 3D6을 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 대안적으로, A베타 1-40 및 A베타 1-42 펩티드를 A베타 1-40의 경우에 포획 항체로서 모노클로날 2G3 및 A베타 1-42의 경우에 포획 항체로서 모노클로날 21F12를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. A베타 1-40 및 A베타 1-42 ELISA 둘 다는 리포팅 항체로서 비오티닐화 3D6을 사용하였다. 화합물 처리 후 조건화 배지 중에 방출된 A베타의 농도는 이러한 조건 하에서의 BACE1의 활성에 상응하였다. 10-포인트 억제 곡선을 플롯팅하고, 4-파라미터 로지스틱 방정식에 대입하여 A베타-저하 효과에 대한 EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 구하였다. 제조예 46의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였으며, A베타 저하 효과에 대해 하기 활성을 나타내었다.

표 4

평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차

이들 데이터는 제조예 46의 화합물이 전세포의 A베타 생산을 억제한다고 입증한다.

베타-세크레타제의 생체내 억제

마우스, 기니 피그, 개, 및 원숭이를 포함한 여러 동물 모델을 사용하여 화합물 처리 후의 생체내 베타-세크레타제 활성의 억제에 대해 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 사용된 동물은 야생형, 트랜스제닉, 또는 유전자 녹아웃 동물일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)]에 기재된 바와 같이 제조된 PDAPP 마우스 모델, 및 다른 비-트랜스제닉 또는 유전자 녹아웃 동물은 억제 화합물의 존재 하에 생체내 A베타 및 sAPP베타 생산의 억제를 분석하는데 유용하다. 일반적으로, 2 내지 12월령의 PDAPP 마우스, 유전자 녹아웃 마우스 또는 비-트랜스제닉 동물에게 비히클, 예컨대 옥수수 오일, 시클로덱스트란, 포스페이트 완충액, 파마솔브(PHARMASOLVE)®, 또는 다른 적합한 비히클 중에 제제화된 화합물을 투여하였다. 화합물 투여 1 내지 24시간 후, 동물을 희생시키고, 뇌 뿐만 아니라 뇌척수액 및 혈장을 A베타, C99 및 sAPP 단편의 분석을 위해 제거하였다. 문헌 [May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)] 참조).

표준 생체내 약동학 연구를 위해, 동물에게 다양한 농도의 화합물을 투여하였고, 동일한 시간에 투여한 비히클-처리 대조군과 비교하였다. 일부 시간 경과 연구를 위해, 시간 0에서 시작하여 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액을 선택된 동물로부터 수득하여, 기준선을 수립하였다. 화합물 또는 적절한 비히클을 다른 군에 투여하고, 투여 후 다양한 시점에 희생시켰다. 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액을 선택된 동물로부터 수득하여, A베타 펩티드, sAPP베타 및 다른 APP 단편을 포함한 APP 절단 생성물의 존재에 대해 예를 들어 특이적 샌드위치 ELISA 검정에 의해 분석하였다. 시험 기간의 종료 시, 동물을 희생시키고, 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액을 적절한 경우에 A베타 펩티드, C99 및 sAPP베타의 존재에 대해 분석하였다. APP 트랜스제닉 동물의 뇌 조직을 또한 화합물 처리 후 베타-아밀로이드 플라크의 양에 대해 분석하였다. 본원에 사용된 "A베타 1-x 펩티드"는 잔기 1로 시작하여 잔기 28초과의 C-말단으로 종결하는 A베타 종의 합을 지칭한다. 이는 대부분의 A베타 종을 검출하고, 종종 "총 A베타"로 불린다.

억제 화합물을 투여한 동물 (PDAPP 또는 다른 APP 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 마우스)은 비히클-처리 대조군 또는 시간 0 대조군과 비교 시, 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액에서 A베타 또는 sAPP베타의 감소, 및 뇌 조직에서 베타 아밀로이드 플라크의 감소를 입증할 수 있다. 제조예 46에서, 화합물의 0.3, 1 또는 3 mg/kg 경구 용량의 투여 3시간 후에, A베타 1-x 펩티드 수준은 각각 비히클-처리 마우스와 비교 시 뇌 해마에서는 대략 31%, 39%, 및 61%, 및 뇌 피질에서는 대략 28%, 42%, 및 64% 감소하였다.

시험관내 BACE 효소에 대한 제조예 46의 활성을 고려하면, 이들 A베타 저하 효과는 생체내 BACE 억제와 일치하고, 추가로 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 CNS 침투를 입증한다.

Claims

결정질이고 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 토실레이트 염인 화합물이며,
상기 결정질 토실레이트 염은 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 하기 표에 열거된 회절각 2-세타에서의 X선 회절 스펙트럼에서의 피크를 특징으로 하는 화합물:
유효량의 제1항에 따른 화합물을 포함하는, 환자에서 알츠하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
유효량의 제1항에 따른 화합물을 포함하는, 환자에서 경도 인지 손상에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하기 위한 제약 조성물.
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