KR101871128B1

KR101871128B1 - 항-N3pGlu A베타 항체 + BACE 억제제를 사용하는 조합 알츠하이머 요법

Info

Publication number: KR101871128B1
Application number: KR1020177006748A
Authority: KR
Inventors: 페트릭 코넬리우스 메이; 더스틴 제임스 머고트
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2018-06-25
Also published as: EA031764B1; US9999624B2; IL250387A0; PH12017500493A1; BR112017003571A2; AU2015318257A1; CO2017001875A2; ECSP17015977A; TWI599358B; JP2017529348A; AR101740A1; WO2016043997A1; CL2017000558A1; DOP2017000071A; SG11201701330PA; TN2017000072A1; JP6339741B2; CN106687136A; AU2015318257B2; PE20170464A1

Abstract

본 발명은 인지 또는 신경변성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합된, 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 신경변성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
<화학식 I>

Description

항-N3pGlu A베타 항체 + BACE 억제제를 사용하는 조합 알츠하이머 요법 {COMBINATION ALZHEIMER THERAPY USING ANTI-N3PGLU ABETA ANTIBODIES + A BACE INHIBITOR}

본 발명은 BACE 억제제와 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 조합물, 및 특정 신경계 장애, 예컨대 알츠하이머병을 치료하기 위한 그의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명은 알츠하이머병, 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 신경독성 및 고도의 집합성 펩티드 절편인 아밀로이드 β (A베타) 펩티드를 수반하는 다른 질환 및 장애의 치료 분야에 있다. 알츠하이머병은 전세계적으로 수백만명의 환자에게 영향을 미치는 파괴적인 신경변성 장애이다. 환자에게 단지 일시적, 징후적 이익을 제공하는 시판되는 현재 승인된 작용제의 관점에서, 알츠하이머병의 치료에 있어서 상당한 미충족 필요가 존재한다.

알츠하이머병은 뇌에서의 A베타의 생성, 응집 및 침착을 특징으로 한다. 베타-세크레타제 (베타-부위 아밀로이드 전구체 단백질-절단 효소; BACE)의 완전 또는 부분 억제는 마우스 모델에서 플라크-관련 및 플라크-의존성 병리상태에 대한 유의한 효과를 갖는 것으로 제시된 바 있다. 이는 심지어 A베타 펩티드 수준의 작은 감소조차도 플라크 부담 및 시냅스 결핍의 장기간 유의한 감소를 생성하여, 따라서 특히 알츠하이머병의 치료에서 유의한 치료 이익을 제공할 수 있다.

더욱이, N3pGlu A베타를 특이적으로 표적화하는 항체는 생체내 플라크 수준을 감소시키는 것으로 제시된 바 있다 (US 2013/0142806). N3pE 또는 A베타_p3 _-42로서도 지칭되는 N3pGlu A베타는 단지 플라크에서만 발견되는 A베타 펩티드의 말단절단된 형태이다. N3pGlu A베타 펩티드는 뇌 내의 침착된 A베타의 부차적 성분이긴 하지만, 연구는 N3pGlu A베타 펩티드가 공격적인 응집 특성을 갖고 침착 캐스케이드에서 초기에 축적된다는 것을 증명한 바 있다.

BACE 억제제와 N3pGlu A베타 펩티드에 결합하는 항체의 조합물은 어느 하나의 약물 단독보다 더 효과적일 수 있는 A베타 펩티드-매개 장애, 예컨대 알츠하이머병에 대한 치료를 제공하고자 한다. 예를 들어, 이러한 조합물을 사용하는 치료는 단독으로 사용되는 각각의 약물과 비교하여, 어느 한쪽 또는 둘 다의 약물의 낮은 용량의 사용을 허용하여, 잠재적으로 효능을 유지하면서 보다 낮은 부작용으로 이어질 수 있다. N3pG 항체 및 BACE 억제제를 사용한 A베타의 침착된 형태의 제거를 목표로 하는 것은 기존 플라크 침착물의 식세포 제거를 용이하게 하면서 동시에 A베타의 생성을 억제함으로써 A베타의 추가의 침착을 감소시키거나 방지할 것이다.

US 2009/0209755는, BACE 억제 활성을 보유하며 추가로 Aβ 펩티드에 의해 유발된 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머 유형 치매에 대한 유용한 치료제로서 개시되어 있는 융합된 아미노디히드로티아진 유도체를 개시하고 있다. 또한, 문헌 [J. Neuroscience, 31(46), pages 16507-16516 (2011)]은 경구로 투여되는 CNS-활성 BACE 억제제인 (S)-4-(2,4-디플루오로-5-피리미딘-5-일-페닐)-4-메틸-5,6-디히드로-4H-[1,3]티아진-2-일아민을 개시하고 있다. 미국 특허 번호 8,278,334는 치환된 시클릭 아민 BACE-1 억제제를 항-아밀로이드 항체와 함께 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 신경변성 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있다. 추가로, 문헌 [J. Neuroscience, 34(35), pages 11621-11630 (2014)]은 BACE 억제제 및 항-A베타 항체 간테네루맙을 사용하는 조합 치료가 APP_London 마우스에서의 아밀로이드 감소를 증진시킨다는 것을 개시하고 있다.

따라서, 본 발명은 인지 또는 신경변성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 BACE 억제제를 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 신경변성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 인지 또는 신경변성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 신경변성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서, R은 H 또는 F이고;

A는

이다.

본 발명은 또한 A베타의 형성 및 침착을 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, A베타의 형성 및 침착을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 경도 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 경도 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 경도 인지 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 경도 인지 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 전구 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 전구 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행의 예방을 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행의 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)을 치료하는 방법을 제공한다.

게다가, 본 발명은, 요법에 사용하기 위한, 특히 알츠하이머병, 경도 알츠하이머병, 전구 알츠하이머병의 치료를 위한 또는 알츠하이머병으로의 경도 인지 장애의 진행의 예방을 위한, 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합된, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 추가로 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와의 제약 조성물과 조합된, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명은 추가로 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물, 및 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 본원에 사용된 "키트"는 단일 패키지 내의, 하나의 성분은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이고, 또 다른 성분은 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체인 각각의 성분의 개별 용기를 포함한다. "키트"는 또한 개별 패키지 내의, 하나의 성분은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이고, 또 다른 성분은 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체인 각각의 성분의 개별 용기를 각각의 성분을 조합물로서 투여하는 것에 대한 지침서와 함께 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 알츠하이머병, 경도 알츠하이머병, 전구 알츠하이머병의 치료 또는 알츠하이머병으로의 경도 인지 장애의 진행의 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 조합물의 용도를 제공한다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 2014년 3월 25일에 허여된 "항-N3pGlu 아밀로이드 베타 펩티드 항체 및 그의 용도" 명칭의 미국 특허 번호 8,679,498 B2 (USSN 13/810,895)에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, "항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체", 및 특이적 항체, "B12L" 및 "R17L"가, 상기 항체를 제조하고 사용하는 방법과 함께 확인되고 개시된다는 것을 인지하고 인식할 것이다. 예를 들어 미국 특허 번호 8,679,498 B2의 표 1을 참조한다.

또한, 본 발명에 사용되는 특정 항체에 대한 아미노산 서열은 표 A에 하기 제공된다:

표 A-항체 서열식별번호(SEQ ID NO)

인지 또는 신경변성 질환은 알츠하이머병, 경도 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 전구 알츠하이머병, 뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 다운 증후군 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하기 위한" 또는 "치료"는 기존 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 정지, 감소 또는 역전시키는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "환자"는 인간을 지칭한다.

용어 "A베타 펩티드의 생산의 억제"는 환자에서 A베타 펩티드의 생체내 수준을 감소시키는 것을 의미하는 것으로 여겨진다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시에, 진단 또는 치료 하에 있는 환자에서 목적하는 효과를 제공하는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량, 및 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 양 또는 용량을 지칭한다. 조합 요법은 본 발명의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 함께 신체에서 화학식 I의 화합물 및 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 유효 수준을 제공하는 임의의 방식으로 투여함으로써 수행되는 것으로 이해된다.

유효량은 공지된 기술의 사용에 의해 및 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자로서의 담당 진단자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자를 위한 유효량을 결정하는데 있어서, 환자의 종; 그의 크기, 연령 및 전반적 건강; 수반되는 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정한 화합물; 투여 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특징; 선택되는 용량 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 환경을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 담당 진단자에 의해 고려된다.

화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염은 본 발명의 조합물에서 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상적으로 약 0.1 mg/일 내지 약 1000 mg/일, 바람직하게는 약 0.1 mg/일 내지 약 500 mg/일, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 mg/일 내지 약 100 mg/일의 범위에 포함된다. 또한, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체는 일반적으로 본 발명의 조합물에서 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1주 투여량은 통상적으로 약 0.1 내지 10 mg/kg/주, 바람직하게는 약 0.3 내지 약 6 mg/kg/주, 및 가장 바람직하게는 약 0.3 mg/kg/주 내지 약 3 mg/kg/주의 범위에 포함된다. 일부 경우에는 상기 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 적절량보다 클 수 있는 반면에, 다른 경우에는 보다 더 큰 용량이 허용되는 부작용 하에 이용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지는 않는다.

본 발명의 BACE 억제제 및 항체는 바람직하게는 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 투여 경로는 약물의 물리적 특성 및 환자 및 보호자의 편의에 의해 제한된 임의의 방식으로 변경될 수 있다. 바람직하게는, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체 조성물은 비경구 투여, 예컨대 정맥내 또는 피하 투여를 위한 것이다. 또한, BACE 억제제, 예컨대 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 정맥내 또는 피하 투여를 포함한, 경구, 비경구 또는 경피 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006] 참조).

본원에 사용된 어구 "조합하여"는 BACE 억제제, 예컨대 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체, 예컨대 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 동시에, 또는 순차적으로 임의의 순서로, 또는 그의 임의의 조합을 투여하는 것을 지칭한다. 2종의 분자는 동일한 제약 조성물의 일부로서 또는 개별 제약 조성물로 투여될 수 있다. BACE 억제제는 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 투여 이전에, 이와 동시에, 또는 이에 후속적으로, 또는 그의 일부 조합으로 투여될 수 있다. 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 반복된 간격으로 (예를 들어 치료의 표준 과정 동안) 투여되는 경우에, BACE 억제제는 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 각각의 투여 이전에, 이와 동시에, 또는 이에 후속적으로 또는 그의 일부 조합으로, 또는 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체를 사용하는 요법에 관하여 상이한 간격으로, 또는 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체를 사용하는 치료 과정 이전에, 그 동안의 임의의 시간에, 또는 이에 후속적으로 단일 또는 일련의 용량(들)으로 투여될 수 있다.

하기 단락은 본 발명의 바람직한 기, 치환기, 및 배위를 기재한다.

바람직한 화합물은 하기이다:

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드; 및

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드; 및 그의 제약상 허용되는 염.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염이 특히 바람직하다.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드가 가장 바람직하다.

게다가, 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드가 바람직한 화합물이고; 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 18.6°, 19.3° 및 26.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 11.8°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드가 특히 바람직하다.

바람직한 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체는 미국 특허 번호 8,679,498 B2 (예를 들어 그의 표 1 참조)에서 확인된 B12L 및 R17L이며, B12L가 특히 바람직하다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 I의 화합물이 반응식 A에 도시된 바와 같이 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원에서 화학식 I의 화합물의 특정 호변이성질체 중 1종에 대한 임의의 언급이 주어진 경우에, 이는 호변이성질체 형태 둘 다 및 그의 모든 혼합물을 포괄하는 것으로 이해된다.

<반응식 A>

명료함을 위해 하기 반응식에서 특정 입체화학 중심은 명시되지 않았고, 특정 치환기는 제거되었으며, 이는 어떠한 방식으로도 반응식의 교시를 제한하도록 의도되지 않는다. 게다가, 개별 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체는 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 화학식 I의 화합물의 합성에서 임의의 편리한 시점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 분리 또는 분해될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 명칭 "이성질체 1" 및 "이성질체 2"는 키랄 크로마토그래피로부터 각각 제1 및 제2 용리되는 화합물을 지칭하고, 키랄 크로마토그래피를 합성에서 초기에 개시하면, 동일한 명칭이 후속 중간체 및 실시예에 대해서도 적용된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 화합물이 적어도 2개의 키랄 중심을 함유하는 코어로 구성된다는 것을 인지할 것이다.

<반응식 B>

본 발명이 상기 화합물의 모든 개별 거울상이성질체 뿐만 아니라 거울상이성질체의 혼합물, 예컨대 라세미체를 포괄하지만, 반응식 B에 예시된 바와 같이 1 및 2로 표지된 탄소에서 절대 배열을 갖는 화합물이 본 발명의 바람직한 화합물이다.

추가적으로, 하기 반응식에 기재된 특정 중간체는 1개 이상의 질소 보호기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 각 경우에, 수행될 특정한 반응 조건 및 특정한 변환에 따라 동일하거나 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 익히 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).

화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부가 하기 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 상이한 방식으로 조합되거나 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다. 하기 반응식에서의 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 포함한 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 또한, 모든 치환기는 달리 나타내지 않는 한, 상기 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.

본원에 사용된 바와 같이, "APP"는 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "BOC"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "CSF"는 뇌척수액을 지칭하고; "DCC"는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드를 지칭하고; "DIC"는 디이소프로필카르보디이미드를 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DIPEA"는 디이소프로필에틸아민을 지칭하고; "DMAP"는 디메틸아미노피리딘을 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "ee"는 거울상이성질체 과잉률을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "Ex"는 실시예를 지칭하고; "F12"는 햄(Ham) F12 배지를 지칭하고; "FBS"는 태아 소 혈청을 지칭하고; "FRET"는 형광 공명 에너지 전달을 지칭하고; "HATU"는 (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "hr"은 시간을 지칭하고; "HOAc"는 아세트산을 지칭하고; "HOAt"는 1-히드록시-7-아조벤조트리아졸을 지칭하고; "HOBt"는 1-히드록실벤조트리아졸 수화물을 지칭하고; "HBTU"는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HRP"는 양고추냉이 퍼옥시다제를 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제를 위해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생산하는 작용제의 농도를 지칭하고; "iPr"은 이소프로필을 지칭하고; "min"은 분을 지칭하고; "MTBE"는 메틸 tert-부틸 에테르를 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하고; "PDAPP"는 혈소판 파생된 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "Prep"는 제조를 지칭하고; "psi"는 제곱 인치당 파운드를 지칭하고; "PyBOP"는 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "PyBrop"는 브로모-트리스-피롤리디노 포스포늄헥사플루오로 포스페이트를 지칭하고; "RFU"는 상대 형광 단위를 지칭하고; "Rt"는 체류 시간을 지칭하고; "SCX"는 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 지칭하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "SEM"은 평균의 표준 오차를 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고 "TMB"는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 지칭한다.

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

하기 반응식에서, 모든 치환기는 달리 나타내지 않는 한, 상기 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다. 다른 것들은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 및 임의의 신규 절차를 포함한 하기 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 의해 제조될 수 있다.

<반응식 1>

반응식 1은 옥심 (단계 2의 생성물) 및 (단계 5의 생성물)의 형성을 도시한다. 옥심은 각각 비시클릭 이속사졸 (단계 3 또는 7의 생성물)을 형성하는데 사용될 수 있다. 치환된 방향족 기는 반응식 1, 단계 1 및 단계 7에 제시된 바와 같이 합성의 상이한 시점에서 삽입될 수 있다. "PG"는 아미노 기에 대해 발생된 보호기, 예컨대 카르바메이트 및 알릴이다. 이러한 기는 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다.

2-단계 반응에서, 베타 할로겐을 갖는 케톤을 무기 염기, 예컨대 탄산칼륨을 사용하여 보호된 알릴 아민으로 알킬화시킨 다음 (단계 1), 극성 양성자성 용매 예컨대 에탄올 중에서 히드록실아민 히드로클로라이드 및 유기 염기 예컨대 피리딘으로 처리하여 옥심을 수득할 수 있다 (단계 2). 이어서, 단계 2의 옥심 생성물을 비-극성 용매 예컨대 톨루엔 또는 크실렌 중에서 단계 2의 옥심을 가열하는 것과 같은 여러 방법에 의해 3+2 고리화에서 비시클릭 이속사졸로 전환시켜 비시클릭 이속사졸을 형성할 수 있다 (단계 3). 대안적으로, 옥심을 디메틸 아세탈로부터 출발하여 형성할 수 있으며, 이를 산 예컨대 포름산으로 처리하여 알데히드 (단계 4의 생성물)를 형성한다. 단계 5에서, 단계 4의 알데히드를 히드록실아민 히드로클로라이드 및 염기 예컨대 아세트산나트륨 3수화물을 사용하여 단계 5의 옥심 생성물로 전환시킬 수 있다. 단계 6의 비시클릭 이속사졸 생성물을 차아염소산나트륨의 수용액을 사용하여 단계 6에 제시된 바와 같이 옥심으로부터 형성할 수 있다. 단계 7에서, 이어서 보호된 비시클릭 이속사졸을 방향족 유기리튬 시약 또는 그리냐르(Grignard) 시약과 반응시켜 단계 7의 보호된 비시클릭 이속사졸 생성물을 수득한다.

<반응식 2>

반응식 2는 단계 10 또는 단계 12의 보호된 피롤로 티아진 생성물로의 상이한 경로를 예시한다. 보호된 비시클릭 이속사졸을 압력 수소화 조건 하에 아세트산 중 분말화된 Zn으로 또는 극성 용매 예컨대 에탄올 중에서 라니 니켈(Raney Nickel)에 의해 처리하여 아미노피롤리딘 메탄올 (단계 11의 생성물)을 수득할 수 있다. 이어서, 단계 11의 아미노피롤리딘 메탄올 생성물을 극성 용매 예컨대 THF 중에서 벤조일 이소티오시아네이트와 반응시킨 다음, 1,1카르보닐디이미다졸 (CDI)을 첨가하여 융합된 보호된 피롤리딘 티아진 (단계 12의 생성물)을 수득한다. 대안적으로, 비시클릭 이속사졸의 아민을 벤조일 이소티오시아네이트와 반응시켜 티오우레아 (단계 8의 생성물)를 제공한 다음, 단계 9에서 이속사졸 고리를 아세트산 중 분말화된 아연으로 개환시켜 단계 9의 히드록실 화합물 생성물을 수득할 수 있다. 이어서, 히드록실 화합물을 극성 비양성자성 용매 예컨대 THF 중 CDI 또는 DCM 중 1-클로로-N,N,2-트리메틸프로페닐아민으로 처리하여 융합된 보호된 피롤리딘 티아진 (단계 10의 생성물)을 형성할 수 있다. 융합된 피롤리딘 티아진을 또한 트리페닐포스핀 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD)를 사용하는 것과 같이 미츠노부(Mitsunobu) 반응으로부터 형성할 수 있다.

<반응식 3>

반응식 3은 피롤로 티아진의 아닐린 (단계 13의 생성물)으로의 전환을 도시하며, 이어서 이를 아실화시킨 다음, 피롤리딘을 탈보호 및 헤테로아릴화시킬 수 있다. 아닐린 질소의 아실화 및 티아진 아민의 탈보호는 화학식 I의 화합물로 이어진다.

아지도-탈할로겐화를 아지드 공급원, 예컨대 아지드화나트륨의 존재 하에 적절한 피롤로 티아진 상에서 수행한다. 이러한 아지도-탈할로겐화 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다. 생성된 아지드 중간체의 아닐린 (단계 13의 생성물)으로의 환원을 관련 기술분야에 널리 공지되고 기재되어 있는 수소화 조건에 의해 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 환원제, 예컨대 LiAlH₄, NaBH₄, 및 PPh₃에 의해 실시할 수 있다.

BOC 보호된 피롤리딘을 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 산성 조건 하에 탈보호시킬 수 있다 (단계 14의 단계 1). 이어서, 탈보호된 피롤리딘을 유기 염기 예컨대 dipea, 트리에틸아민 또는 N,N,N,N'-테트라메틸구아니딘을 사용하는 치환된 방향족 피리미딘과의 친핵성 방향족 치환 (SNAr)으로 헤테로아릴화시켜 단계 14에서의 단계 2의 생성물을 수득할 수 있다. 단계 14의 아닐린 생성물을 커플링 조건 하에 헤테로방향족 카르복실산과 커플링시킬 수 있다 (단계 15의 단계 1의 생성물). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 카르복실산 및 아민의 반응으로부터 발생하는 아미드 형성을 위한 다수의 방법 및 시약이 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 커플링 시약 및 아민 염기 예컨대 DIPEA 또는 트리에틸아민의 존재 하에 적절한 아닐린과 적절한 산과의 반응은 티아진 아민의 탈보호 후에 화학식 I의 화합물을 제공할 것이다. 커플링 시약은 카르보디이미드 예컨대 DCC, DIC, EDCI, 및 방향족 옥심 예컨대 HOBt 및 HOAt를 포함한다. 추가적으로, 비-친핵성 음이온의 우로늄 또는 포스포늄 염 예컨대 HBTU, HATU, PyBOP 및 PyBrOP를 보다 전통적인 커플링 시약 대신에 사용할 수 있다. 첨가제 예컨대 DMAP를 사용하여 반응을 증진시킬 수 있다. 대안적으로, 보호된 아닐린 아민을 치환된 벤조일 클로라이드를 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 피리딘의 존재 하에 사용하여 아실화시킬 수 있다. 이어서, 보호된 티아진 아민을 극성 비양성자성 용매 예컨대 에탄올 중 유기 염기 예컨대 피리딘 및 메틸히드록시아민 히드로클로라이드 또는 메탄올 중 무기 염기 예컨대 수산화리튬으로 탈보호시켜 화학식 I의 화합물을 수득할 수 있다.

임의적 단계에서, 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염을 표준 조건 하에 적합한 용매 중에서 화학식 I의 적절한 유리 염기의 적절한 제약상 허용되는 산과의 반응에 의해 형성할 수 있다. 추가적으로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호 시에 동시에 일어날 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection 및 Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); 및 Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)]을 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 I의 화합물을 제약상 허용되는 염, 예컨대 히드로클로라이드 염으로 용이하게 전환시키고, 제약상 허용되는 염, 예컨대 히드로클로라이드 염으로서 단리할 수 있다.

제조예 및 실시예

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

제조예 1

1-(3-브로모페닐)-2-(디알릴아미노)에타논

탄산칼륨 (38.8 g, 281 mmol)을 아세토니트릴 (430 mL) 중 3-브로모페나실 브로마이드 (60 g 216 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 0℃로 냉각시켰다. 디알릴아민 (34.6 mL, 280.63 mmol)을 1시간에 걸쳐 적가하고, 반응물을 밤새 22℃로 가온되도록 하였다. 조 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물 (300 mL) 및 MTBE (300 mL)에 분배하였다. 수성 층을 버리고, 유기 층을 물 (100 mL, 2 x)로 및 염수 (100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 일정한 중량으로 증발시켜 표제 화합물 (62 g, 98%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 294 (M+1).

제조예 2

벤질 N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트

톨루엔 (120 mL) 중 아미노아세트알데히드 디메틸 아세탈 (25 mL, 229 mmol)의 용액을 0℃에서 4.85 M 수산화나트륨 용액 (70.8 mL, 343.5 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하고, 벤질 클로로포르메이트 (33.8 mL, 229 mmol)를 첨가하는 동안 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지하면서 첨가하였다. 혼합물을 4시간에 걸쳐 실온으로 가온하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (54 g, 98%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 240 (M+H).

제조예 3

벤질 N-알릴-N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트

톨루엔 (180 mL) 중 벤질 N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트 (50 g, 208.9 mmol)의 용액을 질소 하에 고체 수산화칼륨 (51.6 g, 919.69 mmol)으로 처리하였다. 10분 후, 벤질트리에틸암모늄 클로라이드 (0.8 g, 3.1 mmol)를 첨가하였다. 추가로 10분 후에 톨루엔 (50 mL) 중 알릴 브로마이드 (33 g, 272.8 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (44 g, 75%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 280 (M+H).

제조예 4

벤질 N-알릴-N-(2-옥소에틸)카르바메이트

포름산 (36.8 mL, 860 mmol) 및 물 (4.84 mL) 중 벤질 N-알릴-N-(2,2-디메톡시에틸)카르바메이트 (30 g, 107 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 헥산/EtOAc (1:2) 및 물로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 염수 용액으로 pH=6까지 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜 표제 화합물 (25 g, 99%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 234 (M+H).

제조예 5

1-(3-브로모페닐)-2-(디알릴아미노)에타논 옥심

에탄올 (720 mL) 및 피리딘 (24.8 mL, 307 mmol) 중 1-(3-브로모페닐)-2-(디알릴아미노)에타논 (60 g, 204.7 mmol)의 용액을 22℃에서 15분 동안 교반하였다. 히드록실아민 히드로클로라이드 (17 g, 246 mmol)를 1시간에 걸쳐 용액에 여러 부분으로 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 50℃로 가온한 다음, 16시간 동안 70℃로 가열하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 물 (300 mL) 및 MTBE (300 mL)에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 물 (100 mL, 2 x) 및 염수 (100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 표제 화합물 (75.5 g, 79%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 309 (M+1).

제조예 6

2-(디알릴아미노)-1-(2-플루오로페닐)에타논 옥심

디알릴아민 (1.56 L, 12.2 mol)을 에탄올 (12.9 L) 중 2-브로모-1-(2-플루오로페닐)에타논 (1291 g, 5.8 mol)의 용액에 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 4시간 동안 교반하였다. 히드록실아민 히드로클로라이드 (543 g, 7.58 mol)를 용액에 여러 부분으로 첨가한 다음, 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 물 (5.1 L) 및 MTBE (6.4 L)에 분배하였다. 탄산나트륨을 첨가하여 수성 층을 pH= 5.5로 조정하고, 수성 층을 추가의 MTBE (1.2 L)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물 (1.45 kg, 104%)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/e): 249 (M+1).

제조예 7

벤질 N-알릴-N-[2-히드록시이미노에틸]카르바메이트

아세토니트릴 (150 mL) 중 벤질 N-알릴-N-(2-옥소에틸)카르바메이트 (25 g, 107 mmol)의 용액을 물 (75 mL) 중 히드록실아민 히드로클로라이드 (9.68 g, 139 mmol) 및 아세트산나트륨 3수화물 (16 g, 117.9 mmol)의 용액으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (24 g, 90%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 249 (M+H).

제조예 8

2-브로모-1-(5-브로모-2-플루오로페닐)에탄-1-온

N-브로모숙신이미드 (984 g, 5.53 mol)를 35℃에서 DCM (7 L) 중 1-(5-브로모-2-플루오로페닐)에탄-1-온 (1000 g, 4.6 mol) 및 p-톨루엔 술폰산 (1315 g, 7.64 mol)의 용액에 여러 부분으로 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 40℃로 가열하였다. 혼합물을 24℃로 냉각시키고, 7% NaHCO₃ (5 L)을 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 10% Na₂SO₃ (5 L) 및 물 (5 L)로 세척하였다. 유기 층을 2-3 부피로 농축시켜 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 9

5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-1-(4-메톡시벤질)헥사히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸

톨루엔 (10 L) 중 2-브로모-1-(5-브로모-2-플루오로페닐)에탄-1-온 (1363 g, 4.61 mol)의 용액에 디알릴아민 (537 g, 5.53 mol) 및 dipea (2381 g, 18.42 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하여 1-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(디알릴아미노)에탄-1-온을 수득하였으며, 이를 단리시키지 않았다. N-(4-메톡시벤질)히드록실아민 (847 g, 5.53 mol) 및 Ti(OiPr)₄ (1965 g, 6.91 mol)를 조 1-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(디알릴아미노)에탄-1-온을 함유하는 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 50% 시트르산 1수화물 (4 L) 및 포화 Na₂CO₃ (4 L)을 첨가하였다. 층을 분리하고, 수층을 MTBE (5 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 물 (5 L)로 세척하고, 규조토를 통해 여과하고, 농축 건조시켰다. EtOAc (10 L) 및 옥살산 (580 g)을 잔류물에 첨가하고, 고체를 여과하고, 1 N NaOH (13 L)에 첨가하였다. MTBE (5 L)를 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 2 부피로 농축시켰다. 헵탄 (3 L)을 첨가하고, 용액을 10℃로 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과하여 표제 화합물 (1330 g, 64%)을 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ: 2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H), 3.78-3.41(m, 6H), 4.01(m, 1H), 5.24-5.01(m, 2H), 5.89-5.85(m, 1H), 6.82-6.80(m, 2H), 7.51-7.13(m, 3H), 7.63-7.62(m, 1H), 7.65-7.64(m, 1H).

제조예 10

5-알릴-6a-(3-브로모페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸

조 1-(3-브로모페닐)-2-(디알릴아미노)에타논 옥심 (75.5 g, 195.34 mmol)을 톨루엔 (600 mL) 중에 용해시키고, 12시간 동안 환류하였다. 용매를 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 수성 1 N HCl (1 L) 및 MTBE (300 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 혼합물을 15분 동안 교반하고, 규조토 (10 g)를 첨가하였다. 혼합물을 추가로 20분 동안 교반하고, 규조토를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 추가의 수성 1 N HCl (200 mL) 및 MTBE (200 mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 1 N HCl (2 x 100 mL)로 세척하였다. 수성 층을 합하고, pH를 NaOH 50% w/w를 사용하여 9로 조정하였다. 수성 혼합물을 MTBE (3 x 250 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 적색 고체 (60 g)를 수득하였다. 적색 고체를 헵탄 (600 mL)으로 희석하고, 혼합물을 환류 하에 20분 동안 가열하였다. 목탄 (2 g)을 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 최종 부피를 300 mL로 조정하기 위해 여과물을 대기압 하에 농축시켰다. 용액을 22℃로 냉각시키고, 3시간 동안 교반하였다. 연황색 고체를 여과를 통해 수집하고, 진공 하에 일정한 중량으로 건조시켜 표제 화합물 (40 g, 60%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 309 (M+1).

제조예 11

5-알릴-6a-(2-플루오로페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸

유동 화학 반응 단계: 343-ml 심리스 스테인레스강 관형 반응기 (O.D=1/8 인치)를 GC 오븐 내부에 두고, 20 mL/분으로 20분 동안 톨루엔으로 플러싱하였다. 질소 (720 psig)의 배압을 적용하고, GC의 온도를 210℃로 설정하였다. 온도가 210℃에 도달된 후에, 톨루엔 (5.81 L) 중 2-(디알릴아미노)-1-(2-플루오로페닐)에타논 옥심 (480.51 g, 1.74 mol)의 용액을 연속 모드로 작업하는 고압 시린지 펌프의 한 쌍을 사용하여 22.866 mL/분으로 반응기를 통해 펌핑하여 15분의 체류 시간을 제공하였다. 모든 원액이 소모된 후에 반응기를 22.866 mL/분으로 30분 동안 톨루엔으로 플러싱하였다. GC 오븐의 온도를 25℃로 설정하고, 전체 용액을 수집하고, 진공 하에 농축시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드 (2.5 L) 및 물 (5 L) 중에 용해시켰다. pH를 염산을 사용하여 1로 조정하고, 수성 층을 분리하고, 수산화나트륨으로 중화시켜 pH를 10으로 조정하였다. 수성 층을 MTBE (3 x 2.5 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물 (248 g, 47%)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/e): 249 (M+1).

제조예 12

5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)헥사히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 히드로클로라이드

트리플루오로아세트산 (4 L, 52.9 mol)을 DCM (12 L) 중 5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-1-(4-메톡시벤질)헥사히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 (1990 g, 4.45 mol)의 용액에 35℃ 미만의 온도를 유지하도록 하는 속도로 적가하였다. 첨가가 완결된 후, 혼합물을 33-43℃로 가온하고, 6시간 동안 교반하였다. NaOH (20%, 10 L)를 35℃ 미만의 온도를 유지하도록 하는 속도로 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 물 (6 L)로 세척하였다. 용액을 농축시키고, 에탄올 (16 L)을 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시키고, EtOAc (10 L)를 첨가하였다. EtOAc 중 4 M HCl (8 L)을 첨가하고, 생성된 고체를 여과하고, 건조시켜 표제 화합물 (1385 g, 85.6%)을 수득하였다. ES m/z 327.1 (M+1)

제조예 13

벤질 3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트

DCM (338 mL) 중 벤질 N-알릴-N-[2-히드록시이미노에틸]카르바메이트 (24 g, 96.6 mmol)의 용액을 차아염소산나트륨 (106.08 mmol, 143.06 mL)의 5% w/w 수용액으로 10분에 걸쳐 적가 처리하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 중아황산나트륨 (7 g)의 40% 수용액으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5% EtOAc로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (18 g, 75%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 247 (M+H).

제조예 14

벤질 6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트

n-부틸 리튬의 1.6 M 헥산 용액 (25.4 mL, 40.6 mmol)을 THF (60 mL) 중 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도벤젠 (12.22 g, 40.6 mmol)의 -78℃ 용액에 적가하여 황색 용액을 수득하였으며, -78℃에서 15분 동안 교반하였다. 삼플루오린화붕소 에테레이트 (5.14 mL, 40.6 mmol)를 THF (60 mL) 중 벤질 3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트 (5 g, 20.3 mmol)의 별개의 -78℃ 용액에 첨가하고, 혼합물을 -78℃에서 5분 동안 교반하였다. 이 용액을 사전에 제조된 -78℃ 유기리튬 혼합물에 캐뉼라를 통해 첨가하였다. 합한 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 포화 수성 염화암모늄으로 켄칭하고, 실온으로 가온하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하고, 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 35분 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.27 g, 27%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 421/423 (M+H).

제조예 15

벤질 1-(벤조일카르바모티오일)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트

벤조일 이소티오시아네이트 (2.87 mL, 21.28 mmol)를 THF (95 mL) 중 벤질 6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트 (5.977 g, 14.2 mmol)의 용액에 적가하고, 질소 하에 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 30분 구배로 정제하여 표제 화합물 (6.05 g, 73%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 584/586 (M+H).

제조예 16

벤질 3-(벤조일카르바모티오일아미노)-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트

벤질 1-(벤조일카르바모티오일)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]이속사졸-5-카르복실레이트 (6.05 g 10.4 mmol) 및 아연 (가루, <10 마이크로미터) (6.77 g, 103.5 mmol)의 혼합물을 아세트산 (52 mL) 중에서 실온에서 밤새 질소 하에 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc로 희석하고, 규조토를 통해 여과하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc, 물, 및 포화 수성 중탄산나트륨으로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하고, 합한 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 30분 구배로 정제하여 표제 화합물 (5.222 g, 86%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 586/588 (M+H).

제조예 17

(1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일)메탄올

탄산나트륨의 포화 수용액을 DCM (7 L) 중 5-알릴-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)헥사히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 히드로클로라이드 (1400 g, 3.85 mol)의 용액에 첨가하여 pH>9에 이르도록 하였다. 층을 분리하고, 유기 추출물을 1.5 부피로 농축시켰다. 아세트산 (1.38 L)을 첨가하고 용액을 2 L로 농축시켰다. 아세트산 (7 L) 및 아연 분말 (2.5 kg, 38.5 mol)을 첨가하고, 혼합물을 40-50℃로 가열하고, 3시간 동안 교반하였다. EtOAc (9.8L)를 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 EtOAc (4 L)로 세척하였다. 여과물을 분리하고, 물 (7 L)을 합한 유기부에 첨가하였다. 수산화암모늄을 첨가하여 pH ≥9에 이르도록 하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 2 L로 농축하였다. 에탄올 (2.8 L)을 첨가하고, 용액을 2 L로 농축시켰다. 에탄올 (19 L)을 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하여 표제 화합물의 에탄올 용액을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 18

[1-알릴-4-아미노-4-(3-브로모페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

아세트산 (400 mL) 중 5-알릴-6a-(3-브로모페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 (40 g, 129.4 mmol)의 22℃ 용액을 아연 분진 (42.3 g, 646.8 mmol)으로 1 부분으로 처리하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 격렬히 교반하였다. EtOAc (400 mL)를 첨가하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 물 (300 mL) 및 MTBE (300 mL)에 분배하였다. pH를 수산화나트륨 50% w/w를 사용하여 8로 조정하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (41 g, 97%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 311 (M+1).

제조예 19

1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

아연 분진 (590 g, 9 mol)을 메탄올 (2.85 L) 및 염화암모늄 포화 수용액 (3.56 L)의 혼합물 중 5-알릴-6a-(2-플루오로페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-피롤로[3,4-c]이속사졸 (3559 g, 1.29 mol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응물을 60℃로 냉각시키고, THF (2.85 L)로 희석하고, 규조토 상에서 뜨거운 상태로 여과하였다. 여과물을 증발시켜 유기 용매를 제거하고, 수성 혼합물을 시트르산 10% w/w 수용액 (4 L) 및 EtOAc (3.5 L)로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 2 L)로 세척하였다. 수성 층을 수산화나트륨 50% w/w로 중화시켜 pH를 10으로 조정한 다음, EtOAc (2 x 1.5 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물 (299 g, 92%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 251 (M+1).

제조예 20

[(3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]암모늄;(2S,3S)-4-히드록시-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]-4-옥소-부타노에이트

디-p-톨루오일-L-타르타르산 1수화물 (1.04 kg, 2.69 mol)을 에탄올 (21 L) 중 (1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일)메탄올 (1264 g, 3.85 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 65-75℃로 가열하고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 5-10℃로 냉각시키고, 시드 결정을 [(3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]암모늄;(2S,3S)-4-히드록시-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]-4-옥소-부타노에이트 (1.0 g)에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 필터 케이크를 차가운 에탄올 (1.4 L)로 세척하였다. 필터 케이크를 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다. 제2 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: IC 키랄팩, 4.6 mm * 250 mm * 5 μm; 용리액: 90% 헥산 (0.3% 디에틸아민); 10% 에탄올 (0.3% 디에틸아민); 1.0 mL/분의 유량, UV 270 nm은 R_t = 7.4분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99% ee) 거울상이성질체 (1050 g, 38%)를 확인하였다.

¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ: 2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H), 3.57-3.31(m, 3H), 3.66-3.58(m, 4H), 3.75-3.74(m, 2H), 5.38-5.36(m, 1H), 5.50-5.46(m, 1H), 5.88(s, 2H), 5.97-5.91(m, 1H), 7.10-7.05(m, 1H), 7.29(d, J=8.0 Hz, 4H), 7.53-7.51(m, 1H), 7.80-7.78(m, 1H), 8.01(d, J=8.0 Hz, 4H).

제조예 21

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올; 2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산

1-메톡시-2-프로판올 (1.13 L) 중 디-p-톨루오일-L-타르타르산 (348.6 g, 884 mmol)의 용액을 40℃로 사전에 가열된 1-메톡시-2-프로판올 (1.13 L) 중 [(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (225.9 g, 902 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 22℃로 냉각시키고, 18시간 동안 교반하였다. 백색 고체를 여과에 의해 수집하고, 1-메톡시-2-프로판올 (600 ml)로 세척하였다. 수집된 고체를 건조시켜 표제 화합물 (183.01 g, 31.8%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 251 (M+1).

제조예 22

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(3-브로모페닐)피롤리딘-3-일]메탄올; (2R,3R)-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산

이소프로필 알콜 (914 mL) 중 [1-알릴-4-아미노-4-(3-브로모페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (77 g, 235 mmol)의 용액을 70℃로 가열하였다. 디-p-톨루오일-L-타르타르산 (86.2 g, 223 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 22℃로 냉각시키고, 밤새 교반하였다. 슬러리를 여과하여 연황색 고체를 수집하고, 이소프로필 알코올로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (63 g, 36%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 311 (M+1). 생성물을 역상 키랄 크로마토그래피에 의해 분석하였다: 제1 용리 이성질체의 분석 (칼럼: 키랄팩 ID-3 4.6 x 50 mm; 용리액: 70:30, 수성 20 mM 중탄산암모늄: 아세토니트릴; 유량: 1.5 mL/분, UV 215 nm)은 R_t = 1.26분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (96% ee) 거울상이성질체를 확인하였다.

제조예 23

((3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일)메탄올

1 N HCl (500 mL, 500 mmol)을 EtOAc (500 mL) 중 [(3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일]암모늄;(2S,3S)-4-히드록시-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]-4-옥소-부타노에이트 (100 g, 139.4 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 수성 층을 분리하고, pH를 1 N NaOH를 사용하여 8로 조정하였다. 수성 층을 EtOAc (350 mL x 2)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 (500 mL)로 세척하고, 농축시켜 표제 화합물 (40 g, 87%)을 수득하였다. 제2 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: IC 키랄팩, 4.6 mm * 250 mm * 5 μm; 용리액: 90% 헥산 (0.3% 디에틸아민); 10% 에탄올 (0.3% 디에틸아민); 1.0 mL/분의 유량, UV 270 nm은 R_t = 7.4분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99.7% ee) 거울상이성질체를 확인하였다.

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃ δ: 2.78-2.70(m, 5H), 3.16-3.00(m, 3H), 3.87-3.75(m, 1H), 3.90-3.84(m, 1H), 5.24-5.11(m, 2H), 5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H), 7.35-7.32(m, 1H), 7.67- 7.65 (m, 1H).

제조예 24

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올;2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산 (211 g, 331 mmol)을 물 (2.1 L) 및 EtOAc (2.3 L) 중에 용해시켰다. 염산 35% w/w를 첨가하여 pH를 1로 조정하였다. 수성 층을 분리하고, pH를 수산화나트륨 50% w/w를 사용하여 10으로 조정하고, EtOAc (2x)로 추출하였다. 수성 층의 pH를 수성 NaOH를 사용하여 10으로 조정하고, MTBE (3x)로 추출하면서 수용액의 pH를 pH=10으로 유지하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 조 표제 화합물 (73 g, 88%, 94.8% ee)을 수득하였다. 생성물을 키랄 크로마토그래피: 칼럼 AS-H, 용리액 10% 이소프로필 알콜, 2% 이소프로필 아민; 유량 3 mL/분, UV 220; 35℃에서 100 bar의 압력에 의해 분석하여 표제 화합물을 R_f = 2.26분의 제2 용리 이성질체로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 251 (M+1).

제조예 25

N-(((3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드

벤조일 이소티오시아네이트 (15.0 g, 91.9 mmol)를 THF (400 mL) 중 ((3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일)메탄올 (30 g, 91.1 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 용액을 25℃로 가온하고, 1시간 동안 교반하여 표제 화합물의 THF 용액을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 26

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(3-브로모페닐)피롤리딘-3-일]메탄올

[(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(3-브로모페닐)피롤리딘-3-일]메탄올; (2R,3R)-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산 (63 g 85.8 mmol)을 수성 1 N HCl (800 mL) 및 EtOAc (400 mL)와 합하고, 혼합물을 22℃에서 15분 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 수성 층의 pH를 수산화나트륨 50% w/w를 사용하여 10으로 조정하였다. 수성 혼합물을 MTBE (3 x 250 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 표제 화합물 (27 g, 99%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 311 (M+1).

제조예 27

N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(3-브로모페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

THF (270 mL) 중 [(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(3-브로모페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (27 g; 86.7 mmol)의 용액을 질소 분위기 하에 -5℃로 냉각시켰다. 벤조일 이소티오시아네이트 (12.3 mL, 91 mmol)를 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 적가하였다. 반응물을 1시간 동안 22℃로 가온되도록 하였다. 1,1'-카르보닐디이미다졸 (28.1 g, 173.5 mmol)을 단일 부분으로 첨가하고, 반응물을 22℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 환류 하에 16시간 동안 가열하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 진공 하에 건조시켰다. 조 물질을 MTBE (500 mL) 및 물 (250 mL)에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 실리카 겔 상에서 90/10에서 60/40 DCM / EtOAc의 구배로 정제하여 표제 화합물 (27 g, 68%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 456 (M+1).

제조예 28

N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드, 디히드로클로라이드

트리페닐포스핀 (36.8 g, 140.3 mmol)을 N-(((3S,4R)-1-알릴-3-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (91.1 mmol)의 THF (400 mL) 용액에 첨가하였다. THF (100 mL) 중 디-t-부틸 아조디카르복실레이트 (31.6 g, 137.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20-30℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, MTBE (400 mL)를 첨가하였다. 용액을 규조토를 통해 여과하고, 케이크를 MTBE (130 mL)로 세척하였다. 여과물을 합하고, EtOAc 중1 N HCl (200 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 500 mL로 농축시켰다. MTBE (320 mL)를 첨가하고, 용액을 여과하고, 헵탄 (130 mL)으로 세척하였다. 고체를 EtOAc (650 mL)로 슬러리화하고, 50-60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 뜨거운 슬러리를 여과하고, 고체를 EtOAc (130 mL) 및 헵탄 (130 mL)으로 세척하였다. 고체를 EtOAc (650 mL) 중에 재슬러리화하고, 50-60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 뜨거운 슬러리를 여과하고, EtOAc (130 mL) 및 헵탄 (130 mL)으로 세척하였다. 고체를 건조시켜 표제 화합물을 디-HCl 염 (40 g, 80%, 99.5% ee)으로서 수득하였다. 제1 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: IC 키랄팩, 4.6 mm * 250 mm * 5 μm; 용리액: 85% 헥산 (0.1% 디에틸아민): 15% 이소프로필 알콜 (0.1% 디에틸아민); 유량 1.0 mL/분, UV 282 nm은 R_t = 12.5분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99.5% ee) 거울상이성질체를 확인하였다.

제조예 29

N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(2-플루오로-5-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

15% 탄산나트륨 (440 mL)을 EtOAc (3 L) 및 물 (784 mL) 중 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 디히드로클로라이드 (495 g, 717.88 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1-2시간 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 실리카 겔 (40 g)을 통해 여과하고, EtOAc (600 mL)로 세척하였다. 여과물을 농축 건조시켜 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드를 수득하였다. 트리플루오로아세트아미드 (136.7 g, 1.21 mol), NaI (182.5 g, 1.22 mol), 4 A 분자체 (342 g), 및 K₂CO₃ (170.9 g, 1.24 mol)을 DMSO (525 mL) 및 1,4-디옥산 (1.025 L) 중 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (341 g, 494.54 mmol)의 용액에 첨가하였다. DMSO (500 mL) 중 트랜스-N,N'-디메틸시클로헥산 (81.6 g, 573.66 mmol) 및 아이오딘화구리 (27.3 g, 143.34 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 100℃로 가온하고, 8시간 동안 교반하고, 24℃로 냉각시켰다. 물 (5.9 L) 및 DCM (5.9 l)을 첨가하고, 혼합물을 여과하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 (5.9 L)로 세척하여 DCM의 용액 중 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 30

N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드, 히드로클로라이드

수산화나트륨 (28.7 g) 및 물 (2.7 L)을 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(2-플루오로-5-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (250 g, 494.4 mmol)의 DCM 용액에 첨가하고, 혼합물을 24℃에서 68시간 동안 교반하였다. 1 N HCl (3.5 L)을 첨가하여 1-3의 pH를 수득하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (680 mL)으로 세척하였다. DCM (4 L)을 수성부에 이어서 21% 수산화암모늄에 첨가하여 8-10의 pH를 수득하였다. 층을 분리하고, 유기 추출물을 합하고, 실리카 겔 (170 g)을 통해 여과하고, DCM (1.4 L)로 세척하였다. 용매를 농축 건조시키고, EtOAc (4 L)로 희석하였다. EtOAc 중 1 N HCl (700 mL)을 25℃ 미만의 온도에서 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 약 7-8 부피로 농축시키고, EtOAc (2.8 L)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 여과하고, EtOAc (400 mL)로 세척하였다. 고체를 건조시켜 표제 화합물 (246 g, 52%)을 수득하였다.

제조예 31

N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로페닐)-6-알릴-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

아세트산 무수물 (23.5g, 0.23 mol)을 DCM (800 mL) 중 N-((4aR,7aS)-6-알릴-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 (100 g, 0.153 mol) 및 트리에틸아민 (54.3 g, 0.535 mol)의 용액에 첨가하였다. 20 - 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 포화 NaHCO₃ (700 mL) 및 물 (600 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하여 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 DCM 중 용액으로서 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 32

N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(2-플루오로페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

THF (2,3L) 중 [(3R,4S)-1-알릴-4-아미노-4-(2-플루오로페닐)피롤리딘-3-일]메탄올 (129,7 g, 414 mmol)의 용액을 0℃에서 질소 분위기 하에 냉각시켰다. 벤조일 이소티오시아네이트 (61.5 mL, 456 mmol)를 5℃ 미만의 온도를 유지하면서 첨가하였다. 반응물을 실온으로 3시간에 걸쳐 가온하고, 1,1'-카르보닐디이미다졸 (87.4 g, 538.9 mmol)을 첨가하고, 반응물을 22℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 22℃로 냉각시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc (1 L) 및 물 (1 L)에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 400 mL)로 추출하였다. 유기부를 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-40% DCM으로부터 EtOAc / DCM의 구배로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 잔류 용매를 함유하는 연황색 고체 (170 g, 99%)로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 396 (M+1).

제조예 33

벤질 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

1,1'-카르보닐디이미다졸 (2.87 g, 17.7 mmol)을 THF (52 mL) 중 벤질 3-(벤조일카르바모티오일아미노)-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (5.198 g, 8.86 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 다음, 반응을 환류 하에 질소 하에 밤새 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 물로 희석하고, EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 30분 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.93 g, 58%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br). 568/570 (M+H)

제조예 34

N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

트리페닐포스핀 (4.0g, 0.015 mol) 및 1,3-디메틸바르비투르산 (15.2 g, 0.097 mol)을 N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로페닐)-6-알릴-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (0.153 mol)의 DCM 용액에 첨가하였다. 아세트산팔라듐 (1.7g, 7.7 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 내지 30℃에서 1시간 동안 교반하였다. 25% 수산화암모늄을 첨가하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 HOAc (물 500 mL 중 3.0 당량)로 세척하고, pH를 25% 수산화암모늄을 사용하여 8-9로 조정하였다. 수성 층을 DCM (2 x 500 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 3-4 부피로 농축시켰다. MTBE (1 L)를 첨가하고, 혼합물을 여과하였다. 혼합물을 농축시키고, 헵탄 (1 L)을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과하고, 수집하고, 건조시켜 표제 화합물 (48 g, 76%)을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 2.15 (s, 3H), 2.87-2.83(m, 1H), 3.43-3.23(m, 5H), 3.70-3.67(m, 1H), 7.12-7.07 (m, 1H), 7.28-7.27 (m, 1H), 7.52-7.41(m, 4H), 7.79(m, 1H), 8.18-8.16(m, 2H). ES m/z 413.1 (M+1).

제조예 35

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-브로모페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

클로로포름 (22 mL) 중 N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(3-브로모페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (1 g, 2.19 mmol) 및 N,N-디메틸바르비투르산 (0.868 g, 5.48 mmol)의 실온 혼합물을 생성된 슬러리를 통해 버블링 질소로 실온에서 5분 동안 탈기하였다. 혼합물을 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0.261 g, 219 μmol)으로 처리하고, 질소 하에 1.5시간 동안 교반하였다. 분리형 플라스크에서, 클로로포름 (486 mL) 중 N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(3-브로모페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (22.2 g, 48.6 mmol) 및 N,N-디메틸바르비투르산 (19.28 g, 121.6 mmol)의 혼합물을 생성된 슬러리를 통해 실온에서 5분 동안 질소를 버블링하여 탈기하였다. 혼합물을 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (5.79 g, 4.86 mmol)으로 처리하고, 질소 하에 2시간 동안 교반하였다. 2종의 반응물을 합하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 물질을 실리카 겔 상에서 DCM 중 0.5%에서 10% 메탄올 30분 구배로 정제하여 표제 화합물 (22.4 g, 100%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 416/418 (M+H).

제조예 36

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

벤조산, 2-메르캅토- (122 g, 793 mmol), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐 (4.15 g, 7.21 mmol), 및 1,4-비스(디페닐포스피노)부탄 (3.14 g, 7.21 mmol)을 무수 2-메틸테트라히드로푸란 (1.96 L) 중 N-[(4aR,7aS)-6-알릴-7a-(2-플루오로페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (178.21 g, 360 mmol)의 용액에 질소 분위기 하에 첨가하였다. 용액을 진공 / 질소 사이클에 의해 3회 탈기한 다음, 질소를 반응물을 통해 15분 동안 버블링하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가열시키면서 질소를 반응물을 통해 버블링하였다. 반응물이 40℃에 도달되면, 버블링을 제거하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 22℃로 냉각시키고, 물 (2 L)로 희석하였다. HCl (5 M) 용액을 첨가하여 pH를 1로 조정하였다. 수성 층을 분리하고, 추가의 EtOAc (2 x 800 mL)로 세척하였다. 수성 층의 pH를 수산화나트륨 50% w/w를 사용하여 10으로 조정한 다음, EtOAc (10 L)로 추출하였다. 수성 층을 추가의 EtOAc (2 x 750 mL)로 세척하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 조 표제 화합물을 연황색 고체 (124.7 g, 97%)로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 356 (M+1).

제조예 37

N-[7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

아이오도트리메틸실란 (2.21 mL, 15.46 mmol)을 아세토니트릴 (44 mL) 중 벤질 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (2.93 g, 5.15 mmol)의 실온 용액에 적가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 SCX 칼럼에 의해 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아로 정제하여 표제 화합물 (2.098 g, 94%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 434/436 (M+H).

제조예 38

tert-부틸 (4aR,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(3-브로모페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

DCM (367 mL) 중 N-[(4aR,7aS)-7a-(3-브로모페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (22.4 g, 36.69 mmol)의 실온 용액을 디-t-부틸디카르보네이트 (8.81 g, 40.36 mmol)에 이어서 트리에틸아민 (7.67 mL, 55.04 mmol)으로 처리하고, 반응물을 질소 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 25분 구배로 정제하여 표제 화합물 (20.22 g, 100%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 516/518 (M+H).

제조예 39

tert-부틸 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

디-t-부틸디카르보네이트 (1.16 g, 5.31 mmol) 및 트리에틸아민 (1.01 mL, 7.25 mmol)을 DCM (48 mL) 중 N-[7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (2.098 g, 4.83 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 30분 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.556 g, 99%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 534/536 (M+H).

제조예 40

tert-부틸 (4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

에탄올 (100 mL) 중 tert-부틸 (4aR,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(3-브로모페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (5 g, 9.7 mmol) 및 트랜스-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 (220.3 mg, 1.5 mmol)의 용액을 아지드화나트륨 (1.30 g, 19.4 mmol)으로 처리하였다. L-아스코르브산 나트륨 염 (0.66 M, 3.2 mL, 2.1 mmol) 및 물 (10 mL)의 수용액을 첨가하고, 플라스크의 상단을 질소로 퍼징하였다. 혼합물을 구리(II)술페이트 5수화물 (0.33 M, 3.2 mL, 1.1 mmol)의 수용액으로 처리하고, 혼합물을 즉시 예열된 핫플레이트 상에서 80℃에서 1.5시간 동안 질소 하에 가열하였다. 균질 혼합물을 가열 시 수득하였다. 반응물을 냉각시키고, 빙수를 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 아지드 생성물을 수득하였다. 조 아지드 생성물을 차가운 에탄올 (150 mL) 중 탄소 상 10% 팔라듐 (2 g)과 합하고, 혼합물을 진공/질소에 이어서 진공/수소를 사용하여 퍼징하였다. 혼합물을 30 psi의 수소 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 배출하고, 필터 케이크를 헹구기 위해 DCM을 사용하여 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 용매를 여과물로부터 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서 DCM 중 50% EtOAc로 정제하여 표제 화합물 (4 g, 91%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 453 (M+H).

제조예 41

tert-부틸 7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

에탄올 (50 mL) 중 tert-부틸 2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (2.556 g, 4.8 mmol) 및 트랜스-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 (150 mg, 1.1 mmol)의 용액을 아지드화나트륨 (933 mg, 14.3 mmol)으로 처리하였다. L-아스코르브산 나트륨 염 (0.66 M, 3.2 mL, 2.1 mmol) 및 물 (1 mL)의 수용액을 첨가하고, 플라스크의 상단을 질소로 퍼징하였다. 혼합물을 구리(II)술페이트 5수화물 (0.33 M, 3.2 mL, 1.1 mmol)의 수용액으로 처리하고, 혼합물을 즉시 예열된 핫플레이트 상에서 80℃에서 1.5시간 동안 질소 하에 가열하였다. 균질 혼합물을 가열 시 수득하였다. 반응물을 냉각시키고, 빙수로 희석하고, 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 아지드 생성물을 수득하였다. 조 아지드 생성물을 차가운 에탄올 (150 mL) 중 탄소 상 10% 팔라듐 (1 g)과 합하고, 혼합물을 진공/질소에 이어서 진공/수소를 사용하여 퍼징하였다. 혼합물을 30 psi의 수소 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 배출하고, 규조토를 통해 여과하고, 필터 케이크를 DCM으로 헹구었다. 용매를 여과물로부터 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카 겔 상에서 DCM 중 50% EtOAc로 정제하여 표제 화합물 (2.014 g, 89%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 471 (M+H).

제조예 42

tert-부틸 (4aR,7aS)-2-벤즈아미도-7a-[3-[(5-플루오로피리딘-2-카르보닐)아미노]페닐]-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트

디메틸포름아미드 (1 ml)를 함유하는 DCM (4 mL) 중 tert-부틸 (4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (93 mg, 0.21 mmol), 5-플루오로피리딘-2-카르복실산 (31.9 mg, 0.23 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (56.7 mg, 0.41 mmol) 및 EDCI (40 mg, 0.21 mmol)의 슬러리를 DIPEA (179.2 μL, 1.03 mmol)로 처리하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (5 mL) 및 포화 수성 중탄산나트륨 (15 mL)으로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 포화 수성 염화나트륨 (10 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 표제 화합물 (105 mg, 89%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 576 (M+H).

제조예 43

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드; 2,2,2-트리플루오로아세트산

tert-부틸 (4aR,7aS)-2-벤즈아미도-7a-[3-[(5-플루오로피리딘-2-카르보닐)아미노]페닐]-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (105mg, 0.18 mmol)를 DCM (2 mL) 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (500 μL, 6.6 mmol)으로 처리하였다. 생성된 황색 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 표제 생성물 (190 mg, 100%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 476 (M+H).

제조예 44

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

트리플루오로아세트산 (25 mL)을 DCM (100 mL) 중 tert-부틸 (4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (4 g, 8.84 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 SCX 칼럼에 의해 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (2.49 g, 80%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 353 (M+H).

제조예 45

N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

트리플루오로아세트산 (10 mL)을 DCM (30 mL) 중 tert-부틸 7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-2-벤즈아미도-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-6-카르복실레이트 (2.013 g, 4.28 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 SCX 칼럼에 의해 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아로 정제하여 표제 화합물 (1.555 g, 98%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 371 (M+H).

제조예 46

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

1,4-디옥산 (60 mL) 중 N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (2.49 g, 7.06 mmol), 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (3.74 g, 28.26 mmol), 및 DIPEA (6.16 mL, 35.32 mmol)의 용액을 환류 하에 질소 하에 4시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 물로 희석하고, EtOAc (3 x)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 25분 구배로 정제하여 표제 화합물 (2.51 g, 79%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 449 (M+H).

제조예 47

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

N-메틸피롤리돈 (997 mL) 중 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (124.7 g, 256 mmol), DIPEA (67 mL), 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (29.3 ml, 307 mmol)의 용액을 100℃로 16시간 동안 가열하였다. 반응물을 22℃로 냉각시키고, 15℃ 미만의 온도를 유지하면서 10℃로 냉각된 물 (10 L)에 주입하였다. 연한 크림색 고체를 여과에 의해 수집하고, 추가의 물로 세척하였다. 습윤 고체를 EtOAc (2 L) 중에 용해시키고, 분리기 깔때기로 옮겼다. 염화나트륨 수용액 5% w/w (1 L)를 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 감압 하에 증발시켰다. 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-40% EtOAc/이소헥산의 구배를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 연황색 고체 (116 g, 70%)로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 452 (M+1).

제조예 48

N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드

2-클로로-5-플루오로피리미딘 (28.9 g, 218 mmol) 및 탄산칼륨 (33.46 g, 242.1 mmol)을 DMF (100 mL) 중 N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로페닐)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (50 g, 121.22 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 80-85℃로 8시간 동안 가열하였다. 혼합물을 24℃로 냉각시키고, 여과하고, DMF (100 mL)로 세척하였다. 고체를 물 (2 L)로 슬러리화하고, 여과하여 표제 화합물 (68.5g, 98%)을 수득하였다. LC-MS: m/z=509.2 (M+1)+.

¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ ppm 1.22 (t, J = 7.28 Hz, 2 H) 1.92 - 2.07 (m, 6 H) 2.89 - 3.20 (m, 2 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.67 (t, J=9.54 Hz, 1 H) 3.84 (br. s., 1 H) 4.16 (br. s., 2 H) 7.23 (br. s., 2 H) 7.35 - 7.61 (m, 8 H) 7.77 (br. s., 2 H) 7.85 - 8.18 (m, 4 H) 8.48 (s, 4 H) 10.15 (br. s., 1 H) 10.46 - 10.59 (m, 1 H).

제조예 49

(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민

수산화리튬 (8.6 g, 204.9 mmol)을 메탄올 (400 mL) 중 N-((4aR,7aS)-7a-(5-아세트아미도-2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (80 g, 157.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 60-70℃로 4시간 동안 가열하였다. 농축된 HCl (132 g)을 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 30℃로 냉각시키고, 농축시켜 메탄올을 제거하였다. 물을 첨가하고, 수성 층을 DCM (3 x)으로 추출하여 표제 화합물을 총 질량의 5.6%가 표제 화합물인 920 g의 수용액으로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

제조예 50

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드; 2,2,2-트리플루오로아세트산 (150 mg, 254 μmol), 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (68 mg, 51 μmol) 및 DIPEA의 용액 (98 μL, 56 μmol)을 DMSO (5 mL)에서 40℃에서 밤새 가열하였다. 추가의 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (68 mg, 51 μmol) 및 DIPEA (98 μL, 56 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 밤새 가열하였다. 추가의 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (68 mg, 51 μmol) 및 DIPEA (98 μL, 56 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 50℃에서 3번째 밤 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 포화 수성 탄산나트륨 (50 mL)으로 희석하여 슬러리를 수득하였으며, 이를 여과하고, 진공 오븐 중에서 50℃에서 4시간 동안 건조시켜 표제 화합물 (60 mg, 41%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 449 (M+H).

대안적 제조예 50

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (282 mg, 628.73 μmol) 및 5-플루오로피리딘-2-카르복실산 (106.46 mg, 754.47 μmol)을 DCM (3 mL) 및 디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중에서 합하였다. HOBT (112.70 mg, 817.35 μmol)에 이어서 EDCI (159.07 mg, 817.35 μmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, pH를 1 N NaOH를 사용하여 ~12로 조정하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 20분 구배로 정제하여 표제 화합물 (327 mg, 91%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 571 (M+H).

제조예 51

N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드

N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-4a,5,6,7-테트라히드로-4H-피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (705 mg, 1.90 mmol), 5-플루오로-2-클로로피리미딘 (1.01 g, 7.61 mmol), 및 DIPEA (1.66 mL, 9.52 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 (20 mL) 중에서 가열하여 4시간 동안 질소 하에 환류하였다. 반응물을 냉각시키고, 물로 희석하고, EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 25분 구배로 정제하여 표제 화합물 (590 mg, 66%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 467 (M+H).

제조예 52

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (400 mg, 891.81 μmol) 및 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (165 mg, 1.07 mmol)을 DCM (4 mL) 및 디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중에서 합하였다. HOBt (160 mg, 1.16 mmol)에 이어서 EDCI (226 mg, 1.16 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, pH를 1 N NaOH를 사용하여 ~12로 조정하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 20분 구배로 정제하여 표제 화합물 (482 mg, 92%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 585 (M+H).

제조예 53

N-[3-[2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드

N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (302 mg, 647 μmol) 및 5-플루오로피리딘-2-카르복실산 (110 mg, 777 μmol)을 DCM (3 mL) 및 디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중에서 합하였다. HOBT (116 mg, 842 μmol)에 이어서 EDCI (164 mg, 842 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, pH를 1 N NaOH를 사용하여 ~12로 조정한 다음, EtOAc (3 x)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 여과하여 불용성 물질을 수집하였다. 고체를 물 및 EtOAc로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 여과물로부터의 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 5%에서 100% EtOAc 20분 구배로 정제하여 추가의 표제 화합물을 합한 수율 (275 mg, 72%)로 수득하였다. ES/MS (m/e): 590 (M+H).

제조예 54

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드, (이성질체 1)

라세미 N-[7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (1.694 g, 3.63 mmol)를 키랄 HPLC (칼럼: 키랄셀(Chiralcel) OJ, 8 x 35 cm; 용리액: 90% 메탄올 (0.2% 디메틸에틸아민) 및 10% 아세토니트릴; 유량 400 mL/분, UV 280 nm)에 의해 정제하였다. 제1 용리 이성질체의 분석 (칼럼: 키랄셀 OJ-H 0.46 x 15 cm; 용리액: 10:90 아세토니트릴:메탄올 (0.2% 디메틸에틸아민 함유); 유량: 0.6 mL/분, UV 280 nm)은 R_t = 6.70분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (99% ee) 거울상이성질체 (723 mg, 43%)를 확인하였다. ES/MS (m/e): 467 (M+H).

제조예 55

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드, (이성질체 1)

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드, 이성질체 1 (0.361 g, 0.77 mmol)을 DCM (4 mL) 및 DMF (0.5 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (240 mg, 1.55 mmol), HOBT (210 mg, 1.55 mmol) 및 EDCI (300 mg, 1.55 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 12 g 실리카 겔 로딩 칼럼 상에 직접 첨가하고, 40 g 실리카 겔 칼럼을 사용하고 0-100% EtOAc/헥산 구배로 용리시켜 정제하였다. 생성물을 EtOAc (200 mL) 중에 용해시키고, 1 N NaOH (2 x 50 mL)로, 및 염수 (1 x 50 mL)로 세척하였다. 실리카 겔 정제를 상기 기재된 바와 같이 반복하여 표제 화합물 (350 mg, 74%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 603 (M+H).

제조예 56

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-시아노-피리딘-2-카르복스아미드

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.30 g, 0.67 mmol)를 DCM (10 mL) 및 5-시아노피리딘-2-카르복실산 (129 mg, 0.87 mmol) 중에 용해시키고, HOBt (185 mg, 1.34 mmol) 및 EDCI (169 mg, 0.87 mmol)를 첨가하였다. DIPEA (0.35 mL, 2 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물질을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-100% EtOAc / 헥산 구배로 용리시키면서 직접 정제하여 표제 화합물 (360 mg, 88%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 579 (M+H).

제조예 57

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-아미노페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.30 g, 0.67 mmol)를 DCM (10 mL) 및 3,5-디플루오로피리딘-2-카르복실산 (138 mg, 0.87 mmol) 중에 용해시키고, HOBT (185 mg, 1.34 mmol) 및 EDCI (169 mg, 0.87 mmol)를 첨가하였다. Dipea (0.35 mL, 2 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-100% EtOAc / 헥산 구배로 용리시키면서 직접 정제하여 표제 화합물 (330 mg, 84%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 590 (M+H).

제조예 58

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-시아노-피리딘-2-카르복스아미드, (이성질체 1)

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.180 g, 0.39 mmol, 이성질체 1)를 DCM (2 mL) 및 DMF (0.25 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 5-시아노피리딘-2-카르복실산 (114 mg, 0.77 mmol), HOBt (106 mg, 0.77 mmol) 및 EDCI (150 mg, 0.77 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물 (10 mL), EtOAc (10 mL)로 희석하고, 1 N NaOH의 용액 (100 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc (2 x 100 mL)로 추출하고, 유기 층을 합하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 상에서 0-100% EtOAc / 헥산 구배를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (133 mg, 57%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 597 (M+H).

제조예 59

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드, (이성질체 1)

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.180 g, 0.39 mmol, 이성질체 1)를 DCM (2 mL) 및 DMF (0.25 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 5-시아노피리딘-2-카르복실산 (114 mg, 0.77 mmol), HOBt (106 mg, 0.77 mmol) 및 EDCI (150 mg, 0.77 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물 (10 mL) 및 EtOAc (10 mL)로 희석한 다음, 1 N NaOH의 용액 (100 mL)에 부었다. 혼합물을 EtOAc (2 x 100 mL)로 추출하고, 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-100% EtOAc / 헥산 구배를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (190 mg, 80%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 608 (M+H).

제조예 60

(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민

수산화리튬 (9.26 g, 386 mmol)을 메탄올 (1.6 L) 중 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (158.6 g, 351.6 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열한 다음, 22℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켜 황색 잔류물이 되도록 하였다. 잔류물을 물 (1 L) 및 EtOAc (750 mL)에 분배하였다. HCl (5 M 수용액)을 첨가하여 pH를 1로 조정하였다. 수성 층을 분리하고, 유기 층을 EtOAc (2 x 200 mL)로 세척하였다. 수성 층의 pH를 수산화나트륨 50% w/w 수용액을 사용하여 pH=10으로 조정하고, EtOAc (3 x 1 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 조 표제 화합물을 연황색 고체 (133.3 g, 99%, 12% 잔류 EtOAc 함유)로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 348 (M+1).

제조예 61

(4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민

황산 (33.4 ml, 626.6 mmol)을 트리플루오로아세트산 (626 mL) 중 (4aR,7aS)-7a-(2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d] [1,3]티아진-2-아민 (45.8 g, 125,3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하였다. 발연 질산 (6.2 mL, 144.1 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 22℃로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, MTBE (250 mL)를 첨가하고, 2회 증발시켰다. 잔류물을 진공 하에 일정한 중량으로 건조시킨 다음, 물 (147 mL) 및 에탄올 (885 mL) 중에 용해시키고, 15분 동안 질소를 버블링하여 탈기하였다. 용액을 압력 반응기로 옮기고, 10% Pd/C 페이스트 유형 87L (6.6 g, 6.27 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 추가의 에탄올 (700 mL)로 희석하고, 80 psi에서 수소로 16시간 동안 가압하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 제2 촉매 충전량을 10% Pd/C 페이스트 유형 87L (6.6 g, 6.27 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 80 psi로 가압하고, 압력 반응기에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 질소로 퍼징하고, 규조토 상에서 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 물 (200ml)과 EtOAc (200 ml) 사이에 분배하였다. 수성 층을 분리하고, 5℃로 냉각시키고, 수산화암모늄 15% w/w로 중화시켰다. 수성 층을 EtOAc (3 x 150 mL)로 추출하였다. 유기부를 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 표제 화합물을 담갈색 고체 (47.7 g, 99%, 잔류 EtOAc 함유)로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 363 (M+1).

실시예 A

N-[3-[2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드

N-[3-[2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (293 mg, 497 μmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (430 mg, 4.97 mmol) 및 피리딘 (402 μL, 4.97 mmol)의 혼합물을 캡핑된 플라스크 내에서 에탄올 (13 mL) 중에서 70℃에서 2.5시간 동안 가열하였다. DMSO (3 mL)를 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 밤새 가열하였다. 추가의 DMSO (10 mL)를 첨가하고, 가열을 70℃에서 4시간 동안 계속하였다. 추가의 O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (208 mg, 2.48 mmol) 및 피리딘 (201 μL, 2.48 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 60℃로 3시간 동안 가열하고, 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 분리형 플라스크에서, N-[3-[2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (276 mg, 468 μmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (405 mg, 4.68 mmol)와 피리딘 (478 μL, 4.68 mmol)의 혼합물을 캡핑된 플라스크 내에서 70℃의 에탄올 (15 mL) 및 DMSO (4 mL) 중에서 밤새 가열하였다. 추가의 DMSO (10 mL)를 첨가하고, 가열을 70℃에서 4시간 동안 계속하였다. 추가의 O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (195 mg, 2.34 mmol) 및 피리딘 (189 μL, 2.34 mmol)을 첨가하고, 70℃에서 3시간 동안 가열하고, 이어서 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 2종의 반응 혼합물을 합하고, 대부분의 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 SCX 칼럼 상에서 3:1 DCM:메탄올을 사용하여 정제하고, 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아를 사용하여 정제하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올 구배의 0.5%에서 10% 20분 구배로 추가로 정제하여 표제 화합물 (451 mg, 96%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 486 (M+H).

실시예 1

N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]페닐}-5-플루오로피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

에탄올 (15 mL) 중 N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (320 mg, 560 μmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (485 mg, 5.60 mmol) 및 피리딘 (453 μL, 5.60 mmol)의 혼합물을 마개를 막은 바이알 중에서 65℃에서 5시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 메탄올 DCM 중 7 N 암모니아 구배의 0.5%에서 10% 30분 구배로 정제하여 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (219 mg, 84%)를 수득하였다. 이 물질을 DCM (1 mL) 및 메탄올 (0.5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.47 mL, 470 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (228 mg, 81%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 468 (M+H).

실시예 2

N-{3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]페닐}-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

에탄올 (20 mL) 중 N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (479 mg, 819 μmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (709 mg, 8.19 mmol) 및 피리딘 (663 μL, 8.19 mmol)의 혼합물을 캡핑된 플라스크 중에서 50℃에서 밤새 가열하였다. DMSO (4 mL)를 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열하여 용액을 수득하였다. 반응물을 냉각시키고, 대부분의 용매를 진공 하에 제거하였다. 물을 첨가하고, pH를 1 N 수산화나트륨을 사용하여 ~12로 조정하였다. 혼합물을 EtOAc (5 x)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올 구배의 0.5%에서 10% 30분 구배로 정제하였다. 혼합물을 SCX 칼럼 상에서 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아로 다시 정제하여 잔류 DMSO를 제거하였다. 혼합물을 마지막으로 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0.5%에서 10% 20분 구배로 정제하여 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드를 수득하였다. 이 물질을 DCM (1 mL) 및 메탄올 (0.5 mL) 중에 용해시키고, 에테르 중 1 M 염화수소 (0.66 mL, 660 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (329 mg, 78%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 481 (M+H).

실시예 3

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

라세미 N-[3-[2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (451 mg, 929 μmol)를 SFC (칼럼: 키랄셀 OD-H (5 um), 2.1 x 25 cm; 용리액: CO₂ 중 40% 메탄올 (0.2% 이소프로필아민; 유량 70 mL/분, UV 225 nm)로 키랄 정제하였다. 제1 용리 이성질체의 키랄 분석: 칼럼: 키랄셀 OD-H (5 μm), 4.6 x 150 mm; 용리액: CO₂ 중 40% 메탄올 (0.2% 이소프로필아민); 유량 5 mL/분, UV 225 nm은 R_t = 1.01분의 거울상이성질체적으로 풍부한 (>99% ee) 거울상이성질체 (175 mg, 360 μmol)를 확인하였다. 이 물질 (유리 염기, 이성질체 1)을 DCM (1 mL) 및 메탄올 (0.5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.36 mL, 360 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (183 mg, 38%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 486 (M+H).

실시예 4

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 히드로클로라이드.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (0.350 g, 0.58 mmol, 이성질체 1)를 THF (2 mL)에 중에 용해시킨 다음, 메탄올 (4 mL) 및 에탄올 (4 mL)을 첨가하였다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (495 mg, 5.81 mmol) 및 피리딘 (470 μL, 5.81 mmol)을 혼합물에 첨가하고, 반응물을 50℃로 가온하고, 밤새 교반하였다. 실리카 겔 (~10 g)을 반응물에 첨가하고, 혼합물을 농축시켰다. 실리카 겔 상에서 건조시킨 샘플을 비어있는 카트리지 상에 로딩하고, DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0-10% 구배로 용리시켜 정제하였다. 생성물을 재차 SCX 칼럼 상에서 3:1 DCM:메탄올에 이어서 2:1 DCM:메탄올 중 7 N 암모니아를 사용하여 정제하였다. 생성물을 마지막으로 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0%에서 10% 구배로 정제하여 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다. 이 물질을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.20 mL, 660 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (71 mg, 23%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 498 (M+H).

실시예 5

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드 (수화됨).

아세토니트릴 (500 mL)을 디메틸포름아미드 (19.2 mL, 248.9 mmol)에 첨가하였다. 옥살릴 클로라이드 (39.3 g, 309.63 mmol)에 이어서 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (46.0g, 298.4 mmol)을 디메틸포름아미드 용액에 첨가하였다. 분리형 플라스크에서, (4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,6,7,7a-헥사히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민의 수용액 (56.8 g, 156.75 mmol)을 아세토니트릴 (500 mL)에 첨가하고, pH를 수산화암모늄 (95 mL)을 사용하여 9로 조정하였다. 이어서, 이 혼합물을 50-55℃로 가열하였다. 산 클로라이드 용액을 적가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. pH를 수산화암모늄을 사용하여 8-9로 조정하였다. 생성된 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물 (123 g)을 수득하였다. 고체를 아세톤 (250 mL) 중에서 1.5시간 동안 슬러리화하고, 여과하였다. 습윤 케이크를 아세톤으로 세척하고 표제 화합물 (110g, 90.5% 순도, HPLC에 의함.)을 수득하였다. THF (1 L) 및 활성탄 (9 g)을 고체에 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, THF (150 mL)로 세척하였다. 유기 용액을 10 부피로 농축시키고, 60℃로 가열하였다. 물 (430 mL)을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 10시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, THF/물 (7:6)로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물 (69 g, 88%)을 수득하였다. LC-MS: m/z=499 (M+1), 순도: 98.3%.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.99 - 3.07 (m, 2 H) 3.07 - 3.14 (m, 1 H) 3.58 - 3.67 (m, 1 H) 3.68 - 3.76 (m, 1 H) 3.76 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 (s, 3 H) 4.07 (d, J=10.92 Hz, 1 H) 6.08 (s, 2 H) 7.19 (dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H) 7.78 - 7.89 (m, 2 H) 8.41 (s, 1 H) 8.44 (s, 2 H) 8.88 (s, 1 H) 10.60 (s, 1 H).

X선 분말 회절 (XRD)

결정질 고체의 XRD 패턴을 CuKa 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 구비되고 35 kV 및 50 mA에서 작동하는 브루커 D4 엔데버(Bruker D4 Endeavor) X선 분말 회절계 상에서 수득하였다. 샘플을 2θ에서의 0.009°의 스텝 크기 및 0.5초/스텝의 스캔 속도, 및 0.6 mm 발산, 5.28 고정된 산란방지 슬릿, 및 9.5 mm 검출기 슬릿을 사용하여 2θ에서의 4 내지 40°를 스캔하였다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고, 평활면을 유리 슬라이드를 사용하여 수득하였다. 결정 형태 회절 패턴을 주위 온도 및 상대 습도에서 수집하였다. 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 회절 피크의 상대 강도가 결정 형태 및 습성과 같은 요인으로부터 생성된 바람직한 배향으로 인해 변할 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우에, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 게다가, 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 각도 피크 위치는 약간 변할 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변동, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동될 수 있다. 본 경우에, 2θ에서의 ± 0.2의 피크 위치 변동성은 나타낸 결정 형태의 명백한 확인을 저해하지 않으면서 이들 잠재적 변동을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 특징적인 피크 (° 2θ의 단위), 전형적으로 보다 현저한 피크의 임의의 고유한 조합을 기준으로 수행될 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴을 8.853 및 26.774 도 2-세타에서의 NIST 675 표준 피크를 기준으로 하여 조정하였다.

결정질 형태 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드의 제조된 샘플을 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 하기 표 2에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로 특징화하였다. 구체적으로, 패턴은 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 18.6°, 19.3°, 및 26.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 11.8°에서의 피크를 함유하였다.

표 2: 실시예 5의 결정질 형태 2의 X선 분말 회절 피크

실시예 6

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-시아노-피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-5-시아노-피리딘-2-카르복스아미드 (360 mg, 0.59 mmol)를 에탄올 (10 mL) 및 DCM (2 mL) 중에 용해시켰다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (504 mg, 5.91 mmol) 및 피리딘 (478 μL, 5.91 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 주말 동안 교반하였다 (70 시간). 반응물을 60℃로 가온하고, 24시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축시켜 조 생성물을 수득하고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0-10% 구배를 사용하여 정제하여 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다. 이 물질을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.54 mL, 540 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (240 mg, 75%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 475 (M+H).

실시예 7

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (330 mg, 0.53 mmol)를 THF (10 mL) 중에 용해시키고, 에탄올 (10 mL)로 희석하였다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (453 mg, 5.32 mmol) 및 피리딘 (430 μL, 5.91 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 주말 동안 교반하였다 (70 시간). 반응물을 60℃로 가온하고, 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실리카 겔 (~10 g) 상에서 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0-10% 구배를 사용하여 정제하여, 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다. 이 물질을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.49 mL, 490 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (159 mg, 54%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 486(M+H).

실시예 8

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-시아노-피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-시아노-피리딘-2-카르복스아미드 (133 mg, 0.22 mmol, 이성질체 1)를 THF (1 mL) 중에 용해시키고, 메탄올 (3 mL) 및 에탄올 (3 mL)로 희석하였다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (190 mg, 2.2 mmol) 및 피리딘 (180 μL, 2.2 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 50℃로 가온하고, 밤새 교반하였다. 혼합물을 실리카 겔 (~10 g) 상에서 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0-10% 구배로 용리시키면서 정제하였다. 이 물질을 SCX 칼럼 상에서 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아를 사용하여 재차 정제하였다. 혼합물을 마지막으로 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0%에서 10% 구배로 정제하여 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다. 이 물질을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.27 mL, 270 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (114 mg, 97%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 493 (M+H).

실시예 9

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드

N-[3-[(4aR,7aS)-2-벤즈아미도-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 (190 mg, 0.31 mmol, 이성질체 1)를 THF (1 mL) 중에 용해시키고, 메탄올 (3 mL) 및 에탄올 (3 mL)로 희석하였다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (267 mg, 3.1 mmol) 및 피리딘 (253 μL, 3.1 mmol)을 첨가하고, 반응물을 50℃로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 SCX 칼럼에 의해 3:1 DCM:메탄올에 이어서 메탄올 중 2:1 DCM:7 N 암모니아를 사용하여 정제하였다. 이 물질을 마지막으로 실리카 겔 상에서 DCM 중 7 N 암모니아 메탄올의 0%에서 10% 구배로 정제하여 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다. 이 물질을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 중 1 M 염화수소 (0.20 mL, 200 μmol)를 첨가하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물 (101 mg, 60%)을 수득하였다. ES/MS (m/e): 504 (M+H).

실시예 10

N-[3-[(4aR,7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-3,5-디플루오로-피리딘-2-카르복스아미드

옥살릴 클로라이드 (10.5 ml, 136,4 mmol)를 아세토니트릴 (617 mL) 및 디메틸포름아미드 (10.5 mL) 중 3,5-디플루오로피콜린산 (19.9 g, 125 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 용액을 에탄올 (823 mL) / 물 (823 mL) 혼합물 중에서 (4aR,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4,4a,5,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (41.1 g, 113 mmol)의 새로이 제조된 용액에 첨가하고, 사전에 50℃로 가열하였다. 반응물을 50℃에서 1시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 22℃로 냉각시키고, 용매를 증발시켰다. 수용액을 DCM (1 L)으로 희석하고, pH를 2 M 수산화나트륨을 사용하여 pH=11로 조정하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 추가의 DCM (2 x 400 mL)으로 세척하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 0-10% DCM으로부터의 암모니아화 메탄올 2 N / DCM의 구배를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 회백색 고체 (45 g, 78%)로서 수득하였다. ES/MS (m/e): 504 (M+1).

시험관내 검정 절차:

시험관내 효소 및 세포 검정을 위해, 시험 화합물을 DMSO 중에서 제조하여 10 mM 원액을 만들었다. 원액을 DMSO 중에서 연속적으로 희석하여 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 10 mM 내지 0.05 nM 범위의 최종 화합물 농도로 10-포인트 희석 곡선을 산출한 후에, 시험관내 효소 및 전세포 검정을 수행하였다.

시험관내 프로테아제 억제 검정:

인간 BACE1의 발현

인간 BACE1 (수탁 번호: AF190725)을 RT-PCR에 의해 총 뇌 cDNA로부터 클로닝하였다. 아미노산 서열 #1 내지 460에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 인간 IgG₁ (Fc) 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA에 삽입하였다 (문헌 [Vasser et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조). huBACE1:Fc로 명명되는 BACE1(1-460) 및 인간 Fc의 이러한 융합 단백질을 pJB02 벡터에 구축하였다. 인간 BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc)를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현하였다. 각각의 구축물의 cDNA 250 μg을 퓨젠(Fugene) 6과 혼합하고, 1 리터 HEK293 세포에 첨가하였다. 형질감염 4일 후에, 정제를 위해 조건화 배지를 수확하였다.

huBACE1:Fc의 정제

huBACE1:Fc를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 효소를 작은 분취량으로 -80℃에서 보관하였다.

BACE1 FRET 검정

시험 화합물의 일련의 희석액을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 화합물을 KH₂PO₄ 완충제 중에서 20x 추가 희석하였다. 10 μL의 각 희석액을 반응 혼합물 (25 μL의 50 mM KH₂PO₄, pH 4.6, 1 mM 트리톤(TRITON)® X-100, 1 mg/mL 소 혈청 알부민, 및 15 μM의 FRET 기질)을 함유하는 상응하는 저 단백질 결합 흑색 플레이트의 A열 내지 H열의 각 웰에 첨가하였다 (문헌 [Yang, et al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)] 참조). 내용물을 플레이트 진탕기 상에서 10분 동안 잘 혼합하였다. KH₂PO₄ 완충제 중 200 pM 인간 BACE1(1-460):Fc (문헌 [Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조) 15 μL를 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트에 첨가하여 반응을 개시하였다. 플레이트 진탕기 상에서 간단히 혼합한 후, 시간 0에서의 혼합물의 RFU를 여기 파장 355 nm 및 방출 파장 460 nm에서 기록하였다. 반응 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 어둡고 습한 오븐에서 실온에서 16 내지 24시간 동안 유지하였다. 인큐베이션의 종료 시 RFU를 시간 0에 사용된 동일한 여기 및 방출 설정으로 기록하였다. 시간 0 및 인큐베이션의 종료 시 RFU의 차이는 화합물 처리 하에서의 BACE1의 활성을 대표한다. RFU 차이를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고, 곡선을 4-파라미터 로지스틱 방정식에 대입하여, EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 구하였다. (문헌 [Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)] 참조).

하기 예시된 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되었고, BACE1에 대해 하기 활성을 나타내었다:

표 3

평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차

이들 데이터는, 표 3의 화합물이 시험관내에서 정제된 재조합 BACE1 효소 활성을 억제함을 증명한다.

베타-세크레타제 활성의 억제를 측정하기 위한 전세포 검정

HEK293Swe 전세포 검정

베타-세크레타제 활성의 억제를 측정하기 위한 통상적인 전세포 검정에서는, 흔히 스웨덴 돌연변이로 불리며 A베타를 과다생성하는 것으로 제시된, Lys651Met652에서 Asn651Leu652로의 자연 발생 이중 돌연변이를 함유하는 인간 APP751 cDNA를 안정하게 발현하는 인간 배아 신장 세포주 HEK293p (ATCC 수탁 번호 CRL-1573) (HEK293Swe로 지칭됨)를 사용하였다 (문헌 [Citron, et al., Nature, 360, 672-674 (1992)]). 시험관내 A베타 감소 검정은 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Dovey, et al., Journal of Neurochemistry, 76, 173-181 (2001); Seubert, et al., Nature, 361, 260 (1993); 및 Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)] 참조).

세포 (3.5 x 10⁴개 세포/웰의 HEK293Swe, 10% FBS 함유 배양 배지 DMEM 200 μL를 함유함)를 목적하는 농도의 억제제 (DMSO로 희석됨)의 존재/부재 하에 37℃에서 4 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 종료 시, 예를 들어 A베타 펩티드를 분석함으로써 베타-세크레타제 활성의 증명을 위해 조건화 배지를 분석하였다. 총 A베타 펩티드 (A베타 1-x)를 포획 항체로서 모노클로날 266 및 리포팅 항체로서 비오티닐화 3D6을 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 대안적으로, A베타 1-40 및 A베타 1-42 펩티드를 A베타 1-40의 경우에 포획 항체로서 모노클로날 2G3 및 A베타 1-42의 경우에 포획 항체로서 모노클로날 21F12를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. A베타 1-40 및 A베타 1-42 ELISA 둘 다 리포팅 항체로서 비오티닐화 3D6을 사용하였다. 화합물 처리 후 조건화 배지 중에 방출된 A베타의 농도는 이러한 조건 하에서의 BACE1의 활성에 상응하였다. 10-포인트 억제 곡선을 표시하고, 4-파라미터 로지스틱 방정식에 대입하여 A베타-저하 효과에 대한 EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 구하였다. 하기 예시된 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되었고, A베타 저하 효과에 대해 하기 활성을 나타내었다:

표 4

이들 데이터는 표 4의 화합물이 전세포의 천연 A베타 생산을 강력하게 억제한다는 것을 증명한다.

PDAPP 1차 뉴런 검정

확증적 전세포 검정을 또한 PDAPP 트랜스제닉 배아 마우스로부터 생성된 1차 뉴런 배양물에서 수행하였다. 1차 피질 뉴런을 배아의 제16일 PDAPP 배아로부터 제조하고, 96 웰 플레이트 (DMEM/F12 (1:1) 플러스 10% FBS 중 15 x 10⁴개 세포/웰)에서 배양하였다. 시험관내에서 2일 후, 배양 배지를 B27 보충물 및 2 μM (최종)의 아라-C(Ara-C) (시그마(Sigma), C1768)를 함유하는 무혈청 DMEM/F12 (1:1)로 대체하였다. 시험관내 제5일에, 뉴런을 목적하는 농도의 억제제 (DMSO 중에 희석됨)의 존재/부재 하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 종료 시, 베타-세크레타제 활성의 증명을 위해 조건화 배지를 분석, 예를 들어 A베타 펩티드를 분석하였다. 총 A베타 펩티드 (A베타 1-x)를 포획 항체로서 모노클로날 266 및 리포팅 항체로서 비오티닐화 3D6을 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 다르게는, A베타 1-40 및 A베타 1-42 펩티드를 A베타 1-40의 경우에 포획 항체로서 모노클로날 2G3 및 A베타 1-42의 경우에 포획 항체로서 모노클로날 21F12를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. A베타 1-40 및 A베타 1-42 ELISA 둘 다 리포팅 항체로서 비오티닐화 3D6을 사용하였다. 화합물 처리 후 조건화 배지 중에 방출된 A베타의 농도는 이러한 조건 하에서의 BACE1의 활성에 상응하였다. 10-포인트 억제 곡선을 표시하고, 4-파라미터 로지스틱 방정식에 대입하여 A베타-저하 효과에 대한 EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 구하였다. 하기 예시된 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되었고, A베타 저하 효과에 대해 하기 활성을 나타내었다:

표 5

평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차

이들 데이터는 표 5의 화합물이 전세포의 A베타 생산을 강력하게 억제함을 증명한다.

베타-세크레타제의 생체내 억제

마우스, 기니 피그, 개, 및 원숭이를 포함한 여러 동물 모델을 사용하여 화합물 처리 후의 생체내 베타-세크레타제 활성의 억제에 대해 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 사용된 동물은 야생형, 트랜스제닉, 또는 유전자 녹아웃 동물일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)]에 기재된 바와 같이 제조된 PDAPP 마우스 모델, 및 다른 비-트랜스제닉 또는 유전자 녹아웃 동물은 억제 화합물의 존재 하에 생체내 A베타 및 sAPP베타 생산의 억제를 분석하는데 유용하였다. 일반적으로, 2 내지 12월령의 PDAPP 마우스, 유전자 녹아웃 마우스 또는 비-트랜스제닉 동물에게 비히클, 예컨대 옥수수 오일, 시클로덱스트란, 포스페이트 완충제, 파마솔브(PHARMASOLVE)®, 또는 다른 적합한 비히클 중에 제제화된 화합물을 투여하였다. 화합물 투여 1 내지 24시간 후에, 동물을 희생시키고, 뇌 뿐만 아니라 뇌척수액 및 혈장을 A베타, C99 및 sAPP 단편의 분석을 위해 제거하였다. (문헌 [May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)] 참조).

표준 생체내 약동학적 연구를 위해, 동물에게 다양한 농도의 화합물을 투여하였고, 동일한 시간에 투여한 비히클-처리 대조군과 비교하였다. 일부 시간 경과 연구를 위해, 시간 0에서 시작하여 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액을 선택된 동물로부터 수득하여, 기준선을 수립하였다. 화합물 또는 적절한 비히클을 다른 군에 투여하고, 투여 후에 다양한 시점에 희생시켰다. 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액을 선택된 동물로부터 수득하여, A베타 펩티드, sAPP베타 및 다른 APP 단편을 포함한 APP 절단 생성물의 존재에 대해 예를 들어 특이적 샌드위치 ELISA 검정에 의해 분석하였다. 시험 기간의 종료 시, 동물을 희생시키고, 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액을 적절하게는 A베타 펩티드, C99 및 sAPP베타의 존재에 대해 분석하였다. APP 트랜스제닉 동물의 뇌 조직을 또한 화합물 처리 후 베타-아밀로이드 플라크의 양에 대해 분석하였다. 본원에 사용된 "A베타 1-x 펩티드"는 잔기 1로 시작하여 잔기 28초과의 C-말단으로 종결하는 A베타 종의 합을 지칭한다. 이것은 대부분의 A베타 종을 검출하고, 종종 "총 A베타"으로 불린다.

억제성 화합물을 투여한 동물 (PDAPP 또는 다른 APP 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 마우스)은 비히클-처리 대조군 또는 시간 0 대조군에 비해, 뇌 조직, 혈장 또는 뇌척수액에서 A베타 또는 sAPP베타의 감소, 및 뇌 조직에서 베타 아밀로이드 플라크의 감소를 증명할 수 있다. 어린 암컷 PDAPP 마우스에게 실시예 1의 화합물의 1, 3 또는 10 mg/kg 경구 용량을 투여한 지 3시간 후에, 비히클-처리 마우스와 비교하여, A베타 1-x 펩티드 수준을 각각 뇌 해마에서는 대략 34%, 48% 및 53%, 및 뇌 피질에서는 대략 43%, 59% 및 66% 감소시켰다.

실시예 3의 화합물의 1 또는 3 mg/kg 경구 용량을 투여한 지 3시간 후에, 비히클-처리 마우스와 비교하여 A베타 1-x 펩티드 수준을 각각 뇌 해마에서는 대략 38% 및 50%, 및 뇌 피질에서는 대략 34% 및 53% 감소시켰다.

실시예 4에서, 화합물의 0.3, 1 또는 3 mg/kg 경구 용량의 투여한 지 3시간 후에 , 비히클-처리 마우스와 비교하여 A베타 1-x 펩티드 수준을 각각 뇌 해마에서 대략 31%, 39% 및 61%, 및 뇌 피질에서는 대략 28%, 42% 및 64% 감소시켰다.

시험관내 BACE 효소에 대한 실시예 1, 3, 및 4의 활성을 고려하면, 이러한 A베타 저하 효과는 생체내 BACE 억제와 일치하고, 추가로 실시예 1, 3, 및 4의 CNS 침투를 증명한다.

이들 연구는 실시예 1 내지 9의 화합물이 BACE를 억제하고, 따라서, A베타 수준을 감소시키는데 유용하다는 것을 제시한다.

조합물 연구

BACE 억제제 공급 파일럿 실험

파일럿 약동학적 및 약역학적 연구는, BACE 억제 단독에 의해 최소 내지 현저한 혈장 및 뇌 A베타 감소를 제공하는 용량을 정의하기 위해 BACE 억제제, 예컨대 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 사료 식이를 PDAPP 마우스에게 공급하여 수행하였다. 어린 PDAPP 마우스에게는 14일 동안 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 100 mg/kg의 "준-bid" 등가 용량의 BACE 억제제를 함유하는 사료 식이를 함유하는 식이를 공급하였다. 인증된 설치류 식이 #8728CM (Harlan labs(하를란 랩스)) 그램당 ~ 0.05, 0.15, 0.5 또는 1.5 mg의 BACE 억제제를 펠릿화 이전에 10분 동안 소르발(Sorvall) 혼합기에서 혼합한 다음에 15분 동안 호바트(Hobart) 혼합기에서 혼합하였다. 32마리의 어린 암컷 PDAPP 마우스를 모 세포주에 따라 비히클-처리군 및 3회 용량의 BACE 억제제로 이루어진 8마리의 4개 군으로 무작위화하였다. 마우스를 14일 동안 음식물에 대한 무제한 접근하도록 하고 후속적으로 희생시켰다. 마우스를 CO₂에 의해 마취시키고, 혈액을 EDTA-코팅된 마이크로원심분리 튜브로 심장 천자에 의해 수집하고, 얼음 상에서 보관하였다. 후속적으로, 혈장을 실온에서 14,000 rpm에서 4분 동안 혈액 샘플의 원심분리에 의해 수집하고, 비처리된 마이크로원심분리 튜브에 전달한 다음, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, 분석까지 -80℃에서 보관하였다. 마우스를 단두에 의해 희생시키고, 뇌를 급속하게 절반으로 미세-절제하고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, 분석까지 -80℃에서 보관하였다 (하나의 절반은 A베타 분석 및 다른 절반은 화합물 노출 측정을 위함). 실질 A베타의 분석을 위해, 뇌 샘플을 약 1분 동안 속도 5에 조직 티어러 (모델 985-370)로 5.5 M 구아니딘-HCl 완충제 (절반 뇌당 0.5 mL) 중에 균질화시켰다. 균질화된 뇌 샘플을 밤새 실온에서 장동운동시켰다.

A베타 ELISA 분석을 위해, 추출물을 수집하고, 카세인 완충제 (프로테아제 억제제 칵테일 (0.01 mg/mL의 시그마 P9340)을 갖는 0.25% 카세인, 0.05% 트윈 20, 0.1% 티메로살, pH 7.4를 갖는 1x PBS)로 적어도 1:10으로 희석하고, 10분 동안 14000 rpm에서 원심분리하였다. 혈장 A베타의 분석을 위해, 샘플을 ELISA에 의한 분석 이전에, 시편 완충제 (PBS; 0.05% 트리톤 X-405; 0.04% 티메로살, 0.6% BSA)로 1:2 희석된다. 혈장 인간 A베타₁ _-x를 각각 m266.2 (항-A베타₁₃ _-28) 및 비오티닐화 3D6 (항-A베타1-5)을 포획 및 리포터 항체로서 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 결정하였다. 미지의 것들을 8 포인트 표준 곡선으로부터 내삽 (기준 곡선의 4-파라미터 피트를 사용하는 소프트 맥스 프로(Soft Max Pro) v. 5.0.1, 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics))한 다음에 희석을 위해 조정함으로써 이중으로 분석하고 pg/mL 결정하였다. 실질 A베타를 상기 기재된 바와 같이 샌드위치 ELISA에 의해 결정하고, 값을 단백질 수준 (브래드포드 쿠마시 플러스 프로테인(Bradford Coomassie Plus Protein) 방법에 의해 이중으로 결정됨)으로 정규화하고, pg/mg 단백질로서 표현하였다.

BACE 억제제의 조직 및 혈장 수준을 결정하기 위해, 하기 방법을 이용하였다: BACE 억제제의 0.1 mg/mL 원액을 메탄올/물 (1:1, v/v)로 연속적으로 희석하여 작업 용액을 제조하였으며, 이를 이어서 대조군 혈장 및 뇌 균질물을 강화시키는데 사용하여 1, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 및 5000 ng/mL의 분석물 농도를 산출하였다. 분석 이전에, 뇌 샘플을 초음파 교란제를 사용하여 메탄올/물 (1:4, v/v)의 3-배 부피로 균질화시켰다. 각각의 연구 샘플, 적절한 보정 표준 및 대조군 매트릭스 샘플의 분취물을 96-웰 플레이트에 전달한 다음, 내부 표준을 함유하는 아세토니트릴과 혼합하였다. 혼합한 후에, 샘플을 원심분리하여 침전된 단백질을 펠릿화하였다. 이어서, 생성된 상청액의 분취물은 깨끗한 96-웰 플레이트에 전달하고, 메탄올/물 (1:1, v/v)로 희석하고, 10 마이크로리터 분취물을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 분석물 농도를 보정 곡선 샘플의 다중 회귀에 의해 결정된 농도 관계에 대한 반응을 사용하여 계산하였다.

생체내 조합 연구

항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체 예컨대 항-N3pGlu-A베타 모노클로날 항체 VII (참조: 표 1, mE8c-IgG2a; 미국 특허 번호 8,679,498 B2에 기재된 바와 같음; USSN 13/810,895) 및 BACE 억제제 예컨대 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합적인 플라크 저하 요법을 평가하기 위해, PDAPP 마우스의 대형 코호트를 먼저 16 내지 18월령으로 에이징시켰다. 에이징된 PDAPP 마우스를 성별, 모 세포주, 및 연령을 기준으로 5개의 치료 아암으로 무작위화하였다. 치료 아암당 20 내지 30마리의 에이징된 PDAPP 마우스가 있었다. 군 1을 치유적 치료 (하기 기재된 부검) 이전에 병리상태의 기준선 수준을 결정하기 위해 연구 개시에서 시간 0으로서 희생시켰다. 이어서, 나머지 4개 군을 하기와 같이 처리하였다: 군-2, 위약 사료 식이 및 12.5 mg/kg의 대조군 이소형 IgG2a의 매주 주사를 제공받은 대조군 동물; 군-3, 12.5 mg/kg의 항-N3pGlu-A베타 모노클로날 항체의 매주 주사를 제공받은 동물; 군-4, 파일럿 공급 연구에서 이전에 정의되었으나 전형적으로 ~3 내지 30 mg/kg/일의 용량의 BACE 억제제 사료 식이를 제공받은 동물; 군-5, BACE 억제제 사료 식이 (~3 내지 30 mg/kg/일) 및 12.5 mg/kg의 항-N3pGlu-A베타 모노클로날 항체의 매주 주사를 제공받은 동물. 항-N3pGlu-A베타 모노클로날 항체를 PBS 완충제에 항체로 이루어진 멸균 원액으로부터 희석하고, 복강내 주사에 의해 동물에게 투여하였다. BACE 억제제를 느슨한 사료 식이 (목적하는 용량에 따른 공급의 그램당 ~0.15 내지 1.5 mg 화합물)와 혼합하고, 공급 펠릿으로 압축하였다. 동물 중량을 연구 개시 및 후속적으로 처리의 제1 개월 동안 매주 기록한 다음, 연구 지속시간 동안 매주 기록하였다. 음식물 섭취를 또한 연구의 과정에 걸쳐 규칙적 간격으로 모니터링하였다. 동물은 총 4-개월 동안 연구 치료를 제공받았다. 동물을 최종 항체 주사 1주 후에 발생하는 부검까지 그들의 각각의 식이를 유지하였다. 부검 시점에서, 동물을 마취시키고, 혈액을 EDTA 사전-세정된 1ml 시린지를 사용하는 심장 천자에 의해 수득하였다. 혈액 샘플을 얼음 상에서 수집하고, 혈장을 표준 원심분리에 의해 단리시켰다. 후속적으로, 동물을 저온 헤파린첨가 염수로 관류하고, 뇌를 제거하고, 좌우 반구로 해부하였다. 하나의 뇌 반구를 조직학적 분석을 위해 급속 동결하고 저장하였다. 나머지 뇌 반구를 해마, 피질, 소뇌 및 중뇌로 이루어진 조직 절편으로 해부하고, 후속적으로 드라이 아이스 상에서 동결시켰다. 혈장 및 조직 샘플을 분석 시점까지 -80℃에서 보관하였다.

약동학적 평가

혈장 약동학을 부검 시점에서 수득된 혈장 샘플 상에서 결정하였다. 혈장 항체 수준을 항원 결합 ELISA 검정에서 결정하며, 여기서 플레이트를 항원 (A베타_p3-42)으로 코팅하고, 후속적으로 희석된 혈장 샘플 또는 검정 완충제 (PBS + 뮤린 혈장 대조군) 중 항-N3pGlu 모노클로날 항체의 연속 희석물로 이루어진 참조 표준과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후에, 결합된 뮤린 항체를 항-뮤린-HRP 접합된 항체에 이어서 TMB로의 색 발현으로 검출하였다. BACE 억제제의 조직 (중뇌) 및 혈장 수준을 결정하기 위해, 하기 방법을 이용하였다: BACE 억제제의 0.1 mg/mL 원액을 메탄올/물 (1:1, v/v)로 연속적으로 희석하여 작업 용액을 제조하였으며, 이를 이어서 대조군 혈장 및 뇌 균질물을 강화시키는데 사용하여 1, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 및 5000 ng/mL의 분석물 농도를 산출하였다. 분석 이전에, 뇌 샘플을 초음파 교란제를 사용하여 메탄올/물 (1:4, v/v)의 3-배 부피로 균질화시켰다. 각각의 연구 샘플, 적절한 보정 표준 및 대조군 매트릭스 샘플의 분취물을 96-웰 플레이트에 전달한 다음, 내부 표준을 함유하는 아세토니트릴과 혼합하였다. 혼합한 후에, 샘플을 원심분리하여 침전된 단백질을 펠릿화하였다. 이어서, 생성된 상청액의 분취물은 깨끗한 96-웰 플레이트에 전달하고, 메탄올/물 (1:1, v/v)로 희석하고, 10 마이크로리터 분취물을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 분석물 농도를 보정 곡선 샘플의 다중 회귀에 의해 결정된 농도 관계에 대한 반응을 사용하여 계산하였다.

약역학적 평가

실질 A베타 농도를 샌드위치 ELISA에 의해 구아니딘 가용화된 조직 균질물에서 결정하였다. 조직 추출을 비드 비터(bead beater) 기술로 수행하였으며, 여기서 동결된 조직을 실리콘화 유리 비드 1 ml를 함유하는 2 ml 딥 웰 디쉬 내 pH 8.0에서 5.5 M 구아니딘/50 mM 트리스/ 0.5X 프로테아제 억제제 칵테일 1 ml로 추출하였다 (밀봉된 플레이트를 각각 3-분의 2개 구간 동안 진탕되었음). 생성된 조직 용해물을 A베타₁ _-40 및 A베타₁ _-42에 대해 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다: 비드 비터 샘플을 2% BSA/PBS-T에 1:10 희석하고, 샘플 플레이트 (밀리포어(Millipore))를 통해 여과하였다. 샘플, 블랭크, 표준, 품질 관리 샘플을 샘플 플레이트에 로딩하기 이전에 2% BSA/PBST에 중 0.55 M 구아니딘/5 mM 트리스에 추가로 희석하였다. 참조 표준을 샘플 희석제에 희석하였다. 15 μg/ml의 포획 항체 21F12 (항-A베타₄₂) 또는 2G3 (항-A베타₄₀)으로 코팅된 플레이트를 샘플과 함께 인큐베이션하고, 검출을 2% BSA/PBS-T에 희석된 비오티닐화 3D6 (항-A베타₁ _-x), 이어서 2% BSA/PBS-T 중 1:20 K 희석 뉴트라비딘-HRP (피어스(Pierce)) 및 TMB (피어스)로의 색 발현으로 달성하였다. A베타 수준을 표준 곡선으로부터 내삽하고, 최종 조직 농도를 조직 습윤 중량의 밀리그램당 A베타의 나노그램으로 계산하였다. 침착된 A베타에 의해 점유된 해마 및 피질의 퍼센트 면적을 조직학적으로 결정하였다. 저온유지 연속 관상 절편 (7 내지 10μm 두께)을 10 μg/ml의 비오티닐화 3D6 (항-A베타₁ _-x) 또는 음성 대조군 뮤린 IgG (비오티닐화)와 함께 인큐베이션하였다. 비오틴에 특이적인 2차 HRP 시약을 이용하고, 침착된 A베타를 DAB-플러스(DAB-Plus) (다코(DAKO))로 가시화하였다. 면역반응성 A베타 침착물을 이미지 프로 플러스(Image Pro plus) 소프트웨어 (미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics))로 캡쳐된 이미지를 분석함으로써 해마 또는 피질 내에서 정의된 관심 면적으로 정량화하였다.

이들 연구는 항-N3pGlu-A베타 모노클로날 항체 및 BACE 억제제, 예컨대 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합 요법이 개별 단독-요법에 비해 증진된 A베타 감소를 생성할 수 있음을 제시할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company MAY, Patrick MERGOTT, Dustin <120> COMBINATION THERAPY <130> P20348 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Val Gln Gly Thr His Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Glu Gly Ile Thr Val Tyr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Gly Thr Thr Val Tyr 1 5 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Thr Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 13 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 14 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Thr Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440

Claims

유효량의 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량의 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 조합하여 포함하는, 환자에서 알츠하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
제1항에 있어서, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 B12L 또는 R17L인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 B12L인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드인 제약 조성물.
제5항에 있어서, 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드가 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 18.6°, 19.3° 및 26.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 11.8°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 것인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물 및 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 동시에 투여되는 것인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체의 투여 이전에 투여되는 것인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 화합물의 투여 이전에 투여되는 것인 제약 조성물.
항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체와 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와의 제약 조성물과 조합된, 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는, 환자에서 알츠하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
제10항에 있어서, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 B12L 또는 R17L인 제약 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 항-N3pGlu A베타 모노클로날 항체가 B12L인 제약 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 화합물이 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드인 제약 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 화합물이 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드인 제약 조성물.
제14항에 있어서, 결정질 형태 2 N-[3-[(4aR, 7aS)-2-아미노-6-(5-플루오로피리미딘-2-일)-4a,5,6,7-테트라히드로피롤로[3,4-d][1,3]티아진-7a(4H)-일]-4-플루오로-페닐]-5-메톡시-피라진-2-카르복스아미드가 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 18.6°, 19.3° 및 26.7°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 함께 11.8°의 회절각 2-세타에서, X선 회절 스펙트럼에서의 실질적인 피크를 특징으로 하는 것인 제약 조성물.
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