EA031764B1

EA031764B1 - КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМБИНАЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К N3PGLU Аβ И ИНГИБИТОРА BACE

Info

Publication number: EA031764B1
Application number: EA201790305A
Authority: EA
Inventors: Патрик Корнелиус Мэй; Дастин Джеймс Мерготт
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2019-02-28
Also published as: US20170224702A1; AU2015318257A1; KR101871128B1; AU2015318257B2; ECSP17015977A; CR20170080A; AR101740A1; ZA201700826B; CN106687136A; TN2017000072A1; JP6339741B2; AP2017009794A0; MX2017003414A; IL250387A0; NZ728636A; PH12017500493A1; SG11201701330PA; SV2017005389A; CA2956835A1; EA201790305A1

Abstract

Изобретение обеспечивает способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулыили его фармацевтически приемлемой соли; в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Aβ. Более того, настоящее изобретение предусматривает набор для лечения болезни Альцгеймера, включающий указанные соединение и моноклональное антитело, а также их применение для лечения упомянутого заболевания.

Description

Настоящее изобретение относится к комбинации ингибитора ВАСЕ с моноклональным антителом к N3pGlu Αβ и к способам ее применения для лечения некоторых неврологических нарушений, таких как болезнь Альцгеймера.

Настоящее изобретение относится к области лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний и нарушений, в которых участвует амилоидный пептид β (Αβ), нейротоксичный и имеющий высокую склонность к агрегации пептидный сегмент белка-предшественника амилоида (АРР). Болезнь Альцгеймера представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, которым страдают миллионы пациентов по всему миру. Ввиду того, доступные в настоящее время на рынке одобренные средства обеспечивают только временное симптоматическое благоприятное действие у пациента, существует неудовлетворенная потребность в средствах лечения болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера характеризуется выработкой, агрегацией и отложением Αβ в головном мозге. Было показано, что полное или частичное ингибирование β-секретазы (фермента, расщепляющего белокпредшественник амилоида по β-сайту; ВАСЕ) оказывает значительное воздействие на патологии, связанные бляшками или зависимые от бляшек, в мышиных моделях. Это позволяет предположить, что даже небольшое снижение уровня пептида Αβ может обеспечивать долгосрочное значительное снижение объема бляшек и синаптического дефицита и тем самым значительные полезные терапевтические эффекты, в частности при лечении болезни Альцгеймера.

Кроме того, было показано, что антитела, специфически нацеленные на N3pGlu Αβ, снижают уровень бляшек in vivo (заявка на патент США № 2013/0142806). N3pGlu Αβ, который также называют N3pE или Aβ_p3-42, представляет собой процессированную форму пептида Aβ, присутствующую исключительно в бляшках. Несмотря на то, что пептид N3pGlu Aβ является минорным компонентом Aβ в отложениях в головном мозге, в исследованиях было продемонстрировано, что пептид N3pGlu Αβ имеет очень высокую склонность к агрегации и быстро накапливается в процессе отложения.

Желаемым эффектом комбинации ингибитора ВАСЕ с антителом, которое связывается с пептидом N3pGlu Αβ, является обеспечение средства лечения нарушений, опосредуемых пептидом Αβ, таких как болезнь Альцгеймера, которое может быть более эффективным, чем каждое лекарственное средство, применяемое по отдельности.

Например, при лечении с применением указанной комбинации можно применять более низкие дозы любого одного или обоих лекарственных средств по сравнению с применением каждого лекарственного средства по отдельности, что может снижать побочные эффекты при сохранении эффективности. Полагают, что направленное удаление образующих отложения форм Aβ с применением антитела к N3pG и ингибитора ВАСЕ способствует фагоцитарному удалению отложений предсуществующих бляшек и при этом снижает или предотвращает дополнительное отложение Αβ путем подавления образования Αβ.

В заявке на патент США № 2009/0209755 описаны конденсированные производные аминодигидротиазина, которые обладают ингибирующей активностью в отношении ВАСЕ, и описаны также как подходящие терапевтические агенты для нейродегенеративных заболеваний, вызываемых пептидом Αβ, таких как деменция альцгеймеровского типа. Кроме того, в J. Neuroscience, 31(46), стр. 16507-16516 (2011), описан (S)-4-(2,4-дифтор-5-пиримидин-5-илфенил)-4-метил-5,6-дигидро-4H-[1,3]тиазин-2-иламин, вводимый перорально ингибитор ВАСЕ, проявляющий активность в ЦНС. В патенте США № 8278334 описан способ лечения когнитивного или нейродегенеративного заболевания, включающий введение ингибитора ВАСЕ-1 на основе замещенного циклического амина совместно с антителом к амилоиду. Кроме того, в J. Neuroscience, 34(35), стр. 11621-11630 (2014) описано, что комбинированное лечение с применением ингибитора ВАСЕ и антитела гентенерумаб к Αβ усиливает снижение уровня амилоида у мышей ^APPLondon.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающему введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы

или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Αβ.

В соответствии с одним вариантом настоящего изобретения, указанное моноклональное антитело к N3pGlu Αβ представляет собой антитело B12L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или антитело R17L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тя

- 1 031764 желую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14.

Более конкретно, указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой B12L.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения, указанное соединение представляет собой N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид. Указанное соединение может представлять собой кристаллическую форму 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида характеризуется пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6, 19,3 и 26,7°; где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.

В соответствии с одним вариантом воплощения настоящего изобретения указанное соединение и моноклональное антитело к N3pGlu Άβ вводят одновременно.

В соответствии с другим вариантом воплощения настоящего изобретения, указанное соединение вводят перед введением указанного моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

В соответствии с еще одним вариантом воплощения настоящего изобретения указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ вводят перед введением указанного соединения.

Изобретение также относится к набору для лечения болезни Альцгеймера, содержащему фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы

NH или его фармацевтически приемлемую соль совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами, и фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело к N3pGlu Άβ совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.

В соответствии с одним вариантом воплощения настоящего изобретения, указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой антитело B12L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13, или антитело R17L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14. Более конкретно, указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой B12L.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения, указанное соединение представляет собой N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид. Указанное соединение может представлять собой кристаллическую форму 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида характеризуется пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6, 19,3 и 26,7°, где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.

Изобретение также относится к применению соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с моноклональным антителом к N3pGlu Άβ для лечения болезни Альцгеймера.

В соответствии с одним вариантом воплощения настоящего изобретения, указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой антитело B12L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или антитело R17L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14. Более конкретно, указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой B12L.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения, указанное соединение представляет собой N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7 -тетрагидропирроло [3,4^][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид. Указанное соединение может представлять собой кри- 2 031764 сталлическую форму 2 №[3-[(4а^7аБ)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Кристаллическая форма 2 №[3-[(4а^7аБ)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида характеризуется пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6, 19,3 и 26,7°; где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.

Подробное описание изобретения

Соответственно, в настоящем документе описан способ лечения когнитивного или нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества ингибитора ВАСЕ в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

При этом ингибитор ВАСЕ представляет собой соединение формулы I

Формула I где R представляет собой Н или F и А представляет собой

или его фармацевтически приемлемой соли;

в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы

или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения заболевания, характеризующегося образованием и отложением Άβ, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения легкой формы болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения умеренного когнитивного расстройства, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения продромальной стадии болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного расстройства до болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения церебральной амилоидной ангиопатии (ЦАА), включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного

- 3 031764 количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ для применения в терапии, в частности для лечения болезни Альцгеймера, легкой формы болезни Альцгеймера, продромальной стадии болезни Альцгеймера или для предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного расстройства до болезни Альцгеймера.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами, в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей моноклональное антитело к N3pGlu Άβ совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.

Кроме того, изобретение обеспечивает набор, содержащий соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль и моноклональное антитело к N3pGlu Άβ.

Изобретение дополнительно обеспечивает набор, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами, и фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело к N3pGlu Άβ совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. При использовании в настоящем описании набор включает отдельные контейнеры каждого компонента, где один из компонентов представляет собой соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, и другой компонент представляет собой моноклональное антитело к N3pGlu Άβ, в одной упаковке. Набор также может включать отдельные контейнеры каждого компонента, где один из компонентов представляет собой соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, и другой компонент представляет собой моноклональное антитело к N3pGlu Άβ, в отдельных упаковках и инструкции по комбинированному введению каждого компонента.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение комбинации соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu Άβ для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера, легкой формы болезни Альцгеймера, продромальной стадии болезни Альцгеймера или для предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного расстройства до болезни Альцгеймера.

Средний специалист в данной области поймет и признает, что моноклональное антитело к N3pGlu Άβ и специфические антитела B12L и R17L, а также способы получения и применения указанных антител средним специалистом в данной области, идентифицированы и описаны например, в патенте США № 8679498 В2, озаглавленном Антитела к пептиду N3pGlu амилоид бета и их применение (ΆηΗN3pGlu Άmyloid Beta Peptide Άntibodies and Uses Thereof), выданном 25 марта 2014 г. (USSN 13/810895). См., например, табл. 1 в патенте США № 8679498 В2.

Кроме того, последовательности аминокислот для определенных антител, применяемых в настоящем изобретении, приведены ниже в табл. А:

Таблица А - SEQ ID антител

Антитело	Легкая цепь	Тяжелая цепь	Вариабель ная область легкой цепи (LCVR)	Вариабель ная область тяжелой цепи (HCVR)
B12L	12	13	9	10
R17L	12	14	9	и

Когнитивное или нейродегенеративное заболевание включает болезнь Альцгеймера, легкую форму болезни Альцгеймера, умеренное когнитивное расстройство, продромальную стадию болезни Альцгеймера, церебральную амилоидную ангиопатию (ЦАА), синдром Дауна и т.д.

При использовании в настоящем описании термины лечение, лечить или способ лечения включают ограничение, замедление, прекращение, снижение или обращение вспять прогрессирования или степени тяжести существующего симптома, нарушения, состояния или заболевания.

При использовании в настоящем описании термин пациент относится к человеку.

Предполагается, что термин подавление выработки пептида Άβ обозначает снижение уровня пептида Άβ у пациента in vivo.

При использовании в настоящем описании термин эффективное количество относится к количеству или дозе соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и к количеству или дозе

- 4 031764 моноклонального антитела к N3pGlu Άβ, которое при введении в виде одной или нескольких доз пациенту обеспечивает желаемое действие у пациента, которому проводят диагностику или лечение. Следует понимать, что комбинированную терапию согласно настоящему изобретению проводят путем введения соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли совместно с моноклональным антителом к N3pGlu Άβ при помощи любого способа, который обеспечивает эффективный уровень соединения формулы I и моноклонального антитела к N3pGlu Άβ в организме.

Эффективное количество может быть легко определено лечащим диагностом, как специалистом в данной области техники, при помощи известных способов и путем изучения результатов, полученных в аналогичных условиях. При определении эффективного количества для пациента лечащий диагност учитывает ряд факторов, включая, но не ограничиваясь ими: вид пациента, его размер, возраст и общее состояние здоровья; конкретное заболевание или нарушение; степень или поражение или тяжесть заболевания или нарушения; ответ индивидуального пациента; конкретное вводимое соединение; способ введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранный режим дозирования; применение сопутствующих лекарственных средств; и другие важные условия.

Соединения формулы I и их фармацевтически приемлемые соли в общем случае являются эффективными в широком диапазоне дозировок в комбинации согласно настоящему изобретению. Например, дневные дозировки, как правило, попадают в диапазон от примерно 0,1 до примерно 1000 мг/день, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 500 мг/день и наиболее предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 100 мг/день. Кроме того, моноклональное антитело к N3pGlu Άβ в общем случае является эффективным в широком диапазоне дозировок в комбинации согласно настоящему изобретению. Например, недельные дозировки, как правило, попадают в диапазон от примерно 0,1 до 10 мг/кг/неделя, предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 6 мг/кг/неделя и наиболее предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 3 мг/кг/неделя. В некоторых случаях дозировки ниже нижнего предела указанного выше диапазона являются более чем достаточными, при этом в других случаях можно применять даже более высокие дозы при приемлемом уровне побочных эффектов, и, таким образом, предполагается, что указанный выше диапазон дозировок не ограничивает каким-либо образом объем изобретения.

Ингибиторы ВАСЕ и антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно включают в состав фармацевтических композиций, которые вводят при помощи любого способа, обеспечивающего биодоступность соединения. Способ введения можно изменять любым образом, учитывая ограничения, связанные с физическими свойствами лекарственных средств и удобством для пациента и лица, осуществляющего уход. Предпочтительно композиции, содержащие моноклональное антитело к N3pGlu Άβ, предназначены для парентерального введения, такого как внутривенное или подкожное введение. Кроме того, ингибитор ВАСЕ, такой как соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, предназначен для перорального, парентерального или чрескожного введения, включая внутривенное или подкожное введение. Указанные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. (См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, ред., 21-е издание, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

При использовании в настоящем описании фраза в комбинации с относится к введению ингибитора ВАСЕ, такого как соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, совместно с моноклональным антителом к N3pGlu Άβ, такому как одновременное или последовательное введение совместно с моноклональным антителом к N3pGlu Άβ в любом порядке, или к любой их комбинации. Две молекулы можно вводить в составе одной фармацевтической композиции или отдельных фармацевтических композиций. Ингибитор ВАСЕ можно вводить до, во время или после введения моноклонального антитела к N3pGlu Άβ или в виде некоторой комбинации. Если моноклональное антитело к N3pGlu Άβ вводят с повторяющимися интервалами (например, в стандартном курсе лечения), то ингибитор ВАСЕ можно вводить до, во время или после каждого введения моноклонального антитела к N3pGlu Άβ или в виде некоторой комбинации или с различными интервалами относительно терапии с применением моноклонального антитела к N3pGlu Άβ или в виде одной или нескольких доз до, в любой момент во время или после курса лечения с применением моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.

В последующих параграфах описаны предпочтительные группы, заместители и конфигурации согласно настоящему изобретению.

Предпочтительными соединениями являются

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид и

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид или его фармацевтически приемлемая соль является особенно предпочтительным.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид является наиболее предпочтительным.

Кроме того, кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида пред

- 5 031764 ставляет собой предпочтительное соединение и кристаллическая форма 2 Х-[3-[(4аК,7а8)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида, характеризующаяся значительным пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6, 19,3 и 26,7°, где погрешность углов дифракции составляет 0,2°, является особенно предпочтительной.

Предпочтительными моноклональными антителами к N3pGlu Άβ являются B12L и R17L, которые определены в патенте США № 8679498 В2 (см., например, табл. 1 в указанном патенте), где B12L является особенно предпочтительным.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединения формулы I могут существовать в таутомерных формах, как изображено на схеме А. Следует понимать, что описание одного конкретного таутомера соединений формулы I в настоящей заявке включает обе таутомерные формы и все их смеси.

Схема А

Для ясности в приведенных ниже схемах не указаны определенные стереохимические центры и исключены определенные заместители, но предполагается, что это никаким образом не ограничивает принципы, приведенные на схемах. Кроме того, специалисты в данной области техники могут отделять или разделять отдельные изомеры, энантиомеры и диастереомеры в любой подходящий момент синтеза соединений формулы I при помощи способов, таких как техники селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, J. Jacques et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981 и E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, WileyInterscience, 1994). Обозначения изомер 1 и изомер 2 относятся к соединениям, которые элюируются при хиральной хроматографии первым и вторым соответственно, и если хиральную хроматографию проводят на ранних стадиях синтеза, то такие же обозначения применяют для последующих промежуточных соединений и в примерах.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединения согласно настоящему изобретению содержат ядро, включающее по меньшей мере два хиральных центра

Схема В

н

Несмотря на то, что настоящее изобретение включает все отдельные энантиомеры, а также смеси энантиомеров указанных соединений, включая рацематы, соединения, имеющие абсолютную конфигурацию атомов углерода, обозначенных 1 и 2, такую как проиллюстрировано на схеме В, представляют собой предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению.

Кроме того, определенные промежуточные соединения, описанные на следующих схемах, могут содержать одну или более азотзащитных групп. Переменные защитные группы могут быть одинаковыми или различными в каждом случае в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных проводимых превращений. Условия введения и удаления защитных групп хорошо известны специалистам и описаны в литературе (см., например, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, четвертое издание, Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

Соединения формулы I или их фармацевтически приемлемые соли можно получать при помощи различных способов, известных в данной области техники, некоторые из которых проиллюстрированы ниже в примерах получения и в примерах. Конкретные стадии синтеза каждого описанного способа можно объединять различным образом или совместно со стадиями из других примеров получения для получения соединений формулы I или их солей. Продукты каждой стадии можно выделять при помощи традиционных способов, хорошо известных в данной области техники, включая экстракцию, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрование, растирание и кристаллизацию. Кроме того, все заместители, если не указано иное, такие как определено выше. Реагенты и исходные вещества легко доступны специалистам в данной области техники.

При использовании в настоящем описании АРР относится к белку-предшественнику амилоида; ВОС относится к трет-бутоксикарбонилу; БСА относится к бычьему сывороточному альбумину; СМЖ относится к спинномозговой жидкости; DCC относится к 1,3-дициклогексилкарбодиимиду; DIC относится к диизопропилкарбодиимиду; ДХМ относится к дихлорметану; DIPEA относится к

- 6 031764 диизопропилэтиламину; DMAP относится к диметиламинопиридину; DMEM относится к среде Игла в модификации Дульбекко; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; EDCI относится к гидрохлориду 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида; ЭДТА относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; э.и. относится к энантиомерному избытку; EtOAc относится к этилацетату; Пр. относится к примеру; F12 относится к среде Хэма F12; ЭБС относится к эмбриональной бычьей сыворотке; FRET относится к резонансному переносу энергии флуоресценции; HATU относится к гексафторфосфату (диметиламино)-Х,Ц-диметил(3Н-[1,2,3]триазоло[4,5-Ь]пиридин-3-илокси)метаниминия; HEK относится к почке эмбриона человека; ч относится к часу или часам; НОАс относится к уксусной кислоте; HOAt относится к 1-гидрокси-7-азобензотриазолу; HOBt относится к гидрату 1гидроксибензотриазола; HBTU относится к гексафторфосфату 2-(Ш-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурония; HRP относится к пероксидазе хрена; IC₅₀ относится к концентрации агента, обеспечивающей 50% от максимального ингибирующего ответа, возможного для указанного агента; iPr относится к изопропилу; мин. относится к минуте или минутам; МТБЭ относится к метил-третбутиловому эфиру; ФБР относится к фосфатному буферному солевому раствору; PDAPP относится к белку-предшественнику амилоида, вырабатываемому тромбоцитами; Пр.пол. относится к примеру получения; psi относится к фунтам на квадратный дюйм; РуВОР относится к гексафторфосфату бензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфония; PyBrop относится к гексафторфосфату бром-триспирролидинофосфония; RFU относится к относительной единице флуоресценции; Rt относится к времени удерживания; SCX относится к сильной катионообменной хроматографии; SFC относится к сверхкритической жидкостной хроматографии; СОС относится к стандартной ошибке среднего; ТГФ относится к тетрагидрофурану и ТМВ относится к 3,3',5,5'-тетраметилбензидину.

Последующие примеры получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.

В приведенных ниже схемах все заместители, если не указано иное, такие как определено выше. Реагенты и исходные вещества в общем случае легко доступны специалистам в данной области техники. Другие можно получать при помощи стандартных техник органической и гетероциклической химии при помощи способов, описанных в последующих примерах получения и примерах, включая любые новые способы.

На схеме 1 изображено получение оксимов (продукт стадии 2 и продукт стадии 5). Каждый из оксимов можно применять для получения бициклического изоксазола (продукт стадии 3 или 7). В различные моменты синтеза можно встраивать замещенную ароматическую группу, как показано на стадии 1 и стадии 7 на схеме 1. PG представляет собой защитную группу, разработанную для аминогруппы, такую как карбамат и аллил. Указанные группы хорошо известны и очевидны в данной области техники.

В 2-стадийном взаимодействии можно проводить алкилирование кетона, содержащего галоген в бета-положении (стадия 1), с применением защищенного аллиламина с использованием неорганического основания, такого как карбонат калия, и затем обрабатывать гидрохлоридом гидроксиламина и органическим основанием, таким как пиридин, в полярном протонном растворителе, таком как этанол, с получением оксима (стадия 2). Затем оксимовый продукт, полученный на стадии 2, можно превращать в бициклический изоксазол в реакции циклизации 3+2 при помощи нескольких способов, таких как нагревание оксима, полученного на стадии 2, в неполярном растворителе, таком как толуол или ксилолы, с получением бициклического изоксазола (стадия 3). В качестве альтернативы оксим можно получать с использованием диметилацеталя в качестве исходного вещества, который обрабатывают кислотой, такой как муравьиная кислота, для получения альдегида (продукт стадии 4). На стадии 5 можно превращать альдегид, полученный на стадии 4, в оксимовый продукт стадии 5 с применением гидрохлорида гидроксиламина и основания, такого как тригидрат ацетата натрия. Бициклический изоксазольный продукт стадии 6 можно получать из оксима, как показано на стадии 6, с применением водного раствора гипохлорита натрия. На стадии 7 проводят взаимодействие бициклического изоксазола с ароматическим литийорганическим реа

- 7 031764 гентом или реактивом Гриньяра с получением защищенного бициклического изоксазольного продукта стадии 7.

Схема 2

PGСтадия 11

PG-N

он

Стадия 10

ОН

PGСтадия 12

PG.PG

На схеме 2 проиллюстрированы различные способы получения защищенного пирролотиазинового продукта стадии 10 или стадии 12. Защищенный бициклический изоксазол можно обрабатывать порошковым Zn в уксусной кислоте или никелем Ренея в полярном растворителе, таком как этанол, в условиях гидрирования под давлением с получением аминопирролидинметанола (продукт стадии 11). Затем проводят взаимодействие аминопирролидинметанольного продукта стадии 11 в бензоилизотиоцианатом в полярном растворителе, таком как ТГФ, после чего добавляют 1,1-карбонилдиимидазол (CDI) с получением конденсированного защищенного пирролидинтиазина (продукт стадии 12). В качестве альтернативы можно проводить взаимодействие по аминогруппе бициклического изоксазола с бензоилизотиоцианатом с получением тиомочевины (продукт стадии 8) и затем на стадии 9 можно проводить раскрытие кольца изоксазола с применением порошкового цинка в уксусной кислоте с получением гидроксильного соединения в качестве продукта стадии 9. Затем гидроксильное соединение можно обрабатывать CDI в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ, или 1-хлор-№,Н,2-триметилпропениламином в ДХМ с получением конденсированного защищенного пирролидинтиазина (продукт стадии 10).

Конденсированный пирролидинтиазин также можно получать в реакции Мицунобу, например, с применением трифенилфосфина и диизопропилазодикарбоксилата (DIAD).

Схема 3

PG ^PG ! Стадия 13

Вг

PG

1. Удал. защ. групп

2. Гетероарилирование

Стадия 14 .PG

2. Удал. защ. групп

Стадия 15

На схеме 3 изображена конверсия пирролотиазина до анилина (продукт стадии 13), который затем можно ацилировать после удаления защитных групп и гетероарилирования пирролидина. Ацилирование по атому азота в анилине и удаление защитных групп аминогруппы при тиазине приводит к получению соединений формулы I.

Проводят азидодегалогенирование соответствующего пирролотиазина в присутствии источника азида, такого как азид натрия. Указанные реакции азидодегалогенирования хорошо известны и определены в данной области техники. Восстановление полученного азидного промежуточного соединения до анилина (продукт стадии 13) можно проводить в условиях гидрирования, хорошо известных и описанных в данной области техники, или с применением восстановителей, хорошо известных в данной области техники, таких как LiAlH₄, NaBH₄ и PPh₃.

- 8 031764

Можно удалять защитные группы в ВОС-защищенном пирролидине в кислотных условиях, хорошо известных в данной области техники (стадия 1 стадии 14). Затем можно проводить гетероарилирование пирролидина с удаленными защитными группами по реакции нуклеофильного ароматического замещения (SNAr) с применением замещенного ароматического пиримидина с использованием органического основания, такого как DIPEA, триэтиламин или Ν,Ν,Ν,Ν'-тетраметилгуанидин, с получением продукта стадии 2 стадии 14. Можно проводить сочетание анилинового продукта стадии 14 с гетероароматическими карбоновыми кислотами в условиях сочетания (продукт стадии 1 стадии 15). Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что существует ряд способов и реагентов для получения амида по реакции карбоновых кислот с аминами. Например, взаимодействие соответствующего анилина с соответствующей кислотой в присутствии реагента сочетания и аминового основания, такого как DIPEA или триэтиламин, приводит к получению соединения формулы I после удаления защитных групп аминогруппы при тиазине. Реагенты сочетания включают карбодиимиды, такие как DCC, DIC, EDCI, и ароматические оксимы, такие как HOBt и HOAt. Кроме того, соли ненуклеофильных анионов урония или фосфония, такие как HBTU, HATU, РуВОР и PyBrOP, можно применять вместо более традиционных реагентов сочетания. Для ускорения взаимодействия можно применять добавки, такие как DMAP. В качестве альтернативы можно проводить ацилирование защищенной аминогруппы анилина с применением замещенных бензоилхлоридов в присутствии основания, такого как триэтиламин или пиридин. Затем можно удалять защитные группы аминогруппы при тиазине с применением органического основания, такого как пиридин и гидрохлорид метилгидроксиламина, в полярном апротонном растворителе, таком как этанол, или неорганического основания, такого как гидроксид лития, в метаноле с получением соединений формулы I.

На необязательной стадии фармацевтически приемлемую соль соединения формулы I можно получать путем взаимодействия соответствующего свободного основания формулы I с соответствующей фармацевтически приемлемой кислотой в подходящем растворителе в стандартных условиях. Кроме того, указанные соли можно получать одновременно с удалением азотзащитных групп. Способы получения указанных солей хорошо известны и описаны в данной области техники. См., например, Gould, P.L., Salt selection for basic drugs, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J. et al. Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000) и Berge, S.M. et al., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединение формулы I можно легко превращать и выделять в виде фармацевтически приемлемой соли, такой как гидрохлоридная соль.

Примеры получения и примеры

Последующие примеры получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобрете ние.

Пример получения 1. 1-(3-Бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон

К 3-бромфенацилбромиду (60 г, 216 ммоль) в ацетонитриле (430 мл) добавляли карбонат калия (38,8 г, 281 ммоль) и охлаждали смесь в атмосфере азота до 0°C. По каплям добавляли диаллиламин (34,6 мл, 280,63 ммоль) в течение 1 часа и оставляли реакционную смесь нагреваться до 22°C на ночь. Концентрировали неочищенную реакционную смесь и разделяли остаток в воде (300 мл) и МТБЭ (300 мл). Отбрасывали водный слой и промывали органический слой водой (100 мл, 2х) и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали растворитель до достижения постоянной массы с получением указанного в заголовке соединения (62 г, 98%). ИЭР/МС (m/e): 294 (М+1).

Пример получения 2. Бензил-Л-(2,2-диметоксиэтил)карбамат

Раствор диметилацеталя аминоацетальдегида (25 мл, 229 ммоль) в толуоле (120 мл) обрабатывали при 0°C 4,85М раствором гидроксида натрия (70,8 мл, 343,5 ммоль). Смесь перемешивали при 0°C в течение 10 мин и добавляли бензилхлорформиат (33,8 мл, 229 ммоль), поддерживая внутреннюю температуру ниже 20°C во время добавления. Смесь нагревали до комнатной температуры в течение 4 ч. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха с получением указанного в заголовке соединения (54 г, 98%). ИЭР/МС (m/e): 240 (М+Н).

- 9 031764

Пример получения 3. Бензил-Ы-аллил-Ы-(2,2-диметоксиэтил)карбамат

Раствор бензил-Ы-(2,2-диметоксиэтил)карбамата (50 г, 208,9 ммоль) в толуоле (180 мл) обрабатывали твердым гидроксидом калия (51,6 г, 916,69 ммоль) в атмосфере азота. Через 10 мин добавляли хлорид бензилтриэтиламмония (0,8 г, 3,1 ммоль). Еще через 10 мин по каплям добавляли раствор аллилбромида (33 г, 272,8 ммоль) в толуоле (50 мл) в течение 10 мин. Полученную смесь перемешивали при 50°C в течение 48 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и гасили реакцию водой. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором, сушили над сульфатом магния и концентрировали досуха с получением указанного в заголовке соединения (44 г, 75%). ИЭР/МС (m/e): 280 (М+Н).

Пример получения 4. Бензил-Ы-аллил-Ы-(2-оксоэтил)арбамат о

Раствор бензил-Ы-аллил-Ы-(2,2-диметоксиэтил)карбамата (30 г, 107 ммоль) в муравьиной кислоте (36,8 мл, 860 ммоль) и воде (4,84 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Концентрировали смесь и разбавляли смесью гексаны/EtOAc (1:2) и водой. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором до рН=6 и сушили над сульфатом натрия. Выпаривали растворитель с получением указанного в заголовке соединения (25 г, 99%). ИЭР/МС (m/e): 234 (М+Н).

Пример получения 5. Оксим 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанона

Раствор 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанона (60 г, 204,7 ммоль) в этаноле (720 мл) и пиридине (24,8 мл, 307 ммоль) перемешивали в течение 15 мин при 22°C. В раствор по частям добавляли гидрохлорид гидроксиламина (17 г, 246 ммоль) в течение 1 ч. Реакционную смесь нагревали до 50°C в течение 2 ч, а затем нагревали до 70°C в течение 16 ч. Выпаривали растворитель и разделяли остаток в воде (300 мл) и МТБЭ (300 мл). Отделяли органический слой и промывали водой (100 мл, 2х) и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением указанного в заголовке соединения (75,5 г, 79%). ИЭР/МС (m/e): 309 (М+1).

Пример получения 6. Оксим 2-(диаллиламино)-1-(2-фторфенил)этанона

В раствор 2-бром-1-(2-фторфенил)этанона (1291 г, 5,8 моль) в этаноле (12,9 л) добавляли диаллиламин (1,56 л, 12,2 моль), поддерживая внутреннюю температуру ниже 30°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при 22°C. В раствор по частям добавляли гидрохлорид гидроксиламина (543 г, 7,58 моль) и затем нагревали в течение 16 ч при 70°C. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выпаривали растворитель и разделяли остаток в воде (5,1 л) и МТБЭ (6,4 л). Добавляли карбонат натрия, доводя рН водного слоя до 5,5, и экстрагировали водный слой дополнительным количеством МТБЭ (1,2 л). Объединяли органические слои и промывали водой и солевым раствором. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (1,45 кг, 104%), которое использовали без дополнительной очистки. ИЭР/МС (m/e): 249 (М+1).

Пример получения 7. Бензил-Ы-аллил-Ы-[2-гидроксииминоэтил] карбамат о

Раствор бензил-Ы-аллил-Ы-(2-оксоэтил)арбамата (25 г, 107 ммоль) в ацетонитриле (150 мл) обрабатывали гидрохлоридом гидроксиламина (9,68 г, 139 ммоль) и раствором тригидрата ацетата натрия (16 г, 117,9 ммоль) в воде (75 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Выпаривали ацетонитрил и экстрагировали водный раствор EtOAc. Отделяли органический слой, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (24 г, 90%). ИЭР/МС (m/e): 249 (М+Н).

- 10 031764

Пример получения 8. 2-Бром-1-(5-бром-2-фторфенил)этан-1-он

F О

В раствор 1-(5-бром-2-фторфенил)этан-1-она (1000 г, 4,6 моль) и п-толуолсульфокислоты (1315 г,

7,64 моль) в ДХМ (7 л) при 35°C по частям добавляли N-бромсукцинимид (984 г, 5,53 моль). Перемешивали смесь и нагревали до 40°C. Охлаждали смесь до 40°C и добавляли 7% NaHCO₃ (5 л). Разделяли слои и промывали органический слой 10% Na₂SO₃ (5 л) и водой (5 л). Концентрировали органический слой в 2-3 раза с получением указанного в заголовке соединения, которое использовали без дополнительной очистки.

Пример получения 9. 5-Аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1-(4-метоксибензил)гексагидро-Шпирроло[3,4-с]изоксазол

В раствор 2-бром-1-(5-бром-2-фторфенил)этан-1-она (1363 г, 4,61 моль) в толуоле (10 л) добавляли диаллиламин (537 г, 5,53 моль) и DIPEA (2381 г, 18,42 моль). Смесь перемешивали в течение 4 часов при 40°C с получением 1-(5-бром-2-фторфенил)-2-(диаллиламино)этан-1-она, который не выделяли. В смесь, содержащую неочищенный 1-(5-бром-2-фторфенил)-2-(диаллиламино)этан-1-он, добавляли N-(4метоксибензил)-гидроксиламин (847 г, 5,53 моль) и Ti(OiPr)₄ (1965 г, 6,91 моль). Смесь перемешивали при 90°C в течение 2 часов. Смесь охлаждали до 20°C и добавляли 50% моногидрат лимонной кислоты (4 л) и насыщенный Na₂CO₃ (4 л). Разделяли слои и экстрагировали водный слой МТБЭ (5 л). Органический экстракт промывали водой (5 л) и фильтровали через диатомитовую землю и концентрировали досуха. К остатку добавляли EtOAc (10 л) и щавелевую кислоту (580 г) и отфильтровывали твердое вещество и добавляли к 1н. NaOH (13 л). Добавляли МТБЭ (5 л) и фильтровали смесь через диатомитовую землю. Разделяли слои и концентрировали органический слой в 2 раза. Добавляли гептан (3 л) и охлаждали раствор до 10°C. Отфильтровывали полученное твердое вещество с получением указанного в заголовке соединения (1330 г, 64%).

1H).

Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ: 2,51-2,49 (m, 3H), 3,09-3,04 (m, 3H), 3,78-3,41 (m, 6H), 4,01 (m, 1H),

Пример получения 10. 5-Аллил-6а-(3-бромфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-Ш-пирроло[3,4-с]изоксазол

В г'

Неочищенный оксим 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанона (75,5 г, 195,34 ммоль) растворяли в толуоле (600 мл) и кипятили с обратным холодильником в течение 12 часов. Выпаривали растворитель в вакууме и растворяли остаток в смеси 1н. водной HCl (1 л) и МТБЭ (300 мл). Смесь перемешивали в течение 15 минут и добавляли диатомитовую землю (10 г). Смесь перемешивали в течение еще 20 мин и фильтровали через диатомитовую землю. Осадок дополнительно промывали 1н. водной HCl (200 мл) и МТБЭ (200 мл). Отделяли органический слой и промывали 1н. HCl (2x100 мл). Объединяли водные слои и доводили рН до 9 при помощи 50% (мас./мас.) NaOH. Водную смесь экстрагировали МТБЭ (3x250 мл). Объединяли органические слои, сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Выпаривали фильтрат и сушили в вакууме с получением красного твердого вещества (60 г). Красное твердое вещество разбавляли гептаном (600 мл) и нагревали смесь до температуры обратной конденсации в течение 20 мин. Добавляли активированный уголь (2 г) и фильтровали смесь через диатомитовую землю. Концентрировали фильтраты при атмосферном давлении до конечного объема 300 мл. Охлаждали раствор до 22°C и перемешивали в течение 3 ч. Собирали бледно-желтое твердое вещество путем фильтрования и сушили в вакууме до постоянной массы с получением указанного в заголовке соединения (40 г, 60%). ИЭР/МС (m/e): 309 (М+1).

Пример получения 11. 5-Аллил-6а-(2-фторфенил)-3,3a,4,6-теΊрагидро-1H-пирроло[3,4-с]изоксазол

Стадия химического взаимодействия в потоке: 343 мл бесшовный трубчатый реактор из нержавеющей стали (O.D.=1/8 дюйма (3,175 мм)) размещали внутри термостата для ГХ и продували толуолом

- 11 031764 с расходом 20 мл/мин в течение 20 мин. Нагнетали избыточное давление азота (720 psig (5 МПа изб.)) и устанавливали температуру ГХ на 210°C. После достижения температуры 210°C через реактор прокачивали раствор оксима 2-(диаллиламино)-1-(2-фторфенил)этанона (480,51 г, 1,74 моль) в толуоле (5,81 л) с расходом 22,866 мл/мин с использованием пары шприц-насосов высокого давления, эксплуатируемых в непрерывном режиме, что давало время удерживания 15 мин. После израсходования всего маточного раствора реактор продували толуолом с расходом 22,866 мл/мин в течение 30 мин. Температуру в термостате ГХ устанавливали на 25°C и собирали весь раствор и концентрировали в вакууме. Выпаривали растворитель и растворяли остаток в метиленхлориде (2,5 л) и воде (5 л). рН доводили до 1 при помощи хлороводородной кислоты и отделяли водный слой и нейтрализовали гидроксидом натрия, доводя рН до 10. Водный слой экстрагировали МТБЭ (3x2,5 л). Объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (248 г, 47%), которое использовали без дополнительной очистки. ИЭР/МС (m/e): 249 (М+1).

Пример получения 12. Гидрохлорид 5-аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)гексагидро-Ш-пирроло[3,4с]изоксазола

В раствор 5 -аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-1 -(4-метоксибензил)гексагидро-1 Н-пирроло [3,4с]изоксазола (1990 г, 4,45 моль) в ДХМ (12 л) по каплям добавляли трифторуксусную кислоту (4 л, 52,9 моль) со скоростью, достаточной для поддержания температуры ниже 35°C. После завершения добавления нагревали смесь до 33-43°C и перемешивали в течение 6 часов. Добавляли NaOH (20%, 10 л) со скоростью, достаточной для поддержания температуры ниже 35°C. Разделяли слои и промывали органический слой водой (6 л). Концентрировали раствор, добавляли этанол (16 л) и фильтровали смесь через диатомитовую землю. Концентрировали фильтрат и добавляли EtOAc (10 л). Добавляли 4М HCl в EtOAc (8 л) и отфильтровывали полученное твердое вещество и сушили с получением указанного в заголовке соединения (1385 г, 85,6%). ИЭР m/z 327,1 (М+1).

Пример получения 13. Бензил-3,3a,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

Раствор бензил-М-аллил-Щ2-гидроксииминоэтил]карбамата (24 г, 96,6 ммоль) в ДХМ (338 мл) обрабатывали, добавляя по каплям в течение 10 мин 5% (мас./мас.) водный раствор гипохлорита натрия (106,08 ммоль, 143,06 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили 40% водным раствором бисульфита натрия (7 г). Отделяли органический слой, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле, элюируя 5% EtOAc в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (18 г, 75%). ИЭР/МС (m/e): 247 (М+Н).

Пример получения 14. Бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3a,4,6-тетрагидро-1H-пирроло[3,4с]изоксазол-5-карбоксилат

В выдерживаемый при -78°C раствор 4-бром-1-фтор-2-йодбензола (12,22 г, 40,6 ммоль) в ТГФ (60 мл) по каплям добавляли 1,6М раствор н-бутиллития в гексанах (25,4 мл, 40,6 ммоль) с получением желтого раствора, который перемешивали при -78°C в течение 15 мин. В выдерживаемый при -78°C отдельный раствор бензил-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (5 г, 20,3 ммоль) в ТГФ (60 мл) добавляли эфират трифторида бора (5,14 мл, 40,6 ммоль) и перемешивали смесь при -78°C в течение 5 мин. Полученный раствор при помощи шприца добавляли в приготовленную ранее и выдерживаемую при -78°C смесь литийорганического соединения. Объединенную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°C. Реакцию гасили насыщенным водным хлоридом аммония и нагревали до комнатной температуры. Экстрагировали смесь EtOAc (3x) и объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 35 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (2,27 г, 27%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 421/423 (М+Н).

Пример получения 15. Бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

- 12 031764

В раствор бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазол-5карбоксилата (5,977 г, 14,2 ммоль) в ТГФ (95 мл) по каплям добавляли бензоилизотиоцианат (2,87 мл, 21,28 ммоль) и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (6,05 г, 73%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 584/586 (М+Н).

Пример получения 16. Бензил-3-(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилат он

Смесь бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3л,4,6-тетрагидропирроло[3,4с]изоксазол-5-карбоксилата (6,05 г, 10,4 ммоль) и цинка (пыль, <10 мкм) (6,77 г, 103,5 ммоль) перемешивали в уксусной кислоте (52 мл) при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и фильтровали через диатомитовую землю. Удаляли растворитель в вакууме и разбавляли остаток EtOAc, водой и насыщенным водным бикарбонатом натрия. Смесь экстрагировали EtOAc (3х), объединяли органические слои и сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (5,222 г, 86%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 586/588 (М+Н).

Пример получения 17. (1-Аллил-4-амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил)метанол он

В раствор гидрохлорида 5-аллил-6а-(5-бром-2-фторфенил)гексагидро-Ш-пирроло[3,4-с]изоксазола (1400 г, 3,85 моль) в ДХМ (7 л) добавляли насыщенный водный раствор карбоната натрия до достижения рН>9. Разделяли слои и концентрировали органический экстракт в 1,5 раза. В раствор добавляли уксусную кислоту (1,38 л), концентрировали до 2 л. Добавляли уксусную кислоту (7 л) и порошок цинка (2,5 кг, 38,5 моль) и нагревали смесь до 40-50°C и перемешивали в течение 3 ч. Добавляли EtOAc (9,8 л) и фильтровали смесь через диатомитовую землю. Осадок промывали EtOAc (4 л). Отделяли фильтрат и к объединенным органическим слоям добавляли воду (7 л). Добавляли гидроксид аммония до рН >9. Разделяли слои и концентрировали органический слой до 2 л. Добавляли этанол (2,8 л) и концентрировали раствор до 2 л. Добавляли этанол (19 л) и фильтровали смесь через диатомитовую землю с получением раствора указанного в заголовке соединения в этаноле, который использовали без дополнительной очистки.

Пример получения 18. [1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол он

Выдерживаемый при 22°C раствор 5-аллил-6а-(3-бромфенил)-3,3a,4,6-тетрагидро-1H-пирроло[3,4с]изоксазола (40 г, 129,4 ммоль) в уксусной кислоте (400 мл) обрабатывали, добавляя за один раз цинковую пыль (42,3 г, 646,8 ммоль). Реакционную смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли EtOAc (400 мл) и фильтровали смесь через диатомитовую землю. Выпаривали фильтрат и сушили остаток в вакууме. Остаток разделяли в воде (300 мл) и МТБЭ (300 мл). рН доводили до 8 при помощи 50% (мас./мас.) гидроксида натрия и отделяли органический слой, сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Выпаривали фильтрат и сушили остаток в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (41 г, 97%). ИЭР/МС (m/e): 311 (М+1).

- 13 031764

Пример получения 19. [1-Аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол он

В раствор 5-аллил-6а-(2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазола (3559 г, 1,29 моль) в смеси метанола (2,85 л) и насыщенного водного раствора хлорида аммония (3,56 л) добавляли цинковую пыль (590 г, 9 моль) и грели смесь в течение 16 ч при 70°C. Реакционную смесь охлаждали до 60°C, разбавляли ТГФ (2,85 л) и фильтровали в горячем виде через диатомитовую землю. Выпаривали фильтрат для удаления органического растворителя и разбавляли водную смесь 10% (мас./мас.) водным раствором лимонной кислоты (4 л) и EtOAc (3,5 л). Отделяли органический слой и промывали водный слой EtOAc (2x2 л). Водный слой нейтрализовали 50% (мас./мас.) гидроксидом натрия, доводя рН до 10, а затем экстрагировали EtOAc (2x1,5 л). Объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (299 г, 92%). ИЭР/МС (m/e): 251 (M+1).

Пример получения 20. ДО^)-4-гидрокси-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]-4-оксобутаноат [(3S,4R)1-аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]аммония

В раствор (1-аллил-4-амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил)метанола (1264 г, 3,85 моль) в этаноле (21 л) добавляли моногидрат ди-п-толуил^-винной кислоты (1,04 кг, 2,69 моль). Смесь нагревали до 65-75°C и перемешивали в течение 3 ч. Смесь охлаждали до 5-10°C, добавляли затравочный кристалл ДО^)-4-гидрокси-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]-4-оксобутаноата [(3S,4R)-1-аллил-3-(5-бром-2фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]аммония (1,0 г) и перемешивали смесь в течение 3 ч. Отфильтровывали твердое вещество и промывали осадок холодным этанолом (1,4 л). Осадок сушили с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества. Хиральный анализ элюируемого вторым изомера: колонка: IC Chiralpak, 4,6 мм * 250 мм * 5 мкм; элюент: 90% гексана (0,3% диэтиламина): 10% этанола (0,3% диэтиламина); расход 1,0 мл/мин, УФ 270 нм, подтверждает получение энантиомерно-обогащенного (99% э.и.) энантиомера, R_t = 7,4 мин, (1050 г, 38%).

¹Н ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 2,40 (s, 6H), 3,05-3,04 (m, 1H), 3,57-3,31 (m, 3H), 3,66-3,58 (m, 4H), 3,75-3,74 (m, 2Н), 5,38-5,36 (m, 1H), 5,50-5,46 (m, 1H), 5,88 (s, 2H), 5,97-5,91 (m, 1H), 7,10-7,05 (m, 1H), 7,29 (d, J=8,0 Гц, 4Н), 7,53-7,51 (m, 1H), 7,80-7,78 (m, 1H), 8,01 (d, J=8,0 Гц, 4Н).

Пример получения 21. Соль 2,3-бис[(4-метилбензоил)окси] бутандиовой кислоты [(3R,4S)-1-аллил4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола он

В раствор [(3R,4S)-1 -аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола (225,9 г, 902 ммоль) в 1-метокси-2-пропаноле (1,13 л), предварительно нагретый до 40°C, добавляли раствор ди-птолуил^-винной кислоты (348,6 г, 884 ммоль) в 1-метокси-2-пропаноле (1,13 л). Реакционную смесь охлаждали до 22°C и перемешивали в течение 18 ч. Собирали белое твердое вещество путем фильтрования и промывали 1-метокси-2-пропанолом (600 мл). Собранное твердое вещество сушили с получением указанного в заголовке соединения (183,01 г, 31,8%). ИЭР/МС (m/e): 251 (М+1).

Пример получения 22. Соль (2R,3R)-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]бутандиовой кислоты [(3R,4S)1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанола

Раствор [1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанола (77 г, 235 ммоль) в изопропиловом спирте (914 мл) нагревали до 70°C. Добавляли ди-п-толуил^-винную кислоту (86,2 г, 223 ммоль) и смесь охлаждали до 22°C в течение 2 ч и перемешивали в течение ночи. Фильтровали взвесь и

- 14 031764 собирали бледно-желтое твердое вещество и промывали изопропиловым спиртом. Твердое вещество сушили в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (63 г, 36%). ИЭР/МС (m/e): 311 (М+1). Продукт анализировали путем обращенно-фазовой хиральной хроматографии: анализ элюируемого первым изомера (колонка: Chiralpak ID-3 4,6 х 50 мм; элюент: 70:30, водный 20 мМ бикарбонат аммония: ацетонитрил; расход: 1,5 мл/мин, УФ 215 нм) подтверждает получение энантиомерно-обогащенного (96% э.и.) энантиомера, R_t = 1,26 мин.

Пример получения 23. ((3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин-3-ил)метанол он

В выдерживаемый при 0°C раствор ДО^)-4-гидрокси-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]-4оксобутаноата [(3S,4R)-1-аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-3-ил]аммония (100 г, 139,4 ммоль) в EtOAc (500 мл) добавляли 1н. HCl (500 мл, 500 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1 часа. Отделяли водный слой и доводили рН до 8 при помощи 1н. NaOH. Водный слой экстрагировали EtOAc (350 мл х2). Объединяли органические слои, промывали водой (500 мл) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (40 г, 87%). Хиральный анализ элюируемого вторым изомера: колонка: IC Chiralpak, 4,6 мм * 250 мм * 5 мкм; элюент: 90% гексана (0,3% диэтиламина) : 10% этанола (0,3% диэтиламина); расход 1,0 мл/мин, УФ 270 нм, подтверждает получение энантиомерно-обогащенного (99,7% э.и.) энантиомера, R_t = 7,4 мин.

’H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ: 2,78-2,70 (m, 5H), 3,16-3,00 (m, 3H), 3,87-3,75 (m, 1H), 3,90-3,84 (m, 1H), 5,24-5,11 (m, 2H), 5,91-5,87 (m, 1H), 6,95-6,91 (m, 1H), 7,35-7,32 (m, 1H), 7,67-7,65 (m, 1H).

Пример получения 24. [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанол он

Соль 2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]бутандиовой кислоты [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(2фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола (211 г, 331 ммоль) растворяли в воде (2,1 л) и EtOAc (2,3 л). Добавляли 35% (мас./мас.) хлороводородную кислоту, доводя рН до 1. Отделяли водный слой и доводили рН до 10 при помощи 50% (мас./мас.) гидроксида натрия и экстрагировали EtOAc (2х). рН водного слоя доводили до 10 при помощи водного NaOH и экстрагировали МТБЭ (3х), поддерживая водный раствор при рН=10. Объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали досуха с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (73 г, 88, 94,8% э.и.). Продукт анализировали путем хиральной хроматографии: колонка AS-H, элюент 10% изопропилового спирта, 2% изопропиламина; расход 3 мл/мин; УФ 220; давление 100 бар (10 МПа) при 35 °C, с получением указанного в заголовке соединения в виде элюируемого вторым изомера, Rf = 2,26 мин ИЭР/МС (m/e): 251 (М+1).

Пример получения 25. N-(((3S,4R)-1-аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин3-ил)карбамотиоил)бензамид он

В выдерживаемый при 0°C раствор ((3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(5-бром-2-фторфенил)пирролидин3-ил)метанола (30 г, 91,1 ммоль) в ТГФ (400 мл) добавляли бензоилизотиоцианат (15,0 г, 91,9 ммоль). Раствор нагревали до 25°C и перемешивали в течение 1 ч с получением раствора указанного в заголовке соединения в ТГФ, который использовали без дополнительной очистки.

Пример получения 26. [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол он

Соль (2R,3R)-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]бутандиовой кислоты [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(3бромфенил)пирролидин-3-ил]метанола (63 г, 85,8 ммоль) объединяли с 1н. водной HCl (800 мл) и EtOAc (400 мл) и перемешивали смесь в течение 15 мин при 22°C. Разделяли слои и доводили рН водного слоя до 10 при помощи 50% (мас./мас.) гидроксида натрия. Водную смесь экстрагировали МТБЭ (3х250 мл).

- 15 031764

Объединенные органические слои сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали досуха с получением указанного в заголовке соединения (27 г, 99%). ИЭР/МС (m/e): 311 (М+1).

Пример получения 27. №[(4аК,7а8)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4б][1,3]тиазин-2-ил] бензамид

Раствор [(3Я,48)-1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанола (27 г; 86,7 ммоль) в ТГФ (270 мл) охлаждали до -5°C в атмосфере азота. По каплям добавляли бензоилизотиоцианат (12,3 мл, 91 ммоль), поддерживая температуру ниже 0°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до 22°C на 1 ч. За один раз добавляли 1,1-карбонилдиимидазол (28,1 г, 173,5 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в течение 1 ч при 22°C, а затем нагревали до температуры обратной конденсации в течение 16 ч. Удаляли растворитель в вакууме и сушили остаток в вакууме. Неочищенное вещество разделяли в МТБЭ (500 мл) и воде (250 мл). Отделяли органический слой, сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали досуха. Неочищенное вещество очищали на силикагеле с градиентом от 90/10 до 60/40 смесями ДХМ/EtOAc с получением указанного в заголовке соединения (27 г, 68%). ИЭР/МС (m/e): 456 (М+1).

Пример получения 28. Дигидрохлорид N-((4aR,7aS)-6-аллил-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамида

В раствор N-(((3S,4R)-1-аллил-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)-пирролидин-3ил)карбамотиоил)бензамида (91,1 ммоль) в ТГФ (400 мл) добавляли трифенилфосфин (36,8 г, 140,3 ммоль). Добавляли ди-трет-бутилазодикарбоксилат (31,6 г, 137,2 ммоль) в ТГФ (100 мл). Смесь перемешивали при 20-30°C в течение 2 ч. Концентрировали смесь и добавляли МТБЭ (400 мл). Фильтровали раствор через диатомитовую землю и промывали осадок МТБЭ (130 мл). Объединяли фильтраты и добавляли 1н. HCl в EtOAc (200 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч и затем концентрировали до 500 мл. Добавляли МТБЭ (320 мл) и фильтровали раствор и промывали гептаном (130 мл). Твердое вещество суспендировали в EtOAc (650 мл) и перемешивали при 50-60°C в течение 2 ч. Фильтровали горячую взвесь и промывали твердое вещество EtOAc (130 мл) и гептаном (130 мл). Твердое вещество повторно суспендировали в EtOAc (650 мл) и перемешивали в течение 2 часов при 50-60°C. Фильтровали горячую взвесь и промывали EtOAc (130 мл) и гептаном (130 мл). Сушили твердое вещество с получением указанного в заголовке соединения в виде бис-соли HCl (40 г, 80%, 99,5% э.и.). Хиральный анализ элюируемого первым изомера: колонка: IC Chiralpak, 4,6 мм * 250 мм * 5 мкм; элюент: 85% гексана (0,1% диэтиламина): 15% изопропилового спирта (0,1% диэтиламина); расход 1,0 мл/мин, УФ 282 нм, подтверждает получение энантиомерно-обогащенного (99,5% э.и.) энантиомера, R_t = 12,5 мин.

Пример получения 29. N-((4aR,7aS)-6-аллил-7а-(2-фтор-5-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамид

В раствор дигидрохлорида N-((4aR,7aS)-6-аллил-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (495 г, 717,88 ммоль) в EtOAc (3 л) и воде (784 мл) добавляли 15% карбонат натрия (440 мл). Смесь перемешивали в течение 1-2 ч. Разделяли слои и фильтровали органический слой через силикагель (40 г) и промывали EtOAc (600 мл). Концентрировали фильтрат досуха с получением N-((4aR,7aS)-6-аллил-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамида. В раствор N-((4aR,7aS)-6-аллил-7а-(5-бром-2фторфенил)-4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (341 г, 494,54 ммоль) в ДМСО (525 мл) и 1,4-диоксане (1,025 л) добавляли трифторацетамид (136,7 г, 1,21 моль), NaI (182,5 г, 1,22 моль), молекулярные сита 4А (342 г) и K₂CO₃ (170,9 г, 1,24 моль). В реакционную смесь добавляли транс-Н№-диметилциклогексан (81,6 г, 573,66 ммоль) и йодид меди (27,3 г, 143,34 ммоль) в ДМСО (500 мл). Смесь перемешивали в течение 5 мин. Нагревали смесь до 100°C и перемешивали в течение 8 ч, охлаждали до 24°C. Добавляли воду (5,9 л) и ДХМ (5,9 л), фильтровали смесь и разделяли слои. Органический слой промывали водой (5,9 л) с получением указанного в заголовке соединения в виде раствора в ДХМ, который использовали без дополнительной очистки.

Пример получения 30. Гидрохлорид N-((4aR,7S)-6-аллил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил)бензамида

- 16 031764

В раствор Х-((4аК,7а8)-6-аллил-7а-(2-фтор-5-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-й][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (250 г, 494,4 ммоль) в ДХМ добавляли гидроксид натрия (28,7 г) и воду (2,7 л) и перемешивали смесь при 24°C в течение 68 ч. Добавляли 1н. HCl (3,5 л) до рН 1-3. Разделяли слои и промывали водный слой ДХМ (680 мл). В водный слой добавляли ДХМ (4 л), затем 21% гидроксид аммония до рН 8-10. Разделяли слои и объединяли органические экстракты, фильтровали через силикагель (170 г) и промывали ДХМ (1,4 л). Концентрировали растворитель досуха и разбавляли EtOAc (4 л). Добавляли 1н. HCl в EtOAc (700 мл) при температуре ниже 25°C и перемешивали смесь в течение 1 ч. Концентрировали смесь примерно в 7-8 раз и добавляли EtOAc (2,8 л). Отфильтровывали полученный осадок и промывали EtOAc (400 мл). Сушили твердое вещество с получением указанного в заголовке соединения (246 г, 52%).

Пример получения 31. N-((4aR,7aS)-7а-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-6-аллил-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-й][1,3]тиазин-2-ил)бензамид

В раствор гидрохлорида N-((4aR,7aS)-6-аллил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4-й][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (100 г, 0,153 моль) и триэтиламина (54,3 г, 0,535 моль) в ДХМ (800 мл) добавляли ангидрид уксусной кислоты (23,5 г, 0,23 моль). После перемешивания в течение 1 ч при 20-25°C добавляли насыщенный NaHCO₃ (700 мл) и воду (600 мл). Разделяли слои с получением указанного в заголовке соединения, которое использовали без дополнительной очистки в виде раствора в ДХМ.

Пример получения 32. N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-2-ил] бензамид

Раствор [(3Щ48)-1-аллил-4-амино-4-(2-фторфенил)пирролидин-3-ил]метанола (129,7 г, 414 ммоль) в ТГФ (2,3 л) охлаждали при 0°C в атмосфере азота. Добавляли бензоилизотиоцианат (61,5 мл, 456 ммоль), поддерживая температуру ниже 5°C. Нагревали реакционную смесь до комнатной температуры в течение 3 ч и добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (87,4 г, 538,9 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при 22°C в течение 1 ч, затем грели при 70°C в течение 16 ч. Охлаждали реакционную смесь до 22°C и выпаривали растворитель. Остаток разделяли в EtOAc (1 л) и воде (1 л). Отделяли органический слой и экстрагировали водный слой EtOAc (2x400 мл). Объединяли органические слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением неочищенного указанного в заголовке соединения. Неочищенный продукт очищали путем хроматографии на силикагеле, элюируя смесями EtOAc/ДХМ с градиентом 0-40% ДХМ, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледножелтого твердого вещества (170 г, 99%), содержащего остаточный растворитель. ИЭР/МС (m/e): 396 (М+1).

Пример получения 33. Бензил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-й][1,3]тиазин-6-карбоксилат

В раствор бензил-3-(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (5,198 г, 8,86 ммоль) в ТГФ (52 мл) добавляли 1,1'карбонилдиимидазол (2,87 г, 17,7 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре и затем грели реакционную смесь при температуре обратной конденсации в течение ночи в атмосфере азота. Охлаждали реакционную смесь, разбавляли водой и экстрагировали EtOAc (3x). Объединяли органические слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (2,93 г, 58%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 568/570 (М+Н).

- 17 031764

Пример получения 34. N-((4aR,7aS)-7а-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло [3,4Ш][1,3]тиазин-2-ил)бензамид

В раствор N-((4aR,7aS)-7a-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-6-аллил-4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (0,153 моль) в ДХМ добавляли трифенилфосфин (4,0 г, 0,015 моль) и 1,3диметилбарбитуровую кислоту (15,2 г, 0,097 моль). Добавляли ацетат палладия (1,7 г, 7,7 ммоль) и перемешивали смесь при 20-30°C в течение 1 ч. Добавляли 25% гидроксид аммония и разделяли слои. Органический слой промывали НОАс (3,0 экв. в 500 мл воды) и доводили рН до 8-9 при помощи 25% гидроксида аммония. Водный слой экстрагировали ДХМ (2x500 мл). Объединяли органические экстракты и концентрировали в 3-4 раза. Добавляли МТБЭ (1 л) и фильтровали смесь. Концентрировали смесь и добавляли гептан (1 л). Отфильтровывали полученное твердое вещество, собирали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (48 г, 76%).

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ: 2,15 (s, 3H), 2,87-2,83 (m, 1H), 3,43-3,23 (m, 5H), 3,70-3,67 (m, 1H), 7,12-7,07 (m, 1H), 7,28-7,27 (m, 1H), 7,52-7,41 (m, 4H), 7,79 (m, 1H), 8,18-8,16 (m, 2H). ИЭР m/z 413,1 (М+1).

Пример получения 35. N-[(4aR,7aS)-7а-(3-бромфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4d] [1,3]тиазин-2-ил] бензамид

Выдерживаемую при комнатной температуре смесь N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4Ш][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (1 г, 2,19 ммоль) и МХ-диметилбарбитуровой кислоты (0,868 г, 5,48 ммоль) в хлороформе (22 мл) дегазировали путем продувания азота через полученную взвесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (0,261 г, 219 мкмоль) и перемешивали в течение 1,5 ч в атмосфере азота. В отдельной колбе смесь N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (22,2 г, 48,6 ммоль) и N,N-диметилбарбитуровой кислоты (19,28 г, 121,6 ммоль) в хлороформе (486 мл) дегазировали путем продувания азота через полученную взвесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (5,79 г, 4,86 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч в атмосфере азота. Объединяли две реакционные смеси и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного продукта. Неочищенное вещество очищали на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 0,5 до 10% смесями метанола в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (22,4 г, 100%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 416/418 (М+Н).

Пример получения 36. N-[(4aR,7aS)-7а-(2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4d] [1,3]тиазин-2-ил] бензамид

В раствор N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2ил]бензамида (178,21 г, 360 ммоль) в безводном 2-метилтетрагидрофуране (1,96 л) в атмосфере азота добавляли 2-меркаптобензойную кислоту (122 г, 793 ммоль), бис(дибензилиденацетон)палладий (4,15 г, 7,21 ммоль) и 1,4-бис(дифенилфосфино)бутан (3,14 г, 7,21 ммоль). Раствор дегазировали с использованием трех циклов вакуумирования/нагнетания азота, затем через реакционную смесь в течение 15 мин продували азот. Реакционную смесь нагревали до 40°C, продувая азот через реакционную смесь. После достижения 40°C продувание прекращали и перемешивали реакционную смесь при 40°C в течение 3 часов в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до 22°C и разбавляли водой (2 л). Добавляли раствор HCl (5М), доводя рН до 1. Отделяли водный слой и дополнительно промывали EtOAc (2x800 мл). рН водного слоя доводили до 10 при помощи 50% (мас./мас.) гидроксида натрия, а затем экстрагировали EtOAc (10 л). Водный слой дополнительно промывали EtOAc (2x750 мл). Объединяли органические экстракты, промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением неочищенного указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (124,7 г, 97%). ИЭР/МС (m/e): 356 (М+1).

- 18 031764

Пример получения 37. П-[7а-(5-бром-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-0][1,3]тиазин-2-ил] бензамид

В выдерживаемый при комнатной температуре раствор бензил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,93 г, 5,15 ммоль) в ацетонитриле (44 мл) по каплям добавляли йодтриметилсилан (2,21 мл, 15,46 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол, затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле с получением указанного в заголовке соединения (2,098 г, 94%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 434/436 (М+Н).

Пример получения 38. Трет-бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3 ]тиазин-6-карбоксилат

Выдерживаемый при комнатной температуре раствор N-[(4aR,7aS)-7а-(3-бромфенил)-4а,5,6,7тетрагидро-4Н-пирроло[3,4Л][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (22,4 г, 36,69 ммоль) в ДХМ (367 мл) обрабатывали ди-трет-бутилдикарбонатом (8,81 г, 40,36 ммоль), затем триэтиламином (7,67 мл, 55,04 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч в атмосфере азота. Удаляли растворитель в вакууме и очищали неочищенный продукт на силикагеле в течение 25 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (20,22 г, 100%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 516/518 (М+Н).

Пример получения 39. Трет-бутил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилат

В раствор Х-[7а-(5-бром-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4Л][1,3]тиазин-2ил]бензамида (2,098 г, 4,83 ммоль) в ДХМ (48 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,16 г, 5,31 ммоль) и триэтиламин (1,01 мл, 7,25 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Удаляли растворитель в вакууме и очищали неочищенный продукт на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (2,556 г, 99%). ИЭР/МС (m/e): (⁷⁹Br/⁸¹Br) 534/536 (М+Н).

Пример получения 40. Трет-бутил-(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилат

Раствор трет-бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7 а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (5 г, 9,7 ммоль) и транс-НХ'-диметил-1,2-циклогександиамина (220,3 мг, 1,5 ммоль) в этаноле (100 мл) обрабатывали азидом натрия (1,30 г, 19,4 ммоль). Добавляли водный раствор натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,66М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воду (10 мл) и продували верхнюю часть колбы азотом. Смесь обрабатывали водным раствором пентагидрата сульфата меди (II) (0,33 М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и немедленно нагревали смесь на предварительно нагретой плитке при 80°C в течение 1,5 ч в атмосфере азота. При нагревании образовывалась гомогенная смесь. Охлаждали реакционную смесь и добавляли ледяную воду. Смесь экстрагировали EtOAc (3х). Объединяли органические слои и сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного азидного продукта. Неочищенный азидный продукт объединяли с 10% палладием на углеродной подложке (2 г) в холодном этаноле (150 мл) и продували смесь путем вакуумирования/нагнетания азота и затем вакуумирования/нагнетания водорода. Смесь перемешивали при комнатной температуре под давлением 30 psi (210 кПа) водорода в течение 2 ч. Продували реакционную смесь и фильтровали смесь через диатомитовую землю с использованием ДХМ для промывки осадка. Удаляли растворитель из фильтрата в вакууме и очищали неочищенный продукт на силикагеле с использованием 50% EtOAc в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (4 г, 91%). ИЭР/МС (m/e): 453 (М+Н).

- 19 031764

Пример получения 41. Трет-бутил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3 ]тиазин-6-карбоксилат

H₂N ^^ трет-бутил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4Раствор

d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,556 г, 4,8 ммоль) и транс-К,№-диметил-1,2-циклогександиамина (150 мг, 1,1 ммоль) в этаноле (50 мл) обрабатывали азидом натрия (933 мг, 14,3 ммоль). Добавляли водный раствор натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,66М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воду (1 мл) и продували верхнюю часть колбы азотом. Смесь обрабатывали водным раствором пентагидрата сульфата меди (II) (0,33 М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и немедленно нагревали смесь на предварительно разогретой плитке при 80°C в течение 1,5 ч в атмосфере азота. При нагревании образовывалась гомогенная смесь. Охлаждали реакционную смесь, разбавляли ледяной водой и экстрагировали смесь ΕίΘΆο (3х). Объединяли органические экстракты и сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного азидного продукта. Неочищенный азидный продукт объединяли с 10% палладием на углеродной подложке (1 г) в холодном этаноле (150 мл) и продували смесь путем вакуумирования/нагнетания азота и затем вакуумирования/нагнетания водорода. Смесь перемешивали при комнатной температуре под давлением 30 psi (210 кПа) водорода в течение 5 ч. Продували реакционную смесь, фильтровали через диатомитовую землю и промывали осадок ДХМ. Удаляли растворитель из фильтрата в вакууме и очищали неочищенный продукт на силикагеле с использованием 50% ΕίΘΆο в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (2,014 г, 89%). ИЭР/МС (m/e): 471 (М+Н).

Пример получения 42. Трет-бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-[3-[(5-фторпиридин-2-карбонил)амино]фенил]-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-6-карбоксилат

Взвесь трет-бутил-(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (93 мг, 0,21 ммоль), 5-фторпиридин-2-карбоновой кислоты (31,9 мг, 0,23 ммоль), гидрата 1-гидроксибензотриазола (56,7 мг, 0,41 ммоль) и EDCI (40 мг, 0,21 ммоль) в ДХМ (4 мл), содержащую диметилформамид (1 мл), обрабатывали DIPEΆ (179,2 мкл, 1,03 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (5 мл) и насыщенным водным бикарбонатом натрия (15 мл). Отделяли органический слой и промывали насыщенным водным хлоридом натрия (10 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (105 мг, 89%). ИЭР/МС (m/e): 576 (М+Н).

Пример получения 43. Соль 2,2,2-трифторуксусной кислоты N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-4а,5,6,7тетрагидро-4Н-пирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида он

Трет-бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-[3-[(5-фторпиридин-2-карбонил)амино]-фенил]-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-6-карбоксилат (105 мг, 0,18 ммоль) растворяли в ДХМ (2 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (500 мкл, 6,6 ммоль). Полученный желтый раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного указанного в заголовке продукта (190 мг, 100%). ИЭР/МС (m/e): 476 (М+Н).

Пример получения 44. N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4d] [1,3]тиазин-2-ил] бензамид

В раствор трет-бутил-(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-

мл) и перемешивали смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 4 ч. Удаляли раство- 20 031764 ритель в вакууме и очищали неочищенный продукт на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол, затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле с получением указанного в заголовке соединения (2,49 г, 80%). ИЭР/МС (m/e): 353 (М+Н).

Пример получения 45. №[7а-(5-амино-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,40][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

В раствор трет-бутил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,013 г, 4,28 ммоль) в ДХМ (30 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (10 мл) и перемешивали смесь при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 4 ч. Удаляли растворитель в вакууме и очищали неочищенный продукт на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол и 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле с получением указанного в заголовке соединения (1,555 г, 98%). ИЭР/МС (m/e): 371 (М+Н).

Пример получения 46. N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло [3,4^][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор N- [(4aR,7aS)-7а-(3 -аминофенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло [3,4-d][ 1,3]тиазин-2ил]бензамида (2,49 г, 7,06 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (3,74 г, 28,26 ммоль) и DIPEA (6,16 мл, 35,32 ммоль) в 1,4-диоксане (60 мл) нагревали до температуры обратной конденсации в течение 4 ч в атмосфере азота. Охлаждали реакционную смесь, разбавляли водой и экстрагировали EtOAc (3х). Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 25 минут с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (2,51 г, 79%). ИЭР/МС (m/e): 449 (М+Н).

Пример получения 47. N-[(4aR,7aS)-7а-(2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4^] [1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор N- [(4aR,7aS)-7 а-(2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло [3,4-d][ 1,3]тиазин-2ил]бензамида (124,7 г, 256 ммоль), DIPEA (67 мл), 5-фтор-2-хлорпиримидина (29,3 мл, 307 ммоль) в Nметилпирролидоне (997 мл) нагревали до 100°C в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до 22°C и выливали в охлажденную при 10°C воду (10 л), поддерживая температуру ниже 15°C. Собирали бледнокремовое твердое вещество путем фильтрования и промывали дополнительным количеством воды. Влажное твердое вещество растворяли в EtOAc (2 л) и переносили в делительную воронку. Добавляли 5% (масс./масс.) водный раствор хлорида натрия (1 л) и отделяли органический слой, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали фильтрат при пониженном давлении. Продукт очищали путем хроматографии на силикагеле с градиентом 0-40% смесями EtOAc/изогексан с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (116 г, 70%). ИЭР/МС (m/e): 452 (М+1).

Пример получения 48. N-((4aR,7aS)-7а-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил)бензамид

о

В раствор N-((4aR,7aS)-7 а-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло [3,40][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (50 г, 121,22 ммоль) в ДМФ (100 мл) добавляли 2-хлор-5-фторпиримидин (28,9 г, 218 ммоль) и карбонат калия (33,46 г, 242,1 ммоль). Смесь нагревали до 80-85°C в течение 8 ч. Охлаждали смесь до 24°C, фильтровали и промывали ДМФ (100 мл). Твердые вещества суспендировали в воде (2 л) и фильтровали с получением указанного в заголовке соединения (68,5 г, 98%). ЖХ-МС: m/z = 509,2 (М+1)+.

^:Н ЯМР (400 МГц, ^-ДМСО) δ ppm 1,22 (t, J=7,28 Гц, 2Н), 1,92-2,07 (m, 6Н), 2,89-3,20 (m, 2H), 3,363,44 (m, 1H), 3,67 (t, J=9,54 Гц, 1H), 3,84 (шир.э, 1H), 4,16 (шир.э, 2H), 7,23 (шир.э, 2H), 7,35-7,61 (m, 8H), 7,77 (шир« 2H), 7,85-8,18 (m, 4H), 8,48 (s, 4H), 10,15 (шир« 1H), 10,46-10,59 (m, 1H).

- 21 031764

Пример получения 49. (4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-амин

В раствор N-((4aR,7aS)-7а-(5-ацетамидо-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,6,7,7агексагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил)бензамида (80 г, 157,3 ммоль) в метаноле (400 мл) добавляли гидроксид лития (8,6 г, 204,9 ммоль). Смесь нагревали до 60-70°C в течение 4 ч. Добавляли концентрированную HCl (132 г) и перемешивали смесь при 55°C в течение 18 ч. Смесь охлаждали до 30°C и концентрировали для удаления метанола. Добавляли воду и экстрагировали водный слой ДХМ (3х) с получением указанного в заголовке соединения в виде водного раствора с общей массой 920 г, 5,6% которого составляло указанное в заголовке соединение, которое использовали без дополнительной очистки.

Пример получения 50. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид

Раствор соли 2,2,2-трифторуксусной кислоты N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-4a,5,6,7-тетрагидро-4Нпирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (150 мг, 254 мкмоль), 5-фтор-2хлорпиримидина (68 мг, 51 мкмоль) и DIPEA (98 мкл, 56 мкмоль) грели в ДМСО (5 мл) в течение ночи при 40°C. Добавляли дополнительное количество 5-фтор-2-хлорпиримидина (68 мг, 51 мкмоль) и DIPEA (98 мкл, 56 мкмоль) и грели смесь в течение ночи при 50°C. Добавляли дополнительное количество 5фтор-2-хлорпиримидина (68 мг, 51 мкмоль) и DIPEA (98 мкл, 56 мкмоль) и грели смесь в третий раз в течение ночи при 50°C. Охлаждали реакционную смесь, разбавляли насыщенным водным карбонатом натрия (50 мл) с получением взвеси, которую фильтровали и сушили в вакуумной печи при 50°C в течение 4 часов с получением указанного в заголовке соединения (60 мг, 41%). ИЭР/МС (m/e): 449 (М+Н).

Альтернативный пример получения 50.

N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил] бензамид (282 мг, 628,73 мкмоль) и 5-фторпиридин-2-карбоновую кислоту (106,46 мг, 754,47 мкмоль) объединяли в ДХМ (3 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли НОВТ (112,70 мг, 817,35 мкмоль) и затем EDCI (159,07 мг, 817,35 мкмоль) и перемешивали полученную смесь в течение 5 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляли водой и доводили рН при помощи 1н. NaOH до -12. Смесь экстрагировали EtOAc (3х). Объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 20 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (327 мг, 91%). ИЭР/МС (m/e): 571 (М+Н).

Пример получения 51. №[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло [3,4^][1,3]тиазин-2-ил] бензамид

Раствор №[7а-(5-амино-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4^][1,3]тиазин-2ил]бензамида (705 мг, 1,90 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (1,01 г, 7,61 ммоль) и DIPEA (1,66 мл, 9,52 ммоль) нагревали в 1,4-диоксане (20 мл) до температуры обратной конденсации в течение 4 ч в атмосфере азота. Охлаждали реакционную смесь, разбавляли водой и экстрагировали EtOAc (3х). Объединяли органические слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 25 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOAc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (590 мг, 66%). ИЭР/МС (m/e): 467 (М+Н).

Пример получения 52. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид

- 22 031764

N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (400 мг, 891,81 мкмоль) и 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (165 мг, 1,07 ммоль) объединяли в ДХМ (4 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли HOBt (160 мг, 1,16 ммоль) и затем EDCI (226 мг, 1,16 ммоль) и перемешивали полученную смесь в течение 5 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляли водой и доводили рН до ~12 при помощи 1н. NaOH. Смесь экстрагировали ЕЮЛе (3х). Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 20 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOЛc в гексанах с получением указанного в заголовке соединения (482 мг, 92%). ИЭР/МС (m/e): 585 (М+Н).

Пример получения 53. ^[3-[2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид

^[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил] бензамид (302 мг, 647 мкмоль) и 5-фторпиридин-2-карбоновую кислоту (110 мг, 777 мкмоль) объединяли в ДХМ (3 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли НОВТ (116 мг, 842 мкмоль) и затем EDCI (164 мг, 842 мкмоль) и перемешивали смесь в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляли водой и доводили рН при помощи 1н. NaOH до ~12 и затем экстрагировали EtOЛc (3х). Объединяли органические слои и фильтровали для сбора нерастворимого вещества. Твердые вещества промывали водой и EtOЛc и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке соединения. Органический слой фильтрата сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме. Остаток очищали на силикагеле в течение 20 мин с градиентом от 5 до 100% смесями EtOЛc в гексанах с получением дополнительного указанного в заголовке соединения с общим выходом (275 мг, 72%). ИЭР/МС (m/e): 590 (М+Н).

Пример получения 54. N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил]бензамид, (изомер 1)

Рацемат №[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (1,694 г, 3,63 ммоль) очищали путем хиральной ВЭЖХ (колонка: Chiralcel OJ, 8 х 35 см; элюент: 90% метанола (0,2% диметилэтиламина) и 10% ацетонитрила; расход 400 мл/мин,

УФ 280 нм). Анализ элюируемого первым изомера (колонка: Chiralcel OJ-H 0,46 х 15 см; элюент: 10:90 ацетонитрил: метанол (с 0,2% диметилэтиламина); расход: 0,6 мл/мин, УФ 280 нм) подтверждает получение энантиомерно-обогащенного (99% э.и.) энантиомера, R_t = 6,70 мин (723 мг, 43%). ИЭР/МС (m/e): 467 (М+Н).

Пример получения 55. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, (изомер 1)

N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,361 г, 0,77 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси ДХМ (4 мл) и ДМФ (0,5 мл). В смесь добавляли 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (240 мг, 1,55 ммоль) и НОВТ (210 мг, 1,55 ммоль) и EDCI (300 мг, 1,55 ммоль) и перемешивали смесь в течение ночи при комнатной температуре. Реакционный раствор помещали непосредственно в колонку с 12 г силикагеля и очищали на 40 г колонке с силикагелем, элюируя с градиентом 0-100% смесями EtOΛc/гексаны. Продукт растворяли в EtOЛc (200 мл), промывали 1н. NaOH (2х50 мл) и солевым раствором (1х50 мл). Повторно проводили очистку на силикагеле согласно приведенному выше описанию с получением указанного в заголовке соединения (350 мг, 74%). ИЭР/МС (m/e): 603 (М+Н).

Пример получения 56. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3 ]тиазин-7а-ил] фенил] - 5 -цианопиридин-2-карбоксамид

- 23 031764

N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил] бензамид (0,30 г, 0,67 ммоль) растворяли в ДХМ (10 мл) и добавляли 5цианопиридин-2-карбоновую кислоту (129 мг, 0,87 ммоль), HOBt (185 мг, 1,34 ммоль) и EDCI (169 мг, 0,87 ммоль). Добавляли DIPEA (0,35 мл, 2 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Вещество очищали непосредственно путем хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-100% смесями EtOAc/гексаны, с получением указанного в заголовке соединения (360 мг, 88%). ИЭР/МС (m/e): 579 (М+Н).

Пример получения 57. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид

N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил] бензамид (0,30 г, 0,67 ммоль) растворяли в ДХМ (10 мл) и добавляли 3,5дифторпиридин-2-карбоновую кислоту (138 мг, 0,87 ммоль), НОВТ (185 мг, 1,34 ммоль) и EDCI (169 мг, 0,87 ммоль). Добавляли DIPEA (0,35 мл, 2 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь помещали очищали непосредственно путем хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-100% смесями EtOAc/гексаны, с получением указанного в заголовке соединения (330 мг, 84%). ИЭР/МС (m/e): 590 (М+Н).

Пример получения 58. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид, (изомер 1)

N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил] бензамид (0,180 г, 0,39 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси ДХМ (2 мл) и ДМФ (0,25 мл). Добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (114 мг, 0,77 ммоль), HOBt (106 мг, 0,77 ммоль) и EDCI (150 мг, 0,77 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Разбавляли смесь водой (10 мл), EtOAc (10 мл) и добавляли в 1н. раствор NaOH (100 мл). Смесь экстрагировали EtOAc (2x100 мл) и объединяли органические слои и промывали солевым раствором. Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали путем хроматографии на силикагеле с градиентом 0-100% смесями EtOAc/гексаны с получением указанного в заголовке соединения (133 мг, 57%). ИЭР/МС (m/e): 597 (М+Н).

Пример получения 59. N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид, (изомер 1)

N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-2-ил] бензамид (0,180 г, 0,39 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси ДХМ (2 мл) и ДМФ (0,25 мл). Добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (114 мг, 0,77 ммоль), HOBt (106 мг, 0,77 ммоль) и EDCI (150 мг, 0,77 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли водой (10 мл) и EtOAc (10 мл) и затем выливали в 1н. раствор NaOH (100 мл). Смесь экстрагировали EtOAc (2x100 мл), объединяли органические экстракты и промывали солевым раствором. Органические слои сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали путем хроматографии на силикагеле с градиентом 0-100% смесями EtOAc/гексаны с получением указан

- 24 031764 ного в заголовке соединения (190 мг, 80%). ИЭР/МС (m/e): 608 (М+Н).

Пример получения 60. (4aR,7aS)-7а-(2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин-2-амин

В смесь N-[(4aR,7aS)-7а-(2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (158,6 г, 351,6 ммоль) в метаноле (1,6 л) добавляли гидроксид лития (9,26 г, 386 ммоль). Смесь грели при 70°C в течение 4 ч и затем охлаждали до 22°C. Реакционную смесь выпаривали в вакууме с получением желтого остатка. Остаток разделяли в воде (1 л) и EtOAc (750 мл). Добавляли HCl (5М водный раствор), доводя рН до 1. Отделяли водный слой и промывали органический слой EtOAc (2x200 мл). Доводили рН водного слоя при помощи 50% (мас./мас.) водного раствора гидроксида натрия до 10 и экстрагировали смесь EtOAc (3x1 л). Объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (133,3 г, 99%, содержало 12% остаточного EtOAc). ИЭР/МС (m/e): 348 (М+1).

Пример получения 61. (4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло [3,4-0][1,3]тиазин-2-амин

В раствор (4aR,7aS)-7а-(2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-2-амина (45,8 г, 125,3 ммоль) в трифторуксусной кислоте (626 мл) добавляли серную кислоту (33,4 мл, 626,6 ммоль). Смесь охлаждали до 0°C и перемешивали в течение 20 мин. Добавляли дымящую азотную кислоту (6,2 мл, 144,1 ммоль) и нагревали реакционную смесь до 22°C и перемешивали в течение 3 ч. Выпаривали реакционную смесь и добавляли МТБЭ (250 мл) и выпаривали еще два раза. Остаток сушили в вакууме до достижения постоянной массы, а затем растворяли в воде (147 мл) и этаноле (885 мл) и дегазировали путем продувания азота в течение 15 мин. Раствор переносили в стойкий к давлению реактор и добавляли 10% пастообразный Pd/C типа 87L (6,6 г, 6,27 ммоль). Смесь дополнительно разбавляли этанолом (700 мл) и нагнетали водород под давлением 80 psi (550 кПа) в течение 16 ч. Фильтровали реакционную смесь, а затем добавляли вторую порцию катализатора 10% пастообразного Pd/C типа 87L (6,6 г, 6,27 ммоль) и нагнетали в смеси давление 80 psi (550 кПа) и перемешивали в течение 3 дней в стойком к давлению реакторе. Реакционную смесь продували азотом и фильтровали через диатомитовую землю. Выпаривали фильтрат и разделяли остаток в воде (200 мл) и EtOAc (200 мл). Отделяли водный слой, охлаждали до 5°C и нейтрализовали 15% (мас./мас.) гидроксидом аммония. Водный слой экстрагировали EtOAc (3x150 мл). Объединяли органические слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-коричневого твердого вещества (47,7 г, 99%, содержало остаточный EtOAc). ИЭР/МС (m/e): 363 (М+1).

Пример А. №[3-[2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид

Смесь №[3-[2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (293 мг, 497 мкмоль), гидрохлорида Ометилгидроксиламина (430 мг, 4,97 ммоль) и пиридина (402 мкл, 4,97 ммоль) нагревали в этаноле (13 мл) до 70°C в закрытой колбе в течение 2,5 ч. Добавляли ДМСО (3 мл) и грели смесь при 70°C в течение ночи. Добавляли дополнительное количество ДМСО (10 мл) и продолжали нагревать при 70°C в течение 4 ч. Добавляли дополнительное количество гидрохлорида О-метилгидроксиламина (208 мг, 2,48 ммоль) и пиридина (201 мкл, 2,48 ммоль) и нагревали смесь до 60°C в течение 3 ч и перемешивали смесь в течение 3 дней при комнатной температуре. В отдельной колбе смесь №[3-[2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (276 мг, 468 мкмоль), гидрохлорида О-метилгидроксиламина (405 мг, 4,68 ммоль) и пиридина (478 мкл, 4,68 ммоль) грели в этаноле (15 мл) и ДМСО (4 мл) при 70°C в закрытой колбе в течение ночи. Добавляли дополнительное количество ДМСО (10 мл) и продолжали нагревать при 70°C в течение 4 ч. Добавляли дополнительное количество гидрохлорида О-метилгидроксиламина (195 мг, 2,34 ммоль) и пиридина (189 мкл, 2,34 ммоль) и продолжали нагревать при 70°C в течение 3 ч, затем перемешивали смесь в течение 3 дней при комнатной температуре. Объединяли две реакционные смеси и удаляли основную часть

- 25 031764 растворителя в вакууме. Неочищенный продукт очищали на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол, затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле. Неочищенный продукт дополнительно очищали на силикагеле в течение 20 мин с градиентом от 0,5 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (451 мг, 96%). ИЭР/МС (m/e): 486 (М+Н).

Пример 1 (Ссылочный).

Гидрохлорид N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]фенил }-5-фторпиридин-2-карбоксамида

Смесь N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (320 мг, 560 мкмоль), гидрохлорида Ометилгидроксиламина (485 мг, 5,60 ммоль) и пиридина (453 мкл, 5,60 ммоль) в этаноле (15 мл) грели при 65°C в закрытой пробирке в течение 5 ч. Охлаждали реакционную смесь и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 0,5 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (219 мг, 84%). Полученное вещество растворяли в ДХМ (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,47 мл, 470 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (228 мг, 81%). ИЭР/МС (m/e): 468 (М+Н).

Пример 2 (Ссылочный).

Гидрохлорид N-{3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]фенил }-5-метоксипиразин-2-карбоксамида

Смесь N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида (479 мг, 819 мкмоль), гидрохлорида Ометилгидроксиламина (709 мг, 8,19 ммоль) и пиридина (663 мкл, 8,19 ммоль) в этаноле (20 мл) грели при 50°C в закрытой колбе в течение ночи. Добавляли ДМСО (4 мл) и нагревали смесь до 70°C в течение 4 ч с получением раствора. Охлаждали реакционную смесь и удаляли основную часть растворителя в вакууме. Добавляли воду и доводили рН до -12 при помощи 1н. гидроксида натрия. Смесь экстрагировали EtOAc (5х). Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель в вакууме. Неочищенный продукт очищали на силикагеле в течение 30 мин с градиентом от 0,5 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ. Смесь снова очищали на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол и затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле для удаления остаточного ДМСО. Наконец, смесь очищали на силикагеле в течение 20 мин с градиентом от 0,5 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Полученное вещество растворяли в ДХМ (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,66 мл, 660 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (329 мг, 78%). ИЭР/МС (m/e): 481 (М+Н).

Пример 3 (Ссылочный).

Гидрохлорид N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида

Проводили хиральную очистку рацемата №[3-[2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (451 мг, 929 мкмоль) путем SFC (колонка: Chiralcel OD-H (5 мкм), 2,1 х 25 см; элюент: 40% метанола (0,2% изопропиламина) в CO₂; расход 70 мл/мин, УФ 225 нм). Хиральный анализ элюируемого первым изомера: колонка: Chiralcel OD-H (5 мкм), 4,6 х 150 мм; элюент: 40% метанола (0,2% изопропиламина) в CO₂; расход 5 мл/мин, УФ

- 26 031764

225 нм, подтверждает получение энантиомерно-обогащенного (>99% э.и.) энантиомера, R_t = 1,01 мин (175 мг, 360 мкмоль). Полученное вещество (свободное основание, изомер 1) растворяли в ДХМ (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,36 мл, 360 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (183 мг, 38%). ИЭР/МС (m/e): 486 (М+Н).

Пример 4. Гидрохлорид N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида

N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (0,350 г, 0,58 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (2 мл) и затем добавляли метанол (4 мл) и этанол (4 мл). В смесь добавляли гидрохлорид Ометилгидроксиламина (495 мг, 5,81 ммоль) и пиридин (470 мкл, 5,81 ммоль) и нагревали реакционную смесь до 50°C и перемешивали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли силикагель (~10 г) и концентрировали смесь. Образец после сушки в силикагеле помещали в пустой картридж и очищали, элюируя с градиентом 0-10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ. Продукт очищали во второй раз на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол и затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле. Наконец, продукт очищали на силикагеле с градиентом от 0 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Полученное вещество растворяли в ДХМ (5 мл) и добавляли 1 М хлороводород в диэтиловом эфире (0,20 мл, 660 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (71 мг, 23%). ИЭР/МС (m/e): 498 (М+Н).

Пример 5. Кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида (гидрат)

К диметилформамиду (19,2 мл, 248,9 ммоль) добавляли ацетонитрил (500 мл). В раствор диметилформамида добавляли ангидрид щавелевой кислоты (39,3 г, 309,63 ммоль), затем 5-метоксипиразин-2карбоновую кислоту (46,0 г, 298,4 ммоль). В отдельной колбе к ацетонитрилу (500 мл) добавляли водный раствор (4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,6,7,7а-гексагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-амина (56,8 г, 156,75 ммоль) и доводили рН до 9 при помощи гидроксида аммония (95 мл). Затем нагревали полученную смесь до 50-55°C. По каплям добавляли раствор хлорангидрида кислоты и перемешивали смесь в течение 3 ч. рН доводили до 8-9 при помощи гидроксида аммония. Отфильтровывали полученный осадок, промывали водой и сушили с получением указанного в заголовке соединения (123 г). Твердое вещество суспендировали в ацетоне (250 мл) в течение 1,5 ч и фильтровали. Влажный осадок промывали ацетоном с получением указанного в заголовке соединения (110 г, чистота 90,5% согласно ВЭЖХ). К твердому веществу добавляли ТГФ (1 л) и активированный уголь (9 г) и нагревали смесь до температуры обратной конденсации в течение ночи. Фильтровали смесь через диатомитовую землю и промывали ТГФ (150 мл). Концентрировали органический раствор в 10 раз и нагревали до 60°C. Добавляли воду (430 мл) и перемешивали смесь при 60°C в течение 8 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 ч. Отфильтровывали полученное твердое вещество, промывали смесью ТГФ/вода (7:6) и сушили с получением указанного в заголовке соединения (69 г, 88%). ЖХ-МС: m/z = 499 (М+1), чистота: 98,3%.

'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d,) δ ppm 2,99-3,07 (m, 2H), 3,07-3,14 (m, 1H), 3,58-3,67 (m, 1H), 3,68-3,76 (m, 1H), 3,76-3,84 (m, 1H), 4,02 (s, 3H), 4,07 (d, J=10,92 Гц, 1H), 6,08 (s, 2H), 7,19 (dd, J=11,98, 8,72 Гц, 1H), 7,78-7,89 (m, 2H), 8,41 (s, 1H), 8,44 (s, 2H), 8,88 (s, 1H), 10,60 (s, 1H).

Рентгеновская порошковая дифракция (XRD)

Дифрактограммы XRD кристаллических твердых веществ получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavor, оборудованном источником CuKa (λ = 1,54060 А) и детектором Vantec, эксплуатируемом при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40°2Θ с шагом 0,009°2Θ и скоростью сканирования 0,5 с/шаг, дивергенция 0,6 мм, 5,28 фиксированная антирассеивающая щель и 9,5 мм щель детектора. Сухой порошок помещали в кварцевый держатель образца, гладкую поверхность получали при помощи предметного стекла. Дифрактограммы кристаллической формы собирали при температуре и относительной влажности окружающей среды. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности пиков дифракции могут быть различными в зависимости от предпочтительной ориентации, определяемой такими факторами, как морфология и форма кристалла. При наличии эффектов предпочтительной ориентации интенсивность пиков изменяется, но положение характеристических пиков в полиморфе остается неизменным. См., например, Фармакопею США №23, Национальный формуляр №18, стр. 1843-1844, 1995.

- 27 031764

Кроме того, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы положения угловых пиков могут незначительно различаться. Например, положения пиков могут сдвигаться из-за изменения температуры и влажности, при которой проводят анализ образца, смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В настоящем случае погрешность расположения пиков ±0,2°2θ учитывает указанные возможные изменения, не препятствуя однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы можно проводить на основании любой уникальной комбинации отличительных пиков (в °2θ), как правило, наиболее выраженных пиков. Дифрактограммы кристаллической формы, собранные при температуре и относительной влажности окружающей среды, нормировали по пикам стандарта NIST 675 при 8,853 и 26,774° 2-тета.

Полученный образец кристаллической формы 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида был охарактеризован при помощи дифрактограммы XRD с применением излучения CuKa как имевший пики дифракции (в градусах 2-тета), такие как описано ниже в табл. 2. В частности, дифрактограмма содержит пик при 11,8° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6, 19,3 и 26,7°; где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.

Таблица 2. Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллической формы 2 согласно примеру 5

Пик	Угол (° 2-тета) +/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика)
1	11,8	100,0
2	18,6	71,4
3	19,3	45,5
4	26,7	41,9
5	20,6	27,3
6	9,0	19,0
7	24,8	18,5
8	22,4	15,5
9	31,9	14,3
10	10,6	И,2

Пример 6 (Ссылочный).

Гидрохлорид N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4б][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамида

N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид (360 мг, 0,59 ммоль) растворяли в этаноле (10 мл) и ДХМ (2 мл). Добавляли гидрохлорид О-метилгидроксиламина (504 мг, 5,91 ммоль) и пиридин (478 мкл, 5,91 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение выходных (70 ч). Нагревали реакционную смесь до 60°C и перемешивали в течение 24 ч. Концентрировали реакционную смесь с получением неочищенного продукта, который очищали путем хроматографии на силикагеле с градиентом 0-10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Полученное вещество растворяли в ДХМ (5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,54 мл, 540 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (240 мг, 75%). ИЭР/МС (m/e): 475 (М+Н).

Пример 7 (Ссылочный).

Гидрохлорид N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамида

N ^Н“^С|

N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид (330 мг, 0,53 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и разбавляли этанолом (10 мл). Добавляли гидрохлорид О-метилгидроксиламина (453 мг, 5,32 ммоль) и

- 28 031764 пиридин (430 мкл, 5,91 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение выходных (70 ч). Нагревали реакционную смесь до 60°C и перемешивали в течение 24 ч. Концентри ровали смесь на силикагеле (~10 г) и очищали путем хроматографии на силикагеле с градиентом 0-10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Полученное вещество растворяли в ДХМ (5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,49 мл, 490 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (159 мг, 54%). ИЭР/МС (m/e): 486 (М+Н).

Пример 8 (Ссылочный).

Гидрохлорид N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4d] [1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамида

N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3 ]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид (133 мг, 0,22 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (1 мл) и разбавляли метанолом (3 мл) и этанолом (3 мл). Добавляли гидрохлорид Ометилгидроксиламина (190 мг, 2,2 ммоль) и пиридин (180 мкл, 2,2 ммоль). Нагревали реакционную смесь до 50°C и перемешивали в течение ночи. Концентрировали смесь на силикагеле (~10 г) и очищали путем хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ. Вещество очищали во второй раз на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол и затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле. Наконец, смесь очищали на силикагеле с градиентом от 0 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Полученное вещество растворяли в ДХМ (5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,27 мл, 270 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (114 мг, 97%). ИЭР/МС (m/e): 493 (М+Н).

Пример 9 (Ссылочный).

Гидрохлорид N- [3 - [(4aR,7aS)-2-амино-6-(5 -фторпиримид ин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4d] [1,3]тиазин-7 а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамида

N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d][1,3 ]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид (190 мг, 0,31 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (1 мл) и разбавляли метанолом (3 мл) и этанолом (3 мл). Добавляли гидрохлорид Ометилгидроксиламина (267 мг, 3,1 ммоль) и пиридин (253 мкл, 3,1 ммоль) и нагревали реакционную смесь до 50°C и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь очищали на колонке SCX с использованием смеси 3:1 ДХМ:метанол и затем 2:1 ДХМ:7н. аммиак в метаноле. Наконец, вещество очищали на силикагеле с градиентом от 0 до 10% смесями 7н. аммиака в метаноле в ДХМ с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Полученное вещество растворяли в ДХМ (5 мл) и добавляли 1М хлороводород в диэтиловом эфире (0,20 мл, 200 мкмоль). Удаляли растворитель в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (101 мг, 60%). ИЭР/МС (m/e): 504 (М+Н).

Пример 10 (Ссылочный).

N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид

F

В раствор 3,5-дифторпиколиновой кислоты (19,9 г, 125 ммоль) в ацетонитриле (617 мл) и диметилформамиде (10,5 мл) добавляли хлорангидрид щавелевой кислоты (10,5 мл, 136,4 ммоль). После 30минутного перемешивания полученный раствор добавляли в свежеприготовленный раствор (4aR,7aS)-7ci(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-амина (41,1 г, 113 ммоль) в смеси этанол (823 мл)/вода (823 мл), предварительно нагретый до 50°C. Реакционную смесь выдерживали при 50°C в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до 22°C и выпаривали растворитель. Водный раствор разбавляли ДХМ (1 л) и доводили рН при помощи 2М гидроксида натрия

- 29 031764 до рН=11. Отделяли органический слой и дополнительно промывали водный слой ДХМ (2х400 мл). Объединяли органические экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха. Неочищенное вещество очищали путем хроматографии на силикагеле с градиентом 0-10% ДХМ смесями 2н. аммиак в метаноле/ДХМ с получением указанного в заголовке соединения в виде беловатого твердого вещества (45 г, 78%). ИЭР/МС (m/e): 504 (М+1).

Исследования in vitro:

Для ферментных и клеточных исследований in vitro готовили растворы исследуемых соединений в ДМСО, получали 10 мМ маточный раствор. Маточный раствор последовательно разбавляли в ДМСО в 96-луночном круглодонном планшете для получения кривой разбавления по десяти точкам, где конечные концентрации соединения находились в диапазоне от 10 мМ до 0,05 нМ, после чего проводили ферментные и исследования на целых клетках in vitro.

Исследования ингибирования протеазы in vitro:

Экспрессия ВАСЕ1 человека

ВАСЕ1 человека (учетный номер: AF190725) клонировали из тотальной кДНК, выделенной из мозга, путем ОТ-ПЦР. Последовательности нуклеотидов, соответствующие последовательностям аминокислот № 1-460, встраивали в кДНК, кодирующую полипептид IgG₁ (Fc) человека (Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)). Указанный химерный белок ВАСЕ1(1-460) и Fc человека, который называли huBACE1:Fc, встраивали в вектор pJB02. BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc) человека транзиентно экспрессировался в клетках HEK293. 250 мкг кДНК каждого конструкта смешивали с Fugene 6 и добавляли к 1 л клеток HEK293. Через 4 дня после трансфекции собирали кондиционированную среду для очистки.

Очистка huBACE1:Fc huBACE1:Fc очищали путем хроматографии белка А. Фермент хранили при -80°C в виде небольших аликвот.

Исследование методом резонансного переноса энергии флюоресценции с временным разрешением (FRET) с использованием ВАСЕ1

Проводили последовательное разбавление исследуемых соединений согласно приведенному выше описанию. Соединения дополнительно разбавляли 20х в буфере KH2PO4. По десять мкл каждого разбавленного раствора добавляли в каждую лунку в ряду А-Н соответствующего черного планшета с низким связыванием с белком, содержащего реакционную смесь (25 мкл 50 мМ KH₂PO₄, рН 4,6, 1 мМ TRITON® Х-100, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 15 мкМ субстрата FRET) (см., Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)). Содержимое тщательно перемешивали на встряхивателе планшетов в течение 10 мин. В планшет, содержащий субстрат и исследуемые соединения, добавляли пятнадцать мкл 200 пМ BACE1(1-460):Fc человека (см., Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)) в буфере KH₂PO₄ для инициирования реакции. Показатель RFU смеси в момент времени 0 измеряли при длине волны возбуждения 355 нм и длине волны испускания 460 нм после краткосрочного перемешивания на шейкере для планшетов. Реакционный планшет накрывали алюминиевой фольгой и выдерживали во влажной камере без доступа света при комнатной температуре в течение 16-24 ч. Измеряли показатель RFU по окончании инкубации при таких же условиях возбуждения и испускания, что использовали для момента времени 0. Разница RFU в момент времени 0 и по окончании инкубации соответствует активности ВАСЕ1 при обработке соединением. Строили график зависимости разницы RFU от концентрации ингибитора, показатели кривой подставляли в четырехпараметровое логистическое уравнение для получения значений ЕС50 и IC₅₀. (См., Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)).

Предложенные соединения, приведенные ниже, которые исследовали по существу согласно приведенному выше описанию, имели следующую активность в отношении ВАСЕ1:

Таблица 3

Пример	ВАСЕ1,1С₅о (нМ)
1	0,610 (± 0,0948, п=8)
2	0,482 (± 0,0580, п=6)
3	0,603 (± 0,0815, п=7)
4	0,615 (± 0,101, п=5)
6	0,450 (± 0,0911, п=4)
7	0,739 (± 0,181, п=7)
8	0,358
9	0,780 (±0,120, п=6)

Среднее ± СОС;

СОС = стандартная ошибка среднего

Полученные данные демонстрируют, что соединения, приведенные в табл. 3, ингибируют активность очищенного рекомбинантного фермента ВАСЕ1 in vitro.

- 30 031764

Исследования на целых клетках для измерения ингибирования активности бета-секретазы Исследование на целых клетках HEK293Swe

В традиционном исследовании на целых клетках для измерения ингибирования активности бетасекретазы применяли клеточную линию почки эмбриона человека HEK293р (учетный номер АТСС CRL1573), стабильно экспрессирующую кДНК АРР751 человека, содержащую природную двойную мутацию Lys651Met652 в виде Asn651Leu652, которую обычно называют шведской мутацией (обозначение HEK293Swe) и обеспечивают повышенную выработку A3 (Citron et al., Nature, 360, 672-674 (1992)). Исследования снижения уровня A3 in vitro описаны в литературе (см., Dovey et al., Journal of Neurochemistry, 76, 173-181 (2001); Seubert et al., Nature, 361, 260 (1993); и Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)).

Клетки (HEK293Swe в количестве 3,5x10⁴ клеток/лунку в 200 мкл питательной среды DMEM, содержащей 10% ЭБС) инкубировали при 37°C в течение 4-24 ч в присутствии/отсутствие ингибиторов (разбавленных в ДМСО) в желаемой концентрации. После завершения инкубации проводили анализ кондиционированной страны для определения активности бета-секретазы, например, анализ уровня пептидов A3. Общий уровень пептидов A3 (A3 1-х) измеряли при помощи сэндвич-анализа ELISA с использованием моноклонального 266 в качестве антитела захвата и биотинилированного 3D6 в качестве репортерного антитела. В качестве альтернативы уровень пептидов A3 1-40 и A3 1-42 измеряли при помощи сэндвич-анализа ELISA с использованием моноклонального 2G3 в качестве антитела захвата для A3 1-40 и моноклонального 21F12 в качестве антитела захвата для A3 1-42. В качестве репортерного антитела в ELISA A3 1-40 и A3 1-42 использовали биотинилированное 3D6. Концентрация A3, высвобождаемого в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности ВАСЕ1 в указанных условиях. Строили кривую ингибирования по 10 точкам и подставляли в четырехпараметровое логистическое уравнение для получения значений EC₅₀ и IC₅₀ в отношении снижения уровня A3. Предложенные соединения, приведенные ниже, которые исследовали по существу согласно приведенному выше описанию, имели следующую активность в отношении понижения уровня A3:

Таблица 4

Пример	НЕК 293 Swe А-бета (1-40) ELISA, 1С₅₀ (нМ)	НЕК 293 Swe А-бета (1-42) ELISA, 1С₅₀ (нМ)
1	0,619	0,437
2	0,324	0,289
3	1,26	0,299
6	0,0887	0,0785
7	0,220	0,211

Полученный данные демонстрируют, что соединения, приведенные в табл. 4, подавляют естественную выработку A3 в цельных клетках.

Исследование с использованием первичных нейронов PDAPP

Также проводили подтверждающее исследование на целых клетках в культурах первичных нейронов, выделенных у эмбрионов трансгенных мышей PDAPP. Первичные кортикальные нейроны получали из эмбрионов PDAPP возрастом 16 дней и выращивали в 96-луночных планшетах (15x10⁴ клеток/лунку в среде DMEM/F12 (1:1) с 10% ЭБС). После выдерживания в течение 2 дней in vitro питательную среду заменяли на бессывороточную среду DMEM/F12 (1:1), содержащую добавку В27 и 2 мкМ (конечная концентрация) Ara-C (Sigma, С1768). На 5 день выдерживания in vitro нейроны инкубировали при 37°C в течение 24 ч в присутствии/отсутствии ингибиторов (разбавленных в ДМСО) в желаемой концентрации. После завершения инкубации проводили анализ кондиционированной среды для определения активности бета-секретазы, например, анализ пептидов A3. Общий уровень пептидов A3 (A3 1-х) измеряли при помощи сэндвич-анализа ELISA с использованием моноклонального 266 в качестве антитела захвата и биотинилированного 3D6 в качестве репортерного антитела. В качестве альтернативы уровень пептидов A3 1-40 и A3 1-42 измеряли при помощи сэндвич-анализа ELISA с использованием моноклонального 2G3 в качестве антитела захвата для A3 1-40 и моноклонального 21F12 в качестве антитела захвата для A3 1-42. В качестве репортерного антитела в ELISA A3 1-40 и A3 1-42 использовали биотинилированное 3D6. Концентрация A3, высвобождаемого в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности ВАСЕ1 в указанных условиях. Строили кривую ингибирования по 10 точкам и подставляли в четырехпараметровое логистическое уравнение для получения значений EC50 и IC50 в отношении снижения уровня A3. Предложенные соединения, приведенные ниже, которые исследовали по существу согласно приведенному выше описанию, имели следующую активность в отношении понижения уровня A3:

- 31 031764

Таблица 5

Пример	А-бета (1-40)в нейронах PDAPP ELISA, 1С₅₀ (нМ)	А-бета (1-42)в нейронах PDAPP ELISA, 1С₅₀ (нМ)
1	0,487 (± 0,0946, п=2)	0,591 (± 0,268, п=2)
2	0,244	1,22 (± 0,967, п=2)
3	0,481 (± 0,371, п=3)	0,363 (± 0,428, п=3)
4	0,275 (±0,176, п=4)	0,228 (± 0,244, п=3)
6	0,132 (±0,0717, п=2)	0,0813
7	0,279 (± 0,0607, п=2)	0,308 (± 0,115, п=2)
8	0,137 (±0,0697, п=3)	0,0725 (±0,0114, п=2)
9	0,309 (± 0,206, п=3)	0,379 (± 0,353, п=3)

Среднее ± СОС;

СОС = стандартная ошибка среднего

Полученные данные демонстрируют, что соединения, приведенные в табл. 5, подавляют выработку Άβ в цельных клетках.

Ингибирование бета-секретазы in vivo

Для скрининга ингибирования активности бета-секретазы in vivo после обработки соединением можно использовать несколько животных моделей, включая мышей, морских свинок, собак и мартышек. Животные, применяемые согласно настоящему изобретению, могут представлять собой животных дикого типа, трансгенных животных или животных с нокаутом гена. Например, модели мышей PDAPP, которых использовали согласно описанию Games et al., Nature 373, 523-527 (1995), и других нетрансгенных животных или животных с нокаутом гена подходят для анализа подавления выработки Άβ и sAPPbeta in vivo в присутствии ингибирующих соединений. В общем случае мышам PDAPP, мышам с нокаутом гена или нетрансгенным животным возрастом от 2 до 12 месяцев вводили соединение в виде составов совместно с носителями, такими как кукурузное масло, циклодекстран, фосфатные буферы, PHARMASOLVE®, или с другими подходящими носителями. По прошествии периода от 1 до 24 ч после введения соединения животных умерщвляли и удаляли мозг, а также спинномозговую жидкость и плазму для анализа уровня Άβ, С99 и фрагментов sAPP. (См., May et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

Для стандартных фармакологических исследований in vivo животным вводили различные концентрации соединения и проводили сравнение с контрольной группой, которой в то же время вводили носитель. В некоторых исследованиях изменений во времени у отдельных животных получали образцы мозговой ткани, плазмы или спинномозговой жидкости, начиная с момента времени 0, для определения исходного уровня. В других группах вводили соединение или соответствующий носитель, затем животных умерщвляли в различные моменты времени после начала дозирования. Получали образцы мозговой ткани, плазмы или спинномозговой жидкости у отдельных животных и проводили анализ на наличие продуктов расщепления АРР, включая пептиды Άβ, sAPPbeta и другие фрагменты АРР, например, при помощи специфических сэндвич-анализов ELISA. По завершении исследуемого периода животных умерщвляли и при необходимости проводили анализ образцов мозговых тканей, плазмы или спинномозговой жидкости на наличие пептидов Άβ, С99 и sAPPbeta. Мозговые ткани трансгенных животных АРР также можно анализировать для определения количества бета-амилоидных бляшек после обработки соединением. Пептид Άβ 1-х при использовании в настоящем описании относится к суммарному содержанию частиц Άβ, которые с одного конца имеют остаток 1, а с другого С-конец при остатке с порядковым номером более 28. Указанный параметр позволяет детектировать основную часть частиц Άβ, и его часто называют тотальный Άβ.

У животных (PDAPP или других АРР трансгенных или нетрансгенных мышей), которым вводили ингибирующее соединение, можно наблюдать снижение уровня Άβ или sAPPbeta в мозговых тканях, плазме или спинномозговой жидкости и уменьшение бета-амилоидных бляшек в мозговой ткани по сравнению с контролем, где вводили носитель, или контролем в момент времени ноль. Через 3 ч после перорального введения 1, 3 или 10 мг/кг дозы соединения согласно примеру 1 молодым самкам мышей PDAPP уровень пептида Άβ 1-х снижался примерно на 34, 48 и 53% в гиппокампе мозга и примерно на 43, 59 и 66% в коре головного мозга, соответственно, по сравнению с мышами, которым вводили носитель.

Через 3 ч после перорального введения 1 или 3 мг/кг дозы соединения согласно примеру 3 уровень пептида Άβ 1-х снижался примерно на 38 и 50% в гиппокампе мозга и примерно на 34 и 53% в коре головного мозга, соответственно, по сравнению с мышами, которым вводили носитель.

В случае соединения согласно примеру 4 через 3 часа после перорального введения 0,3, 1 или 3 мг/кг дозы соединения уровень пептида Άβ 1-х снижался примерно на 31, 39 и 61% в гиппокампе мозга и

- 32 031764 примерно на 28, 42 и 64% в коре головного мозга, соответственно, по сравнению с мышами, которым вводили носитель.

С учетом активности соединений согласно примерам 1, 3 и 4 в отношении фермента ВАСЕ in vitro указанное действие в отношении понижения уровня A3 согласуется с ингибированием ВАСЕ in vivo, что дополнительно подтверждает проницаемость соединений согласно примерам 1, 3 и 4 в ЦНС.

Указанные исследования подтверждают, что соединения согласно примерам 1-9 ингибируют ВАСЕ и, таким образом, подходят для снижения уровня A3.

Исследование комбинации Пилотное исследование корма, содержащего ингибитор ВАСЕ

Проводили пилотное исследование фармакокинетики и фармакодинамики у мышей PDAPP, которым давали корм для грызунов, содержащий ингибитор ВАСЕ, такой как соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, для определения доз, которые обеспечивают минимальное и выраженное снижение уровня A3 в плазме и мозге за счет ингибирования исключительно ВАСЕ. Молодым мышам PDAPP в течение 14 дней давали корм для грызунов, содержащий ингибитор ВАСЕ в дозах, эквивалентных введению 3, 10, 30 или 100 мг/кг дважды в день квази-bid. Ингибитор ВАСЕ в количестве -0,05, 0,15, 0,5 или 1,5 мг на грамм сертифицированного корма для грызунов 8728СМ (Harlan labs) перемешивали в смесителе Sorvall в течение 10 мин, а затем перемешивали в смесителе Hobart в течение 15 мин перед изготовлением гранул. Тридцать двух молодых самок мышей PDAPP случайным образом по родительской клеточной линии распределяли по 4 группам из 8 животных, включавших группу, в которой вводили носитель, и группы, в которых вводили три дозы ингибитора ВАСЕ. Мышам предоставляли доступ к пище ad libitum в течение 14 дней и затем умерщвляли. Мышей анестезировали с использованием CO₂ и собирали кровь путем сердечной пункции в пробирки для микроцентрифуги с покрытием ЭДТА и хранили во льду. Затем собирали образцы плазмы путем центрифугирования образцов крови в течение 4 минут при 14000 об./мин при комнатной температуре, переносили в необработанные пробирки для микроцентрифуги, затем замораживали в сухом льду и хранили при -80°C до проведения анализа. Мышей умерщвляли путем обезглавливания, быстро проводили микродиссекцию мозга и разделяли его на половины, мгновенно замораживали в сухом льду и хранили при -80°C до проведения анализа (в одной половине проводили анализ A3, в другой половине -измерение воздействия соединения). Для анализа паренхимального A3 образцы мозга гомогенизировали в 5,5М буфере гуанидин-HCl (0,5 мл на половину мозга) с использованием гомогенизатора тканей типа ротор/статор (tearor, модель 985-370) со скоростью 5 в течение примерно 1 мин. Гомогенизированные образцы мозга перемешивали путем нутации в течение ночи при комнатной температуре.

Для ELISA-анализа A3 собирали экстракты и разбавляли по меньшей мере 1:10 в казеиновом буфере (1х ФБР, содержащий 0,25% казеина, 0,05% Tween 20, 0,1% тимеросала, рН 7,4, и коктейль ингибиторов протеазы (Sigma P9340, в концентрации 0,01 мг/мл)) и центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин. Для анализа уровня A3 в плазме образцы разбавляли 1:2 в буфере для образцов (ФБР; 0,05% Triton X-405; 0,04% тимеросала, 0,6% БСА) перед проведением анализа ELISA. Уровень A31-x человека в плазме определяли при помощи сэндвич-анализа ELISA с использованием m266.2 (к A3i3_-28) и биотинилированного 3D6 (к A3_1-5) в качестве антитела захвата и репортерного антитела соответственно. Неизвестные образцы исследовали в двух повторностях и определяли значения в пг/мл путем интерполяции (Soft Max Pro, версия 5.0.1, Molecular Dynamics, с использованием 4-параметровой подстановки в стандартную кривую) стандартных кривых, построенных по 8 точкам, и затем делали поправку на разбавление. Уровень паренхимального A3 определяли при помощи сэндвич-анализа ELISA согласно приведенному выше описанию, значения нормировали по уровню белка (который определяли в двух повторно стях при помощи способа Bradford Coomassie Plus Protein) и выражали в виде пг/мг белка.

Для определения уровня ингибитора ВАСЕ в тканях и плазме применяли следующий способ: 0,1 мг/мл маточный раствор ингибитора ВАСЕ последовательно разбавляли в смеси метанол/вода (1:1, об./об.) для получения рабочих растворов, которые затем использовали для повышения концентрации контрольных гомогенатов плазмы и мозга, что давало концентрации анализируемых компонентов, составляющие 1, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 и 5000 нг/мл. Перед проведением анализа образцы мозга гомогенизировали в 3 объемах смеси метанол/вода (1:4, об./об.) на ультразвуковом разрушителе. Аликвоты каждого исследуемого образца, соответствующего калибровочного стандарта и контрольной матрицы переносили в 96-луночный планшет и затем перемешивали с ацетонитрилом, содержащим внутренний стандарт. После перемешивания образцы центрифугировали до образования сгустков осажденных белков. Затем аликвоты полученных надосадочных жидкостей переносили в прозрачный 96луночный планшет и разбавляли смесью метанол/вода (1:1, об./об.) и проводили анализ 10 микролитровых аликвот путем ЖХ-МС/МС. Концентрации анализируемых компонентов вычисляли по отношению ответа к концентрации, определенному при помощи множественной регрессии примерных калибровочных кривых.

Исследование комбинации in vivo

Для оценки комбинированной терапии для понижения уровня бляшек с применением моноклональ

- 33 031764 ного антитела к N3pGlu Άβ, такого как моноклональное антитело VII к N3pGlu Άβ (см. табл. 1, mE8cIgG2a; см. описание патента США № 8679498 В2; USSN 13/810895), и ингибитора ВАСЕ, такого как соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, сначала состаривали крупную когорту мышей PDAPP до возраста от 16 до 18 месяцев. Состаренных мышей PDAPP случайным образом распределяли на пять групп на основании пола, родительской клеточной линии и возраста. В каждую группу включали по 20-30 состаренных мышей PDAPP. Группу 1 умерщвляли в момент времени ноль в начале исследования для определения исходного уровня патологии перед терапевтическим лечением (вскрытие, как описано ниже). В четырех оставшихся группах вводили: в группе 2 контрольным животным вводили корм для грызунов с плацебо и еженедельные инъекции 12,5 мг/кг контрольного изотипа антитела IgG2a; в группе 3 животным вводили еженедельные инъекции 12,5 мг/кг моноклонального антитела к N3pGlu Άβ; в группе 4 животным вводили корм для грызунов с ингибитором ВАСЕ в дозах, определенных в пилотном исследовании корма, как правило, ~ от 3 до 30 мг/кг/день; в группе 5 животным вводили корм для грызунов с ингибитором ВАСЕ (~ от 3 до 30 мг/кг/день) и еженедельные инъекции 12,5 мг/кг моноклонального антитела к N3pGlu Άβ. Моноклональное антитело к N3pGlu Άβ разбавляли из стерильных маточных растворов, содержащих антитело в буфере ФБР, и вводили животным путем интраперитонеальной инъекции. Ингибитор ВАСЕ смешивали с сыпучим кормом для грызунов (~ от 0,15 до 1,5 мг соединения на грамм корма в зависимости от желаемой дозы) и прессовали в гранулы корма. Определяли массу животных в начале исследования и затем раз в неделю в течение первого месяца лечения и затем раз в месяц в ходе исследования. На протяжении исследования с регулярными интервалами также отслеживали прием пищи. Общая продолжительность лечения животных в исследовании составляла 4 месяца. Животным продолжали вводить соответствующий корм до вскрытия, которое проводили через одну неделю после последней инъекции антитела. Во время вскрытия животных анестезировали и собирали образцы крови путем сердечной пункции при помощи 1 мл шприцев, предварительно промытых ЭДТА. Собирали образцы крови во льду и выделяли образцы плазмы при помощи стандартного способа центрифугирования. Затем проводили перфузию животных холодным гепаринизированным солевым раствором и удаляли мозг, проводили диссекцию, разделяли на левое и правое полушария. Одно полушарие мозга мгновенно замораживали и сохраняли для гистологического анализа. Проводили диссекцию оставшегося полушария мозга на тканевые сегменты, состоящие из гиппокампа, коры, мозжечка и среднего мозга, и затем замораживали в сухом льду. Образцы плазмы и тканей хранили при -80°C до начала анализа.

Оценка фармакокинетики

Фармакокинетику в плазме определяли в образцах плазмы, полученных во время вскрытия. Уровень антител в плазме определяли в исследовании связывания с антигеном ELISA, где на планшеты наносили покрытие антигена (Άβ_pз_-42) и затем инкубировали совместно с разбавленными образцами плазмы или стандартом сравнения, состоящим из моноклонального антитела, последовательно разбавленного к N3pGlu в буфере для исследования (ФБР + контрольная плазма мышиных). После промывки планшета связанное мышиное антитело обнаруживали при помощи анти-мышиного антитела, конъюгированного с HRP, затем проводили окрашивание с использованием ТМВ. Для определения уровня ингибитора ВАСЕ в ткани (средний мозг) и плазме применяли следующий способ: 0,1 мг/мл маточный раствор ингибитора ВАСЕ последовательно разбавляли в смеси метанол/вода (1:1, об./об.) для получения рабочих растворов, которые затем использовали для повышения концентрации контрольных гомогенатов плазмы и мозга, что давало концентрации анализируемых компонентов, составляющие 1, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 и 5000 нг/мл. Перед проведением анализа образцы мозга гомогенизировали в 3 объемах смеси метанол/вода (1:4, об./об.) на ультразвуковом разрушителе. Аликвоты каждого исследуемого образца, соответствующего калибровочного стандарта и контрольной матрицы переносили в 96-луночный планшет и затем перемешивали с ацетонитрилом, содержащим внутренний стандарт. После перемешивания образцы центрифугировали до образования сгустков осажденных белков. Затем аликвоты полученных надосадочных жидкостей переносили в прозрачный 96-луночный планшет и разбавляли смесью метанол/вода (1:1, об./об.) и проводили анализ 10 микролитровых аликвот путем ЖХ-МС/МС. Концентрации анализируемых компонентов вычисляли по отношению ответа к концентрации, определенному при помощи множественной регрессии примерных калибровочных кривых.

Оценка фармакодинамики

Концентрацию паренхимального Άβ определяли в гомогенатах тканей, растворенных в гуанидине, при помощи сэндвич-анализа ELISA. Экстракцию ткани проводили при помощи технологии разрушения стеклянными шариками (bead beater), где замороженную ткань экстрагировали 1 мл смеси 5,5М гуанидин/50 мМ Tris/0,5X коктейль ингибиторов протеазы, рН 8,0, в планшетах с 2 мл глубокими лунками, содержащими 1 мл силиконизированных стеклянных шариков (закрытые планшеты встряхивали два раза по 3 минуты). Проводили анализ уровня Άβl_-4o и Άβl_-42 в полученных лизатах тканей при помощи сэндвич-анализа ELISA: образцы для разрушения стеклянными шариками разбавляли 1:10 в 2% БСА/ФБР-Т и фильтровали через планшет для фильтрования образцов (Millipore). Образцы, пустые пробы, стандарты, образцы для контроля качества дополнительно разбавляли в смеси 0,55М гуанидин/5 мМ Tris в 2%

- 34 031764

БСА/ФБРТ, после чего размещали в планшетах для образцов. Стандарт сравнения разбавляли в разбавителе образцов. Планшеты с нанесенным покрытием 15 мкг/мл антитела захвата 21F12 (к Aβ₄₂) или 2G3 (к Aβ₄₀) инкубировали совместно с образцами, детектирование проводили с использованием биотинилированного 3D6 (к Aβ_1-x), разбавленного в 2% БСА/ФБР-Т, затем NeutrAvidin-HRP (Pierce), разбавленного 1:20000 в 2% БСА/ФБР-Т, и окрашивали с использованием ТМВ (Pierce). Уровень Aβ определяли путем интерполяции стандартных кривых, конечную концентрацию в ткани вычисляли как нанограммы Aβ на миллиграмм массы влажной ткани. Площадь в процентах гиппокампа и коры мозга, занятую отложениям Aβ, определяли путем гистологии. Последовательные коронарные срезы для криостата (толщиной от 7 до 10 мкм) инкубировали совместно с 10 мкг/мл биотинилированного 3D6 (к Aβl_-x) или мышиного IgG (биотинилированного) в качестве отрицательного контроля. Применяли вторичные реагенты HRP, специфические к биотину, отложения Aβ визуализировали при помощи DAB-Plus (DAKO). Отложения иммунореактивного Aβ количественно оценивали в данных областях гиппокампа или коры мозга путем анализа подученных изображений при помощи программного обеспечения Image Pro plus (Media Cybernetics).

В указанных исследованиях можно показать, что комбинированная терапия с применением моноклонального антитела к N3pGlu Aβ и ингибитора ВАСЕ, такого как соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, может приводить к повышенному снижению уровня Aβ по сравнению с проведением способов монотерапии по отдельности.

Список последовательностей <SEQ Ш NO: 1; PRT1; искусственная> (LCDR1- B12L/R17L)

KSSQSLLYSRGKTYLN <SEQ Ш NO: 2; PRT1; искусственная>

AVSKLDS <SEQ Ш NO: 3; PRT1; искусственная>

VQGTHYPFT <SEQ Ш NO: 4; PRT1; искусственная>

GYDFTRYYIN <SEQ Ш NO: 5; PRT1; искусственная>

GYTFTRYYIN <SEQ Ш NO: 6; PRT1; искусственная>

WINPGSGNTKYNEKFKG <SEQ Ш NO: 7; PRT1; искусственная>

EGITVY <SEQ Ш NO: 8; PRT1; искусственная>

(LCDR2 - B12L/R17L) (LCDR3 - B12L/R17L) (HCDR1 -B12L) (HCDR1 -R17L) (HCDR2 - B12L/R17L) (HCDR3 - B12L) (HCDR3 - R17L)

- 35 031764

EGTTVY <SEQ Ш NO: 9; PRT1; искусственная> (LCVR - B12L/R17L)

DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWLLQKPGOSPOLLIYAVSKLDS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGOGTKLEIK <SEQ Ш NO: 10; PRT1; искусственная> (HCVR - B12L)

OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYDFTRYYINWVROAPGOGLEWMGWINPGSGN

TKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITVYWGOGTTVTVS S <SEQ Ш NO: 11; PRT1; искусственная> (HCVR - R17L)

OVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYYINWVROAPGOGLEWMGWINPGSGN

TKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTTVYWGOGTTVTVS S <SEQ Ш NO: 12; PRT1; искусственная> (LC - B12L/R17L)

DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCKSSOSLLYSRGKTYLNWLLQKPGOSPOLLIYAVSKLDS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGOGTKLEIKRTVAAPSVF

IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC <SEQ Ш NO: 13; PRT1; искусственная> (НС - B12L)

OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYDFTRYYINWVROAPGOGLEWMGWINPGSGN

TKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITVYWGOGTTVTVS SA

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP

SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK

SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG <SEQ Ш NO: 14; PRT1; искусственная> (НС - R17L)

OVOLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYYINWVROAPGOGLEWMGWINPGSGN

TKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTTVYWGOGTTVTVS S

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVF SC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPG

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ

МЭЙ, Патрик

МЕРГОТТ, Дастин <120> КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ <130> P20348 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> БЕЛОК

- 36 031764

<213>

Искусственная последовательность

<220> <223>	Синтетическая конструкция
<400>	1

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1	5 10 15
<210> <211> <212> <213>	2 7 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	Синтетическая конструкция
<400>	2

Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser

1	5
<210> <211> <212> <213>	3 9 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	Синтетическая конструкция
<400>	3

Val Gln Gly Thr His Tyr Pro Phe Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	4 10 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	Синтетическая конструкция
<400>	4

Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	5 10 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <223>	Синтетическая конструкция
<400>	5

- 37 031764

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn

5 10 <210> 6 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400>6

Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 1015

Gly <210>7 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 7

Glu Gly Ile Thr Val Tyr

5 <210> 8 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400>8

Glu Gly Thr Thr Val Tyr <210>9 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

5 10 15

- 38 031764

Gln

Pro Ala

Ser 20

Ile

Ser Cys

Lys

Ser 25

Ser Gln

Ser

Leu

Leu 30

Tyr

Ser

Arg

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Gln

Leu

Ile

Tyr

Ala

Val

Ser

Lys

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Cys

Val

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> <211> <212> <213>	10 115 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическая	конструкция
<400>	10

Gln Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Asp

Phe

Thr

Arg

Tyr

20

25

30

Tyr

Ile

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Pro

Gly

Ser

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gly

Ile

Thr

Val

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Val

Thr

100

105

110

- 39 031764

Val Ser Ser

115

<210> <211> <212> <213>	11 115 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическая	конструкция
<400>	11

Gln Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Arg

Tyr

20

25

30

Tyr

Ile

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Pro

Gly

Ser

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gly

Thr

Val

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val Ser Ser

115 <210> 12 <211> 219 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

5 10 15

Gln Pro Ala Ser

Ile Ser Cys Lys Ser

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 30

- 40 031764

Arg

Gly

Lys 35

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp 40

Leu

Gln

Lys

Pro 45

Gly Gln

Ser

Pro

Gln

Leu

Ile

Tyr

Ala

Val

Ser

Lys

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Cys

Val

Gln

Gly

85

90

95

Thr

His

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

Arg

Thr

Val

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

115

120

125

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

130

135

140

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

145

150

155

160

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

165

170

175

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

180

185

190

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

195

200

205

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

<210>	13
<211>	444
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическая	конструкция
<400>	13
Gln Val	Gln Leu Val	Gln Ser Gly Ala	Glu Val Lys Lys	Pro Gly Ser
1	5		10	15

- 41 031764

Ser Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Asp

Phe

Thr 30

Arg

Tyr

Ile

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Pro

Gly

Ser

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gly

Ile

Thr

Val

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

115

120

125

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Gly

165

170

175

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Leu

Gly

180

185

190

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

195

200

205

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

210

215

220

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

225

230

235

240

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

245

250

255

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

260

265

270

- 42 031764

Phe Asn

Trp 275

Tyr

Val

Asp

Gly

Val 280

Glu

Val

His

Asn

Ala 285

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

290

295

300

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

305

310

315

320

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

325

330

335

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

340

345

350

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

355

360

365

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

370

375

380

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

385

390

395

400

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

405

410

415

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

420

425

430

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

<210> 14 <211> 444 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20	25	30

- 43 031764

Tyr

Ile Asn Trp 35

Val

Arg Gln

Ala 40

Pro

Gly Gln

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Pro

Gly

Ser

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gly

Thr

Val

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

115

120

125

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Gly

165

170

175

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Leu

Gly

180

185

190

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

195

200

205

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

210

215

220

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

225

230

235

240

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

245

250

255

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

260

265

270

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

275

280

285

- 44 031764

Pro

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg Val 300

Val

Ser Val

Leu

290

295

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

305

310

315

320

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

325

330

335

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

340

345

350

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

355

360

365

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

370

375

380

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

385

390

395

400

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

405

410

415

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

420

425

430

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

435

440

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эффективным количеством моноклонального антитела к N3pGlu A3.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное моноклональное антитело к N3pGlu A3 представляет собой антитело B12L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или антитело R17L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что указанное моноклональное антитело к N3pGlu A3 представляет собой B12L.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид.

- 45 031764
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой кристаллическую форму 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида характеризуется пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6,

19,3 и 26,7°, где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанное соединение и моноклональное антитело к N3pGlu Άβ вводят одновременно.
8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанное соединение вводят перед введением указанного моноклонального антитела к N3pGlu Άβ.
9. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ вводят перед введением указанного соединения.
10. Набор для лечения болезни Альцгеймера, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы или его фармацевтически приемлемую соль совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами, и фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело к N3pGlu Άβ совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.
11. Набор по п.10, где указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой антитело B12L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или антитело R17L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14.
12. Набор по любому из пп.10 или 11, в котором указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой B12L.
13. Набор по любому из пп.10-12, в котором указанное соединение представляет собой N-[3[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид.
14. Набор по любому из пп.10-13, в котором указанное соединение представляет собой кристаллическую форму 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4d][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида.
15. Набор по п.14, в котором кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4Л][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида характеризуется пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6,

19,3 и 26,7°, где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.
16. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с моноклональным антителом к N3pGlu Άβ для лечения болезни Альцгеймера.
17. Применение по п.16, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой антитело B12L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или антитело R17L, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14.
18. Применение по любому из пп.16 или 17, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело к N3pGlu Άβ представляет собой B12L.
19. Применение по любому из пп.16-18, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин

- 46 031764

7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид.
20. Применение по любому из пп.16-19, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой кристаллическую форму 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7тетрагидропирроло [3,4Ч][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида.
21. Применение по п.20, отличающееся тем, что кристаллическая форма 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4Ч][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]-4-фторфенил]-5метоксипиразин-2-карбоксамида характеризуется пиком в спектре рентгеновской дифракции при угле дифракции 11,8° 2-тета совместно с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 18,6,

19,3 и 26,7°, где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.