ES2762098T3 - Método y kit para medición de superalta sensibilidad de proteína y ácido nucleico, y nuevo sustrato enzimático - Google Patents

Método y kit para medición de superalta sensibilidad de proteína y ácido nucleico, y nuevo sustrato enzimático Download PDF

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Abstract

Un método para someter a ensayo la actividad enzimática usando un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usa peroxidasa como una enzima del complejo anticuerpo-enzima y como un sustrato de la enzima se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1),**Fórmula** en la que X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) como un sustrato de peroxidasa, y la cuantificación de un producto de la reacción enzimática se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o de tio-NADPH producida, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o por el tio-NADPH producidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Método y kit para medición de superalta sensibilidad de proteína y ácido nucleico, y nuevo sustrato enzimático [Referencia cruzada a solicitudes de patente relacionadas]
La presente solicitud reivindica la prioridad en la solicitud de patente japonesa 2011-63559, presentada el 23 de marzo de 2011.
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a un ensayo de alta sensibilidad de proteína y ácido nucleico y a un kit que usa un inmunoensayo enzimático y un ensayo de sonda de ácido nucleico. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método que permite un ensayo de ultraalta sensibilidad de proteína o ácido nucleico mientras que evita la interferencia causada en el método del ciclo de tio-NAD usado en estos ensayos de actividad enzimática mediante el empleo de un sustrato enzimático específico para una enzima marcada para un anticuerpo o sonda de ácido nucleico. La presente invención también se refiere a nuevos sustratos enzimáticos que se pueden usar en el ensayo de alta sensibilidad anterior de proteína y ácido nucleico y a un kit.
[Antecedentes en la tecnología]
Aunque se establece técnicamente el método de radioinmunoensayo (RIA) como una medición de alta sensibilidad de proteína o ácido nucleico, en las presentes circunstancias, es imposible cambiar el método mencionado anteriormente por uno que tenga una alta sensibilidad más allá de un grado de 10'16 moles además de mejorar la sensibilidad del equipo de detección. Y mediante el método de RIA, no solo se limita el lugar de la medición a una instalación experimental de isótopos, sino que la fecha de caducidad de los reactivos se volverá extremadamente corta y la sensibilidad de los reactivos disminuirá rápidamente, a causa del uso de nucleidos de vida corta. También tiene el problema del problema de los residuos radiactivos para el método de medición de radiación. Especialmente el problema del abandono en el caso de usar un nucleido de larga duración es serio. Por lo tanto, recientemente la investigación y desarrollo de la medición de alta sensibilidad de proteína o ácido nucleico se han desarrollado considerando "no radiactivo" como palabra clave. De ese modo, la mayoría de la investigación y desarrollo y la mejora técnica del método de RIA no se realizan en las condiciones actuales.
Una medición de alta sensibilidad reemplazada con el método de RIA, que es el inmunoensayo enzimático (método de ELISA) en la medición de proteína (Figura 1), y el método de PCR en la medición de ácido nucleico. El inmunoensayo enzimático puede transcurrir con elevada sensibilidad (10‘15 moles) mediante el método de fluorescencia y el método de luz emitida de sensibilidad de 10'13 moles mediante el ensayo colorimétrico en el revelado inicial, y también transcurre en el desarrollo y la mejora de dispositivo de medición exclusivo. Sin embargo, la sensibilidad ha llegado al límite, pero la operación de la medición es sencilla.
Además, en el método de PCR de medición de alta sensibilidad de ácido nucleico, se considera el problema de la detección de señal específica para la molécula diana, la eficacia de amplificación y las condiciones del producto de PCR llegando a una meseta, la cuantificación de ácido nucleico es estrictamente difícil.
El inmunoensayo enzimático que usa complejo anticuerpo-enzima y el ensayo de sonda de ácido nucleico que usa un complejo ácido nucleico-enzima que usa un ensayo de ciclo de tio-NAD ya se conoce (véase el documento WO2008/117816). Además, Sigma-Aldrich ofrece una enzima de peroxidasa de rábano y, como ensayo de control de calidad, un ensayo enzimático para dicha peroxidasa que usa ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) como sustrato. En Atsushi Iway y col., Kagakukeigaku Kyokai Hokkaido Shibu 2010 nen toki Kenkyu Happyokai koen yosh, 26 de enero de 2010, página 65 a, se describe un ensayo que usa una enzima de galactosidasa y un derivado de androsterona. Asimismo, en Kishi K. y col., Chlinical Chemistry, am. Ass. For chlinical chemistry, vol. 48, n.° 5, 1 de enero de 2002, páginas 737-741, se describe un ensayo que usa colesterol oxidasa, peroxidasa y un sustrato cromogénico.
[Divulgación de la invención]
[Problemas a solucionar mediante la invención]
De acuerdo con el método del Documento de patente 1, el inmunoensayo enzimático se combinó con el método de ciclo enzimático que usa como sustrato el que se produce mediante la enzima de marcaje que usa el inmunoensayo enzimático, y tio-NAD(P)H como sustancia de señal se amplifica de forma progresiva geométrica, y mediante un método de ensayo colorimétrico, da como resultado la cuantificación de proteína o ácido nucleico y la detección mediante ácido nucleico. Sin embargo, reveló que no necesariamente elevada reactividad de la enzima marcada y el sustrato, y el sustrato de la enzima de ciclo marcada inhibe parcialmente la reacción enzimática en la reacción de ciclo enzimático.
El objetivo de la presente invención está en un inmunoensayo enzimático, combinándose el método con el método de ciclo que usa como sustrato el que se produce mediante la enzima marcada usada en el inmunoensayo enzimático, solucionando el problema mencionado anteriormente del sustrato para la enzima marcada, y usando un medio de ensayo colorimétrico, método de detección de elevada sensibilidad de proteína o ácido nucleico mediante ensayo colorimétrico del método más fácil, y proporcionando el ensayo de aumento de la sensibilidad hasta un grado progresivo geométrico. En particular, se proporciona el método de ensayo que aumentó la sensibilidad más de 10-18 moles.
El presente inventor ha tenido éxito en la obtención de un compuesto como sustrato para enzima marcada que soluciona el problema mencionado anteriormente o que proporciona el nuevo compuesto y, por lo tanto, usando estos sustratos, ha tenido éxito en solucionar el problema mencionado anteriormente, y de ese modo se ha completado la presente invención.
[Medios para solucionar los problemas]
La presente invención es como sigue a continuación:
[1] Un método para someter a ensayo la actividad enzimática usando un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usa peroxidasa como enzima del complejo anticuerpo-enzima, y
se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1) como sustrato de la enzima,
Figure imgf000003_0001
en la que
(iii) X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) como sustrato de peroxidasa, y
la cuantificación de un producto de la reacción enzimática se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
[2] Un método para someter a ensayo una sonda de ácido nucleico usando una sonda de ácido nucleico marcada con enzima, en el que
se usa peroxidasa como enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima, y
se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1) como sustrato de la enzima,
Figure imgf000003_0002
en la que
(iii) X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) como sustrato de peroxidasa, y
la cuantificación de un producto de reacción de la reacción enzimática se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
[3] Un kit para inmunoensayo enzimático que comprende los siguientes reactivos (1) a (5):
(1) peroxidasa marcada con un anticuerpo específico frente a un antígeno de la proteína diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
Figure imgf000004_0001
(en la que X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6),
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
[4] Un kit para someter a ensayo una sonda de ácido nucleico que comprende los siguientes reactivos (1) a (5):
(1) peroxidasa marcada con una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
Figure imgf000004_0002
(en la que X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6),
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
[5] Un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1):
Figure imgf000005_0001
en la que,
X representa -O-CO-R, R representa un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
[Efectos de la invención]
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar un inmunoensayo enzimático que mejora la sensibilidad del ensayo hasta 10'18 moles o más, y medir una proteína diana o ácido nucleico diana con elevada sensibilidad.
[Breve descripción de las figuras]
La Figura 1 es el principio de ensayo del inmunoensayo enzimático (método ELISA);
la Figura 2 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 1;
la Figura 3 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 2;
la Figura 4 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 3;
la Figura 5 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 4;
la Figura 6 son compuestos de ejemplo de algunos 3a-hidroxiandrostanos;
la Figura 7 es la curva de calibración de fosfatasa alcalina obtenida en el Ejemplo 1;
la Figura 8 es la curva de calibración de fosfatasa alcalina obtenida en el Ejemplo 2;
la Figura 9 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 3;
la Figura 10 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 4;
la Figura 11 es la curva de calibración de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 5;
la Figura 12 es la curva de calibración de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 6;
la Figura 13 es la curva de calibración de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 7;
la Figura 14 es la curva de calibración de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 8;
la Figura 15 es la curva de calibración de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 9;
la Figura 16 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 10;
la Figura 17 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 11;
la Figura 18 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 12;
la Figura 19 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 13;
la Figura 20 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo de Referencia 7;
la Figura 21 es la curva de calibración de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo de Referencia 8;
la Figura 22 es la curva de calibración de peroxidasa de rábano obtenida en el Ejemplo 14; y
la Figura 23 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 15.
[Mejor modo de llevar a cabo la invención]
[Nuevo sustrato]
La presente invención se refiere a un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1).
Figure imgf000006_0001
en la que, X representa -O-CO-R, R representa un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
El grupo alcoxi C1-6 como ejemplo de Y2 puede ser, por ejemplo, un grupo metoxi, un grupo etoxi, un grupo propoxi, y el grupo alquilo C1-6 puede ser, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo iso-propilo, un grupo n-propilo, un grupo terc-butilo, un grupo n-butilo, un grupo n-pentilo, un grupo n-hexilo,
-CO- en -O-CO-R significa (C=O)-, y el grupo alquilo C1-6 en R puede ser, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo iso-propilo, un grupo n-propilo, un grupo terc-butilo, un grupo n-butilo, un grupo n-pentilo, un grupo nhexilo. Además, R puede ser un grupo fenilo y puede tener un grupo funcional.
Los presentes compuestos de la presente invención se pueden sintetizar basándose en o por referencia a los métodos que se describen en los Ejemplos.
[Ensayo de ciclo enzimático]
La presente invención se refiere a un ensayo enzimático que usa un complejo anticuerpo-enzima, en el que la cuantificación de un producto de reacción mediante la enzima del complejo anticuerpo-enzima se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, y deshidrogenasa (DH), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADpH producido.
El complejo anticuerpo-enzima consiste en un anticuerpo específico frente a un antígeno de la proteína diana y una enzima marcada con este anticuerpo, y se usa en el ensayo de la proteína diana mencionada anteriormente.
Además, la presente invención se refiere un método para someter a ensayo una sonda de ácido nucleico usando una sonda de ácido nucleico marcada con enzima, en el que la cuantificación de un producto de reacción mediante la enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima se lleva a cabo produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, y deshidrogenasa (DH), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
La sonda de ácido nucleico marcada con enzima consiste en una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana y una enzima marcada con esta sonda de ácido nucleico, y se usa en el ensayo del ácido nucleico diana mencionado anteriormente.
En el método de la presente invención, la enzima (enzima de marcaje) del complejo anticuerpo-enzima o la sonda de ácido nucleico marcada con enzima usada es peroxidasa. Como sustrato de la enzima anterior, se usa el derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1).
Se usa el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) como sustrato de peroxidasa, X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6. El derivado de androsterona incluido es el compuesto nuevo de la presente invención.
El ensayo de ultraalta sensibilidad de la presente invención se puede llevar a cabo de forma similar a un inmunoensayo enzimático o ensayo de sonda de ácido nucleico habitual. Por ejemplo, se puede usar un vehículo en fase sólida, que se use en un ensayo habitual, por ejemplo, un vehículo en fase sólida tal como una microplaca o tubo de plástico, una perla magnética y similar en el que un anticuerpo o sonda de ácido nucleico se une específicamente a un sujeto que está inmovilizado sobre la superficie.
El complejo del anticuerpo y la sonda de ácido nucleico-enzima se puede preparar mediante un método habitual. El anticuerpo que constituye el complejo anticuerpo-enzima se puede seleccionar de forma adecuada entre los anticuerpos que se unen específicamente a un sujeto que se va a medir mediante el inmunoensayo enzimático de la presente invención. Por ejemplo, el inmunoensayo enzimático de la presente invención se usa en un ensayo de una proteína, y en el presente documento el anticuerpo que consiste en el complejo anticuerpo-enzima es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que es el sujeto. Además, en este caso, se usa una placa basal en la que está inmovilizado sobre la superficie un anticuerpo que se une específicamente a la proteína sujeto. Además, el anticuerpo que constituye el complejo anticuerpo-enzima y el anticuerpo inmovilizado sobre la placa basal pueden ser un fragmento del anticuerpo. En la presente invención del inmunoensayo enzimático, el sujeto no se limita a una proteína, y puede ser cualquier sustancia que sea un sujeto de medición de un inmunoensayo enzimático habitual además de una proteína.
En el complejo de sonda de ácido nucleico y enzima, la sonda se puede seleccionar adecuadamente de forma similar entre las sondas complementarias a una sonda de ácido nucleico que es complementaria al sujeto de medición.
En el método de la presente invención, la cuantificación de un producto de reacción mediante la enzima del complejo anticuerpo-enzima o la enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, y deshidrogenasa (DH), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
En el método de la presente invención, la concentración de cada componente puede estar en el intervalo que se describe a continuación.
(1) Intervalo de concentración del complejo anticuerpo-enzima o la sonda de ácido nucleico marcada con enzima: 0,01 |jg/ml a 1 mg/ml
(2) Intervalo de concentración del sustrato de la enzima de marcaje:
1 jM a 500 mM
(3) Intervalo de concentración de NADH y/o NADPH:
0,01 mM a 50 mM
(4) Intervalo de concentración de tio-NAD y/o tio-NADP:
0,01 mM a 100 mM
(5) Intervalo de concentración de la deshidrogenasa (DH):
0,01 U/ml a 5000 U/ml
Las condiciones de reacción se pueden determinar de forma adecuada considerando el intervalo de temperatura óptimo de la enzima de marcaje y la deshidrogenasa (DH). Por ejemplo, en cuanto a la temperatura de reacción, la reacción se lleva a cabo preferentemente a temperatura ambiente desde el punto de vista de una manipulación sencilla. Sin embargo, la reacción se puede llevar a cabo a una temperatura mayor o una temperatura menor que la temperatura ambiente considerando el intervalo de temperatura óptimo de la enzima de marcaje y la deshidrogenasa (DH).
El tiempo de reacción puede ser un tiempo suficiente para acumular tio-NADH y/o tio-NADPH, de un modo tal que permita el ensayo de la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o la medición del cambio de color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido. Sin embargo, la cantidad de acumulación de tio-NADH y/o tio-NADPH necesaria para el ensayo o la medición varía dependiendo de las condiciones del ensayo o la medición, y se puede determinar de forma adecuada dependiendo de las condiciones.
El sistema de ciclo que usa tio-NAD(P) en el sistema de ciclo enzimático es un sistema de ciclo único que ha aparecido de forma relativamente reciente. Con este sistema, se lleva a cabo un ciclo, es decir, tio-NAD(P)/tio-NAD(P)H usando deshidrogenasa (DH) con NAD(P)/NAD(P)H como coenzima en condiciones de coexistencia de NAD(P)/NAD(P)H y su análogo, y la amplificación y la cuantificación se llevan a cabo con tio-NAD(P)H (longitud de onda de absorción máxima: 400 nm, coeficiente de absorción molar = 11.900) como sustrato de la deshidrogenasa. El principio para la medición del sistema de ciclo de tio-NAD(P) es como se describe a continuación.
Figure imgf000008_0001
Mientras que el NADH exhibe la absorción máxima a 340 nm (coeficiente de absorción molar = 6200), tio-NAD(P)H exhibe absorción en el intervalo visible (longitud de onda de absorción máxima: 400 nm, coeficiente de absorción molar = 11900) y de ese modo el método de ciclo de tio-NAD(P) tiene la ventaja de permitir la medición usando un espectrofotómetro de absorción o un lector de microplaca generalizado para la medición colorimétrica.
Usando las ventajas de que la medición en el sistema de ciclo que usa tio-NAD(P) se puede llevar a cabo mediante el uso de un espectrofotómetro de absorción o un lector de microplaca generalizado para la medición colorimétrica, algunos métodos convencionales basados en el aumento de la absorción de NADH, tales como un ensayo de actividad y cuantificación de deshidrogenasa de un sustrato de la misma, han mejorado a un método que usa tio-NAD. Sin embargo, aún no ha habido ningún informe del uso de este sistema de ciclo en la mejora de sensibilidad como sistema de detección tal como un inmunoensayo enzimático.
En la presente invención, la combinación de una enzima de marcaje y el sistema de ciclo permite que la reacción de amplificación sea una reacción exponencial por primera vez, dando como resultado de ese modo una mejora de sensibilidad suficiente.
De acuerdo con el ensayo de la presente invención, como se muestra a modo de ejemplo en el inmunoensayo enzimático, los productos producidos con el complejo de enzima y un sustrato en combinación se usan como sustrato de la siguiente reacción de ciclo enzimático, y la absorción del tio-NAD(P)H producido por la reacción de ciclo enzimático se cuantifica colorimétricamente. El ciclo enzimático se lleva a cabo con una deshidrogenasa en esta reacción, y de ese modo se puede usar un sustrato reducido o un sustrato oxidado como sustrato de la reacción de ciclo enzimático.
En la presente invención, la enzima de marcaje usada como complejo de enzima, el sustrato de la misma y la deshidrogenasa usada posteriormente en la reacción de ciclo tienen las propiedades que se describen a continuación.
(1) El producto de la enzima de marcaje es androsterona o un derivado de la misma;
(2) se pueden usar enzimas de marcaje disponibles en el mercado y usadas ampliamente;
(3) el número de recambio del ciclo enzimático es muy elevado; y
(4) la deshidrogenasa usada en esta reacción de ciclo no tiene ninguna contaminación de la enzima de marcaje ni actividad similar a la de la enzima de marcaje.
Algunos ejemplos de la deshidrogenasa (DH) pueden incluir, por ejemplo, 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa. Por ejemplo, cuando se usa 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa como enzima de ciclo entre las combinaciones descritas anteriormente, algunos ejemplos de un candidato para el sustrato que se puede usar androsterona, 11phidroxiandrosterona, 11-oxoandrosterona y 11a-hidroxiandrosterona.
El sustrato para el ciclo es preferentemente el que tiene una velocidad de reacción enzimática elevada (que tiene una alta actividad por el sustrato) y que reacciona incluso a una concentración baja (que tiene un valor bajo de Km). Además, una propiedad deseable como deshidrogenasa es la velocidad de reacción cuando se usa tio-NAD(P) como coenzima. En la reacción de deshidrogenación de androsterona mediante muchas otras deshidrogenasas, la velocidad reacción cuando se usa tio-NAD como coenzima está dentro de varios % de la velocidad de reacción cuando se usa NAD, mientras que con 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, la velocidad reacción con tio-NAD es aproximadamente un 59 % de la velocidad reacción con NAD. De ese modo, 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa tiene una propiedad deseable como enzima de ciclo de la presente invención.
Además, de manera similar, la peroxidasa, que se usa ampliamente como enzima de marcaje, y el peróxido de un derivado de androsterona, por ejemplo, peróxido de terc-butilo, también son una combinación preferible en un punto de síntesis sencilla.
Un ejemplo de reacción que usa 3-p-D galactósido de androsterona como sustrato se describirá a continuación, pero dicho ejemplo no representa la presente invención.
Figure imgf000009_0001
3-P-D-galactopiranósido Androsterona Androsterona-3,17-diona de androsterona
A continuación, se explicará a modo de ejemplo un inmunoensayo enzimático que usa fosfatasa alcalina (ALP) como enzima del complejo anticuerpo-enzima, pero dicho ejemplo no representa la presente invención. La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima usada ampliamente como enzima de marcaje y, cuando el derivado de androsterona se usa como sustrato de ALP en un inmunoensayo enzimático que usa esta ALP, se produce androsterona como producto de reacción. A continuación, se usa 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3a-HSD), deshidrogenasa que usa el producto de reacción de ALP como sustrato, en la reacción de ciclo enzimático.
El ciclo de tio-NAD permite la amplificación y la cuantificación del sustrato de deshidrogenasa con una eficacia de cientos de ciclos por minuto si se selecciona una reacción de deshidrogenasa apropiada. En consecuencia, la actividad de la enzima que presenta tal sustrato como producto de reacción se puede someter a ensayo mediante el ciclo de tio-NAD con una sensibilidad ultraalta.
[Kit para ciclo enzimático]
La presente invención incluye un kit para el método de ciclo enzimático que incluye una enzima marcada con un vehículo reactivo, un sustrato de la misma, una enzima para la reacción de ciclo y tio-NAD y NADH como coenzima de la misma.
El vehículo reactivo representa un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, lectina y similar que tiene actividad de unión frente al sujeto de medición.
El vehículo reactivo no se limita de forma particular si es un material adecuado para el sujeto de medición, o un material adecuado para la enzima de marcaje y el sustrato de la misma.
Más específicamente, la presente invención incluye un kit para un método de ciclo enzimático que incluye una enzima de marcaje, un sustrato de la misma, una enzima para la reacción de ciclo y tio-NAD y NADH como coenzima de la misma.
El kit de la presente invención es un kit para inmunoensayo enzimático que incluye los siguientes reactivos (1) a (5).
(1) peroxidasa, enzima que está marcada con un anticuerpo específico frente a un antígeno de proteína diana, (2) derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima,
(3) deshidrogenasa (DH),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
Además, la presente invención es un kit para medir una sonda de ácido nucleico, que incluye los siguientes reactivos (1) a (5).
(1) peroxidasa, enzima que está marcada con una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana,
(2) derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima,
(3) deshidrogenasa (DH),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
Para la enzima de mareaje, la deshidrogenasa (DH) y el derivado de androsterona representado por la fórmula (1), los que se pueden usar son los descritos anteriormente en el método de la presente invención como tales.
El kit de la presente invención puede ser un anticuerpo marcado con enzima convencional y similar en combinación con los reactivos que constituyen este kit. Este kit se puede usar en un inmunoensayo enzimático que usa un método de ciclo enzimático.
[Ejemplos]
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá basándose en Ejemplos. Sin embargo, tales Ejemplos se pueden modificar de forma diversa en el nivel técnico de este campo. No es necesario decir que la presente invención no pretende limitarse a estos Ejemplos únicamente, a la luz de tal nivel técnico.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá de manera más específica en los siguientes Ejemplos. Los siguientes Ejemplos que se refieren a la fosfatasa alcalina o la peroxidasa no son de acuerdo con la presente invención, pero se muestran como prueba de principio. Únicamente aquellos Ejemplos que se refieren a derivados de peroxidasa y peroxi de androsterona se considerarán de acuerdo con la invención.
Ensayo de fosfatasa alcalina y Pumilio que usa sistema de ciclo de tio-NAD de fosfatasa alcalina (ALP) y 3-fosfato de androsterona (A3P) como sistema de detección.
Ejemplo de Referencia 1
Fabricación de anticuerpo marcado con ALP
Un anticuerpo monoclonal derivado de ratón que tenía reactividad específica frente a antígeno se dializó tres veces con solución tampón de ácido cítrico 0,1 M (pH 3,5) durante 30 minutos. A la solución de anticuerpo se añadió pepsina hasta un 0,5% con respecto a la cantidad de anticuerpo, se mantuvo a 37 °C durante 1 hora, y a continuación se ajustó a pH neutro con solución tampón de Tris 1,5 M (pH 8,8). Esta solución de reacción mixta se filtró sobre gel usando una columna rellena con Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc.), para dar F(ab')2. La ALP se marcó mediante un kit de marcaje de ALP (DOJINDO LABORATORIES) usando 100 |jg de este F(ab')2. Ejemplo de Referencia 2
Preparación de vehículo insoluble inmovilizado con anticuerpo 1
Una solución de un anticuerpo policlonal derivado de cobaya que tenía reactividad específica frente a antígeno disuelto en solución tampón de carbonato sódico 50 mM (pH 9,6) a una concentración de 100 jg/ml, se añadió a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) con 50 pl de cada uno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora, y a continuación se recogió la solución de anticuerpo. Se añadieron 300 pl de TBS que contenían albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 horas para llevar a cabo el tratamiento de bloqueo, para dar una microplaca con anticuerpo policlonal inmovilizado.
Ejemplo de Referencia 3
Preparación de vehículo insoluble inmovilizado con anticuerpo 2
Una solución de un anticuerpo policlonal derivado de cobaya que tenía reactividad específica frente a antígeno disuelto en solución tampón de carbonato sódico 50 mM (pH 9,6) a una concentración de 10 jg/ml, se añadió a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) con 50 pl de cada uno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución del pocillo se retiró con succión, se añadieron 300 pl de TBS que contenían albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 horas para llevar a cabo el tratamiento de bloqueo, y se lavaron con TBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, para dar una microplaca con anticuerpo policlonal inmovilizado.
<Ejemplo Comparativo 1>
Ensayo de Pumilio mediante método en una etapa usando 3-fosfato de 5a-androsterona
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de glicina 0,2 M (pH 8,8)
1,5 mM tio-NAD
1 mM NADH
3-fosfato de 5a-androsterona 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50, 100 y 200 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 2, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 200 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Se añadieron a la microplaca 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado con el método del Ejemplo de Referencia 1 a una concentración de 2,5 pg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %, y se lavó además con TBS. A continuación, se añadieron 100 pl de la solución de ensayo de reacción a cada pocillo, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 2.
En el presente ensayo, se presentaron como problemas la mala reactividad de la enzima (fosfatasa alcalina) con el sustrato (3-fosfato de androsterona), y la inhibición del sustrato en la reacción de ciclo, y de ese modo se probó un método en dos etapas en el que se separan la reacción enzimática y la reacción de ciclo. Además, se descubrió que la 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, en la reacción de ciclo una enzima tenía actividad de fosfatasa, y fue una causa para el blanco, y de ese modo se determinó usar una solución tampón que contenía ácido fosfórico en el momento de la reacción de ciclo del método en dos etapas.
<Ejemplo Comparativo 2>
Ensayo de Pumilio mediante método en dos etapas usando 3-fosfato de 5a-androsterona
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 8,3)
MgCl21 mM
3-fosfato de 5a-androsterona 0,1 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de glicina 0,2 M que contenía hidrogenofosfato disódico 0,2 M (pH 9,6)
tio-NAD 3 mM
NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,5, 0,75, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 20, 50, 75, y 100 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de Referencia 3, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 100 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Se añadieron a la microplaca 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el método del Ejemplo de Referencia 1 a una concentración de 2,5 pg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %, y se lavó además con TBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 pl de la solución de ensayo de reacción A, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron al pocillo 50 pl de la solución de ensayo de reacción B, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 3.
Aunque se probó el método en dos etapas, la sensibilidad no aumentó tanto como se esperaba y, de ese modo, se determinó usar 3-fosfato de 5p-androsterona, que tiene una estructura diferente que la del 3-fosfato de 5aandrosterona usado hasta el momento, con el fin de mejorar la reactividad con fosfatasa alcalina.
<Ejemplo Comparativo 3>
Ensayo de Pumilio mediante método en una etapa usando 3-fosfato de 5p-androsterona
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 8,6)
MgCl20,5 mM
tio-NAD 1,5 mM
NADH 0,5 mM
3-fosfato de 5p-androsterona 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 1, 2, 5, 8, 10, 20 y 50 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de Referencia 3, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 50 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el método del Ejemplo de Referencia 1 a una concentración de 2,5 pg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %, y se lavó además con TBS. A continuación, a cada pocillo, se añadieron 50 pl de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 4.
<Ejemplo Comparativo 4>
Ensayo de Pumilio mediante método en dos etapas usando 3-fosfato de 5p-androsterona
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 8,3)
MgCl21 mM
3-fosfato de 5p-androsterona 0,1 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de glicina 0,2 M que contenía hidrogenofosfato disódico 0,2 M (pH 9,6)
tio-NAD 3 mM
NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2,5, 5, 10, 25 y 50 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de Referencia 3, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 50 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Se añadieron a la microplaca 50 j l de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el método del Ejemplo de Referencia 1 a una concentración de 2,5 |jg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %, y se lavó además con TBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción A, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron al pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción B, y la absorbancia se midió durante 10 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 10 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 5.
Se descubrió que el 3-fosfato de androsterona fue un sustrato de la reacción de ciclo hasta el momento, y el aumento del blanco mediante este resultado se convirtió en un problema. Se determinó que la causa fue la cetona en la posición 17, y de ese modo se determinó usar un sustrato en el que se retirara o se sustituyera la cetona en la posición 17. Los 3a-hidroxiandrostanos sintetizados se muestran en la Figura 6. Además, los números de rotación de las reacciones de ciclo que los usan como sustrato se muestran en la Tabla 1. Entre ellos, el número de rotación de la 5a-androsterona fue el máximo, y los sustratos que estuvieron cerca de este fueron 3a-hidroxi-17p-metoxi-5pandrostano y 5a-dihidrotestosterona. De ese modo, se sintetizó un éster de fosfato del primero, es decir, 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano y se aplicó al ciclo de tio-NAD.
Tabla 1: números de rotación de reacciones de ciclo con 3a-hidroxiandrostanos
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
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Glicoquenodesoxicolato sódico
<Ejemplo 1> Ensayo de fosfatasa alcalina mediante método en una etapa usando 3-fosfato de 3a-hidroxi-17pmetoxi-5p-androstano
Síntesis de 3-fosfato de 3a-hidroxM7p-metoxi-5p-androstano
A una solución en piridina anhidra (4 ml) de oxicloruro de fósforo (0,26 ml), se añadió gota a gota una solución en piridina anhidra (4 ml) que contenía de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano (200 mg) con refrigeración en hielo, y la solución de reacción se agitó adicionalmente durante 1 hora con refrigeración en hielo. La solución de reacción se vertió en agua enfriada con hielo, y la solución se hizo fuertemente alcalina (aproximadamente pH 11), y a continuación se lavó con éter. A continuación, se añadió ácido clorhídrico concentrado a la fase acuosa para ajustar el pH a aproximadamente 2, ya continuación se extrajo con éter. La fase de éter se secó con sulfato sódico anhidro, y a continuación el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo se recristalizó con tetrahidrofurano-hexano para dar un cristal incoloro (210 mg).
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 6 = 0,73 (s, 3H, 18-CH3), 0,95 (s, 3H, 19-CHa), 3,19 (1H, t, J = 8,6 Hz, 17a-H), 3,32 (s, 3H, -OCH3), 4,18 (m, 1H, 3p-H). ESI-HR-MS Calculado para C20H35O5P-H: m/z 385,2149 [M-H]-. Encontrado m/z 385,2157; p.f. 187-188 °C.
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 9,5)
MgCl20,2 mM
tio-NAD 0,6 mM
NADH 4 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0. 1, 0,2, 0,5, 1, y 2 mU/ml de fosfatasa alcalina (concentración final: 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, y 1 mU/ml)
Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 50 j l de solución tampón de Tris (pH 9,5) que contenía la sustancia patrón (fosfatasa alcalina) en un intervalo de 0 a 2 mU/ml y, posteriormente, se añadieron 50 j l de solución de ensayo de reacción B a cada pocillo, respectivamente. A continuación, la absorbancia se midió durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 7.
Posteriormente, que es una enzima de la reacción de ciclo con respecto a la investigación del método en dos etapas, como se ha descrito anteriormente, se usó una solución tampón que contenía ácido fosfórico en el momento de la reacción de ciclo con el fin de inhibir la actividad de fosfatasa en 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa. Sin embargo, se adoptó una solución tampón que contenía ácido pirofosfórico en lugar de la solución tampón que contenía ácido fosfórico como solución tampón que inhibe además esta actividad de fosfatasa.
<Ejemplo 2> Ensayo de fosfatasa alcalina mediante método en dos etapas usando 3-fosfato de 3a-hidroxi-17pmetoxi-5p-androstano
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 9,5)
MgCl20,2 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 1 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,15 M (pH 9,5)
tio-NAD 3 mM
NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
1, 5, 10, 15, 20 jU/ml de fosfatasa alcalina (concentración final: 0,5, 2,5, 5, 7,5 y 10 jU/ml)
Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 25 j l de solución tampón de Tris (pH 9,5) que contenía la sustancia patrón (fosfatasa alcalina) en un intervalo de 0 a 20 jU/ml y, posteriormente, se añadieron 25 j l de solución de ensayo de reacción A al pocillo, respectivamente. La solución de reacción se mezcló, y se mantuvo a 37 °C en una incubadora durante 1 hora. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción B, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 20 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 20 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 8.
Ejemplo de Referencia 4
Purificación de anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (ALP)
Se preparó anticuerpo marcado con ALP usando el kit de marcaje con ALP (DOJINDO LABORATORIES) a partir de 150 jg del F(ab')2 preparado en el Ejemplo de Referencia 1. Dado que esta solución de anticuerpo marcado con ALP contenía diversos complejos que tenían diversos pesos moleculares de ALP y Fab, y la solución anterior tenía variación en la actividad, la solución de anticuerpo marcado con ALP preparada se filtró en gel usando una columna superdex-200 (Amersham Biosciences, Inc.) rellena con solución tampón de Tris (pH 7,0) que contenía MgCh 1 mM, ZnCl20,1 mM y BSA al 0,01 % como solución de elución, y se comparó la actividad de cada fracción, y a continuación solo se recogió la fracción de anticuerpo marcado con ALP que tenía mayor proporción S/N.
Ejemplo de Referencia 5
Preparación de vehículo insoluble inmovilizado con anticuerpo
Una solución de un anticuerpo policlonal derivado de cobaya que tenía reactividad específica frente a antígeno se disolvió en solución tampón de carbonato sódico 50 mM (pH 9,6) a una concentración de 10 pg/ml se añadió a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) con 50 pl cada uno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora, y a continuación la solución en el pocillo se retiró con succión, y se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %. A continuación, se añadieron 200 pl de TBS que contenía albúmina de suero bovino al 5 % (BSA) y se mantuvieron a 4 °C durante 2 horas a una noche para llevar a cabo el tratamiento de bloqueo, y se lavaron con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5%, para dar una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal.
<Ejemplo 3> Ensayo de Pumilio mediante método en una etapa
Solución de ensayo de reacción que usa 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 9,5)
tio-NAD 1,5 mM
NADH 2,5 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,1 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 2, 5, 10 y 25 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 25 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %. Se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían solución a 0,1 % de BSA que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el método del Ejemplo de Referencia 4 en una concentración de aproximadamente 0,8 pg/ml, y la microplaca se agitó a 4°C durante 2 horas. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se lavó además con t Bs . A continuación, a cada pocillo, se añadieron 50 pl de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 9.
<Ejemplo 4> Ensayo de Pumilio mediante método en dos etapas usando 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5pandrostano
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de Tris 0,1 M (pH 9,5)
MgCl20,1 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,2 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,15 M (pH 9,5)
tio-NAD 3 mM
NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25 y 0,5 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 |jl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 0,5 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %. Se añadieron 50 j l de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el método del Ejemplo de Referencia 4 en aproximadamente 0,2 |jg/ml y el F(ab')2 de ratón a una concentración de 1 mg/ml, y la microplaca se agitó a 4 °C durante 2 horas. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el residuo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se lavó además con TBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción A, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron al pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción B, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 10.
Aunque se usó un sustrato modificado en la posición 17, la reacción del blanco no se pudo retirar completamente como se ha descrito anteriormente. De ese modo, se usó p-galactosidasa como enzima de marcaje de ELISA, y se sintetizó p-D-galactósido de androsterona como sustrato de la misma, y la investigación prosiguió.
Ensayo de p-galactosidasa y Pumilio sistema de ciclo de tio-NAD de p-galactosidasa y 3-p-D-galactósido de androsterona usando como sistema de detección.
<Ejemplo 5> Ensayo de p-galactosidasa mediante método en dos etapas usando p-D-galactósido de 5pandrosterona
Síntesis de 3-p-D-galactósido de 5p-androsterona (nombre formal: 3-p-D-galactopiranósido de 5p-androsterona) A una solución en diclorometano (15 ml) de 5p-androsterona (290 mg), se añadieron MS4A (1,25 g) y 2,3,4,6-O-tetrabenzoil-1-tio-p-D-garactopiranósido de fenilo (1,03 g) y la solución de reacción se agitó a -20 °C durante 15 minutos. A continuación, se añadió a la solución de reacción N-yodosuccinimida (435 mg) y ácido trifluorometano sulfónico (15 mg), se agitó a -20 °C durante 2 horas, y a continuación se hizo reaccionar adicionalmente a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron a la solución de reacción 250 j l de trietilamina para detener la reacción, y se lavó con una solución mixta de carbonato sódico saturado y tiosulfato sódico 3:1, y solución salina saturada secuencialmente. La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro, y a continuación el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo se disolvió en metanol (15 ml), y se añadió metóxido sódico al 28 % (500 jl) y la solución de reacción se agitó durante 2 horas. Se añadió ácido acético a la solución de reacción para neutralizarla, y a continuación se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (24 x 240 mm, 10% de metanol-cloroformo), y a continuación se recristalizó en metanol para dar un cristal incoloro (360 mg).
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 8 = 0,85 (s, 3H, 18-CH3), 0,97 (s, 3H, 19-CH3), 3,44-3,49 (m a, 3H, H-2', H-3', H-5'), 3,70 (d, 1H, H-6'a), 3,72 (d, 1H, H-6'b), 3,73 (m, 1H, 3p-H), 3,81 (d, 1H, H-4'), 4,33 (d, 1H, H-1', Jr 2 = 6,2 Hz) ESI-HR-MS Calculado para C25H40O7-H: m/z 451,2701 [M-H]-. Encontrado m/z 451,2711 p.f. 130-135 °C.
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,3)
MgCl20,2 mM
p-D-galactósido de 5p-androsterona 0,1 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0)
tio-NAD 1,2 mM
NADH 3,6 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
1, 4, 10, 40, 100, y 200 pg/ml de p-galactosidasa (concentración final: 0,5, 2, 5, 20, 50 y 100 pg/ml)
Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 25 j l de una solución tampón de fosfato (pH 7,3) que contenía la sustancia patrón (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 200 pg/ml, y posteriormente, se añadieron 25 j l de la solución de ensayo de reacción A al pocillo, respectivamente. La solución de reacción se mezcló, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 60 minutos. A continuación, se añadieron a cada pocilio 50 |jl de la solución de ensayo de reacción B, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 11.
<Ejemplo 6> Ensayo de p-galactosidasa mediante método en una etapa usando p-D-galactósido de 5p-androsterona Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,7)
MgCl210 mM
tio-NAD 6 mM
NADH 1 mM
p-D-galactósido de 5p-androsterona 0,1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
5, 10, 25, 50, 100, y 250 pg/ml de p-galactosidasa (concentración final: 2,5, 5, 12,5, 25, 50 y 125 pg/ml) Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 50 j l de una solución tampón de fosfato (pH 7,7) que contenía la sustancia patrón (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 250 pg/ml, y posteriormente, se añadieron a cada pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción B, respectivamente. La absorbancia se midió durante 120 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 120 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 12.
<Ejemplo 7> Ensayo de p-galactosidasa mediante método en dos etapas usando p-D-galactósido de 5pandrosterona
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,5)
MgCl210 mM
p-D-galactósido de 5p-androsterona 0,1 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0)
tio-NAD 4,8 mM
NADH 0,4 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
1, 4, 10, 40, 100 y 200 pg/ml de p-galactosidasa (concentración final: 0,5, 2, 5, 20, 50 y 100 pg/ml)
Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 25 j l de una solución tampón de fosfato (pH 7,5) que contenía la sustancia patrón (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 200 pg/ml, y posteriormente, se añadieron al pocillo 25 j l de solución de ensayo de reacción A, respectivamente. La solución de reacción se mezcló, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 60 minutos. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 j l de solución de ensayo de reacción B, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 13.
<Ejemplo 8> Ensayo de p-galactosidasa mediante método en una etapa usando p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17pmetoxi-5p-androstano
Síntesis de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano p-D-galactósido de (nombre formal: 3-p-D-galactopiranósido de 3ahidroxM7p-metoxi-5p-androstano)
A una solución en diclorometano (15 ml) de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano (306 mg), se añadieron MS4A (1,25 g) y 2,3,4,6-O-tetrabenzoiM-tio-p-D-garactopiranósido de fenilo (1,03 g) y la solución de reacción se agitó a -20 °C durante 15 minutos. A continuación, se añadieron N-yodosuccinimida (435 mg) y ácido trifluorometano sulfónico (15 mg), la solución de reacción se agitó a -20 °C durante 2 horas, y a continuación se hizo reaccionar adicionalmente a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron a la solución de reacción 250 pl de trietilamina para detener la reacción, y se lavó secuencialmente con una solución mixta de carbonato sódico saturado y tiosulfato sódico 3:1 y solución salina saturada. La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro, y a continuación el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo se disolvió en metanol (15 ml) y se añadió metóxido sódico al 28 % (500 pl) y la solución de reacción se agitó durante 2 horas. Se añadió ácido acético a la solución de reacción para neutralizarla, y a continuación se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El residuo se purificó con cromatografía en columna sobre gel de sílice (24 x 240 mm, 10 % de metanol-cloroformo), y a continuación se recristalizó en acetona-hexano para dar un cristal incoloro (383 mg).
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 8 = 0,73 (s, 3H, 18-CHa), 0,95 (s, 3H, 19-CHa), 3,26 (t, 1H, J = 8,6 Hz, 17a-H), 3,32 (s, 3H, -OCHa), 3,45-3,51 (m a, 3H, H-2', H-3', H-5'), 3,71 (s, 1H, H-6'a), 3,73 (d, 1H, H-6'b), 3,74 (m, 1H, 3p-H), 3,81 (d, 1H, H-4'), 4,33 (d, 1H, H-1', Jr z = 7,5Hz). ESI-HR-MS Calculado para C26H44O7-H: m/z 467,3014 [M-H]-Encontrado m/z 451,3026; p.f. 197-199 °C.
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 8,5)
MgCl210 mM
tio-NAD 6 mM
NADH 1 mM
p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,2 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
5, 10, 25, 50, 100, y 250 pg/ml de p-galactosidasa (concentración final: 2,5, 5, 12,5, 25, 50 y 125 pg/ml) Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 50 pl de una solución tampón de fosfato (pH 8,5) que contenía la sustancia patrón (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 250 pg/ml, y posteriormente, se añadieron a cada pocillo 50 pl de la solución de ensayo de reacción B, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 120 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 120 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 14.
<Ejemplo 9> Ensayo de p-galactosidasa mediante método en dos etapas usando p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17pmetoxi-5p-androstano
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,5)
MgCl24 mM
p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,1 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,1 M (pH 9,8)
tio-NAD 1,2 mM
NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
1, 4, 10, 40, 100 y 200 pg/ml de p-galactosidasa (concentración final: 0,5, 2, 5, 20, 50 y 100 pg/ml)
Método de ensayo
A un pocilio de microplaca de fondo plano, se añadieron 25 |jl de una solución tampón de fosfato (pH 7,5) que contenía la sustancia patrón (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 200 pg/ml, y posteriormente, se añadieron 25 j l de la solución de ensayo de reacción A al pocillo, respectivamente. La solución de reacción se mezcló, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 60 minutos. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 j l de la solución de ensayo de reacción B, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 15.
A continuación se describen algunos ejemplos de mediciones de Pumilio usando p-D-galactósido de androsterona. Sin embargo, no hay ningún anticuerpo que tenga reactividad específica frente a antígeno y está directamente marcado con p-galactosidasa, y de ese modo se intenta el método de Estreptoavidina Biotina Marcada (LSAB). Ejemplo de Referencia 6
Fabricación de anticuerpo marcado con biotina
Se preparó un anticuerpo marcado con biotina a partir de un kit de marcaje con biotina (DOJINDO LABORATORIES) usando 50 jg del F(ab')2 obtenido en el Ejemplo de Referencia 1.
<Ejemplo 10> Ensayo de Pumilio mediante método en una etapa usando p-D-galactósido de 5p-androsterona Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,7)
MgCl25 mM
tio-NAD 1,2 mM
NADH 0,8 mM
p-D-galactósido de 5p-androstano 0,05 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 2,5 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 j l de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 2,5 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 j l de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con biotina preparado en el método del Ejemplo de Referencia 6 en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 j l de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía p-galactosidasa marcada con estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentración de 0,1 U conjugado/ml, y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se lavó además con TBS. A continuación, a cada pocillo, se añadieron 50 j l de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 16.
<Ejemplo 11> Ensayo de Pumilio mediante método en dos etapas usando p-D-galactósido de 5p-androsterona Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,5)
MgCl20,1 mM
p-D-galactósido de 5p-androsterona 0,05 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0)
tio-NAD 3 mM
NADH 2 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,05, 0. 1, 0,5, 1, 2,5 y 5 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 5 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con biotina preparado con el método del Ejemplo de Referencia 6 en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía p-galactosidasa marcada con estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentración de 0,1 U conjugado/ml, y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se lavó además con TBS. A continuación, a cada pocillo, se añadieron 50 pl de la solución de ensayo de reacción A, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron al pocillo 50 pl de la solución de ensayo de reacción B, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 17.
<Ejemplo 12> Ensayo de Pumilio mediante método en una etapa usando p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 8,5)
tio-NAD 1,2 mM
NADH 0,8 mM
p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,05 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,1, 0,5, 1, 2,5, 5 y 10 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 10 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con biotina preparado en el método del Ejemplo de Referencia 6 en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía p-galactosidasa marcada con Estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentración de 0,1 U conjugado/ml, y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se lavó además con TBS. A continuación, a cada pocillo, se añadieron 50 pl de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 18.
<Ejemplo 13> Ensayo de Pumilio mediante método en dos etapas usando p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano
Solución de ensayo de reacción A
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,0)
p-D-galactósido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,05 mM
Solución de ensayo de reacción B
solución tampón de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0)
tio-NAD 2,4 mM
NADH2 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 10 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 10 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con biotina preparado con el método del Ejemplo de Referencia 6 en una concentración de aproximadamente 0,3 pg/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía p-galactosidasa marcada con estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentración de 0,1 U conjugado/ml, y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, y se lavó además con TBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 pl de la solución de ensayo de reacción A, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 60 minutos. Posteriormente, al pocillo, se añadieron 50 pl de solución de ensayo de reacción B, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 19.
<Ejemplo de Referencia 7> Ensayo de Pumilio usando fosfato de p-nitrofenilo (p-NPP)
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de glicina 0,1 M (pH 10,3)
MgCl21 mM
ZnCl21 mM
1 mg/ml de p-NPP
Muestra de ensayo
0, 1, 2,5, 5, 10 y 25 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 3, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 25 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con ALP preparado con el método del Ejemplo de Referencia en una concentración de 1 pg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Se añadieron 100 |jl de la solución de ensayo de reacción a cada pocilio, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 20.
<Ejemplo de Referencia 8> Ensayo de p-galactosidasa usando p-D-galactopiranósido de o-nitrofenilo (ONPG) Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,3)
2-mercaptoetanol 0,2 mM
MgCl21 mM
ONPG 10 mM
Muestra de ensayo
2, 10, 20 y 50 ng/ml de p-galactosidasa (concentración final: 1, 5, 10 y 25 ng/ml)
Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 50 j l de una solución tampón de fosfato (pH 7,3) que contenía la sustancia patrón (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 25 ng/ml, y posteriormente, al pocillo, se añadieron 50 j l de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 60 minutos usando un filtro de 415 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 21.
Método de cálculo del límite de detección y el límite de cuantificación
La cantidad del cambio de absorbancia de cada resultado de medición se representa con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón, y solo las concentraciones en paralelo en la línea recta se extraen para preparar una curva de ajuste. A continuación, se calcula la desviación típica del blanco (sin incluir la sustancia patrón; n > 3), y el valor 3 veces y el valor 10 veces de la misma se dividen por la pendiente de la curva de ajuste, y los valores numéricos obtenidos se toman como el límite de detección y el límite de cuantificación, respectivamente. El límite de detección y el límite de cuantificación calculados de cada resultado de experimento se resumen en las Tablas 2, 3 y 4.
Tabla 2
Límite de detección y límite de cuantificación de fosfatasa alcalina y p-Galactosidasa
Figure imgf000024_0001
Tabla 3
Límite de detección y límite de cuantificación de proteína Pumilio (sistema de p-Galactosidasa)
Ensayo ELISA (unidades: mol)
Figure imgf000025_0002
Tabla 4
Límite de detección y límite de cuantificación de proteína Pumilio (sistema de
fosfatasa alcalina)
Figure imgf000025_0003
<Ejemplo 14>
Ensayo de peroxidasa de rábano mediante método en una etapa usando 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona 3a-ferc-butil-peroxi-5p-Androsterona
Figure imgf000025_0001
Síntesis de 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona
Se disolvió 3a-cloro-5p-androsterona (100 mg) en una solución de diclorometano (15 ml), para preparar la solución de ensayo de reacción. A la presente solución, se añadió una solución de hidroperóxido de terc-butilo (30 mg) disuelto en una solución acuosa (15 ml) de hidróxido sódico al 20 %, y la solución de reacción se hizo reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La fase orgánica se recogió de la solución de reacción, y se lavó con una solución acuosa de hidrogenocarbonato sódico saturado y solución salina saturada, secuencialmente. La fase orgánica se deshidrató con sulfato sódico anhidro, y a continuación el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (24 x 240 mm, 10% de metanolcloroformo), y a continuación se obtuvieron 88 mg del presente compuesto. La identificación del presente compuesto se llevó a cabo mediante RMN 1H, ESI-HR-MS y p.f. (punto de fusión).
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,0)
MgCl210 mM
tio-NAD 6 mM
NADH 1 mM
3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona 0,1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
5, 10, 25, 50, 100 y 250 pg/ml de peroxidasa de rábano (concentración final: 2,5, 5, 12,5, 25, 50 y 125 pg/ml) Método de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se añadieron 50 pl de una solución tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía la sustancia patrón (peroxidasa de rábano) (denominada en lo sucesivo HRP) en un intervalo de 0 a 250 pg/ml, y posteriormente, al pocillo, se añadieron 50 pl de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 120 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 120 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 22.
<Ejemplo 15>
Ensayo de Pumilio mediante método en una etapa usando 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona
Solución de ensayo de reacción
solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,0)
MgCl210 mM
tio-NAD 6 mM
NADH 1 mM
3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona 0,1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 2,5 ng/ml de Pumilio
Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de Referencia 5, se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia patrón) en un intervalo de 0 a 2,5 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %. Se añadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenían una solución de BSA al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con HRP en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución en el pocillo se retiró con succión, y a continuación el pocillo se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía Triton X-100 al 0,5 %. A continuación, a cada pocillo, se añadieron 50 pl de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia patrón. La línea recta obtenida con buena dependencia con la concentración se muestra en la Figura 23.
<Ejemplo de Referencia 9>
Síntesis de 3a-benzoil-peroxi-5p-androsterona y 3a-acetil-peroxi-5p-androsterona
El compuesto del título se obtuvo de forma similar a la síntesis de 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona descrita en el Ejemplo 14 excepto en que se cambió hidroperóxido de terc-butilo por hidroperóxido de benzoílo o hidroperóxido de acetilo.
3a-benzoil-peroxi-5p-Androsterona
Figure imgf000027_0001
3a-acetil-peroxi-5p-Androsterona
Figure imgf000027_0002
La presente invención se puede usar de forma adecuada en el campo del examen clínico o en el campo del examen alimentario que demanda una medición de elevada sensibilidad sencilla.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un método para someter a ensayo la actividad enzimática usando un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usa peroxidasa como una enzima del complejo anticuerpo-enzima y como un sustrato de la enzima se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1),
Figure imgf000028_0001
en la que
X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) como un sustrato de peroxidasa, y
la cuantificación de un producto de la reacción enzimática se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o de tio-NADPH producida, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o por el tio-NADPH producidos.
2. Un método para someter a ensayo una sonda de ácido nucleico usando una sonda de ácido nucleico marcada con enzima, en donde se usa peroxidasa como la enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima, y como un sustrato de la enzima se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1),
Figure imgf000028_0002
en la que
X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa como un sustrato de peroxidasa el derivado de androsterona representado por la fórmula (1), y
la cuantificación de un producto de reacción de la reacción enzimática se lleva a cabo mediante la producción de tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclo enzimático usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o de tio-NADPH producida, o midiendo el cambio del color por tio-NADH y/o por tio-NADPH producidos.
3. Un kit para inmunoensayo enzimático que comprende los siguientes reactivos (1) a (5):
(1) peroxidasa marcada con un anticuerpo específico frente a un antígeno de la proteína diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
Figure imgf000029_0001
en la que X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6,
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
4. Un kit para someter a ensayo una sonda de ácido nucleico que comprende los siguientes reactivos (1) a (5):
(1) peroxidasa marcada con una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana, (2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
Figure imgf000029_0002
en la que X representa -O-CO-R (siempre que R represente un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo), Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6,
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
5. Derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1):
Figure imgf000029_0003
en la que X representa -O-CO-R, R representa un grupo alquilo C1-6 o un grupo fenilo, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un átomo de oxígeno, o Y1 representa hidrógeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3152410A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Sage Therapeutics, Inc. 3,3-disubstituted 19-nor pregnane compounds, compositions, and uses thereof for the treatment of cns related disorders
IL310501A (en) 2012-12-18 2024-03-01 Washington University St Louis Neuroactive steroids converted at the 19th position to the 17th position, their prodrugs, and methods of treatment using them
JP2014124165A (ja) * 2012-12-27 2014-07-07 Bl:Kk タンパク質および核酸の高感度測定法、キット並びに酵素組成物
WO2014169836A1 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Sage Therapeutics, Inc. 19-nor neuroactive steroids and methods of use thereof
IL286794B2 (en) 2013-04-17 2024-06-01 Sage Therapeutics Inc 19- NOR C3, 3- dimomer C21- N- pyrazole Steroids and methods of using them
WO2014169831A1 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Sage Therapeutics, Inc. 19-nor c3,3-disubstituted c21-c-bound heteroaryl steroids and methods of use thereof
RS60420B1 (sr) 2013-04-17 2020-07-31 Sage Therapeutics Inc 19-nor neuroaktivni steroidi za metode lečenja
RU2754534C2 (ru) 2013-07-19 2021-09-03 Сейдж Терапьютикс, Инк. Нейроактивные стероиды, композиции и их использование
DK3488852T3 (da) 2013-08-23 2021-02-01 Sage Therapeutics Inc Neuroaktive steroider, sammensætninger og anvendelser deraf
WO2015195962A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Sage Therapeutics, Inc. Neuroactive steroids, compositions, and uses thereof
CN107404877A (zh) 2014-10-16 2017-11-28 萨奇治疗股份有限公司 靶向cns 障碍的组合物和方法
WO2016061537A1 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Sage Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cns disorders
SI3224269T1 (sl) 2014-11-27 2020-10-30 Sage Therapeutics, Inc. Sestavki in metode za zdravljenje CNS motenj
PL3250210T3 (pl) 2015-01-26 2021-07-26 Sage Therapeutics, Inc. Kompozycje i sposoby leczenia zaburzeń OUN
JP6875996B2 (ja) 2015-02-20 2021-05-26 セージ セラピューティクス， インコーポレイテッド 神経刺激性ステロイド、組成物、およびその使用
JP6960210B2 (ja) 2016-03-30 2021-11-05 悦朗 伊藤 タンパク質及び核酸の超高感度測定方法
EP3481844B1 (en) 2016-07-11 2024-04-17 Sage Therapeutics, Inc. C7, c12, and c16 substituted neuroactive steroids and their methods of use
AU2017297375B2 (en) 2016-07-11 2022-09-15 Sage Therapeutics, Inc. C17, C20, and C21 substituted neuroactive steroids and their methods of use
SG11202112391UA (en) 2019-05-31 2021-12-30 Sage Therapeutics Inc Neuroactive steroids and compositions thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR83554E (fr) 1961-07-21 1964-09-04 Roussel Uclaf Procédé pour la préparation de dérivés de l'étiocholane
US6011023A (en) * 1997-08-27 2000-01-04 Alcon Laboratories, Inc. Angiostatic steroids
WO2008117816A1 (ja) * 2007-03-28 2008-10-02 Etsuro Ito タンパク質および核酸の超高感度測定法
JP4904298B2 (ja) * 2008-03-03 2012-03-28 学校法人村崎学園 徳島文理大学 ステロイド５α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット
JP6960210B2 (ja) * 2016-03-30 2021-11-05 悦朗 伊藤 タンパク質及び核酸の超高感度測定方法

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Publication number Publication date
HK1246360A1 (zh) 2018-09-07
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JP5265816B2 (ja) 2013-08-14
EP2695948A4 (en) 2015-04-08
EP3296405A1 (en) 2018-03-21
EP2987866A2 (en) 2016-02-24
EP2987866B1 (en) 2017-12-06
US9851309B2 (en) 2017-12-26

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