JPWO2012128338A1 - タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 - Google Patents
タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2012128338A1 JPWO2012128338A1 JP2012533408A JP2012533408A JPWO2012128338A1 JP WO2012128338 A1 JPWO2012128338 A1 JP WO2012128338A1 JP 2012533408 A JP2012533408 A JP 2012533408A JP 2012533408 A JP2012533408 A JP 2012533408A JP WO2012128338 A1 JPWO2012128338 A1 JP WO2012128338A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- carbon atoms
- hydrogen
- enzyme
- thio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 163
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 163
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 100
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims abstract description 55
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 136
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 114
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 114
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 109
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 108
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 94
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 84
- 150000001444 androsterones Chemical class 0.000 claims description 77
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 74
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 69
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims description 69
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 67
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 67
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 61
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 54
- 108010062875 Hydroxysteroid Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 48
- 102000011145 Hydroxysteroid Dehydrogenases Human genes 0.000 claims description 48
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 46
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 46
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 44
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 32
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 30
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 27
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 27
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 claims description 26
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims description 26
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 26
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 25
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 claims description 25
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 claims description 25
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 25
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 24
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 24
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 24
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 24
- SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purine-6-thione Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=S)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 20
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 13
- -1 fructosidase Proteins 0.000 claims description 11
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 claims description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 47
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 19
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 156
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 81
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 56
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 45
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 43
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 35
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 35
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 35
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 35
- CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N (2r,3r,4s,5r)-5-[[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-2-(3-carbamothioylpyridin-1-ium-1-yl)-4-hydroxyoxolan-3-olate Chemical compound NC(=S)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)[O-])=C1 CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 29
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 23
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- QGXBDMJGAMFCBF-BNSUEQOYSA-N 3alpha-hydroxy-5beta-androstan-17-one Chemical compound C1[C@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@@H]21 QGXBDMJGAMFCBF-BNSUEQOYSA-N 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 21
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 21
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 20
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 20
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 19
- DJCLLPRQXAXWAB-GSDNACIXSA-N (3r,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-17-methoxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](OC)[C@@]2(C)CC1 DJCLLPRQXAXWAB-GSDNACIXSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- QGXBDMJGAMFCBF-HLUDHZFRSA-N 5α-Androsterone Chemical class C1[C@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 QGXBDMJGAMFCBF-HLUDHZFRSA-N 0.000 description 15
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 15
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 102100036504 Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Human genes 0.000 description 12
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 12
- 101710172561 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 9
- QGXBDMJGAMFCBF-UHFFFAOYSA-N Etiocholanolone Natural products C1C(O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC21 QGXBDMJGAMFCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229940061641 androsterone Drugs 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 8
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- LQZMLBORDGWNPD-UHFFFAOYSA-N N-iodosuccinimide Chemical compound IN1C(=O)CCC1=O LQZMLBORDGWNPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 3
- ACLORNOGSFJLET-HLUDHZFRSA-N [(3r,5s,8r,9s,10s,13s,14s)-10,13-dimethyl-17-oxo-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16-tetradecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1[C@H](OP(O)(O)=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 ACLORNOGSFJLET-HLUDHZFRSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229930182479 fructoside Natural products 0.000 description 2
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 2
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 1
- IUNYGQONJQTULL-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha)-3-Hydroxyandrostane-11,17-dione Natural products C1C(O)CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC21 IUNYGQONJQTULL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIXFHVWJOVNKQK-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,11alpha)-3,11-Dihydroxyandrostan-17-one Natural products C1C(O)CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC21 PIXFHVWJOVNKQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZPGNVHRUGYRDG-BHTIXTJWSA-N (5S,8R,9S,10S,13R,14S)-15-methoxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene Chemical compound COC1[C@@H]2[C@](CC1)(C)CC[C@H]1[C@H]2CC[C@@H]2CCCC[C@]12C XZPGNVHRUGYRDG-BHTIXTJWSA-N 0.000 description 1
- IUNYGQONJQTULL-UFTZPVOZSA-N 11-Ketoandrosterone Chemical compound C1[C@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 IUNYGQONJQTULL-UFTZPVOZSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- PIXFHVWJOVNKQK-PTXZMSDUSA-N 3alpha,11beta-Dihydroxy-5alpha-androstane-17-one Chemical compound C1[C@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 PIXFHVWJOVNKQK-PTXZMSDUSA-N 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-VRPWFDPXSA-N D-fructopyranose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 101000928746 Homo sapiens Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 description 1
- LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl peroxide Chemical compound CC(C)(C)OOC(C)(C)C LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010799 enzyme reaction rate Methods 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- UKJFVOWPUXSBOM-UHFFFAOYSA-N hexane;oxolane Chemical compound C1CCOC1.CCCCCC UKJFVOWPUXSBOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCIHNCMPUBDKT-UHFFFAOYSA-N hexane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCCCCC KDCIHNCMPUBDKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- XCRBXWCUXJNEFX-UHFFFAOYSA-N peroxybenzoic acid Chemical compound OOC(=O)C1=CC=CC=C1 XCRBXWCUXJNEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/90209—Oxidoreductases (1.) acting on NADH or NADPH (1.6), e.g. those with a heme protein as acceptor (1.6.2) (general), Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2) or NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
吸光光度計やプレートリーダー等の汎用測定機器や目視で測定可能な超高感度測定法を提供する。チオNAD(P)を補酵素とする酵素サイクリング法と標識酵素およびその基質の最適な組合わせにより、シグナル物質であるチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅し、そのチオNAD(P)Hを比色定量することにより、汎用測定機器や目視で測定可能な高感度測定法を提供することができる。
Description
本出願は、２０１１年３月２３日出願の日本特願２０１１−６３５５９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
本発明は、酵素免疫測定法および核酸プローブ測定法を利用するタンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに関する。特に本発明は、抗体または核酸プローブに標識する酵素に対して特定の酵素基質を用いることで、これらの酵素の活性測定に用いるチオNADサイクリング法における阻害を回避して、標的タンパク質および核酸の超高感度測定を可能にする方法に関する。さらに本発明は、上記タンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに用いることができる新規な酵素基質も提供する。
タンパク質や核酸の高感度測定法としてラジオイムノアッセイ（RIA）法が技術的に確立されているが、検出装置の感度を上げる以外に、現状では10-16mole程度以上の高感度化は技術的に不可能である。しかも、RIA法では測定の場がアイソトープ実験施設に限定されるだけではなく、短寿命の核種を使用すれば試薬の使用期限が極端に短くなる上に、測定感度も急激に低下する。さらに、放射能測定法に特有の放射性廃棄物の問題も抱えている。特に長寿命の核種を使用する場合の廃棄の問題は大きい。したがって、近年、タンパク質や核酸の高感度測定法の開発研究は「非放射性」をキーワードとして展開されてきた。それゆえ、RIA法に関する研究開発や技術的改良はほとんど行われていない現状である。
RIA法に代わる高感度測定法として、タンパク質の測定には酵素免疫測定法(ELISA法)[図１]が、核酸の測定にはPCR法がある。酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13mole)から蛍光法、発光法へと高感度化(10-15mole)が進められ、専用測定装置の開発・改良も進んでいる。しかし、測定操作が簡便になっただけで感度的には限界に達している。
また、核酸の高感度測定法としてのPCR法では、ターゲット特異的なシグナル検出の問題、増幅効率の問題、PCR産物がプラトーに達する条件等を考え合わせると、核酸の定量は厳密には難しい。
WO2008/117816（特許文献1）には、チオNADサイクリング法を利用する抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法及び酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法が記載されている。
特許文献1に記載の方法は、酵素免疫測定法を、酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせ、シグナル物質としてチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅することで、比色法によって、高感度にタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能である。しかしながら、標識酵素と基質との反応性が必ずしも高くないことや、標識酵素に対する基質が酵素サイクリング法における酵素反応を部分的に阻害することが明らかになった。
そこで本発明の目的は、酵素免疫測定法を酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせた特許文献1に記載の方法において、上記標識酵素に対する基質の問題点を解決した、タンパク質または核酸の比色測定による高感度測定法検出方法が最も簡便な比色法を用い、感度を幾何級数的に高めた測定法を提供することである。具体的には感度を10-18moles 以上に高めた測定法を提供することである。
そこで、本発明者らは、上記課題を解決した標識酵素に対する基質となり得る化合物を見出しまたは新たな化合物を提供し、さらにこれらの基質を用いることで、上記課題を解決できることを見いだして、本発明を完成させた。
本発明は以下の通りである。
[1]
抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
(i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[2]
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
(i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[3]
前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[5]
前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[6]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[7]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[8]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[9]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[10]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[11]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[12]
下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
(式中、X、Y1およびY2の定義は、以下の(A)、(B)および(C)のいずれかである。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。)
[13]
X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[14]
X、Y1およびY2の定義は、 (B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[15]
X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[1]
抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[2]
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[3]
前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[5]
前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[6]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[7]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[8]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[9]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[10]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[11]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[12]
下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。)
[13]
X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[14]
X、Y1およびY2の定義は、 (B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[15]
X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
本発明によれば、測定感度を10-18moles 以上に高めた酵素免疫測定法を提供することができ、標的タンパク質や標的核酸の高感度測定が可能である。
〔新規基質〕
本発明は下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体に関する。
(式中、X、Y1およびY2の定義は、以下の(A)、(B)および(C)のいずれかである。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。)
本発明は下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体に関する。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。)
Y2の例である炭素数1〜6のアルコキシ基は、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などであることができ、炭素数1〜6のアルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、iso-プロピル基、n-プロピル基、tert-ブチル基、n-ブチル基、n-ぺンチル基、n-ヘキシル基などであることができる。
糖残基の糖は、グルコース、ガラクトース、フルクトースまたはマンノースであることができ、使用する標識酵素により適宜選択することができる。
-O-CO-Rにおける-CO-は、-(C=O)-を意味し、Rにおける炭素数1〜6のアルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、iso-プロピル基、n-プロピル基、tert-ブチル基、n-ブチル基、n-ぺンチル基、n-ヘキシル基などであることができる。またRはフェニル基であってもよく、官能基を有していても良い。
Y1及びY2が共同で酸素原子である場合は、Xは糖残基または-O-CO-Rであり、具体的には5α-アンドロステロンまたは5β-アンドロステロンの糖誘導体、例えば、グルコシド、ガラクトシド、フルクトシドまたはマンノシドである。尚、グルコシド、ガラクトシド、フルクトシド及びマンノシドは、正式にはそれぞれグルコピラノシド、ガラクトピラノシド、フルクトピラノシド及びマンノピラノシドと呼称される。
上記本発明の化合物の具体例は、後述の表1に示す。但し、表1には、本発明の化合物の具体例以外に、本発明の方法およびキットで使用できる化合物も含まれている。
上記本発明の化合物は、実施例に記載の方法に基づいてまたは実施例に記載の方法を参照して合成できる。
〔酵素サイクリング法〕
本発明は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。
本発明は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。
上記抗体酵素複合体は、標的タンパク質抗原に特異的な抗体とこの抗体で標識した酵素とからなり、前記標的タンパク質の測定に用いられる。
さらに本発明は、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。
上記酵素標識核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合する核酸プローブとこの核酸プローブで標識した酵素とからなり、前記標的核酸の測定に用いられる。
上記本発明の方法で用いられている抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、アルカリホスファターゼ(ALP)、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼである。上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用いる。
(i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。(i)に含まれるアンドロステロン誘導体は、上記本発明の新規化合物を含むと共に、さらにY2が、水素である化合物も含む。Y2が、水素である化合物はTetrahedron, 1999, Vol.55, No.17, p.5465-5482に記載されている。この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。(ii)に含まれるアンドロステロン誘導体は、上記本発明の新規化合物を含むと共に、さらにY1及びY2は共同で酸素原子である化合物も含む。Y1及びY2は共同で酸素原子である化合物の内、Xがグルコースである化合物はCarbohydrate Research, 1971, Vol.17, No.1，p.199-207に記載されている。この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。Y2が水酸基である、化合物の内、Xがグルコースである化合物はPhytochemistry，1974, Vol.13, No.10，p.2135-2142に記載されている。この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。(iii)に含まれるアンドロステロン誘導体は、上記本発明の新規化合物である。
本発明の超高感度測定法は、通常の酵素免疫測定法や核酸プローブ法と同様に実施することができる。例えば、被検体に特異的に結合する抗体や核酸プローブを表面に固着させた固相担体、例えば、マイクロプレートやプラスチックチューブ、磁気ビーズ等、通常の測定に用いられている固相担体を用いることができる。
抗体および核酸プローブ−酵素複合体は、常法により調製できる。
抗体酵素複合体を構成する抗体は、本発明の酵素免疫測定方法により測定されるべき被検体に特異的に結合する抗体から適宜選択することができる。例えば、本発明の酵素免疫測定方法は、タンパク質の分析に用いられるが、その場合、抗体酵素複合体の抗体は、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体である。また、この場合、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板を用いる。また、抗体酵素複合体を構成する抗体および基板に固着させる抗体は、抗体の断片であっても良い。本発明の酵素免疫測定方法における、被検体は、タンパク質に限定されず、通常の酵素免疫測定方
法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。
法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。
核酸プローブ酵素複合体も同様に測定対象となる核酸に相補的なプローブを適宜選択することができる。
本発明の方法において、抗体酵素複合体の酵素または酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う。
本発明の方法において、各成分の濃度は以下の範囲にすることができる。
（１）抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの濃度範囲
0.01μg/ml 〜 1 mg/ml
（２）標識酵素の基質の濃度範囲
1μM 〜 500 mM
（３）NADHおよび／またはNADPHの濃度範囲
0.01 mM 〜 50 mM
（４）チオNADおよび／またはチオNADPの濃度範囲
0.01 mM 〜 100 mM
（５）デヒドロゲナーゼ(DH)の濃度範囲
0.01 u/ml 〜 5000 u/ml
（１）抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの濃度範囲
0.01μg/ml 〜 1 mg/ml
（２）標識酵素の基質の濃度範囲
1μM 〜 500 mM
（３）NADHおよび／またはNADPHの濃度範囲
0.01 mM 〜 50 mM
（４）チオNADおよび／またはチオNADPの濃度範囲
0.01 mM 〜 100 mM
（５）デヒドロゲナーゼ(DH)の濃度範囲
0.01 u/ml 〜 5000 u/ml
反応条件は、標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)の最適温度範囲を考慮して適宜決定できる。例えば、反応温度は、操作が簡便であることから、室温で実施することが好ましい。但し、標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)の最適温度範囲を考慮して室温より高い温度または低い温度で実施することもできる。
反応時間は、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量の測定、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化の計測が可能な程度まで、チオNADHおよび／またはチオNADPHが蓄積するに十分な時間とすることができる。但し、測定または計測に必要なチオNADHおよび／またはチオNADPHの蓄積量は、測定または計測条件により変化するで、条件に応じて適宜決定できる。
酵素サイクリング系の中でチオNAD(P)を利用するサイクリング系は比較的最近になって登場したユニークなサイクリング系である。この系ではNAD(P)/NAD(P)Hを補酵素として利用する脱水素酵素（Dehydrogenase;DH）を用い、NAD(P)/NAD(P)HとそのアナログであるチオNAD(P)/チオNAD(P)Hが共存する条件下でサイクリングを行い、脱水素酵素の基質をチオNAD(P)H（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）として増幅定量する。チオNAD(P)サイクリング法の測定原理は以下の通りである。
NADHの極大吸収が340 nm（モル吸光係数=6,200）であるのに対し、チオNAD(P)Hは可視域に吸収を示すため（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できることをその長所としている。
チオNAD(P)を利用するサイクリング系は、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できるという長所を利用して、NADHの吸収増加に基づく脱水素酵素活性測定やその基質の定量法などの従来法のいくつかがチオNADを用いる方法に改良されている。しかしながら、このサイクリング系を酵素免疫測定法等の検出系として高感度化に利用した報告は未だない。
本発明では、標識酵素とサイクリング系を組み合わせることにより、初めて増幅反応を幾何級数的な反応とすることが可能となり、十分な高感度化を行うことが可能となった。
本発明では、標識酵素とサイクリング系を組み合わせることにより、初めて増幅反応を幾何級数的な反応とすることが可能となり、十分な高感度化を行うことが可能となった。
本発明の測定法では、酵素免疫測定法の例で示したとおり、酵素複合体とそれに組み合わせた基質で産生された生成物を次の酵素サイクリング反応の基質として用い、酵素サイクリング反応により生成したチオNAD(P)Hの吸収を比色定量するものである。この反応では１種の脱水素酵素で酵素サイクリングを行うため、酵素サイクリング反応の基質としては、還元型基質でも酸化型基質でもよい。
本発明で用いる上記酵素複合体として用いる標識酵素とその基質およびそれに続くサイクリング反応に用いる脱水素酵素は以下のような性質を持っている。
（１）標識酵素の生成物がアンドロステロンまたはその誘導体
（２）市販および汎用されている標識酵素が使用できる
（３）酵素サイクリングのターンオーバー数が大きい
（４）酵素サイクリング反応に使用する脱水素酵素に標識酵素のコンタミや標識酵素と同様の活性がない
（１）標識酵素の生成物がアンドロステロンまたはその誘導体
（２）市販および汎用されている標識酵素が使用できる
（３）酵素サイクリングのターンオーバー数が大きい
（４）酵素サイクリング反応に使用する脱水素酵素に標識酵素のコンタミや標識酵素と同様の活性がない
デヒドロゲナーゼ(DH)としては、例えば、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを上げることができる。
本発明に使用可能な代表的な標識酵素、基質及び酵素サイクリング用の脱水素酵素の組合わせの一例として以下のものがあげられるが、もちろんこの組み合わせに限られるわけではない。
例えば、上記記載の組合せの中でサイクリング酵素として3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる場合、使用可能な基質の候補としては、アンドロステロン、11β-ヒドロキシアンドロステロン、11-オキソアンドロステロン、11α-ヒドロキシアンドロステロンが挙げられる。
サイクリング用の基質としては、酵素の反応速度が速く(基質に対する活性が高い)、低濃度でも反応する(Km値が小さい)ものが好ましい。また、脱水素酵素として好ましい性質は、補酵素としてチオNAD(P)を用いた場合の反応速度である。多くの脱水素酵素では、補酵素としてチオNADを用いた場合の反応速度がNADを用いた場合の数％以内であるのに対し、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるアンドロステロンの脱水素反応では、チオNADでの反応速度がNADでの反応速度の約59％もあり、本発明のサイクリング酵素として、好ましい性質を有している。しかも組合わせる標識酵素として、汎用されているアルカリホスファターゼ（ALP）を用いることが可能であり、アルカリホスファターゼの基質となるアンドロステロン誘導体の3位リン酸エステルの合成が容易であることも好ましい組合わせである。
また、同じように標識酵素として汎用されているグルコシダーゼとアンドロステロン誘導体のグルコシド、ガラクトシダーゼとアンドロステロン誘導体のガラクトシドも合成が容易で好ましい組み合わせである。
また、同じように標識酵素として汎用されているペルオキシダーゼとアンドロステロン誘導体のペルオキシド、例えば、tert-ブチルペルオキシドも合成が容易で好ましい組み合わせである。
アンドロステロン 3-β-Dガラクトシドを基質とした反応例を以下に示す。
抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ(ALP)を用いる酵素免疫測定方法を例にして、以下に説明する。アルカリホスファターゼ(ALP)は、標識酵素として広く用いられている酵素であり、このALPを用いる酵素免疫測定方法では、新規化合物のアンドロステロン誘導体をALPの基質とすると、生成物としてアンドロステロンが生成する。そして、ALPの反応生成物を基質とするデヒドロゲナーゼである、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD)を酵素サイクリング反応に使用する。
チオNADサイクリングは適切な脱水素酵素反応を選択すれば1分当たり数百サイクルという効率で脱水素酵素基質を増幅定量することができる。したがって、このような基質を反応生成物として与える酵素の活性はチオNADサイクリングによって超高感度に測定できることになる。
[酵素サイクリング用キット]
本発明は、反応性担体に標識化された酵素およびその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
反応性担体とは測定対象物と結合する活性を持った抗体・核酸プローブ・レクチン等を表す。
反応性担体は測定対象物に適した物を用いればよく、標識酵素およびその基質も適した物を用いればよく特に限定はされない。
本発明は、反応性担体に標識化された酵素およびその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
反応性担体とは測定対象物と結合する活性を持った抗体・核酸プローブ・レクチン等を表す。
反応性担体は測定対象物に適した物を用いればよく、標識酵素およびその基質も適した物を用いればよく特に限定はされない。
より具体的には、本発明は、標識酵素及びその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
本発明のキットは、以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キットである。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)またはグルコシダーゼまたはガラクトシダーゼまたはフルクトシダーゼまたはマンノシダーゼまたはペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体、
(3)デヒドロゲナーゼ(DH)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)またはグルコシダーゼまたはガラクトシダーゼまたはフルクトシダーゼまたはマンノシダーゼまたはペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体、
(3)デヒドロゲナーゼ(DH)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
さらに本発明は、以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キットである。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)またはグルコシダーゼまたはガラクトシダーゼまたはフルクトシダーゼまたはマンノシダーゼまたはペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体、
(3)デヒドロゲナーゼ(DH)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)またはグルコシダーゼまたはガラクトシダーゼまたはフルクトシダーゼまたはマンノシダーゼまたはペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体、
(3)デヒドロゲナーゼ(DH)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
標識酵素、デヒドロゲナーゼ(DH)および 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体については、上記本発明の方法で説明したものをそのまま利用できる。
本発明のキットは、市販の酵素標識抗体等をこのキットの構成試薬と組合わせて使用することも可能である。このキットは、酵素サイクリング法を用いる酵素免疫測定方法に利用できる。
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明がこれら実施例のみに限定されるべきでないことは云うまでもない。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
Alkaline phosphatase（ALP）とAndrosterone 3-phosphate（A3P）の系のチオNADサイクリングを検出系とする、Alkaline phosphataseとPumilio（プミリオ）の測定。
参考例1
ALP標識抗体の作製
抗原に特異的反応性を有するマウス由来のモノクローナル抗体を0.1 Mクエン酸緩衝液（pH 3.5）で30分間の透析を3回行った。その抗体溶液に抗体量に対し0.5 %になるようにペプシンを添加し、37℃で1時間静置した後、1.5 Mトリス緩衝液（pH 8.8）で中性に調整した。この混合反応液をsuperdex 200を充填したカラム（Amersham Biosciences社）を用いてゲルろ過し、F(ab’)2を得た。
このF(ab’)2を100 μg用いて、ALP-labeling kit（同仁化学社）によりALPを標識した。
ALP標識抗体の作製
抗原に特異的反応性を有するマウス由来のモノクローナル抗体を0.1 Mクエン酸緩衝液（pH 3.5）で30分間の透析を3回行った。その抗体溶液に抗体量に対し0.5 %になるようにペプシンを添加し、37℃で1時間静置した後、1.5 Mトリス緩衝液（pH 8.8）で中性に調整した。この混合反応液をsuperdex 200を充填したカラム（Amersham Biosciences社）を用いてゲルろ過し、F(ab’)2を得た。
このF(ab’)2を100 μg用いて、ALP-labeling kit（同仁化学社）によりALPを標識した。
参考例2
不溶性担体固定化抗体の調製1
抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に100μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後抗体溶液を回収し、2%ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを300μl添加して室温で2時間静置してブロッキング処理を行い、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
不溶性担体固定化抗体の調製1
抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に100μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後抗体溶液を回収し、2%ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを300μl添加して室温で2時間静置してブロッキング処理を行い、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
参考例3
不溶性担体固定化抗体の調製2
抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に10μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後ウェル内の溶液を吸引除去し、0.1 %ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを300μl添加して室温で2時間静置してブロッキング処理を行い、0.05 % Tween 20含有TBSで洗浄し、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
不溶性担体固定化抗体の調製2
抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に10μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後ウェル内の溶液を吸引除去し、0.1 %ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを300μl添加して室温で2時間静置してブロッキング処理を行い、0.05 % Tween 20含有TBSで洗浄し、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
＜比較例1＞ 5α-Androsterone 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.2 M グリシン緩衝液（pH 8.8）
1.5 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.5 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
反応試液
0.2 M グリシン緩衝液（pH 8.8）
1.5 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.5 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
測定試料
0.1、0.5、1、2、5、10、50、100、200 ng/ml Pumilio
0.1、0.5、1、2、5、10、50、100、200 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例2の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜200 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図2に示す。
参考例2の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜200 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図2に示す。
ここで、酵素（Alkaline phosphatase）と基質（Androsterone 3-phosphate）の反応性が悪いこと、基質がサイクリング反応を阻害することが問題点として浮上したため、酵素反応とサイクリング反応を分ける2ステップ法を試した。また、サイクリング反応の酵素である3α-Hydroxysteroid dehydrogenase中にphosphatase活性があり、ブランクの原因となることがわかったため、2ステップ法のサイクリング反応時にはリン酸を含有する緩衝液を使用することにした。
＜比較例2＞ 5α-Androsterone 3-phosphateを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液A
0.1 M トリス緩衝液（pH 8.3）
1 mM MgCl2
0.1 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
反応試液A
0.1 M トリス緩衝液（pH 8.3）
1 mM MgCl2
0.1 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
反応試液B
0.2 M リン酸水素二ナトリウム含有0.2 M グリシン緩衝液（pH 9.6）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
0.2 M リン酸水素二ナトリウム含有0.2 M グリシン緩衝液（pH 9.6）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
測定試料
0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、12.5、20、50、75、100 ng/ml Pumilio
0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、12.5、20、50、75、100 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜100 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図3に示す。
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜100 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図3に示す。
2ステップ法を試したが、期待するほど感度が上がらないので、Alkaline phosphataseとの反応性を向上させるため、ここまで用いていた、5α-Androsterone 3-phosphateとは立体構造の異なる、5β-Androsterone 3-phosphateを使用することにした。
＜比較例3＞ 5β-Androsterone 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1 M トリス緩衝液（pH 8.6）
0.5 mM MgCl2
1.5 mM thio-NAD
0.5 mM NADH
0.5 mM 5β-Androsterone 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
0.1 M トリス緩衝液（pH 8.6）
0.5 mM MgCl2
1.5 mM thio-NAD
0.5 mM NADH
0.5 mM 5β-Androsterone 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
0.1、0.5、1、2、5、8、10、20、50 ng/ml Pumilio
0.1、0.5、1、2、5、8、10、20、50 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜50 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図4に示す。
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜50 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図4に示す。
＜比較例4＞ 5β-Androsterone 3-phosphateを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液A
0.1 M トリス緩衝液（pH 8.3）
1 mM MgCl2
0.1 mM 5β-Androsterone 3-phosphate
0.1 M トリス緩衝液（pH 8.3）
1 mM MgCl2
0.1 mM 5β-Androsterone 3-phosphate
反応試液B
0.2 M リン酸水素二ナトリウム含有0.2 M グリシン緩衝液（pH 9.6）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
0.2 M リン酸水素二ナトリウム含有0.2 M グリシン緩衝液（pH 9.6）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、10、25、50 ng/ml Pumilio
0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、10、25、50 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜50 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して10分間吸光度を測定した。10分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図5に示す。
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜50 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して10分間吸光度を測定した。10分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図5に示す。
ここまでで、Androsterone 3-phosphateがサイクリング反応の基質になっていることがわかり、また、この現象によるブランク上昇も問題点となった。その原因が17位のケトンにあることが判明したので、17位のケトンを除去もしくは置換した基質を使用することにした。合成した3α-ヒドロキシアンドロスタン類は図6に示す。また、これらを基質としたサイクリング反応の回転数を比較すると、表2のようになった。この中では5α-Androsteroneの回転数が最大で、それに近い基質は3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane、5α-Dihydrotestosteroneであったので、まずは前者のリン酸エステル、3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate合成してチオNADサイクリングへ応用した。
＜実施例1＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた1ステップ法によるAlkaline phosphataseの測定
3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateの合成方法
オキシ塩化リン(0.26mL)の無水ピリジン溶液(4 mL)に、氷冷下で3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-androstane (200mg)の無水ピリジン溶液 (4mL)を滴下し、氷冷下でさらに1時間攪拌した。反応液を氷水に注ぎ、溶液を強アルカリ性 (pH 約11)とした後、エーテルで洗浄した。次いで、水層に濃塩酸を加えpHを約2に調整した後、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をテトラヒドロフラン−ヘキサンで再結晶し無色結晶（210 mg）を得た。
オキシ塩化リン(0.26mL)の無水ピリジン溶液(4 mL)に、氷冷下で3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-androstane (200mg)の無水ピリジン溶液 (4mL)を滴下し、氷冷下でさらに1時間攪拌した。反応液を氷水に注ぎ、溶液を強アルカリ性 (pH 約11)とした後、エーテルで洗浄した。次いで、水層に濃塩酸を加えpHを約2に調整した後、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をテトラヒドロフラン−ヘキサンで再結晶し無色結晶（210 mg）を得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4 ) δ= 0.73 (s, 3H, 18-CH3), 0.95 (s, 3H, 19-CH3), 3.19 (1H, t, J=8.6 Hz, 17α-H), 3.32 (s, 3H, -OCH3), 4.18 (m, 1H, 3β-H)
ESI-HR-MS Calculated for C20H35O5P-H: m/z 385.2149 [M-H]−. Found m/z 385.2157
m.p. 187-188℃
ESI-HR-MS Calculated for C20H35O5P-H: m/z 385.2149 [M-H]−. Found m/z 385.2157
m.p. 187-188℃
反応試液
0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
0.2 mM MgCl2
0.6 mM thio-NAD
4 mM NADH
0.5 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
0.2 mM MgCl2
0.6 mM thio-NAD
4 mM NADH
0.5 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.1、0.2、0.5、1、2 mU/ml Alkaline phosphatase（最終濃度 0.05、0.1、0.25、0.5、1 mU/ml）
0.1、0.2、0.5、1、2 mU/ml Alkaline phosphatase（最終濃度 0.05、0.1、0.25、0.5、1 mU/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Alkaline phosphatase）を0〜2 mU/mlの範囲で含有するトリス緩衝溶液（pH 9.5）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図7に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Alkaline phosphatase）を0〜2 mU/mlの範囲で含有するトリス緩衝溶液（pH 9.5）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図7に示す。
続いて2ステップ法の検討について、サイクリング反応の酵素である3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase中のphosphatase活性の阻害のため、サイクリング反応時にはリン酸を含有する緩衝液で反応を行うことはすでに述べたが、リン酸緩衝液よりも、よりこのphosphatase活性を阻害するものとして、ピロリン酸緩衝液を採用することにした。
＜実施例2＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた2ステップ法によるAlkaline phosphataseの測定
反応試液A
0.1 M トリス緩衝液（pH 9.5）
0.2 mM MgCl2
1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
0.1 M トリス緩衝液（pH 9.5）
0.2 mM MgCl2
1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
反応試液B
0.15 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.5）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.15 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.5）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
1、5、10、15、20 μU/ml Alkaline phosphatase（最終濃度 0.5、2.5、5、7.5、10 μU/ml）
1、5、10、15、20 μU/ml Alkaline phosphatase（最終濃度 0.5、2.5、5、7.5、10 μU/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Alkaline phosphatase）を0〜20μU/mlの範囲で含有するトリス緩衝溶液（pH 9.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃のインキュベーターで1時間静置する。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して20分間吸光度を測定した。20分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図8に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Alkaline phosphatase）を0〜20μU/mlの範囲で含有するトリス緩衝溶液（pH 9.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃のインキュベーターで1時間静置する。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して20分間吸光度を測定した。20分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図8に示す。
参考例4
Alkaline phosphatase（ALP）標識抗体の精製
参考例1のように得たF(ab’)2を150μμg用いてALP-labeling-kit（同仁化学）によりALP標識抗体を作製した。このALP標識抗体液中にはALPとFabの様々な分子量の複合体が存在し、活性にバラつきがあるので、作製したALP標識抗体液を1 mM Mgl2、0.1 mM ZnCl2、0.01 % BSAを含有するトリス緩衝液（pH 7.0）を溶出液としてsuperdex 200を充填したカラム（Amersham Biosciences社）を用いてゲルろ過し、各フラクションの活性を比較した上で、S/N比の大きいALP標識抗体のみを回収した。
Alkaline phosphatase（ALP）標識抗体の精製
参考例1のように得たF(ab’)2を150μμg用いてALP-labeling-kit（同仁化学）によりALP標識抗体を作製した。このALP標識抗体液中にはALPとFabの様々な分子量の複合体が存在し、活性にバラつきがあるので、作製したALP標識抗体液を1 mM Mgl2、0.1 mM ZnCl2、0.01 % BSAを含有するトリス緩衝液（pH 7.0）を溶出液としてsuperdex 200を充填したカラム（Amersham Biosciences社）を用いてゲルろ過し、各フラクションの活性を比較した上で、S/N比の大きいALP標識抗体のみを回収した。
参考例5
不溶性担体固定化抗体の調製
抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に10μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後ウェル内の溶液を吸引除去し、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄を行った。次に5 %ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを200μl添加して4℃で2時間から一晩静置してブロッキング処理を行い、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
不溶性担体固定化抗体の調製
抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に10μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後ウェル内の溶液を吸引除去し、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄を行った。次に5 %ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを200μl添加して4℃で2時間から一晩静置してブロッキング処理を行い、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
＜実施例 3＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
1.5 mM thio-NAD
2.5 mM NADH
0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
反応試液
0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
1.5 mM thio-NAD
2.5 mM NADH
0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.1、0.5、2、5、10、25 ng/ml Pumilio
0.1、0.5、2、5、10、25 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例4の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.8μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図9に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例4の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.8μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図9に示す。
＜実施例4＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane3-phosphateを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液A
0.1 M トリス緩衝液（pH 9.5）
0.1mM MgCl2
0.2 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
反応試液B
0.15 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.5）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 ng/ml Pumilio
反応試液A
0.1 M トリス緩衝液（pH 9.5）
0.1mM MgCl2
0.2 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
反応試液B
0.15 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.5）
3 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜0.5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例4の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.2μg/ml、ウサギF(ab’)2を1 mg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図10に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜0.5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例4の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.2μg/ml、ウサギF(ab’)2を1 mg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図10に示す。
このように17位を修飾した基質を使用してもブランク反応は完全には除去できなかった。そこで、ELISAの標識酵素にβ-Galactosidaseを用い、その基質として、Androsterone β-D-Galactosideを合成し、検討を進めた。
β-GalactosidaseとAndrosterone 3-β-D-Galactosideの系のチオNADサイクリングを検出とする、β-GalactosidaseとPumilio（プミリオ）の測定。
＜実施例5＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
5β-Androsterone 3-β-D-Galactoside(正式名：5β-Androsterone 3-β-D-galactopyranoside)の合成方法
5β-Androsterone (290mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)に、MS4A (1.25 g)、Phenyl 2,3,4,6-O-tetrabenzoyl-1-thio-β-D-garactopyranoside (1.03g)を加えて−20℃で15分間攪拌した。次いで、N-ヨードスクシンイミド (435mg), トリフルオロメタンスルホン酸 (15mg)を加え−20℃で2時間攪拌した後、室温にてさらに2時間反応した。反応液にトリエチルアミン250μLを添加し反応を停止し、反応液を飽和炭酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの3：1の混液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をメタノール(15 mL)に溶解し、28 % ナトリムメトキシド(500 μL)加え2時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (24×240 mm, 10 % メタノール−クロロホルム)にて精製後、メタノールで再結晶し無色結晶(360mg)を得た。
5β-Androsterone (290mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)に、MS4A (1.25 g)、Phenyl 2,3,4,6-O-tetrabenzoyl-1-thio-β-D-garactopyranoside (1.03g)を加えて−20℃で15分間攪拌した。次いで、N-ヨードスクシンイミド (435mg), トリフルオロメタンスルホン酸 (15mg)を加え−20℃で2時間攪拌した後、室温にてさらに2時間反応した。反応液にトリエチルアミン250μLを添加し反応を停止し、反応液を飽和炭酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの3：1の混液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をメタノール(15 mL)に溶解し、28 % ナトリムメトキシド(500 μL)加え2時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (24×240 mm, 10 % メタノール−クロロホルム)にて精製後、メタノールで再結晶し無色結晶(360mg)を得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4 ) δ= 0.85 (s, 3H, 18-CH3), 0.97 (s, 3H, 19-CH3), 3.44-3.49 (bm, 3H, H-2’, H-3’, H-5’), 3.70 (d, 1H, H-6’a), 3.72 (d, 1H, H-6’b), 3.73 (m, 1H, 3β-H), 3.81 (d, 1H, H-4’), 4.33 (d, 1H, H-1’, J1’, 2’= 6.2 Hz)
ESI-HR-MS Calculated for C25H40O7-H: m/z 451.2701 [M-H]−. Found m/z 451.2711
m.p. 130-135℃
ESI-HR-MS Calculated for C25H40O7-H: m/z 451.2701 [M-H]−. Found m/z 451.2711
m.p. 130-135℃
反応試液A
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.3）
0.2 mM MgCl2
0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.3）
0.2 mM MgCl2
0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
反応試液B
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
1.2 mM thio-NAD
3.6 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
1.2 mM thio-NAD
3.6 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図11に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図11に示す。
＜実施例6＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
反応試液
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.7）
10 mM MgCl2
6 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.7）
10 mM MgCl2
6 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
5、10、25、50、100、250 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125 pg/ml）
5、10、25、50、100、250 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125 pg/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜250 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.7）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図12に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜250 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.7）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図12に示す。
＜実施例7＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
反応試液A
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
10 mM MgCl2
0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
10 mM MgCl2
0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
反応試液B
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
4.8 mM thio-NAD
0.4 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
4.8 mM thio-NAD
0.4 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図13に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図13に示す。
＜実施例8＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside(正式名：3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-β-D-galactopyranoside)の合成方法
3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane (306mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)に、MS4A (1.25 g)、Phenyl 2,3,4,6-O-tetrabenzoyl-1-thio-β-D-garactopyranoside (1.03g)を加えて−20℃で15分間攪拌した。次いで、N-ヨードスクシンイミド(435mg), トリフルオロメタンスルホン酸 (15mg)を加え−20℃で2時間攪拌した後、室温にてさらに2時間反応した。反応液にトリエチルアミン250μLを添加し反応を停止し、反応液を飽和炭酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの3：1の混液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をメタノール(15 mL)に溶解し、28 % ナトリムメトキシド(500 μL)加え2時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (24×240 mm, 10 % メタノール−クロロホルム)にて精製後、アセトン−ヘキサンで再結晶し無色結晶(383mg)を得た。
3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane (306mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)に、MS4A (1.25 g)、Phenyl 2,3,4,6-O-tetrabenzoyl-1-thio-β-D-garactopyranoside (1.03g)を加えて−20℃で15分間攪拌した。次いで、N-ヨードスクシンイミド(435mg), トリフルオロメタンスルホン酸 (15mg)を加え−20℃で2時間攪拌した後、室温にてさらに2時間反応した。反応液にトリエチルアミン250μLを添加し反応を停止し、反応液を飽和炭酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの3：1の混液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をメタノール(15 mL)に溶解し、28 % ナトリムメトキシド(500 μL)加え2時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (24×240 mm, 10 % メタノール−クロロホルム)にて精製後、アセトン−ヘキサンで再結晶し無色結晶(383mg)を得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4 ) δ= 0.73 (s, 3H, 18-CH3), 0.95 (s, 3H, 19-CH3), 3.26 (t, 1H, J=8.6 Hz, 17α-H), 3.32 (s, 3H, -OCH3), 3.45-3.51 (bm, 3H, H-2’, H-3’, H-5’), 3.71 (s, 1H, H-6’a), 3.73 (d, 1H, H-6’b), 3.74 (m, 1H, 3β-H), 3.81 (d, 1H, H-4’), 4.33 (d, 1H, H-1’, J 1’, 2’= 7.5 Hz)
ESI-HR-MS Calculated for C26H44O7-H: m/z 467.3014 [M-H]−. Found m/z 451.3026
m.p. 197-199℃
ESI-HR-MS Calculated for C26H44O7-H: m/z 467.3014 [M-H]−. Found m/z 451.3026
m.p. 197-199℃
反応試液
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 8.5）
10 mM MgCl2
6 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.2 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 8.5）
10 mM MgCl2
6 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.2 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
5、10、25、50、100、250 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125 pg/ml）
5、10、25、50、100、250 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125 pg/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜250 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 8.5）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図14に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜250 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 8.5）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図14に示す。
＜実施例9＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
反応試液A
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
4 mM MgCl2
0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
4 mM MgCl2
0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside
反応試液B
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.8）
1.2 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.8）
1.2 mM thio-NAD
1 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度 0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図15に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図15に示す。
Androsterone β-D-Galactosideを用いたPumilioの測定の実施例を以下に示す。但し、抗原に特異的反応性をもつ抗体に直接β-Galactosidaseを標識したものがないため、Labeled StreptAvidin-Biotin（LSAB）法を試している。
参考例6
ビオチン標識抗体の作製
参考例1のように得たF(ab’)2を50μg用いてbiotin-labeling-kit（同仁化学）によりビオチン標識抗体を作製した。
ビオチン標識抗体の作製
参考例1のように得たF(ab’)2を50μg用いてbiotin-labeling-kit（同仁化学）によりビオチン標識抗体を作製した。
＜実施例 10＞5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.7）
5 mM MgCl2
1.2 mM thio-NAD
0.8 mM NADH
0.05 mM 5β-Androstaneβ-D-Galactoside
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.7）
5 mM MgCl2
1.2 mM thio-NAD
0.8 mM NADH
0.05 mM 5β-Androstaneβ-D-Galactoside
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜2.5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図16に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜2.5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図16に示す。
＜実施例11＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液A
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
0.1mM MgCl2
0.05 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
0.1mM MgCl2
0.05 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
反応試液B
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
3 mM thio-NAD
2 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
3 mM thio-NAD
2 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.05、0. 1、0.5、1、2.5、5 ng/ml Pumilio
0.05、0. 1、0.5、1、2.5、5 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50 μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図17に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50 μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図17に示す。
＜実施例 12＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 8.5）
1.2 mM thio-NAD
0.8 mM NADH
0.05 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactoside
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 Mリン酸緩衝液（pH 8.5）
1.2 mM thio-NAD
0.8 mM NADH
0.05 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactoside
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.1、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml Pumilio
0.1、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜10 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図18に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜10 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図18に示す。
＜実施例13＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液A
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.0）
0.05 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactoside
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.0）
0.05 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactoside
反応試液B
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
2.4 mM thio-NAD
2 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
2.4 mM thio-NAD
2 mM NADH
40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml Pumilio
0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜10 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.3μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で60分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50 μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図19に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜10 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.3μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で60分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50 μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図19に示す。
＜参考例7＞ p-Nitrophenyl phosphate（p-NPP）を用いたPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1 M グリシン緩衝液（pH 10.3）
1 mM MgCl2
1 mM ZnCl2
1 mg/ml p-NPP
0.1 M グリシン緩衝液（pH 10.3）
1 mM MgCl2
1 mM ZnCl2
1 mg/ml p-NPP
測定試料
0、1、2.5、5、10、25 ng/ml Pumilio
0、1、2.5、5、10、25 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、各ウェルに反応試液を100μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図20に示す。
参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、各ウェルに反応試液を100μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図20に示す。
＜参考例8＞ o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranoside（ONPG）を用いたβ-Galactosidaseの測定
反応試液
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.3）
0.2 mM 2-mercaptoethanol
1 mM MgCl2
10 mM ONPG
0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.3）
0.2 mM 2-mercaptoethanol
1 mM MgCl2
10 mM ONPG
測定試料
2、10、20、50 ng/ml β-Galactosidase（最終濃度 1、5、10、25 ng/ml）
2、10、20、50 ng/ml β-Galactosidase（最終濃度 1、5、10、25 ng/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜25 ng/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液を50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で415 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図21に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0〜25 ng/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液を50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で415 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図21に示す。
検出限界および定量限界の算出方法
各測定結果の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットし、直線上に並ぶ濃度のみを抽出して近似曲線を作成する。次にブランク（標準物質を含まない；n≧3）の標準偏差を算出し、その3倍値および10倍値を近似曲線の傾きで割り、得られる数値をそれぞれ検出限界および定量限界とする。
各実験結果より算出した検出限界および定量限界を表3、4、5にまとめた。
各測定結果の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットし、直線上に並ぶ濃度のみを抽出して近似曲線を作成する。次にブランク（標準物質を含まない；n≧3）の標準偏差を算出し、その3倍値および10倍値を近似曲線の傾きで割り、得られる数値をそれぞれ検出限界および定量限界とする。
各実験結果より算出した検出限界および定量限界を表3、4、5にまとめた。
＜実施例14＞
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるHorseradish peroxidaseの測定
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるHorseradish peroxidaseの測定
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneの合成方法
3α-chloro-5β-Androsterone（100mg）をジクロロメタン溶液（15mL）に溶解させ、反応試液を調製した。本溶液に対し、20%の水酸化ナトリウム水溶液（15mL）にtert-butyl-hydroperoxide（30mg）を溶解した溶液を加え、室温にて2時間撹拌させて反応させた。反応液から有機層を回収し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（24×240 mm，10%メタノール−クロロホルム）にて精製後、本化合物88mgを得た。本化合物の同定は、1H-NMR、ESI-HR-MS およびm.p.(融点)により行った。
3α-chloro-5β-Androsterone（100mg）をジクロロメタン溶液（15mL）に溶解させ、反応試液を調製した。本溶液に対し、20%の水酸化ナトリウム水溶液（15mL）にtert-butyl-hydroperoxide（30mg）を溶解した溶液を加え、室温にて2時間撹拌させて反応させた。反応液から有機層を回収し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（24×240 mm，10%メタノール−クロロホルム）にて精製後、本化合物88mgを得た。本化合物の同定は、1H-NMR、ESI-HR-MS およびm.p.(融点)により行った。
反応試液
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
10mM MgCl2
6mM thio-NAD
1mM NADH
0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
40U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
5、10、25、50、100、250 pg/ml Horseradish peroxidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125pg/ml）
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
10mM MgCl2
6mM thio-NAD
1mM NADH
0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
40U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
試料
5、10、25、50、100、250 pg/ml Horseradish peroxidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125pg/ml）
測定方法
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Horseradish peroxidase）（以下HRPと称する。）を0〜250pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝液（pH7.0）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液を50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性の良い直線を図22に示す。
平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Horseradish peroxidase）（以下HRPと称する。）を0〜250pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝液（pH7.0）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液を50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性の良い直線を図22に示す。
＜実施例15＞
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
10mM MgCl2
6mM thio-NAD
1mM NADH
0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
40U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
10mM MgCl2
6mM thio-NAD
1mM NADH
0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
40U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
測定方法
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜2.5ng/mlの範囲で含有する、0.1%BSA含有TBS（pH7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5% Triton X-100含有TBS（pH7.5）で洗浄し、HRP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1% BSA含有TBS（pH7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5% Triton X-100含有TBS（pH7.5）で洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性の良い直線を図23に示す。
参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜2.5ng/mlの範囲で含有する、0.1%BSA含有TBS（pH7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5% Triton X-100含有TBS（pH7.5）で洗浄し、HRP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1% BSA含有TBS（pH7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5% Triton X-100含有TBS（pH7.5）で洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性の良い直線を図23に示す。
<参考例9>
3α-benzoyl-peroxy-5β-Androsteroneおよび3α-acetyl-peroxy-5β- Androsteroneの合成方法
実施例14に示した3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone の合成方法において、tert-butyl-hydroperoxideをbenzoyl-hydroperoxide またはacetyl-hydroperoxideに替えた以外は同様にして表題化合物を得た。
3α-benzoyl-peroxy-5β-Androsteroneおよび3α-acetyl-peroxy-5β- Androsteroneの合成方法
実施例14に示した3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone の合成方法において、tert-butyl-hydroperoxideをbenzoyl-hydroperoxide またはacetyl-hydroperoxideに替えた以外は同様にして表題化合物を得た。
本発明は、高感度かつ簡便な測定が要求される臨床検査分野や食品検査分野において好適に利用可能である。
本発明は以下の通りである。
[1]
抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
(i) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[2]
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
(i) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[3]
前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[5]
前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、の基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[6]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[7]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[8]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[9]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[10]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[11]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[12]
下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
(式中、X、Y1およびY2の定義は、以下の(A)、(B)および(C)のいずれかである。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。)
[13]
X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[14]
X、Y1およびY2の定義は、(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[15]
X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[1]
抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[2]
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[3]
前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[5]
前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、の基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[6]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[7]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[8]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[9]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[10]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[11]
以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[12]
下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。)
[13]
X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[14]
X、Y1およびY2の定義は、(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[15]
X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2 は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
＜参考例ａ＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
＜参考例ｂ＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
＜参考例ｃ＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
＜参考例ｄ＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
＜参考例ｅ＞
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるHorseradish peroxidaseの測定
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるHorseradish peroxidaseの測定
＜参考例ｆ＞
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
10mM MgCl2
6mM thio-NAD
1mM NADH
0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
40U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
10mM MgCl2
6mM thio-NAD
1mM NADH
0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
40U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
Claims (15)
- 抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。 - 酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。 - 前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項1または2に記載の方法。 - 前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項1または2に記載の方法。 - 前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項1または2に記載の方法。 - 以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP - 以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP - 以下の(1)〜(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP - 以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP - 以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP - 以下の(1)〜(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP - 下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である。) - X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項12に記載のアンドロステロン誘導体。
- X、Y1およびY2の定義は、 (B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項12に記載のアンドロステロン誘導体。
- X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項12に記載のアンドロステロン誘導体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012533408A JP5265816B2 (ja) | 2011-03-23 | 2012-03-23 | タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011063559 | 2011-03-23 | ||
| JP2011063559 | 2011-03-23 | ||
| JP2012533408A JP5265816B2 (ja) | 2011-03-23 | 2012-03-23 | タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 |
| PCT/JP2012/057422 WO2012128338A1 (ja) | 2011-03-23 | 2012-03-23 | タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP5265816B2 JP5265816B2 (ja) | 2013-08-14 |
| JPWO2012128338A1 true JPWO2012128338A1 (ja) | 2014-07-24 |
Family
ID=46879477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012533408A Active JP5265816B2 (ja) | 2011-03-23 | 2012-03-23 | タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9851309B2 (ja) |
| EP (3) | EP2987866B1 (ja) |
| JP (1) | JP5265816B2 (ja) |
| ES (3) | ES2613619T3 (ja) |
| HK (2) | HK1221743A1 (ja) |
| WO (1) | WO2012128338A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3152410A1 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Sage Therapeutics, Inc. | 3,3-disubstituted 19-nor pregnane compounds, compositions, and uses thereof for the treatment of cns related disorders |
| IL310501A (en) | 2012-12-18 | 2024-03-01 | Washington University St Louis | Neuroactive steroids converted at the 19th position to the 17th position, their prodrugs, and methods of treatment using them |
| JP2014124165A (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-07 | Bl:Kk | タンパク質および核酸の高感度測定法、キット並びに酵素組成物 |
| WO2014169836A1 (en) | 2013-04-17 | 2014-10-23 | Sage Therapeutics, Inc. | 19-nor neuroactive steroids and methods of use thereof |
| IL286794B2 (en) | 2013-04-17 | 2024-06-01 | Sage Therapeutics Inc | 19- NOR C3, 3- dimomer C21- N- pyrazole Steroids and methods of using them |
| WO2014169831A1 (en) | 2013-04-17 | 2014-10-23 | Sage Therapeutics, Inc. | 19-nor c3,3-disubstituted c21-c-bound heteroaryl steroids and methods of use thereof |
| RS60420B1 (sr) | 2013-04-17 | 2020-07-31 | Sage Therapeutics Inc | 19-nor neuroaktivni steroidi za metode lečenja |
| RU2754534C2 (ru) | 2013-07-19 | 2021-09-03 | Сейдж Терапьютикс, Инк. | Нейроактивные стероиды, композиции и их использование |
| DK3488852T3 (da) | 2013-08-23 | 2021-02-01 | Sage Therapeutics Inc | Neuroaktive steroider, sammensætninger og anvendelser deraf |
| WO2015195962A1 (en) | 2014-06-18 | 2015-12-23 | Sage Therapeutics, Inc. | Neuroactive steroids, compositions, and uses thereof |
| CN107404877A (zh) | 2014-10-16 | 2017-11-28 | 萨奇治疗股份有限公司 | 靶向cns 障碍的组合物和方法 |
| WO2016061537A1 (en) | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Sage Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating cns disorders |
| SI3224269T1 (sl) | 2014-11-27 | 2020-10-30 | Sage Therapeutics, Inc. | Sestavki in metode za zdravljenje CNS motenj |
| PL3250210T3 (pl) | 2015-01-26 | 2021-07-26 | Sage Therapeutics, Inc. | Kompozycje i sposoby leczenia zaburzeń OUN |
| JP6875996B2 (ja) | 2015-02-20 | 2021-05-26 | セージ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 神経刺激性ステロイド、組成物、およびその使用 |
| JP6960210B2 (ja) | 2016-03-30 | 2021-11-05 | 悦朗 伊藤 | タンパク質及び核酸の超高感度測定方法 |
| EP3481844B1 (en) | 2016-07-11 | 2024-04-17 | Sage Therapeutics, Inc. | C7, c12, and c16 substituted neuroactive steroids and their methods of use |
| AU2017297375B2 (en) | 2016-07-11 | 2022-09-15 | Sage Therapeutics, Inc. | C17, C20, and C21 substituted neuroactive steroids and their methods of use |
| SG11202112391UA (en) | 2019-05-31 | 2021-12-30 | Sage Therapeutics Inc | Neuroactive steroids and compositions thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR83554E (fr) | 1961-07-21 | 1964-09-04 | Roussel Uclaf | Procédé pour la préparation de dérivés de l'étiocholane |
| US6011023A (en) * | 1997-08-27 | 2000-01-04 | Alcon Laboratories, Inc. | Angiostatic steroids |
| WO2008117816A1 (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Etsuro Ito | タンパク質および核酸の超高感度測定法 |
| JP4904298B2 (ja) * | 2008-03-03 | 2012-03-28 | 学校法人村崎学園 徳島文理大学 | ステロイド５α−レダクターゼ活性の測定方法およびそれに用いるキット |
| JP6960210B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2021-11-05 | 悦朗 伊藤 | タンパク質及び核酸の超高感度測定方法 |
-
2012
- 2012-03-23 US US14/006,317 patent/US9851309B2/en active Active
- 2012-03-23 JP JP2012533408A patent/JP5265816B2/ja active Active
- 2012-03-23 EP EP15187872.5A patent/EP2987866B1/en active Active
- 2012-03-23 ES ES12759947.0T patent/ES2613619T3/es active Active
- 2012-03-23 EP EP17197044.5A patent/EP3296405B1/en active Active
- 2012-03-23 WO PCT/JP2012/057422 patent/WO2012128338A1/ja active Application Filing
- 2012-03-23 ES ES17197044T patent/ES2762098T3/es active Active
- 2012-03-23 EP EP12759947.0A patent/EP2695948B1/en active Active
- 2012-03-23 ES ES15187872.5T patent/ES2657986T3/es active Active
-
2016
- 2016-08-16 HK HK16109783.4A patent/HK1221743A1/zh unknown
-
2017
- 2017-12-18 US US15/845,702 patent/US11221299B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-30 HK HK18105590.3A patent/HK1246360A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1246360A1 (zh) | 2018-09-07 |
| HK1221743A1 (zh) | 2017-06-09 |
| US20140017675A1 (en) | 2014-01-16 |
| ES2613619T3 (es) | 2017-05-24 |
| US20180106727A1 (en) | 2018-04-19 |
| ES2762098T3 (es) | 2020-05-22 |
| ES2657986T3 (es) | 2018-03-07 |
| EP2695948B1 (en) | 2016-12-28 |
| EP2695948A1 (en) | 2014-02-12 |
| EP2987866A3 (en) | 2016-06-15 |
| US11221299B2 (en) | 2022-01-11 |
| WO2012128338A1 (ja) | 2012-09-27 |
| EP3296405B1 (en) | 2019-10-09 |
| JP5265816B2 (ja) | 2013-08-14 |
| EP2695948A4 (en) | 2015-04-08 |
| EP3296405A1 (en) | 2018-03-21 |
| EP2987866A2 (en) | 2016-02-24 |
| EP2987866B1 (en) | 2017-12-06 |
| US9851309B2 (en) | 2017-12-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5265816B2 (ja) | タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 | |
| US8329401B2 (en) | Enzyme-catalyzed metal deposition for the enhanced detection of analytes of interest | |
| US7704752B2 (en) | Signalling compounds for use in methods of detecting hydrogen peroxide | |
| AU622904B2 (en) | Enzyme activity determinations method characterized by the using of substrates whose fluorescent properties differs those of the converted products | |
| JPH05501203A (ja) | 増幅化学ルミネセントアッセイ | |
| JP2001516589A (ja) | 化学ルミネセンス化合物及び方法 | |
| US6162610A (en) | Xanthan-ester and acridan substrates for horseradish peroxidase | |
| WO2012006351A1 (en) | In situ chemiluminescent substrates and assays | |
| US20170321245A1 (en) | Flash and Glow 1,2-Dioxetanes | |
| JPH0859686A (ja) | ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法 | |
| Nakazono et al. | Synthesis, chemiluminescence, and application of 2, 4-disubstituted phenyl 10-methyl-10λ4-acridine-9-carboxylates | |
| JP5500985B2 (ja) | タンパク質および核酸の超高感度測定法 | |
| JP2014124165A (ja) | タンパク質および核酸の高感度測定法、キット並びに酵素組成物 | |
| JP3471874B2 (ja) | 化学発光によるホスファターゼの酵素活性測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120913 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120913 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20120913 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20121023 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121030 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130219 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130423 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130501 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5265816 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| S631 | Written request for registration of reclamation of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313631 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S201 | Request for registration of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314201 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S211 | Written request for registration of transfer of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314211 |
|
| S804 | Written request for registration of cancellation of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314803 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |