JP6960210B2 - タンパク質及び核酸の超高感度測定方法 - Google Patents
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Description
[1]
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量が、
NADHおよび/またはNADPH、チオNADおよび/またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび/またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび/またはNADPHから生成した、NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする方法。
[2]
前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、[1]に記載の方法。
[3]
酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量が、
NADHおよび/またはNADPH、チオNADおよび/またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび/またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび/またはNADPHから生成した、NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする方法。
[4]
前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、[3]に記載の方法。
[5]
前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼである[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
前記酵素サイクリング反応の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ以外のデヒドロゲナーゼである[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
前記酵素サイクリング反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で表される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素である、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]
前記抗体酵素複合体の酵素または前記酵素標識核酸プローブの酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
以下の(1)〜(6)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび/またはNADPH、
(5)チオNADおよび/またはチオNADP、
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
[10]
以下の(1)〜(6)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび/またはNADPH、
(5)チオNADおよび/またはチオNADP、
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
[11]
前記(6)の酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼである[9]及び[10]のいずれかに記載のキット。
[12]
前記(6)の酵素反応系は、基質が、(1)の酵素の基質及び(3)のデヒドロゲナーゼの基質にならず、酵素が、(2)の基質及び(5)のチオNADおよび/またはチオNADPと反応しない、[9]〜[11]のいずれかに記載のキット。
[13]
前記(3)のデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSD)であり、
前記(6)の酵素反応系の酵素は、HSD(ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ)以外のデヒドロゲナーゼである[9]〜[12]のいずれかに記載のキット。
[14]
前記(6)の酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で評される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素である、[9]〜[13]のいずれかに記載のキット。
[15]
前記(1)の抗体標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である、[9]、[11]〜[14]のいずれかに記載のキット。
[16]
前記(1)の核酸プローブ標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である、[10]〜[14]のいずれかに記載のキット。
チオ-NAD(P)+は、チオNADおよび/またはチオNADPと同義であり、
チオ-NAD(P)Hは、チオNADHおよび/またはチオNADPHと同義である。
また、デヒドロゲナーゼ(DH)は、脱水素酵素と同義である。
本発明は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法及び酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法(以下、「本発明の方法」と総称する)に関する。酵素測定方法における抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量、及び核酸プローブ測定方法における酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび/またはNADPH、チオNADおよび/またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび/またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる。
法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。
(2)ロイシンデヒドロゲナーゼ及びロイシン、
(3)アラニンデヒドロゲナーゼ及びアラニン、
(4)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びフェニルアラニン、
(5)セリンデヒドロゲナーゼ及びセリン、
(6)バリンデヒドロゲナーゼ及びバリン、
(7)リシンデヒドロゲナーゼ及びリシン、
(8)トリプトファンデヒドロゲナーゼ及びトリプトファン
(9)アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸
(10)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸、
(11)D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びD-3-ヒドロキシ酪酸、
(12)乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸、
(13)グリセロールデヒドロゲナーゼ及びグリセロール
(14)グリセリン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセリン酸
(15)イソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸
(1)抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの濃度範囲
0.01μg/ml〜1 mg/ml
(2)標識酵素の基質の濃度範囲
1μM〜500 mM
(3)NADHおよび/またはNADPHの濃度範囲
0.01 mM〜50 mM
(4)チオNADおよび/またはチオNADPの濃度範囲
0.01 mM〜100 mM
(5)デヒドロゲナーゼ(DH)の濃度範囲
0.01 u/ml〜 5000u/ml
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素の濃度範囲
0.01 u/ml〜5000 u/ml
(7)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素の基質の濃度範囲
1μM〜500 mM
本発明は、反応性担体に標識化された酵素およびその基質、サイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADH、並びにNADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系(酵素および基質)を含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび/またはNADPH、
(5)チオNADおよび/またはチオNADP、
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび/またはNADPH、
(5)チオNADおよび/またはチオNADP、
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
結核菌群に特異的な分泌タンパク質であるMPB64に対するモノクローナル抗体を使用し、当該抗体の標識酵素としてアルカリホスファターゼ(Alkaline phosphatase、以下「ALP」と記す。)、その基質として17β-メトキシ 5β-アンドロスタン 3-ホスフェート(17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate、以下「A3P」と記す。)を用い、酵素サイクリングの酵素として3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-Hydroxysteroid dehydrogenase、以下「3α-HSD」と記す。)を用いた酵素サイクリング反応を行い、更に前記反応の結果生じたNADを補酵素として消費しNADHを生成する酵素反応を組み合わせる方法にて実施した。
マイコバクテリウムボビス BCG Tokyo株(以下「BCG」と記す。)をミドルブルック7H11液体培地に接種し、所定濁度まで培養し培養上清を得た。得られた培養上清を濁度McFarland No.1相当(濃度1x108 cfu/ml相当)に調製し被験試料とした。
参考例1など常法により得た精製MPB64を免疫用抗原として、当該タンパク質に対するモノクローナル抗体を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従って行った。
最終的にMPB64と反応するモノクローナル抗体産生細胞を最終的に2クローン得た。以下、それぞれのクローンが産生する抗体をモノクローナル抗体BL001、BL002と称する。
参考例2にて得られたモノクローナル抗体BL001を100mM 酢酸緩衝液(pH3.8)を用いて透析操作を行った。30分間の透析操作を3回行った。その透析後の抗体溶液に抗体量に対し5%になるようにペプシンを添加し、37℃で2時間加温した後に1.5M トリス塩酸緩衝液(pH8.8)を添加して中和した。反応溶液の一部をSDS(Sodium dodecyl sulfate)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、ペプシン消化処理によりF(ab')2が生成していることを確認した後、Superdex 200 pgを充填したカラム(GEヘルスケア・ジャパン社の製品)を用いて精製し、F(ab')2フラクションを得た。得られたF(ab')2溶液を濃度1mg/mlに調製した。
参考例2にて得られたモノクローナル抗体BL002を10mMトリス塩酸緩衝生理食塩水(pH7.5、以下「TBS」と記す。)にて20μg/mlに調製した。得られた抗体溶液を平底マイクロプレートの各ウェルに100μlずつ加え37℃で1時間静置した。その後、0.05% Tween20含有TBSにて複数回洗浄し、1% ウシ血清アルブミン(以下「BSA」と記す)含有TBS溶液を350μlずつ添加し、室温で1時間静置してブロッキング処理をした。ウェル内の溶液を除去した後、風乾させ、モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを作製した。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液として以下の様に調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
参考例4にて作製したモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、参考例1で調製した被験試料をサンプル希釈液(0.1% BSAおよび0.01% Tween20を含むTBS)で1x105倍希釈したものを100μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄し、参考例3にて作製したALP標識Fab抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する抗体溶液を100μl加え、室温にて1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄した。次に各ウェルに前記反応試液1を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー(コロナ社製SH-9000)で405nmのフィルターを使用し、反応試液添加後5分ごとに各ウェルの吸光度を測定した。なお、被験試料を添加せずサンプル希釈液のみを同様に測定したものをブランク値とし、測定値からブランク値を差し引いた吸光度(以下「ΔO.D.」と記す。)を算出した。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図1に示す。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Glutamate Dehydrogenase、微生物由来)及び前記酵素基質としてL-グルタミン酸(L-Glutamate)を加え、以下に示す反応試液2を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml Glutamate Dehydrogenase
2.0 mM L-Glutamate
参考例4にて作製したモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、参考例1で調製した被験試料をサンプル希釈液(0.1% BSAおよび0.01% Tween20を含むTBS)で1x105倍希釈したものを100μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄し、参考例3にて作製したALP標識Fab抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する抗体溶液を100μl加え、室温にて1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄した。次に各ウェルに前記反応試液2を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー(コロナ社製SH-9000)で405nmのフィルターを使用し、反応試液添加後5分ごとに各ウェルの吸光度を測定した。被験試料を添加せずサンプル希釈液のみを同様に測定したものをブランク値とし、測定値からブランク値を差し引いた吸光度(以下「ΔO.D.」と記す。)を算出した。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、ロイシンデヒドロゲナーゼ(Leucine dehydrogenase、Bacillus sp.由来)及び前記酵素基質としてL-ロイシン(L-Leucine)を加え、以下に示す反応試液3を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml Leucine dehydrogenase
2.0 mM L-Leucine
測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図3に示す。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、アラニンデヒドロゲナーゼ(Alanine dehydrogenase、Bacillus cereus遺伝子組み換え大腸菌由来)及び前記酵素基質としてL-アラニン(L-Alanine)を加え、以下に示す反応試液4を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml Alanine dehydrogenase
2.0 mM L-Alanine
測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図4に示す。
反応試液4を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、アラニンデヒドロゲナーゼによるL-アラニンからピルビン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(L-Phenylalanine dehydrogenase、Sporosarcina sp.由来)及び前記酵素基質としてL-フェニルアラニン(L-Phenylalanine)を加え、以下に示す反応試液5を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml L-Phenylalanine dehydrogenase
2.0 mM L-Phenylalanine
測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図5に示す。
反応試液5を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼによるL-フェニルアラニンからフェニルピルビン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Malate dehydrogenase、微生物由来)及び前記酵素基質としてリンゴ酸(L-Malate)を加え、以下に示す反応試液6を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml Malate dehydrogenase
2.0 mM L-Malate
測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図6に示す。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase 、Pseudomonas sp.由来)及び前記酵素基質としてD-3-ヒドロキシ酪酸(D-3-Hydroxybutyrate)を加え、以下に示す反応試液7を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase
2.0 mM D-3-Hydroxybutyrate
測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図7に示す。
反応試液7を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによるD-3-ヒドロキシ酪酸からアセト酢酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、L-乳酸デヒドロゲナーゼ(Lactate Dehydrogenase、遺伝子組み換え大腸菌由来)及び前記酵素基質としてL-乳酸(L-lactate)を加え、以下に示す反応試液8を調製し測定を行った。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml Lactate Dehydrogenase
2.0 mM L-lactate
測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図8に示す。
反応試液8を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、L-乳酸デヒドロゲナーゼによるL-乳酸からピルビン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
参考例1で調製した被験試料をサンプル希釈液で希釈倍数1X107、1X106、1X105、1X104、1X103倍に希釈した各被験試料を実施例1にて調製した反応試液2を用い、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応を組み合わせた酵素サイクリング法(以下「改良法」と称する)により被験試料中のMPB64の測定を実施した。対照として、比較例1にて調製した反応試液1を用いた従来の酵素サイクリング法(従来法、特許文献2に記載の方法に準じた方法)により同希釈系列の被験試料を測定した。
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 9.0)
2.0 mM チオNAD
0.5 mM NADH
0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
20 U/ml Glutamate Dehydrogenase
2.0 mM L-Glutamate
測定は、希釈倍数1X107、1X106、1X105、1X104、1X103倍に希釈し調製した各被験試料を反応試液1(従来法)と反応試液2(改良法)による二方法で測定した。それ以外は実施例1に記載した方法に準拠して行った。反応試液添加60分後のΔO.D.をプロットしたグラフを図9に示す。
Claims (13)
- 抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量が、
NADHおよび/またはNADPH、チオNADおよび/またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび/またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび/またはNADPHから生成した、NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させること、並びに前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、以下の(i)〜(ix)のいずれかの酵素と基質の組み合わせであることを特徴とする方法。
(i)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸、
(ii)ロイシンデヒドロゲナーゼ及びロイシン、
(iii)アラニンデヒドロゲナーゼ及びアラニン、
(iv)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びフェニルアラニン、
(v)セリンデヒドロゲナーゼ及びセリン、
(vi)バリンデヒドロゲナーゼ及びバリン、
(vii)トリプトファンデヒドロゲナーゼ及びトリプトファン、
(viii)アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸、
(ix)D−3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びD−3−ヒドロキシ酪酸 - 酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量が、
NADHおよび/またはNADPH、チオNADおよび/またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび/またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび/またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび/またはNADPHから生成した、NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させること、並びに前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、以下の(i)〜(ix)のいずれかの酵素と基質の組み合わせであることを特徴とする方法。
(i)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸、
(ii)ロイシンデヒドロゲナーゼ及びロイシン、
(iii)アラニンデヒドロゲナーゼ及びアラニン、
(iv)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びフェニルアラニン、
(v)セリンデヒドロゲナーゼ及びセリン、
(vi)バリンデヒドロゲナーゼ及びバリン、
(vii)トリプトファンデヒドロゲナーゼ及びトリプトファン、
(viii)アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸、
(ix)D−3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びD−3−ヒドロキシ酪酸 - 前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素と基質の組み合わせは、(i)〜(iv)及び(ix)のいずれかの酵素と基質の組み合わせである請求項1または2に記載の方法。
- 前記酵素サイクリング反応の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記酵素サイクリング反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、CH−OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.−で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.−で表される酵素群、CH−CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.−で表される酵素群、CH−NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.−で表される酵素群、CH−NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.−で表される酵素群の中から選択される酵素である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記抗体酵素複合体の酵素または前記酵素標識核酸プローブの酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 以下の(1)〜(6)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび/またはNADPH、
(5)チオNADおよび/またはチオNADP、
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系、
但し、前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系(6)は、基質が、(1)の酵素の基質及び(3)のデヒドロゲナーゼの基質にならず、かつ酵素が、(2)の基質及び(5)のチオNADおよび/またはチオNADPと反応しない酵素であり、以下の(i)〜(ix)のいずれかの酵素と基質の組み合わせである。
(i)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸、
(ii)ロイシンデヒドロゲナーゼ及びロイシン、
(iii)アラニンデヒドロゲナーゼ及びアラニン、
(iv)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びフェニルアラニン、
(v)セリンデヒドロゲナーゼ及びセリン、
(vi)バリンデヒドロゲナーゼ及びバリン、
(vii)トリプトファンデヒドロゲナーゼ及びトリプトファン、
(viii)アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸、
(ix)D−3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びD−3−ヒドロキシ酪酸 - 以下の(1)〜(6)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび/またはNADPH、
(5)チオNADおよび/またはチオNADP、
(6)NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系、
但し、前記NADおよび/またはNADPを選択的に還元する酵素反応系(6)は、基質が、(1)の酵素基質及び(3)のデヒドロゲナーゼ基質にならず、かつ酵素が、(2)の基質及び(5)のチオNADおよび/またはチオNADPと反応しない酵素であり、以下の(i)〜(ix)のいずれかの酵素と基質の組み合わせである。
(i)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸、
(ii)ロイシンデヒドロゲナーゼ及びロイシン、
(iii)アラニンデヒドロゲナーゼ及びアラニン、
(iv)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びフェニルアラニン、
(v)セリンデヒドロゲナーゼ及びセリン、
(vi)バリンデヒドロゲナーゼ及びバリン、
(vii)トリプトファンデヒドロゲナーゼ及びトリプトファン、
(viii)アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸、
(ix)D−3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びD−3−ヒドロキシ酪酸 - 前記(6)の酵素反応系の酵素と基質の組み合わせは、(i)〜(iv)及び(ix)のいずれかの酵素と基質の組み合わせである請求項7及び8のいずれかに記載のキット。
- 前記(3)のデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSD)である請求項7〜9のいずれかに記載のキット。
- 前記(6)の酵素反応系の酵素は、CH−OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.−で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.−で評される酵素群、CH−CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.−で表される酵素群、CH−NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.−で表される酵素群、CH−NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.−で表される酵素群の中から選択される酵素である、請求項7〜10のいずれかに記載のキット。
- 前記(1)の抗体標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である、請求項7、9〜11のいずれかに記載のキット。
- 前記(1)の核酸プローブ標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である、請求項8〜11のいずれかに記載のキット。
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
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C03 | Trial/appeal decision taken |
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C30A | Notification sent |
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A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
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R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
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S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
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S531 | Written request for registration of change of domicile |
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R350 | Written notification of registration of transfer |
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