WO2017169565A1 - タンパク質及び核酸の超高感度測定方法 - Google Patents

タンパク質及び核酸の超高感度測定方法 Download PDF

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悦朗 伊藤
敏明 三浦
昭毅 吉村
渡部　聡
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悦朗 伊藤
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    • G01N2333/90209—Oxidoreductases (1.) acting on NADH or NADPH (1.6), e.g. those with a heme protein as acceptor (1.6.2) (general), Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2) or NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)

Definitions

  • the present invention relates to an ultrasensitive measurement method for proteins and nucleic acids. More specifically, the present invention relates to a highly sensitive measurement method and kit for proteins and nucleic acids using enzyme immunoassay and nucleic acid probe measurement.
  • the present invention amplifies thio-NAD (P) H by a thio-NAD cycling method using an enzyme reaction product produced by an enzyme labeled with an antibody or a nucleic acid probe as a substrate, thereby increasing the ultrahigh target protein and nucleic acid.
  • the present invention relates to a method and a kit in which the amplification of thio-NAD (P) H by the thio-NAD cycling method is further enhanced in a method enabling sensitivity measurement.
  • ELISA method enzyme immunoassay
  • PCR method a method of using a PCR method for nucleic acid measurement.
  • Enzyme immunoassays have been developed with higher sensitivity (10 -15 mole) from the original colorimetric method (10 -13 mole) to the fluorescence method and luminescence method, and the development and improvement of dedicated measuring devices are also progressing.
  • the sensitivity has reached its limit just by making the measurement operation simple.
  • nucleic acid quantification is strictly difficult considering the problem of target-specific signal detection, the problem of amplification efficiency, the conditions under which the PCR product reaches a plateau, and the like.
  • Patent Document 1 describes an enzyme measurement method using an antibody-enzyme complex using a thio NAD cycling method and a nucleic acid probe measurement method using an enzyme-labeled nucleic acid probe. ing.
  • Patent Document 1 WO2008 / 117816
  • Patent Document 2 WO2012 / 128338 The entire description of Patent Documents 1 and 2 is specifically incorporated herein by reference.
  • an enzyme immunoassay is combined with an enzyme cycling method using a product of a labeled enzyme used in the enzyme immunoassay as a substrate.
  • thio-NAD (P) H is geometrically amplified as a signal substance, and this is a method capable of quantitatively quantifying or visually detecting a protein or nucleic acid by a colorimetric method.
  • Patent Document 2 is more improved than the method described in Patent Document 1, in which the reactivity between the labeled enzyme and the substrate and the substrate for the labeled enzyme avoid partial inhibition of the enzyme reaction in the enzyme cycling method. It is a method.
  • a substrate (reduced form) is generated by the enzyme immunoassay method or nucleic acid probe method, which is the first step, and has absorption at 400 nm from this substrate (reduced form), NAD (P) H and thio-NAD (P) + Thio-NAD (P) H is produced, and the amount of thio-NAD (P) H produced is quantified or visually detected.
  • dehydrogenase tends to be inhibited when the amount of NAD (P) H increases, whereas NAD (P) H
  • NAD (P) H If the amount is small, NAD (P) H in the reaction system is depleted early, and the reaction amount from thio-NAD (P) + to thio-NAD (P) H is small, and thio-NAD (P) H It was found that the detection sensitivity could not be increased because the production amount of was low. On the other hand, it was found that this problem can be solved by increasing the addition amount of thio-NAD (P) + and NAD (P) H without changing the ratio of both.
  • the amount of thio-NAD (P) H produced per unit time can be increased, the time to reach the same amount of thio-NAD (P) H can be shortened and the operation time can be shortened.
  • the present inventors have conducted various experimental studies to solve the above problems.
  • the enzyme cycling reaction system does not participate in the reaction of thio-NAD (P) + and thio-NAD (P) H, and reduces -NAD (P) + produced by the enzyme cycling reaction.
  • the present invention has been completed by finding that the above problem can be solved by coexisting a system for generating (regenerating) NAD (P) H.
  • the present invention is as follows. [1] Quantification of the reaction product of the enzyme-enzyme complex by the enzyme An enzymatic cycling reaction using NADH and / or NADPH, thioNAD and / or thioNADP, and dehydrogenase (DH) generates thioNADH and / or thioNADPH, and the amount of thioNADH and / or thioNADPH produced is determined.
  • DH dehydrogenase
  • An enzyme measurement method using an antibody-enzyme complex which is performed by measuring or measuring a color change caused by thio-NADH and / or thio-NADPH produced
  • An enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP produced from NADH and / or NADPH in the enzyme cycling reaction is allowed to coexist in the enzyme cycling reaction system.
  • the substrate does not become an enzyme substrate of an antibody enzyme complex and an enzyme substrate of an enzyme cycling reaction, and the enzyme is an enzyme of an antibody enzyme complex.
  • a method for measuring a nucleic acid probe using an enzyme-labeled nucleic acid probe which is performed by measuring or measuring a color change caused by thio-NADH and / or thio-NADPH generated,
  • An enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP produced from NADH and / or NADPH in the enzyme cycling reaction is allowed to coexist in the enzyme cycling reaction system.
  • the substrate is not the enzyme substrate of the enzyme-labeled nucleic acid probe and the enzyme substrate of the enzyme cycling reaction, and the enzyme is the enzyme of the enzyme-labeled nucleic acid probe.
  • the enzyme in the enzyme cycling reaction is hydroxysteroid dehydrogenase, and the enzyme in the enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP is a dehydrogenase other than hydroxysteroid dehydrogenase [1] to [5] The method of crab.
  • the enzyme of the enzyme cycling reaction system is hydroxysteroid dehydrogenase, and the enzyme of the enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP is EC number 1.1.1.- using CH-OH as an electron donor.
  • Enzyme group represented by EC number 1.5.1.- using CH-NH as an electron donor
  • the enzyme of the antibody-enzyme complex or the enzyme of the enzyme-labeled nucleic acid probe is at least one enzyme selected from the group consisting of alkaline phosphatase, glucosidase, galactosidase, fructosidase, man
  • An enzyme immunoassay kit comprising the following reagents (1) to (6): (1) an enzyme labeled with an antibody specific for a target protein antigen, (2) a substrate for the enzyme of (1) above, (3) dehydrogenase, (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP, (6) Enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP [10]
  • a kit for measuring a nucleic acid probe comprising the following reagents (1) to (6): (1) an enzyme labeled with a nucleic acid probe that specifically binds to a target nucleic acid, (2) a substrate for the enzyme of (1) above, (3) dehydrogenase, (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP, (6) Enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP [11]
  • the substrate is not a substrate of the enzyme of (1) and a substrate of the dehydrogenase of (3), and the enzyme is a substrate of (2) and (5) thio-NAD and / or The kit according to any one of [9] to [11], which does not react with thio-NADP.
  • the dehydrogenase of (3) is a hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)
  • HSD hydroxysteroid dehydrogenase
  • the enzyme of the enzyme reaction system of (6) is an enzyme group represented by EC number 1.1.1.- using CH-OH as an electron donor, EC number 1.2.1 using an aldehyde or oxo group as an electron donor.
  • Enzyme group evaluated by .- EC group having EC number 1.3.1.- using CH-CH as an electron donor, EC number 1.4.1.- using CH-NH 2 as an electron donor Any one of [9] to [13], wherein the enzyme is an enzyme selected from the group of enzymes represented by EC number 1.5.1.- using CH-NH as an electron donor Kit.
  • the enzyme of the antibody labeling enzyme of (1) is at least one enzyme selected from the group consisting of alkaline phosphatase, glucosidase, galactosidase, fructosidase, mannosidase, and peroxidase. 14]. [16] [10] to [14], wherein the enzyme of the nucleic acid probe labeling enzyme of (1) is at least one enzyme selected from the group consisting of alkaline phosphatase, glucosidase, galactosidase, fructosidase, mannosidase, and peroxidase.
  • the kit according to any one.
  • the measurement result of a comparative example (conventional method).
  • -NAD (P) + is synonymous with NAD and / or NADP
  • NAD (P) H is synonymous with NADH and / or NADPH
  • Thio-NAD (P) + is synonymous with thio-NAD and / or thio-NADP
  • Thio-NAD (P) H is synonymous with thio-NADH and / or thio-NADPH.
  • Dehydrogenase (DH) is synonymous with dehydrogenase.
  • the present invention relates to an enzyme measurement method using an antibody-enzyme complex and a nucleic acid probe measurement method using an enzyme-labeled nucleic acid probe (hereinafter collectively referred to as “method of the present invention”).
  • NADH and / or NADPH, thioNAD and / or thioNADP are used to quantify the reaction product of the enzyme-enzyme complex in the enzyme measurement method and the enzyme-labeled nucleic acid probe in the nucleic acid probe measurement method.
  • thio-NADH and / or thio-NADPH by an enzyme cycling reaction using dehydrogenase (DH), and the amount of thio-NADH and / or thio-NADPH produced is measured, or the thio-NADH and / or thio produced. This is done by measuring the color change caused by NADPH.
  • DH dehydrogenase
  • the antibody-enzyme complex used in the method of the present invention is obtained by labeling an enzyme with an antibody specific for a target protein antigen.
  • the enzyme-labeled nucleic acid probe is obtained by labeling an enzyme with a nucleic acid probe that specifically binds to a target nucleic acid.
  • the enzyme (labeled enzyme) of the antibody-enzyme complex or the enzyme-labeled nucleic acid probe include a transferase group represented by EC number 2.-, a hydrolase group represented by EC number 3.-, and EC number 4. It may be at least one enzyme selected from the group consisting of a removed additional enzyme group represented by-and an isomerase group represented by EC number 5.-. Reference can be made to paragraphs 0020 to 0024 of Patent Document 1 for specific examples of these enzymes.
  • the enzyme (labeled enzyme) of the antibody-enzyme complex or enzyme-labeled nucleic acid probe used in the method of the present invention is, for example, alkaline phosphatase (ALP), galactosidase, glucosidase, fructosidase, mannosidase or It can be a peroxidase.
  • ALP alkaline phosphatase
  • galactosidase glucosidase
  • fructosidase fructosidase
  • mannosidase mannosidase
  • the method of the present invention can be carried out in the same manner as the usual enzyme immunoassay method or nucleic acid probe method.
  • a solid phase carrier used for normal measurement such as a solid phase carrier to which an antibody or nucleic acid probe that specifically binds to the analyte is fixed, such as a microplate, plastic tube, or magnetic bead. Can do.
  • Antibody-enzyme complexes and nucleic acid probe-enzyme complexes can be prepared by conventional methods.
  • the antibody constituting the antibody-enzyme complex can be appropriately selected from antibodies that specifically bind to the analyte to be measured by the enzyme immunoassay method of the present invention.
  • the enzyme immunoassay method of the present invention is used for protein analysis.
  • the antibody of the antibody-enzyme complex is an antibody that specifically binds to the protein as the analyte.
  • a substrate on which an antibody that specifically binds to the protein as the analyte is fixed to the surface is used.
  • the antibody constituting the antibody-enzyme complex and the antibody to be fixed to the substrate may be antibody fragments.
  • the analyte in the enzyme immunoassay method of the present invention is not limited to a protein, and can be any substance other than the protein to be measured by a normal enzyme immunoassay method.
  • a probe complementary to the nucleic acid to be measured can be selected as appropriate for the nucleic acid probe enzyme complex.
  • the quantification of the reaction product by the enzyme of the antibody-enzyme complex or the enzyme-labeled nucleic acid probe is performed using NADH and / or NADPH, thioNAD and / or thioNADP, and dehydrogenase (DH).
  • NADH and / or NADPH NADH and / or NADPH
  • thioNAD and / or thioNADP a dehydrogenase
  • DH dehydrogenase
  • the method of the present invention is characterized in that an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP produced from NADH and / or NADPH in the enzyme cycling reaction coexists in the enzyme cycling reaction system.
  • an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP means that coexisting thioNAD and / or thioNADP is not substantially reduced.
  • the enzyme cycling reaction system is not involved in the reaction of thio-NAD (P) + and thio-NAD (P) H, but reduces NAD (P) produced in the enzyme cycling reaction.
  • NAD NAD
  • the enzyme reaction system does not have a substrate as an enzyme substrate of an antibody-enzyme complex and an enzyme substrate of an enzyme cycling reaction, and the enzyme is an enzyme of an antibody-enzyme complex.
  • An enzyme that does not react with the substrate and the substrate of the enzyme in the enzyme cycling reaction is preferred.
  • the enzyme reaction system is such that the substrate is not the enzyme substrate of the enzyme-labeled nucleic acid probe and the enzyme substrate of the enzyme cycling reaction, and the enzyme is the enzyme substrate of the enzyme-labeled nucleic acid probe. And an enzyme that does not react with the enzyme substrate of the enzyme cycling reaction.
  • the reaction for selectively reducing NAD and / or NADP used in the present invention is performed by an oxidoreductase using NAD and / or NADP as an electron acceptor.
  • an oxidoreductase using NAD and / or NADP as an electron acceptor.
  • dehydrogenase is preferable. This is because the enzyme used in the enzyme cycling reaction is also a dehydrogenase, and it is desirable that the optimum conditions are equivalent.
  • the enzyme in the enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP is preferably dehydrogenase.
  • the enzyme in the enzyme cycling reaction is also a dehydrogenase
  • the dehydrogenase that is an enzyme in the enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP and the dehydrogenase that is the enzyme in the enzyme cycling reaction are different substrates. Selected from dehydrogenases with specificity.
  • the dehydrogenase that is the enzyme of the enzyme cycling reaction is preferably a hydroxysteroid dehydrogenase
  • the enzyme in the enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP is a dehydrogenase other than hydroxysteroid dehydrogenase. I.e., a dehydrogenase having a substrate specificity different from that of the hydroxysteroid dehydrogenase.
  • the enzyme in the enzyme cycling reaction system is a dehydrogenase, preferably a hydroxysteroid dehydrogenase, and the enzyme in the enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP has a substrate specificity different from these dehydrogenases, Enzyme group represented by EC number 1.1.1.- using OH as an electron donor, enzyme group evaluated using EC number 1.2.1.- using aldehyde or oxo group as an electron donor, CH-CH as an electron Enzyme group represented by EC number 1.3.1.- as a donor, enzyme group represented by EC number 1.4.1.- using CH-NH 2 as an electron donor, and CH-NH as an electron donor It is preferably selected from the enzyme group represented by EC number 1.5.1.-.
  • Dehydrogenases included in the enzyme group represented by EC number 1.1.1.- are malate dehydrogenase, D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, iditol-2-dehydrogenase, galactitol dehydrogenase, glycerin.
  • Examples thereof include acid dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, gulonic acid-3-dehydrogenase, ribitol-2-dehydrogenase, gluconic acid-5-dehydrogenase, 3-isopropylmethyl dehydrogenase, glucose dehydrogenase, and galactose dehydrogenase.
  • Examples of the dehydrogenase included in the enzyme group represented by EC number 1.2.1.- include aldehyde dehydrogenase, malonic semialdehyde dehydrogenase, and succinic semialdehyde dehydrogenase.
  • Examples of the dehydrogenase included in the enzyme group represented by EC number 1.3.1.- include dihydrouracil dehydrogenase, acyl CoA dehydrogenase, and prefenate dehydrogenase.
  • the dehydrogenase included in the enzyme group represented by EC number 1.4.1.- is glutamate dehydrogenase, leucine dehydrogenase, alanine dehydrogenase, phenylalanine dehydrogenase, serine dehydrogenase, valine dehydrogenase, glycine dehydrogenase, lysine dehydrogenase, tryptophan dehydrogenase, aspartate dehydrogenase, etc. Is mentioned.
  • Examples of the dehydrogenase included in the enzyme group represented by EC number 1.5.1.- include methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, saccharopine dehydrogenase, and D-octopine dehydrogenase.
  • the enzyme that reduces NAD and / or NADP is appropriately selected in consideration of the substrate specificity of the dehydrogenase used in the enzyme cycling reaction. If the substrate used for the enzyme cycling reaction and the substrate structure of the enzyme that reduces NAD and / or NADP are similar, the substrate specificity may be lowered, so that the enzyme reaction is not affected. Select as appropriate.
  • the enzyme substrate that selectively reduces NAD preferably has no steroid skeleton.
  • substances that can be a substrate having no steroid skeleton include organic acids and amino acids.
  • enzymes that selectively reduce NAD using these substances as substrates include malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase.
  • Hydroxybutyrate dehydrogenase Hydroxybutyrate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, leucine dehydrogenase, alanine dehydrogenase, phenylalanine dehydrogenase, serine dehydrogenase, valine dehydrogenase, glycine dehydrogenase, lysine dehydrogenase, tryptophan dehydrogenase, aspartate dehydrogenase and the like.
  • the enzyme that selectively reduces NAD and / or NADP preferably takes into consideration the substrate specificity and the like for the labeling enzyme.
  • an enzyme that selectively reduces NAD and / or NADP is selected from an enzyme that uses a substance other than a substance having a phosphate group as a substrate.
  • Examples of the enzyme using a substance other than a substance having a phosphate group as a substrate include glutamate dehydrogenase, leucine dehydrogenase, alanine dehydrogenase, phenylalanine dehydrogenase, malate dehydrogenase, 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, galactose dehydrogenase, And so on.
  • glucosidase, galactosidase, fructosidase, mannosidase is used as a labeling enzyme
  • an enzyme using a substance other than a substance containing a sugar residue, such as glucose, galactose, fructose, mannose, as a substrate, NAD and / or NADP Is used as an enzyme that selectively reduces.
  • Examples of the enzyme using a substance other than a substance containing a sugar residue as a substrate include glutamate dehydrogenase, leucine dehydrogenase, alanine dehydrogenase, phenylalanine dehydrogenase, malate dehydrogenase, 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, and lactate dehydrogenase.
  • an enzyme that selectively reduces NAD and / or NADP using a substance other than a substance having a peroxide structure as a substrate is used.
  • the enzyme using a substance other than a substance having a peroxide structure as a substrate include glutamate dehydrogenase, leucine dehydrogenase, alanine dehydrogenase, phenylalanine dehydrogenase, malate dehydrogenase, 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, galactose dehydrogenase, etc. Can be mentioned.
  • the combination of an enzyme and a substrate in an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP is not intended to be limited, but examples thereof include the following combinations.
  • the concentration of each component can be set, for example, in the following range.
  • Concentration range of antibody-enzyme complex or enzyme-labeled nucleic acid probe 0.01 ⁇ g / ml to 1 mg / ml
  • Labeling enzyme substrate concentration range 1 ⁇ M to 500 mM 3.
  • NADH and / or NADPH concentration range 0.01 mM to 50 mM
  • the reaction conditions can be appropriately determined in consideration of the optimum temperature range of the enzyme in the enzyme reaction system that selectively reduces labeling enzyme, dehydrogenase (DH) and NAD and / or NADP.
  • the reaction temperature is preferably room temperature since the operation is simple. However, it can be carried out at a temperature higher or lower than room temperature in consideration of the optimum temperature range of the enzyme of the enzyme reaction system that selectively reduces the labeling enzyme, dehydrogenase (DH) and NAD and / or NADP.
  • the reaction time accumulates thio-NADH and / or thio-NADPH to such an extent that the amount of thio-NADH and / or thio-NADPH produced can be measured or the color change due to the produced thio-NADH and / or thio-NADPH can be measured Enough time.
  • the accumulation amount of thio-NADH and / or thio-NADPH necessary for measurement or measurement varies depending on the measurement or measurement conditions, and can be appropriately determined according to the conditions.
  • Cycle cycling using thio NAD (P) is a unique cycling system that appeared relatively recently.
  • the measurement principle of the thio NAD (P) cycling method is as described above, but is described again as follows.
  • Cycling systems using thio-NAD can be measured using popular absorption photometers and colorimetric microplate readers, making it possible to measure dehydrogenase activity based on increased absorption of NADH and its substrates.
  • Some of the conventional methods such as the quantitative method are improved to the method using thio NAD.
  • Patent Document 1 is the first example of using this cycling system as a detection system such as an enzyme immunoassay for enhancing sensitivity.
  • the amplification reaction can be further promoted by combining a labeling enzyme and a cycling system, and further using an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP, thereby further increasing sensitivity. It became possible to do.
  • the product produced by the enzyme complex and the substrate combined therewith is used as a substrate for the next enzyme cycling reaction, and the thiol produced by the enzyme cycling reaction is used. Colorimetric determination of NAD (P) H absorption.
  • the substrate of the enzyme cycling reaction may be a reduced substrate or an oxidized substrate.
  • NAD and / or NADP produced by the enzyme cycling reaction is selectively reduced by using an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP.
  • the present invention relates to an enzyme labeled with a reactive carrier and its substrate, an enzyme for cycling reaction and its coenzyme thio-NAD and NADH, and an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP (enzyme and A kit for the enzyme cycling method.
  • the reactive carrier represents an antibody, a nucleic acid probe, a lectin or the like having an activity to bind to a measurement object.
  • the reactive carrier is not particularly limited as long as it is suitable for the measurement target, and the labeling enzyme and its substrate are also suitable.
  • the present invention relates to a labeling enzyme and its substrate, an enzyme for cycling reaction and its coenzyme, thio-NAD and NADH, and an enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP (enzyme and substrate).
  • a kit for the enzyme cycling method is provided.
  • the kit of the present invention is an enzyme immunoassay kit containing the following reagents (1) to (6).
  • the present invention is a kit for measuring a nucleic acid probe comprising the following reagents (1) to (6).
  • an enzyme labeled with a nucleic acid probe that specifically binds to a target nucleic acid (2) a substrate for the enzyme of (1) above, (3) dehydrogenase, (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP, (6) Enzyme reaction system that selectively reduces NAD and / or NADP
  • the enzyme in the enzyme reaction system of (6) is preferably dehydrogenase.
  • the substrate is not a substrate of the enzyme of (1) and a substrate of the dehydrogenase of (3), and the enzyme is a substrate of (2) and (5) thio-NAD and / or An enzyme that does not react with thio-NADP is preferred.
  • the dehydrogenase (3) is preferably a hydroxysteroid dehydrogenase (HSD), and the enzyme in the enzyme reaction system (6) is preferably a dehydrogenase other than HSD (hydroxysteroid dehydrogenase).
  • HSD hydroxysteroid dehydrogenase
  • the enzyme of the enzyme reaction system of (6) is an enzyme group represented by EC number 1.1.1.- using CH-OH as an electron donor, EC number 1.2.1 using an aldehyde or oxo group as an electron donor. Enzyme group evaluated by .-, EC group having EC number 1.3.1.- using CH-CH as an electron donor, EC number 1.4.1.- using CH-NH 2 as an electron donor It is preferable that the enzyme is selected from the enzyme group represented by EC number 1.5.1.- using CH-NH as an electron donor.
  • the labeling enzyme (1) the dehydrogenase (DH) (3), the enzyme in the enzyme reaction system (6), their substrates, etc., those described in the method of the present invention can be used as they are.
  • the enzyme-labeled enzyme enzyme of (1) of the enzyme immunoassay kit and the enzyme of the nucleic acid probe-labeled enzyme of (1) of the nucleic acid probe assay kit are alkaline phosphatase, glucosidase, galactosidase, fructosidase, mannosidase , And at least one enzyme selected from the group consisting of peroxidases.
  • kit of the present invention a commercially available enzyme-labeled antibody or the like can be used in combination with the constituent reagents of this kit.
  • This kit can be used for an enzyme immunoassay method using an enzyme cycling method.
  • ALP alkaline phosphatase
  • A3P 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -androstane 3-phosphate (17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate, hereinafter referred to as “A3P”) as its substrate
  • 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase as an enzyme cycling enzyme (3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase, hereinafter referred to as “3 ⁇ -HSD”) is used to combine the enzyme reaction that consumes NAD generated as a result of the reaction as a coenzyme and generates NADH. Carried out.
  • Reference Example 1 Mycobacterium bovis BCG Tokyo strain (hereinafter referred to as “BCG”) was inoculated into Middlebrook 7H11 liquid medium and cultured to a predetermined turbidity to obtain a culture supernatant.
  • the obtained culture supernatant was prepared to have a turbidity equivalent to McFarland No. 1 (concentration equivalent to 1 ⁇ 10 8 cfu / ml) and used as a test sample.
  • Reference Example 2 Production of anti-MPB64 monoclonal antibody
  • a monoclonal antibody against the protein was produced. Production of the monoclonal antibody was performed according to a conventional method.
  • 2 clones of monoclonal antibody-producing cells that finally reacted with MPB64 were obtained.
  • the antibodies produced by the respective clones are referred to as monoclonal antibodies BL001 and BL002.
  • Reference Example 3 (Production of ALP-labeled antibody)
  • the monoclonal antibody BL001 obtained in Reference Example 2 was dialyzed using 100 mM acetate buffer (pH 3.8). The dialysis operation for 30 minutes was performed 3 times. Pepsin was added to the antibody solution after the dialysis so as to be 5% of the antibody amount, and the mixture was heated at 37 ° C. for 2 hours, and then neutralized by adding 1.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.8).
  • reaction solution was subjected to SDS (Sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and after confirming that F (ab ') 2 was produced by pepsin digestion, Superdex 200 pg was purified using a column (product of GE Healthcare Japan) packed with F to obtain F (ab ′) 2 fraction.
  • the obtained F (ab ′) 2 solution was prepared to a concentration of 1 mg / ml.
  • Tris-HCl buffer containing ALP of 17.14mg / ml pH7.0,5mM MgCl 2, 0.1mM ZnCl 2, 50% including glycerol
  • 0.1 ml PD-10 column GE Healthcare Japan product
  • the buffer was replaced with 50 mM sodium borate buffer (pH 7.6, containing 1 mM MgCl 2 and 0.1 mM ZnCl 2 ).
  • the obtained ALP solution was adjusted to 1 mg / ml.
  • EMCS dimethylformamide solution
  • ALP solution containing N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide
  • EMCS N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide
  • the Fab antibody solution prepared in the above reaction and the maleimidated ALP solution were mixed and reacted at 4 ° C. overnight.
  • the reaction solution was purified using a column packed with Superdex 200 pg to obtain an ALP-labeled Fab fraction.
  • the obtained ALP-labeled Fab solution was concentrated to a predetermined concentration to prepare an ALP-labeled Fab antibody solution.
  • Reference Example 4 (Preparation of a monoclonal antibody-immobilized microplate)
  • the monoclonal antibody BL002 obtained in Reference Example 2 was prepared to 20 ⁇ g / ml with 10 mM Tris-HCl buffered saline (pH 7.5, hereinafter referred to as “TBS”). 100 ⁇ l of the obtained antibody solution was added to each well of a flat bottom microplate and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the plate was washed several times with 0.05% Tween20-containing TBS, 1% bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”)-containing TBS solution was added 350 ⁇ l at a time, and allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking treatment. After removing the solution in the well, it was air-dried to produce a monoclonal antibody-immobilized microplate.
  • BSA bovine serum albumin
  • Reaction reagent 1 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase
  • Measuring method 100 ⁇ l of the monoclonal antibody-immobilized microplate prepared in Reference Example 4 diluted 1 ⁇ 10 5 times with the sample diluent (TBS containing 0.1% BSA and 0.01% Tween20) prepared in Reference Example 1 Added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, after removing the solution in the well by suction, it was washed three times with TBS containing 0.05% Tween 20, and 100 ⁇ l of an antibody solution containing the ALP-labeled Fab antibody prepared in Reference Example 3 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml was added. And shaken at room temperature for 1 hour.
  • Example 1 Measurement of MPB64 by enzyme cycling reaction combined with glutamate dehydrogenase
  • Glutamic acid is used as an ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody
  • NAD generated as a result of enzyme cycling reaction is reduced to NADH and recovered.
  • a dehydrogenase Glutamate Dehydrogenase, derived from a microorganism
  • L-glutamic acid L-Glutamate
  • Reaction reagent 2 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml Glutamate Dehydrogenase 2.0 mM L-Glutamate
  • Measuring method 100 ⁇ l of the monoclonal antibody-immobilized microplate prepared in Reference Example 4 diluted 1 ⁇ 10 5 times with the sample diluent (TBS containing 0.1% BSA and 0.01% Tween20) prepared in Reference Example 1 Added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, after removing the solution in the well by suction, it was washed three times with TBS containing 0.05% Tween 20, and 100 ⁇ l of an antibody solution containing the ALP-labeled Fab antibody prepared in Reference Example 3 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml was added. And shaken at room temperature for 1 hour.
  • the solution in the well was removed by suction, and then washed 3 times with TBS containing 0.05% Tween 20.
  • the absorbance of the wells was measured.
  • the absorbance obtained by subtracting the blank value from the measured value (hereinafter referred to as “ ⁇ O.D.”) was calculated by measuring the sample diluent in the same manner without adding the test sample.
  • Fig. 2 shows a graph plotting the obtained ⁇ O.D. Since ⁇ O.D. did not reach equilibrium even 60 minutes after addition of reaction reagent 2, NAD produced by the enzyme cycling reaction was converted into L-glutamic acid to ⁇ -ketoglutaric acid by the glutamate dehydrogenase. As a result, the reaction that consumes NAD as a coenzyme and generates NADH proceeds, and as a result, the decrease in NADH concentration in the enzyme cycling reaction test solution is suppressed, and it is confirmed that the reaction that generates thio-NADH continues. It was. Therefore, it was confirmed that the measurement method has a higher sensitivity and a wider measurement range than the measurement method based on the conventional enzyme cycling reaction shown in Comparative Example 1.
  • Example 2 (Measurement of MPB64 by enzyme cycling reaction combined with leucine dehydrogenase)
  • Leucine is used as a reaction system to reduce and recover NAD resulting from enzyme cycling reaction to NADH in enzyme cycling reaction reagent solution 1 using ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody, A3P as enzyme cycling reaction substrate and 3 ⁇ -HSD as enzyme cycling reaction enzyme.
  • Dehydrogenase Leucine dehydrogenase, derived from Bacillus sp.
  • L-leucine L-leucine
  • Reaction reagent 3 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml Leucine dehydrogenase 2.0 mM L-Leucine
  • Example 3 (Measurement of MPB64 by enzyme cycling reaction combined with alanine dehydrogenase) ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody, A3P as the enzyme cycling reaction substrate, and 3 ⁇ -HSD as the enzyme cycling reaction enzyme, and 1 Alanine as the reaction system to reduce and recover NAD resulting from the enzyme cycling reaction to NADH Dehydrogenase (derived from Alanine dehydrogenase, Bacillus cereus genetically modified Escherichia coli) and L-alanine (L-Alanine) as the enzyme substrate were added, and the reaction reagent 4 shown below was prepared and measured.
  • NADH Dehydrogenase derived from Alanine dehydrogenase, Bacillus cereus genetically modified Escherichia coli
  • L-alanine L-alanine
  • Reaction reagent 4 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml Alanine dehydrogenase 2.0 mM L-Alanine
  • Example 4 (Measurement of MPB64 by Enzyme Cycling Reaction Combined with Phenylalanine Dehydrogenase)
  • ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody, A3P as the enzyme cycling reaction substrate and 3 ⁇ -HSD as the enzyme cycling reaction enzyme are used in the enzyme cycling reaction test solution 1, and the reaction system for reducing and recovering NAD resulting from the enzyme cycling reaction to NADH is -Phenylalanine dehydrogenase (derived from L-Phenylalanine dehydrogenase, Sporosarcina sp.) And L-phenylalanine (L-Phenylalanine) as the enzyme substrate were added, and the following reaction sample solution 5 was prepared and measured.
  • Reaction reagent 5 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml L-Phenylalanine dehydrogenase 2.0 mM L-Phenylalanine
  • Example 5 Measurement of MPB64 by enzyme cycling reaction combined with malate dehydrogenase
  • An ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody, A3P as the enzyme cycling reaction substrate and 3 ⁇ -HSD as the enzyme cycling reaction enzyme are used in the enzyme cycling reaction test solution 1, and the reaction system for reducing and recovering NAD resulting from the enzyme cycling reaction to NADH is apple.
  • Acid dehydrogenase (Malate dehydrogenase, derived from a microorganism) and malic acid (L-Malate) as an enzyme substrate were added, and a reaction reagent 6 shown below was prepared and measured.
  • Reaction reagent 6 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml Malate dehydrogenase 2.0 mM L-Malate
  • Example 6 Measurement of MPB64 by enzyme cycling reaction combined with D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase
  • ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody, A3P as the enzyme cycling reaction substrate and 3 ⁇ -HSD as the enzyme cycling reaction enzyme are used in the enzyme cycling reaction test solution 1, and the reaction system for reducing and recovering NAD resulting from the enzyme cycling reaction to NADH is D -3-Hydroxybutyrate dehydrogenase (D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase, derived from Pseudomonas sp.) And D-3-hydroxybutyrate (D-3-Hydroxybutyrate) as the enzyme substrate were added, and the reaction solution 7 shown below was prepared and measured Went.
  • Reaction reagent 7 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase 2.0 mM D-3-Hydroxybutyrate
  • Example 7 Measurement of MPB64 by enzyme cycling reaction combined with lactate dehydrogenase
  • ALP-labeled anti-MPB64 Fab antibody, A3P as the enzyme cycling reaction substrate and 3 ⁇ -HSD as the enzyme cycling reaction enzyme are used in the enzyme cycling reaction test solution 1, and the reaction system for reducing and recovering NAD resulting from the enzyme cycling reaction to NADH is -Lactate dehydrogenase (derived from genetically modified E. coli) and L-lactic acid (L-lactate) as the enzyme substrate were added, and the following reaction sample solution 8 was prepared and measured.
  • Reaction reagent 8 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml Lactate Dehydrogenase 2.0 mM L-lactate
  • Example 8 Using the reaction sample solution 2 prepared in Example 1, each test sample diluted to 1 ⁇ 10 7 , 1 ⁇ 10 6 , 1 ⁇ 10 5 , 1 ⁇ 10 4 , 1 ⁇ 10 3 times with the sample dilution solution of the test sample prepared in Reference Example 1, Measurement of MPB64 in a test sample was performed by an enzyme cycling method (hereinafter referred to as “improved method”) in which NAD was consumed as a coenzyme to generate NADH. As a control, a test sample of the same dilution series was measured by a conventional enzyme cycling method (conventional method, method according to the method described in Patent Document 2) using the reaction sample solution 1 prepared in Comparative Example 1.
  • improved method enzyme cycling method
  • Reaction reagent 1 (conventional method) 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase
  • Reaction reagent 2 (improved method) 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 2.0 mM Thio NAD 0.5 mM NADH 0.1 mM 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase 20 U / ml Glutamate Dehydrogenase 2.0 mM L-Glutamate
  • Measurement method The measurement is performed in two ways using the reaction sample solution 1 (conventional method) and the reaction sample solution 2 (improved method) for each test sample prepared by diluting to 1X10 7 , 1X10 6 , 1X10 5 , 1X10 4 , 1X10 3 times. It was measured. The other procedures were performed in accordance with the method described in Example 1. A graph plotting ⁇ O.D. 60 minutes after the addition of the reaction reagent is shown in FIG.
  • the improved method using reaction sample solution 2 has a wide range of linearity of absorbance for each dilution factor test sample, and the absorbance reaches its peak. It was confirmed that the test sample causing the phenomenon has a low dilution factor, that is, it can be quantitatively measured even with a high concentration test sample. This is because the enzyme reaction from L-glutamate to ⁇ -ketoglutarate by glutamate dehydrogenase proceeds simultaneously in the enzyme cycling reaction system, and NAD generated in the reaction system as a result of the enzyme cycling reaction is converted into NAD by glutamate dehydrogenase as a coenzyme.
  • the reaction that consumes and generates NADH occurs, and as a result, the decrease in NADH concentration in the reaction system is suppressed (the NADH concentration is maintained as compared with the conventional method), and the reaction that generates thio-NADH is considered to be the result. It was. Therefore, it was confirmed that the method of the present invention is a measurement method with higher sensitivity and wider measurement range than the conventional method.
  • the present invention can be suitably used in a wide range of fields including a clinical inspection field and a food inspection field where high sensitivity and simple measurement are required.

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Abstract

本発明は、抗体酵素複合体又は酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量が、NAD(P)H、チオNAD(P)、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNAD(P)Hを生成させ、生成したチオNAD(P)Hの量を測定するか、または生成したチオNAD(P)Hによる色の変化を計測することで行われる、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法又は酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法に関する。前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNAD(P)Hから生成した、NAD(P)を選択的に還元する酵素反応系を共存させる。本発明は、酵素免疫測定用キット及び核酸プローブ測定用キットに関する。酵素サイクリング反応系において、一定量の基質（還元型）に対して、単位時間当たりのチオNAD(P)Hの生成量を高くして、検出感度を高め、これを酵素免疫測定法等と組み合わせて、高感度でのタンパク質または核酸の定量等を可能にする。

Description

タンパク質及び核酸の超高感度測定方法
　本発明は、タンパク質及び核酸の超高感度測定方法に関する。本発明は、より詳細には、酵素免疫測定法および核酸プローブ測定法を利用するタンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに関する。特に本発明は、抗体または核酸プローブに標識する酵素により生成された酵素反応生成物を基質とするチオNADサイクリング法によりチオ-NAD(P)Hを増幅することで、標的タンパク質および核酸の超高感度測定を可能にする方法において、チオNADサイクリング法によるチオ-NAD(P)Hの増幅をより増強させた方法およびキットに関する。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０１６年３月３０日出願の日本特願２０１６－０６８６８６号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　近年、タンパク質や核酸の高感度測定法は、放射性物質を用いない方法が主である。タンパク質の測定の代表例は酵素免疫測定法(ELISA法)であり、核酸の測定にはPCR法を用いる方法がある。酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13mole)から蛍光法、発光法へと高感度化(10-15mole)が進められ、専用測定装置の開発・改良も進んでいる。しかし、測定操作が簡便になっただけで感度的には限界に達している。また、核酸の高感度測定法としてのPCR法では、ターゲット特異的なシグナル検出の問題、増幅効率の問題、PCR産物がプラトーに達する条件等を考え合わせると、核酸の定量は厳密には難しい。
　WO2008/117816（特許文献1）及びWO2012/128338(特許文献2)には、チオNADサイクリング法を利用する抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法及び酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法が記載されている。
特許文献１：WO2008/117816
特許文献２：WO2012/128338
特許文献１及び２の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　特許文献1に記載の方法は、酵素免疫測定法を、酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法と組み合わせる。この組み合わせにより、シグナル物質としてチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅することで、比色法によって、高感度にタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能な方法である。
　特許文献２に記載の方法は、特許文献1に記載の方法における、標識酵素と基質との反応性や標識酵素に対する基質が酵素サイクリング法における酵素反応に対する部分的な阻害を回避した、より改良された方法である。
　しかし、特許文献１及び２に記載の方法における検出感度をより高めた方法が望まれている。特許文献１及び２に記載の方法の範囲内で検出感度を高めるためには、例えば、第一段階である酵素免疫測定法についての条件の最適化及び第二段階である酵素サイクリング法についての条件の最適化がある。本発明者らは、酵素サイクリング法についての条件の最適化及びその問題点について検討した。酵素サイクリング法の基本原理を下記に示す。第一段階である酵素免疫測定法または核酸プローブ法により基質（還元型）が生成し、この基質（還元型）とNAD(P)H及びチオ-NAD(P)+から、４００ｎｍに吸収を有するチオ-NAD(P)Hを生成させ、チオ-NAD(P)Hの生成量を定量するか、目視で検出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　この酵素サイクリング反応系においては、一定量の基質（還元型）に対して、チオ-NAD(P)Hの生成量が高くなればなるほど検出感度は高まり、それをより短時間に行うことができれば、操作時間を短縮することができる。
　本発明者らのその後の検討によれば、この酵素サイクリング反応系においては、脱水素酵素(デヒドロゲナーゼ)はNAD(P)H量が増すと阻害される傾向があり、一方、NAD(P)H量が少ないと、反応系内のNAD(P)Hが早期に枯渇してしまいチオ-NAD(P)+からチオ-NAD(P)Hへの反応量が少なく、チオ-NAD(P)Hの生成量が低くなり、検出感度を高めることができないことが判明した。それに対してこの問題は、チオ-NAD(P)+とNAD(P)Hの添加量を両者の比率を変えずに増加させることで解決できることが判明した。しかし、チオ-NAD(P)+の添加量を増すと、チオ-NAD(P)+の光吸収（４００ｎｍ）により、反応開始前でも着色が生じてしまい、ブランクでも呈色するという新たな問題が判明し、検出感度の向上には適さない方法であった。
　この様な状況下、上記酵素サイクリング反応系において、一定量の基質（還元型）に対して、単位時間当たりのチオ-NAD(P)Hの生成量を高くして、検出感度を高め、これを酵素免疫測定法等と組み合わせて、従来よりさらに高感度でタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能である方法を提供することが、本発明の目的（解決すべき課題）である。
　尚、単位時間当たりのチオ-NAD(P)Hの生成量を高くできれば、同一のチオ-NAD(P)Hの生成量に到達する時間はより短くでき、操作時間を短縮することができる。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の実験検討を重ねた。その結果、上記酵素サイクリング反応系に、チオ-NAD(P)+とチオ-NAD(P)Hの反応には関与せず、酵素サイクリング反応で生成する-NAD(P)+を還元して、NAD(P)Hを生成（再生）させる系を共存させることで、上記課題を解決することができることを見出して、本発明を完成させた。
　本発明は、以下の通りである。
[１]
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量が、
NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび／またはNADPHから生成した、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする方法。
[２]
前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、［１］に記載の方法。
[３]
酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量が、
NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび／またはNADPHから生成した、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする方法。
[４]
前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、［３］に記載の方法。
[５]
前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼである［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
[６]
前記酵素サイクリング反応の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ以外のデヒドロゲナーゼである［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
[７]
前記酵素サイクリング反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で表される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
[８]
前記抗体酵素複合体の酵素または前記酵素標識核酸プローブの酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
[９]
以下の(1)～(6)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP、
(6)NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
[１０]
以下の(1)～(6)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP、
(6)NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
[１１]
前記(6)の酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼである［９］及び［１０］のいずれかに記載のキット。
[１２]
前記(6)の酵素反応系は、基質が、(1)の酵素の基質及び(3)のデヒドロゲナーゼの基質にならず、酵素が、(2)の基質及び(5)のチオNADおよび／またはチオNADPと反応しない、［９］～［１１］のいずれかに記載のキット。
[１３]
前記(3)のデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSD)であり、
前記(6)の酵素反応系の酵素は、HSD(ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ)以外のデヒドロゲナーゼである［９］～［１２］のいずれかに記載のキット。
[１４]
前記(6)の酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で評される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素である、［９］～［１３］のいずれかに記載のキット。
[１５]
前記(1)の抗体標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、［９］、［１１］～［１４］のいずれかに記載のキット。
[１６]
前記(1)の核酸プローブ標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、［１０］～［１４］のいずれかに記載のキット。
　従来法よりさらに高感度でタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能である、酵素免疫測定法および核酸プローブ測定方法を提供することができる。
比較例（従来法）の測定結果。 実施例１で得られたグルタミン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例２で得られたロイシンデヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例３で得られたアラニンデヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例４で得られたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例５で得られたリンゴ酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例６で得られたD-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例７で得られた乳酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果。 実施例８で得られたグルタミン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定結果（従来法との比較を含む）。
　本願明細書において、-NAD(P)+は、NADおよび／またはNADPと同義であり、NAD(P)Hは、NADHおよび／またはNADPHと同義であり、
チオ-NAD(P)+は、チオNADおよび／またはチオNADPと同義であり、
チオ-NAD(P)Hは、チオNADHおよび／またはチオNADPHと同義である。
また、デヒドロゲナーゼ(DH)は、脱水素酵素と同義である。
＜本発明の方法＞
　本発明は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法及び酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法（以下、「本発明の方法」と総称する）に関する。酵素測定方法における抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量、及び核酸プローブ測定方法における酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる。
　本発明の方法で用いられている抗体酵素複合体は、標的タンパク質抗原に特異的な抗体に酵素を標識したものである。また、酵素標識核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合する核酸プローブに酵素を標識したものである。抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、例えば、EC番号2.-で表される転移酵素群、EC番号3.-で表される加水分解酵素群、EC番号4.-で表される除去付加酵素群およびEC番号5.-で表される異性化酵素群から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。これらの酵素の具体例は、特許文献１の段落００２０～００２４を参照できる。
　本発明の方法で用いられている抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、より具体的には、例えば、アルカリホスファターゼ(ALP)、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼであることができる。これらの酵素を用いる方法は、特許文献２の段落００２４～００２７を参照できる。
　本発明に使用可能な代表的な標識酵素、基質及び酵素サイクリング用のデヒドロゲナーゼの組合せの例に関しては、もちろんこれらの組み合わせに限られるわけではないが、特許文献２の段落００４４～００５１を参照できる。
　本発明の方法は、通常の酵素免疫測定法や核酸プローブ法と同様に実施することができる。例えば、被検体に特異的に結合する抗体や核酸プローブを表面に固着させた固相担体、例えば、マイクロプレートやプラスチックチューブ、磁気ビーズ等、通常の測定に用いられている固相担体を用いることができる。
　抗体－酵素複合体および核酸プローブ－酵素複合体は、常法により調製できる。
　抗体酵素複合体を構成する抗体は、本発明の酵素免疫測定方法により測定されるべき被検体に特異的に結合する抗体から適宜選択することができる。例えば、本発明の酵素免疫測定方法は、タンパク質の分析に用いられるが、その場合、抗体酵素複合体の抗体は、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体である。また、この場合、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板を用いる。また、抗体酵素複合体を構成する抗体および基板に固着させる抗体は、抗体の断片であっても良い。本発明の酵素免疫測定方法における、被検体は、タンパク質に限定されず、通常の酵素免疫測定方
法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。
　核酸プローブ酵素複合体も同様に測定対象となる核酸に相補的なプローブを適宜選択することができる。
　本発明の方法において、抗体酵素複合体の酵素または酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う。
　さらに、本発明の方法は、酵素サイクリング反応の系に、酵素サイクリング反応でNADHおよび／またはNADPHから生成した、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする。NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の「選択的に」とは、共存するチオNADおよび／またはチオNADPは、実質的に還元しない、ことを意味する。
　本発明の方法においては、酵素サイクリング反応系に、チオ-NAD(P)+とチオ-NAD(P)Hの反応には関与せず、酵素サイクリング反応で生成するNAD(P)を還元して、NAD(P)Hを生成（再生）させる系を共存させることで、従来法に比べて、さらに高感度でタンパク質または核酸の定量や目視による検出を可能とする。
　前記酵素反応系は、本発明の酵素免疫測定方法においては、基質が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であることが好ましい。また、核酸プローブ測定方法においては、前記酵素反応系は、基質が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であることが好ましい。
　本発明で用いられるNADおよび／またはNADPを選択的に還元する反応は、NADおよび／またはNADPを電子受容体とする酸化還元酵素により行われる。酸化還元酵素の中でもデヒドロゲナーゼが好ましい。その理由として、酵素サイクリング反応に用いる酵素もデヒドロゲナーゼであるため、至適条件が同等であることが望まれるためである。
　NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼであることが好ましい。但し、酵素サイクリング反応の酵素も、デヒドロゲナーゼであることから、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素であるデヒドロゲナーゼと酵素サイクリング反応の酵素であるデヒドロゲナーゼとは、互いに、異なる基質特異性を有するデヒドロゲナーゼから選択される。酵素サイクリング反応の酵素であるデヒドロゲナーゼは、好ましくは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであるので、この場合、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ以外のデヒドロゲナーゼであること、即ちヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼと異なる基質特異性を有するデヒドロゲナーゼから選択される。
　酵素サイクリング反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼ、好ましくはヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、これらのデヒドロゲナーゼとは異なる基質特異性を有する、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で評される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択されることが好ましい。
　EC番号1.1.1.-で表される酵素群に含まれるデヒドロゲナーゼはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、イジトール-2-デヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グロン酸-3-デヒドロゲナーゼ、リビトール-2-デヒドロゲナーゼ、グルコン酸-5-デヒドロゲナーゼ、3-イソプロプルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　EC番号1.2.1.- で表される酵素群に含まれるデヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　EC番号1.3.1.-で表される酵素群に含まれるデヒドロゲナーゼは、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　EC番号1.4.1.-で表される酵素群に含まれるデヒドロゲナーゼは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、グリシンデヒドロゲナーゼ、リシンデヒドロゲナーゼ、トリプトファンデヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　EC番号1.5.1.-で表される酵素群に含まれるデヒドロゲナーゼは、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、サッカロピンデヒドロゲナーゼ、D-オクトピンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　前述のように、NADおよび／またはNADPを還元する酵素は、酵素サイクリング反応に用いるデヒドロゲナーゼの基質特異性等を考慮して、適宜選択する。酵素サイクリング反応に用いる基質と、NADおよび／またはNADPを還元する酵素の基質の構造が似ている場合には基質特異性が低くなる場合があることから、それぞれの酵素反応に影響を及ぼさないように適宜選択する。
　例えば、酵素サイクリング反応の酵素がヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（HSD）の場合は、NADを選択的に還元する酵素の基質となるものはステロイド骨格を持たないものが好ましい。ステロイド骨格を持たない基質となり得る物質としては、例えば、有機酸およびアミノ酸を挙げることができ、これらの物質を基質とするNADを選択的に還元する酵素としては、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、グリシンデヒドロゲナーゼ、リシンデヒドロゲナーゼ、トリプトファンデヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼなどを選択できる。
　尚、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素は、標識酵素に対しても、基質特異性等を考慮することが好ましい。例えば、標識酵素にアルカリホスファターゼを用いる場合には、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素としては、リン酸基を持つ物質以外の物質を基質とする酵素を選択する。リン酸基を持つ物質以外の物質を基質とする酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、などを挙げることができる。
　同様に、標識酵素にグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼを用いる場合は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノースなどの糖残基を含む物質以外の物質を基質とする酵素を、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素として用いる。糖残基を含む物質以外の物質を基質とする酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼなどを挙げることができる。
　また、標識酵素にペルオキシダーゼを用いる場合は、ペルオキシド構造を持つ物質以外の物質を基質とするNADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素を用いる。ペルオキシド構造を持つ物質以外の物質を基質とする酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、などを挙げることができる。
　NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素及び基質の組合せは、これらの制限される意図ではないが、例えば、以下の組み合わせを挙げることができる。
(1)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸、
(2)ロイシンデヒドロゲナーゼ及びロイシン、
(3)アラニンデヒドロゲナーゼ及びアラニン、
(4)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びフェニルアラニン、
(5)セリンデヒドロゲナーゼ及びセリン、
(6)バリンデヒドロゲナーゼ及びバリン、
(7)リシンデヒドロゲナーゼ及びリシン、
(8)トリプトファンデヒドロゲナーゼ及びトリプトファン
(9)アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸
(10)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸、
(11)D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ及びD-3-ヒドロキシ酪酸、
(12)乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸、
(13)グリセロールデヒドロゲナーゼ及びグリセロール
(14)グリセリン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセリン酸
(15)イソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸
　本発明の方法において、各成分の濃度は、例えば、以下の範囲にすることができる。
　（１）抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの濃度範囲
　0.01μg/ml～1 mg/ml
　（２）標識酵素の基質の濃度範囲
　1μM～500 mM
　（３）NADHおよび／またはNADPHの濃度範囲
　0.01 mM～50 mM
　（４）チオNADおよび／またはチオNADPの濃度範囲
　0.01 mM～100 mM
　（５）デヒドロゲナーゼ(DH)の濃度範囲
　0.01 u/ml～ 5000u/ml
　（６）NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素の濃度範囲
　0.01 u/ml～5000 u/ml
　（７）NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素の基質の濃度範囲
　1μM～500 mM
　反応条件は、標識酵素、デヒドロゲナーゼ(DH)並びにNADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素の最適温度範囲を考慮して適宜決定できる。例えば、反応温度は、操作が簡便であることから、室温で実施することが好ましい。但し、標識酵素、デヒドロゲナーゼ(DH)並びにNADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素の最適温度範囲を考慮して室温より高い温度または低い温度で実施することもできる。
　反応時間は、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量の測定、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化の計測が可能な程度まで、チオNADHおよび／またはチオNADPHが蓄積するに十分な時間とすることができる。但し、測定または計測に必要なチオNADHおよび／またはチオNADPHの蓄積量は、測定または計測条件により変化するで、条件に応じて適宜決定できる。
　酵素サイクリング系の中でチオNAD(P)を利用するサイクリング系は比較的最近になって登場したユニークなサイクリング系である。この系ではNAD(P)/NAD(P)Hを補酵素として利用するデヒドロゲナーゼ（Dehydrogenase;DH）を用い、NAD(P)/NAD(P)HとそのアナログであるチオNAD(P)/チオNAD(P)Hが共存する条件下でサイクリングを行い、デヒドロゲナーゼの基質をチオNAD(P)H（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）として増幅定量する。チオNAD(P)サイクリング法の測定原理は、前掲の通りであるが、再度記載すると以下の通りである。
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　NADHの極大吸収が340 nm（モル吸光係数=6,200）であるのに対し、チオNAD(P)Hは可視域に吸収を示すため（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できることをその長所としている。
　チオNAD(P)を利用するサイクリング系は、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できるという長所を利用して、NADHの吸収増加に基づくデヒドロゲナーゼ活性測定やその基質の定量法などの従来法のいくつかがチオNADを用いる方法に改良されている。このサイクリング系を酵素免疫測定法等の検出系として高感度化に利用した例は、特許文献１が初めてである。本発明では、標識酵素とサイクリング系を組み合わせ、さらにそれにNADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を併用することにより、増幅反応をより促進することが可能となり、さらなる高感度化を行うことが可能となった。
　本発明の測定法では、酵素免疫測定法の例で示したとおり、酵素複合体とそれに組み合わせた基質で産生された生成物を次の酵素サイクリング反応の基質として用い、酵素サイクリング反応により生成したチオNAD(P)Hの吸収を比色定量するものである。この反応では１種のデヒドロゲナーゼで酵素サイクリングを行うため、酵素サイクリング反応の基質としては、還元型基質でも酸化型基質でもよい。さらに、本発明では、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を併用することで、酵素サイクリング反応により生成したNADおよび／またはNADPを選択的に還元する。NADおよび／またはNADPを選択的に還元して、NADHおよび／またはNADPHを系内で再生することで、反応開始時に、過剰量のチオNAD(P)、NADHおよび／またはNADPHを系に添加することなく、上記酵素サイクリング反応の進行を促進し、チオNAD(P)Hの生成を促進することができる。
＜酵素サイクリング用キット＞
　本発明は、反応性担体に標識化された酵素およびその基質、サイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADH、並びにNADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系（酵素および基質）を含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
　反応性担体とは測定対象物と結合する活性を持った抗体・核酸プローブ・レクチン等を表す。反応性担体は測定対象物に適した物を用いればよく、標識酵素およびその基質も適した物を用いればよく特に限定はされない。
　より具体的には、本発明は、標識酵素及びその基質、サイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADH、並びにNADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系（酵素および基質）を含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
　本発明のキットは、以下の(1)～(6)の試薬を含む酵素免疫測定用キットである。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP、
(6)NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
　さらに本発明は、以下の(1)～(6)の試薬を含む核酸プローブ測定用キットである。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素、
(2)上記(1)の酵素の基質、
(3)デヒドロゲナーゼ、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP、
(6)NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
　前記(6)の酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼであることが好ましい。
　前記(6)の酵素反応系は、基質が、(1)の酵素の基質及び(3)のデヒドロゲナーゼの基質にならず、酵素が、(2)の基質及び(5)のチオNADおよび／またはチオNADPと反応しない酵素であることが、好ましい。
　前記(3)のデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSD)であり、前記(6)の酵素反応系の酵素は、HSD(ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ)以外のデヒドロゲナーゼであることが好ましい。
　前記(6)の酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で評される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素であることが好ましい。
　(1)の標識酵素、(3)のデヒドロゲナーゼ(DH)、(6)の酵素反応系の酵素、それらの基質等については、上記本発明の方法で説明したものをそのまま利用できる。例えば、前記酵素免疫測定用キットの(1)の抗体標識酵素の酵素および前記核酸プローブ測定用キットの(1)の核酸プローブ標識酵素の酵素は、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素であることができる。
　本発明のキットは、市販の酵素標識抗体等をこのキットの構成試薬と組合せて使用することも可能である。このキットは、酵素サイクリング法を用いる酵素免疫測定方法に利用できる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
実施例：酵素サイクリング反応を用いた結核菌群の測定
　結核菌群に特異的な分泌タンパク質であるMPB64に対するモノクローナル抗体を使用し、当該抗体の標識酵素としてアルカリホスファターゼ（Alkaline phosphatase、以下「ALP」と記す。）、その基質として17β-メトキシ 5β-アンドロスタン 3-ホスフェート（17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate、以下「A3P」と記す。）を用い、酵素サイクリングの酵素として3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3α-Hydroxysteroid dehydrogenase、以下「3α-HSD」と記す。）を用いた酵素サイクリング反応を行い、更に前記反応の結果生じたNADを補酵素として消費しNADHを生成する酵素反応を組み合わせる方法にて実施した。
参考例1  （試料の調製）
　マイコバクテリウムボビス BCG Tokyo株（以下「BCG」と記す。）をミドルブルック7H11液体培地に接種し、所定濁度まで培養し培養上清を得た。得られた培養上清を濁度McFarland No.1相当（濃度1x108 cfu/ml相当）に調製し被験試料とした。
参考例2  （抗MPB64モノクローナル抗体の作出）
　参考例1など常法により得た精製MPB64を免疫用抗原として、当該タンパク質に対するモノクローナル抗体を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従って行った。
　最終的にMPB64と反応するモノクローナル抗体産生細胞を最終的に2クローン得た。以下、それぞれのクローンが産生する抗体をモノクローナル抗体BL001、BL002と称する。
参考例3  （ALP標識抗体の作製）
　参考例2にて得られたモノクローナル抗体BL001を100mM 酢酸緩衝液（pH3.8）を用いて透析操作を行った。30分間の透析操作を3回行った。その透析後の抗体溶液に抗体量に対し5%になるようにペプシンを添加し、37℃で2時間加温した後に1.5M トリス塩酸緩衝液（pH8.8）を添加して中和した。反応溶液の一部をSDS（Sodium dodecyl sulfate）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供し、ペプシン消化処理によりF(ab')2が生成していることを確認した後、Superdex 200 pgを充填したカラム（GEヘルスケア・ジャパン社の製品）を用いて精製し、F(ab')2フラクションを得た。得られたF(ab')2溶液を濃度1mg/mlに調製した。
　得られたF(ab')2溶液0.9mlに対し、0.1M 2-メルカプトエチルアミン溶液を0.1ml添加し、37℃で90分加温し還元処理を実施した。90分間の還元反応後、反応液をSuperdex 200 pgを充填したカラムを用いて精製し、Fabフラクションを得た。
　17.14mg/mlのALPを含む5mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0、5mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、50% glycerolを含む） 0.1mlをPD-10カラム（GEヘルスケア・ジャパン社の製品）に供し、緩衝液を50mM ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH7.6、1mM MgCl2および0.1mM ZnCl2を含む）に置換した。得られたALP溶液は1mg/mlに調製した。ALP溶液0.5mlに対し、N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド（以下「EMCS」と記す。)を含むジメチルホルムアミド溶液（EMCS濃度 17mg/ml）を2.25ml添加し、37℃で30分間反応させた。反応混合液はPD-10カラムに供し、0.1M トリス塩酸緩衝液（pH7.0、1mM MgCl2および0.1mM ZnCl2を含む）に置換し、マレイミド化ALP溶液を得た。
　前記反応にて調製したFab抗体溶液とマレイミド化ALP溶液を混合し、4℃で一昼夜反応させた。反応液はSuperdex 200 pgを充填したカラムを用いて精製し、ALP標識Fabフラクションを得た。得られたALP標識Fab溶液を濃縮し所定濃度に調製し、ALP標識Fab抗体溶液を作製した。
参考例4  （モノクローナル抗体固定化マイクロプレートの調製）
　参考例2にて得られたモノクローナル抗体BL002を10mMトリス塩酸緩衝生理食塩水（pH7.5、以下「TBS」と記す。）にて20μg/mlに調製した。得られた抗体溶液を平底マイクロプレートの各ウェルに100μlずつ加え37℃で１時間静置した。その後、0.05% Tween20含有TBSにて複数回洗浄し、1% ウシ血清アルブミン（以下「BSA」と記す）含有TBS溶液を350μlずつ添加し、室温で1時間静置してブロッキング処理をした。ウェル内の溶液を除去した後、風乾させ、モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを作製した。
比較例　（酵素サイクリング反応によるMPB64の測定：従来法）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液として以下の様に調製し測定を行った。
反応試液1
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
測定方法
　参考例4にて作製したモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、参考例1で調製した被験試料をサンプル希釈液（0.1% BSAおよび0.01% Tween20を含むTBS）で1x105倍希釈したものを100μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄し、参考例3にて作製したALP標識Fab抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する抗体溶液を100μl加え、室温にて1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄した。次に各ウェルに前記反応試液1を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製SH-9000）で405nmのフィルターを使用し、反応試液添加後5分ごとに各ウェルの吸光度を測定した。なお、被験試料を添加せずサンプル希釈液のみを同様に測定したものをブランク値とし、測定値からブランク値を差し引いた吸光度（以下「ΔO.D.」と記す。）を算出した。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図1に示す。
実施例1　（グルタミン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Glutamate Dehydrogenase、微生物由来）及び前記酵素基質としてL-グルタミン酸（L-Glutamate）を加え、以下に示す反応試液2を調製し測定を行った。
反応試液2
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml Glutamate Dehydrogenase
　　　2.0 mM L-Glutamate
測定方法
　参考例4にて作製したモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、参考例1で調製した被験試料をサンプル希釈液（0.1% BSAおよび0.01% Tween20を含むTBS）で1x105倍希釈したものを100μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄し、参考例3にて作製したALP標識Fab抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する抗体溶液を100μl加え、室温にて1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05% Tween 20を含むTBSで3回洗浄した。次に各ウェルに前記反応試液2を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製SH-9000）で405nmのフィルターを使用し、反応試液添加後5分ごとに各ウェルの吸光度を測定した。被験試料を添加せずサンプル希釈液のみを同様に測定したものをブランク値とし、測定値からブランク値を差し引いた吸光度（以下「ΔO.D.」と記す。）を算出した。
　得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図2に示す。反応試液2を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるL-グルタミン酸からα-ケトグルタル酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例2　（ロイシンデヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、ロイシンデヒドロゲナーゼ（Leucine dehydrogenase、Bacillus sp.由来）及び前記酵素基質としてL-ロイシン（L-Leucine）を加え、以下に示す反応試液3を調製し測定を行った。
反応試液3
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml Leucine dehydrogenase
　　　2.0 mM L-Leucine
測定方法
　測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図3に示す。
　反応試液3を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、ロイシンデヒドロゲナーゼによるL-ロイシンから4-メチル-2-オキソペンタン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例3　（アラニンデヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、アラニンデヒドロゲナーゼ（Alanine dehydrogenase、Bacillus cereus遺伝子組み換え大腸菌由来）及び前記酵素基質としてL-アラニン（L-Alanine）を加え、以下に示す反応試液4を調製し測定を行った。
反応試液4
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml Alanine dehydrogenase
　　　2.0 mM L-Alanine
測定方法
　測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図4に示す。
　反応試液4を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、アラニンデヒドロゲナーゼによるL-アラニンからピルビン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例4　（フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（L-Phenylalanine dehydrogenase、Sporosarcina sp.由来）及び前記酵素基質としてL-フェニルアラニン（L-Phenylalanine）を加え、以下に示す反応試液5を調製し測定を行った。
反応試液5
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml L-Phenylalanine dehydrogenase
　　　2.0 mM L-Phenylalanine
測定方法
　測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図5に示す。
　反応試液5を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼによるL-フェニルアラニンからフェニルピルビン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例5　（リンゴ酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Malate dehydrogenase、微生物由来）及び前記酵素基質としてリンゴ酸（L-Malate）を加え、以下に示す反応試液6を調製し測定を行った。
反応試液6
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml Malate dehydrogenase
　　　2.0 mM L-Malate 
測定方法
　測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図6に示す。
　反応試液6を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによるリンゴ酸からオキサロ酢酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例6　（D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase 、Pseudomonas sp.由来）及び前記酵素基質としてD-3-ヒドロキシ酪酸（D-3-Hydroxybutyrate）を加え、以下に示す反応試液7を調製し測定を行った。
反応試液7
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase
　　　2.0 mM D-3-Hydroxybutyrate
測定方法
　測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図7に示す。
　反応試液7を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、D-3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによるD-3-ヒドロキシ酪酸からアセト酢酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例7　（乳酸デヒドロゲナーゼを組み合わせた酵素サイクリング反応によるMPB64の測定）
　ALP標識抗MPB64 Fab抗体、酵素サイクリング反応基質としてA3P及び酵素サイクリング反応酵素として3α-HSDを用いる酵素サイクリング反応試液1に、酵素サイクリング反応の結果生じるNADをNADHへ還元し回復させる反応系として、L-乳酸デヒドロゲナーゼ（Lactate Dehydrogenase、遺伝子組み換え大腸菌由来）及び前記酵素基質としてL-乳酸（L-lactate）を加え、以下に示す反応試液8を調製し測定を行った。
反応試液8
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml Lactate Dehydrogenase
　　　2.0 mM L-lactate
測定方法
　測定は実施例1に記載した方法に準拠して行った。得られたΔO.D.をプロットしたグラフを図8に示す。
　反応試液8を添加した60分後においてもΔO.D.は平衡に達していないことから、酵素サイクリング反応により生じたNADを、L-乳酸デヒドロゲナーゼによるL-乳酸からピルビン酸への酵素反応過程において、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が進行し、結果として酵素サイクリング反応試液におけるNADH濃度の減少が抑制され、チオNADHを生成する反応が継続的に進行していることが確認された。したがって比較例1に示される従来の酵素サイクリング反応による測定方法より、高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
実施例8
　参考例1で調製した被験試料をサンプル希釈液で希釈倍数1X107、1X106、1X105、1X104、1X103倍に希釈した各被験試料を実施例1にて調製した反応試液2を用い、補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応を組み合わせた酵素サイクリング法（以下「改良法」と称する）により被験試料中のMPB64の測定を実施した。対照として、比較例1にて調製した反応試液1を用いた従来の酵素サイクリング法（従来法、特許文献2に記載の方法に準じた方法）により同希釈系列の被験試料を測定した。
反応試液1（従来法）
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
反応試液2（改良法）
　　　0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.0 mM チオNAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.1 mM 17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　　　20 U/ml Glutamate Dehydrogenase
　　　2.0 mM L-Glutamate
測定方法
　測定は、希釈倍数1X107、1X106、1X105、1X104、1X103倍に希釈し調製した各被験試料を反応試液1（従来法）と反応試液2（改良法）による二方法で測定した。それ以外は実施例1に記載した方法に準拠して行った。反応試液添加60分後のΔO.D.をプロットしたグラフを図9に示す。
　反応試液1を用いた従来法と比較して、反応試液2を用いた改良法は、各希釈倍数の被験試料に対して吸光度が直線性を保つ範囲が広いこと、及び、吸光度が頭打ちになる現象を起こす被験試料の希釈倍数が低い、つまりは高濃度の被験試料でも定量的に測定が可能であることが確認された。これは、酵素サイクリング反応系において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるL-グルタミン酸からα-ケトグルタル酸への酵素反応が同時に進行し、酵素サイクリング反応の結果反応系内に生じたNADをグルタミン酸デヒドロゲナーゼが補酵素としてNADを消費しNADHを生成する反応が起こり、結果として反応系内におけるNADH濃度の減少が抑制され（従来法よりもNADH濃度が維持され）、チオNADHを生成する反応が進んだ結果であると考えられた。したがって、本発明の方法は、従来法よりも高感度かつ測定レンジの広い測定方法であることが確認された。
　本発明は、高感度かつ簡便な測定が要求される臨床検査分野や食品検査分野を含む広い分野において好適に利用可能である。

Claims (16)

  1. 抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量が、
    NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
    前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび／またはNADPHから生成した、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする方法。
  2. 前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、抗体酵素複合体の酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、請求項１に記載の方法。
  3. 酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量が、
    NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いた酵素サイクリング反応により、チオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行われる、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
    前記酵素サイクリング反応の系に、前記酵素サイクリング反応でNADHおよび／またはNADPHから生成した、NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系を共存させることを特徴とする方法。
  4. 前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系は、基質が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質にならず、かつ酵素が、酵素標識核酸プローブの酵素の基質及び酵素サイクリング反応の酵素の基質と反応しない酵素であり、請求項３に記載の方法。
  5. 前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼである請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記酵素サイクリング反応の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ以外のデヒドロゲナーゼである請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記酵素サイクリング反応系の酵素は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであり、前記NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で表される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記抗体酵素複合体の酵素または前記酵素標識核酸プローブの酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 以下の(1)～(6)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
    (1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素、
    (2)上記(1)の酵素の基質、
    (3)デヒドロゲナーゼ、
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP、
    (6)NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
  10. 以下の(1)～(6)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
    (1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素、
    (2)上記(1)の酵素の基質、
    (3)デヒドロゲナーゼ、
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP、
    (6)NADおよび／またはNADPを選択的に還元する酵素反応系
  11. 前記(6)の酵素反応系の酵素は、デヒドロゲナーゼである請求項９及び１０のいずれかに記載のキット。
  12. 前記(6)の酵素反応系は、基質が、(1)の酵素の基質及び(3)のデヒドロゲナーゼの基質にならず、酵素が、(2)の基質及び(5)のチオNADおよび／またはチオNADPと反応しない、請求項９～１１のいずれかに記載のキット。
  13. 前記(3)のデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSD)であり、
    前記(6)の酵素反応系の酵素は、HSD(ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ)以外のデヒドロゲナーゼである請求項９～１２のいずれかに記載のキット。
  14. 前記(6)の酵素反応系の酵素は、CH-OHを電子供与体とするEC番号1.1.1.-で表される酵素群、アルデヒドまたはオキソ基を電子供与体とするEC番号1.2.1.-で評される酵素群、CH-CHを電子供与体とするEC番号1.3.1.-で表される酵素群、CH-NH2を電子供与体とするEC番号1.4.1.-で表される酵素群、CH-NHを電子供与体とするEC番号1.5.1.-で表される酵素群の中から選択される酵素である、請求項９～１３のいずれかに記載のキット。
  15. 前記(1)の抗体標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項９、１１～１４のいずれかに記載のキット。
  16. 前記(1)の核酸プローブ標識酵素の酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、及びペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項１０～１４のいずれかに記載のキット。
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