ES2613619T3 - Método y kit para medición de superalta sensibilidad de proteína y ácido nucleico, y nuevo sustrato enzimático - Google Patents

Método y kit para medición de superalta sensibilidad de proteína y ácido nucleico, y nuevo sustrato enzimático Download PDF

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Abstract

Un metodo para someter a ensayo la actividad enzimatica usando un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usa fosfatasa alcalina como la enzima del complejo anticuerpo-enzima y se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) como un sustrato de la enzima,**Fórmula** en la que X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi, o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la formula (1) como un sustrato de fosfatasa alcalina, y la cuantificacion de un producto de la reaccion enzimatica se lleva a cabo mediante la produccion de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o de tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por tio-NADH y/o por tio-NADPH producido.

Description

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DESCRIPCION
Metodo y kit para medicion de superalta sensibilidad de protema y acido nucleico, y nuevo sustrato enzimatico Campo tecnico
La presente invention se refiere a un ensayo de alta sensibilidad de proteina y acido nucleico y a un kit que usa un inmunoensayo enzimatico y un ensayo de sonda de acido nucleico. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo que permite un ensayo de ultraalta sensibilidad de proteina o acido nucleico mientras que evita la interferencia causada en el metodo del ciclo de tio-NAD usado en estos ensayos de actividad enzimatica mediante el empleo de un sustrato enzimatico especifico para una enzima marcada para un anticuerpo o sonda de acido nucleico. La presente invencion tambien se refiere a nuevos sustratos enzimaticos que se pueden usar en el ensayo de alta sensibilidad anterior de proteina y acido nucleico y a un kit.
En particular la presente invencion se refiere a un metodo para evaluar la actividad enzimatica usando un complejo anticuerpo-enzima o una sonda de acido nucleico marcada con enzima, en el que se usa fosfatasa alcalina como enzima del complejo anticuerpo-enzima, y
se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) como sustrato de la enzima,
imagen1
en la que
X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6 cuando el derivado de androsterona representado por la formula (1) se usa como sustrato de fosfatasa alcalina, y
la cuantificacion de un producto de la reaction enzimatica se lleva a cabo mediante la production de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido, ademas de dicho derivado de androsterona y un kit que comprende dicho derivado de androsterona.
Antecedentes en la tecnologia
Aunque se establece tecnicamente el metodo de radioinmunoensayo (RIA) como una medicion de alta sensibilidad de proteina o acido nucleico, en las presentes circunstancias, es imposible cambiar el metodo mencionado anteriormente por uno que tenga una alta sensibilidad mas alla de un grado de 10-16 moles ademas de mejorar la sensibilidad del equipo de detection. Y mediante el metodo de RIA, no solo se limita el lugar de la medicion a una instalacion experimental de isotopos, sino que la fecha de caducidad de los reactivos se volvera extremadamente corta y la sensibilidad de los reactivos disminuira rapidamente, a causa del uso de nucleidos de vida corta. Tambien tiene el problema del problema de los residuos radiactivos para el metodo de medicion de radiation. Especialmente el problema del abandono en el caso de usar un nucleido de larga duration es serio. Por lo tanto, recientemente la investigation y desarrollo de la medicion de alta sensibilidad de proteina o acido nucleico se han desarrollado considerando "no radiactivo" como palabra clave. De ese modo, la mayoria de la investigacion y desarrollo y la mejora tecnica del metodo de RIA no se realizan en las condiciones actuales.
Una medicion de alta sensibilidad reemplazada con el metodo de RIA, que es el inmunoensayo enzimatico (metodo de ELISA) en la medicion de proteina (Figura 1), y el metodo de PCR en la medicion de acido nucleico. El inmunoensayo enzimatico puede transcurrir con elevada sensibilidad (10-15 moles) mediante el metodo de fluorescencia y el metodo de luz emitida de sensibilidad de 10-13 moles mediante el ensayo colorimetrico en el revelado inicial, y tambien transcurre en el desarrollo y la mejora de dispositivo de medicion exclusivo. Sin embargo, la sensibilidad ha llegado al limite, pero la operation de la medicion es sencilla.
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Ademas, en el metodo de PCR de medicion de alta sensibilidad de acido nucleico, se considera el problema de la deteccion de senal espedfica para la molecula diana, la eficacia de amplificacion y las condiciones del producto de PCR llegando a una meseta, la cuantificacion de acido nucleico es estrictamente dificil.
El inmunoensayo enzimatico que usa complejo anticuerpo-enzima y el ensayo de sonda de acido nucleico que usa un complejo acido nucleico-enzima que usa un ensayo de ciclo de tio-NAD ya se conoce (vease el documento de Patente WO2008/117816 (Documento de patente 1))
Divulgacion de la invencion
De acuerdo con el metodo del Documento de patente 1, el inmunoensayo enzimatico se combino con el metodo de ciclo enzimatico que usa como sustrato el que se produce mediante la enzima de marcaje que usa el inmunoensayo enzimatico, y tio-NAD(P)H como sustancia de senal se amplifica de forma progresiva geometrica, y mediante un metodo de ensayo colorimetrico, da como resultado la cuantificacion de proteina o acido nucleico y la deteccion mediante acido nucleico. Sin embargo, revelo que no necesariamente elevada reactividad de la enzima marcada y el sustrato, y el sustrato de la enzima de ciclo marcada inhibe parcialmente la reaccion enzimatica en la reaccion de ciclo enzimatico.
El objeto de la presente invencion esta en un inmunoensayo enzimatico, combinandose el metodo con el metodo de ciclo que usa como sustrato el que se produce mediante la enzima marcada usada en el inmunoensayo enzimatico, solucionando el problema mencionado anteriormente del sustrato para la enzima marcada, y usando un medio de ensayo colorimetrico, metodo de deteccion de elevada sensibilidad de proteina o acido nucleico mediante ensayo colorimetrico del metodo mas facil, y proporcionando el ensayo de aumento de la sensibilidad hasta un grado progresivo geometrico. En particular, se proporciona el metodo de ensayo que aumento la sensibilidad mas de 10-18 moles.
El presente inventor ha tenido exito en la obtencion de un compuesto como sustrato para enzima marcada que soluciona el problema mencionado anteriormente o que proporciona el nuevo compuesto y, por lo tanto, usando estos sustratos, ha tenido exito en solucionar el problema mencionado anteriormente, y de ese modo se ha completado la presente invencion.
Medios para solucionar los problemas
La presente invencion es como sigue a continuacion:
[1] Un metodo para someter a ensayo la actividad enzimatica usando un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usa fosfatasa alcalina como enzima del complejo anticuerpo-enzima, y
se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) como sustrato de la enzima,
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en la que
X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi Ci-6, o un grupo alquilo Ci-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la formula (1) como sustrato de fosfatasa alcalina, y
la cuantificacion de un producto de la reaccion enzimatica se lleva a cabo mediante la produccion de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
[2] Un metodo para someter a ensayo una sonda de acido nucleico usando una sonda de acido nucleico marcada con enzima, en el que
se usa fosfatasa alcalina como enzima de la sonda de acido nucleico marcada con enzima, y
se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) como sustrato de la enzima,
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en la que
X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la formula (1) como sustrato de fosfatasa alcalina, y
la cuantificacion de un producto de reaccion de la reaccion enzimatica se lleva a cabo mediante la produccion de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
[3] El metodo de acuerdo con [1] o [2], en el que
Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6.
[4] Un kit para inmunoensayo enzimatico que comprende los reactivos (1) a (5) descritos a continuacion:
(1) fosfatasa alcalina marcada con un anticuerpo especifico frente a un antigeno de la proteina diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la formula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
imagen4
(en la que, X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6),
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
[5] Un kit para someter a ensayo una sonda de acido nucleico que comprende los siguientes reactivos (1) a (5):
(1) fosfatasa alcalina marcada con una sonda de acido nucleico que se une especificamente a un acido nucleico diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la formula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
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(en la que X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6),
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
[6] Un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1):
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en la que, las definiciones de X, Y1 e Y2 son las siguientes:
X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
Efectos de la invencion
De acuerdo con la presente invencion, es posible proporcionar un inmunoensayo enzimatico que mejora la sensibilidad del ensayo hasta 10-18 moles o mas, y medir una proteina diana o acido nucleico diana con elevada sensibilidad.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 es el principio de ensayo del inmunoensayo enzimatico (metodo ELISA); la Figura 2 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 1;
la Figura 3 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 2;
la Figura 4 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 3;
la Figura 5 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo Comparativo 4;
la Figura 6 son compuestos de ejemplo de algunos 3a-hidroxiandrostanos; la Figura 7 es la curva de calibracion de fosfatasa alcalina obtenida en el Ejemplo 1; la Figura 8 es la curva de calibracion de fosfatasa alcalina obtenida en el Ejemplo 2; la Figura 9 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 3; la Figura 10 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 4; la Figura 11 es la curva de calibracion de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 5;

la Figura 12 es la curva de calibracion de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 6;

la Figura 13 es la curva de calibracion de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 7;

la Figura 14 es la curva de calibracion de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 8;

la Figura 15 es la curva de calibracion de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 9;
la Figura 16 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 10; la Figura 17 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 11; la Figura 18 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 12;
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la Figura 19 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 13;

la Figura 20 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo de Referencia 7;

la Figura 21 es la curva de calibracion de p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo de Referencia 8; la Figura 22 es la curva de calibracion de peroxidasa de rabano obtenida en el Ejemplo 14; y

la Figura 23 es la curva de calibracion de Pumilio obtenida en el Ejemplo 15.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
[Nuevo sustrato]
La presente invencion se refiere a un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1).
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en la que, las definiciones de X, Y1 e Y2 son las que se describen posteriormente.
X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi Ci-6 o un grupo alquilo Ci-6,
El grupo alcoxi Ci-6 como ejemplo de Y2 puede ser, por ejemplo, un grupo metoxi, un grupo etoxi, un grupo propoxi y similar, y el grupo alquilo Ci-6 puede ser, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo iso-propilo, un grupo n-propilo, un grupo terc-butilo, un grupo n-butilo, un grupo n-pentilo, un grupo n-hexilo y similar.
Algunos ejemplos especificos del compuesto de la presente invencion se indican en la Tabla 1 que se describe posteriormente. Sin embargo, la Tabla 1 incluye compuestos que se pueden usar en el metodo y el kit de la presente invencion ademas de los ejemplos especificos del compuesto de la presente invencion.
Los presentes compuestos de la presente invencion se pueden sintetizar basandose en o por referencia a los metodos que se describen en los Ejemplos.
[Ensayo de ciclo enzimatico]
La presente invencion se refiere a un ensayo enzimatico que usa un complejo anticuerpo-enzima, en el que la cuantificacion de un producto de reaccion mediante la enzima del complejo anticuerpo-enzima se lleva a cabo mediante la produccion de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio- NAD y/o tio-NADP, y deshidrogenasa (DH), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
El complejo anticuerpo-enzima consiste en un anticuerpo especifico frente a un antigeno de la proteina diana y una enzima marcada con este anticuerpo, y se usa en el ensayo de la proteina diana mencionada anteriormente.
Ademas, la presente invencion se refiere un metodo para someter a ensayo una sonda de acido nucleico usando una sonda de acido nucleico marcada con enzima, en el que la cuantificacion de un producto de reaccion mediante la enzima de la sonda de acido nucleico marcada con enzima se lleva a cabo produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, y deshidrogenasa (DH), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio- NADH y/o tio-NADPH producido.
La sonda de acido nucleico marcada con enzima consiste en una sonda de acido nucleico que se une especificamente a un acido nucleico diana y una enzima marcada con esta sonda de acido nucleico, y se usa en el ensayo del acido nucleico diana mencionado anteriormente.
En el metodo de la presente invencion, la enzima (enzima de marcaje) del complejo anticuerpo-enzima o la sonda de acido nucleico marcada con enzima usada es fosfatasa alcalina (aLp). Como sustrato de la enzima anterior, se usa
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el derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1).
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En el caso en el que se usa el derivado de androsterona representado por la formula (1) como sustrato de fosfatasa alcalina, X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi Ci-6, o un grupo alquilo Ci-6. El derivado de androsterona incluido en el caso de (i) incluye ademas compuestos en los que Y2 es hidrogeno asi como los nuevos compuestos de la presente invention. El compuesto en el que Y2 es hidrogeno se describe en Tetrahedron, 1999, Vol. 55, n.° 17, p. 5465-5482.
el ensayo de ultraalta sensibilidad de la presente invencion se puede llevar a cabo de forma similar a un inmunoensayo enzimatico o ensayo de sonda de acido nucleico habitual. Por ejemplo, se puede usar un vehiculo en fase solida, que se use en un ensayo habitual, por ejemplo, un vehiculo en fase solida tal como una microplaca o tubo de plastico, una perla magnetica y similar en el que un anticuerpo o sonda de acido nucleico se une especificamente a un sujeto que esta inmovilizado sobre la superficie.
El complejo del anticuerpo y la sonda de acido nucleico-enzima se puede preparar mediante un metodo habitual.
El anticuerpo que constituye el complejo anticuerpo-enzima se puede seleccionar de forma adecuada entre los anticuerpos que se unen especificamente a un sujeto que se va a medir mediante el inmunoensayo enzimatico de la presente invencion. Por ejemplo, el inmunoensayo enzimatico de la presente invencion se usa en un ensayo de una proteina, y en el presente documento el anticuerpo que consiste en el complejo anticuerpo-enzima es un anticuerpo que se une especificamente a una proteina que es el sujeto. Ademas, en este caso, se usa una placa basal en la que esta inmovilizado sobre la superficie un anticuerpo que se une especificamente a la proteina sujeto. Ademas, el anticuerpo que constituye el complejo anticuerpo-enzima y el anticuerpo inmovilizado sobre la placa basal pueden ser un fragmento del anticuerpo. En la presente invencion del inmunoensayo enzimatico, el sujeto no se limita a una proteina, y puede ser cualquier sustancia que sea un sujeto de medicion de un inmunoensayo enzimatico habitual ademas de una proteina.
En el complejo de sonda de acido nucleico y enzima, la sonda se puede seleccionar adecuadamente de forma similar entre las sondas complementarias a una sonda de acido nucleico que es complementaria al sujeto de medicion.
En el metodo de la presente invencion, la cuantificacion de un producto de reaction mediante la enzima del complejo anticuerpo-enzima o la enzima de la sonda de acido nucleico marcada con enzima se lleva a cabo mediante la production de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio- NADP, y deshidrogenasa (DH), y sometiendo a ensayo la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por el tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
En el metodo de la presente invencion, la concentration de cada componente puede estar en el intervalo que se describe a continuation.
(1) Intervalo de concentracion del complejo anticuerpo-enzima o la sonda de acido nucleico marcada con enzima: 0,01 Mg/ml a 1 mg/ml
(2) Intervalo de concentracion del sustrato de la enzima de marcaje:
1 mM a 500 mM
(3) Intervalo de concentracion de NADH y/o NADPH:
0,01 mM a 50 mM
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(4) Intervalo de concentracion de tio-NAD y/o tio-NADP:
0,01 mM a 100 mM
(5) Intervalo de concentracion de la deshidrogenasa (DH):
0,01 U/ml a 5000 U/ml
Las condiciones de reaccion se pueden determinar de forma adecuada considerando el intervalo de temperatura optimo de la enzima de marcaje y la deshidrogenasa (DH). Por ejemplo, en cuanto a la temperatura de reaccion, la reaccion se lleva a cabo preferentemente a temperatura ambiente desde el punto de vista de una manipulation sencilla. Sin embargo, la reaccion se puede llevar a cabo a una temperatura mayor o una temperatura menor que la temperatura ambiente considerando el intervalo de temperatura optimo de la enzima de marcaje y la deshidrogenasa (DH).
El tiempo de reaccion puede ser un tiempo suficiente para acumular tio-NADH y/o tio-NADPH, de un modo tal que permita el ensayo de la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o la medicion del cambio de color por el tio- NADH y/o tio-NADPH producido. Sin embargo, la cantidad de acumulacion de tio-NADH y/o tio-NADPH necesaria para el ensayo o la medicion varia dependiendo de las condiciones del ensayo o la medicion, y se puede determinar de forma adecuada dependiendo de las condiciones.
El sistema de ciclo que usa tio-NAD(P) en el sistema de ciclo enzimatico es un sistema de ciclo unico que ha aparecido de forma relativamente reciente. Con este sistema, se lleva a cabo un ciclo, es decir, tio-NAD(P)/tio- NAD(P)H usando deshidrogenasa (DH) con NAD(P)/NAD(P)H como coenzima en condiciones de coexistencia de NAD(P)/NAD(P)H y su analogo, y la amplification y la cuantificacion se llevan a cabo con tio-NAD(P)H (longitud de onda de absorcion maxima: 400 nm, coeficiente de absorcion molar = 11.900) como sustrato de la deshidrogenasa. El principio para la medicion del sistema de ciclo de tio-NAD(P) es como se describe a continuation.
imagen9
Mientras que el NADH exhibe la absorcion maxima a 340 nm (coeficiente de absorcion molar = 6200), tio-NAD(P)H exhibe absorcion en el intervalo visible (longitud de onda de absorcion maxima: 400 nm, coeficiente de absorcion molar = 11900) y de ese modo el metodo de ciclo de tio-NAD(P) tiene la ventaja de permitir la medicion usando un espectrofotometro de absorcion o un lector de microplaca generalizado para la medicion colorimetrica.
Usando las ventajas de que la medicion en el sistema de ciclo que usa tio-NAD(P) se puede llevar a cabo mediante el uso de un espectrofotometro de absorcion o un lector de microplaca generalizado para la medicion colorimetrica, algunos metodos convencionales basados en el aumento de la absorcion de NADH, tales como un ensayo de actividad y cuantificacion de deshidrogenasa de un sustrato de la misma, han mejorado a un metodo que usa tio- NAD. Sin embargo, aun no ha habido ningun informe del uso de este sistema de ciclo en la mejora de sensibilidad como sistema de detection tal como un inmunoensayo enzimatico.
En la presente invention, la combination de una enzima de marcaje y el sistema de ciclo permite que la reaccion de amplificacion sea una reaccion exponencial por primera vez, dando como resultado de ese modo una mejora de sensibilidad suficiente.
De acuerdo con el ensayo de la presente invencion, como se muestra a modo de ejemplo en el inmunoensayo enzimatico, los productos producidos con el complejo de enzima y un sustrato en combinacion se usan como sustrato de la siguiente reaccion de ciclo enzimatico, y la absorcion del tio-NAD(P)H producido por la reaccion de ciclo enzimatico se cuantifica colorimetricamente. El ciclo enzimatico se lleva a cabo con una deshidrogenasa en esta reaccion, y de ese modo se puede usar un sustrato reducido o un sustrato oxidado como sustrato de la reaccion de ciclo enzimatico.
En la presente invencion, la enzima de marcaje usada como complejo de enzima, el sustrato de la misma y la deshidrogenasa usada posteriormente en la reaccion de ciclo tienen las propiedades que se describen a
continuacion.
(1) El producto de la enzima de marcaje es androsterona o un derivado de la misma;
(2) se pueden usar enzimas de marcaje disponibles en el mercado y usadas ampliamente;
5 (3) el numero de recambio del ciclo enzimatico es muy elevado; y
(4) la deshidrogenasa usada en esta reaccion de ciclo no tiene ninguna contaminacion de la enzima de marcaje ni actividad similar a la de la enzima de marcaje.
Algunos ejemplos de la deshidrogenasa (DH) pueden incluir, por ejemplo, 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa.
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A continuacion se describiran algunos ejemplos de una combination representativa de la enzima de marcaje, el sustrato y la deshidrogenasa para el ciclo enzimatico que se puede usar en la presente invention. La enzima marcada de acuerdo con la presente invencion es una fosfatasa alcalina. Las demas enzimas marcadas de la siguiente tabla 1 no entran dentro del ambito de protection de la presente invencion, pero se pueden usar en 15 combinacion con la fosfatasa o fosfatasas alcalinas. Sin embargo, por supuesto, la combinacion no se limita a estas combinaciones.
Tabla 1
Enzima marcada
Sustrato Deshidrogenasa
a-glucosidasa
3a-glucosido de 5a-androsterona 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
a-glucosidasa
3a-glucosido de 5p-androsterona 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
a-glucosidasa
3-a-glucosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
a-glucosidasa
3-a-glucosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
3-p-glucosido de 5a-androsterona 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
3-p-glucosido de 5p-androsterona 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
3-p-glucosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
3-p-glucosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
3-p-galactosido de 5a-androsterona 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
3-p-galactosido de 5p-androsterona 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
3-p-galactosido de 3p-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
3-p-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metil-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metil-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p -androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-metil-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-metil-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-etil-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-etil-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 17p-acetoxi-3a-hidroxi-5a -androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa acida
3-fosfato de 17p-acetoxi-3a-hidroxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de a-hidroxi-17p-metil-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metil-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-metil-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-metil-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-etil-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 3a,17a-dihidroxi-17p-etil-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 17p-acetoxi-3a-hidroxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Fosfatasa alcalina
3-fosfato de 17p-acetoxi-3a-hidroxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Sulfatasa
3-sulfato de 5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Sulfatasa
3-sulfato de 5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Peroxidasa
3a-terc-butil-peroxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Peroxidasa
3a-terc-butil-peroxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Peroxidasa
3a-benzoil-peroxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Peroxidasa
3a- benzoil-peroxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Peroxidasa
3a-acetil-peroxi-5a-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Peroxidasa
3a-acetil-peroxi-5p-androstano 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Por ejemplo, cuando se usa 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa como enzima de ciclo entre las combinaciones descritas anteriormente, algunos ejemplos de un candidato para el sustrato que se puede usar androsterona, lip-
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hidroxiandrosterona, 11-oxoandrosterona y 11a-hidroxiandrosterona.
El sustrato para el ciclo es preferentemente el que tiene una velocidad de reaccion enzimatica elevada (que tiene una alta actividad por el sustrato) y que reacciona incluso a una concentracion baja (que tiene un valor bajo de Km). Ademas, una propiedad deseable como deshidrogenasa es la velocidad de reaccion cuando se usa tio-NAD(P) como coenzima. En la reaccion de deshidrogenacion de androsterona mediante muchas otras deshidrogenasas, la velocidad reaccion cuando se usa tio-NAD como coenzima esta dentro de varios % de la velocidad de reaccion cuando se usa NAD, mientras que con 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, la velocidad reaccion con tio-NAD es aproximadamente un 59 % de la velocidad reaccion con NAD. De ese modo, 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa tiene una propiedad deseable como enzima de ciclo de la presente invencion. De acuerdo con la invencion, se usa fosfatasa alcalina (ALP) como enzima de marcaje que se combina, y la combinacion con fosfatasa alcalina tambien es preferente desde el punto de vista de una sintesis facil de un ester de fosfato de un derivado de androsterona en la posicion 3 que es un sustrato de fosfatasa alcalina.
A continuacion se explicara a modo de ejemplo un inmunoensayo enzimatico que usa fosfatasa alcalina (ALP) como enzima del complejo anticuerpo-enzima. La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima usada ampliamente como enzima de marcaje y, cuando el derivado de androsterona, el nuevo compuesto, se usa como sustrato de ALP en un inmunoensayo enzimatico que usa esta ALP, se produce androsterona como producto de reaccion. A continuacion, se usa 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3a-HSD), deshidrogenasa que usa el producto de reaccion de ALP como sustrato, en la reaccion de ciclo enzimatico.
El ciclo de tio-NAD permite la amplificacion y la cuantificacion del sustrato de deshidrogenasa con una eficacia de cientos de ciclos por minuto si se selecciona una reaccion de deshidrogenasa apropiada. En consecuencia, la actividad de la enzima que presenta tal sustrato como producto de reaccion se puede someter a ensayo mediante el ciclo de tio-NAD con una sensibilidad ultraalta.
[Kit para ciclo enzimatico]
La presente invencion describe ademas un kit para el metodo de ciclo enzimatico que incluye una enzima marcada con un vehiculo reactivo, un sustrato de la misma, una enzima para la reaccion de ciclo y tio-NAD y NADH como coenzima de la misma.
El vehiculo reactivo representa un anticuerpo, una sonda de acido nucleico, lectina y similar que tiene actividad de union frente al sujeto de medicion.
El vehiculo reactivo no se limita de forma particular si es un material adecuado para el sujeto de medicion, o un material adecuado para la enzima de marcaje y el sustrato de la misma.
Mas especificamente, la presente invencion describe un kit para un metodo de ciclo enzimatico que incluye una enzima de marcaje, un sustrato de la misma, una enzima para la reaccion de ciclo y tio-NAD y NADH como coenzima de la misma.
El kit de la presente invencion es un kit para inmunoensayo enzimatico que incluye los siguientes reactivos (1) a (5).
(1) fosfatasa alcalina (ALP), enzima que esta marcada con un anticuerpo especifico frente a un antigeno de proteina diana,
(2) derivado de androsterona representado por la formula (1), que es un sustrato de la enzima,
(3) deshidrogenasa (DH),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
Ademas, la presente invencion es un kit para medir una sonda de acido nucleico, que incluye los siguientes reactivos (1) a (5).
(1) fosfatasa alcalina (ALP), enzima que esta marcada con una sonda de acido nucleico que se une especificamente a un acido nucleico diana,
(2) derivado de androsterona representado por la formula (1), que es un sustrato de la enzima,
(3) deshidrogenasa (DH),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
Para la enzima de marcaje, la deshidrogenasa (DH) y el derivado de androsterona representado por la formula (1), los que se pueden usar son los descritos anteriormente en el metodo de la presente invencion como tales .
El kit de la presente invencion puede ser un anticuerpo marcado con enzima convencional y similar en combinacion con los reactivos que constituyen este kit. Este kit se puede usar en un inmunoensayo enzimatico que usa un
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metodo de ciclo enzimatico.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira basandose en Ejemplos. Sin embargo, tales Ejemplos se pueden modificar de forma diversa en el nivel tecnico de este campo.
Ensayo de fosfatasa alcalina y Pumilio que usa sistema de ciclo de tio-NAD de fosfatasa alcalina (ALP) y 3-fosfato de androsterona (A3P) como sistema de deteccion.
Ejemplo de Referencia 1
Fabricacion de anticuerpo marcado con ALP
Un anticuerpo monoclonal derivado de raton que tenia reactividad especifica frente a antigeno se dializo tres veces con solucion tampon de acido citrico 0,1 M (pH 3,5) durante 30 minutos. A la solucion de anticuerpo se anadio pepsina hasta un 0,5 % con respecto a la cantidad de anticuerpo, se mantuvo a 37 °C durante 1 hora, y a continuacion se ajusto a pH neutro con solucion tampon de Tris 1,5 M (pH 8,8). Esta solucion de reaccion mixta se filtro sobre gel usando una columna rellena con Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc.), para dar F(ab')2.
La ALP se marco mediante un kit de marcaje de ALP (DOJINDO LABORATORIES) usando 100 |jg de este F(ab')2.
Ejemplo de Referencia 2
Preparacion de vehiculo insoluble inmovilizado con anticuerpo 1
Una solucion de un anticuerpo policlonal derivado de cobaya que tenia reactividad especifica frente a antigeno disuelto en solucion tampon de carbonato sodico 50 mM (pH 9,6) a una concentracion de 100 jg/ml, se anadio a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) con 50 |jl de cada uno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora, y a continuacion se recogio la solucion de anticuerpo. Se anadieron 300 jl de TBS que contenian albumina de suero bovino (BSA) al 2 % y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 horas para llevar a cabo el tratamiento de bloqueo, para dar una microplaca con anticuerpo policlonal inmovilizado.
Ejemplo de Referencia 3
Preparacion de vehiculo insoluble inmovilizado con anticuerpo 2
Una solucion de un anticuerpo policlonal derivado de cobaya que tenia reactividad especifica frente a antigeno disuelto en solucion tampon de carbonato sodico 50 mM (pH 9,6) a una concentracion de 10 jg/ml, se anadio a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) con 50 jl de cada uno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la solucion del pocillo se retiro con succion, se anadieron 300 jl de TBS que contenian albumina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 horas para llevar a cabo el tratamiento de bloqueo, y se lavaron con TBS que contenia Tween 20 al 0,05 %, para dar una microplaca con anticuerpo policlonal inmovilizado.
<Ejemplo Comparativo 1>
Ensayo de Pumilio mediante metodo en una etapa usando 3-fosfato de 5a-androsterona
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de glicina 0,2 M (pH 8,8)
1,5 mM tio-NAD 1 mM NADH
3-fosfato de 5a-androsterona 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 1,2, 5, 10, 50, 100 y 200 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 2, se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 200 ng/ml, y la microplaca se agito a
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temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron a la microplaca 50 pl de TBS (pH 7,5) que conteman una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti- Pumilio marcado con ALP preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 1 a una concentracion de 2,5 |jg/ml, y la microplaca se agito durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, se anadieron 100 pl de la solucion de ensayo de reaccion a cada pocillo, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 2.
En el presente ensayo, se presentaron como problemas la mala reactividad de la enzima (fosfatasa alcalina) con el sustrato (3-fosfato de androsterona), y la inhibicion del sustrato en la reaccion de ciclo, y de ese modo se probo un metodo en dos etapas en el que se separan la reaccion enzimatica y la reaccion de ciclo. Ademas, se descubrio que la 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, en la reaccion de ciclo una enzima tenia actividad de fosfatasa, y fue una causa para el blanco, y de ese modo se determino usar una solucion tampon que contenia acido fosforico en el momento de la reaccion de ciclo del metodo en dos etapas.
<Ejemplo Comparativo 2>
Ensayo de Pumilio mediante metodo en dos etapas usando 3-fosfato de 5a-androsterona Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 8,3)
MgCl2 1 mM
3-fosfato de 5a-androsterona 0,1 mM Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de glicina 0,2 M que contenia hidrogenofosfato disodico 0,2 M (pH 9,6)
tio-NAD 3 mM
NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra de ensayo
0,5, 0,75, 1,2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 20, 50, 75, y 100 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 3, se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 100 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron a la microplaca 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti- Pumilio marcado con ALP preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 1 a una concentracion de 2,5 jg/ml, y la microplaca se agito durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion A, respectivamente, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se anadieron al pocillo 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion B, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 3.
Aunque se probo el metodo en dos etapas, la sensibilidad no aumento tanto como se esperaba y, de ese modo, se determino usar 3-fosfato de 5p-androsterona, que tiene una estructura diferente que la del 3-fosfato de 5a- androsterona usado hasta el momento, con el fin de mejorar la reactividad con fosfatasa alcalina.
Solucion de ensayo de reaccion
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solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 8,6)
MgCl2 0,5 mM tio-NAD 1,5 mM NADH 0,5 mM
3-fosfato de 5p-androsterona 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 1,2, 5, 8, 10, 20 y 50 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 3, se anadieron 50 |jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 50 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 1 a una concentration de 2,5 |jg/ml, y la microplaca se agito durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, a cada pocillo, se anadieron 50 jl de la solucion de ensayo de reaction, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 4.
<Ejemplo Comparativo 4> Ensayo de Pumilio mediante metodo en dos etapas usando 3-fosfato de 5p-androsterona
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 8,3)
MgCl2 1 mM
3-fosfato de 5p-androsterona 0,1 mM Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de glicina 0,2 M que contenia hidrogenofosfato disodico 0,2 M (pH 9,6)
tio-NAD 3 mM NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra de ensayo
0,005, 0,01, 0,05, 0,1,0,25, 0,5, 0,75, 1,2,5, 5, 10, 25 y 50 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 3, se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 50 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron a la microplaca 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 1 a una concentracion de 2,5 jg/ml, y la microplaca se agito durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion A, respectivamente, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se anadieron al pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion B, y la absorbancia se midio durante 10 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 10 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 5.
Se descubrio que el 3-fosfato de androsterona fue un sustrato de la reaccion de ciclo hasta el momento, y el aumento del blanco mediante este resultado se convirtio en un problema. Se determino que la causa fue la cetona en la posicion 17, y de ese modo se determino usar un sustrato en el que se retirara o se sustituyera la cetona en la posicion 17. Los 3a-hidroxiandrostanos sintetizados se muestran en la Figura 6. Ademas, los numeros de rotacion 5 de las reacciones de ciclo que los usan como sustrato se muestran en la Tabla 2. Entre ellos, el numero de rotacion de la 5a-androsterona fue el maximo, y los sustratos que estuvieron cerca de este fueron 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p- androstano y 5a-dihidrotestosterona. De ese modo, se sintetizo un ester de fosfato del primero, es decir, 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano y se aplico al ciclo de tio-NAD.
10
Tabla 2: numeros de rotacion de reacciones de ciclo con 3a-hidroxiandrostanos
Ciclos/min Valor relativo (%)
5a-Androsterona
623 100
5p-Androsterona
384 62
5a-17-CH3
200 32
5a-17-desoxo
241 39
5a-17-CH2
308 49
5p-17-CH3
114 18
5p-17p-OCH3
458 74
5a-DHT
535 86
Glicoquenodesoxicolato (Ejemplo de Referencia)
129 21
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CO
o.
3a-Hidroxi-17-metilen-5a-Androstano (5a-17-CH2)
3a-Hidroxi-17(3-metil-5(3-Androstano (5(3-17-CH3)
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5a-Dihidrotestosterona (5a-DHT)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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Glicoquenodesoxicolato sodico
<Ejemplo 1 > Ensayo de fosfatasa alcalina mediante metodo en una etapa usando 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p- metoxi-5p-androstano
Sintesis de 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano
A una solucion en piridina anhidra (4 ml) de oxicloruro de fosforo (0,26 ml), se anadio gota a gota una solucion en piridina anhidra (4 ml) que contenia de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano (200 mg) con refrigeracion en hielo, y la solucion de reaccion se agito adicionalmente durante 1 hora con refrigeracion en hielo. La solucion de reaccion se vertio en agua enfriada con hielo, y la solucion se hizo fuertemente alcalina (aproximadamente pH 11), y a continuacion se lavo con eter. A continuacion, se anadio acido clorhudrico concentrado a la fase acuosa para ajustar el pH a aproximadamente 2, y a continuacion se extrajo con eter. La fase de eter se seco con sulfato sodico anhidro, y a continuacion el disolvente se retiro por destilacion a presion reducida. El residuo se recristalizo con tetrahidrofurano-hexano para dar un cristal incoloro (210 mg).
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 5 = 0,73 (s, 3H, 18-CH), 0,95 (s, 3H, 19-CH), 3,19 (1 H, t, J = 8,6 Hz, 17a-H), 3,32 (s, 3H, -OCH3), 4,18 (m, 1 H, 3p-H). ESI-HR-MS Calculado para C20H35O5P-H: m/z 385,2149 [M-H]-. Encontrado m/z 385,2157; p.f. 187-188 °C.
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 9,5)
MgCl2 0,2 mM tio-NAD 0,6 mM NADH 4 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,5 mM 20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,2, 0,5, 1, y 2 mU/ml de fosfatasa alcalina (concentracion final: 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, y 1 mU/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 50 |jl de solucion tampon de Tris (pH 9,5) que contenia la sustancia patron (fosfatasa alcalina) en un intervalo de 0 a 2 mU/ml y, posteriormente, se anadieron 50 jl de solucion de ensayo de reaccion B a cada pocillo, respectivamente. A continuacion, la absorbancia se midio durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 7.
Posteriormente, que es una enzima de la reaccion de ciclo con respecto a la investigacion del metodo en dos etapas, como se ha descrito anteriormente, se uso una solucion tampon que contenia acido fosforico en el momento de la reaccion de ciclo con el fin de inhibir la actividad de fosfatasa en 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa. Sin embargo, se adopto una solucion tampon que contenia acido pirofosforico en lugar de la solucion tampon que contenia acido fosforico como solucion tampon que inhibe ademas esta actividad de fosfatasa.
Solucion de ensayo de reaccion A
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 9,5)
MgCl2 0,2 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 1 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,15 M (pH 9,5) tio-NAD 3 mM NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra de ensayo
1,5, 10, 15, 20 mU/ml de fosfatasa alcalina (concentracion final: 0,5, 2,5, 5, 7,5 y 10 mU/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 25 |jl de solucion tampon de Tris (pH 9,5) que contenia la sustancia patron (fosfatasa alcalina) en un intervalo de 0 a 20 mU/ml y, posteriormente, se anadieron 25 ml de solucion de ensayo de reaccion A al pocillo, respectivamente. La solucion de reaccion se mezclo, y se mantuvo a 37 °C en una incubadora durante 1 hora. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion B, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 20 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 20 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 8.
Ejemplo de Referencia 4
Purificacion de anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (ALP)
Se preparo anticuerpo marcado con ALP usando el kit de marcaje con ALP (DOJINDO LABORATORIES) a partir de 150 jg del F(ab')2 preparado en el Ejemplo de Referencia 1. Dado que esta solucion de anticuerpo marcado con ALP contenia diversos complejos que tenian diversos pesos moleculares de ALP y Fab, y la solucion anterior tenia variacion en la actividad, la solucion de anticuerpo marcado con ALP preparada se filtro en gel usando una columna superdex-200 (Amersham Biosciences, Inc.) rellena con solucion tampon de Tris (pH 7,0) que contenia MgCh 1 mM, ZnCl2 0,1 mM y BSA al 0,01 % como solucion de elucion, y se comparo la actividad de cada fraccion, y a continuacion solo se recogio la fraccion de anticuerpo marcado con ALP que tenia mayor proporcion S/N.
Ejemplo de Referencia 5
Preparacion de vehiculo insoluble inmovilizado con anticuerpo
Una solucion de un anticuerpo policlonal derivado de cobaya que tenia reactividad especifica frente a antigeno se disolvio en solucion tampon de carbonato sodico 50 mM (pH 9,6) a una concentracion de 10 jg/ml se anadio a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) con 50 jl cada uno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora, y a continuacion la solucion en el pocillo se retiro con succion, y se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %. A continuacion, se anadieron 200 jl de TBS que contenia albumina de suero bovino al 5 % (BSA) y se mantuvieron a 4 °C durante 2 horas a una noche para llevar a cabo el tratamiento de bloqueo, y se lavaron con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, para dar una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal.
<Ejemplo 3> Ensayo de Pumilio mediante metodo en una etapa
Solucion de ensayo de reaccion que usa 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano
solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 9,5) tio-NAD 1,5 mM NADH 2,5 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,1 mM 20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 2, 5, 10 y 25 ng/ml de Pumilio
5
10
15
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25
30
35
40
45
50
55
60
65
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 25 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuation el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %. Se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian solucion a 0,1 % de BSA que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 4 en una concentration de aproximadamente 0,8 |jg/ml, y la microplaca se agito a 4 °C durante 2 horas. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se lavo ademas con tBs. A continuacion, a cada pocillo, se anadieron 50 pl de la solucion de ensayo de reaction, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 9.
<Ejemplo 4> Ensayo de Pumilio mediante metodo en dos etapas usando 3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p- androstano
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de Tris 0,1 M (pH 9,5)
MgCl2 0,1 mM
3-fosfato de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,2 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,15 M (pH 9,5) tio-NAD 3 mM NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra
0,01, 0,025, 0,05, 0,1,0,25 y 0,5 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 0,5 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %. Se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de bSa al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con ALP preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 4 en aproximadamente 0,2 jg/ml y el F(ab')2 de raton a una concentracion de 1 mg/ml, y la microplaca se agito a 4 °C durante 2 horas. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el residuo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion A, respectivamente, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se anadieron al pocillo 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion B, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 10.
Aunque se uso un sustrato modificado en la position 17, la reaccion del blanco no se pudo retirar completamente como se ha descrito anteriormente. De ese modo, se uso p-galactosidasa como enzima de marcaje de ELISA, y se sintetizo p-D-galactosido de androsterona como sustrato de la misma, y la investigation prosiguio.
Ensayo de p-galactosidasa y Pumilio sistema de ciclo de tio-NAD de p-galactosidasa y 3-p-D-galactosido de androsterona usando como sistema de detection.
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10
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Smtesis de 3-p-D-galactosido de 5p-androsterona (nombre formal: 3-p-D-galactopiranosido de 5p-androsterona)
A una solucion en diclorometano (15 ml) de 5p-androsterona (290 mg), se anadieron MS4A (1,25 g) y 2,3,4,6-O- tetrabenzoil-1-tio-p-D-garactopiranosido de fenilo (1,03 g) y la solucion de reaccion se agito a -20 °C durante 15 minutos. A continuacion, se anadio a la solucion de reaccion N-yodosuccinimida (435 mg) y acido trifluorometano sulfonico (15 mg), se agito a -20 °C durante 2 horas, y a continuacion se hizo reaccionar adicionalmente a temperatura ambiente durante 2 horas. Se anadieron a la solucion de reaccion 250 |jl de trietilamina para detener la reaccion, y se lavo con una solucion mixta de carbonato sodico saturado y tiosulfato sodico 3:1, y solucion salina saturada secuencialmente. La fase organica se seco con sulfato sodico anhidro, y a continuacion el disolvente se retiro por destilacion a presion reducida. El residuo se disolvio en metanol (15 ml), y se anadio metoxido sodico al 28 % (500 jl) y la solucion de reaccion se agito durante 2 horas. Se anadio acido acetico a la solucion de reaccion para neutralizarla, y a continuacion se evaporo hasta sequedad a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de silice (24 x 240 mm, 10 % de metanol-cloroformo), y a continuacion se recristalizo en metanol para dar un cristal incoloro (360 mg).
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 5 = 0,85 (s, 3H, 18-CH), 0,97 (s, 3H, 19-CH), 3,44-3,49 (m a, 3H, H-2', H-3', H-5'), 3,70 (d, 1 H, H-6'a), 3,72 (d, 1 H, H-6'b), 3,73 (m, 1 H, 3p-H), 3,81 (d, 1 H, H-4'), 4,33 (d, 1 H, H-1', Jr, 2- = 6,2 Hz) ESI-HR-MS Calculado para C25H40O7-H: m/z 451,2701 [M-H] -. Encontrado m/z 451,2711 p.f. 130-135 °C.
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,3)
MgCl2 0,2 mM
p-D-galactosido de 5p-androsterona 0,1 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0) tio-NAD 1,2 mM NADH 3,6 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra
1,4, 10, 40, 100, y 200 pg/ml de p-galactosidasa (concentracion final: 0,5, 2, 5, 20, 50 y 100 pg/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 25 jl de una solucion tampon de fosfato (pH 7,3) que contenia la sustancia patron (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 200 pg/ml, y posteriormente, se anadieron 25 jl de la solucion de ensayo de reaccion A al pocillo, respectivamente. La solucion de reaccion se mezclo, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 60 minutos. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion B, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 11.
<Ejemplo 6> Ensayo de p-galactosidasa mediante metodo en una etapa usando p-D-galactosido de 5p-androsterona (no es parte de la presente invencion)
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,7)
MgCl2 10 mM tio-NAD 6 mM NADH 1 mM
p-D-galactosido de 5p-androsterona 0,1 mM 40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
5, 10, 25, 50, 100, y 250 pg/ml de p-galactosidasa (concentracion final: 2,5, 5, 12,5, 25, 50 y 125 pg/ml)
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A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 50 |jl de una solucion tampon de fosfato (pH 7,7) que contenia la sustancia patron (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 250 pg/ml, y posteriormente, se anadieron a cada pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion B, respectivamente. La absorbancia se midio durante 120 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 120 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 12.
<Ejemplo 7> Ensayo de p-galactosidasa mediante metodo en dos etapas usando p-D-galactosido de 5p- androsterona (no es parte de la presente invencion)
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,5)
MgCl2 10 mM
p-D-galactosido de 5p-androsterona 0,1 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0) tio-NAD 4,8 mM NADH 0,4 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra
1,4, 10, 40, 100 y 200 pg/ml de p-galactosidasa (concentracion final: 0,5, 2, 5, 20, 50 y 100 pg/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 25 jl de una solucion tampon de fosfato (pH 7,5) que contenia la sustancia patron (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 200 pg/ml, y posteriormente, se anadieron al pocillo 25 jl de solucion de ensayo de reaccion A, respectivamente. La solucion de reaccion se mezclo, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 60 minutos. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 jl de solucion de ensayo de reaccion B, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 13.
<Ejemplo 8> Ensayo de p-galactosidasa mediante metodo en una etapa usando p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p- metoxi-5p-androstano (no es parte de la presente invencion)
Sintesis de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano p-D-galactosido de (nombre formal: 3-p-D-galactopiranosido de 3a- hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano)
A una solucion en diclorometano (15 ml) de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano (306 mg), se anadieron MS4A (1,25 g) y 2,3,4,6-O-tetrabenzoil-1-tio-p-D-garactopiranosido de fenilo (1,03 g) y la solucion de reaccion se agito a - 20 °C durante 15 minutos. A continuacion, se anadieron N-yodosuccinimida (435 mg) y acido trifluorometano sulfonico (15 mg), la solucion de reaccion se agito a -20 °C durante 2 horas, y a continuacion se hizo reaccionar adicionalmente a temperatura ambiente durante 2 horas. Se anadieron a la solucion de reaccion 250 jl de trietilamina para detener la reaccion, y se lavo secuencialmente con una solucion mixta de carbonato sodico saturado y tiosulfato sodico 3:1 y solucion salina saturada. La fase organica se seco con sulfato sodico anhidro, y a continuacion el disolvente se retiro por destilacion a presion reducida. El residuo se disolvio en metanol (15 ml) y se anadio metoxido sodico al 28 % (500 jl) y la solucion de reaccion se agito durante 2 horas. Se anadio acido acetico a la solucion de reaccion para neutralizarla, y a continuacion se evaporo hasta sequedad a presion reducida. El residuo se purifico con cromatografia en columna sobre gel de silice (24 x 240 mm, 10 % de metanol-cloroformo), y a continuacion se recristalizo en acetona-hexano para dar un cristal incoloro (383 mg).
RMN 1H (400 MHz, Metanol-d4) 5 = 0,73 (s, 3H, 18-CH3), 0,95 (s, 3H, 19-CH), 3,26 (t, 1 H, J = 8,6 Hz, 17a-H), 3,32 (s, 3H, -OCH3), 3,45-3,51 (m a, 3H, H-2', H-3', H-5'), 3,71 (s, 1 H, H-6'a), 3,73 (d, 1 H, H-6'b), 3,74 (m, 1 H, 3p-H), 3,81 (d, 1 H, H-4'), 4,33 (d, 1 H, H-1', Jr,2- = 7,5 Hz). ESI-HR-MS Calculado para C26H44O7-H: m/z 467,3014 [M-H]-. Encontrado m/z 451,3026; p.f. 197-199 °C.
5
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20
25
30
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40
45
50
55
60
65
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 8,5)
MgCl2 10 mM tio-NAD 6 mM NADH 1 mM
p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,2 mM 20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
5, 10, 25, 50, 100, y 250 pg/ml de p-galactosidasa (concentracion final: 2,5, 5, 12,5, 25, 50 y 125 pg/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 50 jl de una solucion tampon de fosfato (pH 8,5) que contenia la sustancia patron (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 250 pg/ml, y posteriormente, se anadieron a cada pocillo 50 |jl de la solucion de ensayo de reaccion B, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 120 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 120 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 14.
<Ejemplo 9> Ensayo de p-galactosidasa mediante metodo en dos etapas usando p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p- metoxi-5p-androstano (no es parte de la presente invencion)
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,5)
MgCl2 4 mM
p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,1 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,1 M (pH 9,8) tio-NAD 1,2 mM NADH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra
1,4, 10, 40, 100 y 200 pg/ml de p-galactosidasa (concentracion final: 0,5, 2, 5, 20, 50 y 100 pg/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 25 jl de una solucion tampon de fosfato (pH 7,5) que contenia la sustancia patron (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 200 pg/ml, y posteriormente, se anadieron 25 jl de la solucion de ensayo de reaccion A al pocillo, respectivamente. La solucion de reaccion se mezclo, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 60 minutos. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion B, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 15.
A continuacion se describen algunos ejemplos de mediciones de Pumilio usando p-D-galactosido de androsterona. Sin embargo, no hay ningun anticuerpo que tenga reactividad especifica frente a antigeno y esta directamente marcado con p-galactosidasa, y de ese modo se intenta el metodo de Estreptoavidina Biotina Marcada (LSAB).
Ejemplo de Referencia 6
Fabricacion de anticuerpo marcado con biotina
Se preparo un anticuerpo marcado con biotina a partir de un kit de marcaje con biotina (DOJINDO LABORATORIES) usando 50 jg del F(ab')2 obtenido en el Ejemplo de Referencia 1.
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<Ejemplo 10> Ensayo de Pumilio mediante metodo en una etapa usando p-D-galactosido de 5p-androsterona (no es parte de la presente invention)
Solution de ensayo de reaction
solution tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,7)
MgCl2 5 mM tio-NAD 1,2 mM NADH 0,8 mM
p-D-galactosido de 5p-androstano 0,05 mM 20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 2,5 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 |jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 2,5 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuation, la solucion en el pocillo se retiro con suction, y a continuation el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con biotina preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 6 en una concentration de aproximadamente 0,1 |jg/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia p-galactosidasa marcada con estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentracion de 0,1 U conjugado/ml, y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, a cada pocillo, se anadieron 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 16.
<Ejemplo 11 > Ensayo de Pumilio mediante metodo en dos etapas usando p-D-galactosido de 5p-androsterona (no es parte de la presente invencion)
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,5)
MgCl2 0,1 mM
p-D-galactosido de 5p-androsterona 0,05 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0) tio-NAD 3 mM NADH 2 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa Muestra
0,05, 0. 1,0,5, 1,2,5 y 5 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 5 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con biotina preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 6 en una concentracion de aproximadamente 0,1 jg/ml, y la
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microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia p-galactosidasa marcada con estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentracion de 0,1 U conjugado/ml, y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, a cada pocillo, se anadieron 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion A, respectivamente, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se anadieron al pocillo 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion B, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 17.
<Ejemplo 12> Ensayo de Pumilio mediante metodo en una etapa usando p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi- 5p-androstano (no es parte de la presente invention)
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 8,5) tio-NAD 1,2 mM NADH 0,8 mM
p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,05 mM 20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,1, 0,5, 1,2,5, 5 y 10 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 10 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con biotina preparado en el metodo del Ejemplo de Referencia 6 en una concentracion de aproximadamente 0,1 pg/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia p-galactosidasa marcada con Estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentracion de 0,1 U conjugado/ml, y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, a cada pocillo, se anadieron 50 pl de la solucion de ensayo de reaccion, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 18.
<Ejemplo 13> Ensayo de Pumilio mediante metodo en dos etapas usando p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi- 5p-androstano (no es parte de la presente invencion)
Solucion de ensayo de reaccion A
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,0)
p-D-galactosido de 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 0,05 mM
Solucion de ensayo de reaccion B
solucion tampon de pirofosfato 0,1 M (pH 9,0) tio-NAD 2,4 mM NADH 2 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
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Muestra
0,25, 0,5, 1,2,5, 5, 10 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 |jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 10 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuation el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con biotina preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 6 en una concentration de aproximadamente 0,3 mg/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia p-galactosidasa marcada con estreptoavidina (F. Hoffmann-La Roche Ltd) en una concentracion de 0,1 U conjugado/ml, y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %, y se lavo ademas con TBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 50 jl de la solucion de ensayo de reaction A, respectivamente, y la microplaca se incubo a 37 °C durante 60 minutos. Posteriormente, al pocillo, se anadieron 50 jl de solucion de ensayo de reaccion B, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 19.
<Ejemplo de Referencia 7> Ensayo de Pumilio usando fosfato de p-nitrofenilo (p-NPP)
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de glicina 0,1 M (pH 10,3)
MgCl2 1 mM ZnCl2 1 mM 1 mg/ml de p-NPP
Muestra de ensayo
0, 1,2,5, 5, 10 y 25 ng/ml de Pumilio
Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 3, se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 25 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con ALP preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia en una concentracion de 1 |jg/ml, y la microplaca se agito durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion la microplaca se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron 100 jl de la solucion de ensayo de reaccion a cada pocillo, y la absorbancia se midio durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 30 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 20.
<Ejemplo de Referencia 8 (no de acuerdo con la invencion)> Ensayo de p-galactosidasa usando p-D- galactopiranosido de o-nitrofenilo (ONPG)
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,3)
2-mercaptoetanol 0,2 mM MgCl2 1 mM ONPG 10 mM
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2, 10, 20 y 50 ng/ml de p-galactosidasa (concentracion final: 1,5, 10 y 25 ng/ml)
Metodo de ensayo
A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 50 |jl de una solucion tampon de fosfato (pH 7,3) que contenia la sustancia patron (p-galactosidasa) en un intervalo de 0 a 25 ng/ml, y posteriormente, al pocillo, se anadieron 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 60 minutos usando un filtro de 415 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 21.
Metodo de calculo del limite de deteccion y el limite de cuantificacion
La cantidad del cambio de absorbancia de cada resultado de medicion se representa con respecto a las concentraciones de la sustancia patron, y solo las concentraciones en paralelo en la linea recta se extraen para preparar una curva de ajuste. A continuation, se calcula la desviacion tipica del blanco (sin incluir la sustancia patron; n > 3), y el valor 3 veces y el valor 10 veces de la misma se dividen por la pendiente de la curva de ajuste, y los valores numericos obtenidos se toman como el limite de deteccion y el limite de cuantificacion, respectivamente.
El limite de deteccion y el limite de cuantificacion calculados de cada resultado de experimento se resumen en las Tablas 3, 4 y 5.
Tabla 3
Limite de deteccion y limite de cuantificacion de fosfatasa alcalina y p-Galactosidasa
Ensayo de ALP y p-Gal (unidades: mol)
Enzima
Sustrato Metodo Limite de deteccion Limite de cuantificacion
ALP
17-OMe 5p-A3P Una etapa 3,25 x 10-18 1,08 x 10-17
Dos etapas
8,19 x 10-20 2,73 x 10-19
p-Gal
5a-AG Dos etapas 3,89 x 10-19 1,3 x 10-18
5p-AG
Una etapa 3,31 x 10-19 1,1 x 10-18
Dos etapas
7,48 x 10-20 2,49 x 10-19
17-OMe 5p-AG
Una etapa 3,21 x 10-19 1,07 x 10-18
Dos etapas
1,09 x 10-19 3,64 x 10-19
ONPG
4,5 x 10-17 1,5 x 10-16
4-MUG
9,76 x 10-18 3,25 x 10-17
Tabla 4
Limite de deteccion y limite de cuantificacion de proteina Pumilio (sistema de p-Galactosidasa) Ensayo ELISA (unidades: mol)
Limite de deteccion Limite de cuantificacion
5p-AG
Una etapa 2,21 x 10-17 7,35 x 10-17
Dos etapas
1,65 x 10-17 5,51 x 10-17
17-OMe 5p-AG
Una etapa 3,24 x 10-17 1,08 x 10-16
Dos etapas
3,17 x 10-17 1,06 x 10-16
4-MUG
2,07 x 10-16 6,91 x 10-16
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Tabla 5
Limite de detection y limite de cuantificacion de proteina Pumilio (sistema de fosfatasa alcalina)
Ensayo ELISA
Sustrato
Limite de deteccion Limite de cuantificacion
5a-A3P
Una etapa 3,57 x 10-14 7,3 x 10-14
Dos etapas
2,63 x 10-16 8,76 x 10-16
5p-A3P
Una etapa 3,96 x 10-15 1,32 x 10-14
Dos etapas
1,2 x 10-16 4 x 10-16
17-OMe 5p-A3P
Una etapa 4,0 x 10-17 1,3 x 10-16
Dos etapas
2,45 x 10-18 8,17 x 10-18
p-NPP
3,97 x 10-16 1,32 x 10-15
<Ejemplo 14>
Ensayo de peroxidasa de rabano (no es parte del ambito de la invention) mediante metodo en una etapa usando 3a- terc-butil-peroxi-5p-androsterona
imagen14
Smtesis de 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona
Se disolvio 3a-cloro-5p-androsterona (100 mg) en una solution de diclorometano (15 ml), para preparar la solution de ensayo de reaction. A la presente solucion, se anadio una solucion de hidroperoxido de terc-butilo (30 mg) disuelto en una solucion acuosa (15 ml) de hidroxido sodico al 20 %, y la solucion de reaccion se hizo reaccionar con agitation a temperatura ambiente durante 2 horas. La fase organica se recogio de la solucion de reaccion, y se lavo con una solucion acuosa de hidrogenocarbonato sodico saturado y solucion salina saturada, secuencialmente. La fase organica se deshidrato con sulfato sodico anhidro, y a continuation el disolvente se retiro por destilacion a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografia sobre gel de silice (24 x 240 mm, 10 % de metanol- cloroformo), y a continuacion se obtuvieron 88 mg del presente compuesto. La identification del presente compuesto se llevo a cabo mediante RMN 1H, ESI-HR-MS y p.f. (punto de fusion).
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,0)
MgCl2 10 mM tio-NAD 6 mM NADH 1 mM
3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona 0,1 mM 40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
5, 10, 25, 50, 100 y 250 pg/ml de peroxidasa de rabano (concentration final: 2,5, 5, 12,5, 25, 50 y 125 pg/ml)
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A un pocillo de microplaca de fondo plano, se anadieron 50 |jl de una solucion tampon de fosfato (pH 7,0) que contenia la sustancia patron (peroxidasa de rabano) (denominada en lo sucesivo HRP) en un intervalo de 0 a 250 pg/ml, y posteriormente, al pocillo, se anadieron 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 120 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 120 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 22.
<Ejemplo 15>
Ensayo de Pumilio mediante metodo en una etapa usando 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona (no es parte de la presente invencion)
Solucion de ensayo de reaccion
solucion tampon de fosfato 0,1 M (pH 7,0)
MgCl2 10 mM tio-NAD 6 mM NADH 1 mM
3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona 0,1 mM 40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Muestra
0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 y 2,5 ng/ml de Pumilio Metodo de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el metodo del Ejemplo de Referencia 5, se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de BSA al 0,1 % que contenia Pumilio purificado (sustancia patron) en un intervalo de 0 a 2,5 ng/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuation, la solucion en el pocillo se retiro con suction, y a continuation el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %. Se anadieron 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenian una solucion de bSa al 0,1 % que contenia el anticuerpo monoclonal de raton anti-Pumilio marcado con HRP en una concentracion de aproximadamente 0,1 |jg/ml, y la microplaca se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La solucion en el pocillo se retiro con succion, y a continuacion el pocillo se lavo con TBS (pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,5 %. A continuacion, a cada pocillo, se anadieron 50 jl de la solucion de ensayo de reaccion, respectivamente, y la absorbancia se midio durante 60 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de absorbancia durante 60 minutos se represento con respecto a las concentraciones de la sustancia patron. La linea recta obtenida con buena dependencia con la concentracion se muestra en la Figura 23.
<Ejemplo de Referencia 9>
Sintesis de 3a-benzoil-peroxi-5p-androsterona y 3a-acetil-peroxi-5p-androsterona
El compuesto del titulo se obtuvo de forma similar a la sintesis de 3a-terc-butil-peroxi-5p-androsterona descrita en el Ejemplo 14 excepto en que se cambio hidroperoxido de terc-butilo por hidroperoxido de benzoilo o hidroperoxido de acetilo.
3a-benzoil-peroxi-5p-Androsterona
imagen15
3a-acetil-peroxi-5p-Androsterona
5
imagen16
La presente invention se puede usar de forma adecuada en el campo del examen clmico o en el campo del examen 10 alimentario que demanda una medicion de elevada sensibilidad sencilla.

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para someter a ensayo la actividad enzimatica usando un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usa fosfatasa alcalina como la enzima del complejo anticuerpo-enzima y se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) como un sustrato de la enzima,
    imagen1
    en la que
    X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi, o un grupo alquilo Ci-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la formula (1) como un sustrato de fosfatasa alcalina,
    y
    la cuantificacion de un producto de la reaccion enzimatica se lleva a cabo mediante la produccion de tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o de tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por tio-NADH y/o por tio-NADPH producido.
  2. 2. Un metodo para someter a ensayo una sonda de acido nucleico usando una sonda de acido nucleico marcada con enzima, en el que se usa fosfatasa alcalina como la enzima de la sonda de acido nucleico marcada con enzima, y se usa un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) como un sustrato de la enzima,
    imagen2
    en la que
    X representa un grupo fosfato, e Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6 cuando se usa el derivado de androsterona representado por la formula (1) como un sustrato de fosfatasa alcalina,
    y
    la cuantificacion de un producto de reaccion de la reaccion enzimatica se lleva a cabo mediante la produccion de tio- NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclo enzimatico usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), y sometiendo a ensayo la cantidad de tio-NADH y/o de tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color por tio-NADH y/o por tio-NADPH producido.
  3. 3. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6.
  4. 4. Un kit para inmunoensayo enzimatico que comprende los reactivos (1) a (5) descritos a continuation:
    (1) fosfatasa alcalina marcada con un anticuerpo especifico frente a un antigeno de la proteina diana,
    (2) un derivado de androsterona representado por la formula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    imagen3
    en la que X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi Ci-6, o un grupo alquilo Ci-6,
    (3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
    (4) NADH y/o NADPH, y
    (5) tio-NAD y/o tio-NADP.
  5. 5. Un kit para someter a ensayo una sonda de acido nucleico que comprende los siguientes reactivos (1) a (5):
    (1) fosfatasa alcalina marcada con una sonda de acido nucleico que se une espedficamente a un acido nucleico diana,
    (2) un derivado de androsterona representado por la formula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
    imagen4
    en la que X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6, o un grupo alquilo C1-6,
    (3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD),
    (4) NADH y/o NADPH, y
    (5) tio-NAD y/o tio-NADP.
  6. 6. Derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1):
    imagen5
    en la que las definiciones de X, Y1 e Y2 son las siguientes:
    X representa un grupo fosfato, Y1 e Y2 representan conjuntamente un grupo metileno, o Y1 representa hidrogeno e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
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