ES2725150T3

ES2725150T3 - Biomarcador

Info

Publication number: ES2725150T3
Application number: ES09805934T
Authority: ES
Inventors: Richard Morgan; Hardev S Pandha
Original assignee: University of Surrey
Current assignee: University of Surrey
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2019-09-19
Anticipated expiration: 2029-12-21
Also published as: MX343251B; RU2573925C2; MX2011006773A; AU2009332712A1; ZA201105184B; WO2010073001A1; US20120020888A1; CN102301006A; CA2747760A1; JP2012513584A; IL213510A0; US9624548B2; AU2009332712B2; CN102301006B; RU2011130795A; EP2382327A1; EP2382327B1; BRPI0923525A2; GB0823445D0; NZ593392A

Abstract

Un método para diagnosticar el cáncer de vejiga en un paciente, comprendiendo dicho método: (a) determinar una cantidad de un biomarcador en una muestra de orina o de tejido de vejiga obtenida de un paciente; (b) comparar la cantidad del biomarcador en la muestra de orina o de tejido de vejiga procedente del paciente con la cantidad del biomarcador en un control normal; en el que una diferencia en la cantidad del biomarcador en la muestra de orina o de tejido de vejiga procedente del paciente, comparada con la cantidad del biomarcador en un control normal, se asocia con la presencia de cáncer de vejiga, en el que el biomarcador comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:1, o uno de sus fragmentos que codifica al menos 250 aminoácidos de SEQ ID NO:2, o un variante que presenta al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, o una molécula de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico; o (ii) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:2, o uno de sus fragmentos que contiene al menos 250 aminoácidos, o un variante que presenta al menos 85% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2, o una molécula de aminoácidos que comprende dicha secuencia de aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcador.

La presente solicitud se refiere a biomarcadores, en particular a biomarcadores para el cáncer de vejiga y el cáncer de pulmón.

El cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en hombres y el décimo cáncer más común en mujeres; se producen 10.000 casos nuevos anuales en el Reino Unido y 63.000 en EE. UU. En la actualidad, el diagnóstico se realiza examinando células en la orina que se han desprendido de la pared de la vejiga (citología) o retirando tejido de la vejiga para realizar una biopsia. La citología es muy específica, pero tiene una sensibilidad baja, y ambas técnicas son caras y largas. Un marcador bioquímico fiable para el cáncer de vejiga sería muy beneficioso para los pacientes.

Con respecto a los tipos de cáncer de vejiga, 90% de los casos son carcinomas de células de transición ("Transitional Cell Carcinomas", TCC) que surgen del revestimiento interior de la vejiga, el urotelio. El 10% restante de cánceres de vejiga son el carcinoma de células escamosas, el adenocarcinoma, el sarcoma o el carcinoma microcítico.

El cáncer de pulmón es el cáncer más común a nivel mundial, con 1,35 millones de nuevos casos anuales, de los cuales 38.000 se producen en el Reino Unido. No está disponible ningún método bioquímico fiable para el diagnóstico del cáncer de pulmón; en la actualidad, el diagnóstico se realiza mediante rayos X, seguido de broncoscopía y/o un barrido de tomografía computerizada ("computerised tomography", CT). Un ensayo bioquímico fiable basado en un único marcador en el suero o en el esputo sería muy beneficioso para los pacientes, y también podría acelerar el diagnóstico. Además, es probable que dicho ensayo sea mucho más barato que los métodos existentes.

Existen varios tipos de cáncer de pulmón. Los cánceres de pulmón no microcíticos ("non-small cell lung cancers", NSCLC) se agrupan debido a que su prognosis y gestión son similares. Consisten en el carcinoma pulmonar de células escamosas, el adenocarcinoma y carcinoma de pulmón macrocítico. El NSCLC es la forma más prevalente de cáncer de pulmón y constituye hasta 80,4% de los casos. El carcinoma de pulmón microcítico ("small cell lung carcinoma, SCLC) comprende 16,8% de los casos. El SCLC a menudo tiene una función endocrina que es un componente importante de la enfermedad. Los cánceres carcinoides y de sarcoma comprenden 0,8% y 0,1% de los casos, respectivamente, siendo 1,9% de los casos de un tipo no especificado.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar el cáncer de vejiga en un paciente, comprendiendo dicho método:

(a) determinar una cantidad de un biomarcador en una muestra de orina o de tejido de vejiga obtenida de un paciente;

(b) comparar la cantidad del biomarcador en la muestra de orina o de tejido de vejiga procedente del paciente con la cantidad del biomarcador en un control normal;

en el que una diferencia en la cantidad del biomarcador en la muestra de orina o de tejido de vejiga procedente del paciente, comparada con la cantidad del biomarcador en un control normal, se asocia con la presencia de cáncer de vejiga, en el que el biomarcador comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:1, o uno de sus fragmentos que codifica al menos 250 aminoácidos de SEQ ID NO:2, o un variante que presenta al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, o una molécula de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico; o

(ii) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:2, o uno de sus fragmentos que contiene al menos 250 aminoácidos, o un variante que presenta al menos 85% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2, o una molécula de aminoácidos que comprende dicha secuencia de aminoácidos.

A este respecto, SEQ ID NO:1 se corresponde con la secuencia de ácido nucleico del gen Engrailed-2 (EN2) (GenBank, n.° de referencia NM_001427) y SEQ ID NO:2 se corresponde con la proteína EN2 codificada por la secuencia (NCBI, n.° de registro P19622, gi21903415).

De forma sorprendente, se ha descubierto que el gen EN2 se encuentra significativamente sobrerregulado en el cáncer de vejiga y el cáncer de pulmón.

El gen EN2 codifica un factor de transcripción que contiene un homeodominio que tiene una serie de funciones importantes en el desarrollo temprano, que incluyen la conducción axonal y la formación de fronteras (analizado en Morgan R. (2006), Engrailed: Complexity and economy of a multifunctional transcription factor, FEBS Letters, 580, 2531-2533, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad). Su n.° de referencia de NCBI/GenBank es de NM_001427. Se ha indicado previamente que actúa como un oncogén en el cáncer de mama, aunque no se le ha atribuido ninguna importancia para el diagnóstico (Martin, N.L., Saba-El-Leil, M.K., Sadekova, S., Meloche, S. y Sauvageau, G. (2005), EN-2 is a candidate oncogene in human breast cancer, Oncogene, 24, 6890-6901, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad). El producto del gen EN2 es una proteína de 33 kDa (EN2).

Preferiblemente, sus fragmentos o variantes comprenden:

(i) una secuencia de ácido nucleico que presenta al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con SEQ ID NO:1, una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse con ella bajo condiciones rigurosas y/o una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con ella;

(ii) una secuencia de aminoácidos que presenta al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2, o

(iii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de (i).

Dicho de otra forma, según la anterior parte (iii), se prefiere que sus fragmentos o variantes comprendan:

(A) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico, en la que dicha secuencia de ácido nucleico presenta al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con SEQ ID NO:1;

(B) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico, en la que dicha secuencia de ácido nucleico puede hibridarse bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que presenta al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con SEQ ID NO:1; o

(C) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico, en la que dicha secuencia de ácido nucleico es complementaria con una secuencia de ácido nucleico que presenta al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con SEQ ID NO:1.

Sus fragmentos comprenden al menos aproximadamente 250 aminoácidos de SEQ ID NO:2 o los correspondientes fragmentos codificadores de SEQ ID NO:1. Los fragmentos también pueden incluir péptidos truncados de los que se han delecionado x aminoácidos del extremo N-terminal y/o C-terminal. En dichos truncamientos, x puede ser 1 o más (concretamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más), pero preferiblemente es menos de 150 aminoácidos de SEQ ID NO:2 o los correspondientes fragmentos codificadores de SEQ ID NO:1. Preferiblemente, sus fragmentos o variantes son sus fragmentos o variantes funcionales.

Los métodos de la presente invención pueden usarse para detectar la aparición, el avance, la estabilización, la mejora y/o la remisión del cáncer de vejiga.

Preferiblemente, el control puede proceder de una muestra previa del mismo paciente, para así controlar la aparición o el avance. Sin embargo, también se prefiere que el control pueda normalizarse para una población, en particular una población sana o normal en la que no exista cáncer de vejiga o cáncer de pulmón. En otras palabras, el control puede consistir en el nivel de un biomarcador que se encuentra en una muestra control normal procedente de un sujeto normal.

Por consiguiente, en un ejemplo de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar o controlar el avance del cáncer de vejiga, que comprende detectar y/o cuantificar el biomarcador específico de cáncer en un fluido biológico obtenido de un paciente.

Se prefieren proporcionar al menos dos etapas de detección y/o cuantificación, separadas en el tiempo.

Preferiblemente, las etapas se separan en unos pocos días, semanas, años o meses, para determinar si han cambiado los niveles del biomarcador específico de cáncer, lo cual indica si se ha producido un cambio en el avance del cáncer y permite realizar comparaciones entre el nivel del biomarcador en muestras tomadas en dos o más ocasiones, puesto que un aumento en el nivel del biomarcador a lo largo del tiempo es indicativo de la aparición o el avance del cáncer, mientras que una disminución en el nivel del biomarcador puede indicar la mejora y/o la remisión del cáncer.

Preferiblemente, la diferencia en el nivel del biomarcador es estadísticamente significativa, y se determina usando un "ensayo de la t” que proporciona intervalos de confianza de preferiblemente al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente al menos aproximadamente 99,5%, preferiblemente al menos aproximadamente 99,95%, preferiblemente al menos aproximadamente 99,99%.

Los biomarcadores y los métodos de la invención son particularmente útiles para detectar el cáncer de estadio temprano y son más sensibles que los métodos conocidos para detectar el cáncer de vejiga de estadio temprano. Así, los biomarcadores y métodos de la invención son particularmente útiles para confirmar el cáncer cuando un paciente ha dado un resultado negativo para el cáncer usando métodos convencionales.

La prognosis y la elección del tratamiento dependen del estadio del cáncer y del estado de salud general del paciente.

Con relación al cáncer de vejiga, los estadios se definen según el cáncer esté presente solo en el revestimiento de la vejiga o si se ha diseminado hacia otras áreas. Para planificar el tratamiento, resulta deseable conocer el estadio de la enfermedad. Así, tras haber diagnosticado el cáncer de vejiga, en general se realizan otros ensayos para determinar el estadio del cáncer.

El estadio 0 es un cáncer muy temprano. En este estadio, el cáncer solo se encuentra sobre el revestimiento interno de la vejiga. Después de retirar el cáncer, no se observa hinchazón ni bultos durante un examen interno. En el estadio I, las células del cáncer se han introducido un poco más en el revestimiento interno de la vejiga, pero no se han diseminado hacia la pared muscular de la vejiga. En el estadio II, las células del cáncer se han propagado hasta el revestimiento interno de los músculos que revisten la vejiga. En el estadio III, las células del cáncer se han extendido a través de la pared muscular de la vejiga hasta la capa de tejido que rodea la vejiga y/o hasta los órganos reproductivos cercanos. En este estadio, todavía puede observarse hinchazón o bultos, incluso después de que el tejido canceroso se haya retirado de modo quirúrgico. En el estadio IV, las células del cáncer se han extendido hasta la pared del abdomen o la pelvis o hasta los nódulos linfáticos cercanos. Los nódulos linfáticos son estructuras pequeñas con forma de judía que se encuentran a lo largo del cuerpo; producen y almacenan las células que combaten las infecciones. El cáncer también puede haberse extendido hasta los nódulos linfáticos y otras partes del cuerpo alejadas de la vejiga.

Se apreciará que la expresión "estadio temprano", tal como se emplea en la presente, puede referirse al estadio 0, al estadio I y/o al estadio II del cáncer de vejiga.

Con respecto a la expresión "estadio tardío", tal como se emplea en la presente, se apreciará que esta expresión puede referirse al estadio III y/o al estadio IV del cáncer de vejiga.

Se apreciará que la naturaleza de "estadio temprano" y "estadio tardío" de los estadios de una enfermedad de cáncer pueden ser determinados por un médico. También se contempla que puedan estar asociados con estadios no metastásicos y metastásicos, respectivamente.

Se proporcionan métodos según la presente invención para detectar el cáncer de estadio temprano, en los que un aumento entre el control y la muestra obtenida del paciente es indicativo de un cáncer de estadio temprano. Preferiblemente, el aumento es de al menos aproximadamente 100%, preferiblemente al menos aproximadamente 125%, preferiblemente al menos aproximadamente 150%, preferiblemente al menos aproximadamente 200%, preferiblemente al menos aproximadamente 250%, preferiblemente al menos aproximadamente 300%, preferiblemente al menos aproximadamente 500%.

También se proporcionan métodos según la presente invención para detectar el cáncer de estadio tardío, en los que un aumento entre el control y la muestra obtenida del paciente es indicativo de un cáncer de estadio tardío. Preferiblemente, el aumento es de al menos aproximadamente 100%, preferiblemente al menos aproximadamente 125%, preferiblemente al menos aproximadamente 150%, preferiblemente al menos aproximadamente 200%, preferiblemente al menos aproximadamente 250%, preferiblemente al menos aproximadamente 300%, preferiblemente al menos aproximadamente 500%, preferiblemente al menos aproximadamente 750%, preferiblemente al menos aproximadamente 1000%, preferiblemente al menos aproximadamente 1500%.

La presente invención permite controlar un cambio en el estadio del cáncer, en el que un aumento, con relación a una muestra de estadio más temprano o control, es indicativo del avance del cáncer desde un estadio más temprano a un estadio más tardío de la enfermedad, por ejemplo, desde el estadio 0 al estadio I, desde el estadio I al estadio II, desde el estadio II al estadio III, desde el estadio III al estadio IV, desde un estadio temprano a un estadio tardío, o desde un estadio limitado de la enfermedad a un estadio extendido de la enfermedad. Preferiblemente, el aumento es de al menos aproximadamente 100%, preferiblemente al menos aproximadamente 125%, preferiblemente al menos aproximadamente 150%, preferiblemente al menos aproximadamente 200%, preferiblemente al menos aproximadamente 250%, preferiblemente al menos aproximadamente 300%, preferiblemente al menos aproximadamente 500%, preferiblemente al menos aproximadamente 750%, preferiblemente al menos aproximadamente 1000%, preferiblemente al menos aproximadamente 1500%.

En los métodos relacionados con el cáncer de vejiga, se prefiere que el biomarcador específico del cáncer de vejiga sea indicativo de la presencia del cáncer de vejiga o del riesgo de desarrollar cáncer de vejiga cuando esté presente a un nivel de al menos aproximadamente 2 veces preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 200 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 500 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 750 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 1000 veces más que el de un control normal.

La presente invención permite controlar la eficacia de un tratamiento para el cáncer de vejiga, que comprende detectar y/o cuantificar la presencia del biomarcador específico de cáncer en una muestra biológica obtenida de un paciente.

Preferiblemente, en los métodos de la presente invención, la detección y/o cuantificación del biomarcador específico de melanoma se realiza por uno o más de MALDI-TOF, SELDI, mediante la interacción con un ligando o ligandos, sistemas de análisis basados en geles unidimensionales o bidimensionales, cromatografía líquida, técnicas combinadas de cromatografía líquida y espectrometría de masas, que incluyen ICAT(R) o iTRAQ(R), cromatografía en capa fina, espectroscopía de r Mn , inmunoensayos de "sandwich", ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas ("enzyme linked immunosorbent assay", ELISA), radioinmunoensayos ("radioimmunoassay", RAI), inmunoensayos de enzimas ("enzyme immunoassay", EIA), ensayos de flujo lateral/tiras inmunocromatográficas, transferencia Western, inmunoprecipitación, inmunoensayos basados en partículas, que incluyen partículas de oro, plata o látex, partículas magnéticas o puntos cuánticos, e inmunohistoquímica sobre secciones de tejidos.

Preferiblemente, la detección y/o la cuantificación del biomarcador específico de cáncer se realiza en una placa de microtitulación, en formato de tira, matriz o sobre un chip.

Preferiblemente, la detección y/o la cuantificación del biomarcador específico de cáncer se realiza mediante un ELISA que comprende anticuerpos específicos del biomarcador específico de cáncer, preferiblemente unido a un indicador.

Preferiblemente, la detección y/o la cuantificación del biomarcador específico de cáncer se realiza mediante un biodetector.

Preferiblemente, la muestra comprende un fluido biológico o tejido obtenido del paciente. Preferiblemente, el fluido biológico o tejido comprende fluido celular, líquido cefalorraquídeo ("cerebrospinal fluid", CSF), semen, orina, sangre, esputo o saliva. En realizaciones preferidas relacionadas con el cáncer de vejiga, la muestra es orina obtenida de un paciente.

Preferiblemente, el biomarcador puede detectarse sobre la superficie de células.

También se prefiere que el fluido biológico esté sustancial o completamente exento de células enteras/intactas. Preferiblemente, el fluido biológico está exento de plaquetas y residuos celulares (tales como los que se producen después de la lisis de las células). Preferiblemente, el fluido biológico está exento de células procariotas y eucariotas.

Estas muestras pueden obtenerse mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como será evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden obtenerse con facilidad muestras de orina y de esputo, mientras que las muestras de sangre o de suero pueden obtenerse por vía parenteral usando una aguja y una jeringa, por ejemplo. Pueden obtenerse muestras sin células o sustancialmente sin células sometiendo la muestra a diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a centrifugación y filtración.

Aunque en general se prefiere no utilizar técnicas invasivas para obtener la muestra, puede seguir siendo preferible obtener muestras, tales como homogeneizados de tejidos, secciones de tejidos y especímenes de biopsia.

En realizaciones preferidas, los métodos de la invención son para diagnosticar una enfermedad en un estadio temprano, por ejemplo, antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención son para diagnosticar una enfermedad en un estadio clínico.

Descripción detallada de la invención

A continuación se describen ejemplos de realizaciones de la presente invención con referencia a las figuras adjuntas.

La figura 1 muestra el análisis de la proteína EN2 en orina procedente de pacientes que se han sometido a un examen citoscópico para un cáncer de vejiga sospechado;

la figura 2 muestra la expresión de EN2 en cáncer de pulmón;

la figura 3 demuestra que EN2 está presente sobre la superficie de las células de cáncer de vejiga;

la figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico de EN2 (SEQ ID NO:1); y

la figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de EN2 (SEQ ID NO:2).

La invención se refiere a biomarcadores específicos del cáncer de vejiga.

En esta memoria descriptiva, los términos "comprende" y "comprendiendo" significan "incluye, entre otras cosas". Estos términos no deben entenderse como "consiste solo en".

En esta memoria descriptiva, el término "aproximadamente" significa más o menos 20%, más preferiblemente más o menos 10%, incluso más preferiblemente más o menos 5%, lo más preferiblemente más o menos 2%.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de una composición que se requiere para reducir la gravedad y/o para mejorar al menos un trastorno o síntoma que aparece como resultado de la enfermedad en cuestión.

En esta memoria descriptiva, se han descrito realizaciones de tal forma que se puede redactar una memoria descriptiva clara y concisa, pero se pretende y se apreciará que las realizaciones pueden combinarse o separarse de varias formas sin apartarse de la invención.

En esta memoria descriptiva, "identidad", tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de similitud de secuencia entre las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, según se determina mediante la correspondencia entre hebras de dichas secuencias. El porcentaje de identidad puede calcularse con facilidad mediante métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988), todos los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para obtener la mayor correspondencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos de acceso público. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete informático GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984), que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad). El programa BLAST X es de acceso público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad). Como ilustración, un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que presenta al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" con una secuencia de nucleótidos de referencia de "SEQ ID NO:A" significa que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia del polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia de "SEQ ID NO:A". En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o una serie de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De forma análoga, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta al menos, por ejemplo, 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia de "SEQ ID NO:B" significa que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia "SEQ ID NO:B". En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los restos aminoácidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro aminoácido, o una serie de aminoácidos de hasta 5% de los restos aminoácidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "se híbrida bajo condiciones rigurosas" pretende describir condiciones para la hibridación y el lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que codifican un receptor al menos 50% homólogo entre sí generalmente permanecen hibridadas entre sí. Las condiciones pueden ser de tal forma que secuencias al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 75% o más homólogas entre sí permanecen hibridadas entre sí. Estas condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas son una hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguidas de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 50-65 °C. En una realización, una molécula de ácido nucleico de receptor aislada que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO:1 se corresponde con una molécula de ácido nucleico natural. Tal como se emplea en la presente, una molécula de ácido nucleico "natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural).

Dentro de esta memoria descriptiva, un "anticuerpo o fragmento de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE) o fragmento (tal como un Fab, F(ab')2, Fv, Fv unido por disulfuro, mcFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, mcFv unido por disulfuro, diacuerpo) derivado de cualquier especie que produce un anticuerpo de modo natural o creado mediante la tecnología del ADN recombinante, aislado a partir de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias.

Dentro de esta memoria descriptiva, el término "tratamiento" significa el tratamiento de una enfermedad existente y/o el tratamiento profiláctico para prevenir la aparición de una enfermedad. Como tales, los métodos de la invención pueden usarse para el tratamiento, la prevención, la inhibición del avance o el retraso en la aparición de una enfermedad.

El término "biomarcador" se emplea en la técnica y significa un indicador diferenciado biológico u obtenido de modo biológico de un proceso, acontecimiento o trastorno. En otras palabras, un biomarcador es indicativo de cierto estado biológico, tal como la presencia de tejido canceroso. En algunos casos, diferentes formas de biomarcadores pueden ser indicativas de ciertos estados de enfermedad, pero, aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, se cree que simplemente la presencia de niveles elevados de los biomarcadores de la presente invención en fluidos corporales, tales como esputo u orina, es indicativa de cáncer de pulmón o cáncer de vejiga, respectivamente. Aunque en la actualidad no se contempla que se segreguen diferentes glicoformas, por ejemplo, del péptido EN2, no obstante estas se incluyen en la presente invención. Por ejemplo, aún pueden determinarse diferentes glicoformas, tales como una estructura de glicoforma alterada o un contenido en azúcar alterado, para EN2, y estas se incluyen e incluso también pueden ser indicativas del avance del cáncer de vejiga o cáncer de pulmón. También se contemplan truncamientos, mutaciones o deleciones del péptido EN2 o acoplamientos o sus fragmentos.

Tal como se analizó anteriormente, se ha descubierto, de modo sorprendente, que no se produce un aumento significativo en la expresión del gen EN2 en tumores de vejiga, comparado con el tejido normal. Además, EN2 se encuentra en la orina de pacientes con cáncer de vejiga. Se cree que EN-2 puede ser segregada o puede detectarse en fluidos corporales debido a filtraciones desde células dañadas o muertas. Estos niveles aumentados son indicativos de cáncer de vejiga de estadio temprano y de estadio tardío. Aunque se produce un aumento significativo entre los niveles control o normales y el cáncer de vejiga de estadio temprano, también se produce un aumento muy significativo entre el cáncer de vejiga de estadio temprano y de estadio tardío. En sentido amplio, una ventaja de la presente invención es que puede detectarse la sustancia y también el estadio del cáncer. Esto ayuda a la prognosis y a la proporción de terapias adecuadas.

Otra ventaja de la presente invención es que puede proporcionarse un diagnóstico preciso sin recurrir a procedimientos invasivos desagradables y potencialmente perjudiciales, que además también pueden ser poco precisos. Además, la presente invención es particularmente sensible. Preferiblemente, los métodos de la presente invención pueden detectar la aparición de un cáncer antes que cualquier otro método de detección y antes de la aparición de síntomas abiertos del cáncer. Por tanto, el cáncer puede tratarse en un estadio temprano cuando es más susceptible a dicho tratamiento y es menos probable que haya entrado en el estadio metastásico.

Los biomarcadores de la presente invención pueden usarse en métodos de diagnóstico, por ejemplo, la selección clínica, y en métodos de evaluación de la prognosis, para controlar los resultados de una terapia, para identificar los pacientes que respondan con mayor probabilidad a un tratamiento terapéutico concreto, para la selección y desarrollo de fármacos. Además, los biomarcadores de la presente invención y sus usos son valiosos para la identificación de nuevos tratamientos de fármacos y para el descubrimiento de nuevas dianas para el tratamiento con fármacos.

El término "diagnóstico" incluye la identificación, la confirmación y/o la caracterización de la presencia o la ausencia de cáncer de vejiga, junto con su estadio de desarrollo, tal como el estadio temprano o el estadio tardío, o de un cáncer benigno o metastásico.

Ejemplos

EN2 en el cáncer de vejiga

Los inventores han estudiado la expresión de EN2 en cáncer de vejiga. Se comparó el número de transcritos de ARNm de EN2 en tres tumores TCC diferentes con el del tejido normal adyacente al tumor ("NAT") usando una PCR semicuantitativa. Esto reveló que EN2 se expresa a un nivel 1457 veces mayor en tumores que en el NAT.

Se realizó otro estudio para determinar si esta diferencia en la expresión génica se refleja en la cantidad real de proteína EN2 presente en la orina de pacientes con cáncer de vejiga. Con este fin se recogió orina de pacientes que se estaban sometiendo a un examen citoscópico para un cáncer de vejiga sospechado. Se emplearon 20 pl de orina para ensayar la proteína EN2 mediante un análisis de la transferencia Western usando los métodos descritos a continuación. En total, se examinaron 62 pacientes, de los cuales solo tres fueron diagnosticados posteriormente con cáncer de vejiga. Los tres individuos presentaban proteína EN2 en la orina, mientras que los 59 individuos que no padecían la enfermedad no presentaron cantidades detectables de la proteína EN2. Los resultados se muestran en la figura 1.

EN2 en cáncer de pulmón (ejemplo comparativo)

Los inventores han estudiado la expresión de EN2 en cáncer de pulmón. Se comparó el número de transcritos de ARNm de EN2 en tres tumores NSCLC diferentes con el del tejido normal adyacente al tumor ("NAT") y A549, una línea celular derivada de un tumor NSCLC, usando una PCR semicuantitativa. Esto reveló que, con relación a NAT, EN2 se expresa a un nivel 28,9 veces mayor y 14,6 veces mayor en tumores y en células A549, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 2.

Métodos usados

1. Detección de la proteína EN2 en muestras de orina (cáncer de vejiga)

Detección de la proteína EN2 mediante análisis de la transferencia Western: se centrifugaron 1,5 ml de orina a 10.000 g durante cinco minutos para retirar las células y los residuos celulares. Después se mezclaron directamente 20 pl del sobrenadante con 5 pl de tampón de ensayo en gel LDL (Invitrogen) y 2 pl de agente reductor (Invitrogen) y se calentó hasta 70 °C durante diez minutos. Las proteínas se resolvieron mediante una electroforesis en gel de SDS al 10%-poliacrilamida y se trasladaron a una membrana de poli(fluoruro de vinilideno). Se empleó un anticuerpo anti-EN2 (Abcam, Reino Unido) a una concentración de 0,5 pg/ml.

2. Detección de ARN de EN2 en muestras de tejido (cáncer de vejiga y de pulmón)

PCR cuantitativa: En primer lugar se desnaturalizó el ARN calentando hasta 65 °C durante cinco minutos. Se incubaron 1-5 pg de ^aRⁿen un volumen de 50 pl a 37 °C durante una hora con concentraciones finales de DTT 10 mM, mezcla de dNTP 1 mM, así como cebadores de poliT 100 ng/ml, 200 unidades de transcriptasa inversa (Invitrogen, EE. UU.) y 40 unidades de RNaseOUT (Invitrogen, EE. UU.). La reacción de síntesis de ADNc se terminó colocando los tubos a 80 °C durante cinco minutos. Se realizó una RT-PCR usando la máquina de PCR a tiempo real Stratagene MX4000, y se midió la acumulación del producto de la PCR durante la fase exponencial de la reacción mediante fluorescencia verde SYBR. Se calculó la expresión de EN2 con relación a la del gen de betaactina, cuya expresión es relativamente constante en muchos tipos de células.

3. Detección de EN2 sobre la superficie de células de cáncer de vejiga.

Se incubaron cuatro líneas celulares derivadas del cáncer de vejiga con un anticuerpo anti-EN2, seguido de un anticuerpo secundario con un marcador fluorescente. Las células después se clasificaron mediante FACS. Los resultados se muestran en la figura 3. La línea negra muestra las células tratadas solo con el anticuerpo secundario, y la línea gris muestra las células tratadas con ambos. Un desplazamiento de la curva gris hacia la derecha indica que la proteína EN2 estaba disponible sobre la superficie de la célula para que el anticuerpo primario se una a ella. Estos resultados demuestran que las líneas celulares 'TCC', 'EJ' y 'BHK', pero no 'T24', tienen la proteína EN2 sobre la superficie de las células.

Obtención del tejido: el ARN de tumor de vejiga y pulmón, junto con el ARN del tejido adyacente normal, se adquirieron en Ambion Inc., EE. UU.

Secuencias de los cebadores de Q-PCR:

Beta-actina (humana):

HsBeta-actina directo: 5' ATGTACCCTGGCATTGCCGAC 3' (SEQ ID NO:3)

HsBeta-actina inverso: 5' GACTCGTCATACTCCTGCTTG 3' (SEQ ID NO:4)

EN2 (humana):

HsEN2 directo: 5' GAACCCGAACAAAGAGGACA 3' (SEQ ID NO:5) HsEN2 inverso: 5' CGCTTGTTCTGGAACCAAAT 3' (SEQ ID NO:6)

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un método para diagnosticar el cáncer de vejiga en un paciente, comprendiendo dicho método:

2. - El método según la reivindicación 1, en el que sus fragmentos o variantes comprenden:

(ii) una secuencia de aminoácidos que presenta al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2.

3. - El método según la reivindicación 1 o 2 para detectar el cáncer de estadio temprano o tardío, en el que un aumento entre el control y la muestra obtenida del paciente es indicativo de un cáncer de estadio temprano, o en el que un aumento entre el control y la muestra obtenida del paciente es indicativo de un cáncer de estadio tardío.