ES2710522T3 - Procedimientos y composiciones para la extracción de venas y autotransplante - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de tratamiento de un explante venoso antes de transplantar, que comprende: (a) estabilizar un explante venoso con azul brillante G para producir un explante venoso, en el que el azul brillante G se aplica al explante venoso con un rotulador y/o con una solución tamponada que contiene azul brillante G a un pH de 7,0-7,6; y (b) conservar la viabilidad funcional del explante venoso estabilizado.

Description

DESCRIPCION

Procedimientos y composiciones para la extraccion de venas y autotransplante

Campo de la invencion

La invencion se refiere en general a los campos de vena antologa, injerto de vena, conservacion de vena, conservacion de tejido, hiperplasia de la mtima, vasoespasmo, productos farmaceuticos, dispositivos y biologfa vascular.

Antecedentes de la invencion

La vena safena mayor humana (VSH) sigue siendo el conducto mas usado para derivacion de arterias coronaria y perifericas. La VSH normalmente se extrae de la pierna con exposicion quirurgica directa o extraccion endoscopica de la vena. Las ramas se ligan y la vena se extrae y se coloca en la “mesa negra” antes de la implantacion. La mayona de los cirujanos introducen la VSH en solucion salina heparinizada a temperatura ambiente. La vena se canula en el extremo distal y se distiende manualmente (con una jeringuilla) con solucion salina heparinizada. Esto permite la identificacion y union de las ramas laterales que se han perdido durante la extraccion. Esta distension manual conduce a danos en la vena. Las venas tambien se marcan con un marcador de piel quirurgico para optimizar la orientacion durante la implantacion.

De mas de 1 millon de procedimientos de derivacion coronaria que se realizan todos los anos en el mundo, el 10­ 15% de los injertos de vena coronaria sufren una oclusion trombotica temprana; un 10-15% adicional se ocluyen en los siguientes 1-5 anos debido a hiperplasia de la mtima y un 30-40% mas se incluyen en los siguientes 5-7 anos por la aterosclerosis progresiva superpuesta sobre la hiperplasia de la mtima. Menos de la mitad de los injertos de venas siguen permeables tras 12 anos (Motwani y Topol, 1998). La colusion de los injertos venosos conduce a infarto de miocardio, perdida de extremidades y muerte.

La causa principal del fallo de las derivaciones arteriales es la hiperplasia de la mtima (Clowes y Reidy, 1991). A pesar de los muchos recientes avances tecnologicos en las intervenciones vasculares, la hiperplasia de la mtima sigue siendo un problema caro y morbido no resuelto. La hiperplasia de la mtima esta mediada por una secuencia de acontecimientos que incluyen la proliferacion del musculo liso vascular, la migracion, la modulacion fenotfpica y la produccion de matriz extracelular (Allaire y Clowes, 1997; Mosse et al., 1985). Este proceso conduce a un estrechamiento patologico de la luz del vaso, estenosis del injerto y, en ultima instancia, fallo del injerto (LoGerfo et al., 1983).

Una serie de farmacos que se han probado para determinar su capacidad para inhibir la hiperplasia de la mtima han fracasado en los ensayos clmicos. Los agentes antitromboticos y antiplaquetarios, tales como warfarina, clopidogrel y aspirina, tiene poco o ningun efecto sobre la hiperplasia de la mtima (Kent y Liu, 2004). Se ha demostrado que las endoprotesis vasculares que liberan farmacos son eficaces en la prevencion de la reestenosis tras angioplastia coronaria; no obstante, no se ha aprobado ninguna sustancia terapeutica para conductos autologos. Dos ensayos clmicos de tamano grande para la prevencion del fallo de los injertos de venas vasculares coronarios y perifericos usando um debo E2F (una secuencia corta de ADN que se une a factores de transcripcion y secuestra estas protemas) para prevenir la proliferacion del musculo liso fallaron en su criterio de valoracion principal. Los datos de estos ensayos clmicos grandes sugieren que simplemente limitando la respuesta de proliferacion no es adecuado para prevenir la hiperplasia de la mtima (Mann et al., 1999; Alexander et al., 2005). Por tanto, se tiene que apuntar a otros mecanismos distintos a la proliferacion para el exito de la prevencion del fallo del injerto venoso.

La lesion en el injerto venoso durante la extraccion produce vasoespasmo e hiperplasia de la mtima, que hace que se ocluyan los injertos. Por tanto, sena de gran beneficio identificar nuevos procedimientos quirurgicos y terapeuticas para prevenir la lesion en el injerto durante la extraccion y la posterior hiperplasia de la mtima.

Sumario de la invencion

Por tanto, de acuerdo con la presente invencion se proporciona un procedimiento de tratar un explante venoso antes del transplante que comprende (a) estabilizar un explante venoso con azul brillante G para producir un explante venoso estabilizado, en el que el azul brillante G se aplica al explante venoso con un rotulador y/o con una solucion tampon que contiene el azul brillante G a un pH de 7,0 - 7,6; y (b) preservar la viabilidad funcional del explante venoso estabilizado. En una realizacion, se puede aplicar azul brillante G al explante venoso mediante un rotulador que comprende un colorante y en el que el colorante comprende el azul brillante G. En otra realizacion, se puede aplicar azul brillante G al explante venoso poniendo en contacto el explante venoso con una solucion tamponada que comprende el azul brillante G a un pH de 7,0-7,6. El procedimiento puede ademas restaurar la viabilidad funcional del explante venoso que antes de la etapa (a) no era viable. La viabilidad funcional del musculo liso se define en el presente documento como la capacidad para contraerse en respuesta a la despolarizacion o a agonistas. Para el endotelio, la viabilidad se define la capacidad de los vasos recontrafdos para relajarse la respuesta al acetilcolina. Adicionalmente, la solucion tamponada puede comprender ademas heparina, solucion salina tamponada, MOPS, HEPES, PIPES, acetato y/o Plasmalyte. El pH de la solucion tamponada puede ser, por ejemplo, 7,35-7,45 o 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6.

Adicionalmente, la solucion tamponada puede comprender ademas sulfato de magnesio o solucion salina equilibrada de Hank.

Adicionalmente, la solucion tamponada puede comprender ademas uno o mas de un agente anticontractil, un agente antioxidante, un oligosacarido, un agente coloidal, un agente antiinflamatorio, un conservante de la funcion endotelial, un regulador metabolico, un hidrogel, un inhibidor de la protema del shock termico 27 (HSP27), un regulador de HSP20 y/o un inhibidor de la quinas MAPKAP 2.

Adicionalmente, el agente anticontractil puede ser al menos uno de un inhibidor de la fosfodiesterasa (p. ej., papaverina, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, udenafilo, avanafilo cilistizol, pentoxifilina, dipiridamol o una combinacion de los mismos), un bloqueante de los canales de calcio (p. ej., amlodipina, aranidipina, azelnidipina, bamidipina, cilnidipina, clevidipina, efonidipina, felodipina, lacidipina, lercanidipina, mandipina, nicardipina, nifedipina, nilvadipina, nimodipina, nisoldipina, netrendipina, prandipina o una combinacion de los mismos), un donante de oxido mtrico (p. ej., nitroprusiato sodico, nitroglicerina o una combinacion de las mismas), o un analogo de nucleotidos dclicos (dibutiril cAMP, dibutiril cGMP o una combinacion de los mismos o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el agente antioxidante puede ser, por ejemplo, N-acetilcistema, alopurinol, glutation, manitol, acido ascorbico, un tocoferol, un tocotrienol o un fenol de te verde o una combinacion de los mismos.

Ademas, el oligosacarido puede ser, por ejemplo, acido lactobionico, rafinosa o trehalosa, o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el agente coloidal puede ser, por ejemplo, almidon de hidroxietilo, dextrano, sangre o albumina, o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el agente antiinflamatorio puede ser, por ejemplo, un corticosteroide (p. ej., dexametasona, hidrocortisona, cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona o una combinacion de los mismos) o un antiinflamatorio no esteroideo (p. ej., aspirina, ibuprofeno, naproxeno, acido salidlico o una combinacion de los mismos) un inhibidor de la MAPKAP quinasa 2, anti-TNF-a, anti-IL-1-p, un inhibidor de la Cox-2 o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el conservante de la funcion endotelial puede, por ejemplo, un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (p. ej., enalaprilo, ramiprilo, quinaprilo, perindoprilo, lisinoprilo, benazeprilo, monoprilo o una combinacion de los mismos), un inhibidor del receptor de angiotensina (p. ej., losartan), una estatina (p. ej., atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o una combinacion de los mismos), metformina, aminoimidazol carboxamida ribonucleotido (AICAR) o un estrogeno (p. ej., estriol, estradiol, estrona, 17p-estradiol o una combinacion de los mismos).

Adicionalmente, el regulador metabolico puede ser, por ejemplo, glucosa, adenosina amilina, peptido genico relacionado con la calcitonina, insulina o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el hidrogel puede estar compuesto de, por ejemplo, un polisacarido natural tal como alginato, dextrano, chitosano y glucosaminoglucano o un polfmero hidrofilo tal como polietilenglicol, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polihidroxibutirato o poli(n-isopropilacrilamida).

Adicionalmente, el inhibidor de HSP27 puede ser, por ejemplo, un ARNsi o ARNmi que inhibe la expresion de HSP27, un anti-ARNmi que potencia la expresion de HSP20 o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el inhibidor de la MAPKAP quinasa 2 puede ser, por ejemplo, un inhibidor peptfdico.

En la realizacion en la que se aplica azul brillante G en el explante venoso poniendo en contacto el explante venoso con una solucion tamponada que comprende el azul brillante G a un pH de 7,0 - 7,6, despues el explante venoso se puede marcar con un marcador sin alcohol, tal como, entre otros, erioglaucina/Colorante azul n° 1, indigotina, Rojo Allura AC o azul brillante G.

El procedimiento puede comprender ademas lavar la luz del explante venoso de forma que la presion de lavado interna no supere los o no supere los 20 kPa.

La presente invencion tambien proporciona un rotulador quirurgico esteril en el que (i) el rotulador es cargado con un colorante que comprende azul brillante G; o (ii) el rotulador esta vado y se proporciona con azul brillante G en una solucion esteril o en forma de reactivo esteril para que un usuario cargue el rotulador.

En otra realizacion, se proporciona un kit de explante venoso que comprende

(a) el rotulador quirurgico como se he definido anteriormente; y

(b) una solucion tamponada fisiologica esteril o reactivos esteriles para fabricar la misma. La solucion tamponada puede comprender, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato, MOPS, HEPES, PIPES, acetato o Plasmalyte. La solucion tamponada puede estar a un pH de 7,0-7,6, o de 7,35-7,45;

en el que el kit comprende opcionalmente ademas uno o mas de

(c) un recipiente adecuado para banar un explante venoso;

(d) uno o mas de heparina, un agente anti-contractil, un agente antioxidante, un oligosacarido, un agente coloidal, un agente antiinflamatorio, un conservante de la funcion endotelial, un regulador metabolico, un hidrogel, un inhibidor de la protema del shock termico 27, sulfato de magnesio y/o un inhibidor de la quinas MAPKAP 2;

(e) el dispositivo para lavar la luz de un explante venoso; en el que dicho dispositivo esta disenado para prevenir presiones de lavado en el interior del explante venoso superiores a 26,7 kPa o superiores a 20 kPa. El dispositivo puede comprender una jeringuilla y/o un cateter y una valvula de venteo. Adicionalmente, la jeringuilla o cateter puede comprender una punta en forma de bala que comprende una luz para su introduccion en un extremo proximal de dicho explante venoso. Adicionalmente, e kit puede ademas comprender una pinza disenada para sujetar dicho explante venoso.

En el presente documento tambien se describe un dispositivo para lavar la luz de un explante venoso; dicho dispositivo esta disenado para prevenir las presiones de lavado dentro del explante venoso de mas de 26,7 kPa o mas de 20 kPa. El dispositivo puede comprender una jeringuilla y/o cateter y una valvula de venteo. La jeringuilla o cateter puede comprender una punta con forma de bala que comprende una luz para introducir un extremo distal de dicho explante venoso. Adicionalmente, el dispositivo puede comprender ademas un tapon con forma de bala que carece de una luz para introducir un extremo proximal de dicho explante venoso. Adicionalmente, el dispositivo puede comprender ademas una pinza disenada para soportar dicho explante venoso.

Todavfa otra realizacion mas comprende una solucion tamponada esteril de pH 7,0-7,6, en la que dicha solucion tamponada comprende azul brillante G, y opcionalmente comprende ademas heparina. Adicionalmente, la solucion tamponada puede comprender solucion salina tamponada con fosfato, MOPS, HEPES, PIPES, acetato o Plasmalyte. Adicionalmente, el pH puede ser 7,35-7,45 o 7,0, 7,1, 7,2,7,3, 7,4, 7,5 o 7,6.

Adicionalmente, la solucion tamponada puede comprender ademas sulfato de magnesio o solucion salina equilibrada de Hanks.

Adicionalmente, la solucion tamponada puede comprender ademas uno o mas de un agente anticontractil, un agente antioxidante, un oligosacarido, un agente coloidal, un agente antiinflamatorio, un conservante de la funcion endotelial, un regulador metabolico, un hidrogel, un inhibidor de la protema del shock toxico 27 (HSP27), un regulador de HSP20, un inhibidor de la MAPKAP quinasa 2 y/o combinaciones de los mismos, Adicionalmente, el agente anticontractil puede ser un inhibidor de la fosfodiesterasa (p. ej., papaverina, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, udenafilo, avanafilo cilistizol, pentoxifilina, dipiridamol o una combinacion de los mismos), un bloqueante de los canales de calcio (p. ej., amlodipina, aranidipina, azelnidipina, barnidipina, cilnidipina, clevidipina, efonidipina, felodipina, lacidipina, lercanidipina, mandipina, nicardipina, nifedipina, nilvadipina, nimodipina, nisoldipina, netrendipina, prandipina), un donante de oxido mtrico (nitroprusiato sodico, nitroglicerina o una combinacion de los mismos) o un analogo de nucleotidos dclicos (p. ej., dibutiril cAMP, dibutiril cGMP o una combinacion de los mismos).

Adicionalmente, el agente antioxidante puede ser, por ejemplo, N-acetilcistema, alopurinol, glutation, manitol, acido ascorbico, un tocoferol, un tocotrienol o un fenol del te verde o una combinacion de los mismos.

El oligosacarido puede ser, por ejemplo, acido lactobionico, rafinosa, trehalosa o una combinacion de los mismos. El agente coloidal puede ser, por ejemplo, hidroxietilalmidon, dextrano o albumina o una combinacion de los mismos. El agente antiinflamatorio puede ser, por ejemplo, un corticosteroide (p. ej., dexametasona, hidrocortisona, cortisona, prednisona, prednisolona, metilpredinisolona o una combinacion de los mismos), un antiinflamatorio no esteroideo (p. ej., aspirina, ibuprofeno, naproxano, acido salidlico o una combinacion de los mismos), un inhibidor de la MPAKAP quinasa 2, anti-TNF-a, anti-IL-1-p, un inhibidor de la Cox-2 o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el conservante de la funcion endotelial puede ser un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (p. ej., enalaprilo, ramiprilo, quinaprilo, perindoprilo, lisinoprilo, benazeprilo, monoprilo o una combinacion de los mismos), un inhibidor del receptor de angiotensina (p. ej., losartan), una estatina (p. ej., atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o una combinacion de los mismos), metformina, un estrogeno (p. ej., estriol, estradiol, estrona, 17pestradiol o una combinacion de los mismos) o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el regulador metabolico puede ser, por ejemplo, glucosa, adenosina, amilina, peptido genico relacionado con la calcitonina, insulina o una combinacion de los mismos.

Adicionalmente, el hidrogel puede estar compuesto por un polisacarido natural, tal como alginato, dextrano, chitosano, y glicosaminoglicano o un polfmero hidrofilo tal como polietilenglicol, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polihidroxibutirato o poli(n-isopropilacrilamida).

Adicionalmente, el inhibidor de la HSP27 puede ser, por ejemplo, un ARNsi o ARNmi que inhibe la expresion de HSP27, un anti-ARNmi que potencia la expresion de HSP20 o una combinacion de los mismos.

El inhibidor de la MAPKAP quinasa 2 puede ser, por ejemplo, un inhibidor peptfdico.

Por tanto, las composiciones de la presente invencion tienen amplios usos, incluyendo el uso en la asistencia sanitaria proporcionando dispositivos medicos esteriles y esterilizacion y descontaminacion de superficies.

De acuerdo con lo anterior, la presente invencion tambien proporciona un colorante que comprende azul brillante G para su uso en el marcaje de una vena en un paciente, antes de la extraccion de la vena del paciente.

La presente invencion tambien proporciona el uso de azul brillante G para marcar un explante venoso.

La presente invencion tambien proporciona el uso de azul brillante G para estabiliza y/o conservar o restaurar la viabilidad funcional de un explante venoso.

Breve descripcion de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invencion. La invencion se puede entender mejor por referencia a una o mas de estas figuras en combinacion con la descripcion detallada de realizaciones espedficas presentadas en el presente documento.

La FIG. 1 muestra la viabilidad funcional del musculo liso variable en la vena safena humana.

Las FIGS. 2A-B muestran que las tecnicas actuales de extraccion quirurgica conducen a una menor viabilidad funcional del musculo liso.

La FIG. 3 demuestra que las tecnicas actuales de extraccion quirurgica conducen a una reduccion de la viabilidad funcional endotelial.

Las FIGS. 4A-B muestran que las actuales tecnicas de extraccion quirurgica reducen la relajacion independiente del endotelio de la vena safena humana.

La FIG. 5 demuestra que los injertos de vena safena humana con marcajes azules mostraban una menor viabilidad funcional del musculo liso.

La FIG. 6 demuestra que el marcaje cutaneo quirurgico reduda la viabilidad del musculo liso de la vena safena humana.

La FIG. 7 muestra que los rotuladores para piel quirurgicos reducen la viabilidad de la vena safena de cerdo. La FIG. 8 muestra que la respuesta funcional (respuesta contractil a KCI) se correlaciona con la viabilidad celular en las venas safenas humanas.

Las FIGS. 9A-B demuestran que la erioglaucina restaura la viabilidad funcional despues de una lesion por estiramiento en la vena safena porcina.

La FIG. 10 muestra que Rojo Allura no restableda la lesion inducida por estiramiento en venas safenas porcinas. La FIG. 11 demuestra que la erioglaucina restablece la viabilidad del musculo liso en la vena safena humana. Las FIGS. 12A-C muestran que la erioglaucina bloquea la contraccion inducida por BzATP en la vena safena. La FIG. 13 demuestra que la erioglaucina reduce el espesor de la mtima en la vena safena humana en un modelo de cultivo organico.

La FIG. 14 muestra que la erioglaucina reduce el espesor de la capa mtima en la vena safena porcina distendida. La FIG. 15 demuestra que la manipulacion durante la preparacion quirurgica altera la relajacion dependiente del endotelio en la vena safena humana.

La FIG. 16 muestra que una valvula de liberacion de presion (de venteo) limita la presion en la vena safena humana durante la distension manual.

La FIG. 17 muestra que la distension manual con una valvula de liberacion de presion evita la perdida de funcion endotelial en la vena safena porcina.

La FIG. 18A-B muestra que la preincubacion con papaverina inhibe las contracciones inducidas por histamina y KCl en la arteria coronaria porcina.

La FIG. 19A-B muestra que la preincubacion con papaverina inhibe las contracciones inducidas por norepinefrina en la vena safena humana.

La FIG. 20 muestra el kit del dispositivo de extraccion de vena.

Descripcion detallada de la invencion

Por tanto, la presente solicitud describe nuevos procedimientos y reactivos con los que extraer, tratar, conservar y transplantar conductos autologos e inhibir la hiperplasia de la mtima. El pH de la solucion usada para almacenar los conductos vena autologos antes de la implantacion, que incluye solucion salina heparinizada, es altamente acido (pH 6,2). Se ha demostrado que este pH acido reduce la funcionalidad del conducto. Ademas, el uso de los marcadores de piel quirurgicos que comprende alcohol isopropflico, para marcar los conductos autologos, tambien reduce la funcionalidad del conducto. La erioglaucina, conocida por otro lado como FD y C colorante azul n° 1, no es toxica para la vena y restablece la integridad funcional despues de la lesion. Tambien se ha demostrado que la distension manual comun de la vena puede conducir a presiones intraluminales superiores a 40 kPa, que tambien tienen un efecto perjudicial sobre la funcionalidad del conducto. La colocacion de la valvula de venteo sobre la jeringuilla reduce lo maximo posible la presion intraluminal a 17,3-18,7 kPa, de modo que se protege el conducto de la vena.

I. Solucion de extraccion

En un aspecto, la presente invencion proporciona una solucion tamponada esteril, a pH 7,0-7,6, que comprende azul brillante G en el que introducir la vena despues de la extraccion. En una realizacion, el tampon es solucion salina tamponada con fosfato; no obstante, son formulaciones alternativas MOPS, HEPES, PIPES y acetato. Tambien se puede anadir a la solucion sulfato de magnesio (5 mM) para estabilizar membranas.

Otra opcion de tampon es Plasma-Lyte 56 Injection (inyeccion de multiples electrolitos, de tipo 1, USP) una solucion hipotonica apirogena esteril en un recipiente de una sola dosis para administracion intravenosa. Cada 100 ml contiene 234 mg de cloruro sodico, USP (NaCl); 128 mg de acetato potasico (C2H3KO2) y 32 mg de acetato de magnesio tetrahidrato (Mg(C2H3O2)2^4H2O). No contiene agentes antimicrobianos. El pH se ajusta con acido clorhudrico.

La solucion de extraccion se puede preparar como una solucion altamente viscosa, tal como se describe en Seal y Panitch (2003). Estos autores describieron una matriz polimerica de formacion rapida con propiedades de liberacion controlada basada en afinidad desarrollada a base de interacciones entre peptidos de union a la heparina y heparina. Las pruebas mecanicas dinamicas de las composiciones al 10% (peso/volumen) que consisten en una proporcion molar de 3:1 entre poli(etilenglicol)-copeptido (aproximadamente 18.000 g/mol) y la heparina (aproximadamente 18.000 g/mol) revelo un perfil viscoelastico similar al de las soluciones polimericas concentradas de alto peso molecular y en fusion. Ademas, las mezclas biopolimericas recuperadas rapidamente tras desnaturalizacion termica y agresion mecanica. Estos materiales de tipo gel pudieron secuestrar peptidos exogenos de union a heparina y podnan liberar estos peptidos durante varios dfas a velocidades dependientes de la afinidad relativa por la heparina. Las velocidades iniciales de liberacion variaron desde 3,3% por hora para un peptido con baja afinidad por la heparina a 0,025% por hora para un peptido con una fuerte afinidad por la heparina. Alterando la afinidad de los peptidos por la heparina se pueden desarrollar una serie de peptidos para dar una gama de perfiles de liberacion utiles para la liberacion controlada in vivo de sustancias terapeuticas.

II. Aditivos complementarios de la solucion

En otro aspecto, las soluciones pueden contener aditivos adicionales para abordar varios aspectos protectores de la invencion.

Por ejemplo, las soluciones pueden incluir heparina (1-10 U/ml) para prevenir la formacion de trombos. La heparina es un glucosaminoglucano altamente sulfatado que se usa ampliamente como anticoagulante inyectable y tiene la densidad de carga negativa mas alta de cualquier molecula biologica conocida. Tambien se puede usar para formar una superficie anticoagulante interna en varios dispositivos medicos y experimentales, tales como tubos de ensayos y maquinas para dialisis renal. La heparina de calidad farmaceutica deriva de tejidos mucosos de animales para carne sacrificados, tales como intestino porcino (de cerdo) o pulmon bovino (de vaca).

Aunque se usa principalmente en medicina para anticoagulacion, el papel fisiologico verdadero de la heparina en el cuerpo permanece sin aclarar, porque la anticoagulacion sangumea se consigue principalmente con proteoglicanos de heparan sulfato derivados de celulas endoteliales. Normalmente, la heparina se almacena en el interior de los granulos de los mastocitos y solo se liberan en la vasculatura en los lugares en los que hay una lesion tisular. Se ha propuesto que, en lugar de anticoagulacion, el principal objetivo de la heparina es un mecanismo de defensa en los lugares en los que hay una lesion tisular contra las bacterias invasoras y otros materiales extranos. Ademas, esta conservado en una serie de especies muy diferentes, incluyendo algunos invertebrados que no tienen un sistema de coagulacion de la sangre similar.

La heparina nativa es un polfmero con un peso molecular que vana de 3 kDa a 50 kDa, aunque el peso molecular promedio de las preparaciones de heparina mas comerciales esta en el intervalo de 12 kDa a 15 kDa. La heparina es un miembro de la familia de glucosaminoglucanos de los hidratos de carbono (definido como un compuesto organico que tiene la formula empmca Cm(H2O)n; es decir, consiste unicamente en carbono, hidrogeno y oxfgeno, con una proporcion atomos de hidrogeno:oxfgeno de 2:1). Los glucosaminoglucanos(GAG) o mucopolisacaridos son polisacaridos largos sin ramificar que consisten en una unidad repetida de disacaridos. La unidad de repeticion consiste en una hexosa (azucar de seis carbonos) o un acido hexuronico unida a una hexosamina (azucar de seis carbonos que contiene nitrogeno).

La heparina (que incluye la molecula de heparan sulfato estrechamente relacionada) consiste en una unidad repetida de disacarido sulfatada de forma variable. Las principales unidades de disacarido que se producen en la heparina se muestran a continuacion. La unidad de disacarido mas frecuente esta compuesta por un acido iduronico 2-O-sulfatado y glucosamina 6-O-sulfatada, N-sulfatada, IdoA(2S)-GlcNS(6S). Por ejemplo, esto suma el 85% de las heparinas de pulmon de carne y aproximadamente el 75% de los de mucosa intestinal porcina. Mas adelante se muestran los disacaridos raros que contienen una glucosamina 3-O-sulfatada (GlcNS(3S,6S)) o un grupo amina libre (GlcNH3+). En condiciones fisiologicas, los grupos ester y amida sulfato estan desprotonados y atraen a los contraiones con carga positiva para formar una sal de heparina. Es de esta forma en que la heparina se suele administrar como anticoagulante.

En otro aspecto, la solucion de extraccion puede ser un hidrogel que recubre el vaso para minimizar el volumen manteniendo la humedad del vaso. Ademas, el hidrogel puede contener una sustancia terapeutica para ayudar a mantener la relajacion vascular. Los hidrogeles incluyen los sintetizados a partir de polfmeros hidrofilos que estan reticulados a traves de enlaces covalentes, tales como poli(etilenglicol), poliacrilamida, polifumerato, poli(N-isopropilacrilamida) etc., o cualquier material de tipo gel reticulado a traves de interacciones ffsicas, incluyendo hidrofobicas e ionicas. Los geles incluyen poliuretanos, agarosa y alginatos.

En otro aspecto, la solucion incluye papaverina (1 mM) para inhibir la contraccion y el espasmo de la vena. Agentes antiespasmodicos alternativos son nicardipina, nitroprusiato sodico, nitroglicerina (0,5-1,0 mM) o dibutiril cAMP (2 mM).

En otro aspecto, la solucion incluye antioxidantes para prevenir el dano oxidativo en la vena. Antioxidantes concretos de interes son N-acetilcistema (10 mM), alopurinol (1 mM), glutation (3 mM), manitol (30-60 mM) o fenoles de te verde (0,5-1,0 mg/ml).

En otro aspecto, pueden incluirse oligosacaridos en la solucion de extraccion para prevenir la desecacion del injerto. Oligosacaridos concretos son acido lactobionico ((100 mM), rafinosa (30 mM) o trehalosa (30 mM). El acido lactobionico es un disacarido que proporciona soporte osmotico y previene la dilatacion celular. La rafinosa es un trisacarido que proporciona hipertonicidad. La trehalosa es un disacarido con propiedades de retencion de agua. En otro aspecto, puede incluirse almidon en la solucion de extraccion para soportar la presion osmotica coloidal. El hidroxietilalmidon ((30-50 mM), dextrano (40 g/l), sangre o albumina son agentes coloidales particularmente contemplados.

En otro aspecto, la solucion incluye agentes antiinflamatorios. Los esteroides como la dexametasona (5-10 mg/l) o el acido salidlico son ejemplos de agentes antiinflamatorios.

En otro aspecto se incluiran farmacos para prevenir la disfuncion endotelial. Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, las estatinas, la metformina, AICAR y los estrogenos son ejemplos de dichos farmacos.

En otro aspecto, la solucion incluye reguladores metabolicos. La glucosa (200 mM), la adenosina (5 mM) y la insulina (100 U/ml) son reguladores metabolicos particularmente contemplados.

En otro aspecto, la solucion incluye un nuevo inhibidor peptfdico de la MAPKAP quinasa 2 (y peptidos relacionados) para reducir la inflamacion, potenciar la relajacion del musculo liso y prevenir el espasmo. Las solicitudes de PCT US2007/16246 Y US2008/72525 describen dichos inhibidores y se incorporan en el presente documento por referencia.

En otro aspecto, la solucion incluye ARNsi o ARNmi para disminuir la expresion de HSP27 para prevenir la hiperplasia de la mtima. Las secuencias de ARNsi de hebra sentido son 1) G^a C^cAAGGAUGGCGUGGUGUU (SEC ID N° 1) y 2) AUACACGCUGCCCCCCGGUUU (SEC ID N° 2). Las secuencias de ARNmi de hebra sentido son 1) miR-580 o miR-1300, AACUCUUACUACUUAGUAAUCC (SEC ID N° 3) y 2) miR-552, UUGUCCACUGACCAAUCUGUU (SEC ID N° 4). La secuencia de anti-miR-320 es: UCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU. La expresion de ARNsi y ARNmi es plasmfdica o sintetica. Se puede liberar el ADN o los oligoduplex sinteticos mediante permeabilizacion o presurizacion reversible (Monahan et al., 2009).

III. Antagonistas del receptor de P2X7

Las lesiones conducen a una liberacion prolongada de ATP que pueden actuar los receptores de ATP (Khakh y North, 2006). Los receptores P2X son una familia de canales ionicos dependientes de ligando que se unen al ATP extracelular. El receptor P2 X7 es responsable de la lisis dependiente de ATP de los macrofagos y tambien se encuentra en el musculo liso de la vena safena humana (Cario-Toumaniantz et al., 1998). Activation of the P2 X7 receptor can form membrane pores permeable to large molecules in human saphenous vein (Cario-Toumaniantz et al., 1998). Esto conduce a incrementos de los niveles de Ca2+ intracelular, que puede activar las caspasas y, en ultima instancia, producir la muerte celular por autolisis y apoptosis (Donnelly-Roberts et al., 2004). La activacion del receptor P2X7 se ha asociado con la activacion de la ruta de la p38 MAPK y con cambios en el citoesqueleto de la actina (Pfeiffer et al., 2004). La activacion del receptor P2X7 tambien conduce a la produccion y liberacion de interleucinas y otras citocinas que contribuyen a la respuesta inflamatoria (Donnelly-Roberts et al., 2004). Recientemente, se ha mostrado que la activacion sistemica de un antagonista del receptor P2 X7 mejora la recuperacion en un modelo de roedor de lesion de la medula espinal inducida por estiramiento (Peng et al., 2009). En la literatura se ha descrito una serie de antagonistas del receptor P2 X7. Por ejemplo, Alcaraz et al. (2003) describen la smtesis y la evaluacion farmacologica de una serie de potentes antagonistas del receptor P2 X7. Los compuestos inhiben la formacion de poros mediada por BzATP en las celulas THP-1. La distribucion del receptor P2 X7 en las celulas inflamatorias, mas principalmente en los macrofagos, mastocitos y linfocitos, sugiere que los antagonistas de P2 X7 tienen un papel significativo en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria. Carroll et al. (2009) revisaron distintas series qmmicas de antagonistas potentes y altamente selectivos del receptor P2 X7.

Las siguientes patentes de EE.UU. divulgan antagonistas del receptor P2 X7: 7.709.469. 6.812.226. 7.741.493 7.718.693 y 7.326.792. Las siguientes publicaciones de patente de EE.UU. divulgan antagonistas del receptor P2 X7: 2010/0292295, 2010/0292224, 2010/0286390, 2010/0210705, 2010/0168171, 2010/0160389, 2010/0160388, 2010/0160387, 2010/0160384, 2010/0160373, 2010/0144829, 2010/0144727, 2010/0105068, 2010/0075968, 2010/0056595, 2010/0036101, 2009/0264501, 2009/0215727, 2009/0197928, 2009/0149524, 2009/0005330, 2008/0132550, 2008/0009541,2007/0122849, 2007/0082930, 2005/0054013, 2005/0026916 y 2002/0182646.

Como se ha tratado anteriormente, un aspecto de la invencion incluye un marcador que contiene azul brillante G para marcar la vena, FD y C Azul n.° 1 (erioglaucina), es un colorante alimentario artificial aprobado por la FDA (E N°133), que no solo se ha demostrado que es no toxico sino que es protector de las tecnicas de extraccion que son daninos para las venas safenas y es un antagonista del receptor P2 X7. El azul brillante G es un analogo de la erioglaucina y tambien se contempla como un antagonista del receptor P2 X7.

La indigotina (E132) es otro colorante artificial azul oscuro aprobado por la FDA. El Verde Rapido (E143) es otro colorante artificial verde azulado aprobado por la FDA. Los colorantes naturales, tales como la curcumina o la betanina, son otras alternativas. La curcumina es el principal curcuminoide de la especia tumerico y tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Como aditivo alimentario, su numero E es E100. La betanina es un colorante alimentario glucosfdico rojo obtenido de la remolacha y un colorante alimentario natural. Otros posibles colorantes incluyen el azul genestema, azul de venas, tinta china, Rojo Allura AC, tartazina y eritrosina.

IV. Dispositivos

En estudios preliminares, que se tratan mas adelante, se demuestra que las tecnicas de extraccion usadas actualmente son daninas para las venas safenas. Estos datos suponen un nuevo paradigma para pensar sobre los fallos de los injertos de venas y ofrecen abordajes simples y directos para mejorar la lesion en los injertos de venas. Por tanto, en otro aspecto de la invencion, la presente divulgacion describe una valvula de “venteo" para prevenir la sobredistension de la vena durante la union de la rama lateral. La valvula T de alivio de la presion Qosina (parte n° D002501) es un ejemplo. En otro aspecto de la invencion, la presente invencion describe una aguja "en punta de bala” que se usa para fijar la vena y un dispositivo para prevenir el estiramiento de la vena.

V. Kits

La presente invencion describe un kit para usar junto con procedimientos quirurgicos de transplantes de vena. Los kits de inmunodeteccion comprenderan, en medios de recipientes adecuados, varios recipientes, dispositivos y/o reactivos, junto con las instrucciones de uso adecuadas.

El kit comprendera soluciones de extraccion o reactivos para fabricarlos. Las soluciones o reactivos se proporcionaran en forma esteril, opcionalmente con recipientes esteriles para mezclar y almacenar soluciones de extraccion. El kit puede tambien comprender de forma ventajosa una camara para banar/almacenar tejido de transplante despues del explante y antes del transplante. Tambien se pueden incluir otros diversos aditivos complementarios descritos anteriormente.

Otro elemento del kit puede ser la inclusion de un rotulador quirurgico que comprende un colorante/marcador no toxico, como se ha descrito anteriormente. El rotulador puede estar “previamente cargado” con el marcador/colorante o se puede proporcionar vacfo con el marcador/colorante en solucion o en forma de reactivo para que el usuario lo cargue en el rotulador.

Otros dispositivos, incluidos una jeringuilla, cateter y /o tubos equipados con o que incluyen una valvula de venteo como se ha descrito anteriormente. Tambien se puede incluir un dispositivo para sujetar una vena en su lugar, tal como una pinza, equipada opcionalmente con un soporte o base, que permite colocar “sin manos” el injerto para su tratamiento posterior.

El aspecto del recipiente del kit generalmente incluira medios par sujetar al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, paquete, jeringuilla, cateter u otro recipiente de forma segura y protegida, por ejemplo, en confinamiento cerrado para la venta comercial. Dichos medios pueden incluir recipientes de plasticos moldeados por inyeccion o por soplado en los que se retienen los recipientes, dispositivos o reactivos deseados.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Los expertos en la materia deben apreciar que las tecnicas divulgadas en los ejemplos siguientes representan tecnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la practica de la invencion y, por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para esta practica. No obstante, los expertos en la materia debenan, a la luz de la presente divulgacion, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones espedficas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado parecido o similar sin desviarse del alcance de la invencion.

Ejemplo 1. Toxicidad de los rotuladores quirurgicos para el tejido venoso

Se recogieron los segmentos desechados no identificados de vena safena humana (n = 66 ), despues de obtener el consentimiento informado aprobado por la Junta de Revision Institucional de la Universidad Vanderbilt (Nashville, TN), de pacientes sometidos a una derivacion de las arterias coronarias o una derivacion vascular periferica. Las venas se almacenaron en solucion salina hasta el final del procedimiento quirurgico, momento en el cual se introdujeron en tampon de extraccion de transplante fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, 50 g/l de hidroxietilalmidon pH 7,4). La presencia de marcas azules se evaluo para cada VSH. Se cortaron anillos de 1,0 mm de anchura de los segmentos de la vena safena diseccionada libre de grasa y de tejido conjuntivo, se rasparon del endotelio y se suspendieron en un bano muscular que contiene un tampon bicarbonato (NaCl 120 mM, KCl 4,7 mM, MgSO41,0 mM, NaH2PO41,0 mM, glucosa 10 mM, CaCh 1,5 mM y Na2HCO325 mM, pH 7.4), se gasificaron con 95% de O2 / 5% de CO2 a 37°C. Los anillos se estiraron manualmente hasta 4 g de tension y se mantuvieron a una tension de reposo de 1g y se equilibraron durante ~2 horas. Se obtuvieron mediciones de la fuerza usando un transductor de fuerza Radnoti Glass Technology (Monrovia, CA) (159901 A) en interfaz con un sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO). Para determinar la viabilidad, los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y se midio la fuerza generada. La fuerza se convirtio en tension ([Newtons (N)/m2] = fuerza (g) x 0,0987/area, en la que el area es igual al peso humedo [mg / longitud (mm a la longitud maxima)] dividida por 1,055) 105N/m2. Se produjo una variabilidad en la viabilidad funcional de las venas (FIG. 1). Las venas que generaban una tension de < 0,025 x 105 N/m2 se consideraron no viables (gris) y las que generaban una tension de > 0,025 x 105 N/m2 eran viables (negro). El 40% de las venas analizadas fue no viable. Cada punto representa un paciente diferente y un agregado de al menos tres anillos distintos de cada paciente.

Los segmentos de vena safena humana (n = 8 ) se recogieron antes de la preparacion de la vena para el transplante en la circulacion arterial (sin manipular, SM) y despues de la preparacion quirurgica (despues de la manipulacion, DM). La preparacion implica distension manual de la vena, marcar con un rotulador de piel quirurgico e introducir la vena en solucion salina heparinizada. Se determino la respuesta contractil a KCl 110 mM (FIG. 2A) o a fenilefrina (10-6M, FIG. 2B) y la fuerza generada se convirtio en tension (105 N/m2). La manipulacion durante la preparacion de la vena condujo a una menor respuesta contractil al KCl y a la fenilefrina (FIGS. 2A-B). Cada punto representa un paciente diferente y un agregado de la respuesta al menos tres anillos distintos de cada paciente.

Las venas safenas humanas tambien se precontrajeron con fenilefrina (10-6M), seguido de tratamiento con carbacol (5 x 10-7M) para determinar la relajacion dependiente del endotelio (Furchgott et al., 1980). Los segmentos de vena safena humana (n = 5) se recogieron antes de la preparacion de la vena para el transplante en la circulacion arterial (sin manipular, SM) y despues de la preparacion quirurgica (despues de la manipulacion, DM). Los anillos de cada segmento se suspendieron en un bano de musculo, se equilibraron en un tampon bicarbonato y se contrajeron con KCl 110 mM. Tras 30 minutos adicionales de equilibrado en un tampon bicarbonato, los anillos se precontrajeron con fenilefrina (PE) 10-6M y se trataron con carbacol 5x10-7M. La fuerza se midio y se convirtio en tension 105 N/m2. Las respuestas se expresaron como el % de la contraccion maxima inducida por PE. La manipulacion tfpica durante la preparacion quirurgica condujo a una menor relajacion dependiente del endotelio (FIG. 3). SM min tema 28,74 ± 3,542% de la relajacion dependiente del endotelio, mientras que los DM se contrajeron en respuesta al carbacol ((­ 5,976 ± 0,9172%).

Las venas safenas humanas tambien se precontrajeron con fenilefrina (10-6 M), seguido de tratamiento con nitroprusiato sodico (10-7M) para determinar la relajacion independiente del endotelio. Los segmentos de la vena safena (n = 6 ) se recogieron antes de la preparacion de la extraccion (sin manipular, SM) o despues de la preparacion de la extraccion (despues de la manipulacion, DM). Los anillos de cada segmento se suspendieron en un bano de musculo, se equilibraron en un tampon bicarbonato y se contrajeron con KCl 110 mM. Tras 30 minutos adicionales de equilibrado en un tampon bicarbonato, los anillos se precontrajeron con fenilefrina (PE) 10-6M y se trataron con nitroprusiato sodico 10 -7M. La manipulacion tfpica durante la preparacion quirurgica redujo la relajacion independiente del endotelio de la vena safena humana (FIGS. 4A-B). Trazados de la fuerza representativos de los segmentos SM y DM recogidos del mismo paciente en respuesta a PE y SNP (FIG. 4A). Las relajaciones independientes del endotelio mostradas por los dos grupos, expresada como el % de la contraccion maxima inducida por PE, fueron significativamente diferentes. Las venas SM mostraron una relajacion del 86,62 /- 5,986%, mientras que las venas DM mostraron una relajacion del 4,292 /- 1,397% (FIG. 4B).

De las 38 venas recogidas de los pacientes sometidos a una derivacion de las arterias coronarias o a cirugfa de revascularizacion vascular periferica, 16 de las venas no teman ningun color visible con rotulador quirurgico mientras que 22 de las venas teman un color visible. Se cortaron anillos de las venas, se suspendieron en bano muscular y se equilibraron en tampon bicarbonato. Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM y la fuerza generada se convirtio en tension (105 N/m2). La fuerza generada por los dos grupos de venas fue significativamente diferente (FIG. 5). Las venas que teman un marcaje azul visible mostraron respuestas menos contractiles (0,047 ± 0,014105N/m2) que las venas que no teman un marcaje visible (0,174 ± 0,023105 N/m2).

Los segmentos desechados no identificados de la vena safena humana que no teman ningun color se usaron para analizar el efecto de diferentes procedimientos de marcaje. Los anillos cortados de los segmentos se dejaron sin marcar (control; n = 12), se marcaron con un rotulador quirurgico (Cardinal Health, #5227 tinta violeta para marcaje; n = 5), se marcaron en 50% de alcohol isopropflico, un disolvente usado en el marcador de la piel (n = 4) o se marcaron con azul de metileno (Akorn, Inc., Lake Forest IL; n = 10) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los anillos se rasparon del endotelio y se suspendieron en un bano muscular que contiene un tampon bicarbonato (NaCl 120 mM, KCl 4,7 mM, MgSO41,0 mM, NaH2PO41,0 mM, glucosa l0 mM, CaCl2 1,5 mM y Na2HCO325 mM, pH 7.4), se gasificaron con 95% de O2 / 5% de CO2 a 37°C. Los anillos se estiraron manualmente hasta 4 g de tension y se mantuvieron a una tension de reposo de 1 g y se equilibraron durante ~2 horas. Se obtuvieron mediciones de la fuerza usando un transductor de fuerza Radnoti Glass Technology (Monrovia, CA) (159901 A) en interfaz con un sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO). Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y la fuerza generada se convirtio en tension 105N/m2. Los tres grupos marcados fueron significativamente diferentes del grupo control sin marcar (p <0,05) (FIG. 6). Los anillos que no teman marcajes teman una tension promedio de 0,110 ± 0,014 105N/m2, los anillos marcados con el marcador de piel quirurgico teman una tension promedio de 0,003 ± 0,001105 N/m2, los anillos marcados con un 50% de alcohol isopropflico teman una tension promedio de 0,005 ± 0,003 105N/m2 y los anillos marcados con azul de metileno teman una tension promedio de 0,014 ± 0,01 105N/m2.

Las venas safenas porcinas recien aisladas se usaron para analizar el efecto de diferentes procedimientos de marcaje. Las venas se recogieron e introdujeron en tampon de extraccion para transplantes fno [lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50g/l, pH 7,4]. Los vasos se almacenaron en tampon de extraccion para transplantes a 4°C y se analizaron en las 24 horas posteriores a la extraccion. Para analizar la viabilidad se cortaron anillos de 1,0 mm de anchura de segmentos de la vena safena y se les retiro la grasa y el tejido conjuntivo. Los anillos de vena safena no se trataron (control; n = 6), se marcaron con el marcador de piel quirurgico (n = 3) o 50 % de alcohol isopropflico (el disolvente usado en el marcador quirurgico; n = 3) y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los anillos se equilibraron despues en un bano muscular, se contrajeron con KCl y la fuerza se midio y se convirtio en tension (105 N/m2). Los anillos que no teman marcas teman una tension promedio de 0,263 ± 0,039 N/m2, los anillos marcados con el marcador de piel quirurgico teman una tension promedio de 0,114 ± 0,017 N/m2 y los anillos marcados con 50% de alcohol isopropflico teman una tension promedio de 0,00005 ± 0,00005 N/m2. Los dos grupos marcados fueron significativamente diferentes del grupo control sin marcar (p <0,05). (FIG. 7).

Ejemplo 2. Celulas de vena vivas se correlacionan con la viabilidad funcional

Se uso un ensayo de celulas vivas para determinar la viabilidad celular de la vena safena humana. Se recogieron los segmentos desechados no identificados de vena safena (n = 13), despues de obtener el consentimiento informado aprobado por la Junta de Revision Institucional de la Universidad Vanderbilt (Nashville, TN), de pacientes sometidos a una derivacion de las arterias coronarias o una derivacion vascular periferica. Las venas se almacenaron en solucion salina hasta el final del procedimiento quirurgico, momento en el cual se introdujeron en tampon de extraccion de transplante fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, 50 g/l de hidroxietilalmidon pH 7,4). Los vasos se almacenaron en tampon de extraccion para transplantes a 4°C y se analizaron en las 24 horas posteriores a la extraccion. Cada vena se sometio a un experimento fisiologico y el ensayo de celulas vivas usando bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT). Para analizar la viabilidad, se cortaron anillos de 1,0 mm de anchura de los segmentos de la vena safena diseccionada libre de grasa y de tejido conjuntivo, algunos se rasparon del endotelio y se suspendieron en un bano muscular que contiene un tampon bicarbonato (NaCl 120 mM, KCl 4,7 mM, MgSO41,0 mM, NaH2PO41,0 mM, glucosa 10 mM, CaCl21,5 mM y Na2HCO325 mM, pH 7.4), se gasificaron con 95% de O2 / 5% de CO2 a 37°C. Los anillos se estiraron manualmente hasta 4 g de tension y se mantuvieron a una tension de reposo de 1g y se equilibraron durante ~2 horas. Se obtuvieron mediciones de la fuerza usando un transductor de fuerza Radnoti Glass Technology (Monrovia, CA) (159901 A) en interfaz con un sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO). Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y se midio la fuerza generada. Todos los tejidos que no se contrajeron con KCl se consideraron no viables. La fuerza se convirtio en tension 105 N/m2 para cada anillo y se promedio para cada vena. Para evaluar la viabilidad celular, tres anillos de cada vena se colocaron por separado en 0,25 ml de una solucion de MTT al 0,1% (preparada en solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 7,4). Para el control negativo, un anillo se coloco en 20 ml de agua y se sometio a microondas durante 10 minutos para inactivar cualquier actividad enzimatica antes de introducirlo en la solucion de MTT al 0,1%. Los anillos se incubaron a 37°C durante 1 hora. La reaccion se detuvo introduciendo los anillos en agua destilada. Los tejidos se pesaron y se introdujeron en 1 ml de CelloSolve (Sigma) durante 4 horas a 37 °C para extraer el colorante de formazan de cada uno. La concentracion del colorante se midio a 570 nm usando un espectrofotometro (Beckman Coulter). La absorbancia del control negativo se resto de cada muestra. El mdice de viabilidad se expreso como la DO570/mg/ml. El promedio para cada vena se calculo de los tres anillos. La tension promedio obtenida de cada vena se represento a continuacion frente al mdice de viabilidad promedio.

Los datos representan una pendiente significativa que muestra que habfa una relacion proporcional (R2 = 0,7262) entre la viabilidad mitocondrial y la viabilidad por tension determinada por la a contraccion inducida por KCl 110 mM (FIG. 8). Los anillos de VSH representativos del mdice de viabilidad bajo (izquierda) y alta (derecha) se muestran en el recuadro.

Ejemplo 3. Soluciones y procedimientos de extraccion de venas

La vena safena porcina recien aislada se recogio en tampon de extraccion para transplantes fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50 g/l, pH 7,4). Los vasos se analizaron en las 24 horas de la extraccion y se almacenaron en tampon de extraccion para transplantes a 4°C. La vena se limpio de grasa y tejido conjuntivo y se corto en segmentos de 2 cm de longitud. Los segmentos se estiraron hasta dos veces su longitud de reposo (estirado; n = 7) o no se manipularon (control; n = 12). Despues de estirar, los segmentos de ambos grupos se dividieron adicionalmente. Despues se aplico una solucion de erioglaucina (FCF, 2,6 mM, en 5% de propilenglicol y agua) o vetnculo con una torunda de algodon en una lmea longitudinal en los segmentos de vena sin tratar (FCF; n = 8) o estirados (Estirado+FCF; n = 3). Los segmentos se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en Plasmalyte y despues se cortaron en anillos. Los anillos se suspendieron en un bano muscular que contiene un tampon bicarbonato (NaCl 120 mM, KCl 4,7 mM, MgSO41,0 mM, NaH2PO41,0 mM, glucosa 10 mM, CaCl21,5 mM y Na2HCO325 mM, pH 7.4), se introdujeron burbujas de 95% de O2 / 5% de CO2 a 37°C. Los anillos se estiraron manualmente hasta 4 g de tension y se mantuvieron a una tension de reposo de 1g y se equilibraron durante ~2 horas. Las mediciones de la fuerza se obtuvieron usando un transductor de fuerza Radnoti Glass Technology (Monrovia, CA) (159901A) en interfaz con un sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO. Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y la fuerza generada se convirtio en tension 105 N/m2 (FIG. 9). Los anillos control teman una tension promedio de 0,47 ± 0,034 N/m2, los anillos marcados con el colorante erioglaucina teman una tension promedio de 0,566 ± 0,064 N/m2 y los anillos estirados teman una tension promedio de 0,367 ± 0,042 N/m2 y los anillos estirados con el colorante erioglaucina teman una tension promedio de 0,713 ± 0,111 N/m2. La tension para la vena estirada fue significativamente diferente (*p < 0,05) de la de las venas no estiradas control y la vena estirada con el colorante erioglaucina ((#p < 0,05) fue significativamente diferente cuando se comparo con la estirada sin el colorante erioglaucina (FIG. 9).

No obstante, el tratamiento con otro colorante, Rojo Allura, no restablecio la viabilidad funcional despues de la lesion por estiramiento de la vena safena porcina (FlG. 10), las venas safenas porcinas (n = 4) se dejaron sin tratar (control) o se estiraron a dos veces su longitud de reposo (sin colorante), se cortaron en anillos y se suspendieron en el tampon bicarbonato en un bano muscular. Los anillos de los segmentos estirados se incubaron con Rojo Allura 50 |jM (+Rojo) o 50 |^jM de erioglaucina (+FCF) durante 30 minutos. Despues se dejaron equilibrar los anillos en el tampon bicarbonato antes de contraerlos con KCl 110 mM. La fuerza generada se convirtio en tension (105N/m2). Los datos representan la respuesta contractil relativa a los anillos control, que se fijo como un 100%. La tension para la vena estirada no fue significativamente diferente de la de la vena estirada con Rojo Allura (NS). El colorante erioglaucina restablecio significativamente la respuesta contractil en la vena estirada (#p <0,05) cuando se comparo con la vena estirada con Rojo Allura.

El efecto de la erioglaucina sobre la vena safena humana se determino usando segmentos desechados no identificados de vena safena humana de pacientes sometidos a derivacion de arterias coronarias o a cirugfa de derivacion vascular periferica (n = 4). Las venas se almacenaron en solucion salina hasta el final del procedimiento quirurgico, momento en el cual se introdujeron en tampon de extraccion de transplante fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, 50 g/l de hidroxietilalmidon pH 7,4). Los vasos se analizaron en las 24 horas posteriores al almacenamiento de extraccion en tampon de extraccion de transplantes a 4°C. Para analizar la viabilidad, se cortaron anillos de 1,0 mm de anchura de segmentos de la vena safena de la que se ha limpiado la grasa y el tejido conjuntivo, se trataron con una solucion de erioglaucina (FCF, 2.6 mM, en 5% de propilenglicol y agua) o vetnculo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues, los tejidos se rasparon del endotelio y se suspendieron en un bano muscular que contiene un tampon bicarbonato, se desgasificaron con 95% de 02/5% de CO2 a 37°C. Los anillos se estiraron manualmente hasta 4 g de tension y se mantuvieron a una tension de reposo de 1 g y se equilibraron durante ~2 horas. Se obtuvieron mediciones de la fuerza usando un transductor de fuerza Radnoti Glass Technology (Monrovia, CA) (159901 A) en interfaz con un sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO). Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y se midio la fuerza generada. La fuerza se convirtio en tension 105 N/m2 y se represento para los anillos de vetnculo y de erioglaucina. Los trazados representativos de la muestra de los anillos se dejaron sin tratar (control) o se trataron con el colorante erioglaucina (FCF) se representan (FIG. 11A). Los anillos de vetnculo teman una tension promedio de 0,015 ± 0,012 N/m2 y los anillos tratados con erioglaucina teman una tension promedio de 0,103 ± 0,021 N/m2 (FIG. 11B). Los dos grupos eran significativamente diferentes (p < 0,05).

Los segmentos de la vena safena humana se recogieron tras la extraccion antes de la manipulacion quirurgica de pacientes sometidos a derivacion de las arterias coronarias o a cirugfa de derivacion vascular periferica y se almacenaron en PlasmaLyte. Los vasos se analizaron en las 2 horas anteriores a la extraccion. La vena safena porcina recien aislada se recogio en tampon de extraccion para transplantes fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgS045 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50 g/l, pH 7,4). Los vasos se analizaron en las 24 horas anteriores a la extraccion. Se cortaron anillos de 1,0 mm de anchura de las venas safenas porcinas (FIG. 12A, n = 2) y la vena safena humana no manipulada (FIG. 12B, n = 4) se limpio de grasa y tejido conjuntivo. Despues, los anillos se rasparon del endotelio y se suspendieron en un bano muscular que contiene un tampon bicarbonato, se introdujeron burbujas con 95% de 02/5% de CO2 a 37°C. Los anillos se estiraron manualmente hasta 4 g de tension y se mantuvieron a una tension de reposo de 1 g y se equilibraron durante ~2 horas. Se obtuvieron mediciones de la fuerza usando un transductor de fuerza Radnoti Glass Technology (Monrovia, CA) (159901 A) en interfaz con un sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO). Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM. Tras un equilibrado adicional de 30 minutos, los anillos se trataron con una solucion de erioglaucina (FCF, 50-200 pM durante 30 minutos) o vehmulo durante 30 minutos y despues se contrajeron con BzATP 100 pM. La fuerza se midio y se convirtio en tension. La respuesta se expreso como el % de la contraccion maxima de KCl. El trazado de la fuerza representativa de la vena safena humana contrafda con BzATP despues del tratamiento con vehmulo (control) o erioglaucina 50 pM (pretratamiento con FCF) se representa en la FIG. 12C. El pretratamiento con erioglaucina (FCF) pero no el vehmulo (control) inhibio significativamente la contraccion inducida por BzATP (*p<0,05) (FIG. 12B).

Los segmentos de vena safena humana se recogieron antes de la preparacion de la vena para transplante en la circulacion arterial (sin manipular, SM) y despues de la preparacion quirurgica (despues de manipular, DM) de los mismos pacientes en PlasmaLyte y se usaron en las 2 horas posteriores a la extraccion. El segmento se corto en anillos de ~1 mm y un anillo de cada grupo se fijo en formalina (pre-cultivo). Los otros anillos se cultivaron en medio RPMI suplementado con 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y 30% de suero bovino fetal a 5% de CO2 y a 37°C en ausencia (Control) o presencia de erioglaucina (FCF) 50 pM durante 14 dfas. Tras 14 dfas, los anillos se fijaron en formalina, se seccionaron a 5 pm y se tineron usando tincion de Verhoff Van Gieson. La micrograffa optica de los anillos se capturo usando un Axiovert 200 y el espesor de la mtima se midio usando AxioVision. Los datos representan el % del incremento del espesor de la mtima relacionado con el espesor de la mtima basal del anillo pre-cultivo que se fijo como el 0%. Las barras de error muestran el error estandar de la media. La manipulacion durante la preparacion de la vena aumento el espesor de la capa mtima (#p = 0,053 en la prueba t pareada) y el tratamiento con erioglaucina inhibio significativamente (* p < ,05) el desarrollo del espesor de la mtima cuando se comparo con el control (FIG. 13).

La vena safena porcina recien extrafda se recogio mediante un procedimiento sin tocar en condiciones esteriles y se almaceno en tampon de extraccion para transplantes fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgS045 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50 g/l, pH 7,4). Los vasos se usaron en las 24 horas anteriores a la extraccion. Las venas se dividieron en tres segmentos que se dejaron sin tratar (sin manipular, n = 7), se distendieron (distendidas, n = 8) a >40 kPa o se distendieron en presencia de la valvula de alivio de presion (venteo, n = 7). Cada segmento se corto despues en anillos de ~1 mm y un anillo de cada condicion se fijo inmediatamente en formalina (pre-cultivo). Los otros anillos se cultivaron en medio RPMI suplementado con 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y 30% de suero bovino fetal a 5% de CO2 y a 37°C en ausencia (Control) o presencia de erioglaucina (FCF) 50 pM, azul brillante G (BBG) 50 pM o Rojo Allura 50 pM durante 14 dfas. Tras 14 dfas, los anillos se fijaron en formalina, se seccionaron a 5 pm y se tineron usando tincion de Verhoff Van Gieson. La micrograffa optica de los anillos se capturo usando un Axiovert 200 y el espesor de la mtima se midio usando AxioVision. El tratamiento con erioglaucina pero no con rojo allura inhibio los incrementos inducidos por la distension en el espesor de la mtima, * p < 0,05 en comparacion con las distendidascontrol (FIG. 14).

Los anillos de la arteria mamaria interna izquierda humana (LIMA; n = 3) y las venas safenas se obtuvieron antes de la preparacion de la vena para transplante en la circulacion arterial (sin manipular, SM; n = 5) y tras la preparacion quirurgica (despues de la manipulacion, DM; n = 5). Los anillos cortados de los segmentos SM se incubaron en solucion de la University of Wisconsin (UW), solucion salina heparinizada (HS), PlasmaLyte heparinizado (HP) o PlasmaLyte heparinizado que contiene trehalosa (HPT) 30 mM durante 2 horas a temperatura ambiente. Se cortaron anillos de las venas, se suspendieron en bano muscular y se equilibraron en tampon bicarbonato. Los anillos se precontrajeron con fenilefrina 10'6 M y despues se trataron con carbacol 5 x 10'7 M para determinar la relajacion dependiente del endotelio. Los anillos de la LIMA teman una relajacion dependiente del endotelio mayor que la vena safena (FIG. 15). La manipulacion durante la preparacion quirurgica condujo a una menor relajacion dependiente del endotelio (FIG. 15). El almacenamiento en solucion salina heparinizada [* p < 0,05 en comparacion con HS para todos los grupos SM (SM, UW, HP, y HPT)], pero no en Plasmalyte heparinizado, Plasmalyte heparinizado mas trehalosa o solucion de extraccion para transplante condujo a una menor relajacion dependiente del endotelio (FIG.

15). Los datos se presentan como el % de relajacion (en comparacion con la contraccion maxima inducida por fenilefrina).

Se recogieron los segmentos desechados no identificados de vena safena humana (n = 5), despues de obtener el consentimiento informado aprobado por la Junta de Revision Institucional de la Universidad Vanderbilt (Nashville, TN), de pacientes sometidos a una derivacion de las arterias coronarias o una derivacion vascular periferica. Las venas se almacenaron en solucion salina hasta el final del procedimiento quirurgico, momento en el cual se introdujeron en tampon de extraccion de transplante fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, 50 g/l de hidroxietilalmidon pH 7,4). Los vasos se analizaron en las 24 horas posteriores a la extraccion y almacenamiento en tampon de extraccion para transplante a 4°C. Se conecto una valvula de venteo a una jeringuilla en un extremo y a una vena safena canulada en el otro. El extremo distal de la vena safena tambien se canulo y se conecto a un transductor de presion. La presion se monitorizo mientras que la vena se distendio con cuna jeringuilla manual y sin la valvula de liberacion de presion. El monitor de presion no medina las presiones por encima de los 40 kPa. Esto creo tres grupos y fueron los siguientes: presion de venteo (Popoff), presion maxima con valvula de venteo (max con valvula) y presion maxima sin valvula de venteo (max sin valvula). Las venas que teman una valvula de venteo teman una presion media de 18 ± 0,17 kPa y una presion maxima de 19 ± 0,27 kPa, mientras que las venas sin la valvula de venteo teman una presion media de 40 ± 0,00 kPa (FIG. 16). La presion promedio y maxima en las venas con la valvula de venteo fueron significativamente diferentes de las de las venas sin la valvula de venteo (p <0,05).

La vena safena porcina recien extrafda se recogio mediante un procedimiento sin tocar en condiciones esteriles y se almaceno en tampon de extraccion para transplantes fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50 g/l, pH 7,4). Los vasos se usaron en las 24 horas anteriores a la extraccion. Las venas (n = 4) se distendieron manualmente con una jeringuilla en ausencia (distendidas) o presencia de una valvula de liberacion de presion (venteo) en lmea. Los segmentos control no estaban distendidos (ND). Tras la distension se cortaron anillos de los segmentos y se suspendieron en un bano muscular. Los anillos se contrajeron previamente con fenilefrina 10-6 M y despues se trataron con carbacol 5 x 10-7 M para determinar la relajacion dependiente del endotelio. Los datos se presentan como el % de relajacion (en comparacion con la contraccion maxima inducida por fenilefrina). La distension manual con una jeringuilla a mano condujo a disminuciones significativas (p < 0,0005) en la relajacion dependiente del endotelio y la valvula de liberacion de presion evita esta perdida de relajacion dependiente del endotelio (FIG. 17).

Arterias coronarias porcinas se aislaron de cerdos sacrificados y se introdujeron directamente en tampon de extraccion para transplantes fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50 g/l, pH 7,4). Las arterias coronarias se limpiaron de grasa y tejidos adventicios y se retiro el endotelio. Se cortaron anillos transversales (de 1,0 mm de espesor) y se suspendieron en un bano muscular, se unieron mediante seda 3-0 para forzar los transductores (Kent Scientific, CT) en interfaz con una tabla A-D de traduccion de datos (Data Translation, MA). Los datos se adquirieron con el programa de software Power Lab. Lo anillos de arterias coronarias porcinas se suspendieron en un bano muscular y se equilibraron en tampon bicarbonato de Krebs Ringer durante 2 horas. Los anillos se estiraron y la longitud se ajusto progresivamente hasta obtener la tension maxima. Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y la fuerza generada se midio y se convirtio en tension [Newtons (N)/m2] = fuerza (g) x 0,0987/area, en la que el area es igual al peso humedo [mg/longitud (mm a la longitud maxima)] dividido por 1,055. Los anillos se lavaron y equilibraron durante otros 30 minutos. Los anillos se trataron con histamina 5 pM, KCl 110 mM, papaverina (PAP) 1 mM, papaverina 1 mM durante 10 minutos, seguido de histamina 5 pM o papaverina 1 mM durante 10 min, seguido de KCl 110 mM y la fuerza generada se midio y se convirtio en tension. Los trazados de la fuerza representativos de los anillos tratados con histamina (Hist), 5 pM, KCl (KCl) 110 mM, papaverina (PAP) 1 mM, papaverina 1 mM durante 10 minutos, seguido de histamina 5 pM (Pap+Hist) o papaverina 1 mM durante 10 min, seguido de KCl (Pap+KCl) 110 mM se representaron en la FIG. 18^a . La disminucion de la tension se convirtio en un porcentaje de la contraccion maxima inicial por KCl, que se fijo en 100%. El tratamiento con papaverina redujo la tension basal en los anillos (-15,0 ± 3,135%) (FIG. 18B). El pretratamiento de los anillos con papaverina inhibio completamente la contraccion inducida por histamina (-12,0 ± 4,163 en comparacion con 98,613 ±11,049) y KCl (-20,0 ±10,00 en comparacion con 103,33 ± 2,404%) (FIG. 18B).

Los segmentos desechados no identificados de vena safena humana (n = 6) se recogieron, tras el consentimiento informado aprobado por la Junta de Revision Institucional de la Universidad de Vanderbilt (Nashville, TN), de pacientes sometidos a cirugfa de derivacion de las arterias coronarias o de derivacion vascular periferica. Las venas se almacenaron en una solucion salina hasta el final del procedimiento quirurgico, momento en el cual se introdujeron en tampon de extraccion para transplantes fno (lactobionato potasico 100 mM, KH2PO425 mM, MgSO4 5 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutation 3 mM, alopurinol 1 mM, hidroxietilalmidon 50 g/l, pH 7,4). Los vasos se analizaron en las 24 horas posteriores a la extraccion y almacenamiento en tampon de extraccion para transplantes a 4°C. Las venas se limpiaron de grasa y de tejidos adventicios y se retiro el endotelio. Se cortaron anillos transversales (de 1,0 mm de espesor) y se suspendieron en un bano muscular, se unieron mediante seda 3-0 para forzar los transductores (Kent Scientific, CT) en interfaz con el sistema de adquisicion de datos Powerlab y el software Chart (AD Instruments, Colorado Springs, CO). Los anillos de vena safena humana se suspendieron en un bano muscular y se equilibraron en tampon bicarbonato de Krebs Ringer durante 2 horas. Los anillos se estiraron y la longitud se ajusto progresivamente hasta obtener la tension maxima. Los anillos se contrajeron con KCl 110 mM (con sustitucion equimolar de NaCl en tampon bicarbonato) y la fuerza generada se midio y se convirtio en tension [Newtons (N)/m2] = fuerza (g) x 0,0987/area, en la que el area es igual al peso humedo [mg/longitud (mm a la longitud maxima)] dividido por 1,055. Los anillos se lavaron y equilibraron durante otros 30 minutos. Los anillos se trataron con norepinefrina (NE) 0,5 pM, papaverina (Pap) 1 mM o papaverina 1 mM durante 10 minutos, seguido de NE 0,5 pM y la fuerza generada se midio y se convirtio en tension. La disminucion de la tension se convirtio en un porcentaje de la contraccion maxima inicial por KCl, que se fijo en 100%. Los trazados de la fuerza representativos de los anillos tratados con NE (NE) 0,5 pM, papaverina (Pap) 1 mM o papaverina 1 mM durante 10 minutos, seguido de NE 0,5 pM se representaron en FIG. 19A. La disminucion de la tension se convirtio en un porcentaje de la contraccion inicial maxima por KCl que se fijo en 100%. n = 6. El tratamiento con papaverina redujo la tension basal en los anillos (-9,772.0 ± 3,226%). El pretratamiento de la vena safena humana con papaverina inhibio completamente la contraccion inducida por NE (-3,210 ± 5,119 en comparacion 89,935 ± 18,344%) (FIG. 19B).

El dispositivo de extraccion de vena se muestra en la FIG. 20. El extremo distal de la vena (la vena esta invertida por las valvulas de la vena) se canula con un cateter de plastico con punta en forma de bala que tiene una luz para irrigacion y se fija al cateter con una pinza con un muelle. El cateter esta recortado en la base. Y un cateter con punta en forma de bala adicional sin luz se fija al extremo proximal de la vena con el extremo opuesto de la base recortado. El dispositivo se abre poco a poco hasta que la vena tiene la misma longitud que in vivo. Una jeringuilla con un tubo de extension y una valvula de liberacion de presion en lmea se fija al extremo distal de la vena. Ahora, la vena se puede distender y se ligan las ramas laterales.

Ejemplo 4. Protocolo clinico predictivo

La vena safena mayor se extraera quirurgicamente usando tecnicas quirurgicas estandar. El extremo distal de la vena se puede canular con una canula venosa con punta en forma de bala y se fija con una pinza o un nudo de seda. La valvula de liberacion de la presion se fijara a la canula con una jeringuilla de 10 o 20 cc fijada al otro extremo de la valvula. En algunos casos, los tubos de extension se colocaran entre la jeringuilla y la valvula. La vena se distendera con la solucion de extraccion de la vena y las tributarias identificadas y ligadas con suturas de seda o pinzas. La vena se marcara con el marcador del kit a lo largo de una superficie larga para mantener la orientacion de la vena. En algunos casos, la vena se puede marcar antes de su extraccion del paciente. Despues, la vena se introducira en la solucion de extraccion hasta la implantacion en la circulacion arterial. En una realizacion, el colorante del rotulador contendra un antagonista del receptor P2 X7 y la solucion de extraccion no contendra un antagonista del receptor P2 X7. En otra realizacion, el colorante del rotulador no contendra un antagonista del receptor P2 X7, pero sf la solucion. En una tercera realizacion, tanto el colorante del rotulador como la solucion contendran un antagonista del receptor P2 X7.

VII. Referencias

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Publicacion de patente de EE.UU. 2002/0182646

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de tratamiento de un explante venoso antes de transplantar, que comprende:

(a) estabilizar un explante venoso con azul brillante G para producir un explante venoso, en el que el azul brillante G se aplica al explante venoso con un rotulador y/o con una solucion tamponada que contiene azul brillante G a un pH de 7,0-7,6; y

(b) conservar la viabilidad funcional del explante venoso estabilizado.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que azul brillante G se aplica al explante venoso con un rotulador que comprende un colorante, y en el que el colorante comprende el azul brillante G.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que se azul brillante G al explante venoso poniendo en contacto el explante venoso con una solucion tamponada que comprende azul brillante G a un pH de 7,0-7,6, y opcionalmente en el que la solucion tamponada comprende ademas heparina, solucion salina tamponada con fosfato, MOPS, HEPES, PIPES, acetato y/o Plasmalyte.

4. El procedimiento de cualquier reivindicacion precedente, en el que el procedimiento restablece la viabilidad funcional del explante venoso que, antes de la etapa (a) de la reivindicacion 1, no era viable.

5. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que dicha solucion tamponada comprende ademas uno o mas de un agente anticontractil (tal como un inhibidor de la fosfodiesterasa, un bloqueante de los canales de calcio, un donante de oxido mtrico o un analogo de nucleotidos dclicos), un agente antioxidante (tal cono N-acetilcistema, alopurinol, glutation, manitol, acido ascorbico, un tocoferol, un tocotrienol o un fenol de te verde), un oligosacarido (tal como acido lactobionico, rafinosa o trehalosa), un agente coloidal (tal como hidroxietilalmidon, dextrano, sangre o albumina), un agente antiinflamatorio (tal como un corticosteroide, un antiinflamatorio no esteroideo, un inhibidor de la MAPKAP quinasa 2, anti-TNF-a, anti-IL-1-p, o un inhibidor de la Cox-2), un conservante de la funcion endotelial (tal como un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina, un inhibidor del receptor de angiotensina, una estatina, metformina o un estrogeno), un regulador metabolico (tal como glucosa, adenosina amilina, peptido genico relacionado con la calcitonina o insulina), un hidrogel (por ejemplo, un hidrogel compuesto por un polisacarido natural, tal como alginato, dextrano, chitosano y glucosaminoglucano, o un polfmero hidrofilo, tal como polietilenglicol, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polihidroxibutirato o poli(n-isopropilacrilamida), un inhibidor de la protema del shock termico 27 (HSP27) (tal como un ARNsi o ARNmi que inhibe la expresion de HSP27), un regulador de HSP20 (tal como un anti-ARNmi que potencia la expresion de HSP20) y/o un inhibidor de la quinasa MAPKAP 2 (tal como un inhibidor peptfdico).

6. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que dicho explante esta marcado con un marcador sin alcohol y, opcionalmente, en el que dicho marcador comprende un colorante que comprende azul brillante G y, ademas opcionalmente, en el que el procedimiento restaura la viabilidad funcional de un explante venoso que, antes de estabilizar la etapa (b) de la reivindicacion 1, no era viable.

7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que

(a) el explante venoso estabilizado se caracteriza ademas por ser capaz de generar una fuerza contractil superior a la de un vaso sangumeo control cuando se contrae con KCl in vitro; o

(b) el explante venoso estabilizado se caracteriza ademas por ser capaz de resistir presiones de lavado internas de menos de 26,7 kPa cuando esta distendido y, opcionalmente, en el que la luz de los explantes venosos estabilizados se lava con la solucion tamponada a presiones de lavado inferiores a 26,7 kPa .

8. Un rotulador quirurgico esteril en el que (i) el rotulador esta cargado con un colorante que comprende azul brillante G o (ii) el rotulador esta vacm y se proporciona con azul brillante G en una solucion esteril o en forma de reactivo esteril para que un usuario cargue el rotulador.

9. Un kit de transplante de vena esteril, que comprende:

(a) un rotulador quirurgico esteril de acuerdo con la reivindicacion 8; y

(b) una solucion fisiologica tamponada esteril o reactivos esteriles para fabricarla, opcionalmente en el que dicha solucion tamponada comprende solucion salina tamponada con fosfato, MOPS, HEPES, PIPES, acetato o Plasmalyte, y/o en la que dicha solucion tamponada esteril tiene un pH de 7,0-7,6;

en el que el kit opcionalmente comprende ademas uno o mas de

(c) un recipiente adecuado para banar un explante venoso;

(d) uno o mas de heparina, un agente anti-contractil, un agente antioxidante, un oligosacarido, un agente coloidal, un agente antiinflamatorio, un conservante de la funcion endotelial, un regulador metabolico, un hidrogel, un inhibidor de la protema del shock termico, sulfato de magnesio y/o un inhibidor de la quinas MAPKAP 2;

(e) un dispositivo para lavar la luz de un explante venoso, en el que dicho dispositivo esta disenado para prevenir las presiones de lavado en el interior del explante venoso superiores a 26,7 kPa o de mas de 20 kPa y, opcionalmente, en el que el dispositivo comprende una jeringuilla y/o un cateter y una valvula de venteo y, ademas opcionalmente, en el que la jeringuilla o cateter comprende una punta con forma de bala que comprende una luz para la introduccion en un extremo proximal de dicho explante venoso; y/o

(f) una pinza disenada para sujetar dicho explante venoso.

10. Una solucion tamponada esteril de pH de 7,0-7,6, tal como pH 7,35-7,45, o un pH seleccionado de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6, en la que dicha solucion tamponada comprende azul brillante G, y opcionalmente ademas comprende heparina, opcionalmente en la que dicha solucion tamponada comprende solucion salina tamponada con fosfato, MOPS, HEPES, PIPES, acetato o Plasmalyte.

11. La solucion de la reivindicacion 10, en la que dicha solucion tamponada comprende ademas uno o mas de un agente anticontractil (tal como un inhibidor de la fosfodiesterasa, un bloqueante de los canales de calcio, un donante de oxido mtrico o un analogo de nucleotidos dclicos), un agente antioxidante (tal cono N-acetilcistema, alopurinol, glutation, manitol, acido ascorbico, un tocoferol, un tocotrienol o un fenol de te verde), un oligosacarido (tal como acido lactobionico, rafinosa o trehalosa), un agente coloidal (tal como hidroxietilalmidon, dextrano, sangre o albumina), un agente antiinflamatorio (tal como un corticosteroide, un antiinflamatorio no esteroideo, un inhibidor de la MAPKAP quinasa 2, anti-TNF-a, anti-IL-1-p, o un inhibidor de la Cox-2), un conservante de la funcion endotelial (tal como un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina, un inhibidor del receptor de angiotensina, una estatina, metformina o un estrogeno), un regulador metabolico (tal como glucosa, adenosina, amilina, peptido genico relacionado con la calcitonina o insulina), un hidrogel (tal como un hidrogel compuesto por un polisacarido natural tal como alginato, dextrano, chitosano y glucosaminoglucano, o un polfmero hidrofilo tal como polietilenglicol, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polihidroxibutirato o poli(n-isopropilacrilamida), un inhibidor de la protema del shock termico 27 (HSP27) (tal como un ARNsi o ARNmi que inhibe la expresion de HSP27), un regulador de HSP20 (tal como un anti-ARNmi que potencia la expresion de HSP20) y/o un inhibidor de la quinasa MAPKAP 2 (tal como un inhibidor peptidico).

12. Un colorante que comprende azul brillante G para su uso en el marcado de una vena en un paciente antes de la extraccion de la vena del paciente.

13. Uso de azul brillante G para marcar un explante venoso.

14. Uso de azul brillante G para estabilizar y/o conservar o restablecer la viabilidad funcional de un explante venoso.