CN102834102A - 用于静脉采集和自体移植的改进的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

移植失败的首要原因是随后发生内膜增生，这代表了对认为与平滑肌增殖、迁移、表型转化以及细胞外基质(ECM)沉积相关之损伤的反应。本发明显示通常用于静脉采集的外科技术(拉伸静脉、将静脉置于低pH溶液以及使用有毒的外科皮肤标记物)导致损伤。因此本发明提供无毒的外科标记物和其他添加剂，所述外科标记物还对拉伸诱导的功能活力丧失提供保护。本发明还提供用于降低物理应力或对其所产生影响提供保护的设备和组合物。

Description

用于静脉采集和自体移植的改进的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年12月8日提交的序列号为No.61/267,640的美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用合并到本文中。
技术领域
本发明一般地涉及如下领域：自体静脉、静脉移植、静脉保存、组织保存、内膜增生、血管痉挛、药物、设备以及血管生物学。
本发明在来自国立卫生研究院的资助No.2R01 HL070715的政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
人大隐静脉(HSV)仍然是用于冠状和外周动脉旁路移植的最常用管道。HSV通常用直接手术暴露或者内窥镜静脉采集从腿采集。将分支结扎并且将静脉取出，并在植入之前置于“后台(back table)”。多数外科医生将HSV在室温下置于肝素化盐溶液中。在远端对静脉进行插管并且用肝素化盐溶液人工扩张(用注射器)。这允许对在采集过程中遗漏的分支进行鉴别和结扎。这种人工扩张引起静脉损伤。静脉还可用外科皮肤标记物进行标记，从而在植入期间优化其取向。
在全世界每年进行的超过1百万例冠状旁路手术中，10％至15％的冠状静脉移植物发生早期血栓性阻塞；还有10％至15％在之后的1年至5年由于内膜增生而发生阻塞，再有30％至40％在随后的5年至7年中由于内膜增生与进行性动脉粥样硬化的叠加而发生阻塞。12年后少于一半的静脉移植物仍有效(Motwani & Topol，1998)。静脉移植物阻塞引起心肌梗塞、肢体丧失以及死亡。
动脉旁路移植失败的首要原因是内膜增生(Clowes & Reidy，1991)。尽管血管介入近来有许多技术发展，但是内膜增生仍然是昂贵的、与疾病相关的并且未解决的问题。内膜增生由一连串事件介导，包括血管平滑肌增殖、迁移、表型转化以及细胞外基质产生(Allaire & Clowes，1997；Mosse等人，1985)。该过程引起血管腔的病理性变窄、移植物狭窄，并最终引起移植物衰竭(LoGerfo等人，1983)。
测试其抑制内膜增生之能力的许多药物在临床试验中都失败了。抗血栓剂和抗血小板剂(如华法林(warfarin)、氯吡格雷(clopidogrel)和阿司匹林(aspirin))对内膜增生没有或几乎没有作用(Kent & Liu，2004)。药物洗出式支架在预防冠状动脉血管成形术之后的再狭窄中已表现出有效；但是，还没有治疗被批准用于自体管道。使用E2F诱饵(与转录因子结合从而隔离这些蛋白质的DNA短序列)预防平滑肌增殖的以预防冠状和外周血管静脉移植物衰竭的两个大型临床试验的最初目的失败了。来自这些大型临床试验的数据指出，简单地限制增殖应答不足以预防内膜增生(Mann等人，1999；Alexander等人，2005)。因此，对于成功预防静脉移植的失败而言，需要靶向的是增殖以外的其他机制。
采集期间对静脉移植物的损伤引起血管痉挛和内膜增生，其导致移植物阻塞。因此，鉴定出防止在采集期间对移植物的损伤以及后续内膜增生的新的外科方法和治疗剂将是非常有益的。
发明内容
因此，根据本发明，提供在移植之前处理静脉外植体的方法，其包括(a)提供静脉外植体；(b)将所述静脉外植体在包含P2X7受体拮抗剂的pH7.0至pH7.6的缓冲溶液中进行稳定化，以产生稳定化静脉外植体；以及(c)保持所述稳定化静脉外植体的功能活力。所述方法还可恢复在步骤(b)之前无活力的静脉外植体的功能活力。本文将平滑肌的功能活力(functional viability)定义为应答于去极化或激动剂而收缩的能力。对内皮细胞而言，活力定义为预收缩的血管应答于乙酰胆碱而舒张的能力。另外，所述缓冲溶液可进一步包含肝素。所述P2X7受体拮抗剂可以是羊毛罂红/蓝染料#1(erioglaucine/Blue Dye#1)或亮蓝G(brilliant blue G)，或者它们的组合。所述缓冲溶液还可进一步包含磷酸盐缓冲液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸盐或勃脉力(Plasmalyte)。所述pH可以是7.35至7.45，或者7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。
另外，所述缓冲溶液可进一步包含硫酸镁或汉克斯(Hanks’)平衡盐溶液。
另外，所述缓冲溶液可进一步包含以下一种或更多种：抗收缩剂、抗氧化剂、寡糖、胶体剂(colloid agent)、抗炎剂、内皮功能保存剂(endothelialfunction preservative)、代谢调节剂、水凝胶、热休克蛋白27(HSP27)抑制剂、HSP20调节剂和/或MAPKAP激酶2抑制剂。
进一步，所述抗收缩剂可以是以下至少一种：磷酸二酯酶抑制剂(例如，罂粟碱(papaverine)、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、乌地那非(udenafil)、阿伐那非西络他唑(avanafilcilistizol)、己酮可可碱(pentoxifylline)、双嘧达莫(dipyridamole)，或其组合)、钙通道阻断剂(例如，氨氯地平(amlodipine)、阿雷地平(aranidipine)、阿折地平(azelnidipine)、巴尼地平(barnidipine)、西尼地平(cilnidipine)、氯维地平(clevidipine)、依福地平(efonidipine)、非洛地平(felodipine)、拉西地平(lacidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、马尼地平(mandipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(netrendipine)、普拉地平(prandipine)，或其组合)、一氧化氮供体(例如，硝普钠(sodium nitroprusside)、硝酸甘油(nitroglycerin)，或其组合)或者环核苷酸类似物(双丁酰cAMP(dibutyryl cAMP)、双丁酰cGMP(dibutyryl cGMP)或其组合)，或其组合。
进一步，所述抗氧化剂可以是例如N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗坏血酸、生育酚、生育三烯酚(tocotrienol)或绿茶酚或其组合。
进一步，所述寡糖可以是例如乳糖酸(lactobionic acid)、棉子糖或海藻糖或其组合。
进一步，所述胶体剂可以是例如羟乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白或其组合。
进一步，所述抗炎剂可以是例如皮质甾类(例如，地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)或其组合)或者非甾类抗炎剂(例如，阿司匹林、布洛芬(ibuprophen)、萘普生水杨酸(naproxen salicylic acid)或其组合)、MAPKAP激酶2抑制剂、抗-TNF-α、抗-IL-1-β、Cox-2抑制剂，或其组合。
另外，所述内皮功能保存剂可以是例如血管紧张素转换酶抑制剂(例如，依那普利(enalapril)、雷米普利(ramipril)、喹那普利(quinapril)、培哚普利(perindopril)、赖诺普利(lisinopril)、内那普利(benazepril)、福辛普利(monopril)或其组合)、血管紧张素受体抑制剂(例如氯沙坦(losartan))、抑制素(statin)(例如阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗素伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)或其组合)、二甲双胍(metformin)、氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸(aminoimidazolecarboxamide ribonucleotide，AICAR)或雌激素(例如，雌三醇(estriol)、雌二醇(estradiol)、雌酮(estrone)、17β-雌二醇或其组合)。
另外，所述代谢调节剂可以是例如葡萄糖、腺苷胰淀素(adenosineamylin)、降钙素相关基因肽(calcitonin related gene peptide)、胰岛素，或其组合。
另外，所述水凝胶可包括例如天然多糖如藻酸盐(alginate)、葡聚糖、壳聚糖和糖胺聚糖；或亲水性聚合物如聚乙二醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚羟基丁酸或聚(n-异丙基丙烯酰胺)。
进一步，所述HSP27抑制剂可以是例如抑制HSP27表达的siRNA或miRNA，增强HSP20表达的抗-miRNA，或其组合。
另外，所述MAPKAP激酶2抑制剂可以是例如肽抑制剂。
所述外植体可用不基于醇的标记物进行标记，例如但不限于羊毛罂红/蓝染料#1、靛蓝(indigotine)、诱惑红AC(Allura Red AC)或亮蓝G。
所述方法可进一步包括冲洗所述静脉外植体的管腔以使内部冲洗压不超过200mm Hg，或不超过150mm Hg。
在另一个实施方案中，本发明提供静脉移植试剂盒，其包含(a)含有P2X7受体拮抗剂的组织标记笔；以及(b)生理缓冲溶液或用于制备它的试剂。另外，所述试剂盒可进一步包含适于浸浴静脉外植体的容器。另外，所述试剂盒可进一步包含以下中的一种或更多种：肝素、抗收缩剂、抗氧化剂、寡糖、胶体剂、抗炎剂、内皮功能保存剂、代谢调节剂、水凝胶、热休克蛋白抑制剂、硫酸镁和/或MAPKAP激酶2抑制剂。
所述缓冲溶液可包含例如磷酸盐缓冲液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸盐或勃脉力。所述缓冲溶液可以是pH7.0至pH7.6，或者pH7.35至pH7.45。所述P2X7受体拮抗剂可以包含例如羊毛罂红/蓝染料#1、诱惑红AC、亮蓝G，或其任何组合。
所述试剂盒可进一步包含用于冲洗所述静脉外植体的管腔的设备；所述设备设计成防止所述静脉外植体内部的冲洗压大于200mm Hg，或大于150mm Hg。所述设备可包含注射器和/或导管和压力安全阀(pop-offvalve)。另外，所述注射器或导管可包含子弹状尖端，所述子弹状尖端包含用于引入所述静脉外植体近端的管腔。另外，所述试剂盒还进一步包含设计成把持所述静脉外植体的夹具。
本发明还提供用于冲洗所述静脉外植体管腔的设备；所述设备设计成防止所述静脉外植体内部的冲洗压大于200mm Hg，或大于150mm Hg。所述设备可包含注射器和/或导管和压力安全阀。所述注射器或导管可包含子弹状尖端，所述子弹状尖端包含用于引入所述静脉外植体远端的管腔。此外，所述设备还可包含用于引入所述静脉外植体近端的无管腔的子弹状塞。另外，所述设备还可包含设计成把持所述静脉外植体的夹具。
另一个实施方案包含pH7.0至pH7.6的缓冲溶液，其中所述缓冲溶液进一步包含肝素和P2X7受体拮抗剂。所述P2X7受体拮抗剂可以是例如羊毛罂红/蓝染料#1或亮蓝G或其组合。另外，所述缓冲溶液可进一步包含肝素，连同羊毛罂红/蓝染料#1、亮蓝G中一种或更多种，或其两者。进一步，所述缓冲溶液可包含磷酸盐缓冲液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸盐或勃脉力。进一步，所述pH可以是7.35至7.45，或者7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。
另外，所述缓冲溶液可进一步包含硫酸镁或汉克斯平衡盐溶液。
另外，所述缓冲溶液可进一步包含以下一种或更多种：抗收缩剂、抗氧化剂、寡糖、胶体剂、抗炎剂、内皮功能保存剂、代谢调节剂、水凝胶、热休克蛋白27(HSP27)抑制剂、HSP20调节剂、MAPKAP激酶2抑制剂，和/或其组合。
进一步，所述抗收缩剂可以是磷酸二酯酶抑制剂(例如，罂粟碱、西地那非、他达拉非、伐地那非、乌地那非、阿伐那非西络他唑、己酮可可碱、双嘧达莫，或其组合)、钙通道阻断剂(例如，氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平)、一氧化氮供体(例如，硝普钠、硝酸甘油，或其组合)或者环核苷酸类似物(例如，双丁酰cAMP、双丁酰cGMP，或其组合)。
进一步，所述抗氧化剂可以是例如N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗坏血酸、生育酚、生育三烯酚或绿茶酚，或其组合。
所述寡糖可以是例如乳糖酸、棉子糖、海藻糖，或其组合。
所述胶体剂可以是例如羟乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白，或其组合。
所述抗炎剂可以是例如皮质甾类(例如，地塞米松、氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙，或其组合)、非甾类抗炎剂(例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生水杨酸，或其组合)、MAPKAP激酶2抑制剂、抗-TNF-α、抗-IL-1-β、Cox-2抑制剂，或其组合。
此外，所述内皮功能保存剂可以是血管紧张素转换酶抑制剂(例如，依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、内那普利、福辛普利，或其组合)、血管紧张素受体抑制剂(例如，氯沙坦)、抑制素(例如，阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗素伐他汀、辛伐他汀，或其组合)、二甲双胍、雌激素(例如，雌三醇、雌二醇、雌酮、17β-雌二醇，或其组合)，或其组合。
进一步，所述代谢调节剂可以是例如葡萄糖、腺苷胰淀素、降钙素相关基因肽、胰岛素，或其组合。
另外，所述水凝胶可以包含天然多糖如藻酸盐、葡聚糖、壳聚糖和糖胺聚糖；或亲水性聚合物，如聚乙二醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚羟基丁酸或聚(n-异丙基丙烯酰胺)。
进一步，所述HSP27抑制剂可以是，例如抑制HSP27表达的siRNA或miRNA，增强HSP20表达的抗-miRNA，或其组合。
所述MAPKAP激酶2抑制剂可以是，例如肽抑制剂。
因此，本发明组合物具有广泛的用途，其包括通过提供无菌医疗设备以及表面杀菌和去污染(decontamination)而在保健中的用途。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，其用于进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或更多幅并与本文所述具体实施方案相结合，可以更好地理解本发明。
图1示出人隐静脉中可变的平滑肌功能活力。
图2A至B示出现有外科采集技术引起平滑肌功能活力的降低。
图3显示现有外科采集技术引起内皮功能活力的降低。
图4A至B示出现有外科采集技术降低了人隐静脉的内皮非依赖性舒张。
图5显示，具有蓝色标记的人隐静脉移植物显示出平滑肌功能活力的降低。
图6显示，外科皮肤标记降低了人隐静脉平滑肌活力。
图7示出，外科皮肤标记笔降低了猪隐静脉的活力。
图8示出，人隐静脉中功能性应答(对KCl有收缩应答)与细胞活力具有相关性。
图9A至B显示，在猪隐静脉中，羊毛罂红在拉伸性损伤后恢复了功能活力。
图10示出在猪的隐静脉中诱惑红没有恢复拉伸诱导的损伤。
图11证明在人隐静脉中羊毛罂红恢复了平滑肌活力。
图12A至C示出在隐静脉中羊毛罂红阻断了BzATP诱导的收缩。
图13证明羊毛罂红降低了器官培养模型中的人隐静脉中的内膜厚度。
图14示出在扩张的猪隐静脉中羊毛罂红降低了内膜层增厚。
图15显示，外科手术准备过程中的操作损害了人隐静脉的内皮依赖性舒张。
图16示出压力释放(压力安全)阀限制了人工扩张期间人隐静脉中的压力。
图17示出用压力释放阀进行的人工扩张防止了猪隐静脉中内皮功能的丧失。
图18A至B示出，用罂粟碱进行的预孵育抑制了猪冠状动脉中组胺和KCl诱导的舒张。
图19A至B示出，用罂粟碱进行的预孵育抑制了人隐静脉中去甲肾上腺素诱导的舒张。
图20示出静脉采集设备试剂盒。
具体实施方式
因此，本发明提供用于采集、处理、保存以及移植自体管道并抑制内膜增生的新方法和试剂。用于在植入前保存自体静脉管道的溶液(包括肝素化盐溶液)的pH是高酸性的(pH6.2)。这种酸性pH已显示降低所述管道的功能。另外，用于标记所述自体管道的包含异丙醇的外科皮肤标记物的使用也降低所述管道的功能。羊毛罂红(也被称为FD&C蓝染料#1)对静脉无毒并且在损伤后恢复功能完整性。还显示常见的静脉人工扩张能导致管腔内压大于300mm Hg，这对管道功能也具有有害的效果。将压力安全阀置于注射器上，这将可能的最高管腔内压降低到130mm Hg至140mm Hg，从而保护所述静脉管道。
I.采集溶液
在一个方面中，本发明提供pH7.0至pH7.6的缓冲溶液，用于在采集后放置静脉。在一个实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液；但是，MOPS、Hepes、Pipes和醋酸盐也是备选的制剂。还可将硫酸镁(5mM)加入所述溶液以稳定膜。
另一个缓冲液选择是勃脉力(Plasma-Lyte)56注射液(多电解质注射液，1型，USP)，这是一种用于静脉施用的单剂量容器中的无菌、无热原的低渗溶液。每100mL包含234mg氯化钠，USP(NaCl)；128mg醋酸钾，USP(C2H3KO2)；以及32mg四水醋酸镁(Mg(C2H3O2)2·4H2O)。其不包含抗微生物剂。pH用盐酸调节。
在本发明的另一个方面中，所述采集溶液能够作为高粘度溶液制备，如Seal & Panitch(2003)中所述。这些作者描述了，基于肝素结合肽与肝素之间的相互作用而开发了具有基于亲和性的控制释放特性的快速形成的聚合物基质。由聚乙二醇-co-肽(约18,000g/mol)和肝素(约18,000g/mol)以3∶1摩尔比组成的10％(w/v)组合物的动态机械测试显示出与浓缩的大分子量聚合物溶液和熔体(melt)相似的粘弹性谱。另外，所述生物聚合物混合物在热变性和机械损伤后迅速恢复。这些凝胶样材料能够隔离外源性肝素结合肽并且能够以依赖于相对肝素亲和力的速率在数天中释放这些肽。最初的释放速率为每小时3.3％(对于具有低肝素亲和力的肽)到每小时0.025％(对具有强肝素亲和力的肽)。通过改变肽对肝素的亲和力，能够开发一系列的肽以获得可用于在体内可控递送治疗剂的一系列释放谱。
II.补充性溶液添加剂
在本发明的另一个方面中，本发明的溶液可包含另外的添加剂以解决本发明要保护的各个方面。
例如，本发明的溶液可包含肝素(1U/ml至10U/ml)以预防血栓形成。肝素是广泛用作可注射抗凝剂的高度硫酸化的糖胺聚糖，并且具有任何已知生物分子中最高的负电荷密度。其还可用于在各种实验和医疗设备上(如试管和肾透析机)形成内部抗凝剂表面。药物级的肝素源自屠宰的肉用动物的粘膜组织(如猪的肠或牛的肺)。
尽管在医学中主要用于抗凝，但肝素在体内真正的生理作用仍然不清楚，因为血液抗凝主要通过内皮细胞衍生的硫酸类肝素蛋白多糖来实现。肝素通常贮存于肥大细胞的分泌颗粒中并且仅释放到组织损伤部位的血管。有人提出肝素的主要目的是在组织损伤部位对抗入侵的细菌和其它异物的防御机制，而不是抗凝。另外，其保留在许多极为不同的物种中，包括没有相似的血液凝固系统的一些无脊椎动物。
天然肝素是分子量从3kDa至50kDa的聚合物，但是大多数市售肝素制品的平均分子量为12kDa至15kDa。肝素是碳水化合物(定义为具有经验式Cm(H2O)n的有机化合物；也就是说只由碳、氢和氧组成，并且氢∶氧的原子比为2∶1)的糖胺聚糖家族的成员。糖胺聚糖(GAG)或粘多糖是长非支链多糖，由重复的二糖单元组成。所述重复的单元由与氨基己糖(包含氮的六碳糖)相连的己糖(六碳糖)或己糖醛酸组成。
肝素(包括密切相关的分子硫酸类肝素)由不同硫酸化程度的重复二糖单元组成。肝素中主要的二糖单元如下。最常见的二糖单元包含2-O-硫酸艾杜糖醛酸和6-O-硫酸化的N-硫酸葡萄糖胺，IdoA(2S)-GlcNS(6S)。例如，这构成了牛肺中肝素的85％以及猪肠粘膜中肝素的约75％。下文没有示出包含3-O硫酸葡萄糖胺(GlcNS(3S，6S))或游离氨基(GlcNH3 +)的罕见的二糖。在生理条件下，所述酯和酰胺硫酸基团去质子化并吸引带正电荷的反离子以形成肝素盐。肝素通常以这种形式作为抗凝剂施用。
在另一个方面中，所述采集溶液可以是覆盖所述血管以使体积最小化而同时保持所述血管湿润的水凝胶。另外，所述水凝胶可包含治疗剂以帮助维持血管舒张。水凝胶包括合成自通过共价键交联的亲水性聚合物的那些，如聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚富马酸、聚(N-异丙基丙烯酰胺)等，或者是通过物理相互作用(包括疏水的和离子的)而交联的任何凝胶样材料。凝胶包括聚氨酯、琼脂糖和藻酸盐。
在本发明的另一个方面中，本发明包括罂粟碱(1mM)以抑制静脉的收缩和痉挛。其他的抗痉挛剂是尼卡地平、硝普钠、硝酸甘油(0.5mM至1.0mM)或双丁酰cAMP(2mM)。
在本发明的另一个方面中，本发明包括抗氧化剂以预防所述静脉的氧化性损伤。N-乙酰半胱氨酸(10mM)、别嘌呤醇(1mM)、谷胱甘肽(3mM)、甘露醇(30mM至60mM)或绿茶酚(0.5mg/ml至1.0mg/ml)是具体的目标抗氧化剂。
在另一个方面中，本发明在所述采集溶液中提供寡糖以防止所述移植物干燥。乳糖酸(100mM)、棉子糖(30mM)或海藻糖(30mM)是具体的寡糖。乳糖酸是二糖，其提供渗透性支持并防止细胞肿胀。棉子糖是三糖，其提供高渗性。海藻糖是具有保水特性的二糖。
在另一个方面中，本发明在所述采集溶液中提供淀粉以支持胶体渗透压。羟乙基淀粉(30mM至50mM)、葡聚糖(40g/l)、血液或白蛋白是具体考虑的胶体剂。
在本发明的另一个方面中，本发明包括抗炎剂。类固醇如地塞米松(5mg/l至10mg/l)或水杨酸是抗炎剂的例子。
在本发明的另一个方面中，将包括药物以预防内皮功能障碍。血管紧张素转换酶抑制剂、抑制素、二甲双胍、AICAR和雌激素是这类药物的例子。
在本发明的另一个方面中，本发明包括代谢调节剂。葡萄糖(200mM)、腺苷(5mM)和胰岛素(100U/ml)是具体考虑的代谢调节剂。
在本发明的另一个方面中，本发明包括新的MAPKAP激酶2(和相关肽)肽抑制剂以降低炎症、增强平滑肌舒张并且预防痉挛。PCT申请US2007/16246和US2008/72525描述了这种抑制剂，其通过引用并入本文中。
在本发明的另一个方面中，本发明包括siRNA或miRNA以降低HSP27的表达从而预防内膜增生。有义链siRNA序列是1)GACCAAGGAUGGCGUGGUGUU(SEQ ID NO：1)和2)AUACACGCUGCCCCCCGGUUU(SEQ ID NO：2)。有义链miRNA序列是1)miR-580或miR-1300，AACUCUUACUACUUAGUAAUCC(SEQ IDNO：3)和2)miR-552，UUGUCCACUGACCAAUCUGUU(SEQ ID NO：4)。抗miR-320序列是：UCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU。所述siRNA和miRNA的表达是基于质粒或合成。所述DNA或合成的寡聚双螺旋的递送可通过可逆透化或加压而进行(Monahan等人，2009)。
III.P2X7受体拮抗剂
损伤引起能够活化ATP受体的ATP的延长释放(Khakh & North，2006)。P2X受体是与细胞外ATP结合的配体门控离子通道家族。P2X7受体负责巨噬细胞的ATP依赖性裂解，并且也发现于人隐静脉平滑肌(Cario-Toumaniantz等人，1998)。P2X7受体的活化能够在人隐静脉中形成能透过大分子的膜孔(Cario-Toumaniantz等人，1998)。这引起能够活化胱天蛋白酶(caspases)并且最终由于自身溶解和凋亡而引起细胞死亡的细胞内Ca2+的增加(Donnelly-Roberts等人，2004)。P2X7受体的活化与p38 MAPK途径的活化以及肌动蛋白细胞骨架的改变相关(Pfeiffer等人，2004)。P2X7受体的活化还引起促进炎性应答的白细胞介素和其它细胞因子的产生和释放(Donnelly-Roberts等人，2004)。近来，已显示P2X7受体拮抗剂的全身性施用在拉伸诱导脊椎损伤的啮齿动物模型中改善了恢复(Peng等人，2009)。
多种P2X7受体拮抗剂在文献中已有描述。例如，Alcaraz等人(2003)描述了一系列有效的P2X7受体拮抗剂的合成和药理学评价。所述化合物在THP-1细胞中抑制BzATP介导的孔形成。P2X7受体在炎性细胞(最尤其是巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞)中的分布提示，P2X7拮抗剂在炎性疾病的治疗中具有显著的作用。Carroll等人(2009)综述了不同化学类别的强效且高选择性的P2X7受体拮抗剂。
通过引用合并到本文中的下述美国专利公开了P2X7受体拮抗剂：7,709,469、6,812,226、7,741,493、7,718,693和7,326,792。通过引用合并到本文中的下述的美国专利申请公开了P2X7受体拮抗剂：2010/0292295、2010/0292224、2010/0286390、2010/0210705、2010/0168171、2010/0160389、2010/0160388、2010/0160387、2010/0160384、2010/0160373、2010/0144829、2010/0144727、2010/0105068、2010/0075968、2010/0056595、2010/0036101、2009/0264501、2009/0215727、2009/0197928、2009/0149524、2009/0005330、2008/0132550、2008/0009541、2007/0122849、2007/0082930、2005/0054013、2005/0026916和2002/0182646。
如上述讨论的，本发明的一个方面包括用于标记静脉的含有无毒染料的标记物。由FDA(E#133)批准的人造食用染料FD&C蓝#1(羊毛罂红)也已显示出不仅是无毒的，而且对损害隐静脉的采集技术而言是保护性的，并且是P2X7受体拮抗剂。类似羊毛罂红的亮蓝G也认为是P2X7受体拮抗剂。
靛蓝(E132)是被FDA批准的另一深蓝色人造染料。固绿(FastGreen)(E143)是被FDA批准的另一个蓝绿色人造染料。天然染料如姜黄素(curcurmin)或甜菜苷(betanin)是另外的备选方案。姜黄素是姜黄这种香料中的主要类姜黄色素(curcuminoid)，具有抗氧化和抗炎的特性。作为食品添加剂，其E编号是E100。甜菜苷是得自甜菜的红色糖苷类食用染料，并且是天然食用染料。其它可能的染料包括染料木素蓝(genestein blue)、伊文思蓝(evans blue)、印度墨(india ink)、诱惑红AC、酒石黄(Tartazine)和赤藓红(Erythrosine)。
IV.设备
下述讨论的初步研究证明，目前使用的采集技术对隐静脉有害。这些数据提出关于静脉移植物衰竭的新思考模式，并且提供简单直接的方法来缓解静脉移植物的损伤。
因此，在本发明的另一个方面中，本发明包括“压力安全”阀以防止静脉在分支结扎过程中过度扩张。科西纳(Qosina)压力释放T阀(部件号D002501)是一个例子。在本发明的另一个方面中，本发明包括用于紧固静脉的“子弹形尖端”的针状物以及用于防止静脉拉伸的设备。
V.试剂盒
本发明的实施方案还可体现为与外科静脉移植方法结合使用的试剂盒。免疫检测试剂盒将在合适的容纳设备中包含各种容器、设备和/或试剂，并连同适当的使用说明书。
在某些实施方案中，所述试剂盒将包含采集溶液，或用于制备它的试剂。所述溶液或试剂将以无菌形式提供，任选地与用于混合并保存采集溶液的无菌容器一起提供。所述试剂盒还可有利地包含室，其用于在外植后以及移植前浸浴/保存移植组织。所述试剂盒还可包括上述各种其它补充性添加剂。
如上所述，所述试剂盒的另一个要素可以是包含上述无毒染料/标记物的外科记号笔。所述笔可用标记物/染料“预先填装”，或者可以空的形式提供，由用户将以溶液或试剂形式的标记物/染料填装到所述笔中。
另外，试剂盒包括设备，包括上述注射器、导管和/或者装有或包含压力安全阀的管。包括的设备还可以是用于固定把持静脉的设备，如夹具，任选地具有支架或基座，允许“不沾手”地定位所述植入物用于进一步处理。
所述试剂盒的容器方面将通常包括用于以安全和保护性的方式存放至少一个瓶、试管、烧瓶、瓶子、包、注射器、导管或其它容器的装置，例如紧密包装用于销售。这样的装置可包括其中装有期望的容器、设备或试剂的注塑或吹塑的塑料容器。
VI.实施例
包括下述实施例以展示本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员会认识到，以下实施例中所公开的技术代表了本发明人发现在本发明实践中很好地发挥功能的技术，因此可认为是构成其实践的优选模式。但是，根据本文公开内容，本领域技术人员会认识到，可在公开的具体实施方案中做出许多改变，而仍然得到不脱离本发明构思和范围的相同或相似的结果。
实施例1——外科标记笔对静脉组织的毒性
在由范德堡大学机构审查委员会(Institutional Review Board of theVanderbilt University)(Nashville，TN)批准的知情同意后，从进行冠状动脉旁路术或外周血管旁路手术的患者中收集人隐静脉的无标记的丢弃区段(n＝66)。将静脉贮存于盐溶液中直到外科手术结束，这时将其置于冷的移植物采集缓冲液中(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mMMgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)并贮存于4℃。在采集24小时内测试血管。对每个HSV评价蓝色标记的存在情况。从分离的无脂肪和结缔组织的的隐静脉部分切下1.0mm宽的环，剥离内皮并悬于包含碳酸氢盐缓冲液(120mM NaCl、4.7mM KCl、1.0mM MgSO4、1.0mM NaH2PO4、10mM葡萄糖、1.5mM CaCl2和25mM Na2HCO3，pH7.4)的肌肉槽(muscle bath)中，于37℃用95％ O2/5％ CO2充气。将该环人工拉伸至4g张力，并维持在获得的1g静止张力并平衡～2小时。使用与Powerlab数据采集系统(Powerlab data acquisition system)和Chart软件(AD Instruments，Colorado Springs，CO)接口的罗德诺提玻璃技术公司(Radnoti GlassTechnology)(Monrovia，CA)的力传感器(159901A)获得力测量。为了确定活力，用110mM KCl使环收缩(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)，并测量产生的力。将力转化为应力([牛顿(N)/m2]＝力(g)×0.0987/面积，其中面积等于湿重[mg/长度(以最大长度的mm数)]除以1.055)105N/m2。静脉的功能活力中存在变异性(图1)。产生≤0.025×105N/m2应力的静脉被认为是无活力的(灰色)，产生＞0.025×105N/m2应力的那些是有活力的(黑色)。所测试静脉的40％是无活力的。每个点代表不同的患者以及来自该患者的至少三个单独的环的集合。
在对静脉进行移植到动脉循环的准备之前(未操作的，UM)以及外科准备之后(操作之后，AM)收集人隐静脉的区段(n＝8)。所述准备包括对静脉进行人工扩张，用外科皮肤标记物标记以及将静脉置于肝素化盐溶液中。测定对110mM KCl(图2A)或去氧肾上腺素(10-6M，图2B)的收缩应答，并将产生的力转化为应力(105N/m2)。静脉准备期间的操作导致对KCl和去氧肾上腺素收缩应答的降低(图2A至B)。每个点代表不同的患者以及来自每个患者的至少三个单独的环的应答的集合。
人隐静脉还用去氧肾上腺素(10-6M)预收缩，然后用卡巴胆碱(carbachol)(5×10-7M)处理以测定内皮依赖性舒张(Furchgott等人，1980)。在对静脉进行移植到动脉循环的准备之前(未操作的，UM)和外科准备之后(操作后，AM)收集人隐静脉的区段(n＝5)。将来自每个区段的环悬浮于肌肉槽中，用碳酸氢盐缓冲液平衡并且用110mM KCl收缩。用碳酸氢盐缓冲液中再平衡30分钟后，将环用10-6M的去氧肾上腺素(PE)收缩并且用5×10-7M的卡巴胆碱处理。测量力并转化为应力105N/m2。应答表示为最大PE诱导收缩的％。外科准备期间的典型操作引起内皮依赖性舒张的降低(图3)。UM静脉具有(28.74±3.542)％的内皮依赖性舒张，而AM应答于卡巴胆碱而收缩((-5.976±0.9172)％)，。
人隐静脉还用去氧肾上腺素(10-6M)预收缩，然后用硝普钠(10-7M)处理以测定内皮非依赖性舒张。在采集准备之前(未操作的，UM)或采集准备之后(操作后，AM)收集隐静脉的区段(n＝6)。将来自每个区段的环悬浮于肌肉槽中，在碳酸氢盐缓冲液中平衡并且用110mM KCl收缩。用碳酸氢盐缓冲液再平衡30分钟之后，将环用10-6M去氧肾上腺素(PE)预收缩并且用10-7M的硝普钠处理。外科准备期间的典型操作降低了人隐静脉的内皮非依赖性舒张(图4A至B)。收集自同一患者的UM和AM区段应答于PE和SNP的代表性力追踪(图4A)。两组所显示的内皮非依赖性舒张(表示为最大PE诱导收缩的％)显著不同。UM静脉显示(86.62+/-5.986)％的舒张，而AM静脉显示(4.292+/-1.397)％的舒张(图4B)。
在收集自进行冠状动脉旁路术或外周血管血运重建手术之患者的38个静脉中，16个静脉没有任何可见的外科标记笔颜色，而22个静脉有可见的颜色。从静脉上切下环，悬浮于肌肉槽中并在碳酸氢盐缓冲液中平衡。将环用110mM KCl收缩并且将产生的力转化为应力(105N/m2)。两组静脉产生的力显著不同(图5)。具有可见蓝色标记的静脉((0.047±0.014)105N/m2)比没有可见标记的静脉((0.174±0.023)105N/m2)展现出更低的收缩应答。
将没有任何颜色的人隐静脉的无标记丢弃部分用于测试不同标记方法的效果。将切自该部分的环不进行标记(对照；n＝12)、用外科皮肤标记物标记(Cardinal Health，#5227紫色标记墨水；n＝5)、用50％异丙醇(一种用于皮肤标记物的溶剂(n＝4))标记或用亚甲基蓝(Akorn，Inc.，Lake Forest IL；n＝10)标记，并且在室温下孵育15分钟。将环剥离内皮并悬浮于包含碳酸氢盐缓冲液(120mM NaCl、4.7mM KCl、1.0mMMgSO4、1.0mM NaH2PO4、10mM葡萄糖、1.5mM CaCl2和25mMNa2HCO3，pH 7.4)的肌肉槽中，于37℃用95％ O2/5％ CO2充气。将环人工拉伸至4g张力，并以静止的1g张力维持以及平衡～2小时。使用与Powerlab数据采集系统和Chart软件(AD Instruments，Colorado Springs，CO)接口的罗德诺提玻璃技术公司(Monrovia，CA)的力传感器(159901A)获得力测量。将环用110mM KCl收缩(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)，并且将产生的力转化为应力105N/m2。三个标记的组与未标记的对照组显著不同(p≤0.05)(图6)。没有标记的环具有(0.110±0.014)105N/m2的平均应力，用外科皮肤标记物标记的环具有(0.003±0.00110)105N/m2的平均应力，用50％异丙醇标记的环具有(0.005±0.003)105N/m2的平均应力，用亚甲基蓝标记的环具有(0.014±0.01)105N/m2的平均应力。
将新分离的猪隐静脉用于测试不同标记方法的效果。收集静脉并置于冷的移植物采集缓冲液[100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4]。将血管在4℃下贮存于移植物采集缓冲液中并在采集的24小时内测试。为了测试活力，从隐静脉区段中切下1.0mm宽的环并且剥离脂肪和结缔组织。将隐静脉环不处理(对照；n＝6)、用外科皮肤标记物(n＝3)或50％异丙醇(用于外科标记物的溶剂；n＝3)标记，并且在室温下孵育15分钟。之后将环在肌肉槽中平衡，用KCl收缩，测量力并转化为应力(105N/m2)。没有标记的环具有(0.263±0.039)N/m2的平均应力，用外科皮肤标记物标记的环具有(0.114±0.017)N/m2的平均应力，以及用50％异丙醇标记的环具有(0.00005±0.00005)N/m2的平均应力。两个标记组与对照未标记组显著不同(p≤0.05)。(图7)。
实施例2-活静脉细胞与功能活力有相关性
用活细胞测定来确定人隐静脉细胞的活力。在由范德堡大学机构审查委员会(Nashville，TN)批准的知情同意后，从进行冠状动脉旁路术或外周血管旁路手术的患者中收集人隐静脉的无标记丢弃区段(n＝13)。将静脉贮存于盐溶液直到外科手术结束，这是将其置于冷的移植物采集缓冲液中(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。将静脉在4℃下贮存于移植物采集缓冲液中并在采集的24小时内测试。用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)对每个静脉进行生理实验和活细胞测定。为了测试活力，从没有脂肪和结缔组织的隐静脉区段切下1.0mm宽的环，将一些剥离内皮并悬于包含碳酸氢盐缓冲液(120mM NaCl、4.7mM KCl、1.0mM MgSO4、1.0mM NaH2PO4、10mM葡萄糖、1.5mM CaCl2和25mM Na2HCO3，pH7.4)的肌肉槽中，于37℃用95％ O2/5％ CO2充气。将环人工拉伸至4g的张力，并且以获得的1g静止张力维持以及平衡～2小时。使用与Powerlab数据采集系统和Chart软件(AD Instruments，Colorado Springs，CO)接口的罗德诺提玻璃技术公司(Monrovia，CA)的力传感器(159901A)获得力测量。将环用110mM KCl(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)收缩，并且测量产生的力。对KCl未收缩的任何组织认为是无活力的。对于每个环将力转化为应力105N/m2并且对于每个静脉进行平均。为了评估细胞的活力，将来自每个静脉的3个环分别置于0.25ml的0.1％MTT溶液(用Dulbecco磷酸盐缓冲液pH7.4制备)。对于阴性对照，在置于0.1％MTT溶液之前，将一个环置于20ml水中并微波10分钟以灭活任何酶活性。将环于37℃孵育1小时。将该环置于蒸馏水中来终止反应。将组织称重并在37℃下置于1ml CelloSolve(Sigma)中4小时以提取每个的甲臜(formazan)色素。用分光光度计(Beckman Coulter)在570nm下测量色素浓度。从每个样品中减去阴性对照的吸光度。活力指数表示为OD570/mg/ml。对于3个环中计算每个静脉的平均值。然后用得自每个静脉的平均应力对平均活力指数作图。
数据表现出显著的倾斜，显示线粒体活力与应力活力(通过110mMKCl诱导的收缩来确定)之间有正比关系(R2＝0.7262)(图8)。插图中示出低(左)和高(右)活力指数的代表性HSV环。
实施例3-静脉采集溶液和程序
将新分离的猪隐静脉收集于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。将血管在采集的24小时内测试，并且在4℃贮存于移植物采集缓冲液中。将静脉剥离脂肪和结缔组织并切成2cm长的区段。将区段拉伸至2倍于其静止长度(拉伸的；n＝7)或者不操作(对照；n＝12)。拉伸后，将来自这两组的区段进一步分开。然后用棉拭子将羊毛罂红溶液(FCF，5％异丙醇和水中2.6mM)或赋形剂沿纵向线施加到未处理(FCF；n＝8)或拉伸(Stretched+FCF；n＝3)的静脉区段。将区段在勃脉力中于室温孵育15分钟并之后切成环。将环悬浮于包含碳酸氢盐缓冲液(120mM NaCl、4.7mM KCl、1.0mM MgSO4、1.0mM NaH2PO4、10mM葡萄糖、1.5mMCaCl2和25mM Na2HCO3，pH7.4)的肌肉槽中，在37℃通以95％O2/5％CO2。将环人工拉伸至4g张力，并以1g的静止张力维持并平衡～2小时。使用与Powerlab数据采集系统和Chart软件(AD Instruments，ColoradoSprings，CO)接口的罗德诺提玻璃技术公司(Monrovia，CA)的力传感器(159901A)获得力测量。将环用110mM KCl(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)收缩，然后将产生的力转化为应力105N/m2(图9)。对照环具有(0.47±0.034)N/m2的平均应力，用羊毛罂红染料标记的环具有(0.566±0.064)N/m2的平均应力，拉伸的环具有(0.367±0.042)N/m2的平均应力，具有羊毛罂红染料的拉伸的环具有(0.713±0.111)N/m2的平均应力。拉伸静脉的应力与对照非拉伸静脉显著(＊p＜0.05)不同，与没有羊毛罂红染料的拉伸相比，具有羊毛罂红染料的拉伸静脉显著(#p＜0.05)不同(图9)。
但是，在猪隐静脉拉伸性损伤后，用另一染料(诱惑红)处理没有恢复功能活力(图10)，将猪隐静脉(n＝4)不处理(对照)或拉伸至两倍于其静息长度(没有染料)，切成环并悬浮于肌肉槽中的碳酸氢盐缓冲液。来自拉伸部分的环与50μM诱惑红(+红)或与50μM羊毛罂红(+FCF)孵育30分钟。然后使环于碳酸氢盐缓冲液中平衡，之后用110mM KCl收缩。将产生的力转化为应力(105N/m2)。数据代表相对于对照环应答(设置为100％)的收缩。拉伸静脉的应力与具有诱惑红的拉伸静脉没有显著的不同(NS)。与具有诱惑红的拉伸静脉相比，羊毛罂红显著地恢复了拉伸静脉中的收缩应答(#p≤0.05)。
使用来自进行冠状动脉旁路术或外周血管旁路手术患者的人隐静脉的无标记丢弃区段来确定羊毛罂红对人隐静脉影响(n＝4)。将静脉贮存于盐溶液中直到外科手术结束，这时将其置于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。在4℃下贮存于移植物采集缓冲液中的血管在采集的24小时内测试。为了测试活力，从剥离脂肪和结缔组织的隐静脉上切下1.0mm宽的环，用羊毛罂红溶液(FCF，5％异丙醇和水中2.6mM)或赋形剂处理并且在室温下孵育30分钟。之后将组织剥离内皮并悬于包含碳酸氢盐缓冲液的肌肉槽中，在37℃下用95％ O2/5％ CO2充气。将环人工拉伸至4g的张力，以1g的静止张力维持并平衡～2小时。使用与Powerlab数据采集系统和Chart软件(AD Instruments，Colorado Springs，CO)接口的罗德诺提玻璃技术公司(Monrovia，CA)的力传感器(159901A)获得力测量。将环用110mM KCl(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)收缩，并且测量产生的力。将力转化为应力105N/m2，并且对赋形剂和羊毛罂红环作图。显示了未处理的(对照)或用羊毛罂红染料处理环的代表性追踪(图11A)。赋形剂环具有(0.015±0.012)N/m2的平均应力，羊毛罂红处理的环具有(0.103±0.021)N/m2的平均应力。这两组显著不同(p≤0.05)。
在采集后、外科操作之前从进行冠状动脉旁路或外周血管旁路手术的患者收集人隐静脉区段并保存于勃脉力中。血管在采集的2小时内测试。将新分离的猪隐静脉收集于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。将血管在采集的24小时内测试。从剥离脂肪和结缔组织的猪隐静脉(图12A，n＝2)和未操作的人隐静脉(图12B，n＝4)上切下1.0mm宽的环。之后将环剥离内皮并悬浮于包含碳酸氢盐缓冲液的肌肉槽中，于37℃通以95％ O2/5％ CO2。将该环人工拉伸至4g张力，以及以获得的1g的静止张力维持并平衡～2小时。使用与Powerlab数据采集系统和Chart软件(AD Instruments，Colorado Springs，CO)接口的罗德诺提玻璃技术公司(Monrovia，CA)的力传感器(159901A)获得力测量。将环用110mM KCl收缩。再平衡30分钟的之后，将环用羊毛罂红溶液(FCF，50μM至200μM，30分钟)或用赋形剂处理30分钟，之后用100μM BzATP收缩。测量力并转化为应力。应答表示为最大KCl收缩的％。用赋形剂(对照)或50μM羊毛罂红(FCF预处理)预处理之后用BzATP收缩的人隐静脉的代表性力跟踪示于图12C。用羊毛罂红(FCF)而不是赋形剂(对照)的预处理显著地抑制了BzATP诱导的收缩(＊p＜0.05)(图12B)。
在对静脉进行移植到动脉循环的准备之前(未操作，UM)和在外科准备之后(操作后，AM)，在勃脉力中从同一患者收集人隐静脉区段，并在采集的2小时内使用。将该区段切成～1mm的环，将来自每一组的一个环在福尔马林中固定(预培养)。在50μM羊毛罂红存在(FCF)或不存在(对照)的情况下，将其他环在补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和30％胎牛血清的RPMI培养基中在5％CO2下于37℃培养14天。14天后，将环以福尔马林固定，以5μm切片并用沃尔夫-冯吉尔森染剂(Verhoff Van Gieson stain)染色。用Axiovert 200捕获该环的光学显微图并且用AxioVision测量内膜厚度。数据代表内膜厚度与培养前环的基础内膜厚度(设置为0％)的增加％。误差线示出平均值的标准差。与对照相比，静脉准备期间的操作提高了内膜层的增厚(在配对t检验中#p＝0.053)，并且羊毛罂红处理显著地(＊p＜.05)抑制了内膜厚度的发展(图13)。
在无菌条件下通过非触碰法(no touch method)采集新鲜的猪隐静脉并贮存于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。血管在采集的24小时内使用。将静脉分成三部分：未处理的(未操作，n＝7)，扩张至＞300mm Hg的(扩张的，n＝8)，或在压力释放阀存在的情况下扩张的(过压释放，n＝7)。然后将每个区段切成～1mm的环，并将来自每种条件的一个环立即用福尔马林固定(预培养)。其他的环在5％CO2和37℃下，在不存在(对照)或存在50μM羊毛罂红(FCF)、50μM亮蓝G(BBG)或50μM诱惑红的情况下于补充1％L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和30％胎牛血清的RPMI培养基中培养14天。14天后，将环用福尔马林固定，以5μm切片并用沃尔夫-冯吉尔森染剂染色。用Axiovert 200捕获环的光学显微图并且用AxioVision测量内膜厚度。与扩张对照相比，羊毛罂红处理抑制了扩张诱导的内膜增厚的增强，诱惑红则不然(＊p＜.05)(图14)。
在对静脉进行移植到动脉循环的准备之前(未操作，UM；n＝5)和外科准备之后(操作后，AM；n＝5)获得人左乳内动脉(LIMA；n＝3)和隐静脉的环。将切自UM区段的环在威斯康星大学溶液(University ofWisconsin Solution)(UM)、肝素化盐溶液(HS)、肝素化勃脉力(HP)或包含30mM海藻糖的肝素化勃脉力(HPT)中于室温孵育2小时。环切自静脉、悬于肌肉槽中并在碳酸氢盐缓冲液中平衡。将环用10-6M去氧肾上腺素预收缩，之后用5×10-7M卡巴胆碱(carbachol)以测定内皮依赖性舒张。来自LIMA的环具有比隐静脉更大的内皮依赖性舒张(图15)。在外科准备期间的操作引起内皮依赖性舒张的减少(图15)。在肝素化盐溶液中的保存[＊p＜0.05，与所有UM组(UM、UW、HP&HPT)的HS相比]引起内皮依赖性舒张的减少，而肝素化勃脉力、肝素化勃脉力加上海藻糖或移植物采集溶液则不然(图15)。数据代表％舒张(与去氧肾上腺素诱导的最大收缩相比)。
在由范德堡大学机构审查委员会(Nashville，TN)批准的知情同意后，从进行冠状动脉旁路或外周血管旁路手术的患者中收集人隐静脉的无标记丢弃区段(n＝5)。将静脉贮存于盐溶液中直到外科手术结束，这时将其置于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)中。静脉在采集的24小时内测试并在4℃贮存于移植物采集缓冲液中。将压力安全阀一端连接注射器，另一端连接插管的隐静脉。隐静脉的远端也是插管的并连接到压力传感器。当在有或没有压力释放阀的情况下用手持注射器扩张该静脉时监测压力。压力监测器将不测量高于300mm Hg的压力。这产生了以下三组：过压释放压力(Popoff)、具有压力安全阀的最大压力(具有阀的最大的)以及没有压力安全阀的最大压力(没有阀的最大的)。具有压力安全阀的静脉具有(129±1.265)mm Hg的平均压力以及(141.8±1.985)mm Hg的最大压力，而没有压力安全阀的静脉具有(300±0.00)mm Hg的最大压力(图16)。具有压力安全阀的静脉中的平均和最大压力与没有压力安全阀的静脉显著不同(p≤0.05)。
在无菌条件下通过非触碰法采集新鲜的猪的隐静脉并贮存于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。该血管在采集的24小时内使用。在直列式压力释放阀(压力安全)缺乏(扩张)或存在的情况下用注射器人工扩张静脉(n＝4)。对照部分是非扩张的(ND)。扩张后，将环切自该部分并悬浮于肌槽。将该环用10-6M去氧肾上腺素预收缩，之后用5×10-7M卡巴胆碱处理以确定内皮依赖性舒张。数据表示为％舒张(与最大去氧肾上腺素诱导的收缩相比)。用手持注射器进行的人工扩张在内皮依赖性舒张中引起显著的降低(p＜0.0005)并且该压力释放阀预防这种内皮依赖性舒张的丧失(图17)。
从处死的猪新分离猪的冠状动脉，并直接置于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。将冠状动脉剥离脂肪和血管外膜组织并将内皮移除。切出横向环(1.0mm厚)并悬浮于肌肉槽，通过丝线3-0连接到与数据转换A-D面板(DataTranslation，MA)接口的力传感器(Kent Scientific，CT)。数据用PowerLab软件程序得到。将猪的冠状动脉环悬浮于肌肉槽并在克-林二氏碳酸氢盐缓冲液中平衡2小时。将该环拉伸并逐渐调节长度直到获得最大的张力。该环用110mM KCl(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)收缩，测量产生的力并转化为应力[牛顿(N)/m2]＝力(g)×0.0987/面积，其中面积等于湿重[mg/长度(最大长度的mm)]除以1.055。洗涤环并再平衡30分钟。将环用以下进行处理：5μM组胺、110mM KCl、1mM罂粟碱(PAP)、1mM罂粟碱处理10分钟然后用5μM组胺，或者1mM罂粟碱处理10分钟然后用110mM KCl，测量产生的力并将其转化为应力。用5μM组胺(Hist)、110mM KCl(KCl)、1mM罂粟碱(PAP)、1mM罂粟碱10分钟后用5μM组胺(Pap+Hist)或者1mM罂粟碱10分钟后用110mM KCl(Pap+KCl)处理的环的代表性力追踪示于图18A。将应力的减少转化为最大原始KCl收缩(设置为100％)的百分数。罂粟碱处理降低了环中的基底张力((-15.0±3.135)％)(图18B)。用罂粟碱预处理的环完全抑制了组胺(与98.613±11.049相比-12.0±4.163)和KCl(与(103.33±2.404)％相比-20.0±10.00)诱导的收缩(图18B)。
在由范德堡大学机构审查委员会(Nashville，TN)批准的知情同意后，从进行冠状动脉旁路或外周血管旁路手术的患者中收集人隐静脉的无标记丢弃区段(n＝6)。将静脉贮存于盐溶液直到外科手术结束这时将其置于冷的移植物采集缓冲液(100mM乳糖酸钾、25mM KH2PO4、5mMMgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇、50g/L羟乙基淀粉，pH7.4)。将静脉在采集的24小时内测试并在4℃贮存于移植物采集缓冲液中。将静脉除去脂肪和血管外膜组织并且将内皮移除。切出横向环(1.0mm厚)并悬浮于肌肉槽中，通过丝线3-0连接到与数据转换A-D面板接口的力传感器(Kent Scientific，CT)。将人隐静脉悬浮于肌肉槽并且在克-林二氏碳酸氢盐缓冲液中平衡2小时。将环拉伸并逐渐调节长度直到获得最大的张力。将环用110mM KCl(等摩尔替换碳酸氢盐缓冲液中的NaCl)收缩，测量产生的力并将其转化为应力[牛顿(N)/m2]＝力(g)×0.0987/面积，其中面积等于湿重[mg/长度(最大长度的mm)]除以1.055。洗涤环并再平衡30分钟。环用0.5μM去甲肾上腺素(NE)、1mM罂粟碱(PAP)处理，或用1mM罂粟碱处理10分钟后用0.5μM NE处理，测量产生的力并将其转化为应力。将应力的减少转化为最大原始KCl收缩(设置为100％)的百分数。用0.5μM NE(NE)、1mM罂粟碱(PAP)或者1mM罂粟碱处理10分钟后再用5μM NE处理的环的代表性力追踪示于图19A。将应力的减少转化为最大原始KCl收缩(设置为100％)的百分数。N＝6。罂粟碱处理降低了环的基底张力((-9.772.0±3.226)％)。用罂粟碱预处理人隐静脉完全抑制了NE(与(89.935±18.344)％相比的-3.210±5.119)诱导的收缩(图19B)。
静脉采集设备在图20中示出。对静脉(由于该静脉中的阀，该静脉是翻转的)的远端用子弹尖端的塑料导管(其具有用于冲洗的腔)进行插管，并用弹簧钳紧固在导管上。将导管夹在底座上。将另一个没有腔的子弹状尖端的导管连接至夹在该底座相对端的静脉近端。将该设备用棘轮打开直到该静脉具有与体内相同的长度。将具有延伸管和直列式压强释放阀的注射器连接该静脉的远端。现在该静脉能够扩张并分支结扎。
实施例4-预示性的临床方案
将使用标准外科技术通过外科手术采集大隐静脉。在静脉的远端将用子弹状尖端的静脉管进行插管，并用夹具或丝带固定。将压强释放阀与插管相连，阀的另一端连接10cc或20cc注射器。在一些情况下，注射器和阀之间置有延长管。用静脉采集溶液使静脉扩张，鉴别支流并用丝带或夹具结扎。用试剂盒中的标记物沿着一个长表面标记该静脉以维持该静脉的取向。在一些情况下，将静脉在从患者中移出之前标记。之后静脉将置于采集溶液中直到植入动脉循环。在一个实施方案中，笔中的染料将包含P2X7受体拮抗剂，而采集溶液将不包含P2X7受体拮抗剂。在另一个实施方案中，笔中的染料将不包含P2X7受体拮抗剂，但是溶液将含有。在第三个实施方案中，笔的染料和溶液都将含有P2X7受体拮抗剂。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
根据本公开内容，可以无需过度实验而实施和完成本文公开的和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管就一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员而言显而易见的是，可对本文所述组合物和/或方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序进行改变，而不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体的，显而易见的是，本文所述试剂可替换为在化学上和生理学上相关的某些试剂，而实现相同或相似的效果。对本领域技术人员而言显而易见的所有这些相似的替代和改变都认为在本发明的精神、范围和构思中，如由附加的权利要求书所限定的。
VII.参考文献
下述的参考文献通过引用具体地合并到本文中，其程度为对本文提供补充性的示例性程序或其它细节。
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Claims (57)

1.一种在移植之前处理静脉外植体的方法，其包括：
(a)提供静脉外植体；
(b)在包含P2X7受体拮抗剂的pH为pH7.0至pH7.6的缓冲溶液中对所述静脉外植体进行稳定化，以产生稳定化静脉外植体；以及
(c)保持所述稳定化静脉外植体的功能活力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法恢复在步骤(b)之前无活力的静脉外植体的功能活力。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲溶液还包含肝素。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述缓冲溶液包含(i)肝素和(ii)羊毛罂红/蓝染料#1和/或亮蓝G。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲溶液包含磷酸盐缓冲液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸盐或勃脉力。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述缓冲溶液还包含以下一种或更多种：抗收缩剂、抗氧化剂、寡糖、胶体剂、抗炎剂、内皮功能保存剂、代谢调节剂、水凝胶、热休克蛋白27(HSP27)抑制剂、HSP20调节剂和/或MAPKAP激酶2抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗收缩剂是磷酸二酯酶抑制剂、钙通道阻断剂、一氧化氮供体或环核苷酸类似物。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗坏血酸、生育酚、生育三烯酚或绿茶酚。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述寡糖是乳糖酸、棉子糖或海藻糖。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述胶体剂是羟乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗炎剂是皮质甾类、非甾类抗炎剂、mapkap激酶2抑制剂、抗TNF-α、抗IL-1-β或Cox-2抑制剂。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述内皮功能保存剂是血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体抑制剂、抑制素、二甲双胍或雌激素。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述代谢调节剂是葡萄糖、腺苷胰淀素、降钙素相关基因肽或胰岛素。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述水凝胶包含天然多糖，如藻酸盐、葡聚糖、壳聚糖和糖胺聚糖；或者亲水性聚合物，如聚乙二醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚羟基丁酸或聚(n-异丙基丙烯酰胺)。
15.根据权利要求6所述的方法，其中所述HSP27抑制剂是抑制HSP27表达的siRNA或miRNA。
16.根据权利要求6所述的方法，其中所述HSP20调节剂是增强HSP20表达的抗miRNA。
17.根据权利要求6所述的方法，其中所述MAPKAP激酶2抑制剂是肽抑制剂。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述外植体用不基于醇的标记物进行标记。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述P2X7受体拮抗剂是羊毛罂红/蓝染料#1或亮蓝G。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法恢复在稳定化步骤(b)之前无活力的静脉外植体的功能活力。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述稳定化静脉外植体的特征还在于，当在体外用KCl使其收缩时，其能够产生大于对照血管的收缩力。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述稳定化静脉外植体的特征还在于，使其扩张时，其能够承受小于200mm Hg的内部冲洗压。
23.根据权利要求22所述的方法，其中用所述缓冲溶液以小于200mm Hg的冲洗压冲洗所述稳定化静脉外植体的管腔。
24.一种静脉移植试剂盒，其包含：
(a)包含P2X7受体拮抗剂的组织标记笔；以及
(b)生理缓冲溶液或用于制备它的试剂。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其还包含适于浸浴静脉外植体的容器。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，其还包含以下一种或更多种：肝素、抗收缩剂、抗氧化剂、寡糖、胶体剂、抗炎剂、内皮功能保存剂、代谢调节剂、水凝胶、热休克蛋白抑制剂、硫酸镁和/或MAPKAP激酶2抑制剂。
27.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述缓冲溶液包含磷酸盐缓冲液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸盐或勃脉力。
28.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述缓冲溶液为pH7.0至pH7.6。
29.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述P2X7受体拮抗剂包含羊毛罂红/蓝染料#1或亮蓝G。
30.根据权利要求24所述的试剂盒，其还包含用于冲洗所述静脉外植体管腔的设备，所述设备设计成防止所述静脉外植体内的冲洗压大于200mm Hg。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述用于冲洗所述静脉外植体管腔的设备设计成防止所述静脉外植体内的冲洗压大于150mm Hg。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述设备包含注射器和/或导管和压力安全阀。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述注射器或导管包含子弹状尖端，所述子弹状尖端包含用于引入所述静脉外植体近端的管腔。
34.根据权利要求24所述的试剂盒，其还包含设计成把持所述静脉外植体的夹具。
35.一种用于冲洗静脉外植体的管腔的设备，所述设备设计成防止所述静脉外植体内的冲洗压大于200mm Hg。
36.根据权利要求35所述的设备，其中所述设备包含注射器和/或导管和压力安全阀。
37.根据权利要求36所述的设备，其中所述注射器或导管包含子弹状尖端，所述子弹状尖端包含用于引入所述静脉外植体远端的管腔。
38.根据权利要求36所述的设备，其还包含用于引入所述静脉外植体近端的无管腔的子弹状塞。
39.根据权利要求35所述的设备，其还包含设计成把持所述静脉外植体的夹具。
40.根据权利要求35所述的设备，其中所述设备设计成防止所述静脉外植体内的冲洗压大于150mm Hg。
41.一种pH7.0至pH7.6的缓冲溶液，其中所述缓冲溶液包含肝素和P2X7受体拮抗剂。
42.根据权利要求41所述的溶液，其中所述P2X7受体拮抗剂包含羊毛罂红/蓝染料#1或亮蓝G。
43.根据权利要求41所述的溶液，其中所述缓冲溶液包含磷酸盐缓冲液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸盐或勃脉力。
44.根据权利要求41所述的溶液，其中所述缓冲溶液还包含以下一种或更多种：抗收缩剂、抗氧化剂、寡糖、胶体剂、抗炎剂、内皮功能保存剂、代谢调节剂、水凝胶、热休克蛋白27(HSP27)抑制剂、HSP20调节剂和/或MAPKAP激酶2抑制剂。
45.根据权利要求44所述的溶液，其中所述抗收缩剂是磷酸二酯酶抑制剂、钙通道阻断剂、一氧化氮供体或环核苷酸类似物。
46.根据权利要求44所述的溶液，其中所述抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗坏血酸、生育酚、生育三烯酚或绿茶酚。
47.根据权利要求44所述的溶液，其中所述寡糖是乳糖酸、棉子糖或海藻糖。
48.根据权利要求44所述的溶液，其中所述胶体剂是羟乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白。
49.根据权利要求44所述的溶液，其中所述抗炎剂是皮质甾类、非甾类抗炎剂、mapkap激酶2抑制剂、抗TNF-α、抗IL-1-β或Cox-2抑制剂。
50.根据权利要求44所述的溶液，其中所述内皮功能保存剂是血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体抑制剂、抑制素、二甲双胍或雌激素。
51.根据权利要求44所述的溶液，其中所述代谢调节剂是葡萄糖、腺苷胰淀素、降钙素相关基因肽或胰岛素。
52.根据权利要求44所述的溶液，其中所述水凝胶包含天然多糖，如藻酸盐、葡聚糖、壳聚糖和糖胺聚糖；或亲水性聚合物，如聚乙二醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚羟基丁酸或聚(n-异丙基丙烯酰胺)。
53.根据权利要求44所述的溶液，其中所述HSP27抑制剂是抑制HSP27表达的siRNA或miRNA。
54.根据权利要求44所述的溶液，其中所述HSP20调节剂是增强HSP20表达的抗miRNA。
55.根据权利要求44所述的溶液，其中所述MAPKAP激酶2抑制剂是肽抑制剂。
56.根据权利要求41所述的溶液，其中所述pH是7.35至7.45。
57.根据权利要求41所述的溶液，其中所述pH是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。
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