ES2704657T3 - Focalización selectiva de la interacción CD40L/MAC-1 por inhibidores de péptidos pequeños y su uso para el tratamiento de inflamación y aterogénesis - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos CEQLKKSKTLC en donde el polipéptido no contiene más de 12 aminoácidos, caracterizado porque el polipéptido posee una estructura cíclica.

Description

DESCRIPCIÓN

Focalización selectiva de la interacción CD40L/Mac-1 por inhibidores de péptidos pequeños y su uso para el tratamiento de inflamación y aterogénesis.

La presente invención se refiere al ligando de CD40 (CD40L) que cumple una función en enfermedades asociadas con inflamación y aterogénesis. El ligando de CD40, también conocido como CD154 humano, es una proteína transmembrana de tipo II de 33 kDa y es miembro de la superfamilia de genes del factor de necrosis tumoral (TNF). Si bien CD40L se expresa preferencialmente en células T CD4+ activadas y plaquetas activadas, también se halla en otras células hematopoyéticas y no hematopoyéticas tales como las células epiteliales y endoteliales.

En un modo similar a todos los otros miembros de la familia de TNF, el CD40L unido a membrana existe en una forma trimérica, que es esencial para la actividad biológica plena de la molécula. El CD40L soluble aparece principalmente como monómero en la sangre pero se suele trimerizar en concentraciones superiores. El CD40L se identificó inicialmente como ligando de CD40, pero más recientemente se han descrito receptores adicionales de CD40, a saber las integrinas aIIbp3, a5p1 y Mac-1.

El antígeno de macrófagos 1 (Mac-1) también se conoce como integrina aM (ITGAM) que es una subunidad de proteína que forma la molécula de integrina heterodinámica aMp-2 (aMp²). aMp² se expresa en la superficie de muchos leucocitos implicados en el sistema inmune innato, incluidos monocitos, granulocitos, macrófagos y linfocitos citolíticos naturales. Media la inflamación regulando la adhesión de leucocitos, y la migración ha estado implicada en varios procesos inmunes tales como fagocitosis, citotoxicidad mediada por las células, quimiotaxis y activación celular.

El CD40L participa en enfermedades inflamatorias crónicas tales como aterosclerosis. A través de la interacción con su receptor clásico de CD40, CD40L regula la función de las células B y de las células T. CD40L también estabiliza los trombos a través de la interacción con la integrina de plaquetas anbp³. Si bien el tratamiento con anticuerpos anti-CD40L generó resultados alentadores en ensayos clínicos tempranos, las grandes complicaciones tromboembólicas prohibieron el seguimiento de esta estrategia. Además, la inhibición a largo plazo de CD40L - como se requiere más probablemente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas - compromete severamente las defensas del hospedante, convirtiendo la inhibición generalizada de CD40L en una estrategia poco atractiva. Zirlik et al., Circulation, 2007, 1571-1580 describieron previamente que CD40L media la aterogénesis independientemente de CD40 en ratones, y propusieron una nueva interacción con la integrina de leucocitos Mac-1. En este artículo, no se describe si la interacción de toda la proteína Mac-1 y CD40L tiene lugar in vitro. No se intentó ninguna focalización por péptidos o anticuerpos específicos.

El documento WO 2004/045542 describe biconjugados terapéuticos que comprenden un polímero hidrófilo y péptidos capaces de unirse específicamente a un ligando expresado en una superficie celular. El polipéptido puede derivar de una gran variedad de secuencias, entre otras, el dominio CD11 bl.

El documento WO 91/19511 describe un método para controlar un daño a los tejidos mediado por fagocitos (como inflamación) en un paciente humano, en donde el método comprende la administración de una composición terapéutica de un péptido que comprende parte de la subunidad de integrina p2 de CD11b. Los péptidos descritos difieren, no obstante, de los péptidos de la presente invención. Asimismo, la arterosclerosis no es una diana primaria de esta publicación.

Wolf et al. "Interaction of CD40L with the Leukocyte Integrin Mac-1: A New Pathway for CD40L-Mediated Inflammation in Atherogenesis", Heart, Lung and Circulation, vol. 17, 1 de enero de 2008, pág. S 240 mencionan la interacción de CD40L y Mac-1 como vía alternativa para la inflamación mediada por CD40L. Este mecanismo expande la comprensión de la señalización inflamatoria durante la aterogénesis. En ese resumen, no obstante, no se menciona el sitio de unión ni los péptidos o anticuerpos específicos.

Li et al., The American Journal of Pathology, vol. 172 (2008), pág 1141-1151, describen un modelo animal de restenosis en lugar de arterosclerosis. Se describe la inducción de la expresión de Mac-1 por CD40L, pero no se describe la unión entre CD40L y Mac-1 ni ningún uso terapéutico de esto.

Zhang et al., J.Biol.Chemistry (1996), pág 29953-29957, describen la identificación de un sitio discreto dentro del dominio I de integrina aMp² que modula la actividad adhesiva de este receptor. Esta región se describe como compuesta por dos bucles cortos espacialmente proximales.

Aquí esta interacción y su uso terapéutico se caracterizan en un nivel molecular, identificando los aminoácidos E162-L170, localizados en el bucle expuesto entre la hélice a l y la p-lámina B del dominio Mac-1, como un sitio de unión distinto para CD40L. La focalización de la unión de CD40L/Mac-1 con un péptido inhibidor estable preferido, en el siguiente: cM7, demostró ser específica y en última instancia eficaz para atenuar la inflamación y la formación de lesiones ateroscleróticas en ratones. La inhibición específica de la interacción CD40L/Mac-1 podría por lo tanto representar una nueva y atractiva estrategia de tratamiento antiinflamatorio para aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias crónicas, evitando los efectos indeseados de la inhibición global de la acción del ligando CD40.

La inflamación crónica promueve la aterosclerosis. CD40L, un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral descrito primero en las células T, participa como regulador clave de aterogénesis. El bloqueo funcional de CD40L no solamente redujo la formación y la progresión de placa aterosclerótica, sino que además atenuó el contenido de monocitos y lípidos de estas lesiones, aumentando a la vez el número de fibras de colágeno y células de músculo liso - características comúnmente asociadas con placas más estables en seres humanos. CD40L también aumenta la expresión de monocitos/macrófagos de colagenasas implicadas en la ruptura de placas y de factor de tejido, un desencadenante de trombosis después de la ruptura de las placas. El sorprendente hallazgo describió previamente que CD40L promueve la aterogénesis sin participación de CD40L en células derivadas de médula ósea, e independientemente de su receptor clásico de CD40. Estos hallazgos señalan una función de CD40L en las células vasculares, como células de músculo liso o endoteliales, interactuando con un receptor alternativo.

La presente invención se define en las reivindicaciones anejas.

La presente invención se refiere a la interacción de CD40L con la integrina de leucocitos Mac-1, un receptor adhesivo que interactúa con una diversidad de ligandos conocidos implicados en inmunidad, inflamación y hemostasia. La inhibición de Mac-1 neutralizando anticuerpos atenuó marcadamente la formación de lesiones ateroscleróticas afectando la incorporación de monocitos. Aquí, la interacción entre CD40L y Mac-1 se usa para aplicaciones terapéuticas potenciales. La invención se define además en las reivindicaciones.

Si bien la inflamación promueve muchas enfermedades crónicas, incluida la aterosclerosis, existen actualmente pocas opciones de tratamiento antiinflamatorio. En el contexto de aterosclerosis, las estatinas (fármacos reductores de lípidos que ejercen varias acciones antiinflamatorias) vislumbran el potencial terapéutico de dichas estrategias. Otra clase de fármacos, los inhibidores de Cox-2, ejemplifica el impresionante alcance de los beneficios terapéuticos pero también demuestra la dificultad de desarrollar fármacos antiinflamatorios sin efectos colaterales. Conceptos anteriores que apuntaron a la inhibición global de citocinas tales como CD40L fracasaron debido a efectos colaterales agudos o a largo plazo.

La presente invención se refiere a la inhibición específica de la interacción CD40L/Mac-1 usando inhibidores de péptidos pequeños y/o anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos bien definida y a su uso en las composiciones farmacéuticas. El péptido que comprende la secuencia EQLKKSKTL imita parte de un dominio I de Mac-1 y por lo tanto se une a su región de contraparte en CD40L. Los anticuerpos se dirigen contra la secuencia de péptidos (después de la modificación) y por consiguiente se unen a EQLKKSKTL en Mac-1.

La secuencia de aminoácidos relevante se ha identificado en el curso de la presente invención, y los polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos EQLKKSKTL (SEQ ID NO:1). Es esencial que el péptido a utilizar tenga la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1. No obstante, es posible modificar ligeramente la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, reemplazando aminoácidos individuales. Cuando se reemplazan dichos aminoácidos, la polaridad del aminoácido se mantiene. Esto significa que los aminoácidos que tienen carácter hidrófobo o hidrófilo se reemplazan por otros aminoácidos que tienen el mismo carácter. Es por ejemplo posible reemplazar un residuo leucina por un residuo isoleucina, o un residuo leucina por uno arginina. Preferiblemente, se reemplaza solamente un aminoácido de SEQ ID NO:1.

En una modificación alternativa, uno o posiblemente también dos aminoácidos pueden ser eliminados, mediante lo cual se mantiene la actividad biológica. No obstante, se debe verificar cautelosamente qué aminoácido puede ser eliminado, por lo que la actividad del péptido debe ser vigilada cautelosamente.

El polipéptido no tiene más de 12 aminoácidos. El polipéptido de la presente invención puede contener en el término N y/o el término C, aminoácidos adicionales que no influyen negativamente sobre la actividad biológica del polipéptido.

Los experimentos demuestran que la parte probablemente más importante de la secuencia de péptidos es el motivo de aminoácidos QLK que puede ser la parte más importante del péptido. En consecuencia, los anticuerpos que se pueden usar para propósitos farmacéuticos se dirigen preferiblemente al motivo QLK. En otra realización preferida, el motivo hacia el cual se dirigen los anticuerpos es EQLKK. Este motivo también se puede usar en una estructura cíclica, a saber CEQLKKC.

El polipéptido utilizado en la composición farmacéutica debe estabilizarse contra degradación en el paciente. O bien se modifica químicamente la estructura del péptido en un modo tal que se inhibe la degradación normal o por lo menos se demora. El péptido se estabiliza en la forma de una secuencia cíclica que todavía tiene los efectos biológicos deseados. La ventaja de esta estructura peptídica cíclica es la degradación demorada y por lo tanto la mejor biodisponibilidad. El péptido de la invención tiene la secuencia de aminoácidos CEQLKKSKTLC (SEQ ID NO:2).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en una forma adecuada conocida por el experto en la técnica. La composición se puede administrar o bien por vía oral o en la forma de una inyección adecuada. Además, es posible la administración tópica en la forma de cremas o ungüentos. Además del polipéptido de la presente invención, la composición farmacéutica comprende aditivos comúnmente utilizados a una composición farmacéutica, como estabilizantes, reguladores de pH, conservantes y similares.

La composición farmacéutica preferiblemente se utiliza en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria y/o en el tratamiento de enfermedad aterosclerótica. En particular, las composiciones se pueden usar preferiblemente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas tales como cardiopatía coronaria, artritis reumatoidea, lupus, asma y potencialmente todas las demás afecciones con las que se ha implicado previamente el CD40L.

En otra realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo que comprende la secuencia de aminoácidos VMEQLKKSKTLFS (SEQ ID NO:3). El anticuerpo preferido es un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos se pueden preparar o bien por humanización de anticuerpos de ratón o los anticuerpos se pueden obtener con el llamado método de exhibición de fagos. Dado que se conoce el epítopo contra el cual se dirige el anticuerpo, dichos anticuerpos se pueden obtener fácilmente. Dichos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo contenido dentro de la secuencia determinada y por lo tanto el anticuerpo inhibe la adhesión de Mac-1 a CD40L. Los anticuerpos son anticuerpos IgG preferidos. En una realización alternativa, también se pueden emplear fragmentos de unión (Fab). Se entiende que dichas partes funcionalmente activas de los anticuerpos están abarcadas por el término "anticuerpo".

La estrategia descrita basada en péptidos podría superar algunas de estas limitaciones. CD40L posee por lo menos cuatro receptores diferentes, incluidos CD40 y las integrinas anbp³, Mac-1 (aMp²) y avp¹. Esta invención utiliza un nuevo inhibidor selectivo para caracterizar propiedades dependientes de los receptores de CD40L. El uso de estrategias similares para bloquear selectivamente otros pares de interacción y sus funciones definidas en inflamación, inmunología y hemostasia podría permitir el desarrollo de fármacos a medida para distintas afecciones dependientes de CD40L. El polipéptido cíclico que tiene la SEQ ID NO:2 (cM7) fue eficaz y específico en la inhibición de la unión CD40L/Mac-1 y sus efectos en dirección 3', como expresión génica inflamatoria, reclutamiento de células inflamatorias y aterogénesis. Por consiguiente, cM7 puede representar una nueva y fructífera estrategia para combatir enfermedades inflamatorias crónicas como la aterosclerosis.

Uno de los resultados sorprendentes fue que los polipéptidos de la presente invención fueron capaces de inhibir específicamente la interacción CD40L/Mac-1 sin, no obstante, provocar otros efectos colaterales inespecíficos o indeseados. En particular, los polipéptidos de la presente invención no interfirieron con la formación de trombos mediada por CD40L/GPIIb/IIIa in vivo. Los resultados descritos en la presente solicitud respaldan el concepto de un bloqueo terapéutico de CD40L. El concepto previamente conocido apuntó a la inhibición global de CD40L y fracasó debido a efectos colaterales agudos o de largo plazo. En particular, los datos clínicos revelaron complicaciones tromboembólicas muy probablemente debido a desestabilización de los trombos [Andre et al. (2002), Nat.Med. 8, pág 247-252]. En contraste, la inhibición específica de la interacción CD40L/Mac-1 obtenible por los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención casi no afectó la integridad de la trombosis. En particular cM7 no interfirió con la unión CD40-CD40L in vitro y no indujo cambios en las características inmunológicas básicas tales como alteración del fenotipo Th1/Th2.

Los resultados de los experimentos se resumen en las figuras y se explican en más detalle en las leyendas de las figuras.

La Figura 1 muestra que CD40L se une a un sitio distinto dentro del dominio I de Mac-1.

(a) Dominio I exhibido basado en su estructura cristalina (INA5): izquierda, como un diagrama de cinta; derecha, como un modelo de la superficie hidratada con péptidos lineales correspondientes a las secciones, M1 a M8.

(b) CD40L recombinante específicamente unido al dominio I inmovilizado en un ensayo de unión de fase sólida. (c) Concentración del dominio I dependientemente unido a CD40L inmovilizado. La inserción muestra CD40L purificado recombinante y el dominio I en un gel de acrilamida teñido con azul de Coomassie. Se ensayaron distintos clones que bloquean específicamente Mac-1 (2LPM19c, ICRF44), CD40L (40804, 24-31) y LFA-1 (HI111) para evaluar su capacidad de bloquear la adhesión de células CHO que expresan Mac-1 a fibrinógeno inmovilizado (d) o CD40L (e).

Se usaron inhibidores de péptidos pequeños, M1 a M8 (50 pM) para bloquear la unión de CD40L al dominio I inmovilizado en un ensayo de unión de fase sólida (f) (Las secuencias de M1 a M8 se muestran en la Tabla 1), para bloquear la adhesión de células THP-1 activadas a CD40L inmovilizado en un ensayo de adhesión (g), y para bloquear la unión de CD40L marcado por fluorescencia a granulocitos y monocitos humanos recién aislados en citometría de flujo (h).

(i) Los péptidos M1 a M8 se inmovilizaron a placas de plástico altamente absorbentes, y se cuantificó la unión directa de CD40L biotinilado.

(j) También se ensayó la capacidad de los péptidos del dominio I (50 pM) de bloquear la unión de CD40L a células CHO que expresan Mac-1 en citometría de flujo, como lo demuestran los diagramas de puntos representativos. Los datos se presentan como el error estándar de la media ± de por lo menos tres experimentos independientes (b, c, d, e, f, g, i). Se incluyen tres donantes masculinos sanos en (h). n.b.: sin unión

La Figura 2 muestra la caracterización in vitro e in vivo del antagonista de péptidos.

(a) El péptido M7 que imita el sitio de unión CD40L/Mac-1 se ensayó en un ensayo de unión de fase sólida, además de la dependencia de la concentración de inhibición de la unión de CD40L al dominio I inmovilizado.

(b) cM7, una variante cíclica del inhibidor del péptido específico M7, optimizada para uso in vivo, inhibió la adhesión de una línea celular CHO que expresa Mac-1 a CD40L inmovilizado en un ensayo de cámara de flujo dinámico. Para demostrar la especificidad, cM7 no pudo bloquear la adhesión de células que expresan Mac-1 a los ligandos de Mac-1 alternativos ICAM-1 (c), y GPIba (d), mientras que el péptido control M2 específico de GPIba bloqueó eficientemente la adhesión a la proteína de plaquetas.

(e) cM7 y scM7 no afectaron la unión de CD40L a fragmentos de CD40-Fc inmovilizados, mientras que la concentración de un anticuerpo anti-CD40 bloqueante bloqueó en forma dependiente la interacción molecular.

(f) cM7 marcado con FITC se unió específicamente a fibroblastos murinos transfectados con CD40L, pero no a fibroblastos transfectados con control, según lo demostrado por citometría de flujo.

(g) Farmacocinética de cM7 inyectado por vía intraperitoneal.

(h) cM7 inyectado por vía intraperitoneal atenuó la respuesta inflamatoria inducida por TNFa en comparación con scM7 (n=8 por grupo) reduciendo los niveles en el plasma del quimioatrayente MCP-1 y (i) aumentando los niveles en el plasma de IL-10 protectora.

(j) Se redujo el estrés oxidativo en granulocitos de animales tratados con cM7.

(k,l) Disminuyó la activación de plaquetas después de la inyección de cM7, como lo demuestra la expresión de P-selectina de las plaquetas y la reducción de agregados de leucocitos-plaquetas. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media de por lo menos tres experimentos independientes.

La Figura 3 ilustra que la interacción CD40L/Mac-1 contribuye al reclutamiento de células inflamatorias in vitro e in vivo.

(a) El tratamiento de ratones WT (tipo salvaje) (n=6 por grupo) con el inhibidor del péptido específico cM7 inhibió el reclutamiento de leucocitos producidos por tioglicolato en la cavidad peritoneal, en comparación con el control de péptido no específico, scM7, o una inyección de disolución salina. El tratamiento con péptidos no tuvo efecto en ratones CD40L'/_ (n=6 por grupo).

(b) Se dejó que las células CHO que expresan Mac-1 se adhirieran a células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) sensibilizadas con TNF-a, mientras que ambos tipos de células se bloquearon selectivamente con anticuerpos contra Mac-1, CD40L o LFA-1.

(c) El anticuerpo anti-CD40L bloqueó la adhesión dinámica de monocitos humanos a HUVEC comparables con anti-ICAM-1 o anti-Mac-1 (n>4).

(d) Células Mac-1-CHO adheridas a CD40L inmovilizado preferiblemente bajo condiciones de flujo en comparación con fibrinógeno.

(e-g) La cantidad de leucocitos murinos adherentes y rodantes disminuyó cuando interactuaron con células endoteliales (EC) deficientes de CD40L en comparación con EC de tipo salvaje (n=5 por grupo). La velocidad de rodamiento de leucocitos promedio aumento en EC deficientes de CD40L.

(h) La deficiencia de CD40L no reguló la expresión superficial de las moléculas de adhesión ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 o P-selectina.

(i) En microscopia intravital, la adhesión de (j) y el rodamiento (k) de leucocitos en ratones expuestos a TNFa- se bloquearon con inyección intraperitoneal de cM7 (n=10), pero no de scM7 (n=9) ni disolución salina (n=12).

(l) Por vía intravenosa, cM7 bloqueó directamente el rodamiento de leucocitos en microscopía intravital. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Barra de escala bar 20 pm (i).

La Figura 4 muestra que el bloqueo específico de la interacción CD40L/Mac-1 atenúa la aterosclerosis en ratones. Los ratones LDLr-/- consumieron una dieta rica en colesterol durante 20 semanas. Los ratones recibieron inyecciones del inhibidor específico de la interacción CD40L/Mac-1, cM7 (n=13), un control de péptidos inespecífico, scM7 (n=12), o disolución salina (n=12), tres veces por semana.

(a) cM7 redujo significativamente el área de lesión íntima en raíces aórticas en comparación con scM7 o el péptido control.

(b) La deposición de lípidos en la aorta abdominal se redujo con el tratamiento de cM7.

(c) El contenido de lípido en raíces aórticas, según lo evaluado por cuantificación del área Aceite-rojo-O positiva, se redujo en animales tratados con cM7, en comparación con los controles. La cantidad de macrófagos (d) y células de músculo liso (e) dentro de la placa aterosclerótica, además del contenido de colágeno (f), se cuantificó por inmunohistoquímica.

(g) La distribución relativa de fibras de colágeno estables e inestables se determinó por microscopia polarizada usando tinción de rojo picrosirius. Los animales tratados con cM7 exhibieron un porcentaje significativamente mayor de fibras de colágeno estables con polarización roja en comparación con los ratones tratados con scM7 y disolución salina (p=0,0081 frente a disolución salina, p=0,0140 frente a scM7; n>9 por grupo).

(h) El contenido de células T y el marcador de proliferación Ki-67 (i) se cuantificaron en cortes ateroscleróticos. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media, imágenes representativas para Aceite rojo O- (b), Mac-3- (c), a-actina- (e) y rojo picrosirius (f) tinción específica, además de aortas en face representativas teñidas para Aceite rojo O, que se muestran a la derecha. Barra escala 1000 pm (a,b), 200 pm (c, e, f).

Figura 5: Expresión bacteriana de variantes recombinantes del dominio I de Mac-1 y CD40L.

(a) Los residuos amino de Mac-1 humanos R a S , que codifican el dominio I de aM, se produjeron como proteína de fusión His-tag soluble (~28 kDa) en un sistema de expresión bacteriana y se purificaron por cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC).

(b) Se eliminaron además proteínas bacterianas contaminantes por cromatografía de intercambio aniónico y concentraciones mayores de cloruro de sodio. Las fracciones de elución que contenían el dominio I aislado según lo evaluado por manchas de Coomassie se combinaron y dializaron contra PBS.

(c) La región homóloga a TNF de CD40L humano (E a L ) se produjo como proteína de fusión c-myc- y His-tag. La proteína (~19kDa) se extrajo de los cuerpos de inclusión insolubles, se purificó por IMAC y se replegó por diálisis subsiguiente contra PBS. La pureza de ambas preparaciones de proteína fue >95% según lo evaluado por gel de SDS-poliacrilamida. Fracciones de lavado (W), columna de flujo (FT), fracciones de elución (E), (M) marcador del tamaño de la proteína.

Figura 6: El tratamiento de péptido con cM7 no causó apoptosis celular ni citotoxicidad in vitro e in vivo. (a,b) Los macrófagos reclutados en la cavidad peritoneal por tioglicolato se expusieron a inyecciones intraperitoneales de cM7, scM7, o se bloqueó el anticuerpo anti-Mac-1 M1/70. Después de 4 horas, las células de exudados peritoneales se cosecharon y cuantificaron para unión de anexina V y carga de yoduro de propidio. cM7 no causó un incremento de las células apoptóticas o necróticas in vivo en comparación con scM7, mientras que el tratamiento de anticuerpos resultó en un porcentaje significativamente mayor de apoptosis y necrosis celular en macrófagos peritoneales. (c,d) Células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) cultivadas in vitro con cM7, scM7 o una combinación de CD40L o un anticuerpo bloqueante anti-CD40. Según lo evaluado por la actividad de caspasa 3/7, el tratamiento con el péptido durante 24 horas no indujo citotoxicidad celular. La apoptosis de células endoteliales, según lo determinado por liberación de LDH, aumentó ligeramente en HUVEC sensibilizadas con CD40L cuando se incubaron con cM7. Los datos se presentan como media ±error estándar de la media de por lo menos 3 experimentos independientes.

Figura 7: Un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el sitio de unión CD40L en el dominio I de Mac-1 modula el reclutamiento de leucocitos in vitro. Se inmunizaron ratones con el péptido lineal V160-S172. (a) El clon RC3 se unión específicamente al péptido inmovilizado M7, pero no a la versión mezclada sM7 o al fragmento del dominio I de Mac-1, M8. (b) Anti-M7 bloqueó la adhesión de células CHO que expresan Mac-1 a CD40L inmovilizado comparable con el clon de anticuerpo de bloqueo del dominio I pan 2LPM19c. Las células CHO no pudieron adherirse en fibrinógeno después del bloqueo del dominio I pan, pero sí después del bloqueo del tramo lineal V160-S172. (c) En un tratamiento anti-M7 de ensayo de cámara de flujo dinámico, el tratamiento bloqueó la adhesión de células RAW246.7 murinas a una monocapa confluente de células endoteliales activadas con el respectivo control de IgG. Los datos se presentan como media terror estándar de la media de por lo menos 3 experimentos independientes.

La Figura 8 muestra los efectos del tratamiento de cM7 en propiedades inflamatorias básicas in vivo. Los ratones C57/B6 se trataron con el inhibidor específico de interacción CD40L/Mac-1, cM7, o con el control de péptido inespecífico scM7 con inyecciones intraperitoneales. Se indujo un estado inflamatorio por inyección de TNF-a. (a-c).

En un modelo agudo de inflamación (exposición a citocinas por TNFa) el compuesto de la presente invención redujo los niveles de las quimiocinas CXCL-1 (= MCP-1) y RANTES, ambas implicadas con células inflamatorias que provocan enfermedades inflamatorias como aterosclerosis. Por otra parte, la IL-10 de la citocina más inflamatoria TH² tendió a elevarse. Se escogió un modelo agudo dado que los niveles de citocina en ratones ateroscleróticos prácticamente no se regulan sistémicamente. Los niveles en el plasma de quimiocinas CXCL-1 y RANTES se desplazaron hacia un estado menos inflamatorio, mientras que los niveles en plasma de IL-10 protectora tendieron a aumentar en ratones tratados con cM7. (d-e) La activación de subconjuntos de leucocitos se evaluó cuantificando la expresión superficial de las moléculas de adhesión ICAM-1, -2, y P-Selectina en citometría de flujo. El reclutamiento inducido por TNF-a de monocitos (g), neutrófilos (h) y monocitos inflamatorios Gr-1-positivos (i) se determinó en ambos grupos. Los datos se presentan como media terror estándar de la media de 8 animales por grupo.

Figura 9: Efectos del tratamiento de péptido a largo plazo sobre las propiedades inmunológicas in vivo. Los ratones LDLR'/_ consumieron una dieta rica en colesterol y recibieron inyecciones del inhibidor de péptido cM7, el péptido control scM7 o disolución salina tres veces por semana por un periodo total de 20 semanas. (a-f) Se cuantificaron los niveles de citocinas en el plasma IL-6, IL-1, IL-12, TNF-a e IFN-^y por ensayo de perlas citométrico. Las subpoblaciones de células T (g-h), células B- (i) y monocitos inflamatorios Gr-1-positivos (j) se cuantificaron por citometría de flujo.

Ejemplo 1

Expresión de proteína recombinante. El dominio I de Mac-1 se produjo como una proteína de fusión His-tag insertando la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos de Mac-1 R115 a S340 en pET20b (Novagen), y purificación subsiguiente por cromatografía de afinidad con metales inmovilizados Ni-NTA (Qiagen) y cromatografía de intercambio aniónico usando Q-Sepharose (GE Healthcare). Se produjo CD40L como proteína de fusión His- y cmyc-tag insertando ADN codificante para los aminoácidos E108 a L261 en pHOG-2134. Se purificó CD40L por cromatografía de afinidad con metales inmovilizados Ni-NTA.

El dominio I de Mac-1 se produjo como proteína de fusión que contenía His-tag C-terminal insertando la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos de Mac-1 R115 a S340 en el vector de expresión pET20b (Novagen) mediante una estrategia basada en PCR usando los siguientes cebadores: 5'-AG^a A^gTT^c C^cAGAGGCCCT-3' (SEQ ID NO:4) y 5'-GAGTGCGGCCGCGGCAGCGCTGAAGCCTTCCTG-3' (SEQ ID NO:5). Una línea celular CHO expresó constitutivamente toda la cadena a de Mac-1 humana como molde. El fragmento de PCR resultante se clonó en pGEMT (Promega), liberado por NcoI y NotI (New England Biolabs) y se insertó en pET20b linealizado con Ncol-Notl. Este vector de expresión se transformó en BL-21 DE Star (Invitrogen) y se expresó por adición de IPTG 0,5 mM (Sigma). La proteína se extrajo por lisis BugBuster (Novagen) y posteriormente se purificó por cromatografía de afinidad con metales inmovilizados Ni-NTA (Qiagen) en un sistema de FPLC estándar (GE Healthcare). Después de la elución de la proteína diana por imidazol 250 nM (Sigma) la fracción que contenía el dominio I de Mac-1 (~28 kDa) se dializó contra Tris-Cl 20 mM, NaCl 20 mM, pH 8,0 y se purificó por cromatografía de intercambio aniónico en una columna Q-Sepharose (GE Healthcare). Se produjo CD40L como proteína de fusión que contenía His- y c-myc-tag N-terminales, además de un dominio de trimerización.

Las secuencias de ADN codificantes para los aminoácidos E108 a L26 se ampliaron por PCR usando los siguientes cebadores: 5'-CCTAGGCGGCCGCTATCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGAC-3' (SEQ ID NO:6) y 5'- CTTCTAGA AAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGA-3' (SEQ ID NO:7). Un clon de ADNc que codifica CD40L humano (Origene) sirvió como molde. Se ampliaron his- y c-myc-tag con los siguientes cebadores: 5'-CCGGCCATGGCCGAACAAAAGCTGATCTCAGAAGAAG-3' (SEQ ID NO:8) y 5'-TGAG GTACCTAGGTGATGGTGATGGTGATGTGAG-3' (SEQ ID NO:9). Como molde para la trimerización se usó el cebador 5'-AT GAAACAGATTGAAGATAAAATT GAAGAAATT CTG AGCAAAATTTATCATATTGAAAACGAAATTGCGCGTATTAAAAAACTGATTGGAGAA-3' (SEQ ID NO:10). Todos los fragmentos de PCR se clonaron en pGEMT y se liberaron mediante NcoI, KpnI (His- y c-myc-Tag), KpnI y XbaI (motivo de trimerización) y XbaI y NotI (CD40L). Los fragmentos posteriormente se clonaron en el vector de expresión pHOG-21 (Schwarz et al., Circ.Res., 2006, pág. 25-33) y se transformaron en bacterias TG-1 (Promega). Se expresó CD40L después de la inducción con IPTG 1 mM. Las proteínas se extrajeron como cuerpos de inclusión insolubles, se solubilizaron en urea 7 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-CI 100 mM, pH 8,0 y se purificaron bajo condiciones desnaturalizantes por cromatografía de afinidad con metales inmovilizados Ni-NTA. Se replegó CD40L por diálisis contra reducción de las concentraciones de urea. Ambas proteínas finalmente se dializaron contra PBS y se conservaron a -80°C hasta uso posterior. La pureza de ambas proteínas recombinantes fue >90% según lo evaluado por electroforesis en gel SDS.

Debido a que la mayoría de los ligandos de Mac-1 - como fibrinógeno, ICAM-1, GPIba, RAGE, C3bi o heparina - se unen al dominio I de Mac-1, un tramo de ~200 aminoácidos dentro de la subunidad aM de la integrina (Fig. 1a), se planteó la hipótesis de que el dominio I también sirve como pareja de unión para CD40L. Para ensayar esta hipótesis, se produjeron variantes recombinantes del dominio I y CD40L como se muestra en la Figura 5.

En un ensayo de unión de fase sólida, CD40L, o bien soluble o inmovilizado, se unió específicamente al dominio I aislado (Fig. 1b,c). Un Kdof ~66nM reveló interacción de gran afinidad comparable con la afinidad de CD40L para anbp³ (~30nM). Para identificar el sitio de unión por CD40L, se empleó una estrategia de mapeo de péptidos que usa los péptidos lineales M1-M8, que se origina en la superficie hidratada del dominio I de Mac-1 como se muestra en la Tabla 1.

En un ensayo de unión de fase sólida inicial que evaluaba la unión del dominio I de Mac-1 aislado a CD40L inmovilizado, los fragmentos de Mac-1 M3, M4, M5 y M7 emergieron como posibles inhibidores candidatos (Fig. 1f). En el ámbito más fisiológico con la proteína Mac-1 total en un entorno de membrana celular, M7 bloqueó de la forma más eficiente la adhesión de células THP-1 a CD40L. El grado de inhibición se asemejó a aquel de un anticuerpo de bloqueo de un dominio I pan (Fig. 1g). Asimismo, M7 fue el único péptido que bloqueó la unión de CD40L a granulocitos y monocitos humanos en la citometría de flujo (Fig. 1h). Finalmente, M7 medió la unión directa a CD40L en un ensayo de unión de fase sólida (Fig. 1i) y neutralizó la unión de CD40L a células de ovario de hámster chino que expresaban Mac-1 constitutivamente activada (Mac-1-CHO) (Fig. 1j). La concentración de M7 bloqueó en forma dependiente la unión de CD40L al dominio I con un valor CI⁵⁰ de ~4 ^|j M (Fig. 2a).

Cabe destacar que el tramo de residuos amino dentro del dominio I de Mac-1 correspondiente al péptido M7, E162-L170, reside en un bucle expuesto entre la hélice a l y la lámina p B en la estructura terciaria, y no ha estado implicado en la unión de ligandos de Mac-1 alternativos GPIba, NIF, C3bi, ICAM-1, o fibrinógeno. Esto sugiere un sitio de unión distinto para CD40L, y por lo tanto el potencial de bloquear esta interacción selectivamente. Modificamos el péptido M7 añadiendo residuos cisteína flanqueantes y ciclización subsiguiente (cM7) para aumentar la estabilidad en el plasma in vivo. Un péptido mezclado, scM7, sirvió como control (ver Tabla 1). Para evaluar la especificidad de este inhibidor de péptido, se ensayó la adhesión de células Mac-1-CHO a distintos ligandos de Mac-1 en la cámara de flujo. Si bien cM7 bloqueó potencialmente la adhesión celular a CD40L (Fig. 2b), no afectó la adhesión a ICAM-1 y GPIba (Fig. 2c,d). En contraste, M2 - pero no M7 - bloqueó la interacción entre Mac-1 y GPIba, como se describió previamente, sin afectar la unión CD40L-Mac-1. Asimismo, cM7 no alteró la unión de CD40 a CD40L (Fig. 2e). Además, el tratamiento de cM7 no indujo apoptosis ni citotoxicidad in vitro e in vivo, sugiriendo buena tolerabilidad de estos agentes como se expone en la Figura 6.

Para proporcionar más datos sobre la importancia específica de la región ^e162-L170 para la unión CD40L/Mac-1, se generó un anticuerpo monoclonal contra el péptido V - S 172, llamado anti-M7. Se obtuvo un anticuerpo específico de un péptido correspondiente a la secuencia del dominio I de Mac-1 humano V160-S172 (llamado anti-M7) inmunizando a ratones con el péptido C-VMEQLKKSKTLFS-NH2 (SEQ ID NO:3) acoplado a toxoide diftérico (Monash Antibody Technologies Facility, Monash University, Melbourne, Australia). Los ensayos de fase sólida demostraron gran unión anti-suero al péptido inmovilizado M7. Este anticuerpo se unió específicamente a M7, pero no a la versión mezclada sM7 o M8, otro fragmento de Mac-1 de longitud similar. Anti-M7 bloqueó la adhesión de células Mac-1-CHO a CD40L inmovilizado, pero no a fibrinógeno (Figura 7).

Asimismo, cM7 marcado con FITC dependiente de la concentración se unió a fibroblastos murinos que expresan excesivamente CD40L, pero no a las células transfectadas con control respectivas (Fig. 2f).

Ejemplo 2

Ensayo de unión de fase sólida. Se incubó CD40L recombinante con el dominio I de Mac-1 inmovilizado en presencia o ausencia de péptidos bloqueantes. La unión de sCD40L se detectó por adición de anti-cmyc-HRP (Invitrogen), sustrato TMB (Pierce) y reacción colorimétrica. Alternativamente, se inmovilizó CD40L (Provitro), y la unión del dominio I de Mac-1 recombinante se cuantificó por adición de anti-His-Biotin (Qiagen), y estreptavidina acoplada a HRP (Pierce). Para la unión a péptidos inmovilizados, se biotiniló CD40L con el kit Micro Biotinylation (Sigma). Se usó una mezcla de molaridades equivalentes de todos los péptidos como control positivo del ensayo. El dominio I de Mac-1 recombinante se inmovilizó en placas de 96 pocillos (Nunc) en PBS a 4°C durante la noche. Después de bloquear en 2 % BSA/PBS y posterior lavado con PBS, se añadió CD40L recombinante a los pocillos en las concentraciones indicadas y se incubó durante 2 horas a 37 °C. El efecto de los péptidos M1-M8 se evaluó incubando CD40L (10 pg/ml) en presencia de péptidos (50 pM). Después de extraer el c D40l no ligado lavando con 0,1 % Tween-20/PBS, se añadió anti-c-myc-HRP (Invitrogen) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La unión se cuantificó por adición de sustrato TMB (Pierce), reacción colorimétrica a 450 nm. Alternativamente, se inmovilizó CD40L sin His-tag (Provitro) y se bloqueó como se describió anteriormente. La unión del dominio I de Mac-1 recombinante se cuantificó por adición de anticuerpo monoclonal anti-His-Biotina (Qiagen), estreptavidina acoplada a HRP (Pierce) y reacción colorimétrica a 450 nm. Para la unión específica del dominio I de Mac-1, los pocillos recubiertos con BSA se sustrajeron del CD40L recubierto. Se estimó el valor Kd usando un modelo de regresión no lineal de hipérbola de unión a un sitio con el Software Prism (Graphpad). Para cuantificación de la unión de CD40L a los péptidos, se inmovilizaron péptidos en placas de 96 pocillos durante la noche a 4 °C en carbonato sódico 50 mM, pH 10,6. Se biotiniló CD40L usando el kit Micro-Biotinylation (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante y se detectó por estreptavidina acoplada a HRP (Pierce) y reacción colorimétrica. Una mezcla de molaridades equivalentes de todos los péptidos se usó como control positivo. La absorbancia en pocillos recubiertos con BSA se usó como control negativo y se sustrajo.

Ejemplo 3

3.1 Ensayos de adhesión dinámica y estática. Se recubrieron placas de 96 pocillos (Nunc) con sCD40L y se incubaron con células CHO que expresaban constitutivamente Mac-1 activada, como se describió previamente, o células THP-1. Se permitió que las células se adhirieran durante 20 a 50 minutos. Los anticuerpos bloqueantes (10 pg/ml) se pre-incubaron con las células. Como se indica, los ensayos se llevaron a cabo en presencia de péptidos (50 pM). Se añadió tampón de permeabilización (6 mg/ml sustrato de fosfatasa (Sigma), 1% Triton X-100, acetato sódico 50 mM, pH 5,5) para cuantificar las células adherentes por reacción colorimétrica. Alternativamente, se contaron las células adherentes. Se aislaron EC murinas como se describió previamente. Las células CHO que expresaban Mac-1 se cargaron con CFDA-SE (Invitrogen), se dejaron adherir durante 45 minutos y se cuantificaron con microscopio de fluorescencia. Para ensayos de adhesión dinámica, se recubrieron placas de 35 mm con 1% BSA, o CD40L, GPIba (Abnova), fibrinógeno (Sigma), o ICAM-1 (R&D systems). Las células adherentes y rodantes se cuantificaron en un sistema de cámara de flujo paralelo (Glycotech) a la velocidad de cizallamiento indicada y en presencia de los péptidos indicados (1 pM) o anticuerpos (10 pg/ml). Alternativamente, se observó la adhesión o el rodamiento de células de exudado peritoneal en células endoteliales murinas.

3.2 Ensayos de adhesión estática. Se recubrieron placas de 96 pocillos (Nunc) con sCD40L (10 pg/ml) en PBS durante la noche a 4 °C. Después de extraer el CD40L no ligado lavando con PBS, las placas se bloquearon con 0,1 % agarosa durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con PBS. Los anticuerpos bloqueantes contra CD40L (10 pg/ml) se introdujeron en los pocillos como se indicó y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y posteriormente se lavó con PBS. Las células CHO que expresaban constitutivamente Mac-14 activadas o células THP-1 se pre-incubaron con anticuerpos bloqueantes de la función contra CD11b o CD11a (10 pg/ml) durante 15 min a temperatura ambiente. Se permitió que se adhirieran 5 x 104 células/pocillo durante 20 a 50 min a 37 °C. Como se indicó, los ensayos de adhesión estática se llevaron a cabo en presencia de péptidos en una concentración de 50 pM. Después de extraer las células no ligadas lavando con PBS, se añadió tampón de permeabilización (6 mg/ml sustrato de fosfatasa (Sigma), 1 % Triton X-100, acetato de sodio 50 mM, pH 5,5) durante 1 hora a 37 °C y las células adherentes se cuantificaron por reacción colorimétrica a 405 nm. Alternativamente, se contaron las células adherentes bajo el microscopio (Zeiss). Alternativamente, se estimularon células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) con 50 ng/ml TNF-a antes del experimento. Se cargaron células CHO que expresan Mac-1 con carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFDA, Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células HUVEC o CHO se incubaron selectivamente con anticuerpos bloqueantes (10 pg/ml) como se indica, se lavaron, y se dejó que las células se adhirieran en HUVEC durante 35 min a 37°C. Después de eliminar las células no ligadas lavando con PBS, las células adherentes se contaron bajo el microscopio de fluorescencia.

Ejemplo 4

4.1 Citometría de flujo. Se efectuaron análisis citométricos de flujo, ensayos de activación de plaquetas y cuantificación de leucocitos-agregados plaquetarios, como se describió previamente (Zirlik et al., 2007). La unión de cM7 a fibroblastos murinos que expresan CD40L se determinó por cuantificación de cM7 acoplado a FITC. La unión de CD40L a células CHO que expresan Mac-1 o a leucocitos humanos se efectuó por incubación con CD40L (10 pg/ml) y detección subsiguiente con anticuerpo anti-PentaHis (Qiagen).

4.2 Ensayo de cámara de flujo laminar. Para ensayos de adhesión dinámica, se recubrieron placas de 35 mm durante la noche a 4 °C con 1 % BSA, CD40L, GPIba (Abnova), ICAM-1 (R&D systems) o fibrinógeno (Sigma), a una concentración de 10 pg/ml, y 30 pg/ml, respectivamente. La adhesión y rodamiento de células CHO que expresan Mac-1 se ensayó en un sistema de cámara de flujo paralelo (Glycotech) usando caudales en aumento de 0,5 dina/cm2 (flujo venoso) hasta 15 dina/cm2 (flujo arterial). Las células se cuantificaron bajo el microscopio (Olympus). Como se indica, se ensayaron los efectos de los inhibidores en las velocidades de cizallamiento indicadas y en presencia de los péptidos indicados (1 pM) o anticuerpos (10 pg/ml). Alternativamente, se aislaron células endoteliales murinas y se estimularon con TNF-a como se describió anteriormente. Las células de exudado peritoneal de adhesión y rodamiento en células endoteliales murinas aisladas se cuantificaron como se describió anteriormente. La velocidad de rodamiento se computó empleando la herramienta de rastreo celular Pro cell (Media Cybernetics)

4.3 Citometría de flujo. Los análisis citométricos de flujo, además de los ensayos de activación de plaquetas y cuantificación de leucocitos-agregados celulares, se efectuaron como se describió precedentemente (Quezada et al., Ann.Rev.Immunol. (2004), pág 307-328). En síntesis, se tomaron muestras de sangre murina por punción intracardiaca. Se lisaron los glóbulos rojos en NH⁴Cl 155mM, K²HPO⁴5,7 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3. Los leucocitos se resuspendieron en 0,1 % BSA/PBS y se bloquearon los receptores Fc por anticuerpos anti-CD16/CD32 (Ebioscience). Los anticuerpos para clasificación celular activada por fluorescencia específica de epítopos (FACS Calibur, BD) incluyeron anti-CD11b, anti-CD115, anti-Gr-1, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20, anti-CD41, anti-CD62P, anti-CD54, anti-CD102 y anti-CD106 (todos de Ebioscience). La unión de cM7 a CD40L- o fibroblastos murinos transfectados con control se determinó por incubación de FITC-cM7 en las concentraciones indicadas con células durante 30 min a 37 °C y posterior cuantificación de la fluorescencia en el canal FL-1. La unión de CD40L a leucocitos humanos o células CHO que expresan Mac-1 se efectuó por incubación de la proteína de fusión His-tag-CD40L (10 pg/ml) durante 30 min a 37 °C en PBS Ca2+/Mg2+ y posterior detección con anti-PentaHis marcado con Alexa488 (Qiagen). Los monocitos y granulocitos humanos se segmentaron en función de sus propiedades en la dispersión frontal o lateral. Para el análisis de la expresión endotelial de moléculas de adhesión, las células se estimularon con TNF-a durante 24 horas, se desprendieron usando accutasa (Sigma) y se incubaron con anticuerpos acoplados a fluorocromo.

Ejemplo 5

Exposición a citocinas. Ratones C57BL/6J de 8 semanas de vida recibieron una inyección intraperitoneal de 200 ng de TNF-a (R&D systems) murino y 100 pg o bien de los péptidos cM7, scM7 o un volumen equivalente de disolución salina estéril. Después de 5 horas, los ratones fueron sacrificados con CO². Se lavó la cavidad peritoneal con 2 ml de PBS y se filtraron las citocinas del sobrenadante. Se extrajo sangre con una punción intracardiaca. Las concentraciones en el plasma de IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-a, IFN-^y, MCP-1, KC y RANTES se determinaron por Matriz Citométrica de Microesferas (CBA, BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La activación de leucocitos y plaquetas periféricos se evaluó por citometría de flujo como se describió previamente.

Ejemplo 6

Ensayo de estrés oxidativo. Se preincubaron leucocitos murinos con Dihidrorodamina (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante y se vigiló la formación de estrés oxidativo reactivo por citometría de flujo.

Ejemplo 8

Modelo de peritonitis murina. Ratones WT o CD40L'/' (Jackson Laboratories) recibieron una inyección de 2 ml de caldo de tioglicolato al 4 % (Sigma). Se efectuó un lavaje peritoneal después de 15 horas, lavando la cavidad peritoneal con PBS. Las células de exudado peritoneal (PEC) se cuantificaron después de la lisis de los glóbulos rojos.

Ejemplo 9

Microscopia intravital. Los ratones recibieron una inyección intraperitoneal 5 horas antes de la cirugía de 200 ng de TNFa (R&D systems) murino y 100 pg de péptidos disueltos en disolución salina estéril 5 horas antes de la cirugía. Los ratones fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de hidrocloruro de cetamina (Essex) y xilacina (Bayer) en una dosis de 187,5 mg/kg de peso corporal y 62,5 mg/kg de peso corporal, respectivamente. El músculo cremáster se exteriorizó como se describió previamente (lezzi et al., PNAS (2009), pág 876-881). Para algunos experimentos, se colocó un catéter en la vena yugular, y se administraron péptidos durante la microscopia. El cremáster se perfundió con disolución salina termocontrolada (36°C). Se colocó a los ratones en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Se filmó con un microscopio intravital (AxioScope Vario, Carl Zeiss) equipado con un sistema de cámara de alta sensibilidad con un objetivo de inmersión salina (Wplan-APOCHROMAT 20x/1,0DIC IR, Carl Zeiss) (AxioCam MRm, Carl Zeiss) durante 30 segundos cada uno. El flujo de leucocitos rodantes se definió como el número de leucocitos móviles a una velocidad menor que los eritrocitos. La velocidad de rodamiento de los leucocitos se midió por el tiempo promedio requerido para que los leucocitos rodaran en una longitud definida de la vénula en cada punto de tiempo. Los leucocitos adherentes se definieron como células que permanecieron quietas durante por lo menos 30 segundos. El flujo de leucocitos rodantes y el flujo adherente fueron cuantificados por el investigador bajo condiciones de enmascaramiento.

Ejemplo 10

Estudio de aterogénesis. Ratones macho de ocho semanas de vida deficientes del receptor de LDL (LDLr-/-) (Jackson Laboratories) que habían consumido una dieta rica en colesterol (HCD) se trataron con inyecciones intraperitoneales de los péptidos cM7, scM7 (Peptide Specialty Laboratory) en una dosis de 100 pg, o disolución salina estéril tres veces por semana. Después de 20 semanas, se extrajeron muestras de sangre para análisis citométrico de flujo de subpoblaciones de leucocitos, niveles en plasma de colesterol y triglicéridos, además de determinación de citocinas y quimiocinas en el plasma. Se determinó la presión arterial con una medición no invasiva de la presión arterial (NIBP, Harvard Apparatus). Los ratones fueron sacrificados, y se congelaron las raíces y los arcos aórticos en OCT (compuesto OCT; Tissue-Tek). Las aortas torácicas y abdominales se fijaron en 10 % formalina tamponada. Se fijaron en acetona cortes de cryostat en serie (6 pm) de tejidos aórticos de ratón, y se secaron al aire. Se bloqueó la unión no específica con 5 % suero normal apropiado para la especie (Vector Laboratories). Los cortes luego se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en disolución salina tamponada con fosfato, enriquecida con 5 % suero normal apropiado para la especie. La incubación con anticuerpos secundarios fue seguida de complejo avidina-biotina (ABC, Vector Laboratories). La unión de anticuerpos se visualizó con 3-amino-9-etilcarbazol (AEC; Dako), seguida de contratinción con disolución de hematoxilina de Gill (Sigma-Aldrich). Las tinciones de control incluyeron tinción con los respectivos isotipos de IgG (Pharmingen, Dako). Los anticuerpos utilizados fueron Mac -3 anti-ratón de rata para tinción específica de macrófagos, anti a-actina para tinción específica de células de músculo liso (Dako). Para la visualización de colágeno de tipo I, se incubaron cortes congelados fijados con formalina durante 4 horas en una disolución al 0,1 % recién preparada de rojo picrosirius (Polysciences) en ácido pícrico acuoso saturado. Después de enjuagar en HCl 0,01 N y agua destilada, los cortes se deshidrataron en etanol al 70 % y se montaron en Permount (Vector Laboratories). La tinción con rojo Picrosirius se analizó por microscopia de polarización. Dado que el color de las fibras de colágeno evaluadas en la tinción de rojo picrosirius depende del espesor de las fibras de colágeno y cambia de verde (fibras delgadas) a amarillo, naranja y rojo (fibras gruesas), se cuantificó la distribución de color en los cortes de colágeno teñidos. La deposición de lípidos se determinó por tinción aceite rojo O después de la fijación de formalina en cortes aórticos o en preparaciones en face de la aorta abdominal. Para cuantificar la composición de las lesiones aórticas, se analizaron los cortes del tejido aórtico en forma microscópica en todos los ratones. Dentro de la raíz aórtica, se analizaron las áreas lesionadas en cortes transversales obtenidos al nivel de las 3 valvas de la válvula aórtica, inmediatamente proximales al ostium de la arteria coronaria derecha. El área de la pared aórtica total, el área de lesión en la raíz aórtica y el porcentaje del área teñida para macrófagos, lípidos, SMC o colágeno se determinaron mediante cuantificación de imágenes asistidas por ordenador (ImagePro, Media Cybernetics).

Ejemplo 11

11.1 Farmacocinética del inhibidor de péptidos. Ratones C57BL/6J recibieron inyecciones intraperitoneales de cM7 marcado con FITC. La fluorescencia en las muestras de plasma se midió en los puntos de tiempo indicados en la lectora de placas de fluorescencia (Spectramax). Se usó CM7-FITC diluido en muestras de plasma como estándar.

11.2 Modelado estructural. La estructura del dominio I de Mac-1 se visualizó usando el sistema de visualización Sirius 1.2 (San Diego Supercomputer Center) y un conjunto de datos cristalográficos para el dominio I de Mac-1 (PDB ID: 1NA5).

11.3 Anticuerpos y péptidos. Se adquirieron los siguientes anticuerpos específicos de epítopos: CD11 b anti-humano, clon 2LPM19c (Santa Cruz Biotechnology); CD11b anti-humano, clon ICRF44 (Biolegend); CD11a anti-humano, clon HI111 (Biolegend); CD40L anti-humano, clon 24-31 (Calbiochem); CD40L anti-humano, clon 40804 (R&D systems); ICAM-1 anti-humano, clon BBIG-I1 (R&D systems). Los péptidos se sintetizaron de Peptide Specialty Laboratories (Heidelberg), se purificaron por HPLC y se ciclaron, si correspondía. La masa molecular se determinó por espectrometría de masas. Los péptidos tuvieron una pureza >95%.

11.4 Cultivo celular. Se adquirieron células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) de Lonza y se desarrollaron en M199, suero de ternero fetal al 20 % (FCS), 1% Penicilina/Estreptomicina, 0,1 % Fungizone, 1 % aminoácidos no esenciales (NEAA), 1 % Na-Pyruvat, 1 % Heparina, 1 % ECGS. Se cultivaron células THP-1 monocíticas en RPMI 1640, 1 % Penicilina/Estreptomicina, 10 % FCS, 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Las células CHO que expresan constitutivamente Mac-1 se describieron previamente y se cultivaron en DMEM, 1 % Penicilina/Estreptomicina, 10 % FCS, 1 % NEAA, 1 % L-Glutamina, 125 pg/ml Zeocina, 70 pg/ml Geniticina. CD40L-y fibroblastos murinos transfectados con control fueron obsequiados por el Dr. K. Zirlik (Universidad de Freiburg, Departamento de Hematología, Freiburg, Alemania) y se cultivaron en DMEM, 1 % Penicilina/Estreptomicina, 10 % FCS, 1 % NEAA, 1% L-glutamina, 125 pg/ml.

11.5 Aislamiento de células endoteliales murinas. Para aislamiento de células endoteliales murinas se sacrificaron los correspondientes ratones de tipo salvaje o CD40L'/_ (todos C57BL/6J) con CO², y se cosecharon los pulmones, corazón, cerebro e hígado empleando técnicas estériles, se trozaron con una navaja y se digirieron en 0,2 % colagenasa tipo 1/1% BSA (Worthington, Lakewood, NJ y Sigma, St. Louis, MO) durante 90 min a 37 °C. Después de lavar con 0,1 % BSA y filtrar con una malla de nylon de 70 pm, las células se resuspendieron en 0,1 % BSA y se incubaron con un anticuerpo CD31 anti-ratón a Dynabeads anti-rata de oveja (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) durante 10 min a temperatura ambiente. Las células luego se separaron y se lavaron tres veces usando un concentrador de partículas magnéticas (Dynal Biotech) y se sembraron en placas recubiertas con gelatina. Después de alcanzar confluencia, se efectuó una segunda clasificación magnética con un anticuerpo ICAM-2 anti-ratón de rata (BD Pharmingen). Las células se desarrollaron en DMEM de alta glucosa enriquecido con 20 % suero bovino fetal (FBS), 1 % piruvato sódico, 1 % heparina, 1 % factor de crecimiento endotelial bovino, 0,6 % NEAA y 1 % penicilina/estreptomicina. Las células se mantuvieron en M-199 enriquecido con 0,1 % FBS 24 h antes de los experimentos.

12. Resultados de los ejemplos

Los resultados de los experimentos anteriormente descritos se resumen y exponen en las figuras y se explican en las leyendas de las figuras y en más detalle a continuación: La aplicación terapéutica de péptidos in vivo requiere disponibilidad plasmática adecuada. Después de la inyección intraperitoneal, cM7 persistió en el plasma entre 30 minutos y 4 horas (Fig. 2g). Se ensayó si el inhibidor de péptidos moduló efectivamente las funciones inflamatorias in vivo .Tras el tratamiento con cM7, los ratones expuestos a TNFa intraperitoneal expresaron niveles en plasma inferiores de MCP-1, y por tendencia también de CXCL-1 y RANTES, mientras que los niveles de IL-10 aumentaron tanto en plasma como en el fluido peritoneal (Fig. 2h,i; Fig. 8 a-c). El tratamiento con cM7 también atenuó el estallido oxidativo granulocítico inducido por TNFa (Fig. 2j) y redujo la expresión de L-selectina plaquetaria, así como también los agregados de granulocitos/monocitos y plaquetas (Fig. 2k,l), demostrando varias propiedades anti-inflamatorias del agente de la presente invención.

Ya que Mac-1 funciona clásicamente como un factor de adhesión en enfermedades inflamatorias, se planteó la hipótesis de que cM7 puede limitar el reclutamiento de células inflamatorias. De hecho, cM7 redujo en forma potente la acumulación de células peritoneales producidas por tioglicolato en ratones de tipo salvaje, pero no en ratones CD40L'/_ (Fig. 3a). Desde el punto de vista mecanístico, la adhesión de Mac-1-CHO y células endoteliales humanas podría anularse con el bloqueo selectivo de CD40L en EC o Mac-1 en células CHO, pero no viceversa, convirtiendo a la interacción entre CD40L endotelial y Mac-1 de leucocitos en la diana más probable para nuestro péptido.

El tratamiento anti-CD40L bloqueó la adhesión en el mismo grado que el tratamiento con anti-ICAM-1 o anti-Mac-1 (Fig. 3c). CD40L, a diferencia del fibrinógeno, preferiblemente se unió a células bajo flujo fisiológico (Fig 3d). Por consiguiente, las EC deficientes deCD40L estuvieron altamente afectadas en el reclutamiento de leucocitos murinos en la cámara de flujo (Fig 3e-g), un efecto no causado por una expresión alterada de moléculas de adhesión (Fig. 3h). De modo similar, anti-M7 previno la adhesión de leucocitos a EC activadas (Figura 7).

Finalmente, la inyección intraperitoneal de cM7 redujo potentemente el rodamiento y la adhesión firme en vasos de cremáster de ratones expuestos a TNFa (Fig. 3i-k), mientras que la presión arterial y los recuentos de leucocitos y plaquetas no sufrieron modificaciones (ver Tabla 2).

Se obtuvieron datos similares cuando se inyectó cM7 por vía intravenosa (Fig. 3l).

Colectivamente, estos datos identifican la interacción CD40L/Mac-1 como un potente regulador del reclutamiento de leucocitos in vivo susceptibles a focalización eficaz y específica por cM7.

El reclutamiento de monocitos contribuye de manera crítica al inicio y la progresión de las enfermedades inflamatorias más crónicas. Por lo tanto, se ensayó si el inhibidor de péptidos podría mitigar la aterosclerosis in vivo en ratones. Ratones LDLr-/" que habían sido sometidos a una dieta rica en colesterol durante 20 semanas presentaron lesiones significativamente menores tanto en el seno aórtico como en la aorta abdominal cuando se trataron con cM7 (Fig. 4a, 4b). Más allá de una mera reducción de tamaño, las placas ateroscleróticas de los animales tratados con cM7 contenían significativamente menos macrófagos y menos acumulación de lípidos, mientras que aumentaron las células de músculo liso (Fig. 4c-e). El contenido de colágeno aumentó en las placas tanto del grupo de tratamiento como del grupo control (Fig. 4f), pero hubo un porcentaje mayor de fibras de colágeno grandes y estables en los animales tratados con cM7 (Fig. 4g). Este resultado demuestra que la inhibición genética o terapéutica de CD40L atenúa la formación de lesiones ateroscleróticas y remodela la placa hacia una morfología con más características de estabilidad. No se observaron cambios en las características inmunológicas - como números de células T, células B o citocinas - indicando un fenotipo Th1-/Th-2 - tal como IL-10, IL-12 o INFy - tras el tratamiento a largo plazo con cM7 (Figura 9).

Los niveles de lípidos, peso, subconjuntos de leucocitos, presión arterial, niveles de citocinas y niveles de quimiocinas permanecieron inalterados (ver Tabla 3).

Ejemplo 12

Se controlaron los posibles efectos colaterales en un modelo de trombosis in vivo. Ratones C57BL/6J de 3-4 semanas de vida recibieron una inyección intraperitoneal o bien de disolución salina estéril (100 pl), los péptidos cM7, scM7, o los anticuerpos indicados. Se escogió una arteriola mesentérica y se la lesionó con ferricloruro. Las plaquetas se tiñeron por inyección retroorbital de rodamina 3G y se visualizaron mediante un microscopio intravital (AxioScope Vario, Carl Zeiss). Se analizaron el tiempo de oclusión de los vasos y la tasa de embolización de los trombos. El tiempo de sangrado del rabo se determinó como se describió previamente (Andre et al., Loc.Cit.).

La Figura 10 muestra que la interacción CD40/Mac-1 no media la formación de trombos ni la estabilidad en los ratones. Ratones C57BI/6 de tipo salvaje recibieron inyecciones de los péptidos cM7, scM7 (100pg), anticuerpos bloqueantes contra Mac-1, CD40L, CD40 (100pg), control de isotipo IgG (100 pg) o disolución salina, antes de evaluar el tiempo de sangrado del rabo (A) y la formación de trombos in vivo (B-D) en las arteriolas mesentéricas después de la lesión con ferricloruro. La tasa de tromboembolización se definió como la frecuencia de embolia/min (C,D). Los datos se presentan como media terror estándar de la media de por lo menos 4 animales por grupo. Barra de escala 200 pm.

El funcionamiento hemostático de CD40L depende de la interacción o bien con CD40 o con integrina de plaquetas GPIIb/IIIa (anbp³) (Andre et al. loc. cit). La inhibición de esta interacción con las estrategias terapéuticas anteriores que empleaban anticuerpos que neutralizan CD40L total provocó complicaciones tromboembólicas. Por lo tanto, confirmando los estudios previos, el tratamiento con un anticuerpo bloqueante anti-CD40L prolongó significativamente el tiempo de sangrado de la vena del rabo por 74±12% (n>4, p=0,04) en nuestro estudio. Cabe destacar que el bloqueo selectivo con cM7 no afectó el tiempo de sangrado (Fig. 10A), lo que sugiere que la interacción CD40L-Mac-1 es específica de las vías inflamatorias de CD40L. Por consiguiente, cM7 no prolongó el tiempo de oclusión de los vasos en un modelo de trombosis arterial, mientras que la formación de trombos impidió el tratamiento anti-CD40L y anti-CD40 en arteriolas mesentéricas provocando una prolongación del tiempo de oclusión en 113±22% (n=5, p=0,005) y 116±22% (n=4, p=0,05), respectivamente (Fig. 10B). Asimismo, la disrupción de la interacción CD40L-Mac-1 por cM7 solamente causó un ligero incremento en la tasa de tromboembolización (n=5, p=0,005). No obstante, este fue un efecto insignificante en comparación con la tasa del tratamiento anti-CD40L y anti-CD40 que aumenta la tasa de embolización en 339±38% (n=6, p=0,001), y 173±40% (n=3, p=0,008), respectivamente. Cabe destacar que el tratamiento con anticuerpos anti-Mac-1 neutralizantes también aumentó la tasa de embolización - aunque en forma moderada -por 131±41% (n=4, p=0,03, Fig. 10C, D).

Los datos demuestran que CD40L se une específicamente a una región distinta dentro del dominio I de Mac-1. Los péptidos aquí bloquearon la unión de CD40L a Mac-1, pero no afectaron algunas de las otras interacciones receptorligando. En consecuencia, los péptidos descritos en este documento y los anticuerpos se pueden utilizar como medicamentos que no presentan efectos colaterales indeseados.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos CEQLKKSKTLC en donde el polipéptido no contiene más de 12 aminoácidos, caracterizado porque el polipéptido posee una estructura cíclica.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad aterosclerótica.

4. Anticuerpo caracterizado porque se une específicamente a un epítopo que comprende la secuencia de aminoácidos VMEQLKKSKTLFS (SEQ ID NO:3) y que inhibe la adhesión de Mac-1 a CD40L.

5. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo según la reivindicación 4.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 para uso en el tratamiento de una enfermedad aterosclerótica.