ES2960415T3 - Composición farmacéutica que comprende un péptido de tipo ligando peptídico alterado (LPA) - Google Patents

Abstract

La invención provee una composición farmacéutica que comprende el péptido tipo APL identificado como SEQ ID No. 1, el tampón acetato de sodio a pH 3,9 - 4,7; y al menos un azúcar estabilizante seleccionado entre la sacarosa y la trehalosa. Dicha composición farmacéutica es útil para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias relacionadas con un aumento de los neutrófilos o de la citrulinación de proteínas. Entre estas enfermedades inflamatorias se encuentran la artritis reumatoide (AR), la artritis idiopática juvenil (AIJ), la espondilitis anquilosante (EA), la enfermedad de Alzheimer, y la fibrosis hepática o pulmonar. La invención también revela un método para el tratamiento de dichas enfermedades, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica del péptido tipo APL identificado como SEQ ID No. 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición farmacéutica que comprende un péptido de tipo ligando peptídico alterado (LPA)

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una rama de la medicina, en particular a una composición farmacéutica que comprende un péptido modificado tipo LPA (Ligando Peptídico Alterado, abreviado LPA). La administración de esta composición a pacientes disminuye los eventos asociados con la citrulinación de proteínas. La composición es útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide (AR), espondilitis anquilosante (EA), artritis idiopática juvenil (AIJ), fibrosis hepática y enfermedad de Alzheimer.

Estado de la técnica anterior

La citrulinación es una modificación postraduccional de proteínas que transforma el grupo guanidinio (carga positiva) de la arginina a un grupo ureido citrulinado (neutro). Las enzimas peptidil-arginina deiminasas (PAD) catalizan esta transformación (Bicker K. L., Thompson P. R. 2013, Biopolymers, 99: 155-163). En la AR, la exposición a agentes ambientales que desencadenan la enfermedad y la NETosis (NET) de los neutrófilos representan las principales fuentes de autoantígenos citrulinados. La NETosis es una muerte celular programada en la cual ocurre la ruptura de la membrana plasmática, asociada a cambios en la morfología nuclear de los neutrófilos. La liberación del contenido citoplasmático de los neutrófilos en el espacio extracelular forma una matriz de cromatina enriquecida con gránulos de proteínas antimicrobianas y enzimas, las llamadas trampas extracelulares de neutrófilos. En este proceso se liberan enzimas PAD e histonas H3 citrulinadas, las cuales se convierten en potentes autoantígenos (Konig MF, Andrade F.

2016. Front Inmunol 7: 461), y aumentan la respuesta inflamatoria de los fibroblastos sinoviales que invaden el cartílago. Por otro lado, los agentes ambientales que desencadenan la AR provocan apoptosis y muerte debido a la necrosis de las células que forman la matriz extracelular. Las células necróticas liberan su contenido citoplasmático al espacio extracelular. Durante este proceso, también se liberan enzimas PAD, las cuales se activan debido a los niveles de calcio en el espacio extracelular y provocan la citrulinación de las autoproteínas.

La NETosis de neutrófilos también se asocia con la patogénesis de EA y AIJ (Giaglis S y otros, 2016. Front, Pediatr, 4:97). Por otro lado, la NETosis puede exacerbar los procesos neuroinflamatorios, promoviendo el daño vascular en el parénquima de pacientes con enfermedad de Alzheimer (Pietronigro EC y otros, 2017. Front Immunol 8: 211).

Además, la NETosis es un proceso biológico que contribuye al desarrollo de fibrosis en diversos tejidos tales como el pulmón y el hígado, asociado con la citrulinación de la vimentina (Branzk N, Papayannopoulos V. Seminars in Inmunopathology, 2013; 35 (4): 513-530).

En particular, en la AR se han descrito varias proteínas que son dianas de la citrulinación, entre las que se encuentran el fibrinógeno, la queratina, la fibronectina, la vimentina, el colágeno tipo II y la a-enolasa (McInnes IB, Schett G. 2011 N Engl J Med. 365 (23): 2205-2219). Por otro lado, se ha encontrado que la citrulinación de la vimentina contribuye significativamente a la patogénesis de la EA, la AIJ, la fibrosis hepática y pulmonar y la enfermedad de Alzheimer (S. Gudmann y otros, 2015. Autoimmunity 48: 73-79).

Durante la progresión de la AR, las células B proliferan y se diferencian en células que secretan anticuerpos antiproteína citrulinada (ACPA), después de la interacción con células T auxiliares activadas por péptidos citrulinados. Los ACPA se encuentran en el 50 % de los pacientes, aproximadamente un año antes del debut de la AR. Los estudios en modelos animales sugieren que la migración de estos autoanticuerpos, desde sitios extraarticulares hasta la membrana sinovial, desencadena la inflamación de las articulaciones. Además, la presencia de ACPA en la membrana sinovial es un factor de riesgo para esta enfermedad, porque estos autoanticuerpos reconocen moléculas de vimentina citrulinada e inducen la diferenciación de células mononucleares en osteoclastos, que promueven la resorción y destrucción ósea (Martin-Mola E. y otros 2016. Rheumatol Int. 36 (8): 1043-1063).

Un factor que contribuye notablemente a la patogénesis de la AR es la activación de los neutrófilos por complejos inmunes depositados en el líquido sinovial o en la superficie del cartílago (Rollet-Labelle E. y otros, 2013. J Inflamm (Lond). 1): 27). Los neutrófilos inducen la síntesis y liberan productos citotóxicos (prostaglandinas, proteasas y radicales libres de oxígeno), los cuales dañan gravemente la articulación. Los neutrófilos orquestan el proceso inflamatorio a través de cuatro mecanismos: (1) secreción de citocinas y quimiocinas, incluidas<i>L-23, IL-12, RANKL (receptor activador del ligando del factor nuclear kB) e IL-18, el cual provocó la activación de osteoclastos y linfocitos B; (2) aumento de la expresión de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase II; (3) interacciones célula-célula que provocan la activación de otros tipos de células que destruyen la articulación; y (4) liberación de proteasas que activan o inactivan citocinas y quimiocinas implicadas en el daño articular (Wright H. L y otros (2014. Nat Rev Rheumatol. 10 (10): 593-601).

Los neutrófilos tienen una vida media corta, aproximadamente entre 30 minutos y 8 horas. Las proteínas S100A8/9 representan el 40 % de las proteínas del citosol de estas células; este complejo indujo la muerte celular programada de los neutrófilos (M Atallah, y otros, 2012. PLoS ONE 7: 2 (e29333). S100A8 y S100A9 suelen estar en un complejo conocido como calprotectina, tanto S100A8 como S100A9 y la calprotectina, provocan quimiotaxis de neutrófilos, en concentraciones muy bajas (intervalo nanomolar). La calprotectina (S100A8/9) se encuentra en altas concentraciones en sitios locales de inflamación o en el suero de pacientes con enfermedades inflamatorias como AR, fibrosis y enfermedad de Crohn (Cerezo, L. y otros 2011. Arthritis Res. Ther. 13 (4): R122).

Cohen y Monsonego en la solicitud de patente No. WO2009090650 reivindica el uso de un péptido derivado de HSP60, en combinación con la proteína p-amiloide, para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos 458-474 de HSP60. Otros autores revelaron el uso de pequeños péptidos que también previenen la agregación de la proteína p-amiloide para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (P Sundaram y otros, Patents on Potential Drugs to Treat Alzheimer's Disease: Special Emphasis on Small Peptides, 2014. 9: 71-75). Solicitud de patente No. PCT / IL2003 / 000132 reivindica el uso del péptido p277, derivado de HSP60, el cual es capaz de modular la actividad de las células T, a través del TLR tipo 2, para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias crónicas, entre las que se cita la fibrosis pulmonar. En la solicitud de patente WO2006032216 se reivindica el péptido de tipo LPA identificado en el Listado de Secuencias como Seq ID No. 1; y su uso en el tratamiento de la AR. Por otra parte, la patente EP2374468 describe el uso de dicho péptido en el tratamiento de la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y diabetes mellitus tipo I.

Actualmente, no existen terapias efectivas que provoquen la disminución de los niveles de ACPA, la NETosis y el proceso biológico de citrulinación de proteínas. Tampoco existe una cura eficaz para la artritis autoinmune tales como la AR, la AIJ y la EA, ni para otras enfermedades que también se caracterizan por la citrulinación de sus propias proteínas, como la enfermedad de Alzheimer y la fibrosis hepática y pulmonar. Por tanto, sigue siendo interesante obtener fármacos que ofrezcan ventajas terapéuticas respecto a los fármacos que existen en el tratamiento de este tipo de enfermedades.

Explicación de la invención

La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente, ya que proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de tipo LPA identificado como SEQ ID No. 1, tampón acetato de sodio a pH 3,9-4,7; y al menos un azúcar estabilizante seleccionado:

sacarosa o trehalosa. El péptido identificado como Seq ID No. 1 se deriva de una región de HSP60 humana, comprendida entre los aminoácidos 83 a 109. Los péptidos tipo LPA son similares a los análogos peptídicos inmunogénicos, pero con una o más sustituciones en las posiciones de contacto esenciales con el receptor de células T, o con el complejo principal de histocompatibilidad clase II, que modifica la cascada de eventos necesarios para la activación de las células T. Las concentraciones de este péptido en la composición farmacéutica de la presente invención permiten una respuesta inmunológica eficaz en el huésped.

El péptido de Seq ID No. 1 se produce mediante síntesis química. El nivel y la calidad de la respuesta inmune que induce se pueden evaluar en experimentos como los descritos en la presente invención. En un ejemplo de esta invención el péptido está en una concentración entre 0,5 mg / ml y 10 mg / ml en la composición farmacéutica. El tampón acetato de sodio tiene una concentración entre 30 mM y 70 mM. Por otra parte, en un ejemplo de esta invención el azúcar estabilizante está en el intervalo entre 10 mg/ml y 40 mg/ml.

La composición farmacéutica de esta invención se caracteriza por su alta estabilidad y seguridad. Esto se verificó en los pacientes durante el examen. La composición farmacéutica fue bien tolerada. No se identificaron eventos adversos graves en ningún paciente, no se modificaron parámetros bioquímicos ni hematológicos. Estos resultados fueron inesperados, teniendo en cuenta que el pH de la formulación es de alrededor de 4,0; o distante del pH fisiológico.

En formulaciones similares de otros compuestos, donde el pH está alejado del pH fisiológico, se han observado eventos adversos en el lugar de la inyección, como irritabilidad y dolor. En una modalidad de esta invención, la composición que se administra a los pacientes es líquida o liofilizada.

En la presente invención se revela la capacidad de la formulación farmacéutica que comprende el péptido identificado como Seq ID No. 1, excipiente sacarosa o trehalosa y tampón acetato de sodio a pH entre 3,9 y 4,7, para reducir el porcentaje de neutrófilos, la NETosis y los niveles de ACPA. Estos eventos patogénicos están involucrados en el desarrollo de AR, AIJ, EA, enfermedad de Alzheimer y fibrosis. La composición farmacéutica descrita anteriormente disminuyó significativamente el número de neutrófilos en ensayos ex vivo realizados con células aisladas de pacientes con estas enfermedades.

Sorprendentemente, esta preparación farmacéutica también disminuyó significativamente los niveles de anti-CCP (anti-CCP) del péptido citrulinado cíclico en un grupo de pacientes con AR que se trataron con esta preparación. Además, el péptido disminuyó los niveles de las proteínas S100A9 y S100A8 en ensayos ex vivo, realizados con células mononucleares aisladas de pacientes con AR.

Por tanto, otro aspecto de esta invención es el uso de dicha composición farmacéutica para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria relacionada con un aumento de neutrófilos o citrulinación de proteínas. El uso de estrategias antígeno-específicas que regulen la respuesta inmune exacerbada, con la consiguiente disminución del proceso de citrulinación característico de estas enfermedades, representa un enfoque terapéutico muy novedoso. En una modalidad de la invención, la composición se usa para preparar un medicamento para una enfermedad inflamatoria que se selecciona del grupo que consiste en AR, AIJ, EA, enfermedad de Alzheimer y fibrosis hepática y pulmonar.

Se ha sugerido que el péptido identificado como Seq ID No. 1 podría ser útil para el tratamiento de la AR (Domínguez MC y otros, 2011. Autoimmunity 44 (6): 471-482; Barberá A. y otros, 2016. Cell Stress and Chaperones 21: 735-744). Sin embargo, no hay evidencia que sugiera que una formulación particular de este péptido pueda usarse para el tratamiento de enfermedades inflamatorias en donde la citrulinación de proteínas aumenta y están presentes anticuerpos contra las proteínas citrulinadas.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria relacionada con un aumento de neutrófilos o citrulinación de proteínas. Este método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención. En una modalidad de la invención, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en AR, AIJ, EA, enfermedad de Alzheimer y fibrosis hepática y pulmonar.

La cantidad eficaz de la composición es aquella que, cuando se administra, produce una disminución de los niveles de anticuerpos anti-CCP, anticuerpos NETosis y la consiguiente citrulinación de proteínas en los pacientes. En el transcurso del tratamiento, la cantidad de péptido administrada puede verse modificada, de acuerdo con determinados factores tales como la edad, el sexo, el estado de salud general, así como el nivel de respuesta inmune en general. En otra modalidad de la invención, como parte del método, también se administran a los pacientes fármacos antiinflamatorios o antagonistas de citoquinas. En una modalidad particular, en el método de tratamiento de enfermedades inflamatorias, la composición farmacéutica que comprende el péptido de tipo LPA es líquida o liofilizada, la cual se disuelve para ser administrada.

En una modalidad, la composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral o por vía mucosa. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica del péptido se administra por vía subcutánea. En otra modalidad, la composición farmacéutica se administra por vía oral.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Perfil cromatográfico del péptido de tipo LPA identificado como Seq ID No. 1 disuelto en 50 mM de tampón fosfato de sodio; pH 7,4. El perfil se obtuvo mediante cromatografía de fase reversa (HPLC-FR), (A) tiempo 0, (B) 15 días de almacenamiento a 37 °C.

Figura 2. Evaluación de la solubilidad del péptido identificado como Seq ID No. 1 en varios excipientes, determinada por HPLC-FR.

Figura 3. Cromatografía de exclusión molecular - HPLC del péptido de Seq ID No. 1 disuelto en agua (A), en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (B) y en sacarosa (C).

Figura 4. Efecto del pH sobre la concentración de péptido identificado como Seq ID No. 1, en muestras formuladas y almacenadas a 4 °C (A) y a 37 °C (B).

Figura 5. Efecto del pH sobre la pureza del péptido identificado como Seq ID No. 1, en muestras formuladas y almacenadas a 37 °C.

Figura 6. Efecto de la composición farmacéutica del péptido sobre la viabilidad celular de neutrófilos obtenidos de sangre periférica de pacientes con EA. Las células cultivadas sin estimulación peptídica son el control negativo. Figura 7. Efecto de la administración de una composición farmacéutica de péptido sobre la concentración de anti-CCP en pacientes con AR tratados con el mismo. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el tiempo 0 (sin tratamiento) y los tres tiempos evaluados.

Ejemplos de la descripción detallada

Ejemplo 1. Obtención de una formulación peptídica tipo LPA para el uso en humanos.

El péptido de tipo LPA se obtuvo mediante síntesis química. Se observó que al disolver el péptido identificado como Seq ID No. 1 en 50 mM de tampón fosfato de sodio; pH 7,4, este se desestabiliza progresivamente. Para estudiar las causas de tal efecto, el péptido se disolvió en ese tampón y se almacenó a 37 °C durante 15 días. Posteriormente, se analizaron periódicamente varias alícuotas mediante HPLC-FR. Se verificó la presencia de especies contaminantes, estas se purificaron y se analizaron por espectrometría de masas, y se identificaron varias fracciones que podrían corresponder a degradaciones.

Con el fin de acelerar la degradación, el péptido se incubó en condiciones de estrés que permitieran obtener las posibles especies degradadas del péptido de forma rápida y en altas proporciones. Las fracciones recogidas después de HPLC-FR se caracterizaron mediante espectrometría de masas. En la Figura 1A se muestra el perfil cromatográfico del péptido intacto en tiempo cero. La Figura 1B muestra el perfil del mismo péptido luego de ser incubado durante 15 días a 37 °C, en las condiciones antes mencionadas. Luego del análisis por espectrometría de masas de las fracciones observadas en la Figura 1B, se determinó que las fracciones 1, 2 y 4 corresponden a variantes desamidadas del péptido, mientras que la fracción 3 corresponde al péptido intacto.

El péptido tiene cuatro asparaginas, lo cual explica las especies desamidadas obtenidas, que afectan su estabilidad cuando se disuelven en 50 mM de tampón fosfato de sodio; pH 7,4. Adicionalmente, el péptido es muy poco soluble en este tampón, lo que dificulta la preparación de una formulación farmacéutica que pueda administrarse a los pacientes en la dosis eficaz. Tomando estos resultados, se realizaron estudios de preformulación, para obtener un producto farmacéutico estable que comprenda el péptido. Se evaluaron diferentes especies iónicas, pH y excipientes, para lograr la total solubilidad del péptido y una alta estabilidad química. La solubilidad del péptido se evaluó con diferentes excipientes, los cuales incluyeron diferentes sales iónicas, azúcares, polioles, aminoácidos y detergentes.

La primera etapa del desarrollo de la formulación incluyó la evaluación de la influencia de las especies tampón y el pH en la estabilidad química y física del péptido. Es poco soluble en tampón de fosfato de sodio y muy poco soluble en otras especies iónicas, como el citrato de sodio, el glutamato de sodio y el Tris-HCl. La Figura 2 muestra la solubilidad del péptido en algunos de los excipientes evaluados.

El tampón acetato de sodio, preparado con ácido acético e hidróxido de sodio, fue el que mejor solubilizó el péptido, cuando se evalúan concentraciones de tampón entre 10 y 70 mM.

Por otro lado, la Tabla 1 resume los resultados de la evaluación de la solubilidad del péptido, formulado a concentraciones entre 1 y 10 mg / ml, con diferentes tipos de excipientes farmacéuticamente aceptables. Cabe señalar que la mayor solubilidad del péptido se obtuvo en soluciones de sacarosa o trehalosa, seguidas del tampón de acetato de sodio. Otros excipientes no estabilizaron de la misma forma el péptido en estudio.

T l 1. Ef l x i i n v l r l l ili l i

También se realizó mediante HPLC el análisis del péptido disuelto en agua, en sacarosa (20 mg / ml) y en PBS, que mostró la influencia del azúcar en la estabilidad física del péptido. En PBS el péptido eluyó en un tiempo de retención más corto, en comparación con la muestra disuelta en agua y en solución de sacarosa. Esto indica que PBS puede favorecer las interacciones entre monómeros del péptido, por lo tanto en cromatografía eluye como agregado. Sin embargo, la sacarosa inhibe la interacción entre moléculas del péptido, y este eluye, en su mayoría, como una especie con mayor tiempo de retención, que puede corresponder al monómero de péptido. Este resultado, que se muestra en la Figura 3, corrobora el mejor perfil de solubilidad del péptido obtenido con solución de sacarosa. El péptido disuelto en agua, el cual se usa como control, alcanza también una buena solubilidad. Sin embargo, no constituye una especie tampón, que es necesaria para la formulación del péptido y su uso como fármaco.

A partir de estos resultados, para estudios adicionales se formuló el péptido a 2,5 mg / ml, en tampón de acetato de sodio 50 mM, y se analizó la influencia del pH sobre la estabilidad química y física del péptido en la formulación. Se analizaron tres valores de pH: 3,0; 4,0 y 5,0. Las muestras se filtraron y almacenaron a 4 °C o a 37 °C, durante 15 días. La evaluación de la estabilidad y concentración del péptido se llevó a cabo mediante HPLC-FR. Los resultados de la concentración del péptido almacenado a 4 °C o a 37 °C, respectivamente, se muestran en las Figuras 4A y 4B, respectivamente. El péptido no se disuelve completamente a pH 5,0, por lo que las concentraciones son inferiores a las obtenidas a pH 3,0 o pH 4,0. A 37 °C se acelera el proceso de precipitación. Con el tiempo se observa una disminución en la concentración del péptido en los tres pH estudiados, siendo este efecto mayor en el siguiente orden: pH 5,0 >pH 4,0 > pH 3,0. En estas condiciones analizadas, la estabilidad física del péptido fue mayor a pH 3,0.

La integridad química del péptido (expresada como % de pureza en HPLC-FR) fue superior al 95%, para las muestras formuladas en tres valores de pH, cuando estas se almacenaron a 4 °C, durante 15 días. Sin embargo, cuando las muestras se incubaron a 37 °C, se observó una tendencia a disminuir la pureza, siendo ésta mayor para las muestras formuladas a pH 3,0. Estos resultados se muestran en la Figura 5, los cuales indican que el pH 3,0 favorece la degradación química del péptido.

En correspondencia con estos resultados, se concluyó que la formulación óptima es aquella donde el péptido se encuentra en tampón acetato de sodio, en un intervalo entre 30 mM y 70 mM, a pH alrededor de 4,0. Además, de acuerdo con estos resultados del estudio de solubilidad (Tabla 1), se decidió usar como azúcar estabilizante sacarosa o trehalosa, en una concentración entre 10 y 40 mg / ml, para preparar una composición liofilizada del péptido de tipo LPA en estudio. Estos azúcares estabilizantes fueron esenciales para la completa solubilidad del péptido, y estos azúcares también fueron importantes para el almacenamiento en estado liofilizado, ya que contribuyeron a la estabilidad del péptido.

En la composición descrita, no se detectaron especies moleculares correspondientes a degradaciones del péptido. Esta composición farmacéutica demostró ser un producto consistente durante la fabricación de varios lotes. Esto mostró una estabilidad real de 24 meses almacenado a 4 °C.

Ejemplo 2. Disminución de neutrófilos en ensayos ex vivo realizados con células de pacientes tratados.

Como se mencionó anteriormente, los neutrófilos tienen un papel crucial en la progresión y la cronicidad de varias enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, se estudió el efecto de la composición farmacéutica del péptido de tipo LPA identificado como Seq ID No. 1, que se seleccionó en el Ejemplo 1, sobre la viabilidad de los neutrófilos de los pacientes.

La sangre de los pacientes se diluyó 1: 2 con la solución de dextrano T500 al 3 %, se mezcló mediante inversión repetida de los tubos y se incubó durante 18-20 minutos a temperatura ambiente para la sedimentación de eritrocitos. Se extrajo el estrato superior, rico en leucocitos, y se transfirió a tubos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 500xg, durante 10 minutos a 4 °C. El sedimento celular se resuspendió en 10 ml de PBS libre de iones. Se transfirieron cinco mililitros de esta suspensión celular a tubos de centrífuga de 15 ml, que contenían 3 ml de Ficoll-Paque™ PLUS (Amersham Biosciences AB, Suecia). Estos tubos se centrifugaron a 400 xg, durante 40 minutos, a temperatura ambiente. Después de la centrifugación se observaron cuatro capas, correspondientes a plasma más PBS, células mononucleares de sangre periférica (CMSP), solución de Ficoll-Paque y capa de granulocitos más eritrocitos. Se extrajo la capa correspondiente a los granulocitos. Los eritrocitos restantes se lisaron mediante la adición de agua destilada estéril. Se centrifugó a 500 xg durante 5 minutos a 4 °C. Los neutrófilos se resuspendieron en medio de cultivo RPMI 1640, que contenía suero bovino fetal al 10 % y se suplementaron con gentamicina (100 U / ml) y L-glutamina (2 mM) (Gibco BRL, EE.UU).

Los neutrófilos se sembraron (1*10[2]6[3] células / pocillo) en placas de 96 pocillos (Costar, EE.UU.), en un volumen final de 100 pl, y estimuladas (por triplicado) con la composición seleccionada en el Ejemplo 1, a las siguientes concentraciones de péptido: 10, 40, 80 y 160 pg/ml. La estimulación se llevó a cabo durante 24 h. Se usaron células no estimuladas con dicha composición como control del crecimiento de las células basales. El efecto de la formulación peptídica sobre la viabilidad de las células se determinó con el ensayo de bromuro de 3-[[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazolio (abreviado MTT, Sigma, EE.UU.), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Después de 24 h de cultivo, se añadieron 20 pl / pocillo de MTT, preparado a una concentración de 5 mg/ml en medio de cultivo. Luego las placas se incubaron durante 4 h en las mismas condiciones de cultivo. Al final de este tiempo, se agregaron 100 pl de dimetilsulfóxido y se homogeneizó el contenido de los pocillos. El promedio de densidades ópticas de las células no estimuladas se consideró 100 % de la viabilidad celular. A partir de este valor se calculó la viabilidad de las células cultivadas con formulación peptídica, de acuerdo con las densidades ópticas medias en cada caso.

Como se ve en la Figura 6, fue muy marcada la disminución en la viabilidad celular de los neutrófilos de pacientes con EA, con respecto a las células sin estimulación peptídica. El péptido formulado disminuyó la viabilidad celular hasta en un 35 %, cuando se compara con las células sin estimulación peptídica. Resultados muy similares a estos se encontraron en los experimentos realizados con neutrófilos aislados de pacientes con otras enfermedades inflamatorias (Tabla 2). Estos resultados apoyan el uso de la composición seleccionada de este péptido en el tratamiento de dichas enfermedades, ya que disminuye una población celular implicada en la patogénesis de estas patologías.

Tabla 2. Efecto de la composición farmacéutica del péptido de tipo LPA sobre la viabilidad celular de neutrófilos en pacientes con enfermedades inflamatorias

Sin embargo, cuando se analizaron formulaciones farmacéuticas de péptidos preparadas con otros excipientes, se encontró que el efecto de disminuir la viabilidad celular de los neutrófilos se reducía notablemente. Esto se observa en la Tabla 3. Estas células se aislaron de sangre periférica de pacientes con enfermedades inflamatorias caracterizadas por un aumento en la citrulinación de proteínas, a razón de un paciente por cada enfermedad. Para el aislamiento de estas células en estudio se siguió el protocolo descrito anteriormente.

Tabla 3. Efecto de los excipientes presentes en la formulación del péptido de tipo LPA sobre la viabilidad celular de ________________________ neutrófilos en pacientes con enfermedades inflamatorias_______________________ % inhibición de la viabilidad celular de los neutrófilos en pacientes Excipiente Concentració R IJ ohna brosisb Alzheimer0 Sacarosa o Trehalosa en 10- 40 mg/ml 35 35 30 30 35 Acetato de Sodio * Especies iónicas: 10 mM - 50 5 0 0 0 5 Hidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de sodio Ácido cítrico-citrato desodio10 mM - 50 0 0 0 0 0 Glutamato sódico 10 mM - 50 20 15 15 20 20 Tris-HCl 10 mM - 50 20 20 20 15 20 Cloruro de sodio 5 -15 mg/ml 5 5 5 5 0 Aminoácidos: Glicina 10 - 20 mg/m 10 5 5 10 10 a: Enfermedad de Crohn, b: fibrosis hepática, c: Enfermedad de Alzheimer. *: Composición farmacéutica seleccionada en el Ejemplo 1, que se usa como control del experimento._________________________________

Estos resultados confirman que la formulación del péptido en tampón acetato de sodio (30-70 mM), a pH 3,9-7,7; y sacarosa o trehalosa (10-40 mg/ml) es útil para inducir una disminución en la viabilidad celular de los neutrófilos aislados de pacientes con AR, AIJ, EA, fibrosis y enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 3. Disminución de las proteínas S100A8 y S100A9 y NETosis en ensayos ex vivo con células aisladas de pacientes con AR.

Las muestras se derivaron de tres pacientes femeninas con AR, con 5 años de evolución de la enfermedad y una edad entre 50 a 55 años.

En el momento de la extracción de sangre, los pacientes presentaban una actividad moderada de la enfermedad, de acuerdo con el índice clínico DAS28 (puntuación de actividad de la enfermedad), el cual es un índice de actividad de la enfermedad conocido por los expertos en esta rama de la medicina. (PL Van Riel y J. Fransen, 2005. Arthritis Res Ther 7: 189-190).

La sangre de los pacientes se diluyó 1: 2 con una solución tampón de fosfato. Se realizó aislamiento de células mononucleares, con un gradiente de Ficoll. Las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10 %. Se cultivaron diez millones de células a 37 °C en una atmósfera húmeda de 5 % de CO2, con el péptido formulado (a 40 pg/ml) como se procedió en el Ejemplo 1, durante 24 horas o 5 días. Además, se cultivaron células no estimuladas con el péptido, que constituían los controles de los experimentos.

Luego del cultivo, las células se trataron con una solución salina rica en detergentes, proteasas y con isótopo de oxígeno 18, para provocar la ruptura de la membrana plasmática y el marcaje de las proteínas. Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas LC / MS / MS, realizando 18 corridas para cada muestra.

Posteriormente se realizó la interpretación biológica de los resultados, para lo cual se determinaron las proteínas que cambiaron significativamente en cada cultivo celular, tanto a las 24 horas como a los 5 días de incubación con la composición farmacéutica que comprende el péptido. Todas las proteínas se caracterizaron en cuanto a su función biológica, sus posibles modificaciones postraduccionales y su relación con las enfermedades. Con el uso de la lista total de proteínas que cambiaron significativamente, se realizaron análisis de enriquecimiento por vías metabólicas, por procesos moleculares, por redes de interacción y por enfermedades. Este procedimiento también se aplicó a muestras de cada paciente de forma independiente, comparando los resultados con los dos tiempos del estudio y con el análisis global.

Por otro lado, se seleccionaron aquellas proteínas identificadas que tuvieron el mismo comportamiento en al menos dos de los pacientes estudiados, o en las muestras de ambos tiempos de estudio en un solo paciente. Con esta nueva lista de proteínas, se realizó minería de textos para identificar aquellas que estaban directamente relacionadas con la enfermedad. Las proteínas identificadas con esta estrategia se estudiaron en términos de sus funciones y su calidad como biomarcador de enfermedades.

El análisis de enriquecimiento se realizó mediante mapas, rutas metabólicas y procesos biológicos, comparando todos los experimentos entre sí (cada paciente, células evaluadas a las 24 horas y a los 5 días). Entre los mapas o rutas biológicas más representadas se encuentran la NETosis y las relacionadas con la respuesta al daño en el ácido desoxirribonucleico. Cuando se analizaron las proteínas identificadas en los tres pacientes, se encontraron como proteínas relevantes S100A8 y S100A9.

Estas proteínas disminuyeron en las células de tres pacientes, cuando éstas se cultivaron con una composición farmacéutica que comprende el péptido, tanto durante 24 horas como durante 5 días, en comparación con las células sin estimulación peptídica. Dicha composición farmacéutica también disminuyó notablemente la NETosis. Las proteínas S100A8 y S100A9 están presentes en los neutrófilos, donde constituyen el 40 % de las proteínas del citosol, pero también están presentes en los monocitos. Sin embargo, la NETosis es un proceso particularmente asociado con los neutrófilos. Este último punto puede explicarse por el hecho de que es probable que el anillo de células mononucleares aislado de los pacientes estuviera contaminado con neutrófilos. Este es un hecho muy probable, considerando que en los tres pacientes se encontró una actividad moderada de la enfermedad, donde el número de neutrófilos está aumentado.

Por otro lado, estos resultados sugieren que la referida composición farmacéutica, que comprende péptido de tipo LPA y excipientes seleccionados, puede contribuir a disminuir la citrulinación de proteínas características de diversas enfermedades tales como la artritis autoinmune, la fibrosis y la enfermedad de Alzheimer. La citrulinación es un proceso que favorece el desarrollo de estas patologías, y precisamente los productos que se liberan al medio extracelular durante la NETosis son precursores de la citrulinación.

Ejemplo 4. Disminución de los niveles de anticuerpos anti-CCP en pacientes con AR tratados con una composición que comprende el péptido de tipo LPA.

Muestras de sangre analizadas derivadas de pacientes con AR, incluidas en un ensayo clínico de fase I. A los pacientes se les inoculó una composición que comprendía el péptido de tipo LPA identificado como Seq. ID Núm. 1, que se describió en el Ejemplo 1. Al momento de la inclusión, los pacientes presentaban actividad moderada de la enfermedad, de acuerdo con el índice clínico DAS28.

El ensayo clínico se estructuró en tres niveles de dosis de péptido: 1 mg, 2,5 mg y 5 mg.

Los pacientes se trataron con la composición farmacéutica de péptido durante seis meses.

Ellos recibieron nueve administraciones de dicha formulación, por vía subcutánea, divididas en una dosis semanal durante el primer mes, y una dosis mensual durante cinco meses.

Se realizó un seguimiento de los pacientes para la detección de eventos adversos. La composición farmacéutica del péptido de tipo LPA administrada fue bien tolerada por todos los pacientes. No se identificaron eventos adversos graves en ningún paciente y no se modificaron parámetros bioquímicos o hematológicos. Estos resultados fueron sorprendentes, tomando en consideración que el pH de la formulación es alrededor de 4,0; este está lejos del pH fisiológico. En estudios previos de otros autores se ha reportado daño local en el sitio de administración, cuando el pH de la formulación administrada estaba alejado del pH fisiológico.

Además, se cuantificó la concentración de anticuerpos anti-CCP en el plasma de los pacientes, mediante un ensayo comercial tipo ELISA. Este ELISA permite la determinación de anticuerpos contra cuatro antígenos: Vimentina, Colágeno tipo II, Fibrinógeno y a-enolasa. Los resultados se expresaron en pg/ml y se analizaron con el programa estadístico GraphPad Prism. Se aplicó la prueba T para comparar los tiempos evaluados con respecto al tiempo cero.

Sorprendentemente, como se ve en la Figura 7, el tratamiento con una formulación peptídica de tipo LPA seleccionada indujo una disminución significativa en la concentración de anticuerpos anti-CCP en el plasma de los pacientes tratados, con respecto al tiempo cero (p<0,05). Las muestras de pacientes correspondieron a 13, 25 y 48 semanas de tratamiento. Estos resultados demostraron un efecto terapéutico de esta formulación, ya que los anticuerpos anti-CCP contribuyen a la patogénesis de la AR y otras enfermedades inflamatorias como la AIJ, la EA, la enfermedad de Alzheimer y la fibrosis hepática y pulmonar. Por otro lado, los resultados indican que dicha composición farmacéutica, la cual comprende el péptido de tipo LPA, puede contribuir a disminuir el proceso de citrulinación de las autoproteínas, característico de las enfermedades mencionadas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de tipo LPA identificado como SEQ ID No. 1, tampón de acetato de sodio a pH 3,9-4,7; y al menos un azúcar estabilizante seleccionado de sacarosa y trehalosa.

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el péptido está en una concentración entre 0,5 mg/ml y 10 mg / ml.

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el tampón de acetato de sodio tiene una concentración entre 30 mM y 70 mM.

4. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el azúcar estabilizante está en el intervalo entre 10 mg / ml y 40 mg/ml.

5. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la cual se encuentra en forma líquida o es el producto de la resuspensión de un liofilizado.

6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para el uso como un medicamento.

7. Composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha composición es para el uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria relacionada con un aumento de neutrófilos o citrulinación de proteínas; y en donde la enfermedad inflamatoria se selecciona de un grupo que consiste en artritis reumatoide (AR), artritis idiopática juvenil (AIJ), espondilitis anquilosante (EA), enfermedad de Alzheimer y fibrosis hepática o pulmonar.