ES2704155T3 - Método de transfección de células - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, método que comprende: (i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de 5 un embrión aviar, en donde (a) el polinucleótido comprende un transposón y la mezcla de transfección comprende una transposasa o un polinucleótido que codifica una transposasa; o (b) la mezcla de transfección comprende una nucleasa dirigida, o un polinucleótido que codifica una nucleasa dirigida; y mediante lo cual el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales primordiales en el ave, e (ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle en un polluelo.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de transfección de células
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para transfectar células. En particular, la presente invención se refiere a métodos para transfectar células germinales primordiales en aves.
Antecedentes
El desarrollo de una técnica eficiente para desarrollar aves transgénicas o modificadas genéticamente tiene una gran importancia para las industrias tanto agrícola como biofarmacéutica, así como para incrementar nuestra comprensión de la biología aviar a través de estudios genómicos funcionales. La producción de aves de corral jugará un papel importante para garantizar la seguridad alimentaria para el planeta a la vista del crecimiento de la población, y los avances modernos en biotecnología, tal como el desarrollo de aves de corral transgénicas ayudará a que la industria satisfaga la demanda de la población creciente.
Más específicamente, la aplicación de la tecnología transgénica para modificar rasgos en las aves de corral, algo que no es posible con la cría convencional, tal como resistencia a enfermedades y modulación de la determinación sexual, será ahora posible y proporcionará beneficios importantes para la industria de las aves de corral. La demanda de proteínas biofarmacéuticas está creciendo rápidamente y hasta hace poco se han usado sistemas de producción basados en células in vitro para producir nuevas proteínas recombinantes para el tratamiento de enfermedades. Ahora, se está desarrollando el uso de ganado transgénico como biorreactores para la producción de proteínas recombinantes como una alternativa importante a los sistemas basados en células que son costosos y laboriosos. El desarrollo de la tecnología transgénica para los pollos ha permitido el desarrollo del huevo como un biorreactor para conseguir altos niveles de producción y purificación de proteínas biofarmacéuticas.
También se han hecho intentos para introducir genes extraños seleccionados clonándolos en un vector de retrovirus (p. ej., virus reticuloendotelial o virus de la leucosis aviar), inyectando el virus recombinante en huevos fértiles, permitiendo que el virus infecte el embrión en desarrollo (p. ej., células germinales primordiales), creando de esta manera una gónada u óvulo quimérico, y usando el recombinante resultante para intentar introducir un gen extraño en la progenie. Sin embargo, la industria de las aves de corral ha sido reticente a usar comercialmente esta tecnología ya que el virus (en su estado natural) es un patógeno, incluso los vectores de virus competentes para la replicación variantes pueden, a veces, inducir tumores, y las variantes incompetentes para la replicación requieren dosificaciones altas o repetidas. También, incluso las construcciones de virus defectivas para la replicación pueden presentar algún riesgo de recombinarse con la cubierta de virus endógenos y convertirse en competentes para la replicación. Además, estos vectores están limitados actualmente a insertos de ADN con un tamaño relativamente pequeño (p. ej., dos quilobases o menos).
También ha habido intentos para inyectar ADN extraño en el óvulo fertilizado no desarrollado después de su retirada quirúrgica de la gallina. Sin embargo, esta estrategia requirió la incubación del embrión en desarrollo en una serie de contenedores sustitutos. Además, requirió gallinerías ponedoras especializadas y una gran práctica para obtener las habilidades quirúrgicas y técnicas necesarias.
Una estrategia alternativa implica la inyección de células embrionarias o células germinales primordiales (CGP) modificadas genéticamente en un embrión receptor poco después de la puesta. En esta estrategia, se crearon cultivos de CGP que retenían su capacidad de diferenciarse en óvulos funcionales o células productoras de espermatozoides cuando se incorporaban en el embrión en desarrollo. Los cultivos de CGP de este tipo pueden modificarse genéticamente y después inyectarse en los embriones receptores. Los embriones receptores se habrán modificado típicamente por irradiación gamma para debilitar a las células germinales primordiales endógenas, de manera que se proporciona una ventaja de selección a las células inyectadas en su direccionamiento a la cresta gonadal. Las células modificadas madurarán entonces y producirán espermatozoides u óvulos capaces de transmitir el transgén al menos a la siguiente generación. Esta técnica es larga, sin embargo, ya que requiere la retirada de las CGP de un embrión donante, y su cultivo y reintroducción posterior en un embrión receptor. Además, la eficiencia con la pueden obtenerse aves que comprenden CGP modificadas genéticamente usando esta técnica es baja.
De acuerdo con esto, permanece una necesidad de métodos para modificar genéticamente células germinales primordiales aviares.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han encontrado que la inyección directa de reactivos de transfección mezclados con ADN en la sangre de embriones aviares en desarrollo tiene como resultado la introducción del ADN en las células germinales primordiales (CGP) y la inserción del ADN en el genoma del ave.
De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un método para producir un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, método que comprende:
(i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de un embrión aviar,
en donde: (a) el polinucleótido comprende un transposón y la mezcla de transfección comprende una transposasa o un polinucleótido que codifica una transposasa; o
(b) la mezcla de transfección comprende una nucleasa dirigida, o un polinucleótido que codifica una nucleasa dirigida; y
mediante lo cual el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales del ave; e
(ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle en un polluelo.
La mezcla de transfección se inyecta preferiblemente en el embrión aviar en el momento de la migración de las CGP aproximadamente en los Estadios 12-17. En una realización preferida, la mezcla de transfección se inyecta en el embrión aviar en los Estadios 13-14.
Aunque puede usarse cualquier reactivo de transfección adecuado en los métodos de la invención, preferiblemente el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico.
En una realización, el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico monovalente seleccionado de uno o más de DOTMA (cloruro de N-[1-(2.3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetil amonio), DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-3-(trimetilamonio)propano), DMRIE (bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi etil amonio) y DDAB (bromuro de dimetil dioctadecil amonio).
En otra realización, el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico polivalente seleccionado de uno o más de DOSPA (trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio) y DOSPER (1,3-dioleoiloxi-2-(6carboxi espermil)-propil-amida, TMTPS (tetrametiltetrapalmitoil espermina), TMTo S (tetrametiltetraoleil espermina), TMTLS (tetrametiltetralauril espermina), TMTMS (tetrametiltetramiristil espermina) y TMDOS (tetrametildioleil espermina).
En otra realización más, el reactivo de transfección comprende DOSPA (trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio).
En otra realización, el reactivo de transfección comprende además un lípido neutro. El lípido neutro puede comprender, por ejemplo, (DOPE) dioleoil fosfatidiletanolamina, DPhPE (difitanoilfosfatidiletanolamina) o colesterol.
En una realización particular, el reactivo de transfección comprende una mezcla 3:1 (p/p) de DOSPA y DOPE antes de mezclar el reactivo de transfección con el polinucleótido.
Ventajosamente, los métodos de la presente invención son adecuados para el uso de métodos no retrovirales para introducir un polinucleótido en el genoma de una célula germinal. Así, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un transposón o nucleasa de dedo de cinc.
En una realización particular, la mezcla de transfección comprende un polinucleótido que codifica una transposasa. La transposasa puede estar codificada por ADN tal como en un plásmido, o, alternativamente, el polinucleótido que codifica la transposasa es ARN.
En una realización específica, el transposón se selecciona de Tol2, mini-Tol2, Sleeping Beauty y PiggyBac.
En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una nucleasa de dedo de cinc.
Aunque las células germinales que se modifican genéticamente en el ave pueden ser células germinales embrionarias, preferiblemente las células son células germinales primordiales.
En una realización, la mezcla de inyección se inyecta en el embrión en la cáscara de huevo en la que se desarrolla el embrión.
El polinucleótido en la mezcla de transfección puede ser una molécula de ARN o molécula de ADN que codifica un polipéptido, o una molécula de ADN que codifica un ARN que comprende una región bicatenaria. En una realización particular, el polinucleótido codifica una molécula de ARN que comprende una región bicatenaria. La molécula de ARN puede ser, por ejemplo, un ARNsi, ARNsh o ARN señuelo.
En otra realización, el polinucleótido codifica un polipéptido.
En una realización, la molécula de ARN o polipéptido reduce la replicación de un virus en una célula comparado con una célula que carece de la molécula de ARN o polipéptido.
Los métodos de la invención pueden usarse para tomar como diana cualquier patógeno viral de un ave. En una realización, el virus es el virus influenza.
También se describe un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, en donde el ave se produce por el método de la invención.
También se describe una célula germinal modificada genéticamente del ave de la invención, en donde la célula germinal comprende el polinucleótido insertado en el genoma.
También se describen espermas producidos por el ave que comprenden células modificadas genéticamente de la invención.
También se describe un huevo producido por el ave que comprende células modificadas genéticamente de la invención.
También se describe un método para modificar genéticamente células germinales en un ave, método que comprende (i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de un embrión aviar contenido en un huevo, e
(ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para permitir que el embrión se desarrolle en un polluelo, en donde el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales en el ave.
En realizaciones adicionales, el método comprende una o más de las características de la invención como se describe en la presente memoria.
También se describe un método para producir un ave modificada genéticamente, método que comprende:
(i) obtener el ave que comprende células germinales modificadas genéticamente de la invención,
(ii) criar a partir del ave que comprende células germinales modificadas genéticamente para producir progenie, y (iii) seleccionar la progenie que comprende el polinucleótido insertado en el genoma.
También se describe un método para producir alimento, método que comprende:
(i) obtener el ave que comprende células germinales modificadas genéticamente de la invención o el ave modificada genéticamente de la invención, y
(ii) producir alimento a partir del ave.
En un caso, el método comprende recoger carne y/o huevos del ave.
También se describe un método para criar un ave modificada genéticamente, método que comprende
(i) llevar a cabo el método de la invención para producir un polluelo o progenie,
(ii) permitir que el polluelo o la progenie se desarrolle en un ave sexualmente madura, y
(iii) criar a partir del ave sexualmente madura para producir un ave modificado genéticamente.
También se describe un método para modular un rasgo en un ave, método que comprende
(i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de un embrión aviar, mediante lo cual el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales en el ave e
(ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para permitir que el embrión se desarrolle en un polluelo, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido o molécula de ARN que comprende una región bicatenaria que modula un rasgo en el ave.
En un caso, la molécula de ARN comprende un ARNsi, ARNsh o ARN señuelo.
En un caso, el rasgo se selecciona de masa muscular, sexo, contenido nutricional y/o resistencia a enfermedad. También se describe un método para incrementar la resistencia de un ave a un virus, método que comprende llevar a cabo el método de la invención, en donde el polinucleótido es un ARNsi, ARNsh o ARN señuelo que reduce la replicación del virus en una célula, o el polinucleótido codifica un péptido antiviral que reduce la replicación del virus en una célula.
En un caso particular, el virus es el virus influenza.
En algunas realizaciones de la invención, el ave se selecciona de un pollo, pato, pavo, ganso, gallo bantam o codorniz.
En otra realización de los métodos de la invención, la mezcla de transfección comprende además una nucleasa dirigida, o un polinucleótido que codifica una nucleasa dirigida, para facilitar la integración del polinucleótido en el genoma de la célula germinal. Por ejemplo, la nucleasa dirigida puede seleccionarse de una Nucleasa de Dedo de Cinc, TALEN y CRISPR.
Una realización de la presente memoria es un método para producir un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, método que comprende:
(i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de un embrión aviar, mediante lo cual el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales en el ave, e
(ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle en un polluelo,
en donde el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico, el polinucleótido comprende además una secuencia que codifica un transposón, y la mezcla de transfección se inyecta en el vaso sanguíneo del embrión aviar en los Estadios 13-14.
En una realización, el reactivo de transfección comprende Lipofectamina 2000 o una mezcla 3:1 (p/p) de DOSPA y DOPE antes de mezclar el reactivo de transfección con el polinucleótido, el transposón es Tol2 o mini-Tol2, y la mezcla de transfección comprende un polinucleótido que codifica la transposasa Tol2.
Una realización de la presente memoria es un método para producir un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, método que comprende:
(i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de un embrión aviar, mediante lo cual el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales en el ave, e
(ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle en un polluelo,
en donde el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico y un lípido neutro, el polinucleótido comprende además una secuencia que codifica una nucleasa de dedo de cinc, y la mezcla de transfección se inyecta en el vaso sanguíneo del embrión aviar en los Estadios 13-14.
En una realización, el reactivo de transfección comprende Lipofectamina 2000 o una mezcla 3:1 (p/p) de DOSPA y DOPE antes de mezclar el reactivo de transfección con el polinucleótido.
Como será evidente, los rasgos y características preferidos de un aspecto de la invención son aplicables a muchos otros aspectos de la invención.
A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.
La invención se describe a continuación en la presente memoria mediante los siguientes Ejemplos no limitativos y con referencia a las figuras adjuntas.
Descripción breve de los dibujos
Figura 1. Inyección directa de ADN que codifica EGFP formando un complejo con Lipofectamina 2000 en embriones aviares. Imágenes fluorescentes (lado izquierdo) y de campo brillante concordantes (lado derecho) de gónadas tomadas de embriones en el Día 7.
Figura 2. Imágenes de inyección directa de ADN que codifica EGFP formando un complejo con Lipofectamina 2000 en embriones aviares en el Día 14. Imágenes fluorescentes (lado derecho) y de campo brillante concordantes (lado izquierdo) de gónadas tomadas de embriones en el Día 14. La última imagen fluorescente es un primer plano de la agrupación de la izquierda de células verdes en un embrión. Esta región se retiró por disección del resto de la gónada para la tinción con el homólogo de vasa en pollos (cvh). Una pequeña sección del resto de la gónada se usó como un control negativo.
Figura 3. Inyección directa de ADN que codifica EGFP formando un complejo con Lipofectamina 2000 en embriones aviares. Tinción de células para el marcador de CGP cvh. Tinción con DAPI que muestra material nuclear y tinción de todas las células. cvh, un marcador específico de CGP, ha teñido una subpoblación de células (células de color gris más claro). Las células transformadas que han recibido el transposón a través de inyección directa y se tiñeron de verde se indican con flechas.
Figura 4. Confirmación de la optimización in vitro por Inyección Directa en embriones aviares. Expresión de EGFP en las gónadas de embriones en el Día 14.
Figura 5. Inyección directa de ADN que codifica EGFP y una construcción con múltiples cargas útiles que comprende múltiples secuencias que codifican ARNsh formando un complejo con Lipofectamina 2000 en embriones de pollo para engorde. Imágenes fluorescentes de gónadas en el Día 12.
Figura 6. Inyección directa de ADN que codifica EGFP, una construcción con múltiples cargas útiles y construcción en horquilla extendida formando un complejo con Lipofectamina 2000 en embriones de pollo para engorde. Imágenes fluorescentes de gónadas de embriones en el Día 14 después de la Inyección Directa.
Figura 7. Inyección directa de la construcción Tol2-EGFP con cada uno de dos casetes de expresión de ARNsh múltiples (pMAT084 y pMAT085). Imágenes de 10 gónadas tomadas en el Día 14 que muestran la expresión de EGFP.
Figura 8. Electroforesis en gel de productos de PCR de cribado que indican la integración del ARNsh PB en los embriones sometidos a inyección directa. Se extrajo ADN de una muestra enriquecida en CGP de los embriones tratados con ZFN, así como de embriones control a los 5 días después de la inyección directa con ZFN y un plásmido de reparación (que contenía el ARNsh PB). Se realizó entonces una PCR de cribado para detectar la integración del ARNsh PB en el genoma. El carril 1 muestra los embriones a los que se inyectó PB, el carril 2 los embriones control, el carril 3 células tratadas con ZFN (control positivo) y el carril 4 es un control de agua.
Claves para el listado de secuencias
SEQ ID NO:1 - Secuencia de polinucleótido de la construcción Tol2 EGFP
SEQ ID NO:2 - Secuencia de aminoácidos de la transposasa Tol2
SEQ ID NO:3 - Cebador oligonucleotídico Cribado 7
SEQ ID NO:4 - Cebador oligonucleotídico Cribado 6
SEQ ID NO:5 - Cebador oligonucleotídico directo de miniTol2
SEQ ID NO:6 - Cebador oligonucleotídico inverso de miniTol2
SEQ ID NO:7 - Sonda de detección de miniTol2
SEQ ID NO:8 - Cebador directo de la región genómica control
SEQ ID NO:9 - Cebador inverso de la región genómica control
SEQ ID NO:10 - Sonda de la región genómica control
Descripción detallada
Técnicas y definiciones generales
A no ser que se defina específicamente otra cosa, debe entenderse que todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica (p. ej., en química de proteínas, bioquímica, cultivo celular, genética molecular, microbiología, e inmunología).
A no ser que se indique otra cosa, las técnicas de ADN y proteínas recombinantes, cultivo celular, e inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, muy conocidos para los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican en la bibliografía, en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3a edn, Springer (1994), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente).
El término "ave", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier especie, subespecie o raza de organismo de la Clase taxonómica Aves, tal como, pero no limitado a, organismos tales como pollo, pavo, pato, ganso, codorniz, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos y rátidas incluyendo avestruz, emú y casuario. El término incluye las varias cepas conocidas de Gallus gallus (pollos), por ejemplo, Leghorn Blanco, Leghorn Marrón, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Cornualles, Menorca, Amrox, California Gris, perdiz italiana coloreada, así como cepas de pavos, faisanes, codornices, pato, avestruces y otras aves de corral criadas comúnmente en cantidades comerciales.
El término "aves de corral" incluye todas las aves mantenidas, recogidas, o domesticadas para carne o huevos, por ejemplo, pollo, pavo, avestruz, gallina silvestre, pichón, gallina de Guinea, faisán, codorniz, pato, ganso, y emú.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "ave modificada genéticamente" o "ave transgénica" se refiere a cualquier ave en la que una o más de las células del ave contienen ácido nucleico heterólogo introducido mediante la intervención humana.
Técnica de inyección directa
La línea germinal en pollos se inicia como células del epiblasto de un ingreso de embrión en Estadio X en el hipoblasto naciente (Kagami et al., 1997; y Petitte, 2002). Al progresar el hipoblasto anteriormente, las pre-células germinales primordiales son llevadas al creciente germinal donde pueden identificarse como células grandes ricas en glucógeno. La identificación más temprana de células en la línea germinal por estos criterios morfológicos se produce aproximadamente 8 horas después del comienzo de la incubación (Estadio 4 usando el sistema de estadificación establecido por Hamburger y Hamilton, (1951)). Las células germinales primordiales residen en el creciente germinal desde el Estadio 4 hasta que migran a través de la vasculatura durante el Estadio 12-17. En ese momento, las células germinales primordiales son una pequeña población de aproximadamente 200 células. Desde la vasculatura, las células germinales primordiales migran a la cresta genital y se incorporan en el ovario o testículos al diferenciarse las gónadas.
Se han generado previamente pollos quiméricos en su línea germinal por el trasplante de CGP donantes y células germinales gonadales de varios estadios del desarrollo (blastodermo hasta embrión de 20 días) en embriones receptores. También se han descrito métodos para obtener pollos transgénicos a partir de cultivos a largo plazo de células germinales primordiales (CGP) aviares, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060206952. Cuando se combinan con un embrión aviar huésped por procedimientos conocidos, estas CGP modificadas se transmiten a través de la línea germinal para rendir descendencia modificada genéticamente.
A diferencia de los métodos de la técnica anterior usados comúnmente que se basan en recoger las CGP de embriones donantes, los métodos de la presente invención implican la inyección directa de una mezcla de transfección en un embrión aviar. Así, los métodos de la invención pueden usarse para transfectar células germinales aviares incluyendo CGP y células germinales embrionarias.
Mezcla de transfección
En los métodos de la presente invención, un polinucleótido forma un complejo o se mezcla con un reactivo de transfección adecuado. El término "reactivo de transfección", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una composición añadida al polinucleótido para aumentar la captación del polinucleótido en una célula eucariota incluyendo, pero no limitado a, una célula aviar, tal como una célula germinal primordial. Aunque puede usarse cualquier reactivo de transfección que se sabe en la técnica que es adecuado para transfectar células eucariotas, los presentes inventores han encontrado que los reactivos de transfección que comprenden un lípido catiónico son particularmente útiles en los métodos de la presente invención. Así, en una realización preferida, se seleccionan lípidos catiónicos monovalentes de uno o más de DOTMA (cloruro de N-[1-(2.3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetil amonio), DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-3-(trimetilamonio)propano), DMRIE (bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi etil amonio) o DDAB (bromuro de dimetil dioctadecil amonio). Los lípidos catiónicos polivalentes preferidos son lipoesperminas, específicamente DOSPA (trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio) y DOSPER (1,3-dioleoiloxi-2-(6carboxiespermil)-propil-amida, y las di- y tetra-alquil-tetra-metil esperminas, incluyendo pero no limitado a, TMTPS (tetrametiltetrapalmitoil espermina), TMTOS (tetrametiltetraoleil espermina), TMTLS (tetrametiltetralauril espermina), TMTMS (tetrametiltetramiristil espermina) y TMDOS (tetrametildioleil espermina). Los lípidos catiónicos se combinan opcionalmente con lípidos no catiónicos, particularmente lípidos neutros, por ejemplo, lípidos tales como DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina), DPhPE (difitanoilfosfatidiletanolamina) o colesterol. Una composición de lípido catiónico compuesta por una mezcla 3:1 (p/p) de DOSPA y DOPE o una mezcla 1:1 (p/p) de DOTMA y DOPE es generalmente útil en los métodos de la invención. Los ejemplos no limitativos de reactivos de transfección adecuados disponibles comercialmente que comprenden lípidos catiónicos incluyen Lipofectamina (Life Technologies) y Lipofectamina 2000 (Life Technologies).
En general, cualquier dendrímero que puede emplearse para introducir ácido nucleico en cualquier célula, particularmente en una célula eucariota, es útil en los métodos de esta invención. Se prefieren los dendrímeros de generación 5 o mayor (G5 o mayor), siendo particularmente interesantes los de la generación entre G5-G10. Los dendrímeros que pueden ser útiles en la invención incluyen aquellos con núcleos de NH3 o etilendiamina, GX(NH3) o GX(EDA), donde X=el número de generación. Se prefieren los dendrímeros en los que X=5-10. Los dendrímeros que pueden ser útiles en la invención incluyen aquellos en los que la unidad repetitiva de las capas internas es una amidoamina (para formar poliamidoaminas, es decir, PAMAM). Los dendrímeros útiles incluyen aquellos en los que los grupos funcionales terminales en la superficie externa del dendrímero proporcionan una densidad de carga positiva, p. ej., como con grupos funcionales amina terminales. La carga superficial y la naturaleza química de la superficie externa del dendrímero pueden variarse cambiando los grupos funcionales en la superficie, por ejemplo, por reacción de algunos o todos los grupos amina de la superficie. Son particularmente interesantes los dendrímeros que están funcionalizados por reacción con aminoácidos catiónicos, tales como lisina o arginina. Pueden emplearse en los métodos de esta invención dendrímeros injertados como se describe, por ejemplo, en las solicitudes PCT WO 9622321 y WO9631549 y se indica en la Pat. U.S. No. 5,266,106. También pueden emplearse en los métodos de la invención dendrímeros activados (Haensler y Szoka, 1993; y Tang et al., 1996).
El reactivo de transfección puede comprender además secuencias peptídicas de proteínas virales, bacterianas o animales y otras fuentes, incluyendo péptidos, proteínas o fragmentos o partes de las mismas que puedan aumentar la eficiencia de la transfección de células eucariotas mediada por agentes de transfección, incluyendo lípidos catiónicos y dendrímeros. Dichos péptidos se describen en US 20030069173 e incluyen, por ejemplo, péptidos o proteínas virales del virus influenza, adenovirus, virus del bosque de Semliki, VIH, hepatitis, virus del herpes simple, virus de la estomatitis vesicular o virus de simio 40 y más específicamente una secuencia peptídica RGD, una secuencia peptídica NLS y/o una secuencia peptídica VSVG y péptidos o proteínas modificados de cada uno de los anteriores.
El polinucleótido puede mezclarse (o "formar un complejo") con el reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante o protocolos conocidos. Como ejemplo, cuando se transfecta ADN plasmídico con el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies), el ADN puede diluirse en 50 pl de medio Opit-MEM y mezclarse suavemente. El reactivo Lipofectamina 2000 se mezcla suavemente y se diluye una cantidad apropiada en 50 pl de medio OptiMEM. Después de una incubación de 5 minutos, el ADN diluido y el reactivo de transfección se combinan y se mezclan suavemente a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Un volumen adecuado de la mezcla de transfección puede inyectarse directamente en un embrión aviar según el método de la invención. Típicamente, un volumen adecuado para la inyección en un embrión aviar es aproximadamente 1 pl a aproximadamente 3 pl, aunque los volúmenes adecuados pueden ser determinados por factores tales como el estadio del embrión y la especie de ave a la que se está inyectando. El experto en la técnica apreciará que los protocolos para mezclar el reactivo de transfección y el ADN, así como el volumen que se va a inyectar en el embrión aviar, pueden optimizarse a la vista de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.
Inyección en el embrión
Antes de la inyección, los huevos se incuban a una temperatura adecuada para el desarrollo embrionario, por ejemplo, alrededor de 37.5 a 38 °C, con el extremo puntiagudo (taglion) hacia arriba durante aproximadamente 2.5 días (Estadios 12-17), o hasta el momento en el que los vasos sanguíneos en el embrión tienen un tamaño suficiente como para permitir la inyección. El tiempo óptimo para la inyección de la mezcla de transfección es el momento de la migración de las CGP que típicamente ocurre alrededor de los Estadios 12-17, pero más preferiblemente en los Estadios 13-14. Como apreciará el experto en la técnica, los pollos para engorde tienen típicamente embriones con un crecimiento más rápido, y de esta manera la inyección debería ocurrir preferiblemente más temprano en los Estadios 13-14 de manera que la mezcla de transfección se introduce en la corriente sanguínea en el momento de la migración de las CGP.
Para acceder a un vaso sanguíneo del embrión aviar, se hace un agujero en la cáscara del huevo. Por ejemplo, puede hacerse un agujero de aproximadamente 10 mm en el extremo puntiagudo del huevo usando un implemento adecuado tal como fórceps. La sección de la cáscara y las membranas asociadas se retiran cuidadosamente para evitar dañar el embrión y sus membranas.
Pueden usarse micropipetas compuestas por tubos capilares de vidrio siliconizado para inyectar la mezcla de transfección en el vaso sanguíneo del embrión aviar. Típicamente, las micropipetas se succionan o "tiran" con un tirador de micropipetas y las puntas se biselan con la ayuda de una esmeriladora de pipeta hasta un diámetro (apertura interna) de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 50 pm de diámetro, más preferiblemente alrededor de 25 pm a alrededor de 30 pm de diámetro. Las micropipetas se esmerilan típicamente hasta un diámetro de alrededor de 25 pm a alrededor de 30 pm para facilitar la inyección de las CGP en un embrión aviar. El experto en la técnica apreciará que puede usarse un diámetro más estrecho en los métodos de la presente invención ya que la mezcla de transfección no comprende células. Una micropipeta producida de esta manera también se refiere como un "capilar de vidrio estirado".
Un capilar de vidrio estirado se carga con aproximadamente 1 -3 pl del complejo de transfección. La inyección se hace en cualquier vaso sanguíneo con un tamaño suficiente como para acomodar el capilar, tal como la vena marginal o la aorta dorsal, o cualquier otro vaso sanguíneo con un tamaño suficiente como para recibir el capilar. Puede usarse presión de aire para expeler el complejo de transfección desde el capilar al vaso sanguíneo.
Después de la inyección de la mezcla de transfección en el vaso sanguíneo del embrión aviar, el huevo se sella usando una cantidad suficiente de parafilm, u otra película sellante adecuada como se conoce en la técnica. Por ejemplo, cuando se ha hecho un agujero de 10 mm en la cáscara, puede usarse una pieza cuadrada de aproximadamente 20 mm de parafilm para cubrir el agujero. Puede usarse entonces una hoja de escalpelo templada para fijar el parafilm a la superficie externa del huevo. Los huevos se dan la vuelta entonces hacia la posición del extremo puntiagudo hacia abajo y se incuban a una temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle, tal como hasta un análisis posterior o eclosión.
Tal y como se usa en la presente memoria, las expresiones "temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle" y "temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle en un polluelo" se refieren a las temperaturas de incubación que se requieren para que un embrión aviar continúe desarrollándose en el huevo y preferiblemente se desarrolle en un polluelo que está listo para eclosionar. Los expertos en la técnica pueden determinar las temperaturas de incubación adecuadas. Por ejemplo, un huevo de pollo se incuba típicamente a aproximadamente 35.8 a aproximadamente 38 °C. Están disponibles comercialmente incubadores que controlan la temperatura de incubación a niveles deseables, por ejemplo, 37.9 °C en los Días 1 a 6 después de la puesta, aproximadamente 37.6 °C en los Días 9 y 10, aproximadamente 37.5 °C en los Días 11 y 12, aproximadamente 37.4 °C en el Día 13, aproximadamente 37.3 °C en los Días 14 y 15, aproximadamente 37.2 °C en el Día 16, aproximadamente 37.1 °C en el Día 17, y que pueden caer hasta 35.8 °C sobre el Día 22.
Integración genómica de los polinucleótidos
Para facilitar la integración del polinucleótido en el genoma de las células germinales aviares, se usa preferiblemente un transposón, nucleasa de dedo de cinc, u otra construcción o vector no viral en el método de la invención.
Los ejemplos de transposones adecuados incluyen Tol2 (Kawakami et al., 2002), mini-Tol2, Sleeping Beauty (Ivics et al., 1997), PiggyBac (Ding et al., 2005), Mariner y Galluhop. El transposón Tol2 que se aisló por primera vez del pez medaka Oryzias latipes y que pertenece a la familia de transposones hAT se describe en Kawakami et al. (2000). Mini-Tol2 es una variante de Tol2 y se describe en Balciunas et al. (2006). Los transposones Tol2 y Mini-Tol2 facilitan la integración de un transgén en el genoma de un organismo cuando actúa conjuntamente con la transposasa Tol2. Mediante la administración de la transposasa Tol2 en un plásmido no replicativo separado, solo se integran en el genoma el transposón Tol2 o Mini-Tol2 y el transgén y el plásmido que contiene la transposasa Tol2 se pierde en un número limitado de divisiones celulares. Así, un transposón Tol2 o Mini-Tol2 integrado no tendrá ya la capacidad de experimentar un evento de transposición posterior. Adicionalmente, como se sabe que Tol2 no es un transposón aviar natural, no hay actividad transposasa endógena en una célula aviar, por ejemplo, una célula de pollo, que cause eventos de transposición adicionales. Como se entenderá en la técnica, puede incluirse un ARN que codifica la transposasa Tol2 en la mezcla de transfección como una alternativa a un plásmido de ADN que codifica la transposasa. Así, el transposón Tol2 y la transposasa son particularmente idóneos para uso en los métodos de la presente invención.
Puede usarse cualquier otro sistema de transposón adecuado en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, el sistema de transposón puede ser un sistema de transposón Sleeping Beauty, Frog Prince o Mos1, o puede usarse cualquier transposón que pertenezca a la familia de transposones tc1/mariner o hAT.
El experto en la técnica entenderá que puede ser deseable incluir elementos genéticos adicionales en las construcciones que se van a inyectar en el embrión aviar. Los ejemplos de un elemento genético adicional que puede incluirse en la construcción de ácido nucleico incluyen un gen informador, tal como uno o más genes para una proteína marcadora fluorescente tal como GFP o RFP; una enzima que se pueda ensayar fácilmente tal como betagalactosidasa, luciferasa, beta-glucuronidasa, cloranfenicol acetil transferasa o fosfatasa alcalina embrionaria secretada; o proteínas para las que están disponibles fácilmente inmunoensayos tales como hormonas o citoquinas. Otros elementos genéticos que pueden encontrar uso en realizaciones de la presente invención incluyen aquellos que codifican proteínas que confieren una ventaja selectiva en el crecimiento a las células tales como adenosina desaminasa, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, o resistencia a fármacos.
También pueden usarse tecnologías de edición genómica en los métodos de la invención. Como ejemplo, la tecnología de edición genómica puede ser una nucleasa dirigida. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "nucleasa dirigida" incluye la referencia a una proteína natural o a una proteína preparada por ingeniería. En una realización, la endonucleasa dirigida puede ser una meganucleasa. Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas caracterizadas por secuencias de reconocimiento largas, es decir, la secuencia de reconocimiento varía generalmente de aproximadamente 12 pares de bases a aproximadamente 40 pares de bases. Como consecuencia de este requerimiento, la secuencia de reconocimiento ocurre generalmente solo una vez en cualquier genoma dado. Entre las meganucleasas, la familia de endonucleasas con direccionamiento denominada LAGLIDADG se ha convertido en una herramienta valiosa para el estudio de genomas y modificación de genomas por ingeniería. Una meganucleasa puede estar dirigida a una secuencia cromosómica específica mediante la modificación de su secuencia de reconocimiento usando técnicas muy conocidas para los expertos en la técnica.
En otra realización, la "nucleasa dirigida" es una nucleasa de dedo de cinc. Las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) son nucleasas artificiales generadas fusionando un dominio de unión a ADN de dedo de cinc a un dominio de escisión de ADN. Los dominios de dedo de cinc pueden prepararse por ingeniería para dirigirse a secuencias de ADN diana deseadas y esto permite que las nucleasas de dedo de cinc tomen como diana secuencias únicas en genomas complejos. Aprovechando la maquinaría de reparación del ADN endógena, estos reactivos pueden usarse para alterar de forma precisa los genomas de organismos superiores. Las nucleasas de dedo de cinc son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente US No. 7,241,574 y se revisan en Durai et al. (2005) y Davis y Stokoe (2010).
Antes de la presente invención, se esperaba que con el fin de modificar las CGP usando la tecnología de nucleasas de dedo de cinc, las construcciones de dedo de cinc se introducirían en CGP cultivadas. Las células transfectadas que comprendieran la inserción/modificación deseada se seleccionarían y clonarían. Las células elegidas y clonadas se inyectarían en un embrión receptor deplecionado de CGP.
Los presentes inventores han encontrado, sorprendentemente, que la inyección directa de una construcción de nucleasa de dedo de cinc en un embrión aviar producía una modificación genómica específica que podía detectarse en la gónada del embrión transfectado en el Día 14. Este descubrimiento fue sorprendente porque se esperaba que los niveles combinados de eficiencia de la transfección y actividad de la nucleasa de dedo de cinc serían demasiado bajos para detectar una modificación específica en un embrión sometido a inyección directa. A la vista de la especificidad del direccionamiento de las secuencias de ADN deseadas, y el descubrimiento de los presentes inventores de que la combinación de una nucleasa de dedo de cinc y reactivo de transfección inyectado directamente en un embrión logra unos niveles de eficiencia mayores de los esperados, las nucleasas de dedo de cinc son particularmente útiles para introducir un polinucleótido en el genoma de una célula germinal aviar en los métodos de la presente invención.
En otra realización más, la endonucleasa dirigida puede ser una nucleasa efectora semejante a un activador de la transcripción (TALE) (véase, p. ej., Zhang et al., 2011). Los TALE son factores de transcripción del patógeno de plantas Xanthomonas que pueden prepararse fácilmente por ingeniería para unirse a nuevas dianas de ADN. Los TALE o versiones truncadas de los mismos pueden unirse al dominio catalítico de endonucleasas tales como Fokl para crear endonucleasas dirigidas denominadas nucleasas TALE o TALEN.
En otra realización más, la "nucleasa dirigida" es una nucleasa de Repeticiones Palindrómicas Cortas Intercaladas Regularmente (CRISPR) (Barrangou, 2012). CRISPR es un sistema de nucleasa microbiano implicado en la defensa frente a fagos y plásmidos invasores. Los loci de CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificadores capaces de programar la especificidad de la escisión de ácido nucleico mediada por CRISPR. Se han identificado tres tipos (I-III) de sistemas CRISPR a lo largo de un amplio rango de huéspedes bacterianos. Una característica clave de cada locus de CRISPR es la presencia de una matriz de secuencias repetitivas (repeticiones directas) espaciadas entre sí por cadenas cortas de secuencias no repetitivas (espaciadores). La matriz de CRISPR no codificadora se transcribe y escinde en las repeticiones directas en ARNcr cortos que contienen secuencias espaciadoras individuales, que dirigen a las nucleasas Cas al sitio diana (protoespaciador).
El tipo II de CRISPR es uno de los sistemas mejor caracterizados (por ejemplo, véase Cong et al., 2013) y lleva a cabo la rotura dirigida de ADN bicatenario en cuatro etapas secuenciales. En primer lugar, dos ARN no codificadores la matriz de pre-ARNcr y ARNtracr, se transcriben del locus de CRISPR. En segundo lugar, el ARNtracr hibrida con las regiones de repetición del pre-ARNcr y media el procesamiento de pre-ARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo ARNcr:ARNtracr maduro dirige a Cas9 al ADN diana mediante emparejamiento de pares de bases de Wastson-Crick entre el espaciador en el ARNcr y el protoespaciador en el a Dn diana, al lado del resto adyacente al protoespaciador (PAM), un requerimiento adicional para el reconocimiento de la diana. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN diana para crear una rotura bicatenaria en el protoespaciador. El sistema CRISPR también puede usarse para generar roturas monocatenarias en el genoma. Así, el sistema CRISPR puede usarse para la edición genómica específica de sitio guiada por ARN.
Polinucleótidos
Los métodos de la presente invención pueden utilizarse para incorporar polinucleótidos en el genoma de células germinales primordiales aviares que pueden transmitirse a la progenie modificada genéticamente. Los polinucleótidos integrados en el genoma pueden impartir una función o actividad deseable a las células modificadas genéticamente que comprenden el polinucleótido, tal como, por ejemplo, modificación de un rasgo de producción o incremento de la resistencia a enfermedad. Así, los polinucleótidos que pueden integrarse en el genoma de células germinales incluyen aquellos que codifican ARN de interferencia cortos (ARNsi), ARN de horquilla cortos (ARNsh), ARN de horquilla cortos extendidos (ARNeh), ARN catalíticos tales como ribozimas, ARN señuelos, así como aquellos que codifican polipéptidos endógenos o exógenos tales como aquellos que pueden usarse para modular un rasgo de producción o resistencia incrementada a enfermedad en un ave.
Así, en algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden usarse para modificar cualquier rasgo de una especie aviar. Los rasgos preferidos que pueden modificarse incluyen rasgos de producción y resistencia a enfermedad. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "rasgo de producción" se refiere a cualquier fenotipo de un ave que tiene valor comercial tal como masa muscular, sexo, resistencia a enfermedad o contenido nutricional. Los rasgos preferidos que pueden modificarse según los métodos de la presente invención incluyen sexo, masa muscular y resistencia a enfermedad. Los ejemplos de genes que pueden tomarse como diana para modificar el sexo como un rasgo de producción en un ave incluyen DMRT1, WPKCI (ASW), R-espondina, FOX9, aromatasa, AMH y p-catenina.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "masa muscular" se refiere al peso del tejido muscular. Un incremento en la masa muscular puede determinarse pesando el tejido muscular total de un pájaro que nace de un huevo tratado como se describe en la presente memoria cuando se compara con un pájaro de la misma especie de ave, más preferiblemente cepa o cruce de ave, e incluso más preferiblemente el mismo pájaro, al que no se ha administrado un ácido nucleico como se define en la presente memoria. Alternativamente, pueden usarse músculos específicos tales como músculos del pecho y/o pierna para identificar un incremento en la masa muscular. Los genes que pueden tomarse como diana para la modulación de la masa muscular incluyen, por ejemplo, el gen de la miostatina.
ARN de interferencia
En determinadas realizaciones, los métodos de la presente invención utilizan moléculas de ácido nucleico que codifican regiones bicatenarias para ARN de interferencia con el fin de modular rasgos en un ave. Los términos "ARN de interferencia", "ARNi" o "silenciador génico" se refieren generalmente a un proceso en el que una molécula de ARN bicatenario reduce la expresión de una secuencia de ácido nucleico con la que la molécula de ARN bicatenario comparte una homología sustancial o total. Sin embargo, se ha mostrado que el ARN de interferencia puede conseguirse usando moléculas bicatenarias que no son ARN (véase, por ejemplo, US 20070004667).
Las regiones bicatenarias deberían tener al menos 19 nucleótidos contiguos, por ejemplo, aproximadamente 19 a 23 nucleótidos, o pueden ser más largas, por ejemplo 30 o 50 nucleótidos, o 100 nucleótidos o más. Puede usarse la secuencia de longitud completa correspondiente al transcrito del gen entero. Preferiblemente, tienen una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos.
El grado de identidad de una región bicatenaria de una molécula de ácido nucleico con el transcrito diana debería ser al menos el 90 % y más preferiblemente el 95-100 %. La molécula de ácido nucleico puede, por supuesto, comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula.
El término "ARN de interferencia corto" o "ARNsi", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende ribonucleótidos capaces de inhibir o regular a la baja la expresión génica, por ejemplo, mediando ARNi de una manera específica de secuencia, en donde la parte bicatenaria tiene una longitud menor de 50 nucleótidos, preferiblemente una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos. Por ejemplo, el ARNsi puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende regiones auto-complementarias con sentido y antisentido, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una parte de esta, y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una parte de esta. El ARNsi puede ensamblarse a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena con sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y con sentido son auto-complementarias.
Tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que el término ARNsi sea equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específico de secuencia, por ejemplo, micro-ARN (ARNmi), ARN de horquilla corto (ARNsh), oligonucleótido de interferencia corto, ácido nucleico de interferencia corto (NAsi), oligonucleótido modificado de interferencia corto, ARNsi modificado químicamente, ARN silenciador génico post-transcripcional (ARNptgs), y otros. Además, tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que el término ARNi sea equivalente a otros términos usados para describir ARN de interferencia específico de secuencia, tal como silenciamiento génico post-transcripcional, inhibición de la traducción, o epigenética. Por ejemplo, las moléculas de ARNsi como se describe en la presente memoria pueden usarse para silenciar epigenéticamente genes tanto a nivel post-transcripcional como al nivel pre-transcripcional. En un ejemplo no limitativo, la regulación epigenética de la expresión génica por moléculas de ARNsi como se describe en la presente memoria puede producirse a partir de la modificación mediada por ARNsi de la estructura de la cromatina para alterar la expresión génica.
Por "ARNsh" o "ARN de horquilla corto" se quiere decir una molécula de ARN en la que menos de aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos, están emparejados por bases con una secuencia complementaria localizada en la misma molécula de ARN, y en la que dicha secuencia y secuencia complementaria están separadas por una región no emparejada de al menos aproximadamente 4 a aproximadamente 15 nucleótidos que forma un bucle monocatenario por encima de la estructura de tallo creada por las dos regiones con complementariedad de bases.
Los ARNsh incluidos son ARNds de horquilla duales o con dos dedos o múltiples dedos, en los que la molécula de ARN comprende dos o más de dichas estructuras de tallo-bucle separadas por regiones espaciadoras monocatenarias.
La regulación por microARN es una rama especializada de la ruta de silenciamiento de ARN que evolucionó hacia la regulación génica, divergiendo de ARNi/PTGS convencional. Los microARN son una clase específica de ARN pequeños que están codificados en elementos semejantes a genes organizados en una repetición invertida característica. Cuando se transcriben, los genes de microARN dan lugar a ARN precursores con tallo-bucle a partir de los que se procesan posteriormente los microARN. Los microARN tienen típicamente una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos. Los miARN liberados se incorporan en complejos semejantes a RISC que contienen un subconjunto particular de proteínas Argonauta que ejercen la represión génica específica de secuencia.
Resistencia a enfermedad
Los métodos de la presente invención pueden usarse para integrar un polinucleótido que confiere resistencia a enfermedad a una célula en el genoma de células germinales primordiales en un embrión aviar. Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar una molécula de ácido nucleico tal como un ARNsi, ARNsh o ARNmi que reduce la expresión de un gen del huésped o patógeno produciendo una disminución de la replicación viral en células en las que está presente el polinucleótido. La "replicación de virus", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la amplificación del genoma viral en una célula huésped, el empaquetamiento del genoma viral en una célula y/o la liberación de partículas virales infecciosas de una célula.
Alternativamente, el polinucleótido puede codificar un ARN señuelo. Los ARN señuelos se conocen en la técnica y contienen secuencias de bases de nucleótidos particulares que se unen a proteínas de virus que son esenciales para la replicación de un virus patogénico. Los ARN señuelos que están dirigidos a proteínas de VIH fueron descritos en primer lugar por Sullenger et al. (1990). El experto en la técnica apreciará, sin embargo, que los ARN señuelos pueden diseñarse para tomar como diana proteínas que juegan un papel en la replicación de los patógenos virales aviares, tales como ARN señuelos dirigidos a las proteínas del complejo de la polimerasa del virus influenza.
Preferiblemente, mediante la reducción de la replicación de virus en células aviares, el ave modificado genéticamente que comprende el polinucleótido tendrá una resistencia incrementada a un patógeno viral. Tal y como se usa en la presente memoria, un ave que es "resistente" o tiene una "resistencia incrementada" a un patógeno o patógeno viral presenta síntomas reducidos o ausencia de síntomas de la enfermedad comparado con un ave susceptible cuando se expone al patógeno. Usando los métodos de la invención, las aves pueden hacerse resistentes a patógenos tales como, pero no limitado a, virus influenza, virus de la enfermedad de Marek, virus de la enfermedad de Newcastle y virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa.
Producción in ovo de proteínas recombinantes
Petitte y Modziak (2007) describen la gallina doméstica como un "biorreactor de proteínas muy eficiente". El reconocimiento de que el huevo de aves contiene grandes cantidades de proteína, y más de la mitad de la proteína de la clara o albúmina del huevo está compuesta por una única especie, hay un gran potencial para producir proteínas recombinantes o heterólogas en los huevos. Las dificultades encontradas en los métodos de la técnica anterior para producir aves de corral transgénicas para la producción de proteínas terapéuticas en huevos están bien descritas en la técnica. Aunque se ha conseguido usando un sistema de lentivirus indeseable, no se ha conseguido la producción de pájaros transgénicos que depositen altos niveles de proteínas comercialmente relevantes en un huevo. De acuerdo con esto, los métodos de la presente invención pueden usarse para producir aves modificadas genéticamente que expresan un polipéptido heterólogo o recombinante en huevos. Las proteínas con importancia comercial que podrían producirse en huevos incluyen proteínas terapéuticas tales como anticuerpos y antígenos para vacunas.
Producción y cría de aves modificadas genéticamente
También se describen métodos para criar aves modificadas genéticamente y métodos para producir alimento a partir de aves modificadas genéticamente. El experto en la técnica apreciará que un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente puede ser quimérica en la línea germinal, ya que solo algunas de las células germinales que han migrado a las gónadas están modificadas genéticamente. Así, el ave que comprende células germinales modificadas genéticamente puede criarse para producir progenie en la que todas las células están modificadas genéticamente. Así, también se describe un método para producir un ave modificada genéticamente, método que comprende: (i) obtener el ave que comprende células germinales modificadas genéticamente (ii) criar a partir del ave que comprende células germinales modificadas genéticamente para producir progenie, y (iii) seleccionar la progenie que comprende el polinucleótido insertado en el genoma.
El ave que comprende células germinales modificadas genéticamente puede usarse en la producción de alimento. Así, los métodos descritos en la presente memoria son aplicables a la producción de productos de aves de corral para consumo humano y animal. Los métodos para producir alimento a partir de aves de corral son muy conocidos en la técnica y pueden comprender la recogida de carne y/o huevos de las aves de corral tales como, pero no limitado a, un pollo. En determinadas realizaciones, el ave se ha modificado genéticamente para incluir un polinucleótido que modula un rasgo de producción.
Ejemplos
Ejemplo 1. Inyección directa de la construcción de expresión de EGFP en embriones
Se formó un complejo con 5.1 gg de una construcción de ácido nucleico que codifica GFP mejorada (EGFP) flanqueado por secuencias Tol2 y 1.0 gg de un plásmido que codifica la transposasa Tol2 con 3 gl de Lipofectamina 2000. La formación de complejos de los ácidos nucleicos y el reactivo de transfección se llevó a cabo en un volumen total de 90 gl de medio OptiMEM u OptiPRO usando los tiempos de incubación recomendados por el fabricante (Life Technologies).
Después de la incubación final de 20 minutos, se inyectaron 1-3 pl del complejo en un vaso sanguíneo de embriones de pollo en el Día 2.5 (Estadios 13-17; Hamburger y Hamilton, 1951). No se requirió retirada de sangre. El acceso al embrión se consiguió por la retirada de una pequeña sección (10 mm) de la cáscara. Después de la inyección, el agujero se selló con un cuadrado de 20 mm de parafilm.
La expresión de EGFP se observó en el Día 7 y Día 14 en la mayor parte de las gónadas a varios niveles. También se mostró que las células disociadas de las gónadas y las células verdes eran CGP (Figuras 1,2 y 3).
Ejemplo 2. Optimización in vitro de las relaciones ADN a reactivo de transfección
Se realizaron experimentos para ensayar la relación óptima de ADN:Lipofectamina 2000 y el volumen del medio para preparar el complejo de transfección. Una construcción de ADN que codifica EGFP y una única horquilla (ARNsh) con secuencias Tol2 flanqueantes formó un complejo con Lipafectamina 2000 en volúmenes de OptiMEM de 50, 40, 30 o 20 pl. Las relaciones de ADN (pg) a Lipofectamina 2000 (pl) usadas fueron como sigue: 1:2, 2:4 y 4:8.
Los complejos se transfectaron en células de fibroblastos de pollo (DF-1) y se analizaron para determinar la expresión de EGFP. Los resultados indicaron (no mostrados) que una relación de ADN (pg):Lipofectamina 2000 de 1:2 en 30 pl de medio funcionaba ligeramente mejor que una relación de 2:4 en 50 pl.
Los datos in vitro se confirmaron posteriormente en embriones. Se formó complejos con 0.33 pg de construcción de ADN que comprendía el transposón Tol2, 0.66 pg de plásmido de transposasa, y 2 pl de Lipofectamina 2000 en OptiMEM y se inyectó directamente en embriones de pollo. Todos los embriones vivos tenían buenos niveles de expresión de EGFP en el Día 14 (Figura 4).
Ejemplo 3. Ensayo del reactivo de transfección FuGene
Se ensayó FuGene (Promega) como un reactivo de transfección usando una relación ADN:Fugene similar a la recomendada por el fabricante para la transfección de cultivos celulares. La construcción de ADN formando un complejo con FuGene comprendía un casete de expresión de EGFP con secuencias Tol2 flanqueantes. El complejo (0.66 pg de la construcción EGFP-Tol2, 1.33 pg de plásmido de transposasa, 6 pl de FuGene) se inyectó directamente en 15 embriones. Uno de los embriones mostró cantidades muy pequeñas de expresión de EGFP en las gónadas en el Día 14. Este experimento se repitió, y en el Día 12 los 10 embriones a los que se había inyectado todavía estaban vivos. Dos de los embriones tenían una pareja de células verdes en las gónadas.
Ejemplo 4. Transformación por inyección directa de líneas para engorde
Como los experimentos previos de inyección directa se habían realizado en líneas de pollos ponedores de huevos, el propósito de este experimento fue ensayar si el método de inyección directa podría usarse para transformar con éxito líneas de pollos para engorde. Se formó complejos con una construcción de expresión de EGFP que comprendía una única horquilla y secuencias Tol2 flanqueantes y Lipofectamina 2000 (0.33 pg de construcción de transposón, 0.66 pg de transposasa, 2 pl de Lipofectamina 2000) y se inyectó directamente en la aorta dorsal de embriones de pollo. Doce de 13 embriones inyectados estaban vivos en el Día 10 y se detectaron buenas cantidades de expresión de EGFP en la mayor parte de las gónadas.
Este experimento se repitió con una construcción de expresión de EGFP que comprendía múltiples horquillas (ARNsh) (0.33 pg de transposón, 0.66 pg de transposasa, 2 pl de Lipofectamina 2000). Se encontraron buenas cantidades de expresión de EGFP en los embriones en el Día 12 (Figura 5).
Ejemplo 5. Comparación de OptiMEM con OptiPRO como medio del reactivo de transfección
Se realizó una comparación entre OptiMEM (que contiene productos animales), OptiPRO (que no contiene productos animales), y PBSA como el medio del reactivo de transfección. Se formó complejos con una construcción de expresión de EGFP que comprendía secuencias Tol2 flanqueantes y el reactivo de transfección (0.33 pg de transposón, 0.66 pg de transposasa, 2 pl de Lipofectamina 2000) y se inyectó directamente en embriones de pollo. Todos los embriones mostraron algo de verde en las gónadas en el Día 12 y el medio usado no afectó a la mortalidad. OptiMEM y OptiPRO proporcionaron resultados equivalentes, mientras PBSA produjo una expresión de EGFP significativamente reducida en las gónadas.
Ejemplo 6. Líneas de pollos ponedores inyectadas con una construcción con múltiples cargas útiles
Se formaron complejos con dos construcciones de ADN y reactivo de transfección y se inyectó directamente en embriones de pollo. La primera construcción de ADN comprendía un casete de expresión de EGFP y múltiples horquillas ARNsh flanqueados por secuencias Tol2, y la segunda construcción comprendía una construcción de expresión de EGFP y un casete de única horquilla extendida que codifica tres regiones bicatenarias. Se formaron complejos de las construcciones con reactivo de transfección en las siguientes cantidades: 0.33 pg de transposón, 0.66 pg de transposasa, 2 pL de Lipofectamina 2000. En el Día 14, se encontró expresión de EGFP en las gónadas de la mayor parte de los embriones para ambas construcciones.
Ejemplo 7. Ensayo de la persistencia de Tol2-EGFP
Se formaron complejos de una construcción de ADN que comprendía un casete de expresión de EGFP, múltiples horquillas y flanqueado por Tol2 con reactivo de transfección. (0.33 pg de transposón, 2 pL de Lipofectamina 2000). El complejo de transfección sin transposasa se inyectó directamente en embriones de pollo.
Los embriones en los que se omitió la transposasa todavía mostraron células verdes en algunos embriones, pero en menos células que las observadas cuando se incluye la transposasa. Esto sugiere que el plásmido puede permanecer en las células gonadales durante al menos 2 semanas después de la inyección directa y que no todo el verde observado se debe a la integración de Tol2 en el genoma.
Ejemplo 8. Lipofectamina sin productos animales
Se formaron complejos con un casete de expresión de EGFP con Tol2 y múltiples casetes de expresión de ARNsh con un reactivo de transfección sin productos animales (Lipofectamina 2000CD) (0.33 pg de transposón, 0.66 pg de transposasa,
2 pl de Lipofectamina 2000 CD). En el Día 14, los 10 embriones examinados tenían buenas cantidades de expresión de EGFP en las gónadas (Figura 7).
Ejemplo 9. Inyección directa en el día 3.5
En todos los experimentos previos, las inyecciones de los complejos de transfección se realizaron en el Día 2.5. El propósito de este experimento fue ensayar un tiempo alternativo (Día 3.5) para la inyección directa de los embriones. Se formaron complejos con una construcción de ADN que comprendía una construcción de expresión de EGFP y Tol2 con Lipofectamina 2000CD (0.33 pg de transposón, 0.66 pg de transposasa, 2 pl de Lipofectamina2000 CD).
En el Día 14, 8 de los 21 embriones tenían pequeñas cantidades de expresión de EGFP en las gónadas. Así, el momento en el tiempo de la inyección directa en el Día 2.5 es importante, y sobre el Día 3.5, no se observa una transfección eficiente de las CGP.
Ejemplo 10. Alteración de las proporciones de transposón a transposasa
Mientras se mantenían las relaciones ADN:Lipofectamina2000 CD:medio, incrementamos la proporción de transposón en la mezcla de ADN mientras disminuíamos ligeramente la proporción de plásmido transposasa. Se usaron volúmenes ligeramente diferentes debido a la necesidad de inyectar más huevos en futuros experimentos. Los inventores también ensayaron retirar sangre del embrión antes de la inyección de la mezcla de transfección para determinar si esto permitía un volumen incrementado de la mezcla que se va a inyectar.
Se formaron complejos con una construcción de ADN que comprendía un casete de expresión de EGFP y Tol2 con reactivo de transfección. (0.66 pg de transposón, 1.0 pg de transposasa, 3 pl de Lipofectamina2000 CD). En el Día 14, los embriones con extracción de sangre previa tenían niveles similares de expresión de EGFP en las gónadas comparado con los embriones sin extracción de sangre. Las nuevas relaciones de ADN funcionaron bien, observándose buenos niveles de expresión de EGFP.
Ejemplo 11. Reactivo de transfección JetPEI
Para JetPEI, se formaron complejos con la construcción de ADN que comprendía un casete de expresión de EGFP y Tol2 con el reactivo de transfección (4 pg de transposón, 6 pg de transposasa, 1.6 pl de JetPEI (transfección Poliplus) en 50 pl de OptiPRO (con glucosa al 5 %). JetPEI produjo la coagulación de la sangre después de la inyección, pero esto no afectó la capacidad de supervivencia de los embriones. Se encontraron células verdes en estos embriones y en las gónadas, pero la mayoría eran morfológicamente diferentes de las CGP transformadas observadas cuando se usó Lipofectamina2000.
Se realizó un segundo experimento para ensayar el reactivo de transfección JetPEI. Se usaron dos mezclas de reacción: i) 0.66 pg de transposón, 1.0 pg de transposasa, 0.5 pl de JetPEI en 100 pl de OptiPRO (con glucosa al 5 %); y ii) 1.32 pg de transposón, 2.0 pg de transposasa, 0.5 pl de JetPEI en 100 pl de OptiPRO (con glucosa al 5 %).
JetPEI causó la coagulación de la sangre después de la inyección y la mezcla de reacción (ii) produjo una capacidad de supervivencia de los embriones mejorada. De nuevo, se encontró algo de expresión de EGFP en las gónadas, pero, de nuevo, no parecía que el tipo celular fuera semejante a CGP. Las gónadas se tomaron y las células se disociaron y tiñeron para detectar marcadores de CGP. Ninguna de las células vedes mostraron tinción para los marcadores de CGP, confirmando que las CGP no se habían transfectado por el complejo JetPEI.
Ejemplo 12. Nucleasa de dedo de cinc
El propósito del experimento fue determinar si los plásmidos de nucleasa de dedo de cinc pueden usarse para transformar CGP por la técnica de la inyección directa. El ADN usado en el experimento comprendía dos plásmidos de nucleasa de dedo de cinc y el fragmento solapado, que formó complejos con el reactivo de transfección 0.5 pg de cada plásmido, 3 pl de Lipofectamina2000 CD, en 90 pl de OptiPRO.
Como no había EGFP presente en los plásmidos, los inventores se basaron en un ensayo de PCR que amplificaría un fragmento, solo si el fragmentos solapado se había incorporado en el genoma del pollo. Después de 14 días de incubación, las gónadas se retiraron, se enriquecieron en CGP usando un método de selección con anticuerpo, y se preparó ADN genómico. La PCR reveló que el fragmento solapado se había incorporado en el genoma del pollo. Estos resultados demuestran que las nucleasas de dedo de cinc son adecuadas para integrar ADN en el genoma de CGP aviares usando el método de inyección directa de la presente invención.
Ejemplo 13. Resultados
Siguiendo los protocolos indicados anteriormente, los inventores observaron una transformación significativa de CGP en las gónadas de embriones receptores, y en un grado mucho mayor que el descrito en los métodos de la técnica anterior para transfectar CGP. A través de la tinción de células con marcadores específicos de CGP, los inventores mostraron que la mayoría de las células transformadas en la gónada eran CGP. Los inventores han criado embriones receptores hasta la madurez sexual y han sido capaces de detectar secuencias de transposón Tol2 en el semen de >90 % de los machos adultos.
Se usaron otros reactivos de transfección, sin embargo, los reactivos basados en lípidos proporcionaron una transfección superior de CGP. JetPEI transfectó las células por este método, pero no se pudo mostrar que ninguna de las células transfectadas fuera CGP. FuGene transfectó las células a una tasa muy baja.
Ejemplo 14. Modificación del genoma por inyección directa usando nucleasas de dedo de cinc
Se inyectó una nucleasa de dedo de cinc (ZFN) dirigida a una región del intrón 5 el gen PANK1 junto con un plásmido que contenía el ARNsh PB1-2257 anti-influenza y las regiones requeridas para la reparación homóloga en embriones que se analizaron posteriormente para determinar la integración del ARNsh.
Un total de 1.5 pg de ADN (500 pg de cada plásmido ZFN y 500 pg del plásmido de reparación) se añadieron a 45 pl de OptiPRO y se formaron entonces complejos con 3 pl de lipofectamina2000 CD en 45 pl de OptiPRO antes de inyectarlo en 30 huevos de 2.5 días. Los huevos se incubaron hasta el día 7 cuando las gónadas se retiraron, se disociaron y se enriquecieron en CGP usando un separador MACS con un anticuerpo SSEA-1 (Santa Cruz Biotech). El ADN se extrajo de la muestra enriquecida en CGP de los embriones tratados con ZFN y embriones control usando un kit ADNeasy de Qiagen.
Se llevó a cabo una PCR para cribar la integración exitosa del ARNsh usando un cebador que se une al genoma fuera de la región usada para la reparación homóloga (Cribado 75' GTGACTCAGACTCCTGTTAG (SEQ ID NO:3)) y uno que se une al ARNsh (Cribado 65' TCTGCTGCTTCACAGTCTTC (SEQ ID NO:4)). La PCR se realizó usando mezcla maestra verde (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante usando las condiciones de ciclos de 94 °C durante 2 min seguido de 36 ciclos de 94 °C durante 45 segs, 55 °C durante 45 segs y 72 °C durante 1 min 10 seg. Esto fue seguido de una extensión final a 72 °C durante 10 min.
La PCR se llevó a cabo en la muestra enriquecida en ADN de CGP de los embriones tratados con ZFN, así como de los embriones control, ADN de células control positivo, que se ha mostrado previamente que tienen el ARNsh integrado en ellas y un control de agua. La Figura 8 muestra la electroforesis en gel de estas reacciones de PCR. El primer carril, que contiene la PCR de los embriones a los que se inyectó directamente ZFN, muestra claramente una banda que indica la integración genómica en los embriones sometidos a inyección.
Ejemplo 15. Resultados de la modificación del genoma de pollos por inyección directa
Después de varias rondas de inyecciones directas, un total de 277 gallos se criaron hasta la madurez sexual y su semen se ensayó para determinar la presencia del transgén Tol2. De las 277 muestras ensayadas, se encontró que 98 contenían el transgén Tol2 con niveles variados de porcentaje de semen positivo. Varios de estos gallos positivos G(0) se aparearon y se cribó un total de 7393 polluelos G(1). Se encontró que sesenta y cinco de los polluelos eran transgénicos. Los apareamientos posteriores usando estos polluelos G(1) han mostrado una herencia Mendeliana de los transgenes hasta la generación G(2).
Los polluelos nacidos se crecieron hasta la madurez sexual y se usó PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para detectar la presencia de miniTol-EGFP en el semen. Se recogieron muestras de semen y se extrajo el ADN de 20 pl de semen diluido en 180 pl de PBS usando el kit de sangre y tejido DNeasy de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico del semen se diluyó entonces 1/100 en ddhbO para usarse en la reacción de PCR. Se llevó a cabo la qPCR en un Mastercycler® ep realplex (Eppendorf Hamburgo, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se pusieron a punto reacciones de 20 pl que contenían 10 pl de mezcla maestra universal Taqman 2x (Applied Biosystems), 1 pl de mezcla de ensayo marcada FAM 20x (Applied Biosystems) y 9 pl de ADN diluido. Cada muestra se dispuso en duplicado con cebadores y sonda específicos para minTol2:
Cebador directo 5' CAGTCAAAAAGTACTTATTTTTTGGAGATCACT 3' (SEQ ID NO: 5)
Cebador inverso 5' GGGCATCAGCGCAATTCAATT 3' (SEQ ID NO:6);
Sonda de detección 5' ATAGCAAGGGAAAATAG 3' (SEQ ID NO:7);

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, método que comprende:
(i) inyectar una mezcla de transfección que comprende un polinucleótido mezclado con un reactivo de transfección en un vaso sanguíneo de un embrión aviar,
en donde
(a) el polinucleótido comprende un transposón y la mezcla de transfección comprende una transposasa o un polinucleótido que codifica una transposasa; o
(b) la mezcla de transfección comprende una nucleasa dirigida, o un polinucleótido que codifica una nucleasa dirigida; y
mediante lo cual el polinucleótido se inserta en el genoma de una o más células germinales primordiales en el ave, e (ii) incubar el embrión a una temperatura suficiente para que el embrión se desarrolle en un polluelo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de transfección se inyecta en el embrión aviar en los Estadios 13-14.
3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico.
4. El método de la reivindicación 3, en donde
i) el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico monovalente seleccionado de uno o más de DOTMA (cloruro de N-[1-(2.3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetil amonio), DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-3-(trimetilamonio)propano), DMRIE (bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi etil amonio) y DDAB (bromuro de dimetil dioctadecil amonio), y/o
ii) el reactivo de transfección comprende un lípido catiónico polivalente seleccionado de uno o más de DOSPA (trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio) y DOSPER (1,3-dioleoiloxi-2-(6carboxi espermil)-propil-amida, TMTPS (tetrametiltetrapalmitoil espermina), TMTOS (tetrametiltetraoleil espermina), TMTLS (tetrametiltetralauril espermina), TMTMS (tetrametiltetramiristil espermina) y TMDOS (tetrametildioleil espermina).
5. El método de la reivindicación 3 o reivindicación 4, en donde el reactivo de transfección comprende además un lípido neutro.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la mezcla de transfección comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una transposasa o una nucleasa dirigida seleccionada del grupo que consiste en una nucleasa de dedo de cinc, una TALEN o una nucleasa dirigida CRISPR.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la mezcla de inyección se inyecta en el embrión en la cáscara del huevo en la que se desarrolla el embrión.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polinucleótido codifica una molécula de ARN que comprende una región bicatenaria, o el polinucleótido codifica un polipéptido.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde, cuando está presente en el genoma del ave, o una progenie de este, el polinucleótido modifica un rasgo del ave.
10. Un método para incrementar la resistencia de un ave a un virus, método que comprende llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el polinucleótido codifica un ARNsi, ARNsh o ARN señuelo que reduce la replicación del virus en una célula, o el polinucleótido codifica un péptido antiviral que reduce la replicación del virus en una célula.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ave se selecciona de un pollo, pato, pavo, ganso, gallo bantam o codorniz.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el polinucleótido comprende un transposón y la mezcla de transfección comprende una transposasa o un polinucleótido que codifica una transposasa.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la mezcla de transfección comprende una nucleasa dirigida, o un polinucleótido que codifica una nucleasa dirigida.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la nucleasa dirigida codificada es una nucleasa dirigida CRISPR.
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CN (2) CN112626128A (es)
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BR (1) BR112014026186B8 (es)
ES (2) ES2704155T3 (es)
WO (1) WO2013155572A1 (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
AU2013204327B2 (en) * 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
US10100331B2 (en) 2012-10-29 2018-10-16 Agency For Science, Technology And Research Reagent for gene-drug therapeutics
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
SG11201504523UA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
CN106536729A (zh) * 2013-12-12 2017-03-22 布罗德研究所有限公司 使用粒子递送组分靶向障碍和疾病的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
WO2015089462A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
CA2932472A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CN103782953A (zh) * 2014-01-23 2014-05-14 固镇县玉鹏蔬菜开发有限责任公司 一种小鹅瘟的预防方法
CN105265383A (zh) * 2014-10-18 2016-01-27 颍上县永祥旱粮研究所 一种林下鸡养殖方法
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
CN104789599A (zh) * 2015-04-13 2015-07-22 浙江省农业科学院 一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法
CN109536474A (zh) 2015-06-18 2019-03-29 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
CN108474007A (zh) * 2015-08-07 2018-08-31 联邦科学技术研究组织 产生包含种系遗传修饰的动物的方法
BR112018010499A8 (pt) 2015-11-24 2019-02-26 Commw Scient Ind Res Org método para replicar um vírus, vírus, método para produzir uma composição de vacina, composição de vacina, população de células in vitro, método para produzir uma população de células, e população de células
EP3380616A4 (en) 2015-11-24 2019-11-06 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation MANUFACTURE OF VIRUSES IN BIRDS
US10858669B2 (en) 2015-12-25 2020-12-08 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Genetically modified chicken egg with an exogenous sequence knocked into the ovalbumin gene
MA48783A (fr) * 2017-05-25 2020-04-08 Eggxyt Ltd Procédés de détermination du sexe d'embryons aviaires dans les ufs non éclos et moyens correspondants
CN109275622A (zh) * 2017-07-20 2019-01-29 龚海华 一种蛋鸡的循环养殖方法
CN107723313A (zh) * 2017-10-30 2018-02-23 扬州大学 一种外源物质导入鸡胚的方法
JP7568507B2 (ja) * 2017-11-15 2024-10-16 ウィヤード・サイエンス・エルエルシー 非骨髄破壊的な骨髄再構成のための方法および組成物
KR102103103B1 (ko) * 2018-08-16 2020-04-21 (주)라트바이오 인위적 뉴클레아제를 생산하는 형질전환 동물 및 형질전환 배아
JP7418470B2 (ja) * 2019-04-08 2024-01-19 ディーエヌエー ツーポイントオー インク． オリジアス由来のトランスポザーゼを用いた核酸コンストラクトの真核細胞への組み込み

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5162215A (en) * 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
GB8906214D0 (en) 1989-03-17 1989-05-04 Nat Res Dev Introducing an exogenous gene into birds
US5631329A (en) 1990-08-27 1997-05-20 Dendritech, Inc. Process for producing hyper-comb-branched polymers
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5266106A (en) 1992-10-22 1993-11-30 Xerox Corporation Ink compositions with dendrimer grafts
WO1996031549A1 (de) 1995-04-07 1996-10-10 Mueller Egbert Dendrimere pfropfpolymerisate
US20030069173A1 (en) 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
JP4320054B2 (ja) * 1996-08-13 2009-08-26 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
CN1195844C (zh) 1997-08-04 2005-04-06 马萨诸塞州大学 鸟原始生殖细胞(pgc)细胞系及其长期培养的方法
JP2003517261A (ja) 1997-08-04 2003-05-27 ユニバシティ オブ マサチューセッツ、ア パブリック インスチチユーション オブ ハイアー エデュケイション オブ ザ コモンウエルス オブ マサチューセッツ、アズ リプリゼンテッド バイ イッツ アマースト キャンパス Ｐｇｃの長期間培養によるトリの胚生殖（ｅｇ）細胞系の産生、クローン形成およびキメラ形成へのその利用
ES2357495T3 (es) * 1997-10-16 2011-04-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aves transgénicas y producción de proteína.
DE60037107T2 (de) 1999-02-11 2008-09-25 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Pluripotente embryonale keimzellinie aus vögeln
US6140118A (en) 1999-08-11 2000-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Avian blastodermal cell lines
JP4609869B2 (ja) 1999-12-03 2011-01-12 独立行政法人科学技術振興機構 トランスポゾン転移酵素および遺伝子改変方法
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
JP4300287B2 (ja) 2002-02-14 2009-07-22 国立大学法人東京海洋大学 分離始原生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法
JP4364474B2 (ja) 2002-02-15 2009-11-18 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 哺乳動物において機能的なトランスポゾン
US20040172667A1 (en) * 2002-06-26 2004-09-02 Cooper Richard K. Administration of transposon-based vectors to reproductive organs
US7527966B2 (en) * 2002-06-26 2009-05-05 Transgenrx, Inc. Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
KR100502889B1 (ko) 2003-04-21 2005-07-20 한미약품(주) 조류 원시생식세포의 생식선 전이 효율의 개선방법
EP1850659B1 (en) 2005-02-01 2016-11-23 Synageva BioPharma Corp. Long term culture of chicken primordial germ cells
RU2533804C2 (ru) 2005-03-31 2014-11-20 Ронен КАХАНА Получение домашней птицы и других животных, устойчивых к вирусному заболеванию
US20070293449A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for delivery of double-stranded rna
AU2007319881B2 (en) * 2006-11-13 2012-05-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
WO2008138072A1 (en) 2007-05-16 2008-11-20 Mat Malta Advanced Technologies Limited Treatment and prevention of influenza
WO2009023800A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 Origen Therapeutics Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus
NZ583783A (en) * 2007-09-20 2012-10-26 Commw Scient Ind Res Org Avian interferon-lambda polypeptide and genetic sequences encoding the same
US20110041195A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Organisms homozygous for targeted modification
KR20140046408A (ko) * 2011-02-25 2014-04-18 리컴비네틱스 인코포레이티드 유전자 변형 동물 및 이의 생산방법
AU2013204327B2 (en) * 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
WO2014138792A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Double-stranded rna
WO2014165825A2 (en) * 2013-04-04 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
ES2965286T3 (es) * 2014-07-14 2024-04-12 Univ Washington State Silenciamiento de NANOS que abate las células germinales
CN108474007A (zh) * 2015-08-07 2018-08-31 联邦科学技术研究组织 产生包含种系遗传修饰的动物的方法
CN105524941A (zh) * 2016-01-19 2016-04-27 扬州大学 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法
TW202241259A (zh) * 2020-12-31 2022-11-01 以色列國家農業部、農村發展農業研究組織（沃爾卡尼研究所） 不育禽類胚胎、其產生及用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP3460065A1 (en) 2019-03-27
AU2013248945A1 (en) 2014-10-30
US10897881B2 (en) 2021-01-26
EP2839016A1 (en) 2015-02-25
WO2013155572A1 (en) 2013-10-24
JP2015514404A (ja) 2015-05-21
AU2013204327A1 (en) 2013-11-07
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US20210112789A1 (en) 2021-04-22
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EP2839016A4 (en) 2015-11-25
ES2963732T3 (es) 2024-04-01
US20150072064A1 (en) 2015-03-12
CN112626128A (zh) 2021-04-09
EP2839016B1 (en) 2018-10-03
AU2013204327B2 (en) 2016-09-01
JP6531239B2 (ja) 2019-06-19
BR112014026186A2 (pt) 2017-07-18
US20230189769A1 (en) 2023-06-22
BR112014026186B8 (pt) 2023-01-31
KR102076784B1 (ko) 2020-02-12
CN104619848B (zh) 2020-12-15
BR112014026186B1 (pt) 2022-02-01

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