BR112014026186B1 - Método para a produção de uma ave e método para aumentar a resistência de uma ave a um vírus - Google Patents
Método para a produção de uma ave e método para aumentar a resistência de uma ave a um vírus Download PDFInfo
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Abstract
MÉTODO DE TRANSFECÇÃO CELULAR. A presente invenção refere-se a métodos para a transfecção de células. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de transfecção de células germinais primordiais nas aves, e de métodos de criação de aves, com características modificadas.
Description
[001] A presente invenção refere-se aos métodos de transfecção de células. Em particular, a presente invenção refere-se aos métodos de transfecção de células germinativas primordiais em aves, e aos métodos de criação de aves com características modificadas.
[002] O desenvolvimento de uma técnica eficiente para desenvolver aves transgênicas ou geneticamente modificadas é de grande importância para as indústrias agrícola e de biofarmacêuticos, bem como para aumentar a nossa compreensão da biologia das aves através de estudos genômicos funcionais. A produção avícola irá desempenhar um importante papel no sentido de garantir a segurança alimentar para o planeta face ao crescimento populacional, e modernos avanços em biotecnologia, como o desenvolvimento de aves transgênicas, ajudarão a indústria a atender a demanda para uma maior produção.
[003] Mais especificamente, a aplicação da tecnologia transgênica para modificar características nas aves, que não é possível por meio de reprodução convencional, tais como resistência a doenças e modulação de determinação do sexo, será agora possível e proporcionará grandes benefícios à indústria avícola. A demanda por proteínas biofarmacêuticas está crescendo rapidamente e, até recentemente, sistemas de fabricação baseados em células in vitro para produzir novas proteínas recombinantes para o tratamento da doença têm sido utilizados. O uso de gado transgênico como biorreatores para a produção de proteínas recombinantes está sendo agora desenvolvida como uma importante alternativa aos sistemas à base de células caros e trabalhosos. O desenvolvimento da tecnologia transgênica para as galinhas permitiu que o ovo fosse desenvolvido como um biorreator para altos níveis de produção e purificação de proteínas biofarmacêuticas.
[004] Também foram feitas tentativas para introduzir genes estrangeiros selecionados por clonagem dos mesmos em um vetor retroviral (por exemplo, vírus reticuloendotelial ou vírus da leucose aviária), injeção do vírus recombinante em ovos férteis, permissão de o vírus infectar o embrião em desenvolvimento (por exemplo, células germinativas primordiais), criando assim uma gônada ou óvulo quimérico, e usando o recombinante resultante para tentar introduzir um gene estrangeiro na progenia. No entanto, a indústria avícola tem sido relutante para usar, comercialmente, esta tecnologia, uma vez que o vírus (em seu estado natural) é um agente patogênico, e até mesmos vetores de vírus competentes para replicação variantes podem, às vezes, induzir tumores, e variantes incompetentes para replicação exigem dosagens altas ou repetidas. Da mesma forma, até mesmo constructos de vírus defeituosos para replicação podem representar certo grau de risco de recombinação com envelopes de vírus endógenos e tornar-se competentes para replicação. Além disso, esses vetores estão atualmente limitados a inserções de DNA de tamanho relativamente pequeno (por exemplo, de duas quilobases ou menos).
[005] Também tem havido tentativas de injetar DNA estrangeiro em óvulo fertilizado não desenvolvido após ele ser removido cirurgicamente da galinha. No entanto, essa abordagem exigiu a incubação do embrião em desenvolvimento em uma série de recipientes substitutos. Além disso, foram necessários bandos de galinhas e muita prática para obter as habilidades cirúrgicas e técnicas necessárias.
[006] Uma abordagem alternativa envolve a injeção de células embrionárias geneticamente modificadas, ou de células germinativas primordiais (PGCs) em um embrião receptor logo após a postura. Nessa abordagem, culturas de PCG foram criadas, que mantiveram a sua capacidade de se diferenciarem em óvulos ou espermatozoides funcionais que produziram células, quando incorporadas no embrião em desenvolvimento. As culturas de PGC deste tipo podem ser geneticamente modificadas e, em seguida, injetadas nos embriões receptores. Os embriões receptores poderiam ter sido tipicamente modificados por irradiação gama para debilitar as células germinativas primordiais endógenas, de modo a conferir às células injetadas uma vantagem de seleção em termos de hospedagem na crista gonadal. As células modificadas poderiam, em seguida, maturar e produzir espermatozoides ou óvulos capazes de transmitir o transgene para pelo menos a próxima geração. No entanto, esta técnica é demorada, pois exige a remoção das PGCs de um embrião doador e a sua subsequente cultura e reintrodução em um embrião receptor. Além disso, a eficiência na qual as aves que compreendem PGCs geneticamente modificadas podem ser obtidas usando esta técnica é baixa.
[007] Nesse sentido, ainda há uma necessidade por métodos de modificação genética de células germinativas primordiais de aves.
[008] Os presentes inventores verificaram que a injeção direta de reagentes de transfecção misturados com o DNA no sangue de embriões aviários em desenvolvimento resulta na introdução do DNA nas células germinativas primordiais (PGCs) e na inserção do DNA no genoma aviário.
[009] Por conseguinte, a presente invenção fornece um método para a produção de uma ave que compreende células germinativas geneticamente modificadas, o qual compreende:(i) injetar uma mistura de transfecção compreendendo um polinucleotídeo misturado com um reagente de transfecção em um vaso sanguíneo de um embrião aviário, por meio do que o polinucleotídeo é inserido no genoma de uma ou mais células germinativas na ave.
[0010] Em uma modalidade, o método compreende ainda (ii) incubar o embrião a uma temperatura suficiente para o embrião se tornar uma galinha.
[0011] A mistura de transfecção é, preferencialmente, injetada no embrião da ave no momento de migração da PGC aproximadamente nos estágios 12 a 17. Em uma modalidade preferencial, a mistura de transfecção é injetada no embrião da ave nos estágios 13 a 14.
[0012] Embora qualquer reagente de transfecção adequado possa ser usado nos métodos da invenção, preferencialmente o reagente de transfecção compreende um lipídio catiônico.
[0013] Em uma modalidade, o reagente de transfecçãocompreende um lipídio catiônico monovalente selecionado a partir de um ou mais de DOTMA (cloreto de N-[1-(2,3- dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio), DOTAP (1,2-(bis)oleoilóxi-3-3-(trimetilamônio)propano), DMRIE (brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamônio) e DDAB (brometo de dimetildioctadecilamônio). Em outra modalidade, o reagente de transfecção compreende um lipídiocatiônico polivalente selecionado a partir de um ou mais deDOSPA (trifluoracetato de 2,3-dioleoilóxi-N-[2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanamínio) e DOSPER (1,3-dioleoilóxi-2-(6-carboxiespermil)-propilamida),TMTPS (tetrametiltetrapalmitoilespermina), TMTOS (tetrametiltetraoleilespermina), TMTLS (tetrametiltetralaurilespermina), TMTMS (tetrametiltetramiristilespermina) e TMDOS (tetrametildioleilespermina).
[0014] Em ainda outra modalidade, o reagente de transfecção compreende DOSPA (trifluoracetato de 2,3- dioleilóxi- N-[2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1- propanamínio).
[0015] Em outra modalidade, o reagente de transfecção compreende ainda um lipídio neutro. O lipídio neutro pode compreende, por exemplo, DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina, DPhPE (diftanoilfosfatidiletanolamina) ou colesterol.
[0016] Em uma modalidade particular, o reagente de transfecção compreende uma mistura 3:1 (p/p) de DOSPA e DOPE antes da mistura do reagente de transfecção com o polinucleotídeo.
[0017] Vantajosamente, os métodos da presente invenção são adequados para o uso dos métodos não retrovirais de introdução de um polinucleotídeo no genoma de uma célula germinativa. Assim, em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um transposão ou uma nuclease de dedo do zinco.
[0018] Em uma modalidade particular, a mistura de transfecção compreende um polinucleotídeo que codifica uma transposase. A transposase pode ser codificada pelo DNA, tal como em um plasmídeo, ou alternativamente, o polinucleotídeo que codifica a transposase é RNA.
[0019] Em uma modalidade específica, o transposão é selecionado de Tol2, mini-Tol2, Bela Adormecida (Sleeping Beauty) e PiggyBac.
[0020] Em outra modalidade, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma nuclease de dedo do zinco.
[0021] Embo ra as células germinativas que são geneticamente modificadas nas aves possam ser células germinativas embrionárias, preferencialmente as células são células germinativas primordiais.
[0022] Em uma modalidade, a mistura de injeção é injetada no embrião na casca do ovo, na qual o embrião se desenvolveu.
[0023] O polinucleotídeo na mistura de transfecção pode ser uma molécula de RNA ou molécula de DNA que codifica um polipeptídeo, ou uma molécula de DNA que codifica um RNA que compreende uma região de fita dupla. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo codifica uma molécula de RNA que compreende uma região de fita dupla. A molécula de RNA pode, por exemplo, ser um siRNA, shRNA ou RNA falso (RNA decoy).
[0024] Em outra modalidade, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo.
[0025] Em uma modalidade, a molécula de RNA ou o polipeptídeo reduz a replicação de vírus em uma célula, em comparação com uma célula sem a molécula de RNA ou polipeptídeo.
[0026] Os métodos da invenção podem ser usados para alvejar qualquer patógeno viral de uma ave. Em uma modalidade, o vírus é o vírus influenza.
[0027] A presente invenção fornece adicionalmente uma ave, que possui células germinativas geneticamente modificadas, em que a ave é produzida pelo método da invenção.
[0028] A presente invenção fornece ainda uma célula germinativa geneticamente modificada da ave da invenção, em que a célula germinativa compreende o polinucleotídeo inserido no genoma.
[0029] A presente invenção fornece ainda esperma produzido pelas aves, que compreende as células geneticamente modificadas da invenção.
[0030] A presente invenção fornece ainda um ovo produzido pelas aves, que compreende as células geneticamente modificadas da invenção.
[0031] A presente invenção fornece ainda um método para modificar geneticamente as células germinativas em uma ave, o qual compreende: (i) injetar uma mistura de transfecção compreendendo um polinucleotídeo misturado com um reagente de transfecção em um vaso sanguíneo de um embrião aviário contido em um ovo; e(ii) incubar o embrião a uma temperatura suficiente para permitir que o embrião se desenvolva em uma galinha;em que o polinucleotídeo é inserido no genoma de uma ou mais células germinativas na ave.
[0032] Em modalidades adicionais, o métodocompreende uma ou mais das características da invenção, como descrito nesse documento.
[0033] A presente invenção fornece ainda um métodopara a produção de uma ave geneticamente modificada, a qualcompreende:(i) obter a ave que compreende as células germinativasgeneticamente modificadas da invenção;(ii) criar a partir da ave que compreende célulasgerminativas geneticamente modificadas para produzirdescendência; e(iii) selecionar a progenia que compreende opolinucleotídeo inserido no genoma.
[0034] A presente invenção fornece ainda uma avegeneticamente modificada produzida pelo método da invenção.
[0035] A presente invenção fornece ainda um métodode produção de alimentos, o qual compreende:(i) obter a ave que compreende células germinativasgeneticamente modificadas da invenção, ou a avegeneticamente modificada da invenção; e(ii) produzir alimentos a partir da ave.
[0036] Em uma modalidade, o método coletar carnee/ou ovos da ave.
[0037] A presente invenção fornece ainda um métodode criação de aves geneticamente modificadas, o qualcompreende:(i) realizar o método da invenção para produzir umagalinha ou progenia;(ii) permitir que o pinto ou progenia se desenvolva emuma ave sexualmente madura; e(iii) criar a partir de uma ave sexualmente madurapara produzir uma ave geneticamente modificada.
[0038] Em uma modalidade, a invenção fornece umaave geneticamente modificada produzida de acordo com ométodo da invenção.
[0039] A presente invenção fornece ainda um métodode modulação de uma característica em uma ave, o métodocompreendendo:(i) injetar uma mistura de transfecção compreendendoum polinucleotídeo misturado com um reagente de transfecçãoem um vaso sanguíneo de um embrião da ave, por meio do queo polinucleotídeo é inserido no genoma de uma ou maiscélulas germinativas na ave; e(ii) incubar o embrião a uma temperatura suficientepara permitir que o embrião se desenvolva em uma galinha;em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo oumolécula de RNA que compreende uma região de fita dupla quemodula uma característica na ave.
[0040] Em uma modalidade, a molécula de RNAcompreende um siRNA, shRNA ou RNA falso.
[0041] Em uma modalidade, a característica é selecionada de massa muscular, sexo, teor nutricional e/ou resistência a doenças.
[0042] A presente invenção fornece inda um método de aumentar a resistência de um ave a um vírus, o método compreendendo realizar o método da invenção, em que o polinucleotídeo é um siRNA, shRNA ou RNA falso que reduz a replicação do vírus em uma célula, ou o polinucleotídeo codifica um peptídeo antiviral que reduz a replicação do vírus em uma célula.
[0043] Em uma modalidade particular, o vírus é o vírus influenza.
[0044] A presente invenção fornece ainda uma ave produzida de acordo com o método da invenção.
[0045] Em algumas modalidades da invenção, a ave é selecionada dentre uma galinha, pato, peru, ganso, galinha bantam ou codorna.
[0046] Em outra modalidade dos métodos da invenção, a mistura de transfecção compreende ainda uma nuclease de direcionamento, ou um polinucleotídeo que codifica uma nuclease de direcionamento, para facilitar a integração do polinucleotídeo no genoma da célula germinativa. Por exemplo, a nuclease de direcionamento pode ser selecionada de uma nuclease de dedo do zinco, TALEN e CRISPR.
[0047] A presente invenção fornece ainda um método para a produção de uma ave que compreende células germinativas geneticamente modificadas, o qual compreende:(i) injetar uma mistura de transfecção compreendendo um polinucleotídeo misturado com um reagente de transfecção em um vaso sanguíneo de um embrião da ave, por meio do que o polinucleotídeo é inserido no genoma de uma ou mais células germinativas na ave; e(ii) incubar o embrião a uma temperatura suficiente para que o embrião se desenvolva em uma galinha;em que o reagente de transfecção compreende um lipídio catiônico, o polinucleotídeo compreende ainda uma sequência que codifica um transposão, e a mistura de transfecção é injetada no vaso sanguíneo do embrião da ave nos estágios 13 e 14.
[0048] Em uma modalidade, o reagente de transfecção compreende lipofectamina 2000 ou uma mistura 3:1 (p/p) de DOSPA e DOPE antes de misturar o reagente de transfecção com o polinucleotídeo, o transposão é Tol2 ou mini-Tol2 e a mistura de transfecção compreende um polinucleotídeo que codifica a Tol2 transposase.
[0049] A presente invenção fornece ainda um método para a produção de uma ave que compreende células germinativas geneticamente modificadas, o qual compreende:(i) injetar uma mistura de transfecção compreendendo um polinucleotídeo misturado com um reagente de transfecção em um vaso sanguíneo de um embrião da ave, por meio do que o polinucleotídeo é inserido no genoma de uma ou mais células germinativas na ave; e(ii) incubar o embrião a uma temperatura suficiente para que o embrião se desenvolva em uma galinha;em que o reagente de transfecção compreende um lipídio catiônico e um lipídio neutro, o polinucleotídeo compreende ainda uma sequência que codifica uma nuclease de dedo do zinco, e a mistura de transfecção é injetada no vaso sanguíneo do embrião da ave nos estágios 13 e 14.
[0050] Em uma modalidade, o reagente de transfecção compreende lipofectamina 2000 ou uma mistura 3:1 (p/p) de DOSPA e DOPE antes da mistura do reagente de transfecção com o polinucleotídeo.
[0051] Como será evidente, as características preferenciais e as características de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção.
[0052] Em todo este relatório descritivo, a palavra "compreendem" ou variações como “compreende” ou “compreendendo” serão interpretadas como implicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa estabelecida, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.
[0053] A invenção é descrita abaixo por meio dos seguintes exemplos não limitantes e com referência às figuras associadas.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0054] Figura 1. Injeção direta de DNA que codifica o EGFP complexado com a lipofectamina 2000 em embriões de aves. Imagens fluorescentes (lado esquerdo) e imagens do campo claro correspondentes (lado direito) das gônadas retiradas dos embriões no dia 7.
[0055] Figura 2. Injeção direta de DNA que codifica o EGFP complexado com a lipofectamina 2000 em embriões de aves, imagens do dia 14. Imagens fluorescentes (lado direito) e imagens do campo claro correspondentes (lado esquerdo) das gônadas retiradas dos embriões no dia 14. A última imagem fluorescente é uma ampliação do conjunto esquerdo de células verdes em um embrião. Essa região foi removida por dissecação do restante da gônada para corar com o homólogo vasa de galinha (cvh). Uma pequena parte do restante da gônada foi usada como um controle negativo.
[0056] Figura 3. Injeção direta de DNA que codifica o EGFP complexado com a lipofectamina 2000 em embriões de aves. Coloração de células para o cvh marcador de PGC. Coloração com DAPI mostrando o material nuclear e a coloração de todas as células, cvh, um marcador específico da PGC marcou uma subpopulação de células (células cinzas mais claras). As células transformadas que receberam o transposão através de injeção direta e que ficaram com coloração verde estão indicadas pelas setas.
[0057] Figura 4. Confirmação da otimização in vitro por injeção direta em embriões de aves. Expressão de EGFP em gônadas dos embriões no dia 14.
[0058] Figura 5. Injeção direta de DNA que codifica EGFP e um constructo com múltiplas ogivas (“multi-warhead”) que compreende várias sequências que codificam shRNAs complexados com a lipofectamina 2000 em embriões da linhagem de frango de corte. Imagens fluorescentes de gônadas no dia 12.
[0059] Figura 6. Injeção direta de DNA que codifica EGFP, e um constructo com múltiplas ogivas e constructo em forma de grampo (“hairpin”) estendido complexado com lipofectamina 2000 em embriões da linhagem das galinhas poedeiras. Imagens fluorescentes das gônadas dos embriões do dia 14 após a injeção direta.
[0060] Figura 7. Injeção direta do constructo Tol2-EGFP com cada um dos dois cassetes de expressão de shRNA múltiplos (pMAT084 e pMAT085). Imagens de 10 gônadas tiradas no dia 14, mostrando a expressão de EGFP.
[0061] Figura 8. Eletroforese em gel da varredurados produtos de PCR indicando a integração do shRNA PB nos embriões injetados diretos. O DNA foi extraído de uma amostra de PGC enriquecidas a partir dos embriões tratados com ZFN, bem como, de embriões de controle em 5 dias após a injeção direta com ZFN e um plasmídeo de reparação (contendo o shRNA de PB). Um PCR de varredura foi, em seguida, realizado para detectar a integração do shRNA de PB no genoma. A raia 1 mostra embriões injetados com PB, embriões de controle na raia 2, células tratadas com ZFN na raia 3 (controle positivo) e a raia 4 é um controle de água.CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIASSEQ ID NO: 1 - sequência polinucleotídica doconstructo de EGFP Tol2;SEQ ID NO: 2 - sequência de aminoácidos da transposaseTol2;SEQ ID NO: 3 - iniciador do oligonucleotídeo davarredura 7;SEQ ID NO: 4 - iniciador do oligonucleotídeo davarredura 6;SEQ ID NO: 5 - iniciador do oligonucleotídeo normal deminiTol2;SEQ ID NO: 6 - iniciador do oligonucleotídeo reversode miniTol2;SEQ ID NO: 7 - sonda de detecção de miniTol2; SEQ ID NO: 8 - iniciador normal da região de controlegenômica;SEQ ID NO: 9 - iniciador reverso da região de controlegenômica;SEQ ID NO: 10 - sonda da região de controle genômica.
[0062] A menos que seja definido de outra forma,todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento devem ser considerados como possuindo o mesmo significado que é comumente compreendido por uma pessoa versada na técnica normal (por exemplo, em química de proteínas, bioquímica, cultura de células, genética molecular, microbiologia e Imunologia).
[0063] A menos que seja indicado de outra forma, oDNA e a proteína recombinante, a cultura de células e as técnicas imunológicas utilizadas no presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Essas técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tais como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3° ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3a ed. Springer (1994), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), e F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o momento), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o momento).
[0064] O termo "aviário", conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer espécie, subespécie ou raça de organismo da classe taxonômica Aves, tais como, mas sem se limitar, a tais organismos como galinha, peru, pato, ganso, codorna, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos e ratites, incluindo avestruz, ema e casuar. O termo inclui as diversas variedades conhecidas de Gallus gallus (galinhas), por exemplo, White Leghorn, Brown Leghorn, Rock Barrada, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Cornish, Minorca, Amrox, California Gray e Partidge-coloured italiana, bem como tipos de perus, faisões, codornas, pato, avestruzes e outras aves domésticas comumente criadas em quantidades comerciais.
[0065] O termo "aves domésticas" inclui todas as aves mantidas, criadas ou domesticadas para a produção de carne ou ovos, por exemplo, galinha, peru, avestruz, codorna, pombo, galinha d’angola, faisão, pato, ganso e ema.
[0066] Conforme utilizado na presente invenção, uma “ave geneticamente modificada” ou “ave transgênica" refere- se a qualquer ave na qual uma ou mais das células da ave contém ácido nucleico heterólogo introduzido por meio de intervenção humana.
[0067] A linhagem germinativa nas galinhas é iniciada como as células do epiblasto de um ingresso de embrião no estágio X no hipoblasto nascente (Kagami et al., 1997; e Petitte, 2002). Conforme o hipoblasto se desenvolve anteriormente, as células germinativas primordiais são empurradas para frente no germinal crescente, onde elas podem ser identificadas como as células grandes carregadas com glicogênio. A primeira identificação das células na linhagem germinativa por estes critérios morfológicos ocorre a cerca de 8 horas após o início da incubação (fase 4 usando o sistema de estágios estabelecido por Hamburger e Hamilton, (1951)). As células germinativas primordiais residem no crescente germinal do estágio 4, até elas migrarem através da vasculatura durante os estágios 12 a 17. Neste momento, as células germinativas primordiais são uma pequena população de cerca de 200 células. A partir da vasculatura, as células germinativas primordiais migram para dentro da crista genital e são incorporadas nos ovários ou testículos conforme a gônada se diferencia.
[0068] As galinhas quiméricas da linhagem germinativa foram geradas anteriormente por transplante das PGCs doadoras e das células germinativas da gônada a partir de vários estágios de desenvolvimento (blastoderma até o embrião de 20 dias) nos embriões receptores. Métodos para obter galinhas transgênicas de culturas de longo prazo das células germinativas primordiais de aves (PGCs) também foram descritos, por exemplo, no pedido de patente US 20060206952. Quando combinados com um embrião da ave hospedeira por procedimentos conhecidos, aqueles PGCs modificados são transmitidos através da linhagem germinativa para produzir descendência geneticamente modificada.
[0069] Ao contrário dos métodos comumente usados datécnica anterior, que se baseiam na coleta de embriões doadores, os métodos da presente invenção envolvem a injeção direta de uma mistura de transfecção em um embrião da ave. Assim, os métodos da invenção podem ser usados para transfectar células germinativas de aves, incluindo PGCs e células germinativas embrionárias.
[0070] Nos métodos da presente invenção, umpolinucleotídeo é complexado ou misturado com um reagente de transfecção apropriado. O termo "reagente de transfecção", conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma composição adicionada ao polinucleotídeo para aumentar a absorção do polinucleotídeo em uma célula eucariótica incluindo, mas sem se limitar, a uma célula aviária, como uma célula germinativa primordial. Embora qualquer reagente de transfecção conhecido na técnica como sendo apropriado para transfectar células eucarióticas podeser usado, os presentes inventores verificaram que os reagentes de transfecção compreendendo um lipídio catiônico são particularmente úteis nos métodos da presente invenção. Assim, em uma modalidade preferencial, lipídios catiônicos monovalentes são selecionados a partir de um ou mais de DOTMA (cloreto de N-[1-(2,3-dioleoilóxi)-propil]-N,N,N- trimetilamônio), DOTAP (1,2-bis(oleoilóxi)-3-3-(trimetilamônio)propano), DMRIE (brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamônio) ou DDAB (brometo de dimetildioctadecilamônio). Lipídios catiônicos polivalentes selecionado preferenciais são liposperminas, especificamente DOSPA (trifluoracetato de 2,3-dioleilóxi-N- [2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1,1-propanamínio) e DOSPER (1,3-dioleoilóxi-2-(6-carboxiespermil)- propilamida), e as di e tetra-alquiltetrametilesperminas,incluindo, mas sem se limitar, a TMTPS(tetrametiltetrapalmitoilespermina), TMTOS(tetrametiltetraoleilespermina), TMTLS(tetrametiltetralaurilespermina), TMTMS(tetrametiltetramiristilespermina) e TMDOS(tetrametildioleilespermina). Lipídios catiônicos sãoopcionalmente combinados com lipídios não catiônicos, particularmente lipídios neutros, por exemplo, lipídios como DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina), DPhPE(diftanoilfosfatidiletanolamina) ou colesterol. Umacomposição de lipídio catiônico composta de uma mistura 3:1(p/p) de DOSPA e DOPE, ou uma mistura 1:1 (p/p) de DOTMA eDOPE são geralmente úteis nos métodos da invenção. Exemplosnão limitantes dos reagentes de transfecção comercialmente disponíveis adequados compreendendo lipídios catiônicos incluem lipofectamina (Life Technologies) e lipofectamina 2000 (Life Technologies).
[0071] Em geral, qualquer dendrímero que pode serempregados para introduzir ácido nucleico em qualquer célula, particularmente em uma célula eucariótica, é útil nos métodos desta invenção. Os dendrímeros da geração 5 ou superior (G5 ou superior) são preferenciais, com os da geração entre G5-G10 sendo de particular interesse. Dendrímeros que podem ser úteis na invenção incluem aqueles com NH3 ou núcleos de etilenodiamina, GX(NHs) ou GX(EDA), onde X= o número da geração. Com os dendrímeros onde X = 5 a 10 sendo preferenciais. Os dendrímeros que podem ser úteis na invenção incluem aqueles nos quais a unidade de repetição das camadas internas é um amidoamina (para formar poliamidoaminas, ou seja, PAMAMs). Dendrímeros úteis incluem aqueles em que os grupos funcionais terminais na superfície externa do dendrímero proporcionam uma densidade de carga positiva, por exemplo, tal como acontece com os grupos funcionais de amina terminais. A carga de superfície e a natureza química da superfície externa dos dendrímeros podem variar, mediante alteração dos grupos funcionais na superfície, por exemplo, pela reação de alguns ou de todos os grupos amina de superfície. De particular interesse são os dendrímeros que são funcionalizados pela reação com os aminoácidos catiônicos, como lisina ou arginina. Dendrímeros enxertados conforme descrito, por exemplo, nos pedidos PCT WO 9622321 e WO 9631549 citados na Patente Norte-Americana No. 5.266.106 podem ser utilizados nos métodos dessa invenção. Dendrímeros ativados (Haensler e Szoka, 1993; e Tang et al., 1996), também podem ser utilizados nos métodos da invenção.
[0072] O reagente de transfecção pode adicionalmente compreender sequências de peptídeos de proteínas virais, bacterianas ou animais e outras fontes, incluindo peptídeos, proteínas ou fragmentos ou partes dos mesmos que podem melhorar a eficiência da transfecção das células eucarióticas mediada pelos agentes de transfecção, incluindo lipídios catiônicos e dendrímeros. Tais peptídeos são descritos em US 20030069173 e incluem, por exemplo, peptídeos virais ou proteínas do vírus influenza, adenovírus, vírus da floresta de Semliki, HIV, hepatite, vírus herpes simplex, vírus da estomatite vesicular ou vírus símio 40 e, mais especificamente, uma sequência peptídica RGD, uma sequência peptídica NLS e/ou uma sequência peptídica VSVG, e os peptídeos ou proteínas virais de cada um dos anteriores.
[0073] O polinucleotídeo pode ser misturado (ou"complexado") com o reagente de transfecção de acordo com as instruções dos fabricantes ou protocolos conhecidos. A título de exemplo, ao transfectar o DNA de plasmídeo com o reagente de transfecção lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies), DNA pode ser diluído em 50 μL do meio Opit-MEM e misturado com suavidade. O reagentelipofectamina 2000 é misturado suavemente e uma quantidade apropriada é diluída em 50 μL de meio Opti-MEM. Após um período de incubação de 5 minutos, o DNA diluído e o reagente de transfecção são combinados e misturados delicadamente à temperatura ambiente durante 20 minutos.
[0074] Um volume adequado da mistura de transfecçãopode ser, em seguida, injetado diretamente em um embrião da ave de acordo com o método da invenção. Tipicamente, um volume adequado para a injeção em um embrião da ave é de cerca de 1 μL a cerca de 3 μL, embora volumes adequados podem ser determinados por fatores como o estágio do embrião e as espécies de aves sendo injetadas. A pessoa versada na técnica perceberá que os protocolos para misturar o reagente de transfecção e DNA, bem como o volume a ser injetado no embrião da ave, podem ser otimizados tendo em conta os ensinamentos do presente relatório descritivo.
[0075] Antes da injeção, os ovos são incubados a uma temperatura adequada para o desenvolvimento embrionário, por exemplo, de cerca de 37,5 a 38°C, com a extremidade pontiaguda (taglion) para cima durante cerca de 2,5 dias (estágios 12 a 17), ou até o momento em que os vasos sanguíneos no embrião atingissem tamanho suficiente para permitir a injeção. O momento ideal para a injeção da mistura de transfecção é o momento da migração do PGC que, normalmente, ocorre aproximadamente nos estágios 12 a 17, porém mais preferencialmente nos estágios 13 a 14. Conforme a pessoa versada na técnica irá notar, as galinhas da linhagem de frango de corte têm, tipicamente, embriões de crescimento mais rápido e, portanto, a injeção deve preferencialmente ocorrer ainda nos estágios 13 a 14, de forma a introduzir a mistura de transfecção na corrente sanguínea no momento da migração do PGC.
[0076] Para acessar um vaso sanguíneo do embrião da ave, um buraco é feito na casca do ovo. Por exemplo, um buraco de cerca de 10 mm pode ser feito na extremidade pontiaguda do ovo usando um utensílio apropriado, como um fórceps. A seção de casca e das membranas associadas é removida cuidadosamente, evitando danos ao embrião e às suas membranas.
[0077] Micropipetas de tubo capilar de vidro siliconizado podem ser usadas para injetar a mistura de transfecção nos vasos sanguíneos do embrião da ave. Normalmente, as micropipetas são retiradas ou “puxadas” com um puxador de micropipetas e as pontas são chanfradas com o auxílio de um afiador de pipetas até um diâmetro (abertura interna) de cerca de 10 μm até cerca de 50 μm de diâmetro, mais preferencialmente de cerca de 25 μm até cerca de 30 μm de diâmetro. As micropipetas são tipicamente afiladas até um diâmetro de cerca de 25 μm a cerca de 30 μm, para facilitar a injeção das PGCs em um embrião da ave. A pessoa versada na técnica irá perceber que um diâmetro mais estreito pode ser utilizado nos métodos da presente invenção, uma vez que a mistura de transfecção não compreende as células. Uma micropipeta produzida desta forma é também referida como um "capilar de vidro puxado".
[0078] Um capilar de vidro puxado é carregado comcerca de 1 a 3 μL do complexo de transfecção. A injeção é feita em qualquer vaso sanguíneo de tamanho suficiente para acomodar o capilar, como a veia marginal ou a aorta dorsal, ou qualquer outro vaso sanguíneo de tamanho suficiente para comportar o capilar. Pressão de ar pode ser usada para expulsar o complexo de transfecção do capilar para dentro do vaso sanguíneo.
[0079] Após a injeção da mistura de transfecçãopara dentro do vaso sanguíneo do embrião da ave, o ovo é selado usando uma quantidade suficiente de parafilme, ou outro filme selante apropriado, tal como é conhecido na técnica. Por exemplo, onde um furo de 10 mm foi feito na casca, um pedaço quadrado de aproximadamente 20 mm de parafilme pode ser usado para cobrir o buraco. Uma lâmina de bisturi pode ser, em seguida, usada para afixar o parafilme à superfície exterior do ovo. Os ovos são, em seguida, invertidos até a posição com a extremidade pontiaguda para baixo e incubados a uma temperatura suficiente para o embrião se desenvolver, tal como até após a análise ou chocar o ovo.
[0080] Conforme utilizado na presente invenção, as frases "temperatura suficiente para o embrião se desenvolver" e "temperatura suficiente para o embrião para se desenvolver em uma galinha" referem-se às temperaturas de incubação que são necessárias para um embrião da ave continuar a se desenvolver no ovo e, de preferência, se desenvolver em um pinto que está pronto para sair do ovo. As temperaturas de incubação adequadas podem ser determinadas pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, um ovo de galinha é normalmente incubado de cerca de 35,8 a cerca de 38°C. Incubadoras são comercialmente disponíveis, que controlam a temperatura de incubação em níveis desejáveis, por exemplo, de 37,9°C nos dias 1 a 6 após a colocação do ovo, cerca de 37,6°C nos dias 9 e 10, cerca de 37,5°C nos dias 11 e 12, cerca de 37,4°C no dia 13, cerca de 37,3°C nos dias 14 e 15, cerca de 37,2°C no dia 16 e cerca de 37,1°C no dia 17, e que podem diminuir até cerca de 35,8°C por volta do dia 22.Integração genômica dos polinucleotídeos
[0081] Para facilitar a integração do polinucleotídeo no genoma das células germinativas de aves, preferencialmente de um transposão, a nuclease de dedo do zinco, ou outro constructo ou vetor não viral, é usada no método da invenção.
[0082] Exemplos de transposãos apropriados incluem Tol2 (Kawakami et al., 2002), mini-Tol2, Bela Adormecida (Ivies et al., 1997), PiggyBac (Ding et al., 2005), Mariner e Galluhop. O transposão Tol2 que foi primeiramente isolado do peixinho dos arrozais Oryzias latipes e pertence à família hAT de transposãos é descrito em Kawakami et al. (2000). Mini-Tol2 é um variante do Tol2 e é descrito em Balciunas et al. (2006). Os transposãos Tol2 e Mini-Tol2 facilitam a integração de um transgene no genoma de um organismo ao agir em conjunto com a transposase Tol2. Ao entregar a transposase Tol2 em um plasmídeo não replicante separado, apenas o transposão Tol2 ou Mini-Tol2 e o transgene são integrados no genoma, e o plasmídeo contendo a transposase Tol2 é perdida em um número limitado de divisões celulares. Assim, um transposão Tol2 ou Mini-Tol2 integrado já não terá a capacidade de sofrer um evento de transposição subsequente. Além disso, como o Tol2 não é conhecido por ser um transposão aviário de ocorrência natural, não há nenhuma atividade da transposase endógena em uma célula aviária, por exemplo, uma célula de galinha, para causar mais eventos de transposição. Como seria compreendido na técnica, um RNA que codifica a Tol2 transposase pode ser incluída na mistura de transfecção como uma alternativa para um plasmídeo de DNA que codifica a transposase. Assim, o transposão Tol2 e a transposase são particularmente adequados para uso nos métodos da presente invenção.
[0083] Qualque r outro sistema de transposão adequado pode ser usado nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o sistema de transposão pode ser um sistema de transposão Bela Adormecida, Frog Prince ou Mosl, ou qualquer transposão pertencente à família de transposãos tel/mariner ou hAT pode ser usado.
[0084] A pessoa versada na técnica compreenderá que pode ser desejável incluir elementos genéticos adicionais nos constructos a serem injetados no embrião da ave. Exemplos de um elemento genético adicional que pode ser incluído no constructo de ácido nucleico incluem um gene repórter, como um ou mais genes para uma proteína marcadora fluorescente como GFP ou RFP; uma enzima facilmente analisada, como a beta-galactosidase, luciferase, beta- glicuronidase, acetiltransferase cloranfênica ou fosfatase alcalina secretada embrionária; ou proteínas para as quais os imunoensaios estão prontamente disponíveis, tais como hormônios ou citocinas. Outros elementos genéticos que podem encontrar uso nas modalidades da presente invenção incluem aqueles que codificam as proteínas que conferem uma vantagem seletiva de crescimento em células, como a adenosina desaminase, fosfotransferase aminoglicoidica, di- hidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase ou resistência a fármacos.
[0085] As tecnologias de edição de genoma também podem ser utilizadas nos métodos da invenção. A título de exemplo, a tecnologia de edição do genoma pode ser uma nuclease de direcionamento. Conforme utilizado na presente invenção, o termo "nuclease de direcionamento" inclui a referência a uma proteína de ocorrência natural, ou uma proteína modificada. Em uma modalidade, a endonuclease de direcionamento pode ser uma meganuclease. As meganucleases são endodesoxirribonucleases caracterizadas por longas sequências de reconhecimento, ou seja, a sequência de reconhecimento geralmente varia de cerca de 12 pares de base a cerca de 40 pares de bases. Como consequência desse requisito, a sequência de reconhecimento geralmente ocorre apenas uma vez em qualquer determinado genoma. Entre as meganucleases, a família das endonucleases residentes chamada LAGLIDADG tornou-se uma ferramenta valiosa para o estudo de genomas e engenharia genômica. Uma meganuclease pode ser direcionada para uma sequência cromossômica específica, por meio da modificação de sua sequência de reconhecimento usando técnicas bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica.
[0086] Em outra modalidade, a “nuclease de direcionamento” é uma nuclease de dedo do zinco. Nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são nucleases artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. Domínios de dedo de zinco podem ser manipulados para alvejar as sequências de DNA desejadas, e isso permite que as nucleases de dedo de zinco sejam direcionadas para sequências únicas dentro de genomas complexos. Ao tirar vantagem da maquinaria de reparo de DNA endógeno, esses reagentes podem ser usados para alterar precisamente os genomas de organismos superiores. As nucleases de dedo de zinco são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, na Patente Norte-Americana No. 7.241.574 e revistas em Durai et al. (2005) e em Davis e Stokoe (2010).
[0087] Antes da presente invenção, esperava-se que, para modificar PGCs usando a tecnologia da nuclease de dedo do zinco, os constructos de dedo de zinco poderiam ser introduzidos nas PGCs cultivadas. As células transfectadas que compreendem as inserções/modificações desejadas poderiam, então, ser selecionadas e clonadas. As células clonadas e selecionadas poderiam ser injetadas em um embrião receptor esgotado de PGC.
[0088] Os presentes inventores verificaram, surpreendentemente, que a injeção direta de um constructo da nuclease de dedo do zinco em um embrião da ave resultou em uma modificação genômica específica que poderia ser detectada na gônada do embrião transfectado no dia 14. Essa verificação foi surpreendente porque se esperava que os níveis de eficiência combinados da transfecção e de atividade da nuclease de dedo do zinco poderiam ser muito baixos para detectar uma modificação específica em um embrião diretamente injetado. Tendo em vista a especificidade do direcionamento das sequências de DNA desejadas e o fato de os presentes inventores terem verificado que a combinação de uma nuclease de dedo do zinco e reagente de transfecção diretamente injetados em um embrião alcançaram níveis de eficiência mais altos do que os níveis esperados, as nucleases de dedo de zinco são particularmente úteis para introduzir um polinucleotídeo no genoma de uma célula germinativa de ave nos métodos da presente invenção.
[0089] Em ainda outra modalidade, a endonuclease de direcionamento pode ser uma nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE) (consulte, por exemplo, Zhang et al., 2011). TALEs são fatores de transcrição do patógeno vegetal Xanthomonas que podem ser prontamente manipulados para se ligar aos novos alvos de DNA. TALEs, ou suas versões truncadas, podem estar ligados ao domínio catalítico das endonucleases, como Fokl, para criar a endonuclease de direcionamento chamada de nucleases TALE ou TALENs.
[0090] Em ainda outra modalidade, a “nuclease dedirecionamento” é uma nuclease de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interespaçadas e Agrupadas (CRISPR) (Barrangou, 2012). CRISPR é um sistema de nuclease microbiano envolvido na defesa contra fagos e plasmídeos invasores.
[0091] Os loci CRISPR em hospedeiros microbianoscontêm uma combinação de genes associados com CRISPR (Cas), bem como elementos de RNA não codificantes capazes de programar a especificidade da clivagem do ácido nucleico mediada por CRISPR. Três tipos (I-III) de sistemas CRISPR foram identificados em uma ampla faixa de hospedeiros bacterianos. Uma característica-chave de cada locus CRISPR é a presença de uma matriz de sequências repetitivas (repetições diretas), intercaladas por trechos curtos de sequências não repetitivas (espaçadores). A matriz CRISPR não codificante é transcrita e clivada dentro de repetições diretas em crRNAs curtos contendo sequências espaçadoras individuais, que direcionam as Cas nucleases para o sítio alvo (protoespaçador).
[0092] A CRISPR tipo II é um dos sistemas mais bemcaracterizados (por exemplo, consulte Cong et al., 2013) e realiza a quebra orientada da fita dupla de DNA em quatro etapas sequenciais. Primeiro, dois RNAs não codificantes, a matriz de pré-crRNA e tracrRNA, são transcritas a partir do lócus CRISPR. Posteriormente, o tracrRNA hibridiza para as regiões de repetição do pré-crRNA e medeia o processamento do pré-crRNA nos crRNAs maduros contendo as sequências espaçadoras individuais. Em terceiro lugar, o complexo de crRNA:tracrRNA maduro direciona Cas9 ao DNA alvo através do pareamento de bases de Wastson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA alvo próximo da porção adjacente do protoespaçador (PAM), um requisito adicional para o reconhecimento do alvo. Por fim, o Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo para criar uma ruptura da fita dupla dentro do protoespaçador. O sistema CRISPR também pode ser usado para gerar quebras de fita simples no genoma. Assim, o sistema CRISPR pode ser usado para a edição do específico do sítio guiado por RNA.
[0093] Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para incorporar os polinucleotídeos no genoma das células germinativas primordiais de aves que podem ser transmitidas à prole geneticamente modificada. Os polinucleotídeos integrados no genoma podem conferir uma função ou atividade desejável sobre as células geneticamente modificadas, compreendendo o polinucleotídeo tal como, por exemplo, modificar uma característica de produção ou aumento da resistência às doenças. Assim, os polinucleotídeos que podem ser integrados ao genoma das células germinativas incluem aqueles que codificam RNAs interferentes curtos (siRNAs), RNAs hairpin curtos (shRNAs), RNAs “hairpin” curtos estendidos (ehRNAs), RNAs catalíticos como ribozimas, RNAs falsos, bem como aqueles que codificam polipeptídeos endógenos ou exógenos, tais como aqueles que podem ser usados para modular uma característica de produção ou aumentar a resistência às doenças em uma ave.
[0094] Des sa forma, em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para modificar qualquer característica de uma espécie aviária.Características preferenciais que podem ser modificadas incluem características de produção e de resistência a doenças. Conforme utilizado na presente invenção, o termo "característica de produção" refere-se a qualquer fenótipo de uma ave que tem valor comercial, tais como massa muscular, sexo, resistência a doenças ou teor nutricional. Características preferenciais que podem ser modificadas de acordo com os métodos da presente invenção incluem sexo, massa muscular e resistência a doenças. Exemplos dos genes que podem ser direcionados para modificar o sexo como uma característica de produção em uma ave incluem DMRT1, WPKCI (ASW), R-espondina, FOX9, aromatase, AMH e β-catenina.
[0095] Conforme utilizado na presente invenção, otermo "massa muscular" refere-se ao peso do tecido muscular. Um aumento na massa muscular pode ser determinado por pesagem do tecido muscular total de um pássaro, que é chocado de um ovo tratado conforme descrito nesse documento, em comparação com um pássaro da mesma espécie de ave, mais preferencialmente de um tipo ou raça de ave, e ainda mais preferencialmente o mesmo pássaro ao qual um ácido nucleico não foi administrado, conforme definido neste documento. Alternativamente, músculos específicos, tais como os músculos do peito e/ou da coxa, podem ser usados para identificar um aumento na massa muscular. Os genes que podem ser direcionados para a modulação da massa muscular incluem, por exemplo, o gene da miostatina.
[0096] Em certas modalidades, os métodos dapresente invenção utilizam moléculas de ácidos nucleicos que codificam regiões de fita dupla para interferência de RNA, a fim de modular características em uma ave. Os termos "interferência de RNA", "RNAi" ou "silenciamento gênico" referem-se, geralmente, a um processo no qual uma molécula de RNA de fita dupla reduz a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos com a qual a molécula de RNA de fita dupla compartilha homologia substancial ou total. No entanto, foi demonstrado que a interferência de RNA pode ser alcançada usando moléculas de fita dupla diferentes de RNA (consulte, por exemplo, US 20070004667).
[0097] As regiões de fita dupla devem ser de, pelo menos, 19 nucleotídeos contíguos, por exemplo, cerca de 19 a 23 nucleotídeos, ou podem ser mais longas, por exemplo, de 30 ou 50 nucleotídeos, ou de 100 nucleotídeos ou mais. A sequência completa que corresponde ao transcrito do gene inteiro pode ser usada. De preferência, elas possuem cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento.
[0098] O grau de identidade de uma região de fita dupla de uma molécula de ácido nucleico em relação ao transcrito alvo deve ser de pelo menos 90% e, mais preferencialmente, de 95 a 100%. A molécula de ácido nucleico pode, certamente, compreender sequências não relacionadas que podem funcionar para estabilizar a molécula.
[0099] O termo "RNA de interferência curto" ou "siRNA", conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende ribonucleotídeos capazes de inibir ou infrarregular a expressão gênica, por exemplo, mediando o RNAi de modo específico para a sequência, sendo que a porção de fita dupla é menor que 50 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente de cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, o siRNA pode ser uma molécula de ácido nucleico que compreende regiões de sentido e antissentido autocomplementares, sendo que a região antissentido compreende a sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo, ou uma porção da mesma, e a região de sentido possui uma sequência de nucleotídeos que corresponde à sequência de ácidos nucleicos alvo, ou uma porção da mesma. O siRNA pode ser montado a partir de doisoligonucleotídeos separados, onde uma fita é a fita de sentido e a outra é a fita antissentido, em que as fitas desentido e antissentido são autocomplementares.
[00100] Conforme utilizado na presente invenção, otermo siRNA tem o propósito de ser equivalente a outros termos usados para descrever moléculas de ácido nucleico que são capazes de mediar o RNAi de sequência específica, por exemplo, micro-RNA (miRNA), RNA de hairpin curto (shRNA), oligonucleotídeo interferente curto, ácido nucleico interferente curto (siNA), oligonucleotídeo modificado interferente curto, siRNA quimicamentemodificado, RNA de silenciamento gênico pós-transcricional (ptgsRNA) e outros. Além disso, conforme utilizado na presente invenção, o termo RNAi tem o propósito de ser equivalente a outros termos usados para descrever a interferência de RNA de sequência específica, como um silenciamento gênico pós-transcricional, inibição de tradução ou epigenética. Por exemplo, moléculas de siRNA, conforme descritas nesse documento, podem ser usadas para silenciar, epigeneticamente, os genes tanto a nível pós- transcricional quanto a nível pré-transcricional. Em um exemplo não limitador, a regulação epigenética da expressão gênica por moléculas de siRNA, conforme descrito nesse documento, pode resultar da modificação mediada pelo siRNA da estrutura da cromatina para alterar a expressão gênica.
[00101] Por "shRNA" ou "RNA de hairpin curto" se entende uma molécula de RNA onde menos de cerca de 50 nucleotídeos, preferencialmente cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos, são pareados em termos de base, com uma sequência complementar localizada na mesma molécula de RNA, e onde a dita sequência e sequência complementar são separadas por uma região não pareada de pelo menos cerca de 4 a cerca de 15 nucleotídeos, que forma uma alça de fita única acima da estrutura da haste criada pelas duas regiões de complementaridade de base.
[00102] Os shRNAs incluídos são duplos ou dsRNAs hairpin com dois ou múltiplos dedos, em que a molécula de RNA compreende duas ou mais de tais estruturas de haste- alça, separadas por regiões espaçadoras de fita simples.
[00103] A regulação do microRNA é uma ramificação especializada da via de silenciamento do RNA que evoluiu no sentido da regulação gênica, divergindo do RNAi/PTGS convencional. MicroRNAs são uma classe específica de RNAs pequenos que são codificados em elementos tipo gene organizados em uma repetição invertida característica. Quando transcritos, os genes de microRNA dão origem aos RNAs precursores de haste-alça, dos quais os microRNAs são posteriormente processados. Os microRNAs possuem tipicamente cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. Os miRNAs liberados são incorporados em complexos tipo RISC contendo um subconjunto particular de proteínas agronautas que exercem repressão do gene específica da sequência.
[00104] Os métodos da presente invenção podem ser usados para integrar um polinucleotídeo que confere resistência a doenças por meio da célula, no genoma de células germinativas primordiais em um embrião da ave. Por exemplo, o polinucleotídeo pode codificar uma molécula de ácido nucleico, como um siRNA, shRNA ou miRNA, que reduz a expressão de um gene hospedeiro ou patógeno, resultando em uma diminuição da replicação viral nas células nas quais o polinucleotídeo está presente. "Replicação viral", conforme utilizado na presente invenção, refere-se à amplificação do genoma viral em uma célula hospedeira, o empacotamento do genoma viral em uma célula e/ou a liberação de partículas virais infecciosas de uma célula.
[00105] Alternativamente, o polinucleotídeo pode codificar um RNA falso. RNAs falsos são conhecidos na técnica e contêm sequências de bases de nucleotídeos particulares, que se ligam às proteínas virais que são essenciais para a replicação do vírus patogênico. RNAs falsos direcionados a proteínas do HIV foram primeiramente descritos por Sullenger et al. (1990). A pessoa versada na técnica compreenderá, no entanto, que RNAs falsos podem ser projetados para atingir proteínas que desempenham uma função na replicação de patógenos virais de aves, como RNAs falsos direcionados para as proteínas do complexo da polimerase do vírus influenza.
[00106] Preferencialmente, pela redução da replicação do vírus nas células de aves, as aves geneticamente modificadas compreendendo o polinucleotídeo terão maior resistência a um patógeno viral. Conforme utilizado na presente invenção, uma ave que é "resistente" ou que tem “maior resistência” a um agente patogênico ou agente patogênico viral apresenta menos sintomas, ou nenhum sintoma da doença em comparação com uma ave suscetível, quando exposta ao agente patogênico. Usando os métodos da invenção, as aves podem se tornar resistentes aos agentes patogênicos, tais como, mas sem se limitar, ao vírus influenza, vírus da doença de Marek, vírus da doença de Newcastle e vírus da doença infecciosa da bursa.Produção de proteínas recombinantes no ovo
[00107] Petitte e Modziak (2007) descrevem a galinha doméstica como um "biorreator de proteínas muito eficiente". Reconhecendo que o ovo de ave contém grandes quantidades de proteína, e mais da metade da proteína na clara de ovo ou albumina compreende uma única espécie, existe grande potencial na produção de proteínas recombinantes ou heterólogas em ovos. As dificuldades encontradas nos métodos da técnica anterior de produção de aves domésticas transgênicas para a produção de proteínas terapêuticas em ovos são bem descritas na técnica. Embora tenha se conseguido usando um sistema de lentivírus indesejável, a produção de aves transgênicas que depositam altos níveis de proteínas comercialmente relevantes em um ovo foi alcançada. Nesse sentido, os métodos da presente invenção podem ser usados para produzir aves geneticamente modificadas que expressam um polipeptídeo heterólogo ou recombinante nos ovos. As proteínas de importância comercial que poderiam ser produzidas em ovos incluem proteínas terapêuticas, tais como anticorpos e antígenos de vacina.Produção e reprodução de aves geneticamente modificadas
[00108] Os métodos da presente invenção incluemmétodos de reprodução de aves geneticamente modificadas e métodos de produção de alimentos de aves geneticamente modificadas. A pessoa versada na técnica compreenderá que uma ave da invenção, compreendendo células germinativas geneticamente modificadas, pode possuir uma linhagem germinativa quimérica, em que apenas algumas das células germinativas que migraram para as gônadas são geneticamente modificadas. Assim, a ave que compreende as células germinativas geneticamente modificadas podem ser criadas para produzir prole, na qual todas as células são geneticamente modificadas. Dessa forma, em uma modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma ave geneticamente modificada, o método compreendendo: (i) obter a ave compreendendo as células germinativas geneticamente modificadas, de acordo com a invenção (ii) reproduzir a partir das aves que compreendem as células germinativas geneticamente modificadas para produzir a prole e (iii) selecionar a prole compreendendo o polinucleotídeo inserido no genoma.
[00109] As aves que compreendem as célulasgerminativas geneticamente modificadas da invenção, e as aves geneticamente modificadas de acordo com a invenção podem ser usadas na produção de alimentos. Assim, os métodos da invenção são aplicáveis à produção de produtos de aves domésticas para consumo humano e animal. Os métodos de produção de alimentos derivados de aves domésticas são bem conhecidos na arte e podem compreender a coleta de carne e/ou ovos de aves domésticas, tais como, mas sem se limitar, a uma galinha. Em certas modalidades, a ave foi geneticamente modificada para incluir um polinucleotídeo que modula uma característica de produção.
[00110] 5,1 μg de um constructo de ácido nucleico que codifica GFP melhorado (EGFP) flanqueado pelas sequências Tol2 e 1,0 μg de um plasmídeo que codifica a transposase Tol2 foram complexados com 3 μL de lipofectamina 2000. A complexação dos ácidos nucleicos e do reagente de transfecção foram realizadas em um volume total de 90 μL de meio OptiMEM ou OptiPRO usando os tempos de incubação recomendados pelo fabricante (Life Technologies).
[00111] Após os 20 últimos minutos de incubação, de1 a 3 μL do complexo foi injetado em um vaso sanguíneo dos embriões de galinha de 2,5 dias (estágios 13 a 17;Hamburger e Hamilton, 1951). Nenhuma remoção de sangue foi necessária. O acesso ao embrião foi alcançado pela remoção de uma pequena seção (10 mm) da casca. Após a injeção, o buraco foi selado com um quadrado de parafilme de 20 mm quadrados.
[00112] A expressão da EGFP foi observada no dia 7 e no dia 14, na maioria das gônadas em diferentes níveis. As células dissociadas das gônadas e as células verdes também demonstraram ser PGCs (figuras 1, 2 e 3). Exemplo 2. Otimização in vitro do DNA para as razões de reagente de transfecção
[00113] Foram realizados experimentos para testar a razão ótima de DNA: Lipofectamina 2000 e o volume dos meios para compor o complexo de transfecção. Um constructo de DNA que codifica EGFP e um único hairpin (shRNA) com sequências Tol2 franqueadoras foi complexado com lipofectamina 2000 em volumes de OptiMEM de 50, 40, 30 ou 20 μL. As razões de DNA (μg) para lipofectamina 2000 (μL) utilizadas foram as seguintes: 1:2, 2:4 e 4:8.
[00114] Os complexos foram transfectados nas células de fibroblastos de galinhas (DF-1) e analisados a partir da expressão da EGFP. Os resultados indicaram (não mostrado) que uma razão de DNA (μg):lipofectamina 2000, de 1:2 em 30 μL de meio funcionou um pouco melhor do que uma razão de 2:4 em 50 μL.
[00115] Os dados in vitro foram posteriormente confirmados nos embriões. 0,33 μg de constructo de DNA, compreendendo o transposão Tol2, 0,66 μg do plasmídeo transposase e 2 μL de lipofectamina 2000 foram complexados em OptiMEM e injetados diretamente nos embriões de galinha. Todos os embriões vivos apresentaram bons níveis de expressão de EGFP no dia 14 (figura 4).Exemplo 3. Teste do reagente de transfecção FuGene
[00116] FuGene (Promega) foi testado como um reagente de transfecção usando uma razão DNA:Fugene semelhante àquela recomendada pelo fabricante para a transfecção da cultura de células. O constructo de DNA complexado com FuGene compreendeu um cassete de expressão de EGFP com sequências flanqueadoras Tol2. O complexo (0,66 μg do constructo EGFP-Tol2, 1,33 μg do plasmídeo transposase, 6 μL de FuGene) foi injetado diretamente em 15 embriões. Um dos embriões apresentou quantidades muito pequenas de expressão de EGFP nas gônadas no dia 14. Esse experimento foi repetido, e no dia 12, todos os 10 embriões que foram injetados ainda estavam vivos. Dois dos embriões possuíam um par de células verdes nas gônadas.Exemplo 4. Transformação por injeção direta das linhagens de frango de corte
[00117] Assim como os experimentos de injeção direta anteriores realizados nas linhagens de galinhas poedeiras, a finalidade desse experimento foi testar se o método de injeção direta poderia ser usado para transformar com sucesso as linhagens de frango de corte. Um constructo de expressão de EGFP compreendendo um único “hairpin” e flanqueando as sequências Tol2 foi complexado com lipofectamina 2000 (0,33 μg de constructo de transposão, 0,66 μg de transposase, 2 μL de lipofectamina 2000) e injetado diretamente na aorta dorsal dos embriões de galinha. Doze dos 13 embriões injetados estavam vivos no dia 10 e boas quantidades de expressão de EGFP foram detectadas na maioria das gônadas.
[00118] Esse experimento foi repetido com um constructo de expressão de EGFP compreendendo vários hairpins (shRNAs) (0,33 μg de transposão, 0,66 μg de transposase e 2 μL de lipofectamina 2000). Boas quantidades de expressão de EGFP foram encontradas nos embriões no dia 12 (figura 5).Exemplo 5. Comparação de OptiMEM com OptiPRO como meio do reagente de transfecção
[00119] Foi feita uma comparação entre o OptiMEM (contendo produtos de origem animal), OptiPRO (sem produtos de origem animal) e PBSA, como o meio do reagente de transfecção. Um constructo de expressão de EGFP compreendendo as sequências flanqueadoras Tol2 foi complexado com o reagente de transfecção (0,33 μg de transposão, 0,66 μg de transposase, 2 μL de Lipofectamina 2000) e injetado diretamente em embriões de galinha. Todos os embriões estavam um pouco verdes nas gônadas no dia 12, e o meio usado não afetou a mortalidade. OptiMEM e OptiPRO produziram resultados equivalentes, enquanto que o PBSA resultou em uma expressão significativamente reduzida do EGFP nas gônadas.Exemplo 6. Linhagens de galinhas poedeiras injetadas com o constructo “multi-warhead” (multi-ogivas)
[00120] Dois constructos de DNA foram complexados com o reagente de transfecção e injetados diretamente nos embriões de galinha. O primeiro constructo de DNA compreendia um cassete de expressão de EGFP e múltiplos “hairpins” de shRNA flanqueados por sequência Tol2, e o segundo constructo compreendia um constructo de expressão de EGFP e um único cassete de “hairpin” estendido codificando três regiões de fita dupla. Os constructos foram complexados com o reagente de transfecção nas seguintes quantidades: 0,33 μg de transposão, 0,66 μg de transposase, 2 μL de lipofectamina 2000. No dia 14, a expressão do EGFP foi encontrada nas gônadas da maioria dos embriões para ambos os constructos.Exemplo 7. Teste de persistência do Tol2-EGFP
[00121] Um constructo de DNA compreendendo umcassete de expressão de EGFP, múltiplos “hairpins” e flanqueado por Tol2 foram complexados com o reagente de transfecção. (0,33 μg de transposão, 2 μL de lipofectamina 2000). O complexo de transfecção sem transposase foi injetado diretamente nos embriões de galinha.
[00122] Os embriões onde a transposase foi omitidaainda apresentaram células verdes em alguns embriões, porém em menos células do que o que foi observado quando a transposase está incluída. Isto sugere que o plasmídeo pode permanecer nas células gonadais durante pelo menos 2 semanas após a injeção direta, e que nem toda a coloração verde observada é devido à integração do Tol2 no genoma.Exemplo 8. Lipofectamina sem ser de origem animal
[00123] Um cassete de expressão de EGFP com Tol2 evários cassetes de expressão de shRNA foi complexado com o reagente de transfecção isento de produtos animais (lipofectamina 2000 CD) (0,33 μg de transposão, 0,66 μg de transposase, 2 μL de lipofectamina 2000 CD). No dia 14, todos os 10 embriões examinados apresentaram boas quantidades de expressão de EGFP nas gônadas (figura 7).Exemplo 9. Injeção direta no dia 3,5
[00124] Em todos os experimentos anteriores,injeções de complexos de transfecção foram realizadas no dia 2,5. A finalidade desse experimento foi testar um tempo alternativo (dia 3,5) para a injeção direta dos embriões. Um constructo de DNA, composto por um constructo de expressão de EGFP e Tol2, foi complexado com lipofectamina 2000CD (0,33 μg de transposão, 0,66 μg de transposase, 2 μLde lipofectamina 2000 CD).
[00125] No dia 14, 8 dos 21 embriões apresentavam pequenas quantidades de expressão de EGFP nas gônadas. Assim, o momento da injeção direta no dia 2,5 é importante, e por volta do dia 3,5, a transfecção eficiente dos PGCs não é observada.Exemplo 10. Alteração das proporções do transposão para transposase
[00126] Mantendo as razões de DNA:lipofectamina 2000 CD:meio, aumentamos a proporção de transposão na mistura de DNA, diminuindo ligeiramente, ao mesmo tempo, a proporção de plasmídeo transposase. Volumes ligeiramente diferentes foram utilizados devido à necessidade de injetar mais ovos em experimentos futuros. Os inventores também testaram a remoção de sangue do embrião antes da injeção da mistura de transfecção para determinar se isso permitiu que um maior volume da mistura fosse injetado.
[00127] Um constructo de DNA compreendendo um cassete de expressão de EGFP e Tol2 foi complexado com o reagente de transfecção. (0,66 μg de transposão, 1,0 μg de transposase, 3 μL de lipofectamina 2000 CD). No dia 14, os embriões antes da sangria apresentavam níveis semelhantes de expressão de EGFP nas gônadas, em comparação com os embriões não pré-sangrados. As novas razões de DNA funcionaram bem, com bons níveis de expressão de EGFP sendo observados.Exemplo 11. Reagente de transfecção JetPEI
[00128] Para o JetPEI, o constructo de DNA compreendendo um cassete de expressão de EGFP e Tol2 foi complexado com o reagente de transfecção (4 μg de transposão, 6 μg de transposase, 1,6 μL de JetPEI (Polyplus transfection) em 50 μL de OptiPRO (com 5% de glicose). O JetPEI causou a coagulação do sangue após a injeção, mas isso não afetou a sobrevivência do embrião. Células verdes foram encontradas nesses embriões e nas gônadas, mas a maioria era morfologicamente diferente dos PGCs transformados observado quando a Lipofectamina2000 foi usada.
[00129] Um segundo experimento foi realizado para testar o reagente de transfecção de JetPEI. Duas misturas reacionais foram utilizadas: i) 0,66 μg de transposão, 1,0 μg de transposase, 0,5 μL de JetPEI em 100 μL de OptiPRO (com 5% de glicose); e ii) 1,32 μg de transposão, 2,0 μg de transposase, 0,5 μL de JetPEI em 100 μL de OptiPRO (com 5% de glicose).
[00130] O JetPEI causou a coagulação do sangue após a injeção, e a mistura reacional (ii) resultou na capacidade de sobrevivência melhorada do embrião. Novamente, certo grau de expressão de EGFP foi verificado nas gônadas, mas novamente o tipo de célula não pareceu ser semelhante à PGC. As gônadas foram removidas e as células dissociadas e coradas para os marcadores de PGC. Não houve células verdes apresentando coloração para os marcadores da PGC, confirmando que as PGCs não estavam sendo transfectadas pelo complexo JetPEI.Exemplo 12. Nuclease de dedo do zinco
[00131] O objetivo do experimento foi determinar se os plasmídeos da nuclease de dedo do zinco podem ser usados para transformar as PGCs pela técnica de injeção direta. O DNA utilizado no experimento compreendia dois plasmídeos de nuclease de dedo do zinco e o fragmento de sobreposição, que estava complexado com o reagente de transfecção que compreendia 0,5 μg de cada plasmídeo, 3 μL de lipofectamina 2000 CD em 90 μL de OptiPRO.
[00132] Como não havia EGFP presente nos plasmídeos, os inventores basearam-se em um teste de PCR que poderia amplificar apenas um fragmento se o fragmento de sobreposição houvesse sido incorporado no genoma da galinha. Após 14 dias de incubação, as gônadas foram removidas, as PGCs enriquecidas usando um método de seleção de anticorpo e o DNA genômico foi preparado. PCR revelou que o fragmento de sobreposição havia sido incorporado no genoma da galinha. Esses resultados demonstram que as nucleases de dedo de zinco são adequadas para integrar o DNA no genoma das PGCs de aves, utilizando o método de injeção direta da presente invenção.Exemplo 13. Resultados
[00133] De acordo com os protocolos descritos acima, os inventores observaram transformação significativa das PGCs nas gônadas dos embriões receptores, e para um grau muito maior do que aquele descrito nos métodos da técnica anterior de transfecção de PGCs. Através da coloração de células com marcadores específicos da PGC, os inventores demonstraram que a maioria das células transformadas na gônada eram PGCs. Os inventores criaram embriões receptores até a maturidade sexual e foram capazes de detectar sequências do transposão Tol2 no sêmen de > 90% dos machos adultos.
[00134] Outros reagentes de transfecção foram usados, no entanto, os reagentes baseados em lipídios proporcionaram melhor transfecção das PGCs. O JetPEI transfectou células por esse método, mas não pode ser mostrado que qualquer uma das células transfectadas eram PGCs. Células FuGene transfectadas em uma taxa muito baixa.Exemplo 14. Modificação por injeção direta do genoma usando nucleases de dedo de zinco
[00135] Uma nuclease de dedo de zinco (ZFN)orientada para uma região do íntron 5 do gene PANK1, foi injetada juntamente com um plasmídeo contendo o shRNA anti-influenza PB 1-2257 e as regiões necessárias para a reparação homóloga em embriões que foram posteriormente analisados quanto à integração do shRNA.
[00136] Um total de 1,5 μg de DNA (500 μg de cadaplasmídeo ZFN e 500 μg do plasmídeo de reparação) foi adicionado a 45 μL de OptiPRO e, em seguida, complexado com 3 μL de lipofectamina2000 CD em 45 μL de OptiPRO antes de ser injetado em 30 ovos 2,5 dias. Os ovos foram incubados até o dia 7, quando as gônadas foram removidas, desassociadas e as PGC enriquecidas por usar um tipo de MACS com um anticorpo SSEA-1 (Santa Cruz Biotech). DNA foi extraído da amostra de PGC enriquecida a partir dos embriões tratados com ZFN, e embriões de controle usando um kit DNAeasy da Qiagen.
[00137] Uma PCR para realizar a varredura pelaintegração bem sucedida do shRNA foi realizada usando um iniciador que se liga ao genoma fora da região usada para reparação homóloga (varredura 7, 5' GTGACTCAGACTCCTGTTAG(SEQ ID NO:3)) e um que se liga ao shRNA (varredura 6, 5'TCTGCTGCTTCACAGTCTTC (SEQ ID NO:4)). PCR foi realizado usando a mistura mestre verde (green master mix) (Promega) de acordo com as instruções do fabricante, usando condições cíclicas de 94°C durante 2 min, seguido por 36 ciclos de 94°C para 45 observações, 55°C para 45 observações e 72°C durante 1 min 10 s. Isso foi seguido por uma extensão final a 72°C durante 10 min.
[00138] A PCR foi realizada na amostra enriquecida com DNA da PGC a partir dos embriões tratados com ZFN, bem como de embriões controle, DNA de células controle positivas, que demonstraram previamente possuir o shRNA integrado nelas e um controle de água. A figura 8 mostra a eletroforese em gel dessas reações de PCR. A primeira raia, que contém a PCR dos embriões diretamente injetados com ZFN, mostra claramente uma banda indicando a integração genômica nos embriões que foram injetados.Exemplo 15. Resultados da modificação do genoma por injeção direta de galinhas
[00139] Após uma série de ciclos de injeções diretas, um total de 277 galos foram criados até a maturidade sexual, e o sêmen deles foi testado quanto à presença do transgene Tol2. Das 277 amostras testadas, verificou-se que 98 continham o transgene Tol2 com níveis variados de porcentagem de sêmen positivo. Um número destes galos G(0) positivos foram acasalados e um total de 7393 pintos G(1) foram testados. Verificou-se que sessenta e cinco pintos eram transgênicos. Acasalamentos posteriores usando esses pintos G(1) demonstraram herança mendeliana dos transgenes para a geração G(2).
[00140] Os pintos nascidos foram criados até a maturidade sexual, e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi utilizado para detectar a presença de miniTol-EGFP no sêmen. Amostras de sêmen foram coletadas e o DNA foi extraído de 20 μL do sêmen diluído em 180 μL de PBS usando o kit de sangue e tecido Qiagen DNeasy, de acordo com as instruções do fabricante. O DNA genômico do sêmen foi, então, diluído até 1/100 em ddH2O para uso na reação de PCR. qPCR foi realizado em um Mastercycler® ep realplex (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 20 μL de reações foram configuradas, contendo 10 μL de mistura mestre universal Taqman 2x (Applied Biosystems), 1 μL de mistura de ensaio marcada com FAM 20x (Applied Biosystems) e 9 μL de DNA diluído. Cada amostra foi configurada em duplicata com iniciadores e sonda específicos para minTol2:iniciador reverso 5' GGGCATCAGCGCAATTCAATT 3' (SEQ ID NO:6);sonda de detecção 5' ATAGCAAGGGAAAATAG 3' (SEQ ID NO:7);e iniciadores e sonda específicos para uma região de controle genômico do genoma de galinha, que atua como um molde de controle:iniciador normal 5' GATGGGAAAACCCTGAACCTC 3' (SEQ ID NO: 8);iniciador reverso 5' CAACCTGCTAGAGAAGATGAGAAGAG 3' (SEQ ID NO:9);sonda de detecção 5' CTGCACTGAATGGAC 3' (SEQ ID NO: 10).
[00141] Os parâmetros do ciclo de PCR estavam eramuma etapa de desnaturação inicial a 95°C durante 10 minutos, seguido por 45 ciclos de 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 1 minuto. Cada galo foi testado pelo menos duas vezes e foi classificado como sendo positivo se um valor CT menor que 36 foi obtido para minTol2. Um CT menor que 32 para a região de controle genômico foi usado para indicar que havia DNA suficiente na amostra testada.
[00142] Será percebido pelas pessoas versadas na técnica que inúmeras variações e/ou modificações podem ser feitas para as modalidades acima descritas, sem se afastar do amplo escopo geral da presente divulgação. As presentes modalidades devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como sendo ilustrativas e não restritivas.
[00143] Todas as publicações discutidas e/ou referenciadas nesse documento são incorporadas no mesmo em suas totalidades.
[00144] O presente pedido reivindica prioridade do US 61/636.331, depositado em 20 de abril de 2012, US 61/783.823, depositado em 14 de março de 2013 e AU 2013204327, depositado em 12 de abril de 2013, todo o conteúdo de cada um dos quais sendo incorporado nesse documento por referência.
[00145] Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares, que tenha sido incluída no presente relatório descritivo, tem o propósito apenas de fornecer um contexto para a presente invenção. Ela não deve ser considerada uma admissão de que algum ou todos estes assuntos fazem parte da base da técnica anterior ou eram de conhecimento geral comum no campo relevante para a presente invenção, tal como existia antes da data de prioridade de cada reivindicação desse pedido.REFERÊNCIASBalciunas et al. (2006) PLoS Genet. 10:el69. Barrangou (2012) Nature Biotechnology, 30:836-838.Cong et al. (2013) Science, 339:819-823.Davis e Stokoe (2010) BMC Med, 8:42.Ding et al. (2005) Cell, 122:473-483.Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res, 33:5978-5990.Hamburger e Hamilton (1951) J Morphol, 88:49-92.Haensler e Szoka, (1993) Bioconjugate Chem, 4:372-379.Ivies et al. (1997) Cell, 91 :501-510.Kagami et al. (1997) Mol Reprod Dev, 48:501-510.Kawakami et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97: 11403-11408.Petitte (2002) J Poultry Sci, 39:205-228.Pettite e Modziak (2007) PIOC Natl Acad Sci USA, 104:1739-1740.Sullenger et al. (1990) Cell, 63:601-608.Tang et al. (1996) Bioconjugate Chem, 7:703-714.Zhang et al. (2011) Nature Biotechnology, 29:149-153.
Claims (14)
1. Método para a produção de uma ave que compreende células germinativas geneticamente modificadas, CARACTERIZADO por compreender:(1) obter um embrião aviário que foi injetado em seu vaso sanguíneo com uma mistura de transfecção compreendendo um polinucleotídeo misturado com um reagente de transfecção,em que(a) o polinucleotídeo compreende um transposão e a mistura de transfecção compreende uma transposase ou um polinucleotídeo que codifica uma transposase; ou(b) a mistura de transfecção compreende uma nuclease de direcionamento ou um polinucleotídeo que codifica uma nuclease de direcionamento; epor meio do qual o polinucleotídeo é inserido no genoma de uma ou mais células germinativas primordiais na ave; e(ii)incubar o embrião a uma temperatura suficiente para que o embrião se desenvolva em uma galinha.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de transfecção é injetada no embrião da ave nos estágios 13 e 14.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de transfecção compreende um lipídio catiônico.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de quei) o reagente de transfecção compreende um lipídio catiônico monovalente selecionado a partir de um ou mais de DOTMA (cloreto de N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N- trimetilamônio), DOTAP (1,2-(bis)oleoilóxi-3-3- (trimetilamônio)propano), DMRIE (brometo de 1,2- dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamônio) e DDAB (brometo de dimetildioctadecilamônio), e/ouii) o reagente de transfecção compreende um lipídio catiônico polivalente selecionado de um ou mais de DOSPA (trifluoracetato de 2,3-dioleilóxi-N- [2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanamínio) e DOSPER (1,3-dioleoilóxi-2-(6-carboxiespermil)-propilamida), TMTPS (tetrametiltetrapalmitoil espermina), TMTOS (tetrametiltetraoleil espermina), TMTLS (tetrametiltetralauril espermina), TMTMS (tetrametiltetramiristil espermina) e TMDOS (tetrametildioleil espermina).
5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de transfecção compreende ainda um lipídio neutro.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de transfecção compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma transposase ou um nucleotídeo de direcionamento selecionado do grupo consistindo em uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease de direcionamento TALEN ou CRISPR.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de injeção foi injetada no embrião na casca do ovo, na qual o embrião se desenvolveu.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo codifica uma molécula de RNA que compreende uma região de fita dupla, ou o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que quando presente no genoma da ave ou uma progênie da mesma, o polinucleotídeo modifica uma característica da ave.
10. Método para aumentar a resistência de uma ave a um vírus, CARACTERIZADO por compreender realizar o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o polinucleotídeo codifica um siRNA, shRNA ou RNA falso que reduz a replicação do vírus em uma célula, ou o polinucleotídeo codifica um peptídeo antiviral que reduz a replicação do vírus em uma célula.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a ave é selecionada de uma galinha, pato, peru, ganso, galinha bantam ou codorna.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um transposão e a mistura de transfecção compreende uma transposase ou um polinucleotídeo que codifica uma transposase.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de transfecção compreende uma nuclease de direcionamento ou um polinucleotídeo que codifica uma nuclease de direcionamento.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a nuclease de direcionamento é uma nuclease de direcionamento CRISPR.
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