ES2702038T3

ES2702038T3 - Métodos de tratamiento de fibrosis y cánceres

Info

Publication number: ES2702038T3
Application number: ES14702771T
Authority: ES
Inventors: Rémy Hanf; Dean Hum; Robert Walczak; Benoît Noel
Original assignee: Genfit SA
Current assignee: Genfit SA
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2019-02-27
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: NZ709420A; US10792277B2; EA031718B1; AU2014206781B2; SG11201505281PA; CN105120855A; CN105120855B; IL239715B; HK1214773A1; PT2948137T; JP2016506913A; PL2948137T3; LT2948137T; KR102196277B1; CA2897258C; CA2897258A1; DK2948137T3; US20150352065A1; SI2948137T1; KR20150114497A

Abstract

Compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona para uso en un método para el tratamiento o prevención de enfermedades fibróticas, en donde la enfermedad fibrótica no es fibrosis hepática, o para el tratamiento o prevención de un cáncer relacionado con tirosina quinasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de tratamiento de fibrosis y cánceres

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso del compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona para tratar enfermedades fibróticas y cánceres.

Antecedentes

Las tirosina quinasas son mediadores importantes de la cascada de señalización, determinando papeles clave en diversos procesos biológicos como crecimiento, diferenciación, metabolismo y apoptosis en respuesta a estímulos externos e internos. Los avances recientes han implicado el papel de las tirosina quinasas en la patofisiolología de la fibrosis o cánceres.

Respecto a la fibrosis, se han identificado diferentes tirosina quinasas como determinantes de la progresión de la enfermedad y dianas potenciales para terapias antifibróticas. Esto incluye tanto tirosina quinasas de receptor (p. ej., quinasas del receptor de PDGF, receptor de VEGF, receptor de EGF, y JAK), así como tirosina quinasas no de receptor (p. ej., quinasas c-Abl, c-Kit, y Src) [1]. En todas las enfermedades fibróticas, los fibroblastos, incluyendo células estrelladas, proliferan y se activan en miofibroblastos. Los miofibroblastos son el tipo celular principal productor de colágeno que experimenta hiperproliferación [2]. Los PDGF son los mitógenos principales para las células de origen mesenquimático. La actividad excesiva de PDGF se ha asociado con varios trastornos humanos, incluyendo fibrosis de órganos y tumorogénesis [3]. Los niveles o actividad elevados de PDGF se han reportado en particular en fibrosis pulmonar, fibrosis hepática [2], escleroderma [4-6], enfermedades renales fibroproliferativas [7, 8], enfermedades mieloproliferativas tales como mielofibrosis idiopática [9, 10], leucemia, en particular en células leucémicas de la médula ósea durante la progresión de leucemia megacarioblástica aguda que manifiesta mielofibrosis [11] y leucemia mielógena crónica [12-14].

Quizás los fármacos más prometedores para tratar fibrosis son los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor de PDGF. Se ha mostrado que la administración del inhibidor de la tirosina quinasa de PDGFR reduce la fibrosis pulmonar en un modelo de rata de daño pulmonar inducido por metales [15], y para mejorar la nefropatía crónica por aloinjerto en ratas [16]. En pacientes con leucemia mielógena crónica, se ha mostrado que un inhibidor de PDGFR no selectivo, Imatinib (Gleevec), induce la regresión de la fibrosis en la médula ósea [17]. Tomados conjuntamente, estos estudios en animales y preclínicos preliminares indican que la inhibición de las tirosina quinasas del receptor de PDGF ofrecen una estrategia de tratamiento viable para enfermedades fibróticas en una variedad de tejidos.

Además de los agentes que bloquean la actividad de la ruta de PDGFR, se ensayaron tanto anticuerpos monoclonales como inhibidores que son moléculas pequeñas que bloquean la actividad aberrante de otras tirosina quinasas en modelos preclínicos de varias enfermedades fibróticas (p. ej., fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis renal, fibrosis hepática, y fibrosis dérmica). Los resultados de estos estudios fueron prometedores e impulsaron ensayos clínicos con diferentes compuestos en enfermedades fibróticas. Hasta ahora, se han reportado los resultados de los estudios con intedanib en fibrosis pulmonar idiopática e imatinib en fibrosis pulmonar idiopática y esclerosis sistémica. Aunque ninguno de estos estudios reportó un resultado primario positivo, las tendencias prometedoras en la eficacia antifibrótica han despertado nuestras esperanzas para una nueva clase de terapias antifibróticas dirigidas efectivas [1].

Respecto a los cánceres, la sobreexpresión de factores de crecimiento y la activación posterior de tirosina quinasas de receptor específicas como PDGFRp, VEGFR pueden causar la sobreactivación de la ruta de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos Raf/MEK/ERK (MAP) [18, 19]. Se sabe que la activación de la ruta de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos Raf/MEK/ERK (MAP) incrementa la proliferación y supervivencia celulares directamente, y puede estimular indirectamente la angiogénesis mediante el incremento de la producción de VEGF y PDGF [18]. Estos procesos se requieren para el crecimiento tumoral y, así, los componentes moleculares de la ruta de señalización Raf/MEK/ERK son dianas terapéuticas potenciales para tratar el cáncer, en particular para el carcinoma hepatocelular (HCC) [20].

El fármaco anticanceroso Sorafenib inhibe las tirosina quinasas de receptor aguas arriba que son importantes en la angiogénesis, incluyendo VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFRp, y kit y las isoformas de serina/treonina quinasa de Raf (p. ej., Raf-1 y B-Raf). Así, Sorafenib puede inducir la muerte de las células tumorales e inhibir la angiogénesis. También se ha mostrado que Sorafenib induce apoptosis en varias líneas de células tumorales a través de mecanismos que no están bien establecidos [20, 21]. Sorafenib es la primera terapia sistémica aprobada por la FDA para pacientes con HCC avanzado que no son susceptibles de tratamiento por resección quirúrgica o trasplante de hígado.

Esto, en conjunto, muestra el interés de identificar nuevos compuestos terapéuticos que actúen sobre las tirosina quinasas, para el tratamiento de enfermedades fibróticas o cánceres.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona nuevos usos de 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona en la preparación de composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades fibróticas y cánceres. La 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona tiene propiedades antifibróticas y anticancerosas a través de la inhibición de tirosina quinasas de receptor y no de receptor y/o la inhibición de sus rutas de señalización intracelulares en fibroblastos.

Descripción de las figuras y las tablas

Abreviaturas usadas en las figuras, en las tables, y en el texto:

- Col1a1 = colágeno, tipo I, alfa 1

- Col4a1 = colágeno, tipo 4, alfa 1

. Cpm = cuentas por minuto

- Ctrl= control o vehículo

- EGFR = Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico

- ERK = Quinasa Regulada por señal Extracelular

- FBS = suero fetal bovino

- FCS = suero fetal de ternera

- FDA = Administración de Alimentos y Medicamentos

- FGFR = Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos

- GIST = Tumor Estromal Gastrointestinal

- HCC = Carcinoma Hepatocelular

- HGFR = Receptor del Factor de Crecimiento de Hepatocitos

- hHSC = células estrelladas hepáticas primarias humanas

- JAK = Quinasa Janus

- MAP = Proteína Activada por Mitógeno

- MEK = Quinasa de la Proteína Quinasa Activada por Mitógeno

- PDGFR = Receptor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas

- RCC = Carcinoma de Células Renales

- RT-PCR = Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Inversa

- TGFpR = Receptor del Factor de Crecimiento Transformante beta

- VEGFR = Receptor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular

Figura. 1. El compuesto de fórmula (I) interfiere con la proliferación de las células hHSC que se indujo con PDGF-BB La proliferación de células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) se estimuló in vitro con PDGF-BB (10ng/mL), que es el mitógeno principal para las células mesenquimáticas. Crenolanib, un potente inhibidor de PDGFR, se usó como un control positivo. Se añadieron Crenolanib y el compuesto de fórmula (I) al cultivo celular 1 antes de la estimulación con PDGF-BB en un medio sin suero. La proliferación celular se evaluó después de 24 horas de incubación midiendo la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU).

Los resultados experimentales se expresaron como media ± desviación estándar (SD) y se representaron gráficamente como gráficos de barras. Los análisis estadísticos se realizaron usando una ANOVA de una vía seguido de ensayos post-hoc de Bonferroni, usando el software Sigma Plot 11.0.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparación frente al grupo de PDGF-BB 10ng/mL)]

Figura 2. El compuesto de fórmula (I) interfiere con la proliferación de las células hHSC que se indujo con suero La proliferación de células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) se estimuló in vitro con suero fetal bovino, FBS (al 0.5%). Crenolanib, un potente inhibidor de PDGFR, se usó como un control positivo. Se añadieron Crenolanib y el compuesto de fórmula (I) al cultivo celular 1 antes de la estimulación con FBS. La proliferación celular se evaluó después de 48 horas de incubación midiendo la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU).

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparación frente al grupo de FBS al 0.5%)]

Figura 3. El compuesto de fórmula (I) interfiere con la fosforilación de PDGFRp inducida por PDGF-BB

La fosforilación de PDGFRp se indujo en hHSC con PDGF-BB, en condiciones sin suero. Las HSC se trataron en primer lugar durante 60 minutos bien con Crenolanib (inhibidor de PDGFR) o con el compuesto de fórmula (I), después se incubaron durante 10 minutos con PDGF-BB (30ng/mL). El grado de la fosforilación de PDGFRp en la tirosina 751 se determinó entonces usando el kit de ELISA basado en células de Fosfo-PDGFRp humano (Y751) (R&D Systems), después de fijación en los pocillos de cultivo.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparación frente al grupo de PDGF-BB 30ng/mL)]

Figura 4. El tratamiento con el compuesto de fórmula (I) previno la inducción de fibrosis colónica en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino.

La expresión de a-SMA, un biomarcador reconocido de la respuesta fibrótica, en colitis inducida por TNBS, se previno parcialmente por la administración del compuesto de fórmula (I).

Los resultados experimentales se expresaron como media ± desviación estándar (SD) y se representaron gráficamente como gráficos de barras. Los análisis estadísticos se realizaron usando un ensayo de t, [*: p<0.05]

Figura 5. El tratamiento con el compuesto de fórmula (I) indujo una respuestas proapoptótica modesta en hHSC activadas y potenció significativamente el efecto proapoptótico de estaurosporina

Las propiedades proapoptóticas del compuesto de fórmula (I), bien solo o en combinación con Estaurosporina, un inhibidor de proteína quinasa de amplio espectro, se evaluaron en las hHSC. Las hHSC se expusieron en primer lugar a deprivación de suero durante 16 horas y posteriormente se trataron bien con el compuesto de fórmula (I) solo o con la combinación del compuesto de fórmula (I) y estaurosporina. El efecto proapoptótico de estos tratamientos se evaluó usando un kit de ensayo de la actividad Caspasa-Glo® 3/7.

Los resultados experimentales se expresaron como media ± desviación estándar (SD) y se representaron gráficamente como gráficos de barras. Los análisis estadísticos se realizaron usando una ANOVA de dos vías no apareado seguido de ensayos post-hoc de Bonferroni, usando el software Sigma Plot 11.0.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparación frente al grupo "Estaurosporina 0.3 |jM”)

f: p<0.05; t f : p<0.01; t t f : p<0.001 (comparación del grupo “sin Estaurosporina”)]

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso del compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona para tratar fibrosis y cánceres, siendo capaz dicho compuesto de disminuir de una manera inesperada la proliferación y activación de fibroblastos humanos incluyendo células estrelladas, el principal tipo celular responsable de la formación de matriz extracelular y fibrosis.

El compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona que se va a usar según la invención tiene la siguiente Fórmula (I):

La técnica anterior no enseña que los efectos antifibróticos y anticancerosos están asociados a 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona debido a la inhibición directa y/o indirecta de tirosina quinasas de receptor.

De acuerdo con esto, la invención se refiere al compuesto 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona para uso en un método para el tratamiento o prevención de enfermedades fibróticas, en donde la enfermedad fibrótica no es fibrosis hepática, o para el tratamiento o prevención de un cáncer relacionado con tirosina quinasa.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere al compuesto de Fórmula (I) para uso en la inhibición de la proliferación y/o activación de células responsables de la producción de fibras de colágeno y/o responsables de la producción de la matriz extracelular.

La presente descripción se refiere además al compuesto de Fórmula (I) para uso en la estimulación de la apoptosis de células responsables de la producción de fibras de colágeno y/o responsables de la producción de la matriz extracelular.

Según la presente invención, el término “fibrosis” incluye en particular una fibrosis de pulmón, corazón, músculo, piel, tejido blando (p. ej., mediastino o retroperitoneo), médula ósea, intestinal, y articular (p. ej., rodilla, hombro u otras articulaciones). En particular, el término “fibrosis” incluye, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastinal, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva (una complicación de la pneumoconiosis de los trabajadores del carbón), fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn, queloides, infarto de miocardio antiguo, escleroderma/esclerosis sistémica, artrofibrosis y algunas formas de capsulitis adhesiva. El término “fibrosis” no incluye fibrosis hepática en el contexto de la presente invención.

Las tirosina quinasas de receptor son ampliamente abundantes y están desrreguladas en los cánceres, y han sido el foco de terapias dirigidas durante varias décadas, usando moléculas pequeñas o anticuerpos [22-24].

Tabla 1: Ejemplos seleccionados de terapias del cáncer dirigidas a Tirosina Quinasas de Receptor

Según la presente invención, la expresión “cáncer relacionado con tirosina quinasa” significa cualquier forma de cáncer que se basa en una actividad o expresión desrregulada de un único o un grupo de receptores con actividad tirosina quinasa. En una realización particular de la invención, la tirosina quinasa es una tirosina quinasa de receptor, más particularmente, las quinasas PDGFR, VEGFR, FGFR, EGFR, c-Kit, o JAK o tirosina quinasas no de receptor, más particularmente, las quinasas c-Abl, o Src. Según una realización particular, el término cáncer incluye carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales, tumor estromal gastrointestinal (GIST), cáncer gástrico, menigioma asociado con neurofibromatosis, tumores pancreáticos neuroendocrinos, tumores pancreáticos exocrinos, leucemia, enfermedades mieloproliferativas/mielodisplásicas, mastocitosis, dermatofibrosarcoma, tumores sólidos incluyendo cánceres de mama, pulmón, tiroides y colorrectal, cáncer de próstata.

En un aspecto particular, la invención se refiere al tratamiento curativo de un cáncer de hígado, en particular de un carcinoma hepatocelular.

En otro aspecto, la invención se refiere al tratamiento o la prevención de un cáncer diferente de un cáncer de hígado. En particular, el cáncer puede seleccionarse de carcinoma de células renales, tumor estromal gastrointestinal (GIST), menigioma asociado con neurofibromatosis, tumores pancreáticos neuroendocrinos, tumores pancreáticos exocrinos, leucemia, enfermedades mieloproliferativas/mielodisplásicas, mastocitosis, dermatofibrosarcoma, tumores sólidos incluyendo cánceres de mama, pulmón, tiroides y colorrectal, cáncer de próstata. En un aspecto particular, el cáncer que se previene o trata es un cáncer fibrótico.

El tratamiento o prevención implica la administración del compuesto o una composición farmacéutica que contiene el mismo a un paciente que tiene un trastorno declarado para curar, retrasar o ralentizar el progreso, mejorando así la afección del paciente o a un sujeto sano, en particular a un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad fibrótica.

Los sujetos que se van a tratar según la invención pueden seleccionarse sobre la base de varios criterios asociados con enfermedades fibróticas o los cánceres tales como tratamientos con fármacos previos, patologías asociadas, genotipo, exposición a factores de riesgo, infección viral, así como cualquier otro biomarcador relevante que pueda evaluarse mediante métodos de imaginería y métodos de detección inmunológicos, bioquímicos, enzimáticos, químicos o de ácidos nucleicos.

La 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona puede tener diferentes formas isoméricas estables.

La síntesis del compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona puede llevarse a cabo, por ejemplo, como se describe para el compuesto 29 en WO2004/005233.

El compuesto de Fórmula (I) puede formularse como sales farmacéuticamente aceptables, siendo sales ligeramente o no tóxicas obtenidas de bases o ácidos orgánicos o inorgánicos del compuesto de Fórmula (I). Estas sales pueden obtenerse durante la etapa de purificación final del compuesto o mediante la incorporación de la sal en el compuesto previamente purificado.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de Fórmula (I) para el tratamiento de enfermedades fibróticas o cánceres pueden comprender uno o varios excipientes o vehículos, aceptables en un contexto farmacéutico (p. ej., disoluciones salinas, disoluciones fisiológicas, disoluciones isotónicas, etc., compatibles con el uso farmacéutico y muy conocidos para un experto en la técnica). Estas composiciones pueden comprender uno o varios agentes o vehículos elegidos entre dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, etc. Los agentes o vehículos útiles para estas formulaciones (líquidas y/o inyectables y/o sólidas) son particularmente metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactosa, aceites vegetales, goma arábiga, liposomas, etc. Estas composiciones pueden formularse en la forma de suspensiones inyectables, geles, aceites, píldoras, supositorios, polvos, cápsulas de gelatina blandas, cápsulas, aerosoles, etc., eventualmente mediante formas galénicas o dispositivos que aseguran una liberación prolongada y/o lenta. Para esta clase de formulación, pueden usarse ventajosamente agentes tales como celulosa, carbonatos o almidones.

El compuesto de Fórmula (I) puede administrarse en una cantidad eficiente mediante el uso de una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente, En el contexto de la invención, el término “cantidad eficiente” se refiere a una cantidad del compuesto suficiente para producir el resultado terapéutico deseado.

El compuesto de Fórmula (I) puede administrarse de diferentes maneras y en diferentes formas, Así, por ejemplo, puede administrarse de una forma sistemática, per os, parenteralmente, por inhalación, o por inyección, tal como, por ejemplo, intravenosamente, por la ruta intramuscular, por la ruta subcutánea, por la ruta transdérmica, por la ruta intraarterial, etc. La administración oral es la ruta de administración preferencial para las composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de Fórmula (I).

La frecuencia y/o dosis relativa a la administración pueden ser adaptadas por un experto en la técnica, en función del paciente, la patología, la forma de administración, etc. Típicamente, los compuestos de Fórmula (I) pueden administrarse para el tratamiento de enfermedades fibróticas o cánceres a dosis que varían entre 0.01 mg y 1 g por administración, preferentemente de 1 mg a 100 mg por administración. La administración puede realizarse diariamente o incluso varias veces al día, si es necesario.

En una realización particular, la invención se refiere al uso del compuesto de Fórmula (I) para el tratamiento de una enfermedad fibrótica o cáncer, en combinación con al menos otro agente terapéuticamente activo. El otro agente activo puede seleccionarse, en particular, de otros agentes antifibróticos u otros agentes anticancerosos tales como Sorafenib. Los inventores han mostrado que el compuesto de Fórmula (I) es capaz de potenciar la actividad proapoptótica de un compuesto proapoptótico. De acuerdo con esto, la invención también se refiere al uso del compuesto de Fórmula (I) en combinación con un fármaco proapoptótico. En particular, el compuesto de Fórmula (I) puede usarse en combinación con un inhibidor de quinasa que tiene un efecto proapoptótico en fibroblastos, tal como Estaurosporina.

En una realización adicional, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades fibróticas o cánceres que comprenden la administración del compuesto de Fórmula (I), en particular en la forma de una composición farmacéutica que contiene este compuesto.

La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Materiales y métodos

Los compuestos se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO, Fluka no. de cat. 41640)

Cultivo de hHSC y condiciones del tratamiento

Las células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) (ScienCell) se cultivaron en medio STeCM (ScienCell no. de cat. 5301) que se suplementó con suero fetal bovino al 2% (FBS, ScienCell no. de cat. 0010), penicilina/estreptomicina al 1% (ScienCell no. de cat. 0503) y suplemento de crecimiento de células estrelladas (SteCGS; ScienCell no. de cat. 5352). Los plásticos del cultivo se recubrieron con Poli-L Lisina (Sigma no. de cat. P4707). Las hHSC se sembraron en placas a una densidad de 1.2*104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron toda la noche a 37 °C. y CO²al 5%, seguido de lavado de las células con PBS (Invitrogen no. de cat. 14190) y reemplazo del medio de crecimiento con un medio sin suero y sin SteCGS durante 24 horas adicionales.

Para el ensayo de proliferación inducida por PDGF, las células se pretrataron con todos los compuestos durante 1 hora antes de la adición de PDGF-BB (10ng/mL; R&D Systems no. de cat. 520-BB). Los tratamientos se continuaron entonces durante 20 horas adicionales. Para el ensayo de proliferación inducida por suero, las células se pretrataron con los compuestos durante 1 hora antes de que se aplicara FBS (0.5%) (ScienCell no. de cat. 0010) en un medio sin SteCGS durante 20 horas.

Determinación de la proliferación inducida por PDGF

La proliferación celular se midió por la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) usando un kit de marcaje y detección de BrdU (Roche no. de cat. 11647229001). La disolución de marcaje de BrdU se añadió a las células, seguido de incubación durante otras 4 horas antes de la fijación, adición de nucleasas, adición de anti-BrdU-POD y sustrato peroxidasa. La absorbancia a 405 nm (con una longitud de onda de referencia a 690 nm) se midió usando un lector de placas ELISA (Tecan).

Ensayo de fosforilación de PDGFRp inducida por PDGF

La fosforilación e PDGFRp en hHSC se midió usando un kit de ELISA basado en células (R&D Systems no. de cat. KCB1767), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, después de la estimulación con PDGF, las células se fijaron y permeabilizaron en los pocillos. La fosforilación de PDGFRp se midió entonces usando un procedimiento de doble marcaje inmunoenzimático. Las células se incubaron simultáneamente con dos anticuerpos primarios: un anticuerpo específico de fósforo que detecta la fosforilación del PDGFRp en la tirosina 751 y un anticuerpo control que reconoce las formas tanto fosforilada como no fosforilada del PDGFRp. Para la detección, se usaron dos anticuerpos secundarios marcados bien con peroxidasa de rábano (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), y dos sustratos fluorogénicos espectralmente distintos bien para HRP o AP. La fluorescencia del PDGFRp fosforilado se normalizó respecto a la de la proteína genérica. La fluorescencia se midió usando un lector de placas ELISA (Tecan).

Activación de HSC con TGF-p1

Las células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) (ScienCell) se cultivaron en condiciones estándar, como se ha descrito anteriormente. Para los experimentos para determinar los patrones de expresión génica, las hHSC se sembraron en placas a una densidad de 1.4*105 células/pocillo en placas de 12 pocillos y se cultivaron toda la noche.

Al día siguiente, el medio de cultivo se retiró, las células se lavaron con PBS (Invitrogen no. de cat. 14190) y se añadió medio sin suero y sin SteCGS durante 16 horas adicionales. Las células se trataron con compuestos además de TGFp1 (1ng/mL) en un medio sin suero y sin SteCGS durante 24 horas.

Expresión génica

El ARN total se aisló usando el Mini Kit RNeasy® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se transcribieron de forma inversa 250ng de ARN total en ADNc usandola RT de M-MLV (Transcriptasa Inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney) (Invitrogen no. de cat. 28025) en presencia de tampón RT 1* (Invitrogen), DTT 1 mM (Invitrogen), dNTP 0.18 mM (Promega), 200 ng de pdN6 (Amersham) y 30 U de inhibidor de ARNasa (Promega).

Después, se llevó a cabo la PCR cuantitativa usando el Sistema MyiQ de Detección de PCR en Tiempo Real de Color Único o Sistema iCycler iQ de Detección de PCR en Tiempo Real Multiplex (ambos sistemas de Biorad). Brevemente, las reacciones de PCR se realizaron en placas de 96 pocillos en 5 pL de mezcla de transcripción inversa diluida 5* usando el kit iQ SYBR Green Supermix. Las condiciones experimentales fueron: 25 pL de volumen de reacción, 3 mM de MgCl², y 0.5 pL de cada uno de los cebadores inverso y directo (10 pMol).

Los niveles de expresión se normalizaron usando la expresión del gen 36B4 como referencia.

Para cada gen, se dibujaron las curvas estándar seleccionando los mejores puntos (al menos tres puntos) con el fin de tener una eficiencia en la reacción de PCR cercana al 100% y un coeficiente de correlación cercano a 1. Los niveles de expresión se determinaron usando la ecuación de las curvas estándar tanto para el gen constitutivo como para el gen diana (teniendo en cuenta la eficiencia específica de la PCR para cada gen diana).

El factor de inducción frente a TGFp1 se determinó como sigue:

A - B

Factor de inducción = ---------B

Con A = nivel de expresión del gen estudiado en el grupo ensayado

B = nivel de expresión del gen estudiado en el grupo de TGFp1 1ng/mL

Así, cuanto menor es el factor de inducción mayor es la inhibición por el compuesto de interés de la activación por TGFp1 de hHSC. Los resultados experimentales se expresaron como la media ± desviación estándar (SD) del factor de inducción.

Evaluación de la apoptosis midiendo la activación de la caspasa 3/7

Las células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) (ScienCell) se cultivaron en condiciones estándar, como se ha descrito anteriormente. Para los ensayos de apoptosis, las hHSC se sembraron en placas a una densidad de 1.2*104 células/pocillo en placas negras de 96 pocilios y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C. y CO²al 5%, seguido de lavado de las células con PBS (Invitrogen no. de cat. 14190) y reemplazo del medio de crecimiento con un medio sin suero y sin SteCGS durante 16 horas adicionales. Las células se trataron con el compuesto de fórmula 1, bien solo o en combinación con estaurosporina, en un medio sin suero y sin SteCGS durante 24 horas. Las actividades de la caspasa-3 y 7 se determinaron usando el ensayo de Promega (Promega no. de cat. G8093) según las instrucciones del fabricante. Al final del periodo de incubación, se añadieron 100 pL de Reactivo Caspase-Glo® 3/7 a cada pocillo que contenía 100 pL de células blanco, control negativo o células tratadas en medio de cultivo. Después de la lisis de las células, la escisión del sustrato (que contiene la secuencia DEVD) por las caspasas 3 y 7 activadas se determinó midiendo la señal luminiscente en un lector de placas clásico de Tecan. La luminiscencia fue proporcional a la cantidad de actividad caspasa presente en las células tratadas.

Medición de la inhibición de la actividad proteína quinasa de FGFR, PDGFR, VEGFR y c-Kit

La inhibición de la quinasa por el compuesto de fórmula (I) se ensayó a una concentración 10pM en 10 quinasas seleccionadas como se presenta en la Tabla siguiente. Se usó un ensayo radiométrico de proteína quinasa (Ensayo de Actividad 33PanQinase®) para medir la actividad quinasa. El ensayo para todas las proteínas quinasas contenía HEPES 70 mM-NaOH pH 7.5, MgCh 3 mM, MnCh 3 mM, Na-ortovanadato 3 pM, DTT 1.2 mM, ATP (cantidades variables correspondientes a la Km de ATP aparente de la quinasa respectiva, véase la Tabla 1), [y-33P]-ATP (aprox.

8*105 cpm por pocillo), proteína quinasa (cantidades variables, véase la Tabla 1), y sustrato (cantidades variables, véase la Tabla siguiente).

Parámetros del ensayo para las proteínas quinasas ensayadas

Las mezclas de reacción se incubaron a 30 °C durante 60 minutos. La reacción se paró con 50 pl de H³PO⁴al 2% (v/v), las placas se aspiraron y se lavaron dos veces con 200 pL de NaCl al 0.9% (p/v). La incorporación de 33P se determinó con un contador de centelleo de microplacas (Microbeta, Wallac).

Para cada quinasa, el valor mediano de las cpm de tres pocillos con mezclas de reacción completas, pero sin quinasa, se definió como “control bajo”. Este valor refleja la unión inespecífica de radiactividad a la placa en ausencia de proteína quinasa, pero en presencia del sustrato. Adicionalmente, para cada quinasa, el valor mediano de las cpm de los otros tres pocillos con la mezcla de reacción completa, pero sin ningún compuesto, se tomó como el “control alto”, es decir, la actividad completa en ausencia de ningún inhibidor. La diferencia entre el control alto y bajo se tomó como el 100% de actividad para cada quinasa.

Como parte de la evaluación de los datos, el valor del control bajo de cada quinasa se sustrajo del valor del control alto, así como de sus “valores de compuesto” correspondientes. La actividad residual (en %) para cada pocillo de compuesto se calculó usando la siguiente fórmula:

Actividad Residual (%) = 100 * [(cpm del compuesto - control bajo) / (control alto - control bajo)].

Evaluación de la inhibición de la proliferación de líneas de células tumorales humanas

Este experimento demostró los efectos inhibidores directos en la proliferación de células cancerosas in vitro del compuesto de fórmula (I). Se cultivaron 22 líneas de células tumorales humanas en medio completo de la ATCC que contenía FBS al 10% a 37 °C en CO²al 5% en un incubador. Para los ensayos de proliferación se usaron células en fase logarítmica. Las células se recogieron, se contaron y después se sembraron a una densidad adecuada en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 16-24 horas. Después, se añadieron distintas concentraciones del compuesto de fórmula (I) (8 concentraciones, diluciones de 3 veces decrecientes, empezando desde 100pM). El medio de tratamiento se renovó cada 24 horas durante el ensayo de proliferación de 72 horas. Las células tratadas con fármaco y las células control se analizaron usando el kit CellTiter-Glo® (Promega). Brevemente, se añadió el Reactivo CellTiter-Glo® a cada pocillo de ensayo y se mezcló durante 2 minutos en un agitador orbital. Las placas se centrifugaron brevemente a 90g y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales para estabilizar la señal luminiscente. Las señales de luminiscencia se detectaron en PHERAstar Plus.

Evaluación del desarrollo de fibrosis en la pared del colon en un modelo de colitis

El compuesto de fórmula (I) se proporcionó oralmente a 30 mg/kg/día a ratas Sprague Dawley empezando 5 días antes de la inducción de la colitis por el ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) y hasta la eutanasia.

Para la inducción de la colitis, se anestesiaron las ratas Sprague Dawley durante 2 horas usando una inyección intraperitoneal de pentobarbital. La colitis se indujo por una inyección intrarectal de TNBS (80mg/kg en etanol al 40%) a 8 cm del ano. Los animales se sacrificaron 4 días después de la administración de TNBS y el efecto preventivo del compuesto de fórmula (I) se evaluó usando el ensayo de la expresión génica.

Estudios de la expresión del gen a-SMA en muestras de colon

El ARN total se aisló usando el Mini Kit RNeasy® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se transcribieron de forma inversa 1|jg de ARN total en ADNc usando la RT de M-MLV (Transcriptasa Inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney) (Invitrogen no. de cat. 28025) en presencia de tampón RT 1* (Invitrogen), DTT 1 mM (Invitrogen), dNTP 0.18 mM (Promega), 200 ng de pdN6 (Amersham) y 30U de inhibidor de ARNasa (Promega). La PCR cuantitativa se llevó a cabo usando el Sistema de Detección de PCR en Tiempo Real CFX96 Touch™ (Biorad). Brevemente, las reacciones de PCR se realizaron en placas de 96 pocillos en 5 pL de mezcla de transcripción inversa diluida 5* usando el kit iQ SYBR Green Supermix. Las condiciones experimentales fueron: 25 pL de volumen de reacción, 3 mM de MgCh, y 0.5 pL de cada uno de los cebadores inverso y directo (10 pMol).

El factor de inducción frente a las ratas tratadas con TNBS se determinó como sigue:

A - B

Factor de inducción = ---------B

Con A = nivel de expresión del gen estudiado en el grupo de TNBS Compuesto de fórmula (I) a 30 mg/kg/día B = nivel de expresión del gen estudiado en el grupo de TNBS

Así, cuanto menor es el factor de inducción mayor es la inhibición por el compuesto de interés de la fibrosis en la pared del colon inducida por TNBS. Los resultados experimentales se expresaron como la media ± desviación estándar (SD) del factor de inducción.

Resultados y conclusiones:

La actividad excesiva de PDGF se ha asociado con varios trastornos humanos, incluyendo fibrosis de órganos y tumorogénesis. PDGF juega un papel clave en la expansión de los miofibroblastos mediante la estimulación de su proliferación, migración y supervivencia.

Inesperadamente, nuestros datos experimentales mostraron que el compuesto de Fórmula (I) inhibe, de una forma dependiente de la dosis, la proliferación de hHSC que se indujo bien por un tratamiento con PDGF (figura 1) o por un tratamiento con suero (figura 2). Como se demuestra en las figuras 1 y 2, la eficacia del compuesto de Fórmula (I) es comparable con la de un inhibidor de PDGFR selectivo, Crenolanib. El compuesto de Fórmula (I) tiene propiedades antiproliferativas e interfiere con la activación funcional de la ruta de señalización de PDGFR. La homo o heterodimerización del receptor inducida por ligando da lugar a la autofosforilación de residuos de tirosina específicos en el dominio citoplásmico de PDGFR y a la activación de algunas rutas de transducción de la señal, incluyendo fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K), Ras-MAPK, quinasas de la familia Src y fosfolipasa Cy (PLCy). Esto produce la estimulación de la proliferación y supervivencia celulares.

Inesperadamente, nuestros datos experimentales mostraron que el compuesto de Fórmula (I) inhibe la fosforilación de la tirosina 751 en el PDGFRp que se indujo en hHSC por el PDGF-BB. La inhibición por el compuesto de Fórmula (I) es dependiente de la dosis y tan eficaz como la inhibición obtenida con un inhibidor de PDGFR selectivo, Crenolanib (figura 3).

Respecto a la fibrosis, ya se han identificado diferentes tirosina quinasas de receptor como determinantes de la progresión de la enfermedad y como dianas potenciales para terapias antifibróticas. Los resultados preclínicos recientes indican que una inhibición simultánea de las rutas activadas de PDGFR, VEGFR y FGFR produjo una actividad antifibrótica aumentada en modelos de fibrosis pulmonar comparado con un tratamiento que inhibe la ruta de PDGFR más selectivamente. Como se muestra en la Tabla 2, los inventores han encontrado inesperadamente que el compuesto de Fórmula (I) era capaz de inhibir la actividad quinasa de quinasas seleccionadas, incluyendo las tirosina quinasas de receptor de PDGFR, VEGFR, FGFR que están implicadas en el desarrollo tanto de la fibrosis como del cáncer.

Tabla 2: El compuesto de Fórmula (I) inhibe la actividad quinasa de tirosina quinasas de receptor seleccionadas según se mide en un ensayo bioquímico de actividad quinasa. Los resultados reportados se obtuvieron a la concentración de 10 pmoles/L.

Como se muestra en la Tabla 3, los inventores han encontrado inesperadamente que además de las propiedades de inhibición directa de quinasa, el compuesto de Fórmula (I) era capaz de inhibir, en hHSC activadas, tanto la expresión de genes profibróticos clásicos, tales como aSMA, Col1a1, Col4a1, TGFpR1, que se inducen después del tratamiento con TGFp1 como la expresión de los receptores con actividad tirosina quinasa VEGFR1, VEGFR2, FGFR1, que están asociados con el desarrollo de fibrosis según se desprende de las fuentes publicadas previamente [63]. Como se muestra en la Tabla 3, el perfil de inhibición génica del compuesto de Fórmula (I) fue muy similar al obtenido con Sorafenib, un inhibidor de tirosina quinasa que tiene como diana PDGFR, VEGFR, RAF y KIT. Previamente se ha demostrado que Sorafenib tiene una actividad antifibrótica importante en modelos preclínicos y eficacia clínica en el tratamiento de cánceres tales como el carcinoma hepatocelular (HCC) y el carcinoma de células renales (RCC) [64 66].

La expresión tanto de genes profibróticos como asociados con el cáncer se indujo en las células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) por el tratamiento con TGFp1 (1 ng/mL) en condiciones sin suero. Se usó Sorafenib (Nevaxar), un inhibidor de múltiples tirosina quinasas de receptor que ejerce propiedades tanto antifibróticas como anticancerosas, como un compuesto de referencia. La expresión de los genes de interés tanto en hHSC tratadas como no tratadas se determinó por la técnica de RT-PCR cuantitativa, después de 24 horas de exposición a TGFp1.

Los resultados experimentales se expresaron como valores de Emáx que indican la inhibición máxima, que se obtuvo a la concentración de 10 pmoles/L. Los análisis estadísticos se realizaron usando una ANOVA de una vía seguido de ensayos post-hoc de Bonferroni, usando el software Sigma Plot 11.0.

[*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparación frente al grupo de TGFp1 1 ng/mL)]

Tabla 3. Tanto el compuesto de Fórmula (I) como Sorafenib interfieren con la expresión de los mismos genes diana que se indujeron en hHSC por el tratamiento con TGFp1.

La fibrosis intestinal es una característica patogénica de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) [67] y está presente en modelos preclínicos de esta enfermedad. Hasta ahora, no se ha identificado ningún tratamiento para prevenir el desarrollo de la fibrosis en IBD ni para tratar la fibrosis instalada. Como se muestra en la figura 4, los inventores han encontrado inesperadamente que el incremento inducido por colitis de la expresión de un marcador de fibrosis (a-SMA) en el colon fue prevenida parcialmente por la administración del compuesto de Fórmula (I) en el modelo preclínico de IBD inducida por el ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS). Esto sugiere que el compuesto de Fórmula (I) puede prevenir y/o tratar el desarrollo de la fibrosis en diferentes órganos y diferentes trastornos.

Tabla 4: El compuesto de Fórmula (I) inhibe la proliferación de líneas celulares experimentales derivadas de los tipos de cáncer seleccionados. Las tasas de inhibición se expresan como valores de CE50 en pmoles/l que se calcularon por el ajuste de las curvas de los datos experimentales como se describe en materiales y métodos.

La mayor parte de los compuestos terapéuticos con actividad anticancerosa interfieren con la proliferación de las células cancerosas. Como se muestra en la Tabla 4, los inventores han encontrado inesperadamente que el compuesto de Fórmula (I) inhibía la proliferación de diversas líneas de células cancerosas que correspondían a diferentes tipos de tumores.

La capacidad para inducir apoptosis en hHSC activadas es una diana importante en las enfermedades fibróticas. Los inventores han encontrado inesperadamente que el compuesto de Fórmula (I) tienen propiedades proapoptóticas modestas, como se muestra en la figura 5, pero que potenció inesperadamente, de una manera dependiente de la dosis, la actividad proapoptótica de un inhibidor de quinasa de amplio espectro, Estaurosporina.

REFERENCIAS

1. Beyer, C., et al., Biochim Biophys Acta, 2012.

2. Bonner, J. C., Cytokine Growth Factor Rev, 2004. 15(4): p. 255-73.

3. Alvarez, R. H., et al., Mayo Clin Proc, 2006. 81(9): p. 1241-57.

4. Klareskog, L., et al., Arthritis Rheum, 1990. 33(10): p. 1534-41.

5. Ludwicka, A., et al., J Rheumatol, 1995. 22(10): p. 1876-83.

6. Yamakage, A., et al., J Exp Med, 1992. 175(5): p. 1227-34.

7. Abboud, H. E., Annu Rev Physiol, 1995. 57: p. 297-309.

8. Alpers, C. E., et al., Kidney Int, 1992. 42(2): p. 390-9.

9. Caenazzo, A., et al., Acta Haematol, 1989. 81(3): p. 131-5.

10. Martyre, M. C., et al., Br J Haematol, 1991.77(1): p. 80-6.

11. Kitagawa, M., et al., Hum Pathol, 1994. 25(7): p. 723-6.

12. Katoh, O., et al., Am J Hematol, 1990. 35(3): p. 145-50.

13. Kimura, A., et al., Leuk Lymphoma, 1995. 18(3-4): p. 237-42.

14. Wickenhauser, C., et al., Leukemia, 1995. 9(2): p. 310-5.

15. Rice, A. B., et al., Am J Pathol, 1999. 155(1): p. 213-21.

16. Savikko, J., et al., Transplantation, 2003. 75(8): p. 1147-53.

17. Beham-Schmid, C., et al., Blood, 2002. 99(1): p. 381-3.

18. Gollob, J. A., et al., Semin Oncol, 2006. 33(4): p. 392-406.

19. Stockl, L., et al., Oncogene, 2003. 22(17): p. 2604-10.

20. Wilhelm, S. M., et al., Cancer Res, 2004. 64(19): p. 7099-109.

21. Wilhelm, S. M., et al., Mol Cancer Ther, 2008. 7(10): p. 3129-40.

22. Yarden, Y., et al., Nat Rev Cancer, 2012. 12(8): p. 553-63.

23. Halper, J., Vet Pathol, 2010. 47(1): p. 77-97.

24. Sliwkowski, M. X., et al., Science, 2013. 341(6151): p. 1192-8.

25. Montero, J. C., et al., Clin Cancer Res, 2011. 17(17): p. 5546-52.

26. Fratto, M. E., et al., Clin Ter, 2010. 161(5): p. 475-82.

27. Malavaki, C. J., et al., FEBS J, 2013. 280(10): p. 2477-89.

28. Lemieux, S., et al., Anticancer Agents Med Chem, 2013. 13(5): p. 748-61.

29. Qiu, Z. Y., et al., Cancer Biol Ther, 2013. 15(3).

30. Cortes, J. E., et al., N Engl J Med, 2013. 369(19): p. 1783-96.

31. Rassi, F. E., et al., Pharmgenomics Pers Med, 2013. 6: p. 57-62.

32. Walker, A. S., et al., J Cancer, 2014. 5(1): p. 44-57.

33. McKeown, E., et al., J Cancer, 2014. 5(1): p. 31-43.

34. Hocking, C. M., et al., Therap Adv Gastroenterol, 2014. 7(1): p. 20-37.

35. Fields, R. C., et al., Ann Surg Oncol, 2011. 18(2): p. 328-36.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona para uso en un método para el tratamiento o prevención de enfermedades fibróticas, en donde la enfermedad fibrótica no es fibrosis hepática, o para el tratamiento o prevención de un cáncer relacionado con tirosina quinasa.

2. El compuesto para uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad fibrótica es un fibrosis de pulmón, corazón, músculo, piel, tejido blando, médula ósea, intestinal, y articular.

3. El compuesto para uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad fibrótica es fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastinal, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva, fibrosis sistémica nefrogénica, fibrosis asociada con enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), fibrosis asociada con colitis, enfermedad de Crohn, queloides, infarto de miocardio antiguo, escleroderma/esclerosis sistémica, artrofibrosis o una capsulitis adhesiva.

4. El compuesto para uso según la reivindicación 1, en donde el cáncer relacionado con tirosina quinasa es un cáncer relacionado con PDGFR, VEGFR o KIT.

5. El compuesto para uso según la reivindicación 1o 4, en donde el cáncer es un carcinoma de células renales, tumor estromal gastrointestinal (GIST), cáncer gástrico, menigioma asociado con neurofibromatosis, tumores pancreáticos neuroendocrinos, tumores pancreáticos exocrinos, leucemia, enfermedades mieloproliferativas/mielodisplásicas, mastocitosis, dermatofibrosarcoma, tumores sólidos incluyendo cáncer de mama, de pulmón, de tiroides o colorrectal o un cáncer de próstata.

6. Compuesto 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona para uso en un método para el tratamiento curativo de un cáncer de hígado

7. El compuesto para uso según la reivindicación 6, en donde el cáncer de hígado es un carcinoma hepatocelular.