CN105120855B - 纤维化和癌症的治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化合物1‑[4‑甲基硫苯基]‑3‑[3,5‑二甲基‑4‑羧基二甲基甲氧基苯基]丙‑2‑烯‑1‑酮在治疗纤维化疾病和癌症中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮在治疗纤维化疾病和癌症中的用途。
背景技术
酪氨酸激酶是信号转导级联的重要介导物,对外部和内部刺激物作出响应而决定了在多种多样的生物过程如生长、分化、代谢和凋亡中的关键作用。最近的进展暗示了酪氨酸激酶在纤维化或癌症的病理生理学中的作用。
对于纤维化来说,不同的酪氨酸激酶已被鉴定为疾病进展的决定因素和抗纤维化疗法的潜在靶点。这包括受体酪氨酸激酶(例如PDGF受体、VEGF受体、EGF受体和JAK激酶)以及非受体酪氨酸激酶(例如c-Abl、c-Kit和Src激酶)两者[1]。在所有纤维化疾病中,成纤维细胞(包括星状细胞)增殖并被活化成肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是经历过度增殖的重要的产胶原蛋白的细胞类型[2]。PDGF是间质起源的细胞的主要有丝分裂原。已将PDGF的过高活性与数种人类障碍(包括器官纤维化和肿瘤发生)相关联[3]。具体来说,已在肺纤维化、肝纤维化[2]、硬皮病[4-6]、肾纤维增殖性疾病[7,8]、骨髓增殖性疾病例如特发性骨髓纤维化[9,10]、白血病中,尤其是在表现出骨髓纤维化的急性成巨核细胞性白血病[11]和慢性髓性白血病[12-14]的发展期间在骨髓的白血病细胞中,报道了升高的PDGF水平或活性。
用于治疗纤维化的最有希望的药物可能是PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂。已显示,PDGFR酪氨酸激酶抑制剂的给药在金属诱导的肺损伤大鼠模型中减少肺纤维化[15],并且在大鼠中减轻慢性移植肾病[16]。已显示,在患有慢性髓性白血病的患者中,非选择性PDGFR抑制剂伊马替尼(Gleevec)引起骨髓纤维化的消退[17]。合在一起,这些动物和初步临床研究表明,PDGF受体酪氨酸激酶的抑制能够为各种不同组织中的纤维化疾病提供可行的治疗策略。
除了阻断PDGFR通路的活性的药剂之外,在各种纤维化疾病(例如特发性肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化)的临床前模型中还测试了阻断其他酪氨酸激酶的异常活性的单克隆抗体和小分子抑制剂两者。这些研究的结果是有希望的,并促使了在纤维化疾病中使用不同化合物的临床试验。到目前为止,已报道了来自于在特发性肺纤维化中使用intedanib以及在特发性肺纤维化和系统性硬化症中使用伊马替尼的研究的结果。尽管这些研究都没有报道阳性的主要结果,但在抗纤维化效能方面有希望的趋势唤起了我们对一类新的有效的抗纤维化靶向疗法的希望[1]。
对于癌症而言,生长因子的过表达和随后特定的受体酪氨酸激酶如PDGFRβ、VEGFR的活化可以造成Raf/MEK/ERK有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶信号转导通路的过度激活[18,19]。已知Raf/MEK/ERK有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶信号转导通路的激活直接提高细胞增殖和存活,并且可以通过增加VEGF和PDGF的生产间接地刺激血管生成[18]。这些过程是肿瘤生长所需要的,因此Raf/MEK/ERK信号转导通路的分子组分是用于治疗癌症、尤其是肝细胞癌(HCC)的潜在治疗靶点[20]。
抗癌药物索拉非尼抑制在血管生成中重要的上游受体酪氨酸激酶,包括VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFRβ和kit以及Raf丝氨酸/苏氨酸激酶同工型(例如Raf-1和B-Raf)。因此,索拉非尼可以诱导肿瘤细胞死亡并抑制血管生成。还已显示,索拉非尼在数种肿瘤细胞系中通过尚不明确的机制诱导凋亡[20,21]。索拉非尼是用于患有晚期HCC并且不适合通过手术切除或肝移植治疗的患者的第一种FDA批准的系统疗法。
这些合在一起显示了鉴定作用于酪氨酸激酶的新治疗剂对纤维化疾病或癌症治疗的重要性。
发明内容
本发明提供了1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮在制备用于治疗纤维化疾病和癌症的药物组合物中的新用途。1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮通过在成纤维细胞中抑制受体和非受体酪氨酸激酶和/或抑制它们的细胞内信号转导通路而具有抗纤维化和抗癌性质。
图表说明
在图、表和文本中使用的缩写:
-Col1a1=I型胶原蛋白,α1
-Col4a1=4型胶原蛋白,α1
-Cpm=每分钟的计数
-Ctrl=对照或介质
-EGFR=表皮生长因子受体
-ERK=细胞外信号调控的激酶
-FBS=胎牛血清
-FCS=胎小牛血清
-FDA=食品和药品监督管理局
-FGFR=成纤维细胞生长因子受体
-GIST=胃肠道间质瘤
-HCC=肝细胞癌
-HGFR=肝细胞生长因子受体
-hHSC=人类原代肝星状细胞
-JAK=Janus激酶
-MAP=有丝分裂原活化蛋白
-MEK=有丝分裂原活化蛋白激酶激酶
-PDGFR=血小板衍生生长因子受体
-RCC=肾细胞癌
-RT-PCR=反转录聚合酶链反应
-TGFβR=转化生长因子β受体
-VEGFR=血管内皮生长因子受体
图1.式(I)的化合物干扰由PDGF-BB诱导的hHSC细胞增殖
在体外用作为间质细胞的主要有丝分裂原的PDGF-BB(10ng/mL)刺激人类原代肝星状细胞(hHSC)的增殖。使用强效PDGFR抑制剂Crenolanib作为阳性对照。向细胞培养物加入Crenolanib和式(I)的化合物,1小时后,用无血清培养基中的PDGF-BB进行刺激。在温育24小时后通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)的掺入来评估细胞增殖。
实验结果被表示成平均值±标准偏差(SD),并被绘制成条形图。利用Sigma Plot11.0软件,使用单因素ANOVA,然后使用Bonferroni事后检验来进行统计学分析。
[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(与PDGF-BB 10ng/mL组比较)]
图2.式(I)的化合物干扰由血清诱导的hHSC细胞增殖
在体外用胎牛血清FBS(0.5%)刺激人类原代肝星状细胞(hHSC)的增殖。使用强效PDGFR抑制剂Crenolanib作为阳性对照。向细胞培养物加入Crenolanib和式(I)的化合物,1小时后,用FBS进行刺激。在温育48小时后通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)的掺入来评估细胞增殖。
实验结果被表示成平均值±标准偏差(SD),并被绘制成条形图。利用Sigma Plot11.0软件,使用单因素ANOVA,然后使用Bonferroni事后检验来进行统计学分析。
[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(与FBS 0.5%组比较)]
图3.式(I)的化合物干扰PDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化
在hHSC中,在无血清条件下使用PDGF-BB诱导PDGFRβ的磷酸化。首先将HSC用Crenolanib(PDGFR抑制剂)或式(I)的化合物处理60分钟,然后与PDGF-BB(30ng/mL)温育10分钟。然后,在固定在培养孔中之后,使用人类Phospho-PDGFRβ(Y751)基于细胞的ELISA试剂盒(Human Phospho-PDGFRβ(Y751)Cell-Based ELISA kit)(R&D Systems)测定PDGFRβ在第751位酪氨酸上的磷酸化程度。
实验结果被表示成平均值±标准偏差(SD),并被绘制成条形图。利用Sigma Plot11.0软件,使用单因素ANOVA,然后使用Bonferroni事后检验来进行统计学分析。
[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(与PDGF-BB 30ng/mL组比较)]
图4.在炎性肠病模型中用式(I)的化合物处理阻止慢性纤维化的诱导在TNBS诱导
的结肠炎中,通过给药式(I)的化合物,部分阻止了公认的纤维化反应的生物标志物α-SMA
的表达。
实验结果被表示成平均值±标准偏差(SD),并被绘制成条形图。使用t-检验来进行统计学分析。[*:p<0.05]
图5.在活化的hHSC中用式(I)的化合物处理诱导了适度的促凋亡反应并显著增强
十字孢碱的促凋亡效果
在hHSC中,评估了单独或与广谱蛋白激酶抑制剂十字孢碱组合的式(I)的化合物的促凋亡性质。首先将HSC暴露于去血清培养16小时,随后用单独的式(I)的化合物或式(I)的化合物与十字孢碱的组合进行处理。使用3/7活性测定试剂盒评估这些处理的促凋亡效果。
实验结果被表示成平均值±标准偏差(SD),并被绘制成条形图。利用Sigma Plot11.0软件,使用不配对双因素ANOVA,然后使用Bonferroni事后检验来进行统计学分析。
[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(与“十字孢碱0.3μM”组的比较)
p<0.05;p<0.01;p<0.001(“无十字孢碱”组的比较)]
发明详述
本发明涉及化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮在治疗纤维化和癌症中的用途,这样的化合物能够以出人意料的方式降低负责纤维化和细胞外基质的形成的主要细胞类型,即人类成纤维细胞(包括星状细胞)的增殖和活化。
根据本发明使用的化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮为下式(I)的化合物
现有技术没有教导1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮由于直接和/或间接抑制受体酪氨酸激酶而具有抗纤维化或抗癌效果。
因此,本发明涉及化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮,其用于治疗或预防纤维化疾病的方法中,或用于治疗或预防与酪氨酸激酶相关的癌症的方法中,其中所述纤维化疾病不是肝纤维化。
另一方面,本发明涉及式(I)的化合物,其用于抑制负责胶原纤维生产和/或负责细胞外基质生产的细胞的增殖和/或活化。
本发明还涉及式(I)的化合物,其用于促进负责胶原纤维生产和/或负责细胞外基质生产的细胞的凋亡。
根据本发明,术语“纤维化”尤其包括肺、心脏、肌肉、皮肤、软组织(例如纵隔或后腹膜)、骨髓、肠和关节(例如膝、肩或其他关节)的纤维化。具体来说,术语“纤维化”包括肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(煤矿工人尘肺的并发症)、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、瘢痕瘤、陈旧性心肌梗塞、硬皮病/系统性硬化症、关节纤维化和某些形式的粘连性囊炎。在本发明的背景中,术语“纤维化”不包括肝纤维化。
受体酪氨酸激酶在癌症中非常丰富且失调,并且数十年来已成为使用小分子或抗体的靶向疗法的焦点[22-24]。
表1:靶向受体酪氨酸激酶的癌症疗法的所选实例
根据本发明,短语“与酪氨酸激酶相关的癌症”是指依赖于单个或一组酪氨酸激酶受体的不受调控的活性或表达的任何癌症形式。在本发明的特定实施方式中,酪氨酸激酶是受体酪氨酸激酶,更具体为PDGFR、VEGFR、FGFR、EGFR、c-Kit或JAK激酶,或者是非受体酪氨酸激酶,更具体为c-Abl或Src激酶。根据特定实施方式,术语癌症包括肝细胞癌、肾细胞癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃癌、与神经纤维瘤相关的脑膜瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺外分泌肿瘤、白血病、骨髓增殖性/骨髓增生异常疾病、肥大细胞增多症、皮肤纤维肉瘤、包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和结直肠癌的实体瘤、前列腺癌。
在特定情况下,本发明涉及肝癌、尤其是肝细胞癌的治愈性治疗。
另一方面,本发明涉及肝癌之外的癌症的治疗或预防。具体来说,所述癌症可以选自肾细胞癌、胃肠道间质瘤(GIST)、与神经纤维瘤相关的脑膜瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺外分泌肿瘤、白血病、骨髓增殖性/骨髓增生异常疾病、肥大细胞增多症、皮肤纤维肉瘤、包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和结直肠癌的实体瘤、前列腺癌。在特定情况下,预防或治疗的癌症是纤维化癌症。
治疗或预防包括将所述化合物或含有所述化合物的药物组合物给药到患有所宣称的障碍的患者,以治愈、延迟或减缓疾病进展,从而改善患者的状况,或给药到健康对象、特别是具有发生纤维化疾病的风险的对象。
本发明的待治疗对象可以在与纤维化疾病或癌症相关的数个判据的基础上进行选择,所述判据例如以前的药物治疗、相关病理学、基因型、暴露于风险因子、病毒感染,以及可以利用成像方法和免疫学、生物化学、酶学、化学或核酸检测方法来评估的任何其他相关生物标志物。
1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮可以具有不同的稳定的异构体形式。
化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮的合成可以例如按照WO2004/005233中为化合物29所描述的方法来进行。
式(I)的化合物可以被配制成可药用盐,其是从式(I)的化合物的有机或无机碱或酸获得的微毒性或无毒性盐。这些盐可以在化合物的最终纯化步骤期间或通过将盐并入到之前纯化的化合物中来获得。
用于治疗纤维化疾病或癌症的包含式(I)的化合物的药物组合物可以包含在制药背景中可接受的一种或数种赋形剂或介质(例如与制药用途相容并且为本领域普通技术人员公知的盐水溶液、生理溶液、等渗溶液等)。这些组合物可以包含一种或数种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的试剂或介质。可用于这些制剂(液体和/或可注射和/或固体制剂)的试剂或介质具体来说为甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露糖醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶、脂质体等。这些组合物可以被配制成可注射悬液、凝胶、油、丸剂、栓剂、粉剂、凝胶帽、胶囊、气溶胶等的形式,最终利用盖伦制剂形式或装置以确保延长和/或缓慢释放。对于这种制剂来说,可以有利地使用诸如纤维素、碳酸盐或淀粉的试剂。
可以通过使用如上定义的药物组合物将式(I)的化合物以有效量给药。在本发明的背景中,术语“有效量”是指足以产生所需治疗结果的化合物的量。
式(I)的化合物可以以不同方式并以不同形式给药。因此,例如,它可以以系统性方式、经口、肠胃外、通过吸入或通过注射,例如静脉内、通过肌内途径、通过皮下途径、通过透皮途径、通过动脉内途径等给药。口服给药是包含式(I)的化合物的药物组合物的优选给药途径。
与给药相关的频率和/或剂量可以由本领域普通技术人员根据患者、病理学、给药形式等进行调整。通常,对于纤维化疾病或癌症的治疗来说,式(I)的化合物可以以每次给药0.01mg至1g、优选为每次给药1mg至100mg的剂量进行给药。如果需要,可以每天一次或甚至每天数次进行给药。
在特定实施方式中,本发明涉及使用式(I)的化合物与至少一种其他治疗活性药剂的组合来治疗纤维化疾病或癌症。所述其他活性药剂可以特别选自其他抗纤维化药剂或其他抗癌药剂例如索拉非尼。本发明人已显示,式(I)的化合物能够增强促凋亡化合物的促凋亡活性。因此,本发明还涉及使用式(I)的化合物与促凋亡药物的组合。具体来说,式(I)的化合物可以与对成纤维细胞具有促凋亡效应的激酶抑制剂例如十字孢碱组合使用。
在其他实施方式中,本发明提供了治疗纤维化疾病或癌症的方法,所述方法包括给药式(I)的化合物,特别是采取含有这种化合物的药物组合物的形式。
参考下面的非限制性实施例进一步描述了本发明。
实施例
材料和方法
将化合物溶解在二甲基亚砜(DMSO,Fluka目录号41640)中。
hHSC培养和处理条件
将人类原代肝星状细胞(hHSC)(ScienCell)培养在增补有2%胎牛血清(FBS,ScienCell目录号0010)、1%青霉素/链霉素(ScienCell目录号0503)和星状细胞生长增补剂(SteCGS;ScienCell目录号5352)的STeCM培养基(ScienCell目录号5301)中。用聚L-赖氨酸(Sigma目录号P4707)包被培养塑料器具。将hHSC以1.2x 104个细胞/孔的密度铺板于96孔板中,并在37℃和5%CO2下培养过夜,然后用PBS(Invitrogen目录号14190)洗涤细胞,并用无血清且无SteCGS的培养基替换生长培养基继续培养24小时。
对于PDGF诱导的增殖测定法来说,在添加PDGF-BB(10ng/mL;R&D Systems目录号520-BB)之前将细胞用所有化合物预处理1小时。然后继续处理另外20小时。对于血清诱导的增殖测定法来说,将细胞用化合物预处理1小时,然后施加在无SteCGS培养基中的FBS(0.5%)(ScienCell目录号0010),持续20小时。
PDGF诱导的增殖的测定
使用BrdU标记和检测试剂盒(Roche目录号11647229001),通过溴脱氧尿苷(BrdU)的掺入来测量细胞增殖。向细胞加入BrdU标记溶液,随后再温育4小时,然后固定,添加核酸酶,添加抗BrdU抗体-POD和过氧化物酶底物。使用ELISA读板器(Tecan)测量405nm处的吸光度(使用690nm的参比波长)。
PDGF诱导的PDGFRβ磷酸化测定法
使用基于细胞的ELISA试剂盒(R&D Systems目录号KCB1767),按照制造商的说明书来测量hHSC中PDGFRβ的磷酸化。简短来说,在用PDGF刺激后,将细胞在孔中固定并通透化。然后使用双重免疫酶法标记程序来测量PDGFRβ磷酸化。将细胞与两种第一抗体同时温育:检测PDGFRβ在第751位酪氨酸上的磷酸化的磷酸化特异性抗体,以及识别磷酸化和非磷酸化两种形式的PDGFRβ的对照抗体。使用用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的两种第二抗体和用于HRP或AP的两种光谱不同的产荧光底物进行检测。将磷酸化的PDGFRβ的荧光归一化到pan-蛋白的荧光。使用ELISA读板器(Tecan)测量荧光。
使用TGF-β1活化HSC
将人类原代肝星状细胞(hHSC)(ScienCell)在如上所述的标准条件下进行培养。对于确定基因表达模式的实验来说,将hHSC以1.4x 105个细胞/孔的密度铺板于12孔板中并培养过夜。第二天,除去培养基,将细胞用PBS(Invitrogen目录号14190)洗涤,并加入无血清且无SteCGS的培养基继续培养16小时。将细胞在无血清且无SteCGS的培养基中用化合物加上TGFβ1(1ng/mL)处理24小时。
基因表达
使用Mini试剂盒(Qiagen),按照制造商的说明书来分离总RNA。使用M-MLV RT(Moloney鼠类白血病病毒反转录酶)(Invitrogen目录号28025),在RT缓冲液1x(Invitrogen)、1mM DTT(Invitrogen)、0.18mM dNTP(Promega)、200ng pdN6(Amersham)和30U RNase抑制剂(Promega)存在下,将250ng总RNA反转录成cDNA。
然后使用MyiQ单色实时PCR检测或iCycler iQ多重实时PCR检测系统(两种系统都来自于Biorad)进行定量PCR。简短来说,在96孔板中,在5μL 5x稀释的反转录混合物上,使用iQ SYBR Green Supermix试剂盒来进行PCR反应。实验条件为:25μL反应体积,3mMMgCl2,反向和正向引物各0.5μL(10pMol)。
引物名称 | 序列ID | 序列(5’->3’) |
αSMA正向 | 1 | ACTGCCTTGGTGTGTGACAA |
αSMA反向 | 2 | TGGTGATGATGCCATGTTCT |
Col1α1正向 | 3 | AATGGTGCTCCTGGTATTGC |
Col1α1反向 | 4 | ACCAGGTTCACCGCTGTTAC |
Col4α1正向 | 5 | GTTGGTCTACCGGGACTCAA |
Col4α1反向 | 6 | GTTCACCTCTGATCCCCTGA |
TGFβR1正向 | 7 | TGTTGGTACCCAAGGAAAGC |
TGFβR1反向 | 8 | CACTCTGTGGTTTGGAGCAA |
VEGFR1正向 | 9 | TGTCAATGTGAAACCCCAGA |
VEGFR1反向 | 10 | GTCACACCTTGCTTCGGAAT |
VEGFR2正向 | 11 | AGCGATGGCCTCTTCTGTAA |
VEGFR2反向 | 12 | ACACGACTCCATGTTGGTCA |
HGFR正向 | 13 | CAGGCAGTGCAGCATGTAGT |
HGFR反向 | 14 | GATGATTCCCTCGGTCAGAA |
FGFR1正向 | 15 | GAAGTTCAAATGCCCTTCCA |
FGFR1反向 | 16 | CCAGCTGGTATGTGTGGTTG |
c-KIT正向 | 17 | GTCTCCACCATCCATCCATC |
引物名称 | 序列ID | 序列(5’->3’) |
c-KIT反向 | 18 | GTTGGTGCACGTGTATTTGC |
36B4正向 | 19 | CATGCTCAACATCTCCCCCTTCTCC |
36B4反向 | 20 | GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG |
使用36B4基因的表达作为参比进行表达水平的归一化。
对于每个基因来说,通过选择最佳点(至少3个点)绘制标准曲线,以便具有接近100%的PCR反应效率和接近于1的相关系数。使用管家基因和靶基因两者的标准曲线方程来确定表达水平(将每个靶基因的特定PCR效率考虑在内)。
相对于TGFβ1的诱导因数如下确定:
其中A=在试验组中所研究的基因的表达水平
B=在TGFβ1 1ng/mL组中所研究的基因的表达水平
因此,诱导因数越低,目标化合物越多地抑制hHSC的TGFβ1活化。实验结果被表示成诱导因数的平均值±标准偏差(SD)。
通过测量半胱天冬酶3/7活化来评估凋亡
将人类原代肝星状细胞(hHSC)(ScienCell)在如上所述的标准条件下进行培养。对于凋亡测定法来说,将hHSC以1.2x 104个细胞/孔的密度铺板于黑色96孔板中,并在37℃和5%CO2下培养24小时,然后用PBS(Invitrogen目录号14190)洗涤细胞,并用无血清且无SteCGS的培养基替换生长培养基,继续培养16小时。将细胞在无血清且无SteCGS的培养基中,用单独或与十字孢碱组合的式1的化合物处理24小时。
使用来自于Promega的测定体系(Promega目录号G8093),按照制造商的说明书来确定半胱天冬酶-3和-7的活性。在温育期结束时,向含有100μL含空白、阴性对照细胞或处理过的细胞的培养基的每个孔加入100μL3/7试剂。在细胞裂解后,通过在来自于Tecan的经典读板器中测量发光信号,来确定活化的半胱天冬酶3和7对底物(含有DEVD序列)的切割。发光与处理过的细胞中存在的半胱天冬酶活性的量成正比。
FGFR、PDGFR、VEGFR和c-Kit蛋白激酶活性抑制的测量
在下面的表中显示的10种所选激酶上,以10μM浓度测试了式(I)的化合物对激酶的抑制。使用测量放射性的蛋白激酶测定体系(33Pan活性测定体系)来测量激酶活性。用于所有蛋白激酶的测定体系含有70mM HEPES-NaOH pH 7.5、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3μM原钒酸钠、1.2mM DTT、ATP(可变量,对应于相应激酶的表观ATP-Km,参见表1)、[γ-33P]-ATP(每个孔约8x 105cpm)、蛋白激酶(可变量,参见表1)和底物(可变量,参见下表)。
用于所测试的激酶的测定体系参数
将反应混合物在30℃温育60分钟。使用50μl 2%(v/v)H3PO4停止反应,对板进行抽吸,并用200μL 0.9%(w/v)NaCl洗涤两次。使用微量板闪烁计数器(Microbeta,Wallac)测定33P的掺入。
对于每种激酶来说,含有完整的反应混合物但没有激酶的三个孔的cpm的中位数值被定义为“低对照”。该值反映出在不存在蛋白激酶但存在底物的情况下,放射活性与板的非特异性结合。此外,对于每种激酶来说,含有完整的反应混合物但没有任何化合物的另外三个孔的cpm的中位数值被作为“高对照”,即在不存在任何抑制剂情况下的完全活性。高对照与低对照之间的差值被作为每种激酶的100%活性。
作为数据评估的一部分,从每种激酶的高对照值中以及从它们相应的“化合物值”中减去低对照值。使用下式来计算每个化合物孔的残留活性(单位为%):
残留活性(%)=100X[(化合物的cpm–低对照)/(高对照–低对照)]。
人类肿瘤细胞系增殖的抑制的评估
本实验证实了式(I)的化合物在体外对癌细胞增殖的直接抑制效应。将22株人类肿瘤细胞系在培养箱中,在含有10%FBS的来自于ATCC的完全培养基中,在37℃和5%CO2下培养。将处于对数期的细胞用于增殖测定。将细胞收集,计数,然后以适合的密度接种在96孔板中并温育16-24小时。然后,加入各种不同浓度的式(I)的化合物(8种浓度,从100μM开始逐渐降低的3倍稀释度)。在72小时的增殖测定期间,每24小时更新处理培养基。使用试剂盒(Promega)分析药物处理的细胞和对照细胞。简单来说,向每个试验孔加入试剂,并在定轨摇床上混合2分钟。将板以90g短暂离心,并在室温下温育另外10分钟以使发光信号稳定。在PHERAstar Plus上检测发光信号。
在结肠炎模型中评估结肠壁纤维化的发展
从通过2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎之前5天开始直至安乐死,将式(I)的化合物以30mg/kg/天的量口服给药于Sprague Dawley大鼠。
为了诱导结肠炎,使用戊巴比妥腹膜内注射将Sprague Dawley大鼠麻醉2小时。通过在距肛门8cm处直肠内注射TNBS(80mg/kg,在40%乙醇中)来诱导结肠炎。在TNBS给药后4天将动物处死,并使用基因表达测定法来评估式(I)的化合物的预防效果。
结肠样品中的α-SMA基因表达研究
使用Mini试剂盒(Qiagen),按照制造商的说明书分离总RNA。使用M-MLVRT(Moloney鼠类白血病病毒反转录酶)(Invitrogen目录号28025),在RT缓冲液1x(Invitrogen)、1mM DTT(Invitrogen)、0.18mM dNTP(Promega)、200ng pdN6(Amersham)和30U RNase抑制剂(Promega)存在下,将1μg总RNA反转录成cDNA。然后使用CFX96 TouchTM实时PCR检测系统(Biorad)进行定量PCR。简短来说,在96孔板中,在5μL 5x稀释的反转录混合物上,使用iQ SYBR Green Supermix试剂盒来进行PCR反应。实验条件为:25μL反应体积,3mM MgCl2,反向和正向引物各0.5μL(10pMol)。
引物名称 | 序列(5’->3’) |
αSMA正向(SEQ ID NO:1) | ACTGGGACGACATGGAAAAG |
αSMA反向(SEQ ID NO:2) | CATCTCCAGAGTCCAGCACA |
使用36B4基因的表达作为参比进行表达水平的归一化。
引物名称 | 序列(5’->3’) |
36B4正向(SEQ ID NO:19) | CATGCTCAACATCTCCCCCTTCTCC |
36B4反向(SEQ ID NO:20) | GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG |
对于每个基因来说,通过选择最佳点(至少3个点)绘制标准曲线,以便具有接近100%的PCR反应效率和接近于1的相关系数。使用管家基因和靶基因两者的标准曲线方程来确定表达水平(将每个靶基因的特定PCR效率考虑在内)。
相对于TNBS处理的大鼠的诱导因数如下确定:
其中A=在TNBS+30mg/kg/天的式(I)的化合物组中所研究的基因的表达水平
B=在TNBS组中所研究的基因的表达水平
因此,诱导因数越低,目标化合物越多地抑制TNBS诱导的结肠壁纤维化。实验结果被表示成诱导因数的平均值±标准偏差(SD)。
结果和结论:
已将PDGF的过高活性与数种人类障碍(包括器官纤维化和肿瘤发生)相关联。在肌成纤维细胞的扩增中,PDGF通过刺激它们的增殖、迁移和存活而发挥关键作用。
出人意料的是,我们的实验数据显示,式(I)的化合物以剂量依赖性方式抑制由PDGF处理(图1)或由血清处理(图2)引起的hHSC的增殖。正如在图1和2上证实的,式(I)的化合物的效能与选择性PDGFR抑制剂Crenolanib的效能相当。式(I)的化合物具有抗增殖性质并干扰PDGFR信号转导通路的功能性激活。
配体诱导的受体的同二聚化或异二聚化导致PDGFR的胞内结构域内的特定酪氨酸残基的自体磷酸化,并导致一些信号转导通路(包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、Ras-MAPK、Src家族激酶和磷脂酶Cγ(PLCγ))的激活。这导致刺激细胞增殖和存活。
出人意料的是,我们的实验数据显示,式(I)的化合物抑制hHSC中由PDGF-BB诱导的PDGFRβ上的第751位酪氨酸的磷酸化。式(I)的化合物的这种抑制是剂量依赖性的,并且与选择性PDGFR抑制剂Crenolanib获得的抑制同样有效(图3)。
对于纤维化来说,已鉴定到不同的受体酪氨酸激酶作为疾病进展的决定因素和抗纤维化疗法的潜在靶点。最近的临床前结果表明,在肺纤维化模型中,与更加选择性地抑制PDGFR通路的处理相比,同时抑制PDGFR、VEGFR和FGFR激活的通路导致抗纤维化活性提高。如表2中所示,本发明人出人意料地发现,式(I)的化合物能够抑制所选激酶(包括参与纤维化和癌症发生两者的受体酪氨酸激酶PDGFR、VEGFR、FGFR)的激酶活性。
表2:正如在生物化学激酶活性测定法中所测量的,式(I)的化合物抑制所选受体 酪氨酸激酶的激酶活性。报告的结果是在10微摩尔/升的浓度下获得的。
如表3中所示,本发明人出人意料地发现,除了直接的激酶抑制性质之外,式(I)的化合物能够在活化的hHSC中抑制在TGFβ1处理后诱导的经典的促纤维化基因例如αSMA、Col1α1、Col4α1、TGFβR1的表达和与纤维化的发生相关的酪氨酸激酶受体VEGFR1、VEGFR2、FGFR1的表达两者,正如从以前发表的资源所判断的[63]。如表3中所示,式(I)的化合物的基因抑制谱与使用靶向PDGFR、VEGFR、RAF和KIT的酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼所获得的非常相似。索拉非尼以前已在临床前模型中显示出重要的抗纤维化活性,并在如肝细胞癌(HCC)和肾细胞癌(RCC)这样的癌症的治疗中显示出临床效能[64-66]。
在原代人类肝星状细胞(hHSC)中,通过在无血清条件下用TGFβ1(1ng/mL)处理,诱导了促纤维化基因和癌相关基因两者的表达。索拉非尼(Nevaxar)这种发挥抗纤维化和抗癌两种性能的多受体酪氨酸激酶抑制剂被用作参比化合物。在暴露于TGFβ124小时后,通过定量RT-PCR技术确定目标基因在处理和未处理的两种hHSC中的表达。
实验结果被表示成Emax值,其指示了在10微摩尔/升浓度下获得的最大抑制。利用Sigma Plot 11.0软件,使用单因素ANOVA,然后使用Bonferroni事后检验来进行统计学分析。
[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(与TGFβ11ng/mL组比较)]
表3式(I)的化合物和索拉非尼两者都干扰hHSC中由TGFβ1处理所引起的相同靶基 因的表达
肠纤维化是炎性肠病(IBD)的发病特点[67],并在这种疾病的临床前模型中出现。到目前为止,没有鉴定到能够在IBD中防止纤维化发生或治疗已建立的纤维化的治疗方法。如图4中所示,本发明人出人意料地发现,在2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的IBD临床前模型中,结肠中结肠炎诱导的纤维化标志物(α-SMA)表达的提高被式(I)的化合物的给药部分地阻止。这表明式(I)的化合物可以在不同器官和不同障碍中预防和/或治疗纤维化发生。
表4:式(I)的化合物抑制源自于所选癌症类型的实验细胞系的增殖。抑制率被表示成以微摩尔/升为单位的EC50值,其如材料和方法中所述通过对实验数据进行曲线拟合来计算。
大多数具有抗癌活性的治疗性化合物干扰癌细胞增殖。如表4中所示,本发明人出人意料地发现,式(I)的化合物抑制对应于不同肿瘤类型的多种多样的癌细胞系的增殖。
诱导活化的hHSC凋亡的能力是纤维化疾病中的重要靶点。本发明人出人意料地发现,式(I)的化合物具有适度的促凋亡性质,如图5中所示,但它出人意料地以剂量依赖性方式增强广谱激酶抑制剂十字孢碱的促凋亡活性。
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Claims (10)
1.化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮在制备药物中的应用,所述药物用于与PDGFR、FGFR、VEGFR或Kit相关的纤维化疾病的治疗或预防,或用于与PDGFR、FGFR、VEGFR或Kit相关的癌症的治疗或预防,其中所述纤维化疾病不是肝纤维化。
2.根据权利要求1所述的应用,其中所述纤维化疾病是肺、心脏、肌肉、皮肤、软组织、骨髓、肠和关节的纤维化。
3.根据权利要求1所述的应用,其中所述纤维化疾病是肺纤维化、囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、炎性肠病(IBD)相关性纤维化、结肠炎相关性纤维化、瘢痕瘤、陈旧性心肌梗塞、硬皮病/系统性硬化症、关节纤维化或粘连性囊炎。
4.根据权利要求3所述的应用,其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化。
5.根据权利要求1所述的应用,其中所述癌症是白血病或实体瘤。
6.根据权利要求5所述的应用,其中所述实体瘤是肾细胞癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胃癌、与神经纤维瘤相关的脑膜瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺外分泌肿瘤、或骨髓增殖性/骨髓增生异常疾病。
7.根据权利要求1所述的应用,其中所述癌症是皮肤纤维肉瘤、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、结直肠癌、或前列腺癌。
8.化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮在制备药物中的应用,所述药物用于肝癌的治疗。
9.根据权利要求8所述的应用,其中所述肝癌是肝细胞癌。
10.化合物1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮在制备药物中的应用,所述药物用于克罗恩病的治疗或预防。
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