CN108779073A - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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M·奥米尔
D·麦奎德
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Xi Naishanyikan Medical College
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Abstract

一种对需要治疗的受试者治疗癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2015年6月23日提交的美国临时申请第62/183,517号的优先权，其主题通过引用整体并入本文。
技术领域
蛋白质激酶作为治疗靶点已被接受，并已成为肿瘤学药物开发工作的主要焦点，包括数百种在流水线中的或已经在临床上的抑制剂。另一方面，蛋白质磷酸酶由于它们缺乏底物特异性以及与被发现为有效活性位点抑制剂的天然产物相关联的毒性而在药物开发中被极大地忽视。
背景技术
蛋白质磷酸酶2A(PP2A)是四种主要丝氨酸苏氨酸磷酸酶中的一种，参与细胞生长和分裂的负调控。PP2A可以使关键的致癌信号蛋白去磷酸化，从而作为肿瘤抑制剂起作用。PP2A蛋白磷酸酶是一种普遍和保守的磷酸酶，具有广泛的底物特异性和不同的细胞功能。与蛋白质激酶的底物特异性狭窄相比，PP2A与多种底物相互作用，因此其活化实际上是协同抑制包括致癌信号途径的多种信号途径的联合疗法。其中PP2A的靶点为致癌信号级联蛋白，例如Raf、MEK、AKT、ERK和FOXO。
发明内容
本申请涉及用于治疗癌症的组合物和方法，特别是涉及PP2A激活剂和激酶抑制剂和/或包含其的药物组合物的用途，以治疗需要治疗的受试者的癌症。
在一些实施方式中，对需要治疗的受试者治疗癌症的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂。在一些方面，受试者可以是人。在其它方面，癌症的特征在于PP2A表达在癌细胞中降低。在另外其它方面，癌症可以选自由白血病、前列腺癌、子宫内膜癌和非小细胞肺癌组成的组。
在一些实施方式中，PP2A激活剂可以包括促进和/或诱导PP2A激活的小分子。例如，PP2A激活剂可以是三环安定药化合物或其衍生物。
在一些实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂选自MEK抑制剂、EGFR抑制剂、Her-2激酶抑制剂、Src抑制剂、IKK抑制剂、Jak2抑制剂、Aurora激酶抑制剂、CHK1抑制剂和GSK-3抑制剂。
在一些实施方式中，当以不存在PP2A激活剂施用时，蛋白质激酶抑制剂的量是亚治疗性的。在其它实施方式中，当与蛋白质激酶抑制剂联合施用时，PP2A激活剂的量为亚治疗性的。
在另一个实施方式中，一种用于对需要治疗的受试者治疗癌症的方法包括：向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括PP2A激活剂、蛋白质激酶抑制剂及其药学上可接受的载体的共制剂。
附图说明
在参考附图阅读以下描述时，本申请的上述和其它特征对于本领域的技术人员来说将变得显而易见，其中：
图1为蛋白质磷酸酶2A(PP2A)由ABC亚基组成并使关键致癌性信号蛋白去磷酸化以作为肿瘤抑制剂起作用的示意图。
图2为说明通过辐射质谱足迹检测到的PP2A A-C二聚体中的构象变化的视觉表示的模型。箭头区表示在实施例化合物1治疗时催化亚基的高度保护的C-末端尾部。
图3示出了由化合物1诱导的Y307去磷酸化和靶点接合的动力学的蛋白印迹分析。化合物1剂量的提高诱导c-Myc的非常快速的去磷酸化，导致以类似的时间依赖性方式的Parp裂解。然而，Y307去磷酸化作为初始PP2A激活的次级事件发生，表明化合物1在非常短的时间点激活磷酸酶是不必要的。
图4(A-E)示出了达沙替尼与MOLT4和A549细胞系中SMAP化合物1和化合物2的联合效应。A)达沙替尼的添加显著增强MOLT4细胞的膜联蛋白/PI积极性。B)通过FACS分析，达沙替尼的添加显著增加A549细胞中的亚G1(凋亡)部分。C)化合物1和达沙替尼联合协同降低MOLT4中的Y307磷酸化，从而更积极地激活PP2A和磷酸化/降解诸如c-Myc的致癌底物。D)达沙替尼与化合物2的联合通过在A549中以较高亲和性去磷酸化Y307来协同激活PP2A。E)MTT法测定使用化合物2/达沙替尼剂量增加联合以使化合物2的IC50在该细胞系中降低接近2倍。
图5示出了用于鉴定抗癌药物联合的磷酸蛋白质组学和生物信息学工作流程的概述。
图6示出了MAPK的标准信号。
图7示出了时间过程磷酸化蛋白组学的KSEA热图结果，仅示出了与图6中的典型MAPK途径相关的激酶。
图8示出了NCR裸鼠中H358异种移植物的瀑布图，显示了在不同的治疗中在研究开始和结束之间的肿瘤体积(mm3)差异。
图9示出了时间过程磷酸蛋白质组学的KSEA热图结果，仅示出了SRC的输出，SRC是一种与典型MAPK途径分开操作的激酶。
图10示出了不同治疗的H358异种移植物肿瘤体积差异的瀑布图。
图11示出了不同治疗的H441异种移植物肿瘤体积差异的瀑布图。
图12示出了不同治疗的H441异种移植物肿瘤体积差异的瀑布图。
具体实施方式
本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这种技术在本领域中通常是已知的，并在方法论中有详细描述，例如Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel等.Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)。除非另有定义，本文所用的所有技术术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。通常理解的分子生物学术语的定义可以在例如Rieger等,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,5th Ed.,Springer-Verlag:New York,1991和Lewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994中找到。本文提供的定义是为了便于理解本文常用的某些术语，并不意味着限制本申请的范围。
定义
本文所述的术语仅用于实施方式的描述，而不应被解释为对本发明整体的限制。除非另有说明，“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用。此外，如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、“该”包括它们的复数形式，除非受上下文周围的限制。
在说明书和权利要求中出现的术语“包括”及其变型不具有限制性含义。
本文所用的术语“治疗”是指对受试者癌症(例如白血病、前列腺癌和非小细胞肺癌)的任何治疗，包括但不限于抑制疾病发展、阻止与疾病相关的临床症状的发展、和/或缓解与疾病相关的症状。然而，术语"治疗"和"改善"不一定意味着表明在折磨受治疗的受试者的癌症下疾病过程的逆转或停止。这样的术语表明，与未治疗时发生的症状相比，与治疗条件相关的有害体征和/或症状减轻或减少，或发展速率或转移率降低。疾病体征或症状的变化可以在受试者的水平上评估(例如评估受试者的功能或状态)，或在组织或细胞水平上评估。根据本发明，在细胞水平的期望治疗机制包括但不限于癌细胞过程扩展和细胞迁移减少、细胞凋亡、细胞周期抑制、细胞分化、或DNA合成抑制中的一种或多种。
本文所用的术语"预防"包括预防临床上明显的不需要的细胞增殖的发生或防止个体临床前明显的阶段发生不需要的快速细胞增殖的风险。本定义的目的也包括防止恶性细胞的转移或阻止或逆转恶性细胞的进展。这包括那些具有高风险的发展癌前病变和癌症的预防性治疗。风险升高表示受试者将发展癌症的风险高于平均水平，这可以通过家族病史或检测导致癌症发病倾向的基因来确定。
本发明包括本文所述的化合物及其药学上可接受的形式，包括异构体(例如非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、盐、溶剂化物、多晶型物和前药等。特别地，如果化合物是光学活性的，本发明具体包括每种化合物的对映异构体以及对映异构体的外消旋混合物。应当理解的是，术语"化合物"包括任何或所有这些形式，无论是否明确地陈述(尽管有时候明确地陈述了"盐")。
本文所用的"药学上可接受的"意指所述化合物或组合物适于向受试者施用以实现本文所述的治疗，而不会对疾病的严重性和治疗的必要性产生过度有害的副作用。
术语"药学上可接受的盐"是指由药学上可接受的包括无机酸和碱以及有机酸和碱的无毒酸或碱制备的盐。本发明的化合物是碱性的，盐可以通过药学上可接受的无毒酸包括无机酸和有机酸制备。适用于本发明化合物的药学上可接受的酸加成盐包括乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、樟脑、樟脑磺酸、碳酸、柠檬酸、乙二磺酸、乙磺酸、乙二胺四乙酸、甲酸、富马酸、葡庚糖、葡萄糖、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、月桂基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘磺酸、硝酸、油酸、双羟丙酸、泛酸、磷酸、新戊酸、聚半乳糖醛酸、水杨酸、硬脂酸、丁二酸、琥珀酸、单宁酸、酒石酸、十八烷酸和对甲苯磺酸等。当所述化合物含有酸性侧链时，本发明化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐或由赖氨酸、精氨酸、N,N'-二苄基乙二胺、氯丙卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。当合适时，另外的药学上可接受的盐包括连接到具有1-20个碳原子的烷基的无毒铵阳离子和羧酸盐、磺酸根和膦酸根阴离子。
本文所用的术语"有效量"是指PP2A激活剂的量和蛋白质激酶抑制剂的量，使其联合足以提供期望的效果。例如，“治疗有效量”提供了有效减少或阻止如受试者异常细胞生长或细胞迁移的疾病或病症的量。其结果可能是体征、症状或疾病或病症的病因或任何其它期望的生物系统改变的减少和/或减轻。治疗的有效性可以通过受试者肿瘤负荷或肿瘤体积的减少或肿瘤生长或肿瘤细胞浸润和/或迁移的减少来评估，以响应于PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂的联合施用。肿瘤负荷的减少可以表示肿瘤质量的直接下降，也可以根据肿瘤生长延迟而测定，它是通过控制肿瘤生长到同一体积所需的时间减去控制肿瘤生长到一定体积的平均时间来计算的。肿瘤细胞转移的减少可以表示肿瘤细胞迁移的直接降低，或可以根据肿瘤细胞转移的延迟而测定。本领域普通技术人员可以通过常规实验确定任一种情况下PP2A激活剂或蛋白质激酶抑制剂的有效量。
用于治疗目的的术语"受试者"包括任何患有特征为不需要的快速细胞增殖病症的人或动物受试者。这种病症包括但不限于癌症和癌前病变。在具体实施方式中，受试者包括疑似患有或已被诊断为癌症的任何人或动物受试者。对于预防方法，受试者包括任何人或动物受试者，并且优选那些有风险获得特征为不需要的快速细胞增殖病症例如癌症的人受试者。受试者可能由于暴露于致癌剂而遗传倾向于患有特征为不需要的快速细胞增殖等的病症，从而存在风险。除了对人类治疗有用外，本发明的化合物也可用于哺乳动物的兽医治疗，包括伴侣动物和农场动物，例如但不限于狗、猫、马、牛、羊和猪。优选地，受试者为人。
如本文所用，术语“诊断为癌症的受试者”、“患有癌症的受试者”或“鉴定为癌症的受试者”是指被鉴定为患有或可能患有癌症的患病受试者。诊断为癌症的受试者的非限制性实例包括使用由董事会认证的病理专家进行的组织分析以及基于分子生物学方法的诊断测试。
本文描述的实施方式涉及用于治疗癌症的组合物和方法，特别涉及PP2A激活剂与蛋白质激酶抑制剂的联合应用，以及包含其的药物组合物，以治疗需要治疗的受试者的癌症。已经表明，小分子化合物可以结合和激活蛋白磷酸酶2A(PP2A)，这是一种通常在人类癌症中是失活的杂三聚体肿瘤抑制剂。然而，这种基于小分子的磷酸酶活化的分子机制尚未被发现。采用辐射质谱足迹(adiolytic mass spectrometry footprinting)，阐明了PP2A复合物的结构变化(参见图2)。不受理论的束缚，据信PP2A激活剂以保护氨基酸残基Y307免受抑制磷酸化的机制以在细胞培养和体内模型中酶促激活该磷酸酶并显示出抗癌作用，而在通过关键致癌信号途径(包括c-Myc、Akt、MAPK和ERK)的随后下调中没有发现其它药物中的明显毒性。这些致癌信号途径可被用来提供PP2A与蛋白质激酶抑制剂的抗癌药物联合，能增强或协同加强PP2A的抗癌作用。此外，已经发现至少一些蛋白质激酶抑制剂例如SRC抑制剂与PP2A激活剂联合使用，可协同去磷酸化Y307，并且在癌症的多种体外模型中更积极地激活PP2A。因此，可将治疗有效量的PP2A激活剂与蛋白质激酶抑制剂联合施用以治疗需要治疗的受试者的癌症。
PP2A激活剂
PP2A激活剂可以为任何药物或化合物，例如药理学化学物质、复合物(例如金属络合物)、肽试剂、融合蛋白或寡核苷酸，其激活磷酸酶和/或在PP2A复合物中诱导显著的构象变化，从而导致在Y307残基处的磷酸化抑制降低。
在一些实施方式中，PP2A激活剂可以包括PP2A的小分子激活剂。例如，PP2A激活剂可以包括能够诱导PP2A复合物中的构象变化以导致在Y307处的磷酸化抑制降低的三环安定药化合物衍生物。在某些具体实施方式中，PP2A激活剂可以包括缺乏GPCR或单胺转运体药理学的三环安定药化合物。
在一些具体实施方式中，用于本发明的小分子三环安定药化合物衍生物PP2A激活剂可以包括化学式(I)的化合物：
其中：
B选自：直接的键、-O-、-(CH2-O)-、-(O-CH2)-、-C(＝O)N(CH3)-和-N(CH3)C(＝O)-；
A选自N和CH；
T为苯环或五元或六元杂芳环；
U为苯环或五元或六元杂芳环；
N为0、1或2；
R1、R2、R3和R4独立地选自H、OH、卤素、氰基、硝基、(C1-C3)烷基氨基、(C1-C3)二烷基氨基、(C1-C3)酰氨基、(C1-C3)烷基磺酰基、(C1-C3)烷硫基、(C1-C3)烷基、(C1-C3)卤代烷基、(C1-C3)卤代烷氧基，-CC(＝O)O(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基；R5和R6独立地选自H、卤素、氰基、硝基、叠氮基、(C1-C3)卤代烷基、(C1-C3)卤代烷氧基和(C1-C3)卤代烷硫基。
C1-C20烃包括烷基、环烷基、多环烷基、链烯基、炔基、芳基及其组合。实例包括苄基、苯乙基、环己基甲基、金刚烷基、樟脑基和萘乙基。烃基是指由氢和碳作为仅有元素组分组成的任何取代基。脂肪族烃是非芳族烃类；它们可以是饱和的或不饱和的、环状的、线性的或枝状的。脂肪族烃的示例包括异丙基、2-丁烯基、2-丁炔基、环戊基、降冰片基等。芳族烃类包括苯(苯基)、萘(萘基)、蒽等。
除非另有说明，烷基(或亚烷基)旨在包括线性的或枝状的饱和烃结构及其组合。烷基是指1-20个碳原子的烷基，优选1-10个碳原子，更优选1-6个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基等。
环烷基是烃的子集并且包括3-8个碳原子的环烃基。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和降冰片基等。
除非另有说明，术语“碳环”旨在包括环原子均为任意氧化态碳原子的环体系。因此(C3-C10)碳环是指非芳族和芳族体系，包括例如环丙烷、苯和环己烯的体系；(C8-C12)碳多环是指诸如降冰片烷、萘烷、茚和萘的体系。如果没有另外的限制，碳环是指单环、双环和多环。
杂环表示脂肪族或芳族碳环残基，其中1-4个碳原子被选自N、O和S的杂原子取代。所述氮和硫杂原子可选地被氧化，并且所述氮杂原子可选地被季铵化。除非另有说明，杂环可以是非芳族(杂脂族)或芳族(杂芳基)。杂环的示例包括吡咯烷、吡唑、吡咯、吲哚、喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、苯并二噁烷、苯并二噁烷(当做为取代基出现时，通常称为亚甲基二氧基苯基)、四唑、吗啉、噻唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、噻吩、呋喃、噁唑、噁唑啉、异噁唑、二噁烷和四氢呋喃等。杂环基残基的示例包括哌嗪基、哌啶基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑基、奎宁基、异噻唑烷基、苯并咪唑基、噻二唑基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噻吩基(历史上也称为苯硫基)、苯并噻吩基、噻吗啉基、噁二唑基、三唑基和四氢喹啉基。
烷氧或烷氧基是指具有1-20个碳原子，优选1-10个碳原子，更优选1-6个碳原子的直链或支链构型的通过氧连接到母体结构的基团。实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基等。低级烷氧基是指含有1-4个碳的基团。为了本申请的目的，烷氧基和低级烷氧基包括亚甲基二氧基和乙二氧基。
术语"卤素"指氟、氯、溴或碘原子。在一个实施方式中，卤素可以为氟或氯原子。
除非另有说明，酰基是指甲酰基以及具有1、2、3、4、5、6、7和8个碳原子的直链、支链、环状结构、饱和、非饱和、芳香及其组合的通过羰基连接到母体结构的基团。实例包括乙酰基、苯甲酰基、丙酰基和异丁酰基等。低级酰基是指含有1-4个碳的基团。当作为取代基本身被提及时，双键氧称为“氧代(oxo)”。
如本文所用的术语“可选取代的”可以与“未取代或取代的”互换地使用。术语“取代的”是指在具体基团中一个或多个氢原子被具体自由基替换。例如，取代的烷基、芳基、环烷基、杂环基等是指这样的烷基、芳基、环烷基或杂环基，其中每个残基的一个或多个H原子被卤素、卤代烷基、烷基、酰基、烷氧基、羟基低级烷基、羰基、苯基、杂芳基、苯磺酰基、羟基、低级烷氧基、卤代烷氧基、氧杂烷基、羧基、烷氧基羰基[-C(＝O)O-烷基]、烷氧基羰基氨基[HNC(＝O)O-烷基]、氨基羰基(也被称为甲酰胺基)[-C(＝O)NH2]、烷基氨基羰基[-C(＝O)NH-烷基]、氰基、乙酰氧基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、(烷基)(芳基)氨基烷基、烷基氨基烷基(包括环烷基氨基烷基)、二烷基氨基烷基、二烷基氨基烷氧基、杂环基烷氧基、巯基、烷硫基、亚砜、砜、磺酰基氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰基氨基烷基、酰基氨基烷氧基、酰氨基、脒基、芳基、苄基、杂环基、杂环基烷基、苯氧基、苄氧基、杂芳氧基、羟基亚氨基、烷氧基亚氨基、氧杂烷基、氨基磺酰基、三苯甲基、脒基、胍基、脲基、苯氧基苯基和苄氧基取代。“氧代”也被包括在称为“可选取代的”中的取代基；本领域技术人员将理解，由于羰基是二价基团，存在其中不适合作为取代基的情况(例如在苯基上)。在一个实施方式中，1、2或3个氢原子被具体自由基替代。在烷基和环烷基的情况下，3个以上的氢原子可以被氟替代；实际上，所有可用的氢原子都可以被氟替代。在优选的实施方式中，取代基为卤素、卤代烷基、烷基、酰基、羟烷基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基羰基烷氧基、羧基、氰基、乙酰氧基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基芳基磺酰基、芳基磺酰基磺酰胺和苄氧基。
在一些实施方式中，小分子PP2A激活剂可以包括化学式(II)的化合物：
在一些实施方式中，小分子PP2A激活剂可以包括化学式(IIIa)或IIIb的化合物：
在下面描述的实施方式中，除非另有说明，化合物可以具有化学式I、II、IIIa或IIIb。
在一些实施方式中，n为1。这些化合物可以设想为2-氨基环己醇的N-芳基磺酰基衍生物：
在一些实施方式中，n为0。这些化合物可以设想为2-氨基环戊醇的N-芳基磺酰基衍生物：
在一些实施方式中，n是2。这些化合物可以设想为2-氨基环庚醇的N-芳基磺酰基衍生物：
在上述亚环醇(环己醇、环戊醇或环庚醇)中的任一种中，优选的环烷醇是相对构型为使得胺和三环相对于醇均为反式的那些：
在该反式：反式亚组中，化合物可以为单一对映异构体IIIa和IIIb或两者的混合物。如果是混合物，混合物最通常是外消旋的，但这不是必要的。生物活性化合物基本纯的单一对映异构体诸如本文所述的这些通常表现优于其外消旋混合物。
在上述亚环醇(环己醇，环戊醇或环庚醇)中的任一种中，A可以为N或CH。在N系列和CH系列中，B可以为直接的键、-O-、-(CH2-O)-、-(O-CH2)-、-C(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)-。
在一些实施方式中，T和U中的至少一个为杂环，例如吡啶、嘧啶、二嗪、噻吩、噻唑、噁唑、咪唑、吡咯或呋喃。在一些实施方式中，T和U中的一个是苯环，T和U中的另一种选自吡啶、嘧啶和噻吩。在其它实施方式中，T和U均为苯环。
当B为直接的键时，T和U为苯环，A为N，环烷醇的亚类中三环取代基为咔唑的结果：
当B为-O-，T和U为苯环，A为N，环烷醇的亚类中三环为二苯并噁嗪的结果：
当B为-(CH2-O)-或-(O-CH2)-，T和U为苯环，A为N，环烷醇的两种亚类中三环取代基为二苯并噁嗪的结果：
当B是-C(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)-，T和U为苯环，A为N，环烷醇的两种亚类中三环取代基为二苯并二氮的结果：
以及
当B为直接的键时，T和U为苯环，A为CH，环烷醇的亚类中三环取代基为芴的结果：
在一些实施方式中，R2和R4为H，并且R1和R3各自独立选自H、OH、F、Cl、Br、CN、CO2CH3、CH3、CF3、OCF3和OCH3。在一些实施方式中，所有R1、R2、R3和R4为H。在一些实施方式中，R1、R2、R3和R4中的至少一个位于远离桥头碳的碳两个位置。在一些实施方式中，R5为H，R6选自H、F、Cl、CF3、OCF3、SCF3、N3和-CN。R6通常处于对位。
用于本发明的示例性PP2A激活剂可以选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，用于本发明的小分子三环安定药化合物衍生物PP2A激活剂化合物可以包括化学式(IV)的化合物：
其中：
B选自：-S-、-(CH2-CH2)-和-CH＝CH-；
A选自N和CH；
N为0、1或2；
X1选自-H、-F、-Cl、-CF3、-CN；
X2选自-H、-F、-Cl、-CF3、-CN；
Y表示各自独立选自-H、-F、-Cl、-(C1-C3)卤代烷基、-(C1-C3)卤代烷氧基、-(C1-C3)烷氧基、-C(＝O)(C1-C3)烷基、-C(＝O)H、-(C1-C3)羟烷基、-(C1-C3)卤代烷硫基、-N3和-CN中的一个或两个取代基。
在一些实施方式中，本发明涉及化学式(V)的化合物，其中，环烷醇是相对构型为使得胺和三环相对于醇均为反式的那些：
在该反式：反式亚组中，化合物可以为单一对映异构体VIa和VIb或两者的混合物。如果是混合物，混合物最通常是外消旋的，但这不是必要的。生物活性化合物基本纯的单一对映异构体诸如本文所述的这些通常表现优于其外消旋混合物。
在一些实施方式中，PP2A激活剂可以包括化学式(VIa)的化合物：
在一些实施方式中，PP2A激活剂可以包括化学式(VIb)的化合物：
在下面描述的实施方式中，除非另有说明，化合物可以具有化学式IV、V、VIa或VIb。
在一些实施方式中，B为-(CH2-CH2)-。在一些实施方式中，B为-S-。在一些实施方式中，B为-CH＝CH-。
在一些实施方式中，A为N。在一些实施方式中，A为CH。
在一些实施方式中，n为0。在一些实施方式中，n为1。在一些实施方式中，n为2。
在一些实施方式中，X1在一些实施方式中为-H，在一些实施方式中，X1为-F。在一些实施方式中，X1为-Cl。在一些实施方式中，X1为-CF3。在一些实施方式中，X1是-CN。
在一些实施方式中，在一些实施方式中，X2是H，在一些实施方式中，X2是-F，X2是-Cl，在一些实施方式中，X2是-CF3。在一些实施方式中，X2是-CN。
在一些实施方式中，X1和X2均为H。
在一些实施方式中，Y为-H。在一些实施方式中，Y为-F。在一些实施方式中，Y为-Cl。在一些实施方式中，Y为-(C1-C3)卤代烷基。在一些实施方式中，Y为-CF3。在一些实施方式中，Y是-CH2CF3或-CF2CF3。在一些实施方式中，Y为-(C1-C3)卤代烷氧基。在一些实施方式中，Y为-OCF3。在一些实施方式中，Y为-OCHF2。在一些实施方式中，Y是-(C1-C3)烷氧基。在一些实施方式中，Y为-OCH3。在一些实施方式中，Y为-C(＝O)(C1-C3)烷基。在一些实施方式中，Y为-C(＝O)CH3。在一些实施方式中，Y为-C(＝O)H。在一些实施方式中，Y为-(C1-C3)羟烷基。在一些实施方式中，Y为–C(CH3)2OH。在一些实施方式中，Y为-(C1-C3)卤代烷硫基。在一些实施方式中，Y为-SCF3。在一些实施方式中，Y为-N3。在一些实施方式中，Y为-CN。在一些实施方式中，Y的一个实例为H或Cl，而Y的另一个实例选自-H、-F、-Cl、-(C1-C3)卤代烷基、-(C1-C3)卤代烷氧基、-(C1-C3)烷氧基、-C(＝O)(C1-C3)烷基、-C(＝O)H、-(C1-C3)羟烷基、-(C1-C3)卤代烷硫基、-N3、-CN。在一些实施方式中，Y的一个实例是Cl，而Y的另一实例是-OCF3。
在一些实施方式中，B为-(CH2-CH2)-，并且n为1。这样的实例如下所示：
在一些实施方式中，B为–(CH2-CH2)–，A为N，且n为1。这样的实例如下所示：
在一些实施方式中，B–(CH2-CH2)–且A为N。这样的实例如下所示：
在一些这样的实施方式中，X1和X2均为H。在一些实施方式中，Y处于对位，如下所示：
在一些实施方式中，Y选自-H、-F、-Cl、-(C1-C3)卤代烷基、-(C1-C3)卤代烷氧基、-(C1-C3)烷氧基、-C(＝O)(C1-C3)烷基、-C(＝O)H、-(C1-C3)羟烷基、-(C1-C3)卤代烷硫基、-N3和-CN。在一些实施方式中，Y选自-H、-F、-Cl、-CF3、-CH2CF3、-CF2CF3-OCF3、-OCHF2、-OCH3、-C(＝O)CH3、-C(＝O)H、–C(CH3)2OH、-SCF3、-N3和-CN。在一些实施方式中，Y为-OCF3。
本文出现的任何碳-碳双键构型的选择仅仅是为了方便，并且不旨在指定特定的构型；因此本文任意描述的碳-碳双键可以是顺式、反式或任意比例的两种混合物。除非另有说明，本发明化合物的所有互变异构形式均在本发明的范围内。
本文所述的化合物含有一个或多个非对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构体形式，所述立体异构体形式可以以绝对立体化学的形式定义为(R)-或(S)-。本发明旨在包括所有这些可能的异构体。光学活性(R)-和(S)-可使用同源手性合成子或同源手性试剂或使用常规技术进行光学拆分制备异构体。当本文所述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，否则其旨在包括(E)-和(Z)-几何异构体。同样地，旨在包括所有互变异构形式。
本文所用的外消旋、双非消旋(ambiscalemic)和非消旋(scalemic)或对映异构纯化合物的图示为取自Maehr，J.Chem.Ed.，62：114-120(1985)中指示的修改版本：简单线条不提供关于立体化学的信息，仅表达连接性；实和虚的楔形用于表示手性原子的绝对构型；波浪线表示否认所代表的键可能产生的任何立体化学含意；实线和粗虚线是表示所显示的相对构型但不不一定表示外消旋特征的几何描述符；楔形和点线或虚线表示绝对构型不确定的对映异纯化合物。例如图示
表示两种反式：反式对映异构体：
中的一种或两种以任意比例，从纯对映异构体到外消旋体。图示：
表示未知绝对立体化学的单一对映异构体，即它可以为两种前述结构中的任一种，作为基本纯的单一对映异构体。并且最后，图示：
表示一种纯的(1R,2R,6S)-2-氨基-6-(C-连接三环)环己醇。为了本公开的目的，“纯的”或“基本纯的”对映异构体旨在表示该对映异构体至少为所示构型的95％以及其它对映异构体为5％或更少。类似地，“纯的”或“基本纯的”非对映异构体旨在表示该非对映异构体为所示相对构型的至少95％和以及其它非对映异构体为5％或更少。在描述实施例的立体化学的文本中，使用了化学摘要的惯例。因此，“(1R,2R,6S)-rel-”表示三个手性中心处于相对关系，其可用实心粗体和虚线在结构图中表示，而没有“rel”的“(1R,2R,6S)”表示绝对构型的单一对映异构体，可用实和虚的楔形在结构图中表示。
在示例性实施方式中，PP2A激活剂可以选自：
能够激活在本文所述方法中使用的PP2A磷酸酶的额外试剂可选自但不限于：FTY720(也称为芬戈莫德)、毛喉素、1,9-二脱氧毛喉素、神经酰胺(也称为鞘氨醇)如C2-神经酰胺、拓扑异构酶抑制剂如依托泊苷(Eposin，Etopophos，VepesidTM，VP-16TM)、微管聚合酶如甲基-3,5-二碘-4-(4′-甲氧基丙氧基)苯甲酸酯(DIPE或DIPE)、脂肪酸如棕榈酸酯、以及硫醇烷基化试剂如N-乙基马来酰亚胺(NEM)。
用于提高本文所述预防或治疗癌症的PP2A活性的另外试剂包括遗传分子，例如过度表达用于内源PP2A激活剂PTPA、PP2A或个别PP2A基因亚基的构建。类似地，这些试剂也可以采用DNA/RNA抑制分子的形式，例如shRNA或反义序列，包括对内源PP2A抑制剂组或对个别PP2A基因亚基或PP2A基因的特定区域(例如转录调控亚基如启动子)具有特异性的那些。
候选的PP2A激活剂或激活试剂可在动物模型中测试。通常地，动物模型是用于癌症研究的模型之一。在动物模型(例如小鼠)中对各种癌症的研究是用于研究人类癌症所普遍接受的做法。例如，将人肿瘤细胞注入动物的裸鼠模型，通常被接受为有用于研究各种各样的癌症的一般模型(参见例如，Polin等人，Investig.New Drugs,15:99-108(1997))。结果通常在用候选试剂治疗的对照动物和未接受治疗的同窝生对照动物之间进行比较。转基因动物模型也是可用的，并且通常被接受作为人类疾病的模型(参见例如，Greenberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3439-3443(1995))。可在这些动物模型中使用候选试剂以确定候选试剂是否激活PP2A活性，减少与癌症相关的一个或多个症状，包括例如癌症转移、癌细胞运动、癌细胞侵入性或其组合。
蛋白质激酶抑制剂
基因激活通过突变的捕获或激酶的扩增来表征，其中磷酸化蛋白质诱导特定的生长和存活的信号途径。有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶级联的过活化已知在细胞增殖和分化中起重要作用。当生长因子与其受体酪氨酸激酶结合时，可以激活该途径。这种相互作用促进了RAS与RAF的关联，并通过MEK(MAP激酶)启动磷酸化级联到ERK。用于MEK磷酸化的唯一已知底物是MAP激酶、ERK1和ERK2。MEK的磷酸化增加了其对ERK的亲和性和催化活性，以及对ATP的亲和性。MAPK途径的组成性激活已在许多疾病例如黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌和卵巢癌，特别是在胰腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌和卵巢癌中发现。
这些激酶的抑制代表用于一些形式的癌症治疗具有有前景的策略，以及许多激酶抑制剂的实例已经在科学文献中描述，包括有益于治疗人类疾病的几个示例(参见例如J.Zhang等,Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors,NatureReviews Cancer,volume 9,2009,28–39)。PP2A可以负调控或正调控许多作为激酶抑制剂的相同信号途径，因此，PP2A激活剂与蛋白质激酶抑制剂的共同施用可以附加和/或协同增强任一类化合物的抗癌作用。如实施例2中所示的一些实施方式中，可以确定PP2A活化作用和对信号途径(例如典型MAPK信号)的选择性激酶抑制作用，以设计特定的PP2A激活剂和激酶抑制剂联合。
已给出PP2A激活剂与蛋白质激酶抑制剂共同施用的协同作用，当PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂联合施用时达到治疗效果的量或剂量基本上小于(即亚治疗的剂量或量)单独施用每种化合物时达到治疗效果所需的量或剂量。PP2A激活剂和/或蛋白质激酶抑制剂共同施用于受试者还可以减轻对单一试剂的抗性。这种抗性导致对较高剂量的药物和/或更新症状的要求。因此，对受试者可以接收的量会有实际的上限。然而，如果同时使用两种或更多种药剂，可以降低任何单一药物的剂量。这对于患者来说是有利的，因为使用较低水平的治疗试剂对于患者来说是更安全的。因此，在本发明的一些方面中，本文所述的组合物可以在亚治疗水平施用于受试者。
在一些实施方式中，当以不存在PP2A激活剂施用时，蛋白质激酶抑制剂的量为亚治疗性的。在其它实施方式中，当与蛋白质激酶抑制剂联合施用时，PP2A激活剂的量为亚治疗性的。在另一些实施方式中，当蛋白质激酶抑制剂和PP2A激活剂均单独施用时，蛋白质激酶抑制剂和PP2A激活剂的量为亚治疗性的。
在一些实施方式中，与PP2A激活剂联合施用的激酶抑制剂为MEK抑制剂。术语MEK抑制剂是指诸如抑制、减少、降低或减小细胞丝裂原蛋白激酶(MAPK)活性的小分子的化合物或试剂。抑制MEK酶活性相应地降低了MEK对底物肽或蛋白质进行磷酸化的能力。MEK1和MEK2是参与RAS-RAF-MEK-ERK信号转导级联的蛋白质激酶。因此，术语“MEK抑制剂”在其范围内包括能够抑制MEK的化合物。
与PP2A激活剂联合的MEK抑制剂的加入可以导致ERK信号的显著抑制，并因此导致癌细胞增殖的降低。由于MEK抑制剂单独治疗导致临床上的剂量限制毒性，PP2A激活剂和MEK抑制剂联合代表一种优异的治疗策略。
MEK抑制剂的实例为AS703026(EMD Serono)；MSC1936367B(EMD Serono)；GSK1120212(GlaxoSmithKline)；AZD6244(6-(4-溴-2-氯-苯基氨基))-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙氧基))-酰胺；司美替尼；结构IV)(Memorial Sloan-KetteringCancer Center)；ARRY-438162(Array BioPharma)；RDEA119(Ardea Biosciences，Inc)；GDC0941(Genentech)；GDC0973(Genentech)；TAK-733(Millennium Pharmaceuticals，Inc)；RO5126766(Hoffmann-La Roche)；和XL-518(Exelixis)U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯基硫基]丁二烯；ARRY-142886；结构V)。MEK抑制剂的进一步非限制性实例包括PD-0325901、AZD2171、GDC-0973/XL-518、PD98059、PD184352、GSK1120212、RDEA436、RDEA119/BAY 869766、AS703026、BIX 02188、BIX 02189、CI-1040，PD0325901和PD98059。MEK的这些和其它抑制剂及其制造方法的非限制性实例已经被描述在美国专利号5,525,625；6,251,943；7,820,664；6,809,106；7,759,518；7,485,643；7,576,072；7,923,456；7,732,616；7,271,178；7,429,667；6,649,640；6,495,582；7,001,905，美国专利公开号US2010/0331334、US2009/0143389、US2008/0280957、US2007/0049591、US2011/0118298，国际专利申请公开号WO98/43960、WO99/01421、WO99/01426、WO00/41505、WO00/42002、WO00/42003、WO00/41994、WO00/42022、WO00/42029、WO00/68201、WO01/68619、WO02/06213和WO03/077914中，其内容通过引用整体并入本文中。
在其它实施方式中，与PP2A激活剂联合施用的激酶抑制剂为IKK抑制剂。IKKs和相关的激酶通过将其非活性胞质复合物与IκB磷酸化以释放NF-κB以积极调节NF-κB，所述NF-κB转移到转录活性的细胞核中。NF-κB是与许多癌症的发病机理相关的转录因子，癌症例如恶性黑素瘤(参见例如D.Melisi和P.Chaio,NF-kB as a target for cancer therapy inExpert Opin.Ther.Targets(2007)11(2):133-144以及Michael Karin等,THE IKK NF-κBSYSTEM:A TREASURE TROVE FOR DRUG DEVELOPMENT,Nature Reviews Drug DiscoveryVolume 3 2004 17-26)。PP2A负调控NF-κB，例如通过其Rel-A亚基的去磷酸化，参见J.Yang等,Protein Phosphatase 2A Interacts with and Directly Dephosphorylates RelA,Vol.276,No.51,December21,pp.47828–47833,2001以及X.Lu和W.Yarbrough,Negativeregulation of RelA phosphorylation:Emerging players and their roles incancer,Cytokine&Growth Factor Reviews 26(2015)7–13。
已经开发了几种IKK抑制剂来减轻或抑制NF-κB功能，例如N-(6-氯-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-8-基)烟酰胺[PS-1135]；N1-(1,8-二甲基咪唑偶氮[1,2-a]喹喔啉-4-基)乙烷-1,2-二胺[BMS-345541]；1-((5-甲氧基-2-(噻吩-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)-3-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮[SPC-839]；N-(6-氯-7-甲氧基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-8-基)-2-甲基烟酰胺[ML120B]；4-氨基-[2,3'-联噻吩]-5-甲酰胺[SC-514]；(E)-1-(6-(4-氯苯氧基)己基)-2-氰基-3-(吡啶-4-基)胍[CHS828(GMX1778)]；和(Z)-3-(2,4-二甲基-5-((2-氧代吲哚啉-3-甲叉基)甲基)-1H-吡咯-3-基)丙酸[SU6668]作为抗癌剂，参见D.Lee和M.Hung,Advancesin Targeting IKK and IKK-Related Kinases for Cancer Therapy,in Clin CancerRes2008；14(18)September 15,2008。PP2A活化化合物与IKK抑制剂的的共同施用可因此增加任一试剂作为抗癌治疗的有效性。
IKK激酶抑制剂的非限制性实例包括N-(6-氯-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-8-基)烟酰胺；N1-(1,8-二甲基咪唑偶氮[1,2-a]喹喔啉-4-基)乙烷-1,2-二胺；1-((5-甲氧基-2-(噻吩-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)-3-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮；N-(6-氯-7-甲氧基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-8-基)-2-甲基烟酰胺；4-氨基-[2,3'-联噻吩]-5-甲酰胺；(E)-1-(6-(4-氯苯氧基)己基)-2-氰基-3-(吡啶-4-基)胍；和(Z)-3-(2,4-二甲基-5-((2-氧代吲哚啉-3-甲叉基)甲基)-1H-吡咯-3-基)丙酸。
在其它实施方式中，与PP2A激活剂联合施用的激酶抑制剂为Src或Jak2激酶抑制剂。PP2A经受多种水平的调节，包括通过磷酸化翻译后修饰，例如参见Maud Martin等,Recent insights into Protein Phosphatase 2A structure and regulation:thereasons why PP2A is no longer considered as a lazy passive housekeepingenzyme in Biotechnol.Agron.Soc.Environ.2010 14(1),243-252和V Jannsens等inPP2A holoenzyme assembly:in cauda venenum(the sting is in the tail)in Trendsin Biochemical Sciences Vol.33(2008)No.3,113-121。因此催化亚基酪氨酸-307的磷酸化作用起到抑制或减少磷酸酶活性的作用。已知使PP2A催化亚基的酪氨酸-307磷酸化的激酶为Src(其它是lck和Jak2)，并且多种自身具备作为抗癌剂的Src激酶抑制剂已经被开发出来，参见例如L Kim等，Src kinases as therapeutic targets for cancer,Nat.Rev.Clin.Oncol.6,587–595(2009)。因此，本文所述的PP2A激活剂与Src或Jak2抑制剂的共同施用将会增强任一种试剂作为抗癌治疗的有效性。在一些实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂为src抑制剂。Src激酶抑制剂的非限制性实例包括塞卡替尼、达沙替尼、博舒替尼和KX01。在具体的实施方式中，所述Src激酶抑制剂为达沙替尼。
在一些实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂为Jak2抑制剂。Jak2抑制剂的非限制性实例包括鲁索替尼(ruxoltinib)、巴瑞克替尼(Baricitinib)、CYT387、来他替尼(lestaurtinib)、帕克替尼(pacritinib)和TG101348。
在一些实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂为Aurora激酶抑制剂。Aurora激酶已被确定为癌症的治疗靶点，参见例如Katayama和Sen,Aurora kinase inhibitors asanticancer molecules,Biochimica et Biophysica Acta,1799,829-839(2010)。Aurora激酶族的丝氨酸/苏氨酸激酶是有丝分裂症的重要调节剂，其经常在人类癌症中过度表达，并且涉及包括在癌细胞中的染色体不稳定性的发展的致癌性转化。此外，PP2A已显示出负调控Aurora激酶，参见Horn等,Functional Interaction of Aurora-A and PP2A duringMitosis,Mo.Biol of the Cell,18,1233-1241(2007)和Sugiyama等,Aurora-Bassociated protein phosphatases as negative regulators of kinase activation,Oncogene,21,3103-3111(2002)。因此，本文所述的PP2A激活剂与Aurora激酶抑制剂的共同施用将会增强任一试剂作为抗癌治疗的有效性。用于本文所述方法中的Aurora抑制剂可以包括Aurora A、B和/或C蛋白质激酶抑制剂。Aurora激酶抑制剂的非限制性实例包括ZM447439、VX-680(MK-0457)、橙皮素(Hesperadin)、PHA-680632、PHA-739358、化合物677、JNJ-7706621、MLN8054、MLN8237、AZD1152、AS703569、PF-3814735和SNS-314。
在另一些实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂可以为Chk1激酶抑制剂。PP2A可以与诸如CIP2A的内源性抑制剂蛋白质相互作用。抑制剂蛋白质如CIP2A的表达降低促进PP2A的活性。Chk 1激酶抑制剂自身具备作为抗癌剂已经被报道，而且Chk1激酶抑制显示出减少CIP2A表达并促进PP2A活性，参见A.Khanna等,Chk1Targeting Reactivates PP2A TumorSuppressor Activity in Cancer Cells,Cancer Res；73(22)November 15,2013。因此，本文所述的PP2A激活剂的共同施用可增加Chk1激酶抑制剂作为抗癌治疗的有效性。
Chk1激酶抑制剂的示例包括(S)-5-(3-氟苯基)-N-(哌啶-3-基)-3-脲基噻吩-2-甲酰胺[AZD-7762]；(S)-1-(5-溴-4-甲基-2-(吗啉-2-基甲氧基)苯基)-3-(5-甲基吡嗪-2-基)脲[LY2603618(Rabusertib)]；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑啉-4-基)-5-(哌啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺[MK8776(Sch900776)]；(S)-3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氯-4-(奎宁环-3-基氨基)喹啉-2(1H)-酮[CHIR-124]；(R)-2-氨基-2-环己基-N-(5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-氧代-2,6-二氢-1H-[1,2]二氮杂卓[4,5,6-cd]吲哚-8-基)乙酰胺[PF-477736]。
在其它实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂可以为GSK-3抑制剂。GSK-3是一种蛋白质激酶，其失调和过度激活涉及包括癌症的几种疾病的病理(参见例如：J.McCubrey等.“GSK-3as potential target for therapeutic intervention in cancer”,Oncotarget,volume 5,number 10,2881-2911(2014)；和A.Martinez等“Glycogen Synthase Kinase 3(GSK-3)Inhibitors as New Promising Drugs for Diabetes,Neurodegeneration,Cancer,and Inflammation”Medicinal Research Reviews,Vol.22,No.4,373-384,2002)。已经开发了GSK3及其异构型的几种抑制剂，并提出作为如报道中的这些条件的治疗，P.Cohen and M.Goedert,Nature Reviews Drug Discovery,volume 3,479–487(2004)。3-((3-氯-4-羟基苯基)氨基)-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮[SB415286]；3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮[SB216763]；6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈[CHIR-99021(CT-99021)]；N2-(2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)-5-硝基吡啶-2,6-二胺[CHIR-98014]；1-(喹啉-4-基)-3-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)脲[A1070722(AXON 1909)]；4-苄基-2-(萘-1-基)-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮[Tideglusib(NP-12,NP031112)]；和3-(9-氟-2-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂卓[6,7,1-H]吲哚-7-基)-4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮[LY2090313]。此外，已发现GSK-3b通过间接促进抑制PP2A催化亚基的酪氨酸-307磷酸化而对PP2A进行负调控。因此，GSK-3b的抑制在体外和体内减少PP2A酪氨酸-307磷酸化，并因此激活PP2A。参见X.Yao等in“Glycogen synthase kinase-3βregulates Tyr 307phosphorylation of proteinphosphatase-2A via protein tyrosine phosphatase 1B but not Src”,Biochem.J.(2011)437,335–344。因此，PP2A激活剂与GSK-3抑制剂的共同施用将增加任一化合物在治疗癌症中的有效性。在一些实施方式中，GSK-3抑制剂为3-((3-氯-4-羟基苯基)氨基)-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮；3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈；N2-(2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)-5-硝基吡啶-2,6-二胺；1-(喹啉-4-基)-3-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)脲；4-苄基-2-(萘-1-基)-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮；和3-(9-氟-2-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂卓[6,7,1-H]吲哚-7-基)-4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮。
在另一些实施方式中，所述蛋白质激酶抑制剂可以为EGFR抑制剂。表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶家族1型亚组的成员，并在细胞生长、分化和存活中起关键作用的生长因子受体。这些受体的活化通常通过特定配体结合而发生，配体结合导致受体家族成员之间的异或同二聚化，以及随后酪氨酸激酶结构域的自动磷酸化。结合EGFR的特异性配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、两亲性蛋白和一些病毒生长因子。EGFR的激活引发细胞内信号途径的级联，涉及细胞增殖(ras/raf/MAP激酶途径)以及存活(PI3激酶/Akt途径)。包括EGFR和HER2的该家庭的成员已经直接涉及细胞转化。许多人类恶性肿瘤与EGFR的异常或过度表达和/或其特异性配体的过度表达相关联。Gullick,Br.Med.Bull.(1991),47:87-98；Modijtahedi&Dean,Int.J.Oncol.(1994),4:277-96；Salomon,等,Crit.Rev.Oncol.Hematol.(1995),19:183-232。EGFR的异常或过度表达已经与许多人类癌症中的预后不良相关联，包括头部和颈部、乳房、结肠、前列腺、肺(例如NSCLC、腺癌和鳞状肺癌)、卵巢、胃肠癌(胃、结肠、胰腺)、肾细胞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、妇科癌和前列腺癌。在一些情况下，肿瘤EGFR的过度表达已经与化学抗性和不良预后相关联。Lei等,Anti-cancer Res.(1999),19:221-28；Veale,et al.,Br.J.Cancer(1993)；68:162-65。在EGFR中的突变也与许多类型的癌症相关。例如，EGFR突变在非粘质BAC患者中是高度普遍的。Finberg等,J.Mol.Diagnostics.(2007)9(3):320-26。在一种实施方式中，EGFR抑制剂是一种抗体，例如Erbitutux(cetuximab,Imclone Systems Inc.)和ABX-EGF(panitumumab,Abgenix,Inc.)。在另一实施方式中，EGFR抑制剂是与ATP竞争的小分子，例如由Dvir等,J Cell Biol.,113:857-865(1991)描述的Tarceva(厄洛替尼,OSIPharmaceuticals)、Iressa(吉非替尼，Astra-Zeneca)、酪氨酸磷酸化抑制剂；在美国专利号5,679,683中公开的三环嘧啶化合物；在Panek,et al.,Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics 283,1433-1444(1997)中公开的6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-(2-二乙基氯代乙氧基))苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-酮(已知为PD166285)。
根据所述方法用于治疗癌症的附加蛋白质激酶抑制剂可以包括小分子阿法替尼、阿帕替尼、阿西替尼、卡博替尼、卡奈替尼、色瑞替尼、克莱拉尼(crenolanib)、福利替尼(foretinib)、克唑替尼、达拉非尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、乐伐替尼、利尼法尼(linifanib)、莫特塞尼(motosanib),尼洛替尼、尼达尼布、帕博西林(palbociclib)、帕唑帕尼、普纳替尼、拉多替尼、瑞戈非尼、西罗莫司、索拉非尼、舒尼替尼、托法替布、坦罗莫司、曲美替尼、凡德他尼、瓦他拉尼、维罗非尼、福马替尼(fostamatinib)、木利替尼、SU6656,单克隆抗体贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、曲妥珠单抗、以及RNA适配体哌加他尼钠(pegaptanib)。
治疗癌症的方法
本文所述的PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂可用于治疗受试者癌症的方法中。所述方法可包括向受试者施用治疗有效量的至少一种PP2A激活剂与至少一种上述蛋白质激酶抑制剂联合，或其药学上可接受的盐形式。
“癌症”或“恶性肿瘤”作为同义术语，是指多种疾病中的任一种，疾病的特征为细胞不受控制、细胞异常增殖，受影响细胞在局部或通过血流和淋巴系统传播到身体的其它部位(即转移)的能力，以及多个特征结构和/或分子特征中的任一种。“癌细胞”是指经历多步肿瘤进展的早期、中期或高级阶段的细胞。癌细胞包括“增生性细胞”，即在恶性进展的早期阶段中的细胞，“发育异常细胞”，即在肿瘤进展的中间阶段中的细胞，以及“肿瘤细胞”，即肿瘤进展的高级阶段中的细胞。
在一些实施方式中，所述癌症的特点是PI3K-AKT-FOXO信号途径、MAPK信号途径和/或KRAS信号途径的失调。癌症可以选自卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳房癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤、结肠直肠癌和肉瘤。
更具体地，癌症可由本文所述的化合物、组合物和方法治疗，包括但不限于以下：贲门癌，包括，例如肉瘤，如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤；黏液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤和畸胎瘤；肺癌，包括，例如，支气管癌，如鳞状细胞，未分化小细胞未分化大细胞、腺癌；肺泡和细支气管肺泡癌；支气管腺瘤；肉瘤；恶性淋巴瘤；软骨错构瘤；间皮瘤；胃肠道肿瘤，包括，例如，食管癌，如鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤；胃的癌症肿瘤，淋巴瘤，例如，与平滑肌肉瘤；胰腺的癌症，如胰腺导管腺癌、胰岛细胞瘤、胰高血糖素瘤，胃泌素瘤、类癌、及血管活性肠肽瘤；的小肠，癌症如腺癌，淋巴瘤、类癌、Kaposi肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、和纤维瘤；大肠癌的，癌症如腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤和平滑肌瘤；泌尿生殖道癌症，包括，例如，肾脏的癌症，如腺癌、肾母细胞瘤(肾母细胞瘤)、淋巴瘤和白血病；肿瘤的膀胱和尿道，如鳞状细胞癌，移行细胞癌，腺癌；前列腺的，例如，腺癌和肉瘤癌；癌睾丸，如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜上皮癌、肉瘤，在间质细胞癌、纤维瘤、腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤；肝肿瘤，包括，例如，肝癌，如肝细胞癌；胆管癌；肝母细胞瘤；血管肉瘤；肝细胞腺瘤；血管瘤；骨肿瘤，包括，例如，骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、Ewing肉瘤，恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)，多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤，脊索瘤，骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)，良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨肌瘤样纤维瘤、骨样骨瘤和骨巨细胞瘤；神经系统的癌症，包括，例如，的头骨，癌症如骨瘤、血管瘤、颗粒OMA，黄色瘤和畸形性骨炎；脑膜的，肿瘤如脑膜瘤，脑膜瘤(meningiosarcoma)，和胶质瘤；脑的癌症，如星形细胞瘤、髓母细胞瘤，胶质瘤，室管膜瘤癌、生殖细胞瘤(松果体瘤)，多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤；肿瘤脊髓，如神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤、肉瘤；妇科癌症，包括，例如，子宫的癌症如子宫内膜癌；子宫颈癌，如宫颈癌、宫颈不典型增生和预肿瘤；卵巢的癌症，如卵巢癌，包括浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌、颗粒卵泡膜细胞瘤、Sertoli睾丸间质细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤；癌症外阴，如鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤；肿瘤阴道，如透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤，和胚胎性横纹肌肉瘤；肿瘤输卵管，如癌；血液系统恶性肿瘤，包括，例如，血液的肿瘤，如急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病，多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(恶性淋巴瘤)和华氏巨球蛋白血症；皮肤癌包括，例如，恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、Kaposi肉瘤发育不良痣，痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、银屑病；和肾上腺癌，包括，例如，神经母细胞瘤。
癌症可以是可能或不是转移的实体瘤。癌症也可能发生在白血病中作为扩散组织。在某些实施方式中，癌症可以选自白血病、前列腺癌、子宫内膜癌和非小细胞肺癌。
可能受益于本文所述方法的受试者包括男性和女性哺乳动物受试者，包括人、非人灵长类和非灵长类哺乳动物。其它哺乳动物受试者包括驯化的农场动物(例如，母牛、马、猪))或宠物(例如狗、猫)。在一些实施方式中，所述受试者可以包括患有特征为不希望的、脑细胞快速细胞增殖的任何人和动物。这些病症包括但不限于癌症和原癌，如以上所述的那些。对于预防的方法，所述受试者可以包括任何人或动物受试者，并且优选那些有患有获得不需要的快速细胞增殖病症(例如癌症)风险的人受试者。受试者可能由于暴露于致癌剂而存在风险，基因倾向于患有不需要的快速细胞增殖等特征的病症等。
在某些实施方式中，在治疗之前，选择患有特定癌症的患者，或选择具有特定癌症风险的患者。癌症的存在可通过临床医生公知的手段来确定。癌症的初始评估是基于患者呈现的症状。此外，存在后续的诊断程序，包括但不限于PET扫描、CAT扫描、活检以及生物标记评估。
治疗试剂的施用和配方
本文还提供了用于治疗癌症的药物组合物，包括PP2A激活剂、蛋白质激酶抑制剂或PP2A激活剂与蛋白质激酶抑制剂的联合，或其药学上可接受的盐形式，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
虽然本文所述的治疗化合物可以作为原料施用，优选以其作为药物组合物。本文所述的药物组合物可包括PP2A激活剂和/或蛋白质激酶抑制剂，与一种或多种药学上可接受的载体以及任选的一种或多种其它治疗成分一起使用。所述载体必须是“可接受的”，从某种意义上载体与制剂的其它成分是相容性的并不对其受体有害。
所述制剂包括适于口服、胃肠外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)，直肠和局部(包括皮肤、口腔、舌下和眼内)施用。最合适的途径可取决于接收者的状况和病症。制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过本领域公知的任何方法来制备。所有方法包括使上述一种或多种治疗化合物或其药学上可接受的盐("活性成分")以及构成一个或多个辅助成分的载体结合的步骤。通常地，所述制剂通过使用液体载体或细分的固体载体或将两者同时均匀且紧密地结合到一个或多个活性成分而制备，如果需要，将产品成形为所需的制剂。
因此，在某些实施方式中，制剂是通过使用液体载体或细分的固体载体或两者同时均匀且紧密地结合PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂。如果需要，将产品成型为所需的制剂，从而得到在本文所述方法中使用的PP2A激活剂和激酶抑制剂的共制剂。
可用于口服施用的制剂可以作为分散单元，如各自含有预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂；例如粉末或颗粒；例如在水溶液或非水液体中的溶液或悬浮液；或例如水包油液体乳液或油包水液体乳液。所述活性成分也可以呈现为丸剂、冲剂或糊剂。
片剂可以通过压缩或模塑来制备，任选地具有一种或多种辅助成分。压缩片剂可以通过在适当的机器中压缩以自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分来制备，任选与粘结剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。模塑片剂可通过在合适的机器中成型为用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物制成。片剂可以任选地被涂覆或分级，并且可以配制成提供活性成分持续的、延迟的或控制释放。
用于肠胃外施用的制剂包括含水和非水无菌注射溶液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，其使制剂与预期受体的血液呈等渗性。用于胃肠外施用的制剂还包括含水和非水无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以在多剂量容器的单位剂量中呈现，例如密封的安瓿和小瓶，并可储存在冷冻干燥(冻干)条件下只需在使用前立即加入无菌液体载体，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。临时的注射溶液和悬浮液可以通过前述种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
在一些实施方式中，上述PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂可以对受试者全身施用(即肠内或胃肠外)。适用于口服施用的制剂是将有效量的试剂或其药学上可接受的盐溶解于稀释剂例如水、生理盐水或橙汁中而制得的溶液；含有有效量的一种或多种固体或颗粒形式的治疗试剂的胶囊剂、扁囊剂或片剂；通过将有效量的活性成分悬浮在合适的分散剂中而制备的悬浮液；通过将有效量的有效成分的溶液分散和乳化在合适的分散剂中而制备的乳液等。
作为适用于胃肠外施用的制剂(例如静脉施用、皮下施用、肌内施用、局部施用、腹膜内施用、鼻内施用和肺部施用等)，含水和非水等渗无菌可注射液体是可用的，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和等渗剂等。也可以提及含水和非水无菌悬浮液，其可含有悬浮剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。所述制剂可以在诸如安瓿或小瓶的容器中包含单位剂量体积或若干分开的剂量。活性成分和药学上可接受的载体也可以冷冻干燥并储存为在刚使用之前可溶解或悬浮在合适无菌载体中的状态。除了液体注射外，吸入剂和软膏也是可接受的。在吸入剂的情况下，冻干状态中的活性成分被微粉化并通过适当的吸入装置吸入施用。吸入剂可根据常规使用的表面活性剂配制吸入剂、油、调味剂、环糊精或其衍生物等所需物。在一些实施方式中，PP2A激活剂和/或蛋白质激酶抑制剂可并入缓释制剂和装置中。
向受试者施用的PP2A激活剂和/或蛋白质激酶抑制剂的剂量可以根据活性成分的种类和活性、疾病的严重性、施用受试者的动物物种、施用受试者的药物耐受性、体重、年龄等变化，以及通常的剂量，对于成年人活性成分的日用量可以为约0.0001至约100mg/kg，例如约0.0001至约10mg/kg，优选约0.005至约1mg/kg。在某些实施方式中，剂量可为约10mg/kg。每日剂量可以例如以典型的每天1-4次单独施用的方式施用。其它优选的施用方法包括约0.01mg至约100mg/kg体重的关节内施用。达到有效量的各种考虑已被描述于例如Goodman和Gilman's：The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th ed.,PergamonPress,1990；and Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,1990。
在另一实施方式中，考虑了结合额外治疗的方法实践。另外的治疗可以包括针对实体瘤的常规化疗、放射治疗或手术，以及用于控制转移的建立。例如，在化疗、放疗或手术过程之前、之中或之后，可以进行施用治疗有效量的PP2A激活剂和本文所述的蛋白质激酶抑制剂联合。
短语“联合治疗”包括将施用PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂的联合和/或另外的治疗作为特定治疗方式的一部分，所述特定治疗方式旨在提供来自这些治疗试剂的协同作用的有益效果。这些治疗试剂在联合中的施用通常在限定的时间段(通常为几分钟、小时、天或周取决于所选择的组合)中进行。“联合治疗”旨在包括这些治疗试剂以顺序方式施用，即其中每一种治疗试剂在不同的时间施用，以及这些治疗试剂或至少两种治疗试剂(即PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂)的施用是基本上同时的方式。通过向所述受试者施用包含PP2A激活剂和具有固定比例的每种治疗剂的激酶抑制剂的共同制剂的单个胶囊，或者用于每种治疗剂的多个单胶囊，可以实现基本上同时施用。每个治疗试剂的顺序或基本上同时施用可通过任何合适的路线实现。每种治疗试剂的顺序或基本同时施用可以通过任何适当的途径实现，包括但不限于口服途径、静脉途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织直接吸收途径。所述治疗试剂可以通过相同的途径或通过不同的途径施用。例如，所选联合的第一治疗试剂可以通过静脉注射，而联合中的其它治疗试剂可以通过口服施用。替代地，例如所有治疗试剂可以口服施用，或所有治疗试剂均可通过静脉注射施用。所述治疗试剂施用的顺序并不特别关键。“联合治疗”还可以包括上述治疗试剂与其它生物活性成分联合施用(例如但不限于第三不同的治疗试剂)以及非药物治疗(例如但不限于手术或放射治疗)。其中联合治疗还包括放射治疗，所述放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要实现治疗试剂与放射治疗联合协同作用的有益效果。例如，在合适的情况下，当放射治疗暂时从治疗试剂施用中移除，有益效果仍然可以实现，可能是几天或甚至几周。
因此，本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括向受试者施用有效量的PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂或其药学上可接受的盐形式，其中向患者施用治疗有效量的一种或多种额外癌症化疗试剂。在一些实施方式中，施用PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂或其药学上可接受的盐形式，可以恢复患者对一种或多种化疗药物的敏感性，其中患者已经发展了对一种或多种化疗剂的耐受性。
为了实现额外癌症化学治疗试剂疗法，大量商用抗肿瘤试剂在临床评价和临床前进展中是可用的，其可被选择通过药物化学联合治疗用于治疗癌症或其它特点为细胞快速增值的病症。该类抗肿瘤试剂分为几种主要种类，即抗生素类试剂、烷基化试剂、抗代谢试剂、激素试剂、免疫试剂、干扰素类试剂和杂类试剂。本领域技术人员将认识到可用于联合治疗的合适的试剂。
示例性化疗试剂可包括烷基化型抗增殖试剂。所述烷基化试剂被认为通过烷基化和交联鸟嘌呤以及可能的DNA中的其它碱基起作用，从而阻止细胞分裂。典型的烷基化试剂包括氮突变体、亚乙基亚胺化合物、烷基硫酸盐、顺铂和各种硝基肟。这些化合物的缺点在于它们不仅攻击恶性细胞，而且还攻击具有自然分裂的其它细胞，例如骨髓、皮肤、胃肠道粘膜和胎儿组织。可用于本发明的烷基化型抗增殖试剂的实例包括但不限于：Shionogi254-S、aldo-磷酰胺类似物、六甲蜜胺、阿那昔酮、Boehringer Mannheim BBR-2207、bestabuulail、布多替钛(budozane)、Wakunaga CA-102、卡铂、卡莫司汀(carmustine(BiCNU))、Chinoin-139、Chinoin-153，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺、American Cyanamid CL-286558、Sanofi CY-233、cyplatates、氮烯唑胺(dacarbazine)、Degussa D-19-3384、Sumimoto DACHP(Myr)2、二苯基螺旋霉素(diphenylspiromustine)、二铂烯细胞增长抑制(diplatinum cytostatic)、Erba偏端霉素衍生物、Chugai DWA-2114R、ITI E09、依莫司汀(elmustine)、Erbamont FCE-24517、雌莫司汀磷酸酯钠(estramustine phosphate sodium)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、福莫司汀(fotemustine)、Unimed G-6-M，Chinoin GYKI-17230、hepsul-fam，异环磷酰胺(ifosfamide)、异丙铂、洛莫司汀(lomustine)、马磷酰胺(mafosfamide)、二溴卫矛醇(mitolactol)、霉酚酸酯(mycophenolate)、Nippon Kayaku NK-121、NCI NSC-264395、NCINSC-342215、奥沙利铂，Upjohn PCNU、松龙苯芥(prednimustine)、Proter PTT-119、雷莫司汀、司莫司汀(semustine)、SmithKline SK&F-101772、噻替派、Yakult Honsha SN-22、spiromus-tine、Tanabe Seiyaku TA-077、牛碘莫司汀(tauromustine)、替莫唑胺(temozolomide)、替罗昔隆(teroxirone)、四铂和三美拉诺(trimelamol)。
在一些实施方式中，本领域技术人员已知的用于放射治疗的放射保护剂可以与PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂联合施用，用于治疗受试者的癌症。放射疗法可以包括电离辐射，特别是由通常使用的线性加速器或放射性核素照射的伽马辐射。通过放射性核素的放射疗法可以在外部或内部实现。放射疗法可包括短距离放射治疗、放射核素治疗、外束照射治疗、热疗(冷冻消融热疗)、放射外科学、带电粒子放射疗法、中子放射治疗和光动力治疗等。
放射治疗可以通过使用直线加速器以X射线或电子束照射受影响的部位来实现。虽然X射线条件将根据与肿瘤距离以及其尺寸等而不同，正常剂量为1.5-3Gy，优选约2Gy，每周2-5次，优选每周4或5倍，持续1-5周，总剂量为20-70Gy，优选40-70Gy，更优选50-60Gy。虽然电子束条件也将依赖于肿瘤有多远以及其尺寸等而不同，正常剂量为2-5Gy，优选4Gy，每周1-5次，优选每周2或3次，持续1-5周，总剂量为30-70Gy，优选40-60Gy。
根据临床情况和期望的结果，本文所述的治疗也可与诸如激素治疗、质子治疗、冷冻手术以及高强度聚焦超声(HIFU)等结合治疗。
本发明通过以下实施例说明。应当理解的是，具体实施例、材料、用量和过程应当根据本发明所述的范围和精神进行广泛的解释。
实施例
实施例1
蛋白质磷酸酶2A(PP2A)是一种异三聚丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其缺失功能介导癌症的发展和进步。PP2A通过多个与多种恶性肿瘤有关致癌性蛋白质的去磷酸化来发挥其肿瘤抑制特性(图1)，包括白血病、前列腺癌和非小细胞肺癌。然而，其磷酸酶活性在多种癌症中通过突变经常被抑制，降低其亚基的表达，以及内源PP2A抑制剂的上调。虽然在由诸如SET蛋白的抑制剂介导的PP2A失活之后的机理没有被很好地描述，但许多致癌性激酶如SRC，已经显示通过在酪氨酸307(Y307)的催化亚基的磷酸化来抑制PP2A杂三聚体形成。Y307是复合物的C-末端尾部的主要抑制磷酸化位点，这一位点的组成性磷酸化突变体已被证明能显著抑制与PP2A A-C二聚体的B亚基结合，并因此显著抑制底物去磷酸化。
相反地，磷酸化缺乏突变体显示出增加的异构体形成和磷酸酶活化，这表明在该酪氨酸位点减少的磷酸化可以是激活PP2A的潜在目标，并增强其肿瘤抑制性。结合起来，这些发现表明使用药理学方法通过降低Y307的磷酸化抑制确定了最大限度地激活PP2A的新途径，可作为一种诱导癌细胞的凋亡的新机制，在所述癌细胞中PP2A是非活性。
我们开发了第一系列能够防止PP2A催化亚基上的主要抑制位点的去磷酸化的PP2A激活剂的第一类药学上可示性系列。在该实施例中，我们首次描述了用FDA批准的SRC抑制剂采用新型药学联合治疗最大程度化Y307残基的去磷酸化以使得PP2A可以被逐渐激活，导致生物协同作用。
我们相信，该方法对治疗其中PP2A失活的癌症具有广泛的意义，并且能够驱动我们有前景的一系列小分子激活剂以增加临床中的活性。
我们还开发了一系列新的三环安定药衍生物，其保留了母体药物的抗增殖性，但缺乏不利的中枢神经系统药理学。本发明提供了TRC系列(下列化合物1和化合物2)的这些再工程三环化合物作为抗癌试剂以细胞系和异种移植物模型进行了研究，与它们的母体化合物相似，它们通过PP2A的活化产生了它们的生物学作用。因此，我们将我们的新试剂称作PP2A的小分子激活剂(SMAPs)。这些SMAPs已经在多个体内模型中表现出作为单一疗法的前景，而是利用基于众所周知的分子机制调节PP2A的联合，拓宽了临床适用性，潜在地提高了该系列的抗癌活性。在这些研究中确定的新联合，我们相信我们已经证实了新的药理学方法来最大限度地激活PP2A，并增强其在各种癌症模型中的抗癌作用。
化合物1诱导PP2A A-C二聚体中的显著构象变化，并保护Y307免受磷酸化抑制
为了阐明由SMAPs诱导的PP2A中的构象变化，我们使用辐射质谱足迹进行结构质谱，这是一种探测诸如PP2A等复合物的结构变化的新方法。在这些实验中，通过X射线束生成羟基自由基并氧化修饰溶剂暴露的氨基酸侧链。对溶剂不可溶解的蛋白质区域是没有修饰的，并且可以被认为是受保护的区域。与单独的PP2A A-C二聚体相比，化合物1的加入导致A和C亚基中溶剂暴露的显著变化，表明了构象的变化(图2)。值得注意的是，在化合物1处理的存在下，与对照组相比(表1)，催化亚基的C-末端尾部显示可溶性减小12倍。蛋白质的C-末端尾部含有Y307，在PP2A上的主要抑制磷酸化位点，其在磷酸化时防止杂三聚形成，表明化合物1保护该位点免受磷酸化抑制作用以酶促激活该磷酸酶。
表1
表1：化合物1处理的肽序列在催化亚基上具有＞4倍的保护因子。突出显示的肽表示C-末端尾部，其在基线处具有较高的溶剂暴露，但是当化合物1加入二聚体时暴露减少12倍，表明SMAP处理作为潜在的方法介导磷酸酶活化从而保护了该C亚基区域。
化合物1介导的Y307去磷酸化不先与目标结合和体外活性
为了评估Y307去磷酸化在SMAP介导磷酸酶活化情况下的动力学，在c-Myc驱动的T-ALL细胞系MOLT 4中在不同时间点使用增加剂量的化合物1进行了时间过程研究。PP2A通过在作为蛋白酶体介导的降解的引发事件的丝氨酸62上的去磷酸化已建立为去磷酸化c-Myc原癌基因，并且在实验室的先前工作已经验证了化合物1介导c-Myc蛋白水解在体外c-Myc驱动的疾病模型。
然而，蛋白印迹分析表明c-Myc基因的去磷酸化和随后的降解以及通过该细胞系的裂解表明的生物影响先于Y307去磷酸化(图3)。这些结果表明，该酪氨酸位点的调节对于由化合物1诱导的PP2A的初始激活不是必需的，并且维持磷酸酶活性和底物去磷酸化可能需要更长的时间点。
当与SRC激酶抑制剂结合时，化合物1显示增加的生物学活性和目标接合
基于许多现有报告，以Y307去磷酸化为新机理活化PP2A，并且数据表明Y307去磷酸化在体外不先于PP2A活化，我们假定用联合方法最大限度地在酪氨酸位点去磷酸化可以增强化合物1诱导的细胞凋亡。因为原癌基因SRC已经被确定为作为一种途径抑制PP2A使该部位磷酸化，我们结合了达沙替尼和化合物1，达沙替尼是目前FDA批准的用于治疗格列卫耐药性CML(treat Gleevec-resistant CML)的SRC激酶抑制剂。这些联合方法显著增强了SMAP诱导的MOLT4T-ALL和A549NSCLC细胞中的凋亡，使化合物1的亚治疗剂量具有治疗活性并增加已有有效剂量的活性(图4A、B)。特别地，当与SMAPs联合时，达沙替尼添加诱导了Y307去磷酸化的显著降低，导致这些细胞系的分子驱动器的磷酸酶活化和去磷酸化提高(图4C、D)。另外，两种药物剂量-增加平行降低了化合物2的GI50浓度近2倍(图4E)。结合来看，这些结果表明达沙替尼与SMAPs联合可以协同去磷酸化Y307，更有针对性地激活PP2A，从而在癌症的多个体外模型中诱导增加的生物学活性。
实施例2
方法
磷酸化蛋白质组样品的制备
使用补充有10％FBS和0.5％青霉素/链霉素的RPMI培养基在37℃和5％CO2下培养H358细胞(ATCC)。每种条件下，用合适的试剂处理2000万细胞，并在规定的时间点采集。所用的剂量如下：17.5μM DT-061、1μM AZD6244和0.25μM MK 2206。然后将细胞颗粒在-80℃短期储存。为了提取蛋白质，在蛋白酶和磷酸酶抑制剂的存在下，在冰上2％SDS缓冲液中对细胞进行脉冲处理。半胱氨酸氨基酸残基接着被还原和烷基化。然后每个样品在37℃下用Lys-C和胰蛋白酶过夜消化800μg蛋白质。然后使用二氧化钛柱进行磷酸肽的富集。
磷酸化蛋白质组学数据处理
使用装配有nanoAcquityTM超高压液相色谱系统(Waters，MA)的LTQ-OrbitrapVelos质谱仪(Thermo Scientific，CA)LC-MS/MS分析富含磷的肽。使用核心的标准程序进行肽的分离和检测。LC-MS/MS的原始数据通过使用x-calibur(Thermo Scientific，2.2SP1)获取。将LC-MS/MS的原始文件Rosetta ElucidatorTM和Mascot程序分析导入和分析以对肽进行测序和确认母体蛋白。
激酶底物富集分析(KSEA)
使用R编程语言生成数据和热图。KSEA方法(Casado等,Sci Signal.,2013)通过评估其所识别的底物的共同磷酸化状态来推断激酶的相对活性输出。激酶-底物关系通过PhosphoSitePlus数据库中确定。对于每个激酶，针对任何激酶的已记录的磷位点底物检索磷酸化蛋白质组学数据。对于每个被确认的命中结果的折叠变化(FC)，通过用处理后中位数肽强度计算，以在DMSO中的中位数肽强度进行划分。计算每激酶的富集分数，然后将所有记录的FCs求平均，并除以数据集中所有磷位点的平均logFC的绝对值。因此，正(负)值表示在治疗时具有增加的(减小的)输出的激酶。然后将该得分通过归一化转换为加权z分数。由此，该分数的统计富集通过确定具有比实际z分数更极端分数的概率来评估。将所有结果编译成热图以便于可视化。对于降低的活性输出或增加的活性输出，每个激酶得分是颜色编码的。
异种移植物研究(Xenograft studies)
将500万H441细胞和1000万H358细胞注入雄性BALB/c nu/nu小鼠的右侧腹(6-8周龄)。通过卡尺测量对肿瘤体积进行评估。肿瘤一旦达到约200mm3，将小鼠随机分成治疗组，并开始研究。每种条件的剂量如下：5mg/kg PP2A激活剂DT-061(BID)、25mg/kg AZD6244(BID)、25mg/kg的达沙替尼(QD)、24mg/kg AZD6244和6mg/kg MK 2206(BID)的联合、5mgkgDT-061和25mg/kg AZD6244(BID)的联合、5mg/kg DT-061(BID)和25mg/kg达沙替尼(QD)的联合。每隔一天测定小鼠肿瘤体积，每周记录体重。在研究结束时，处死小鼠。采集血液、肝脏和肿瘤样品，并进行药效学和药物动力学分析。
结果
图5示出了促进由PP2A活化诱导的时间信号演变以设计合理的抗癌药物联合的磷酸蛋白质组学和生物信息学工作流的概述。每个激酶的输出来自其所确认的底物的共同磷酸化状态。
图7示出了时间过程磷蛋白组学的KSEA热图结果，仅示出了与图6中的典型MAPK途径相关的激酶。基于在其已知底物的磷酸化状态下共同折叠变化改变，KSEA推断激酶活性输出。蓝色(红色)颜色表示在同一时间点处在给定条件下相对于DMSO激酶具有降低的(增加的)活性输出。注意：EGFR和MEK2检测到＜4个底物。RAS没有记录的磷酸化底物并涂成灰色。星号标记的激酶分数满足p＜0.05标准，调整为多个假设测试。用具有DT-061的ERK输出的有限抑制表明使用MEK抑制剂的联合治疗可以增强抗肿瘤作用。
图8示出了NCR裸鼠中H358异种移植物的瀑布图，显示了在不同的治疗中在研究开始和结束之间的肿瘤体积(mm3)差异。每条表示单独的肿瘤。用AZD6244加DT-061的治疗对垂直路径抑制联合进行建模。
图9示出了时间过程磷酸蛋白质组学的KSEA热图结果，仅示出了SRC的输出，SRC是一种与典型MAPK途径分开操作的激酶。注释与图7相同。使用DT-061的SRC输出的最小变化表明，使用SRC抑制剂的联合治疗可以增强抗肿瘤作用。
图10示出了不同治疗的H358异种移植物肿瘤体积差异的瀑布图。绘图参数与图8中使用的相同。达沙替尼、SRC抑制剂、加DT-061的治疗对水平途径抑制联合进行建模。
图11示出了不同治疗H441异种移植物肿瘤体积差异的瀑布图。AZD6244加DT-061的治疗对垂直途径抑制联合进行建模。
图12示出了不同治疗H441异种移植物肿瘤体积差异的瀑布图。AZD6244加DT-061的治疗对垂直途径抑制联合进行建模。绘图参数与图8中使用的相同。达沙替尼、SRC抑制剂、加DT-061的治疗对水平途径抑制联合进行建模。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可用的材料的全部公开内容通过引用并入。以上详细描述和实施例仅出于清楚理解的目的给出。由此不能理解为不必要的限制。本发明不限于所示和所述的具体细节，对于本领域技术人员来说显而易见的变化将包括在由权利要求限定的本发明中。

Claims (24)

1.一种对需要治疗的受试者治疗癌症的方法，其包括：
向所述受试者施用治疗有效量的PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，向所述受试者施用含有PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂的共制剂的药物组合物。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述共制剂含有固定比例的PP2A激活剂和蛋白质激酶抑制剂。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症的特征在于PP2A在癌细胞中具有降低的活性。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症选自由白血病、前列腺癌、子宫内膜癌和非小细胞肺癌组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述PP2A激活剂为小分子。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述PP2A激活剂为三环安定药化合物或其衍生物。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述PP2A激活剂为缺乏GPCR或单胺转运体药理学的三环安定药化合物。
9.如权利要求1所述的方法，其中，当以不存在PP2A激活剂施用时，所述蛋白质激酶抑制剂的量是亚治疗性的。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂选自MEK-1抑制剂、EGFR抑制剂、Her-2激酶抑制剂、Src抑制剂、IKK抑制剂、Jak2抑制剂、Aurora激酶抑制剂、CHK1抑制剂和GSK-3抑制剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂选自由曲美替尼、司美替尼和考比替尼组成的组。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为EGFR抑制剂，选自由厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼和埃克替尼组成的组。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为Src抑制剂，选自由塞卡替尼、达沙替尼和博舒替尼组成的组。
14.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为IKK抑制剂，选自由N-(6-氯-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-8-基)烟酰胺；N1-(1,8-二甲基咪唑偶氮[1,2-a]喹喔啉-4-基)乙烷-1,2-二胺；1-((5-甲氧基-2-(噻吩-2-基)喹唑啉-4-基)氨基)-3-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮；N-(6-氯-7-甲氧基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-8-基)-2-甲基烟酰胺；4-氨基-[2,3'-联噻吩]-5-甲酰胺；(E)-1-(6-(4-氯苯氧基)己基)-2-氰基-3-(吡啶-4-基)胍；和(Z)-3-(2,4-二甲基-5-((2-氧代吲哚啉-3-甲叉基)甲基)-1H-吡咯-3-基)丙酸组成的组。
15.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为Jak2抑制剂，选自鲁索替尼、巴瑞克替尼、CYT387、来他替尼、帕克替尼和TG101348。
16.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为Aurora激酶抑制剂，选自由ZM 447439、VX-680(MK-0457)、橙皮素(Hesperadin)、PHA-680632、PHA-739358、化合物677、JNJ-7706621、MLN8054.、MLN8237、AZD1152、AS703569、PF-03814735和SNS-314组成的组。
17.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为CHK1抑制剂，选自由(S)-5-(3-氟苯基)-N-(哌啶-3-基)-3-脲基噻吩-2-甲酰胺；(S)-1-(5-溴-4-甲基-2-(吗啉-2-基甲氧基)苯基)-3-(5-甲基吡嗪-2-基)脲(Rabusertib)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑啉-4-基)-5-(哌啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺；(S)-3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氯-4-(奎宁环-3-基氨基)喹啉-2(1H)-酮；和(R)-2-氨基-2-环己基-N-(5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-氧代-2,6-二氢-1H-[1,2]二氮杂卓[4,5,6-cd]吲哚-8-基)乙酰胺组成的组。
18.如权利要求10所述的方法，其中，所述蛋白质激酶抑制剂为GSK-3抑制剂，选自由3-((3-氯-4-羟基苯基)氨基)-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮；3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈；N2-(2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)-5-硝基吡啶-2,6-二胺；1-(喹啉-4-基)-3-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)脲；4-苄基-2-(萘-1-基)-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮；和3-(9-氟-2-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂卓[6,7,1-H]吲哚-7-基)-4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮组成的组。
19.如权利要求1所述的方法，其中，PP2A激活剂包括化学式(I)的化合物：
其中：
B选自：-S-、-(CH2-CH2)-、以及-CH＝CH-；
A选自N和CH；
N为0、1或2；
X1选自-H、-F、-Cl、-CF3和-CN；
X2选自-H、-F、-Cl、-CF3和-CN；以及
Y表示各自独立选自-H、-F、-Cl、-(C1-C3)卤代烷基、-(C1-C3)卤代烷氧基、-(C1-C3)烷氧基、-C(＝O)(C1-C3)烷基、-C(＝O)H、-(C1-C3)羟烷基、-(C1-C3)卤代烷硫基、-N3和-CN中的一个或两个取代基。
20.如权利要求17所述的方法，其中，所述PP2A激活剂可以选自由以下组成的组：
21.如权利要求1所述的方法，其中，所述PP2A激活剂包括化学式(IV)的化合物：
其中：
B选自由以下组成的组：直接的键、-O-、-(CH2-O)-、-(O-CH2)-、-C(＝O)N(CH3)-和-N(CH3)C(＝O)-；
A选自N和CH；
T为苯环或者五元或六元杂芳环；
U为苯环或者五元或六元杂芳环；
N为0、1或2；
R1，R2，R3和R4独立地选自H、OH、卤素、氰基、硝基、(C1-C3)烷基氨基、(C1-C3)二烷基氨基、(C1-C3)酰氨基、(C1-C3)烷基磺酰基、(C1-C3)烷硫基、(C1-C3)烷基、(C1-C3)卤代烷基、(C1-C3)卤代烷氧基，-CC(＝O)O(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基；
R5和R6独立地选自H、卤素、氰基、硝基、叠氮基、(C1-C3)卤代烷基、(C1-C3)卤代烷氧基和(C1-C3)卤代烷硫基。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述PP2A激活选自由以下组成的组：
23.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者为人。
24.一种对需要治疗的受试者治疗癌症的方法，其包括：
向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括PP2A激活剂、蛋白质激酶抑制剂及其药学上可接受的载体的共制剂。
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