ES2699653T3 - Detección y medición de linfocitos infiltrados en los tejidos - Google Patents

Abstract

Un método para la identificación de linfocitos que se han infiltrado en un tejido sólido, que comprende: la clasificación de una muestra de linfocitos de un tejido accesible de un individuo en al menos dos subconjuntos, en el que dicho tejido accesible es sangre periférica, médula ósea, fluido linfático, líquido sinovial, o líquido cefalorraquídeo de dicho individuo; la generación de un perfil de clonotipo para cada subconjunto de linfocitos del tejido accesible, en el que cada perfil de clonotipo se genera amplificando ácidos nucleicos recombinados de los linfocitos y secuenciando los ácidos nucleicos aislados de los amplicones resultantes, y en el que cada perfil de clonotipo proporciona una lista de secuencias de clonotipo; la generación de un perfil de clonotipo a partir de una muestra de tejido sólido, en el que el perfil de clonotipo se genera amplificando ácidos nucleicos recombinados de los linfocitos de la muestra de tejido sólido y secuenciando los ácidos nucleicos aislados de los amplicones resultantes, y en el que el perfil de clonotipo proporciona una lista de secuencias de clonotipo; la detección de linfocitos de cada subconjunto que se han infiltrado en el tejido sólido identificando una secuencia de clonotipo de un perfil de clonotipo a partir del tejido sólido que está presente en un perfil de clonotipo de un subconjunto de linfocitos del tejido accesible.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección y medición de linfocitos infiltrados en los tejidos

Antecedentes de la invención

El número y relación de los diferentes subconjuntos de linfocitos infiltrados en un tejido afectado por una enfermedad, tal como un tumor sólido, a menudo es relevante en el pronóstico de la enfermedad, por ejemplo, Deschoolmeester et al, BMC Immunology, 11:19 (2010); Ohtani, Cancer Immunity, 7: 4 (2007); Yu et al, Laboratory Investigation, 86: 231-245 (2006); Diederichsen et al, Cancer Immunol. Immunother., 52: 423-428 (2003); y similares. Lamentablemente, la medición de dichas cantidades utilizando las tecnologías disponibles tales como inmunohistoquímica o citometría de flujo, es difícil, laboriosa, y no disponible para su desarrollo rutinario.

Ahmadzadeh et al., 2008 (Blood, 112(13), 4953-4960) desvela la medición de la expresión de FOXP3 como marcador de células Treg. Utilizando citometría de flujo y análisis inmunohistoquímicos. Concluyeron que la población de células Treg CD4 que infiltra un tumor está representada con precisión por la expresión de FOXP3. Esendagli et al., 2008 (Lung Cancer, 59, 32-40) desvela la medición de la expresión de CD4 y CD25 utilizando citometría de flujo para detectar células T que infiltran un tumor. Elkord et al., 2010 (Expert Opin. Biol. Ther. 10(11),1573-1586) desvela la medición de la expresión de CD4, CD8, CD25 y FoxP3 para la identificación de células T reguladoras que infiltran un tumor. Sfanos et al., 2009 (The Prostate 69, 1694-1703) desvela métodos para la evaluación de la clonabilidad relativa de las células T CD8+ que infiltran la próstata por tipaje de espectros Vp específicos familiares y citometría de flujo, y métodos para confirmar los resultados obtenidos por estos métodos utilizando análisis de secuencia directa de las secuencias de TCR Vp CDR3 implicadas en el reconocimiento del antígeno. Ferradini et al., 1993 (J. Clin. Invest. 91, 1183-1190) desvela la caracterización de la estructura molecular de la cadena p del receptor de célula T expresada por los linfocitos que infiltran un tumor en un caso de melanoma regresivo. La caracterización se llevó a cabo por análisis PCR utilizando los cebadores específicos de la subfamilia Vp para evaluar el uso de Vp. Por otra parte, ha habido cada vez más interés en el uso de secuenciación de ADN a gran escala en aplicaciones diagnósticas y pronósticas ya que el coste de secuenciación de ADN por base ha caído. Por ejemplo, los perfiles de ácidos nucleicos que codifican moléculas inmunitarias tales como receptores de células T o células B, o sus componentes, contienen una información enrome sobre el estado de salud o enfermedad de un organismo, de manera que se ha propuesto el uso de dichos perfiles como indicadores diagnósticos o pronósticos para una amplia variedad de afecciones, por ejemplo, Faham y Willis, publicación de patente de EE. UU. 2010/0151471 y publicación de patente de EE. UU. 2011/207134; Freeman et al, Genome Research, 19: 1817-1824 (2009); Boyd et al, Sci. Transl. Med., 1(12): 12ra23 (2009); He et al, Oncotarget (March 8, 2011).

Sería muy útil para los campos médico y científico si las mejoras en la secuenciación de ácidos nucleicos de altas prestaciones pudieran poner en funcionamiento un ensayo más conveniente y más eficaz para la medición de linfocitos que infiltran tejidos (TIL).

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para identificar linfocitos que han infiltrado un tejido sólido que comprende: Clarificar una muestra de linfocitos a partir de un tejido accesible de un individuo al menos en dos subconjuntos en el que dicho tejido accesibles es sangre periférica, médula ósea, fluido linfático, líquido sinovial, o fluido de la médula espinal de dicho individuo; generar un perfil de clonotipo para cada subconjunto de linfocitos del tejido accesible, en el que cada perfil de clonotipo se genera amplificando ácidos nucleicos recombinantes de los linfocitos y secuenciando los ácidos nucleicos asilados de los amplicones resultantes, y en el que cada perfil de clonotipo proporciona una lista de secuencias de clonotipo; generar un perfil de clonotipo de una muestra del tejido sólido, en el que el perfil de clonotipo se genera amplificando ácidos nucleicos recombinados de linfocitos de la muestra de tejido sólido y secuenciar los ácidos nucleicos aislados de los amplicones resultantes, y en el que el perfil de clonotipo proporciona una lista de secuencias de clonotipos; y

Detectar los linfocitos de cada subconjunto que han infiltrado el tejido sólido, identificando una secuencia de clonotipo del perfil de clonotipo del tejido sólido que está presente en un perfil de clonotipo de un subconjunto de linfocitos del tejido accesible.

La presente divulgación se refiere a métodos para medir, el número, niveles, y/o relaciones de células, tales como los linfocitos, infiltrados en un tejido sólido, tao como un tumor, y para emitir un pronóstico de un paciente basándose en dichas mediciones. La divulgación se ejemplifica con varias implementaciones y aplicaciones, algunas de las cuales se resumen posteriormente y a lo largo de la memoria descriptiva.

En un caso, se describen en el presente documento métodos para identificar los linfocitos que han infiltrado un tejido sólido que comprende las siguientes etapas : (a) clasificar en uno o más subconjuntos una muestra de linfocitos de un tejido accesible de un individuo; (b) generar los perfiles de clonotipo de cada uno o m as subconjuntos de linfocitos del tejido accesible; (c) generar al menos un perfil de clonotipo de al menos una muestra del tejido sólido; y (d) detectar linfocitos de cada subconjunto del tejido sólido con sus clonotipos respectivos.

En otra realización, se describen en el presente documento métodos para la determinación de un pronóstico a partir de un estado de infiltración linfocitaria en un tumor sólido de un paciente, en el que dicho método comprende las etapas de (a) clasificar en uno o más subconjuntos una muestra de linfocitos de sangre periférica del paciente; (b) generar perfiles de clonotipo de cada uno de los uno o más subconjuntos del linfocitos de la sangre periférica; (c) generar al menos un perfil de clonotipo de al menos una muestra del tumor sólido; y (d) determinar el número, niveles, y/o relaciones de linfocitos de cada uno de los uno o más subconjuntos. En un caso, el estado de la infiltración linfocitaria en un tumor sólido significa el número, niveles y/o relaciones de linfocitos de un subconjunto funcional seleccionado en un tumor sólido. En algunos casos, el estado de la infiltración linfocitaria en un tumor sólido también puede incluir una distribución espacial de dichos valores en o adyacentes al tumor sólido.

Breve descripción de los dibujos

Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtiene un mejor entendimiento de las características de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada que expone las realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y lo dibujos adjuntos en los cuales:

La FIG. 1 ilustra en forma de diagrama las etapas de una realización de la invención

Las FIG. 2A-2C muestran un esquema de la PCR en dos etapas para la amplificación de los genes de TCRp. La FIG. 3A ilustra detalles de la determinación de la secuencia de nucleótidos del producto de la PCR de la Fig. 2C. La FIG. 3B ilustra detalles de otra realización de determinación de una secuencia de nucleótidos del producto de PCR de la Fig. 2C.

La FIG. 4A ilustra un esquema de la PCR para generar tres matrices de secuenciación de una cadena IgH en una única reacción. Las FIG. 4B-4C ilustran un esquema de una PCR para la generación de tres matrices de secuenciación de una cadena IgH en tres reacciones separadas después de las cuales los amplicones resultantes se combinan en una PCR secundaria para añadir los sitios de unión de cebador P5 y P7. La FIG. 4D ilustra las localizaciones de las lecturas de secuencia generadas por una cadena IgH. La FIG. 4E ilustra el uso de la estructura del codón de las regiones V y J para mejorar la identificación de bases en la región NDN.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención puede emplear, a menos de que se indique otra cosa, técnicas y descripciones convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), bioinformática, biología celular, y bioquímica, que están en la experiencia de la técnica. Dichas técnicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, muestreo y análisis de células sanguíneas, secuenciación y análisis de ácido nucleico, y similares. Las ilustraciones específicas de técnicas adecuadas pueden tenerse en referencia al ejemplo posteriormente en el presente documento. Sin embargo, se pueden utilizar, por supuesto, otros procedimientos convencionales equivalentes. Dichas técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales de laboratorio convencionales tales como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); PCR Primer: A Laboratory Manual; y Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press); y similares.

En un aspecto, la invención se utiliza para determinar los tipos y números de linfocitos infiltrados en un tejido sólido, tal como un tumor, un tejido afectado por una enfermedad inmunitaria, un tejido afectado por una enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), un tejido normal, o similar, Aunque los tejidos sólidos de interés son normalmente tejidos solidos afectados por una enfermedad, en algunas realizaciones, también se pueden utilizar niveles y/o número y/o relaciones de diferentes subconjuntos de linfocitos en tejidos normales para determinar estados de salud y/o de propensión de un individuo a contraer una enfermedad o afección.

Un esquema de una realización de la invención se muestra en la Fig. 1. Se determinan los clonotipos de linfocitos de un individuo a partir de un tejido fácilmente accesible (100), tal como sangre periférica. Opcionalmente, se pueden implementar etapas de mínima preparación (102) de la muestra, tal como el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). A partir de dicha muestra, se clasifican los linfocitos (104) en subconjuntos, L1, L2, ... LK (106) que habitualmente se corresponden con linfocitos con funciones biológicas distintas; a veces se hace referencia a dichos subconjuntos en el presente documento como “subconjuntos funcionales” o linfocitos. Habitualmente, la clasificación se basa en la presencia o ausencia de uno o más marcadores moleculares característicos de dichos subconjuntos funcionalmente distintos. Dichos marcadores pueden ser marcadores de superficie celular o marcadores intracelulares. En una realización, dichos marcadores son marcadores de superficie celular. Los marcadores de superficie celular ejemplares incluyen, pero no se limitan a, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD45RO, CD117, CD127, y similares.

Los subconjuntos de linfocitos de interés incluyen, pero no se limitan a, células B; células T, células T citotóxicas; células T auxiliares; células T reguladoras, células T auxiliares Th1; células T auxiliares Th2, células T auxiliares Th9, células T auxiliares Th17; células T auxiliares Tfh; células T específicas de antígeno; y células B específicas de antígeno. Cuando un tejido sólido es un tumor sólido, son de particular interés los subconjuntos de células T citotóxicas y las células T reguladoras.

Algunos subconjuntos pueden incluir miembros de otros subconjuntos, incluso debido a un solapamiento, por ejemplo, debido a una técnica de clasificación ineficaz, o debido a miembros de un segundo subconjunto que puede estar contenido completamente en (o anidado en) un primer subconjunto más grande; por ejemplo, el subconjunto de células T incluye las células T citotóxicas y las células T auxiliares como dos subconjuntos contenidos completamente. De la misma manera, los subconjuntos de células T auxiliares incluye varios subconjuntos diferentes contenidos completamente, como se ha señalado. Normalmente, las células de subconjuntos anidados (es decir, subconjuntos de subconjuntos) se obtienen utilizando marcadores adicionales características de dichos subconjuntos. Los subconjuntos de linfocitos habitualmente se identifican funcionalmente y/o por marcadores moleculares utilizando ensayos convencionales, a menudo con kits y marcadores disponibles en el mercado (por ejemplo, BD Biosciences, San Jose, CA). Los marcadores característicos de varios linfocitos de interés son los siguientes: CD4 para células T auxiliares; CD8 para células T citotóxicas; CD4, CD25 y baja expresión de CD127 para las células T reguladoras (o alternativamente, CD4, CD25 y expresión intracelular de FoxP3 para células T reguladoras); y CD45RO+, CCR7-, CD28-, CD27-, CD8+ para las células T efectoras de memoria; y similares (donde los símbolos “+” y “-“ se utilizan como es convencional en la bibliografía sobre inmunología; es decir para indicar la alta expresión y la expresión baja (o ausente), respectivamente). Las sondas de anticuerpo están disponibles en el mercado para aislar dichos subconjuntos por técnicas de clasificación, por ejemplo, FACS, que se describen posteriormente. Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, la presencia, ausencia y/o niveles de linfocitos de dichos subconjuntos proporcionan la información pronóstica, tal como la duración de supervivencia de un paciente sometido a terapia de cáncer. La siguiente Tabla resumen los marcadores de superficie e intracelulares para la identificación de subconjuntos de linfocitos de acuerdo con la invención. Las diferentes realizaciones de la invención incluyen la identificación de clonotipos de diferentes combinaciones de subconjuntos de linfocitos de la Tabla.

Tabla 1

La clasificación celular basada en marcadores de superficie se puede llevar a cabo por una o más tecnologías que incluyen, pero no se limitan a, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), clasificación celular activada magnéticamente (MACS), selección, reajuste, y similares, que normalmente emplean anticuerpos u otros reactivos que reconocen y se unen específicamente a las características de superficie celular de interés. En un aspecto, la clasificación celular basada en marcadores intracelulares también se puede llevar a cabo utilizando FACS fijando y permeabilizando las células, seguido por tinción, por ejemplo, con un anticuerpo marcado específico del marcador intracelular, por ejemplo, como se desvela en Pan et al, PlosOne, 6(3): e17536 (2011). Dichas tecnologías de clasificación y sus aplicaciones se desvelan en las siguientes referencias ejemplares: Recktenwald et al, editores, "Cell Separation Methods and Applications" (Marcel Dekker, 1998); Kearse, editor, "T Cell Protocols," Methods in Molecular Biology, Vol. 134 (Springer, 2000); Miltenyi et al, Cytometry, 11: 231-238 (1990); Davies, capítulo 11, "Cell sorting by flow cytometry," en Macey, Editor, Flow Cytometry: Principles and Applications (Humana Press, Totowa, NJ); y similares. De particular interés para la invención es la clasificación de linfocitos en subconjuntos de interés utilizando FACS, por ejemplo, utilizando un instrumento disponible en el comercio y protocolos del fabricante y kits, tales como un BD Biosciences FACS Aria III o a BD Biosciences Influx (BD Biosciences, San Jose, cA). La utilización de FACS para aislar subconjuntos de células T reguladoras se desvela específicamente en Boyce et al, "Human regulatory T-cell isolation and measurement of function," BD Bioscience Application Note (March, 2010). La clasificación o aislamiento de linfocitos basándose en la especificidad de antígenos de los receptores de celular B o receptores de células B se puede llevar a cabo utilizando FACS o FACS en combinación con otras tecnologías, tales como MACS. Las directrices para utilizar dichas tecnologías para la clasificación y/o aislamiento de células T o células B específicas de antígeno se desvelan en las siguientes referencias ejemplares: Thiel et al, Clin. Immunol., 111(2): 155-161 (2004); Newman et al, J. Immunol. Meth., 272: 177-187 (2003): Hoven et al, J. Immunol. Meth., 117(2): 275-284 (1989); patentes de EE. UU. 5.213.960 y 5.326.696; Moody et al, Cytometry A, 73A: 1086-1092 (2008); Gratama et al, Cytometry A, 58A: 79-86 (2004); Davis et al, Nature Reviews Immunology, 11: 551-558 (2011); patentes de EE. UU. 8.053.235 y 8.309.312; Lee et al, Nature Medicine, 5(6): 677-685 (1999); Altman et al, Science, 274: 94-96 (1996); Leisner et al, PLosOne 3(2): e1678 (2008); "Pro5 MHC Pentamer Handbook," (Prolmmune, Ltd., Reino Unido, 2012); y referencias similares.

En una realización, se pueden clasificar muestras de células sucesivas de un tejido accesible (tal como sangre periférica) en dos poblaciones: (i) un único subconjunto definido (tal como linfocitos CD8+; CD4+, CD25+(alto); y CD127(bajo); o similares) y (ii) todas las demás células. La población (i) se recolecta y se analiza, por ejemplo, extrayendo ácidos nucleicos, amplificando las secuencias de ADN o ARN recombinadas, secuenciándolas, y generando un perfil de clonotipo. Este procedimiento se puede repetir para tantos subconjuntos como se desee, utilizando diferentes sondas específicas del subconjunto.

Volviendo a la Fig. 1, se extrae el ADN o ARN de cada uno de los subconjuntos clasificados y se generan los perfiles de clonotipo (108) para cada subconjunto utilizando las técnicas descritas de manera más completa posteriormente. Los perfiles de clonotipo proporcionan una lista de secuencias de clonotipo en cada subconjunto. En una realización, el número de linfocitos clasificados es lo suficientemente grande para que se pueda identificar un clonotipo distinto de sustancialmente cada célula T en los perfiles de clonotipo. Como se expone de manera más completa posteriormente, en algunas realizaciones, como la identificación incluye un muestreo, “sustancialmente cada célula con un clonotipo distinto” significa cada clonotipo con una frecuencia determinada o por encima, por ejemplo, 0,001, se determina con una probabilidad del noventa por ciento, o noventa y cinco por ciento, o similar. De acuerdo con la invención, la información de clonotipo de los subconjuntos de linfocitos se utiliza para identificar la presencia, ausencia, número y/o niveles de células de distintos subconjuntos de linfocitos que se han infiltrado en un tejido menos accesible, tal como un espécimen o biopsia de un tumor sólido, o un tejido implicado en una enfermedad autoinmunitaria (110). Esto se consigue extrayendo el ADN o ARN del espécimen (110) y generando (112) un perfil de clonotipo (114). Cada clonotipo o perfil (114) se puede asociar entonces con un subconjunto de linfocitos (116) revisando la secuencia de dicho clonotipo en los perfiles (108) de clonotipo específicos de subconjunto; por lo tanto, haciendo dicha asociación se identifican los subconjuntos cuyos miembros han infiltrado el tejido sólido. Además, debido a la gran diversidad de clonotipos, el recuento de clonotipos de cada subconjunto da una buena aproximación del número de linfocitos del subconjunto que se han infiltrado en el espécimen. Si el volumen del espécimen se conoce o se puede determinar, entonces se puede obtener la densidad de linfocitos del subconjunto.

En algunas realizaciones, tal como cuando un tejido inaccesible es un tumor sólido, se pueden tomar una o más muestras del tumor, sea antes o después de la escisión, o retirada quirúrgica. Las muestras que se toman antes de la retirada del tumor pueden obtenerse utilizando aspiraciones con aguja, u otras técnicas convencionales. En algunas realizaciones, se obtienen múltiples muestras, por ejemplo, para determinar una distribución espacial de los subconjuntos de linfocitos en un tejido inaccesible. En algunas realizaciones, al menos se pueden tomar dos muestras, al menos una de la superficie o parte exterior de un tejido inaccesible, y al menos uno del interior del tejido inaccesible. Como se señaló anteriormente, en algunas realizaciones, el tejido inaccesible es un tumor sólido que se ha retirado de un paciente, tal como se ilustra por el espécimen (110) de la Fig. 1. Las muestras de espécimen (110) se puede obtener tras la escisión y después de fijarlo. La generación de perfiles de clonotipo de las muestras de tejido fijadas se describe de manera más completa posteriormente.

De acuerdo con la invención, la realización de la Fig. 1 puede implementarse con las siguientes etapas: (a) clasificar en uno o más subconjuntos una muestra de linfocitos de un tejido accesible de un individuo; (b) generar los perfiles de clonotipo de cada uno de los uno o más subconjuntos de linfocitos del tejido accesible; (c) generar un perfil de clonotipo de una muestra del tejido sólido; y (d) detectar los linfocitos de cada subconjunto en el tejido sólido a partir de sus clonotipos respectivos. En algunas realizaciones, la etapa (a) puede implementarse separando los linfocitos en subconjuntos deseados, o predeterminados por una variedad de técnicas, como se ha mencionado anteriormente, por ejemplo, FACS, utilizando sondas de anticuerpos marcados de marcadores apropiados. El objetivo de la etapa es enriquecer, o preferentemente aislar, un subconjunto de linfocitos puro del tejido accesible con el fin de minimizar la determinación errónea de miembros del subconjunto de los clonotipos identificados en el tejido inaccesible. El grado de enriquecimiento depende de la técnica de separación o clasificación empleada y los marcadores disponibles para los subconjuntos. En algunas realizaciones, la etapa de clasificación produce al menos un subconjunto que está enriquecido en el linfocito diana de manera que al menos el cincuenta por ciento de la población clasificada comprende el linfocito diana. En otras realizaciones, la etapa de clasificación produce al menos un subconjunto que está enriquecido en el linfocito diana de manera que al menos el ochenta por ciento de la población clasificada comprende el linfocito diana. En otras realizaciones, la etapa de clasificación produce al menos un subconjunto que está enriquecido en el linfocito diana de manera que al menos el noventa por ciento de la población clasificada comprende el linfocito diana. En otras realizaciones más, por ejemplo, cuando el linfocito diana pertenece a una población celular rara o una está disponible una sonda eficaz, entonces la etapa de clasificación puede producir un subconjunto que está enriquecido solo a un nivel del cinco por ciento de la población clasificada. En dichos casos, se puede obtener un enriquecimiento adicional utilizando múltiples técnicas de clasificación en tándem, por ejemplo, MACS seguido por fAc S. En algunas realizaciones, como se describe posteriormente, la etapa de generación de un perfil de clonotipo puede implementarse amplificando ácidos nucleicos recombinados de los linfocitos y secuenciación de ácidos nucleicos asilados del amplicón resultante. La etapa de generación puede incluir adicionalmente la unión de las lecturas de secuencias resultantes de la etapa de secuenciación en clonotipos. También, la etapa de generación puede incluir adicionalmente la formación de una base de datos de las secuencias de clonotipo resultante que son propicias para el análisis, por ejemplo, la aplicación de algoritmos para comparar dichas secuencias con las secuencias de clonotipo de otros perfiles de clonotipos.

Como se ha mencionado anteriormente, la divulgación incluye métodos para la determinación de un pronóstico a partir de un estado de infiltración de linfocitos en un tumor sólido de un paciente, en el que dicho método comprende las etapas de: (a) clasificar en uno o más subconjuntos una muestra de linfocitos de la sangre periférica del paciente; (b) generar perfiles de clonotipo para cada uno de los uno o más subconjuntos de linfocitos de la sangre periférica; (c) generar al menos un perfil de clonotipo de al menos una muestra del tumor sólido; y (d) determina el número, niveles y/o relaciones de linfocitos de cada uno de los uno o más subconjuntos. Como se utiliza en el presente documento, un “pronóstico” significa una predicción de un resultado basándose en el número, niveles o relaciones, y/o distribución de subconjuntos funcionales de linfocitos en un tejido inaccesible tal como un tumor sólido. Los resultados pueden ser la supervivencia del paciente, grado de mejora de los síntomas, reducción de la carga tumoral, u toras mediciones sustitutas de mejora o empeoramiento de una afección de enfermedad. Un pronóstico puede ser cualitativo en sus mediciones que indican una mejora o empeoramiento, pero no un grado de mejora (por ejemplo, el número de años adicionales de supervivencia, etc.) o el grado de empeoramiento. Los niveles de linfocitos de subgrupos funcionales pueden ser valores relativos, por ejemplo, en comparación con los niveles o concentraciones (promediados o de otra manera) en otros tejidos del paciente o niveles medios o intervalos en poblaciones de individuos. Los niveles relativos pueden ser en comparación con niveles den sangre periférica de un paciente de subconjuntos funcionales de linfocitos.

Muestras

De acuerdo con la invención, los linfocitos de un tejido accesible se separan en subconjuntos, que se analizan para determinar los clonotipos que, a su vez, se utilizan para determinar el número y/o niveles de linfocitos de los diferentes subconjuntos en los tejidos sólidos; por lo tanto, se obtienen al menos dos tipos de muestras, al menos una de un tejido accesible y al menos una de un tejido sólido. En algunas realizaciones, los tejidos accesibles de los que se toman las muestras incluyen, pero no se limitan, sangre periférica, médula ósea, fluido linfático, o líquido sinovial. En algunas realizaciones, los tejidos solidos de los que se toman las muestras son tumores sólidos, tejidos inflamados asociados con enfermedades autoinmunitarias, y similares. Los tumores sólidos ejemplares de los que se toman muestras de tejido sólido incluyen, pero no se limitan a, melanoma, colorrectal, ovárico, gástrico, de mama, hepatocelular, urotelial, y similares. Son de interés particular, los tumores colorrectales y melanomas. Tejidos sólidos ejemplares relacionados con una enfermedad autoinmune incluyen, pero no se limitan al, tejido conjuntivo, tejido conjuntivo articular, tejido muscular, piel, tejido pulmonar, tejido de intestino delgado, tejidos de colon, y similares. En otros casos, el tejido accesible es la sangre periférica y los tejidos menos accesibles son cualquier tejido que produzca una molestia significa al paciente al tomar la muestra. Por ejemplo, en dichos casos, los tejidos menos accesibles pueden incluir médula ósea, fluido linfático, líquido sinovial, o similares, así como los tejidos sólidos que se desvelaron anteriormente.

Los perfiles de clonotipo se obtienen de muestras de células inmunitarias (sea en tejidos accesibles o menos accesibles), que están presentes en una amplia variedad de tejidos. Las células inmunitarias de interés incluyen las células T y/o células B. Las células T (linfocitos T) incluyen, por ejemplo, células que expresan receptores de células T (TCR). Las células B (linfocitos B) incluyen, por ejemplo, células que expresan receptores de célula B (BCR). Las células T incluyen las células T auxiliares (células T efectoras o células Th), células T citotóxicas (CTL), células T de memoria, y células T reguladoras que se pueden distinguir por marcadores de superficie celular. En un aspecto una muestra de celular T incluye al menos 1.000 células T; pero más normalmente, una muestra incluye al menos 10.000 células T, y más normalmente, al menos 100.000 células T. En otro aspecto, una muestra incluye un número de células T en el intervalo de desde 1000 a 100.000 células. En otro aspecto, una muestra incluye un número de células T en el intervalo de desde 1000 a 1.000.000 células T. Una muestra de células inmunitarias también puede comprender células B. Las células B incluyen, por ejemplo, células B plasmáticas, células B de memoria, células B1, células B2, células B de la zona marginal, y células B foliculares. Las células B pueden expresar inmunoglobulinas (a las que también se hace referencia como anticuerpo o receptores de células B). Como anteriormente, en un aspecto, una muestra de células B incluye al menos 1.000 células B; pero más normalmente, una muestra incluye al menos 10.000 células B, y más normalmente, al menos 100.000 células B. En otro aspecto, una muestra incluye un número de células B en el intervalo de desde 1000 a 1.000.000 células B.

Las muestras (a las que a veces se hace referencia como “muestras de tejido”) que se utilizan en los métodos de la invención pueden provenir de una variedad de tejidos, que incluyen, por ejemplo, tejido tumoral, sangre y plasma sanguíneo, fluido linfático, líquido cefalorraquídeo que rodea el cerebro y la médula espinal, líquido sinovial que rodea las articulaciones óseas, y similares, en una realización, la muestra es una muestra de sangre. La muestra de sangre puede tener aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, o 5.0 ml. La muestra puede ser una biopsia tumoral. La biopsia puede ser de, por ejemplo, un tumor del cerebro, hígado, pulmón, corazón, colon, riñón, o médula ósea. Se puede utilizar cualquier técnica de biopsia utilizada por los expertos en la técnica para aislar una muestra de un sujeto. Por ejemplo, una biopsia puede ser una biopsia abierta, en la que se utilice anestesia general. La biopsia puede ser una biopsia cerrada, en la que se hace un corte más pequeño que en la biopsia abierta. La biopsia puede ser una biopsia central o incisional, en la cual se elimina parte del tejido. La biopsia puede ser una biopsia excisional, en la cual se hace un intento para retirar la lisión completa. La biopsia puede ser una biopsia de aspiración con aguja fina, en la cual la muestra de tejido o fluido se retira con una aguja. En algunas realizaciones, se pueden tomar múltiples muestras de un tumor sólido con el fin de determinar una distribución especial de los subconjuntos de linfocitos en o rodeando un tumor sólido. En algunas realizaciones el número de muestras de un tumor sólido puede estar en el intervalo de 2 a 10, en otras realizaciones, dicho intervalo puede ser de 2 a 20.

Una muestra o muestra de tejido, sea accesible o menos accesible, incluye un ácido nucleico, por ejemplo, ADN (por ejemplo, ADN genómico) o ARN (por ejemplo, ARN mensajero). El ácido nucleico puede ser un ADN libre de la célula o ARN, por ejemplo, extraído del sistema circulatorio, Vlassov et al, Curr. Mol. Med., 10: 142-165 (2010); Swarup et al, FEBS Lett., 581: 795-799 (2007). En los métodos de la invención, la cantidad de ARN o ADN de un sujeto que se puede analizar varía ampliamente. Para la generación de un perfil de clonotipo, se obtiene suficiente ácido nucleico en una muestra para una representación útil del repertorio de receptores inmunitarios del individuo en el tejido. Más particularmente, para la generación de un perfil de clonotipo a partir de ADN genético se extrae al menos 1 ng de ADN total de célula T o célula B (es decir, aproximadamente 300 equivalentes de genoma diploide) de una muestra; y en otra realización, se extraen al menos 3 mg de ADN total (es decir, aproximadamente 900 equivalentes de genoma diploide) de una muestra. Un experto reconocería que como la fracción de linfocitos disminuye en una muestra, las cantidades mínimas anteriores de ADN se pueden aumentar con el fin de generar un perfil de clonotipo que contenga más de aproximadamente 1000 clonotipos independientes. Para la generación de un perfil de clonotipo del ARN, en una realización, se extrae una cantidad suficiente de ARN de manera que se obtengan al menos 1000 transcripciones que codifiquen distintos TCR, BCR, o fragmentos de los mismos. La cantidad de ARN que se corresponde con este límite varía ampliamente de muestra a muestra dependiendo de la fracción de linfocitos en una muestra, el estadio de desarrollo de los linfocitos, las técnicas de toma de muestras, la afección del tejido, y similares. En una realización, se extrae al menos 100 ng de ARN de una muestra de tejido que contiene células B y/o células T para la generación de un perfil de clonotipo; en otra realización, se extraen al menos 500 ng de ARN de una muestra de tejido que contiene células _B y/o células T para la generación de un perfil de clonotipo. El ARN utilizando en los métodos de la invención puede ser el ARN extraído de una muestra de tejido o el ARN poliA extraído directamente de una muestra de tejido o del ARN total extraído de una muestra de tejido. Las extracciones de ácido nucleico anteriores se pueden llevar a cabo utilizando kits disponibles en el mercado, por ejemplo, en Invitrogen (Carlsbad, CA), Qiagen (San Diego, CA), o vendedores similares. Las directrices para la extracción de ARN se encuentran en Liedtke et al, PCR Methods and Applications, 4: 185-187 (1994); y referencias similares.

Como se expone de manera más completa posteriormente (Definiciones), una muestra de linfocitos es lo suficientemente grande para que sustancialmente cada una de las células T o células B con un clonotipo distinto esté representada en ella, formando de esta manera un repertorio (como término que se utiliza en el presente documento). En una realización, se toma una muestra que contiene con una probabilidad del noventa y nueve por ciento cada clonotipo de una población presente con una frecuencia del 0,001 por ciento o más. En otra realización, se toma una muestra que contiene con una probabilidad del noventa y nueve por ciento cada clonotipo de una población presente con una frecuencia de 0,0001 por ciento o más. En una realización, una muestra de células B o células T incluye al menos medio millón de células, y en otra realización dicha muestra incluye al menos un millón de células.

Cuando una fuente de material del que se toma la muestra sea escaso, tal como en las muestras de estudios clínicos, o similares, el ADN del material se puede amplificar por una técnica no tendenciosa, tal como amplificación de genoma completo (WGA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA); o una técnica similar, por ejemplo, Hawkins et al, Curr. Opin. Biotech., 13: 65-67 (2002); Dean et al, Genome Research, 11: 1095-1099 (2001); Wang et al, Nucleic Acids Research, 32: e76 (2004); Hosono et al, Genome Research, 13: 954-964 (2003); y similares.

Las muestras de sangre son de particular interés como una muestra accesible y se pueden obtener utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, Innis et al, editores, PCR Protocols (Academic Press, 1990); o similares. Por ejemplo, se pueden separar los glóbulos blancos sanguíneos de las muestras de sangre utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, con el kit RosetteSep (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Las muestras de sangre pueden variar en volumen de 100 pl a 10 ml; en un aspecto, los volúmenes de la muestra de sangre están en el intervalo de desde 100 pl a 2 ml. El ADN y/o el ARN se pueden entonces extraer de dicha muestra de sangre utilizando técnicas convencionales para su uso en los métodos de la invención, por ejemplo, DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Opcionalmente, los subconjuntos de glóbulos blancos sanguíneos, por ejemplo, los linfocitos, pueden aislarse adicionalmente utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA), clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), o similares.

Como las recombinaciones de identificación están presentes en el ADN de las células de inmunidad adaptativa de cada individuo, así como en sus transcripciones de ARN asociadas, se puede secuenciar el ARN o a Dn en los métodos de la invención proporcionada. Una secuencia recombinada de una célula T o una célula B que codifica un receptor de células T o una molécula de inmunoglobulina, o una parte de la misma, a la que se hace referencia como clonotipo. El ADN o ARN puede corresponderse con secuencias de genes del receptor de células T (TCR) o genes de inmunoglobulina (Ig) que codifican anticuerpos. Por ejemplo, el ADN y ARN se pueden corresponder con secuencias que codifican cadenas a, p, y y 6 de un TCR. En una mayoría de las células T, el TCR es un heterodímero que consiste en una cadena a y una cadena p. La cadena de TCR a se genera por la recombinación VJ, y la cadena p del receptor se genera por recombinación V(D)J. Para la cadena TCR p, en los seres humanos tiene 48 segmentos V, 2 segmentos D, y 13 segmentos J. Varias bases pueden estar eliminadas y otras añadidas (denominadas nucleótidos N y P) en cada una de las dos uniones. En una minoría de las células T, los TCR consisten en cadenas ^y y delta 6. La cadena ^y de TCR se genera por recombinación VJ, y la cadena 6 de TCR se genera por recombinación V(D)J (Kenneth Murphy, Paul Travers, y Mark Walport, Janeway's Immunology 7a edición, Garland Science, 2007).

El ADN y ARN analizados en los métodos de la invención puede corresponderse con secuencias que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulinas con regiones constantes (a, 6, £, ^y, o p) o cadenas ligeras de inmunoglobulinas (IgK o IgL) con las regiones constantes A o k. Cada anticuerpo tiene dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Cada cadena está compuesta por una región constante (C) y una región variable. Para la cadena pesada, la región variable está compuesta de un segmento variable (V), de diversidad (D), y de unión (J). Varias secuencias distintas que codifican cada tipo de estos segmentos están presentes en el genoma. Un evento de recombinación VDJ específico se produce durante el desarrollo de una célula B, haciendo que la célula genere una cadena pesada específica. La diversidad de la cadena ligera se genera de manera similar excepto que no hay región D de manera que solo hay una recombinación VJ. La mutación somática se produce a menudo cerca del sitio de recombinación, produciendo la adición o eliminación de varios nucleótidos, aumentando adicionalmente la diversidad de las cadenas pesada y ligera generadas por las células B. La posible diversidad de los anticuerpos generados por una célula B es entonces el producto de las diferentes cadenas pesada y ligera. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contribuyen a formar la región o sitio de reconocimiento (unión) de antígeno. Añadido a esta diversidad hay un proceso de hipermutación somática que puede producirse después de que se monte una respuesta específica contra algún epítopo.

En un aspecto, cuando se determina el número de linfocitos en una muestra, se añade una cantidad conocida de moléculas reordenadas del receptor inmunitario único con una secuencia conocida, es decir, cantidades conocidas de una o más referencias internas al ADNc o ADN genómico de una muestra de cantidad desconocida. Haciendo el recuento del número relativo de moléculas que se obtienen de la secuencia conocida que se añade en comparación con el resto de las secuencias de la misma muestra, se puede estimar el número de moléculas reordenadas en el receptor inmunitario en la muestra de ADNc inicial. (Dichas técnicas para el recuento molecular se conocen bien, por ejemplo, Brenner et al, Patente de EE. UU. 7.537.897). Los datos de la secuenciación de la secuencia única añadida se pueden utilizar para distinguir las diferentes posibilidades su se utiliza también una calibración por PCR en tiempo real, por ejemplo, como se desvela en Faham y Willis (citados anteriormente).

Extracción de ácidos nucleicos de las muestras fijadas

Las muestras de tejido fijadas (por ejemplo, de un tejido tumoral extirpado, o similares) del que se extraen los ácidos nucleicos en conjunción con la invención normalmente son muestras de tejido fijadas químicamente de un tejido relacionado con una enfermedad, tal como un tumor sólido. Los fijadores químicos que se utilizan para producir las muestras de tejido fijadas que se utilizan en la invención incluyen aldehídos, alcoholes, y reactivos similares. Normalmente, las muestras de tejidos que se utilizan en la invención se fijan con formaldehído o glutaraldehído, y en particular, se proporcionan como muestras de tejido fijadas en formalina embebidas en parafina (FFPE). Las directrices para las técnicas de extracción de un ácido nucleico para su uso en la invención se desvelan en las siguientes referencias: Dedhia et al, Asian Pacific J. Cancer Prev., 8: 55-59 (2007); Okello et al, Analytical Biochemistry, 400: 110-117 (2010); Bereczki et al, Pathology Oncology Research, 13(3): 209-214 (2007); Huijsmans et al, BMC Research Notes, 3: 239 (2010); Wood et al, Nucleic Acids Research, 38(14): e151 (2010); Gilbert et al, PLosOne, 6: e537 (June 2007); Schweiger et al, PLosOne, 4(5): e5548 (May 2009). Además, hay varios kits disponibles en el emrcado para llevar a cabo extracciones de ácido nucleico de tejidos fijados que se pueden utilizar en la invención usando las instrucciones del fabricante: Kit AllPrep DNA/RNA FFPE (Qiagen, San Diego, CA); Kit Absolutely RNA FFPE (Agilent, Santa Clara, CA); Kit QuickExtract FFPE DNA Extraction (Epicentre, Madison, WI); Kit RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation for FFPE (Ambion, Austin, TX); y similares.

En resumen, la extracción de ácido nucleico puede incluir las siguientes etapas: (i) obtención de la muestra fijada cortada en secciones de aproximadamente 20 pm de grosor o menos y en una cantidad suficiente para obtener aproximadamente 6 ng de ADN que se pueda amplificar o aproximadamente 0,5 a 20 ng de ARN que se pueda transcribir inversamente y amplificar; (ii) opcionalmente quitar la cera de la muestra fijada, por ejemplo, mediante lavados con xileno y etanol, tratamiento con d-limoneno y etanol, tratamiento con microondas, o similares; (iii) opcionalmente tratamiento por entrecruzamiento inducido por inversión de fijador del ADN, por ejemplo, incubación a 98 °C durante 15 minutos, o similar; (iv) digestión de los componentes no ácidos nucleicos de la muestra fijada, por ejemplo, con proteinasa K en un tampón convencional, por ejemplo, Tris-HCl, EDTA, NaCl, detergentes, seguidos por una desnaturalización por calor de la proteinasa K tras lo cual la solución resultante se puede utilizar opcionalmente de manera directa para generar un perfil de clonotipos para identificar los clonotipos correlativos; (v) y opcionalmente la extracción de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la extracción con fenol: cloroformo seguido por precipitación en etanol; extracción basada en columna de sílice, por ejemplo, el micro kit QlAamp DNA (Qiagen, CA); o similares. Para el aislamiento de ARN, se puede llevar a cabo una etapa adicional de extracción específica de ARN, por ejemplo, un tratamiento inhibidor de RNasa, un tratamiento con DNasa, extracción en tiocianato de guanidinio/ácida, o similares. Las etapas opcionales adicionales pueden incluir el tratamiento de la muestra de ácido nucleico para retirar los inhibidores de la PCR, por ejemplo, se puede utilizar seroalbúmina bovina o un reactivo similar para este fin, por ejemplo, Satoh et al, J. Clin. Microbiol., 36(11): 3423-3425 (1998).

La cantidad y calidad del ácido nucleico extraído se puede medir con una variedad de maneras, incluyendo, pero sin limitarse al, ensayo de cuantificación PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, OR); análisis con un Bioanalizador 2100 (Agilent, Santa Clara, CA); Mini-Fluorómetro TBS-380 (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA); o similares. En un aspecto, una medición de la calidad del ácido nucleico se puede obtener amplificando, por ejemplo, en una PCR múltiple, un conjunto de fragmentos de genes internos de referencia que tengan tamaños predeterminados, por ejemplo, 100, 200, 300 y 400 pares de bases, como se desvela en Van Dongen et al, Leukemia, 17: 2257-2317 (2003). Después de dicha amplificación, los fragmentos se separan por tamaños y las bandas se cuantifican para proporcionar una distribución que refleje la distribución del tamaño de los fragmentos del ácido nucleico extraído.

Los ácidos nucleicos extraídos de los tejidos fijados tienen una distribución de tamaños con un tamaño medio típico de aproximadamente 200 nucleótidos o menos debido al proceso de fijación. Los fragmentos que contienen los clonotipos tienen tamaños que pueden estar en el intervalo de 100-400 nucleótidos; por lo tanto, para el ADN como material de partida. Para asegurar la presencia de clonotipos que se puedan amplificar en el ácido nucleico extraído, el número de equivalentes genómicos en una muestra debe exceder el número de clonotipos deseado en una cantidad significativa, por ejemplo, normalmente de 3-6 veces. Se tiene que hacer una consideración similar para el ARN como material de partida. Si las roturas y/o adductos de la fijación están distribuidos a lo largo de una secuencia extraída, entonces la probabilidad de que una región de N pares de bases de longitud (por ejemplo, que contenga un clonotipo) no tenga una rotura o aducto se puede estimar de la siguiente manera. Si cada nucleótido tiene una probabilidad, p, de contener una rotura o adducto (por ejemplo, se puede tomar p como 1/200, lo inverso del tamaño de fragmento medio), entonces una estimación de la probabilidad de que un tramo de N pb no tenga una rotura o adducto, es de (1-p)N, por ejemplo, Ross, Introduction to Probability Models, novena Edición (Academic Press, 2006). La inversa de esta cantidad es el factor de aumento en equivalentes genómicos que se debe muestrear con el fin de obtener (como media) el número deseado de fragmentos que se pueden amplificar. Por ejemplo, si se desean al menos 1000 clonotipos que se puedan amplificar, entonces debe haber al menos 1000 secuencias que engloben las secuencias de clonotipos (por ejemplo, más de 300 pares de bases (pb)) que no tengan roturas o adductos inhibidores de la amplificación o entrecruzamientos. Para N = 300 y p = 1/200, (1-p)N < 0,22, de manera que, si se necesitan 6 ng de muestra para dar aproximadamente 1000 equivalentes genómicos de ADN intacto de un tejido no fijado, entonces se necesitarían aproximadamente (1/0,22) x 6 ng, o 25-30 ng de tejido fijado. Para N = 100 y p = 1/200, (1-p)N < 0,61, de manera que, si se necesita una muestra de 6 ng para dar aproximadamente 100 equivalentes genómicos de ADN intacto de un tejido sin fijar, entonces se necesitarían aproximadamente (1/0,61) x 6 ng, o 10 ng de tejido fijado. En un aspecto, para la determinación de clonotipos correlacionados, el número de clonotipos que se pueden amplificar está en el intervalo de 1000 a 10000. En consecuencia, para las muestras fijadas que comprenden aproximadamente un 50-100 % de linfocitos, la muestra de ácido nucleico del tejido fijado se obtiene en una cantidad en el intervalo de 10-500 ng. Para las muestras de tejido fijado que comprenden aproximadamente de un 1-10% de linfocitos, la muestra de ácido nucleico de tejido fijado se obtiene en una cantidad en el intervalo de 1-50 pg.

Identificación de isotipos de células B

En una realización, la invención permite la identificación de isotipos de células B que infiltran un tejido inaccesible. Los isotipos de las inmunoglobulinas producidas por los linfocitos B se pueden determinar a partir de los clonotipos que se diseñan para incluir el ácido nucleico que codifica una parte de la región constante de una inmunoglobulina. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se construyen clonotipos de lecturas de secuencias de nucleótidos que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulinas (IgH). Dichos clonotipos de la invención incluyen una región que codifica VDJ y una parte de su región constante asociada (o región C). El isotipo se determina a partir de una secuencia que codifica la parte de la región C. En una realización, la parte que codifica la región C es adyacente a la región que codifica VDJ, de manera que se puede amplificar una única secuencia contigua por una técnica convencional, tal como una reacción en cadena de la polimerasa, tal como se desvela en Faham y Willis, publicación de patente de EE. UU. 2011/0207134. La parte de un clonotipo que codifica la región C se utiliza para identificar el isotipo por la presencia de alelos característicos. En una realización se incluyen entre 8 y 100 nucleótidos que codifican la región C en un clonotipo; en otra realización se incluyen entre 8 y 20 nucleótido que codifican la región C en un clonotipo. En una realización, dichas partes que codifican la región C se capturan durante la amplificación de secuencias que codifican la IgH como se describe de manera más completa posteriormente. En dichas amplificaciones, uno o más cebadores de la región C se posicionan de manera que se capture en los amplicones resultantes un número de nucleótidos que codifican la región C de los intervalos anteriores.

Existen cinco tipos de cadena pesada de Ig en mamíferos señaladas por las letras griegas: a, 8, £, y, y H. El tipo de cadena pesada define la clase de anticuerpo; estas cadenas se encuentran en los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, respectivamente. Las cadenas pesadas distintas se diferencian en el tamaño y composición; a y y contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que H y £ tienen aproximadamente 550 aminoácidos. Cada cadena pesada tiene dos regiones, la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero son diferentes en los diferentes isotipos. Las cadenas pesadas ^y, a, y 8 tienen una región compuesta por tres dominios de Ig en tándem (en línea), y una región bisagra para una flexibilidad añadida; las cadenas pesadas ^h y £ tienen una región constante compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina. La región variable de la cadena pesada se diferencia en los anticuerpos producidos por diferentes células B, pero es la misma para todos los anticuerpos producidos por una única célula B o un clon de células B. La región variable de cada cadena pesada tiene aproximadamente 110 aminoácidos de longitud y está compuesta por un único dominio de Ig. Las secuencias de nucleótidos de las regiones C de IgH humanas (y otras) se pueden obtener de las bases de datos disponibles públicamente, tal como en el International Immunogenetics Information System (IMGT) en http://www.imgt.org.

Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan la generación de clonotipos de inmunoglobulinas que contienen una información del isotipo. Dichos métodos se pueden implementar con las siguientes etapas: (a) obtención de una muestra de ácidos nucleicos de los linfocitos de un individuo, comprendiendo la muestra secuencias recombinadas que incluyen cada una al menos una parte de un segmento genético C de un receptor de células B; (b) la generación de un amplicón de las secuencias recombinadas, incluyendo cada secuencia del amplicón una parte de un segmento genético C; (c) la secuenciación del amplicón para generar un perfil de clonotipos que comprende cada uno al menos una parte de una región VDJ de un receptor de células B y al menos una parte de un segmento genético C. A partir de la última etapa se determina el isotipo de los linfocitos B de la muestra examinando la secuencia del segmento genético C de su clonotipo. En una realización, el segmento genético C es de una secuencia de nucleótidos que codifican una cadena IgH de dicho receptor de células B. Normalmente, el segmento genético C está en un extremo de un clonotipo y una parte de secuencia recombinada única, por ejemplo, la parte VDJ, está en el otro extremo del clonotipo. En algunas realizaciones, las partes únicas de clonotipos comprenden al menos una parte de una región VDJ.

Amplificación de las poblaciones de ácidos nucleicos

Los amplicones de las poblaciones de ácidos nucleicos diana se pueden generar por una variedad de técnicas de amplificación. En un aspecto de la invención, la PCR múltiple se utiliza para amplificar los miembros de una mezcla de ácidos nucleicos, particularmente mezclas que comprenden moléculas inmunitarias tales como receptores de células T, o partes de los mismos. Las directrices para llevar a cabo PCR múltiples de dichas moléculas inmunitarias se encuentran en las siguientes referencias: Faham y Willis, Publicación de patente de EE. UU. 2011/0207134; Morley, Patente de EE. UU. 5.296.351; Gorski, Patente de EE. UU. 5.837.447; Dau, Patente de EE. UU. 6.087.096; Von Dongen et al, Publicación de patente de EE. UU. 2006/0234234; publicación de patente europea EP 1544308B1; y similares.

Después de la amplificación de ADN del genoma (o amplificación del ácido nucleico en forma de ADNc por trascripción inversa del ARN), se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico individuales, opcionalmente reamplificarse y entonces secuenciarse individualmente. Los protocolos de amplificación ejemplares se pueden encontrar en van Dongen et al, Leukemia, 17: 2257-2317 (2003) o van Dongen et al, Publicación de patente de EE. UU. 2006/0234234. En resumen, un protocolo ejemplar es como sigue: Tampón de reacción: Tampón ABI II o Tampón ABI Gold (Life Technologies, San Diego, CA); 50 ml de volumen de reacción final; 100 ng de muestra de ADN; 10 pmol de cada cebador (sujeto a ajustes para equilibrar la amplificación como se describe posteriormente); dNTPs a 200 mM de concentración final; MgCl2 a 1,5 mM de concentración final (sometido a optimización dependiendo de las secuencias diana y la polimerasa); polimerasa Taq (1-2 U/tubo); condiciones de ciclado: preactivación de 7 min a 95 °C; hibridación a 60 °C; tiempos de ciclado: 30 s de desnaturalización; 30 s de hibridación; 30 s de extensión. Las polimerasas que se pueden utilizar para la amplificación en los métodos de la invención están disponibles en el mercado e incluyen, por ejemplo, polimerasa Taq, polimerasa AccuPrime, o Pfu. La elección de polimerasas para su uso se puede basar en si se prefiere la fidelidad o la eficacia.

Se pueden utilizar mediciones con PCR en tiempo real, tinción con picogreen, electroforesis de nanofluídica (por ejemplo, LabChip) o absorción de UV en una primera etapa para juzgar la cantidad funcional de material que se pueda amplificar.

En un aspecto, las amplificaciones múltiples se llevan a cabo de amena que las cantidades relativas de secuencia en una población de partida son sustancialmente las mismas que en la población amplificada, o amplicón. ES decir, las amplificaciones múltiples se llevan a cabo con una amplificación con mínima desviación entre las secuencias de miembro de una población de la muestra. En una realización, dichas cantidades relativas son sustancialmente las mismas si cada cantidad relativa en un amplicón es de cinco veces su valor en la muestra de partida. En otra realización, dichas cantidades relativas son sustancialmente las mismas si cada cantidad relativa en un amplicón es de dos veces su valor en la muestra de partida. Como se expone de manera más completa posteriormente, la desviación en la amplificación por PCR se puede detectar y corregir utilizando técnicas convencionales de manera que se puede seleccionar un conjunto de cebadores de pCr para un repertorio predeterminado que proporcionen una amplificación sin desviaciones de cualquier muestra.

Con respecto a muchos repertorios basados en las secuencias de TCR y BCR, una amplificación múltiple utiliza opcionalmente todos los segmentos V. La reacción se optimiza para obtener una amplificación que mantenga la abundancia relativa de las secuencias amplificadas por diferentes cebadores del segmento V. Algunos de los cebadores se relacionan, y por lo tanto muchos de los cebadores pueden “interactuar”, amplificando matrices que nos coinciden perfectamente con esto. Las condiciones se optimizan de manera que cada matriz se puede amplificar de una manera similar independientemente del cebador que la amplifica. En otras palabras, si hay dos matrices, entonces después de una amplificación de 1.000 veces ambas matrices se pueden amplificar aproximadamente 1.000 veces, y no importa que en una de las matrices la mitad de los productos amplificados lleve un cebador diferente debido a la interacción. En los análisis posteriores de los datos de secuenciación la secuencia del cebador se elimina de los análisis, y por lo tanto no importa el cebador que se utilice en la amplificación a condición de que la matriz se amplifique de manera igual.

En una realización, la desviación de la amplificación se puede evitar llevando a cabo una amplificación en dos estadios (como se describe en Faham y Willis, citados anteriormente) en el que se implementa un número pequeño de ciclos de amplificación en un primer, o primario, estadio utilizando cebadores que tienen colas no complementarias con las secuencias diana. Las colas incluyen sitios de unión al cebador que se añaden a los finales de las secuencias del amplicón primario de manera que dichos sitios se utilizan en un segundo estadio de amplificación utilizando solo un cebador directo único y un único cebador inverso, eliminando de esa manera una causa primaria de desviación de la amplificación. Preferentemente, la PCR primaria tendrá un número lo suficientemente pequeño (por ejemplo, 5-10) para minimizar la amplificación diferencial por cebadores diferentes. La amplificación secundaria se hace con un para cebadores y por tanto el problema de la amplificación diferencial es mínimo. Un porcentaje de la PCR primaria se toma directamente para la PCR secundaria. Eran suficientes treinta y cinco ciclos (equivalentes a ~ 28 ciclos sin la etapa de dilución de 100 veces) utilizados entre las dos amplificaciones para mostrar una amplificación robusta independientemente de si el desglose de ciclos era: un ciclo primario y 34 secundarios o 25 primarios y 10 secundarios. Incluso aunque haciendo idealmente solo 1 ciclo en la PCR primaria se podía disminuir la desviación de la amplificación, existen otras consideraciones. Un aspecto de esto es la representación. Esto tiene un papel cuando la entrada de cantidad de partida no está en exceso respecto al número de lecturas que se obtienen en último término. Por ejemplo, si se obtienen 1.000.000 de lecturas y se comienza con una entrada de 1.000.000 moléculas entonces tomando solo la representación de 100.000 moléculas para la amplificación secundaria degradaría la precisión de la estimación de la abundancia relativa de diferentes especies en la muestra original. La dilución de 100 veces entre las 2 etapas significa que la representación se reduce a menos de que la amplificación por la PCR primaria genere significativamente más de 100 moléculas. Esto indica que se pueden utilizar un mínimo de 8 ciclos (256 veces) pero de manera más confortable 10 ciclos (~ 1.000 veces). La alternativa a esto es tomar más de un 1 % de la PCR primaria para la secundaria, pero debido a la alta concentración de cebadores que se utiliza en la PCR primaria, se puede utilizar un factor de dilución grande para asegurar que estos cebadores no interfieran en la amplificación y empeoren la desviación de amplificación entre secuencias. Otra alternativa es añadir una etapa de purificación o enzimática para eliminar los cebadores de la PCR primaria para permitir una dilución menor de esta. En este ejemplo, la PCR primaria era de 10 ciclos y la secundaria de 25 ciclos.

Generación de lecturas de secuencia par clonotipos

Se puede utilizar cualquier técnica de alto rendimiento para la secuenciación de ácidos nucleicos en el método de la invención. Preferentemente, dicha técnica tiene la capacidad de generar de una manera barata un volumen de datos de secuencia de los que al menos se puedan determinar 1000 clonotipos, y preferentemente, de los que se puedan determinar al menos 10.000 a 1.000.000 de clonotipos. Las técnicas de secuenciación de ADN incluyen las reacciones de secuenciación didesoxi clásicas (método de Sanger) utilizando terminadores o cebadores marcados y separación en gel en plancha o capilaridad, secuenciación por síntesis utilizando nucleótidos marcados terminados reversiblemente, pirosecuenciación, secuenciación 454, hibridación específica de alelos con una biblioteca de sondas de oligonucleótidos marcados, secuenciación por síntesis utilizando hibridación específica de alelo con una biblioteca de clones marcados que continúa con ligadura, control en tiempo real de la incorporación de nucleótidos marcados durante una etapa de polimerización, secuenciación con polonio, y secuenciación SOLiD. La secuenciación de las moléculas separadas se ha demostrado más recientemente por reacciones de extensión secuencial o sencilla utilizando polimerasas o ligasas, así como por hibridaciones sencillas o secuenciales con bibliotecas de sondas. Estas reacciones se han llevado a cabo en muchas secuencias clónicas en paralelo incluyendo demostraciones en aplicaciones comerciales actuales de 100 millones de secuencias en paralelo. Estas estrategias de secuenciación se pueden utilizar por lo tanto para estudiar el repertorio de receptores de células T (TCR) y/o receptores de células B (BCR).

En un aspecto de la invención, se emplean métodos de secuenciación de alto rendimiento que comprenden una etapa de asilamiento espacial de moléculas individuales en una superficie sólida en la que se secuencian en paralelo. Las superficies sólidas pueden incluir superficies no porosas (tal como en la secuenciación Solexa, por ejemplo, Bentley et al. Nature, 456: 53-59 (2008) o secuenciación genómica completa, por ejemplo, Drmanac et al, Science, 327: 78-81 (2010)), matrices de pocillos, que pueden incluir matrices unidas a perlas o partículas (tales como con la 454, por ejemplo, Margulies et al, Nature, 437: 376-380 (2005) o secuenciación iónica de Torrent publicación de patente de EE. UU. 2010/0137143 o 2010/0304982), membranas microtejidas (tales como con secuenciación SMRT, por ejemplo, Eid et al, Science, 323: 133-138 (2009)), o matrices de perlas (como en la secuenciación SOLiD o secuenciación con polonio, por ejemplo, Kim et al, Science, 316: 1481-1414 (2007)).

En otro aspecto, dichos métodos comprenden la amplificación de moléculas aisladas antes o después de aislarse espacialmente en una superficie sólida. Antes de la amplificación puede comprender una amplificación basada en emulsión, tal como la PCR en emulsión o amplificación en círculo rotatorio. De particular interés es la secuenciación basada en Solexa en la que las moléculas de matriz individuales están aisladas espacialmente en una superficie sólida, después de lo cual se amplifican en paralelo por PCR en puente para formar poblaciones clónicas separadas, o agrupamientos, y entonces se secuencian como se describen en Bentley et al (citado anteriormente) y con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, TruSeq™ Kit de preparación de muestras y hoja de datos Illumina, Inc., San Diego, CA, 2010); y adicionalmente en las siguientes referencias: patentes de EE. U^u . 6.090.592; 6.300.070; 7.115.400; y EP0972081B1. En una realización, las moléculas individuales dispuestas y amplificadas en una superficie sólida forma agrupamientos en una densidad de al menos 105 agrupamientos por cm2; o una densidad de al menos 5 x 105 cm2; o una densidad de al menos 106 agrupamientos por cm2. En una realización, la se emplea secuenciación química que tienen tasas de error relativamente altas. En dichas realizaciones, las puntuaciones de calidad media producidas por dichos químicos son funciones de declinación de manera monótona de las longitudes de lecturas de secuencia. En una realización, dicho declive se corresponde con un 0,5 por ciento de las lecturas de secuencia que tiene al menos un error en las posiciones 1-75; un 1 por ciento de lecturas de secuencia que tienen al menos un error en las posiciones 76-100; y un 2 por ciento de lecturas de secuencia que tienen al menos un error en las posiciones 101-125.

En un aspecto, se obtiene un perfil de clonotipo basado en la secuencia de un individuo utilizando las siguientes etapas: (a) obtención de una muestra de ácido nucleico de las células T y/o células B del individuo; (b) aislamiento espacial de moléculas individuales derivadas de dicha muestra de ácido nucleico, las moléculas individuales comprenden al menos una matriz generada a partir de un ácido nucleico en la muestra, cuya matriz comprende una región reordenada somáticamente o una parte de la misma, siendo cada molécula individual capaz de producir al menos una lectura de secuencia; (c) secuenciación de dichas moléculas individuales aisladas espacialmente; y (d) determinación de abundancias de diferentes secuencias de las moléculas de ácido nucleico a partir de la muestra de ácido nucleico para generar el perfil de clonotipo. En otra realización, un perfil de clonotipo basado en la secuencia se puede generar por las siguientes etapas: (a) obtención de una muestra del paciente que comprende células T o células B; (b) amplificación de moléculas de ácido nucleico de las células T y/o las células B de la muestra, comprendiendo las moléculas de ácido nucleico secuencias recombinante de genes de receptor de células T o genes de inmunoglobulina; (c) secuenciación de las moléculas amplificadas de ácido nucleico para formar un perfil de clonotipo; y (d) determinación de una presencia, ausencia y/o nivel de uno o más clonotipos específicos del paciente, incluyendo cualquiera de los clonotipos filogénicos no registrados anteriormente de los mismos, como enseña Faham y Willis, Publicación de patente de EE. UU. 2011/0207134.

En una realización, cada una de las regiones reordenadas somáticamente comprende una región V y una región J. En otra realización, la etapa de secuenciación comprende la secuenciación bidireccional de cada una de las moléculas individuales aisladas espacialmente para producir al menos una lectura de secuencia directa y al menos una lectura de secuencia inversa. Además de la última realización, al menos una de las lecturas de secuencia directa y al menos una de las lecturas de secuencia inversa tiene una región solapada de manera que las bases de dicha región de solapamiento se determinan por una relación complementaria inversa entre dichas lecturas de secuencia. En otra realización más, cada una de las regiones reordenadas somáticamente comprende una región V y una región J y la etapa de secuenciación incluye adicionalmente la determinación de una secuencia de cada una de las moléculas de ácido nucleico individuales de una o más de sus lecturas de secuencia directa y al menos una lectura de secuencia inversa comenzando desde una posición en una región J y extendiéndose en la dirección de su región V asociada. En otra realización, las moléculas individuales comprenden ácidos nucleicos seleccionados de entre el grupo que consiste en moléculas de IgH completa, moléculas de IgH incompleta, moléculas de IgK completa, moléculas de IgK inactiva, moléculas de TCRp, moléculas de TCR^y, moléculas de TCR5 completas y moléculas de TCR5 incompletas. En otra realización la etapa de secuenciación comprende las lecturas de secuencia que tienen puntaciones de calidad que disminuyen de manera monótona. Además de la última realización, las puntuaciones de calidad que disminuyen de manera monótona son de manera que las tasas de error de las lecturas de secuencia no son mejores que las siguientes: un 0,2 por ciento de las lecturas de secuencia contienen al menos un error en las posiciones de bases 1 a 50, un 0,2 a 0,1 por ciento de lecturas de secuencia que contienen al menos un error en las posiciones 51-75, un 0,5 a 1,5 por ciento de lecturas de secuencia que contienen al menos un error en las posiciones 76-100. En otra realización, el método anterior comprende las siguientes etapas: (a) obtención de una muestra de ácido nucleico de células T y/o células B del individuo; (b) aislamiento espacial de moléculas individuales derivadas de dicha muestra de ácido nucleico, comprendiendo las moléculas individuales conjuntos anidados de matrices generados cada uno de un ácido nucleico de la muestra y conteniendo cada uno una región reordenada somáticamente o una parte de la misma, siendo cada conjunto anidado capaz de producir una pluralidad de lecturas de secuencia que se extienden cada una en la misma dirección y comenzando cada una a partir de una posición diferente en el ácido nucleico a partir de la cual se genera el conjunto anidado; (c) secuenciación de dichas moléculas individuales aisladas espacialmente, y (d) determinación de la abundancia de diferentes secuencias de las moléculas de ácido nucleico a partir de la muestra de ácido nucleico para generar el perfil de clonotipo. En una realización, la etapa de secuenciación incluye la producción de una pluralidad de lecturas de secuencia para cada uno de los conjuntos anidados. En otra realización, cada una de las regiones reordenadas somáticamente comprende una región V y una región j, y cada una de la pluralidad de lecturas de secuencia comienza desde una posición diferente en la región V y se extiende en la dirección de su región J asociada.

En un aspecto, para cada muestra de un individuo, la técnica de secuenciación utilizada en los métodos de la invención genera secuencias de al menos 1000 clonotipos por ejecución; en un aspecto, dicha técnica genera secuencias de al menos 10.000 clonotipos por ejecución; en otro aspecto, dicha técnica genera secuencias de al menos 100.000 clonotipos por ejecución; en otro aspecto, dicha técnica genera secuencias de al menos 500.000 clonotipos por ejecución; y en otro aspecto, dicha técnica genera secuencias de al menos 1.000.000 de clonotipos por ejecución. En otro aspecto más, dicha técnica genera secuencias de entre 100.000 a 1.000.000 de clonotipo por ejecución por muestra individual.

La técnica de secuenciación utilizada en los métodos de la invención proporcionada puede generar aproximadamente 30 pb, aproximadamente 40 pb, aproximadamente 50 pb, aproximadamente 60 pb, aproximadamente 70 pb, aproximadamente 80 pb, aproximadamente 90 pb, aproximadamente 100 pb, aproximadamente 110, aproximadamente 120 pb por lectura, aproximadamente 150 pb, aproximadamente 200 pb, aproximadamente 250 pb, aproximadamente 300 pb, aproximadamente 350 pb, aproximadamente 400 pb, aproximadamente 450 pb, aproximadamente 500 pb, aproximadamente 550 pb, o aproximadamente 600 pb por lectura.

Determinación del clonotipo de los datos de secuencia

La construcción de clonotipos de los datos de lectura de secuencia depende en parte del método de secuenciación utilizado para generar dichos datos, como los métodos son diferentes se esperan diferentes longitudes de lectura y calidad de datos. En una estrategia, se emplea un secuenciador Solexa para generar los datos de lectura de secuencia para el análisis. En una realización se obtiene una muestra que proporciona al menos 0,5-1,0 x 106 linfocitos para producir al menos 1 millón de moléculas matriz, que después de la amplificación opcional pueden producir un millón o más poblaciones clónicas de moléculas de matriz (o agrupamientos). Para más estrategias de secuenciación, incluyendo la estrategia Solexa, dicho sobre muestreo a nivel de agrupamiento es deseable ya que cada secuencia de matriz se determina con un gran grado de redundancia para aumentar la precisión de la determinación de secuencia. Para las implementaciones basadas en Solexa, se determina cada secuencia matriz preferentemente 10 veces o más. Para otras estrategias de secuenciación con diferentes lecturas y calidad de datos esperadas, se pueden utilizar diferentes niveles de redundancia para una precisión comparable de determinación de secuencia. Los expertos en la técnica reconocen que los parámetros anteriores, por ejemplo, tamaño de la muestra, redundancia, y similares son elecciones de diseño relacionadas con aplicaciones particulares.

En un aspecto de la invención, las secuencias de clonotipo (incluyendo, pero sin limitarse a las derivadas de IgH, TCRa, TCRp, TCRy, TCR5 y/o IgLK (IgK)) se puede determinar combinando la información de una o más lecturas de secuencia, por ejemplo, a lo largo de las regiones V(D)J de las cadenas seleccionadas. En otro aspecto, las secuencias de clonotipos se determinan combinando la información de una pluralidad de lecturas de secuencias. Dichas pluralidades de lecturas de secuencia pueden incluir una o más lecturas de secuencia a lo largo de una cadena en sentido (es decir, lecturas de secuencia “directas”) y una o más lecturas de secuencia a lo largo de su cadena complementaria (es decir, lecturas de secuencia “indirectas”) Cuando las lecturas de secuencia múltiples se generan a lo largo de la misma cadena las matrices separadas se generan primero amplificando las moléculas de la muestra con cebadores seleccionados de diferentes posiciones de las lecturas de secuencia. Este concepto se ilustra en la Fig. 4A en la que los cebadores (404, 406, y 408) se emplean para generar amplicones (410, 412, y 414, respectivamente) en una única reacción. Dichas amplificaciones se pueden llevar a cabo en la misma reacción o en reacciones distintas. En un aspecto, cuando se emplea una PCR, las reacciones de amplificación distintas se utilizan para generar las matrices diferentes que, a su vez, se combinan y utilizan para generar múltiples lecturas de secuencia a lo largo de la misma cadena. Esta última estrategia es preferible para evitar la necesidad de equilibrar las concentraciones de cebadores (y/u otros parámetros de reacción) para asegurar una amplificación igual de múltiples matrices (a lo que a veces se hace referencia como “amplificación equilibrada” o “amplificación sin desviación”). La generación de matrices en reacciones diferentes se ilustra en las Fig. 4B-4C. En ellas una muestra que contiene IgH (400) se divide en tres partes (470, 472, y 474) que se añaden a PCR diferentes utilizando cebadores de la región J (401) y cebadores de la región V (404, 406, y 408, respectivamente) para producir amplicones (420, 422, y 424, respectivamente). Los últimos amplicones se combinan entonces (478) en una PCR secundaria (480) utilizando los cebadores P5 y P7 para preparar las matrices (482) para la PCR puente y se secuencia en un secuenciador Illumina GA, o un instrumento similar.

Las lecturas de secuencia generadas en los métodos de la invención pueden tener una amplia variedad de longitudes, dependiendo en parte de la técnica de secuenciación que se va a emplear. Por ejemplo, para algunas técnicas, pueden aparecer varias compensaciones en su implementación, por ejemplo, (i) el número y longitudes de lecturas de secuencia y (ii) el coste y duración de una operación de secuenciación. En una realización, las lecturas de secuencia están en el intervalo de desde 20 a 400 nucleótidos; en otra realización, las lecturas de secuencia están en el intervalo de 30 a 200 nucleótidos; en otra realización más, las lecturas de secuencia están en el intervalo de 30 a 120 nucleótidos. En una realización, se generan 1 a 4 lecturas de secuencia para la determinación de la secuencia de cada clonotipo; en una realización, se generan 2 a 4 lecturas de secuencia para la determinación de la secuencia de cada clonotipo; y en otra realización, 2 a 3 lecturas de secuencia se generan para la determinación de la secuencia de cada clonotipo. En las realizaciones anteriores, los números que se dan son exclusivos de lecturas de secuencia utilizadas para identificar las muestras de individuos diferentes. Las longitudes de las distintas lecturas de secuencia utilizadas en las realizaciones descritas anteriormente también pueden variar basándose en la información que se desean capturar por la lectura; por ejemplo, la localización de partida y la longitud de una lectura de secuencia puede diseñarse para proporcionar la longitud de una región NDN, así como su secuencia de nucleótidos; por lo tanto, se seleccionan las lecturas de secuencia que abarcan la región NDN completa. En otros aspectos, son suficientes una o más lecturas de secuencia en combinación (pero no por separado) engloba una región D y/o NDN.

Como se ha mencionado anteriormente, se puede utilizar una variedad de algoritmos para convertir las lecturas de secuencia en clonotipos. En una realización, las secuencias de clonotipos se determinan en parte alineando lecturas de secuencia con una o más secuencias de referencia de la región V y una o más secuencias de referencia de la región J, y en parte por determinación de bases sin alineamiento con secuencias de referencia, tal como en la región NDN altamente variable. Se puede aplicar una variedad de algoritmos de alineamiento a las lecturas de secuencia y secuencias de referencia. Por ejemplo, las directrices de métodos de selección de alineamiento están disponibles en Batzoglou, Briefings in Bioinformatics, 6: 6-22 (2005). En un aspecto, cuando las lecturas V o lecturas C (como se ha mencionado anteriormente) se alinean a las secuencias de regiones V y J de referencia, se emplea un algoritmo de árbol de búsqueda, por ejemplo, como se describe en general en Gusfield (citado anteriormente) y Cormen et al, Introduction to Algorithms, Tercera Edición (The MIT Press, 2009).

En otra realización, en el extremo de al menos una lectura directa y un extremo de al menos un solapamiento de lectura inversa de una región de solapamiento (por ejemplo, 308 en la Fig. 3A), de manera que las bases de las lecturas estén en una relación complementaria entre ellas. Por lo tanto, por ejemplo, si una lectura directa en la región de solapamiento es “5'-acgttgc”, entones una lectura inversa en una relación complementaria inversa es “5'-gcaacgt” en la misma región solapada. En un aspecto, se determinan las bases en dicha región de solapamiento, al menos en parte, a partir de dicha relación complementaria inversa. Es decir, una probabilidad de determinación de base (o una puntuación de calidad relacionada) en una región potencial aumenta si conserva, o es consistente con, una relación complementaria inversa entre dos lecturas de secuencia. En un aspecto los clonotipos de las cadenas TCRp e IgH (ilustrado en la Fig. 3A) se determina por al menos una lectura de secuencia que comienza en su región J y se extiende en la dirección de su región V asociada (a la que se hace referencia en el presente documento como “lectura C” (304)) y al menos una lectura de secuencia que comienza en su región V y extendiéndose en la dirección de su región J asociada (a la que se hace referencia en el presente documento como “lectura V” (306)). La región de solapamiento (308) puede o no englobar la región NDN (315) como se muestra en la Fig. 3A. La región de solapamiento (308) puede estar completamente en la región J, completamente en la región NDN, completamente en la región V, o puede englobar la frontera entre la región J-región NDN o la frontera entre la región V-región NDN, o ambas de dichas fronteras (como se ilustra en la Fig. 3A). Normalmente, dichas lecturas de secuencia se generan extendiendo cebadores de secuenciación, por ejemplo, (302) y (310) en la Fig. 3A, con una polimerasa en una reacción de síntesis por secuenciación, por ejemplo, Metzger, Nature Reviews Genetics, 11: 31-46 (2010); Fuller et al, Nature Biotechnology, 27: 1013-1023 (2009). Los sitios de unión para los cebadores (302) y (310) están predeterminados, de manera que pueden proporcionar un punto de partida o un punto de anclaje para el alineamiento inicial y el análisis de las lecturas de secuencia. En una realización, una lectura C se posiciona de manera que englobe la región D y/o DND de la cadena de TCRp e IgH e incluye una parte de la región V adyacente, por ejemplo, como se ilustra en las Fig. 3A y 3B. En un aspecto, el solapamiento de la lectura V y la lectura C de la región V se utiliza para alinear las lecturas entre ellas. En otras realizaciones, dicho alineamiento de lecturas de secuencia no es necesario, por ejemplo, con cadenas TCRp, de manera que una lectura V solo puede ser lo suficientemente larga para identificar la región V particular de un clonotipo. Este último aspecto se ilustra en la Fig. 3B. La lectura de secuencia (330) se utiliza para identificar una región V, con o sin solapamiento con otra lectura de secuencia, y otra lectura de secuencia (332) atraviesa la región NDN y se utiliza para determinar la secuencia de la misma. La parte (334) de la lectura de secuencia (332) que se extiende en la región V se utiliza para asociar la información de secuencia de la lectura de secuencia (332) con la de la lectura de secuencia (330) para determinar un clonotipo. Para algunos métodos de secuenciación, dichas estrategias base-por -base como el método de secuenciación Solexa, el tiempo de ejecución de secuenciación y los costes de reactivo se reducen minimizando el número de ciclos de secuenciación en un análisis. Opcionalmente, como se ilustra en la Fig. 3A, el amplicón (300) se produce con un marcador de muestra (312) para distinguir entre clonotipos que se originan de diferentes muestras biológicas, por ejemplo, diferentes pacientes. El marcador de muestra (312) se puede identificar hibridando un cebador a la región de unión al cebador (316) y extendiéndola (314) para producir una lectura de secuencia a través del marcador (312), del cual se codifica el marcador de muestra (312).

La cadena IgH es más desafiante para analizar que la cadena TCRp debido al menos a dos factores: i) la presencia de mutaciones somáticas hace que el mapeo o alineamiento sea más difícil, y ii) la región NDN es mayor, de manera que a menudo no es posible mapear una parte del segmento V en la lectura C. En un aspecto de la invención, este problema se supera utilizando una pluralidad de conjuntos de cebadores para generar las lecturas V, que se localizan en diferentes localizaciones a lo largo de la región V, preferentemente de manera que los sitios de unión del cebador no se solapen y se separen espacialmente, y con al menos un sitio de unión al cebador adyacente a la región NDN, por ejemplo, en una realización de 5 a 50 bases de la unión V-NDN, o en otra realización de 10 a 50 bases de la unión V-NDN. La redundancia de una pluralidad de conjuntos de cebadores minimiza el riesgo de fallos en la detección de un clonotipo debido a un fallo de uno o dos cebadores que tengan sus sitios de unión afectados por mutaciones somáticas. Además, la presencia de al menos un sitio de unión al cebador adyacente a la región NDN hace más probable que una lectura V se solape con la lectura C y, por lo tanto, extienda eficazmente la longitud de la lectura C. Esto permite la generación de una secuencia continua que abarca todos los tamaños de regiones NDN y que también se puede mapear sustancialmente las regiones V y j completas de ambos lados de la región NDN. Las realizaciones para llevar a cabo dicho esquema se ilustran en las Fig. 4A y 4D. En la Fig. 4A, se secuencia una muestra que comprende cadenas IgH (400) generando una pluralidad de amplicones para cada cadena amplificando las cadenas con un único conjunto de cebadores de la región J (401) y una pluralidad (se muestran tres) de conjuntos de cebadores (404, 406, 408) de la región V(402) para producir una pluralidad de amplicones anidados (por ejemplo, 410, 412, 414) que comprenden la misma región n Dn y que tienen diferentes longitudes que engloban sucesivamente partes mayores (411, 413, 415) de la región V(402). Los miembros de un conjunto anidado se pueden agrupar juntos después de la secuenciación anotando la identificación (o identidad sustancial) de sus regiones NDN, J y/o C respectivas, permitiendo de esta manera la reconstrucción de un segmento V(D)J más largo que sería el caso de otra manera de una plataforma de secuenciación con una longitud de lectura y/o calidad de secuencia limitadas. En una realización, la pluralidad de conjuntos de cebador puede ser un número en el intervalo de desde 2 a 5. En otra realización la pluralidad es 2-3; y en otra realización más la pluralidad es 3. Las concentraciones y posiciones de los cebadores en una pluralidad pueden variar ampliamente. Las concentraciones de cebadores de la región V puede ser o no la misma. En una realización, el cebador más cercano de la región NDN tiene una concentración más alta que los otros cebadores de la pluralidad, por ejemplo, para asegurar que los amplicones que contienen la región NDN estén representados en el amplicón resultante. En una realización particular cuando se emplea una pluralidad de tres cebadores, se utiliza una relación de concentración de 60:20:20. Se pueden utilizar uno o más cebadores (por ejemplo 435 y 437 en la Fig. 4D) adyacentes a la región NDN (444) para generar una o más lecturas de secuencia (por ejemplo , 434 y 436) que se solapen con la lectura de secuencia (442) generada por el cebador (432) de la región J, mejorando de esa manera la calidad de las determinaciones de bases en la región de solapamiento (440). Las lecturas de secuencia de una pluralidad de cebadores pueden solaparse o no con el sitio de unión al cebador adyacente corriente abajo y/o la lectura de secuencia adyacente corriente abajo. En una realización, las lecturas de secuencia proximales a la región NDN (por ejemplo, 436 y 438) se pueden utilizar para identificar la región V particular asociada con el clonotipo. Dicha pluralidad de cebadores reduce la probabilidad de que falle la amplificación o sea incompleta en el caso de que uno de los sitios de unión al cebador esté hiper mutado durante el desarrollo de la inmunoglobulina. Esto también aumenta la probabilidad de que la diversidad introducida por la hjpermutación de la región V sea capturada en una secuencia de clonotipo. Se puede llevar a cabo una PCR secundaria para preparar amplicones anidados por secuenciación, por ejemplo, amplificando con los cebadores P5 (401) y P7 (404, 406, 408) como se ilustra para producir amplicones (420, 422, y 424), que pueden distribuirse como moléculas sencillas en una superficie sólida, cuando se amplifican adicionalmente por una PCR puente, o técnica similar.

La determinación de bases en las regiones NDN (particularmente de las cadenas de IgH) se puede mejorar utilizando el codón estructural de las regiones J y V flanqueantes, como se ilustra en la Fig. 4E. (Como se utiliza en el presente documento, “codón estructural” significa los codones de la fase de lectura natural de segmentos de transcripciones TCR o BCR o genes fuera de las regiones NDN, por ejemplo, la región V, la región J, o similares.). En esta, el amplicón (450), que es una vista agradada del amplicón de la Fig. 4B, se muestra junto con las posiciones relativas de la lectura C (442) y la lectura V adyacente (434) encima y los codones estructurales (452 y 454) de la región V (430) y la región J (446), respectivamente, debajo. De acuerdo con este aspecto de la invención, después de que los codones estructurales (452 y 454) se identifiquen por alineamiento convencional de las secuencias de referencia V y J, las bases de la región NDN (456) se determinan (o identifican) base a base moviéndose desde la región J (446) hacia la región V (430) y en la dirección opuesta desde la región V (430) hacia la región J (446) utilizando las lecturas (434) y (442). En condiciones biológicas normales, solamente las secuencias TCR recombinadas o las secuencias de IgH que tienen codones en fase desde la región V a través de la región NDN y hasta la región J se expresan como proteínas. Es decir, de las variantes generadas somáticamente solo se expresan las que cuyas fases de codón de la región J y región V están en fase entre ellas y se mantienen en fase a través de la región NDN. (Aquí las fases correctas de las regiones V y J se determinan a partir de secuencias de referencia). Si se identifica una secuencia fuera de la fase basándose en una o más determinaciones de base de baja calidad, el clonotipo correspondiente se marca para su reevaluación o como una anomalía potencial relacionada con una enfermedad. Si la secuencia identificada está en fase y se basa en determinaciones de bases de alta calidad, entonces hay mayor confianza en que el clonotipo correspondiente se haya determinado correctamente. En consecuencia, en un aspecto, la invención incluye un método de determinación de clonotipos basados en V(D)J de lecturas de secuencia bidireccionales que comprenden las etapas de: (a) generar al menos una lectura de secuencia de la región J que comienza en una región J y se extiende en una región NDN y al menos una lectura de secuencia V que comienza en las regiones V y se extiende a través de la región NDN de manera que al menos una lectura de secuencia de la región V comienza en las regiones V y se extiende a través de la región NDN de manera que la lectura de secuencia de la región J y la lectura de secuencia de la región V se solapan en una región de solapamiento, y la región J y la región V tienen cada una un codón estructural; (b) determinación de si el codón estructural de la región J que se extiende hasta la región NDN está en fase con el codón estructural de la región V que se extiende hasta la región NDN. En una realización adicional, la etapa de generación incluye la generación de al menos una lectura de secuencia de la región V que comienza en la región V y se extiende a través de la región NDN hasta la región J, de manera que la lectura de secuencia de la región J y la lectura de secuencia de la región V se solapan en una región de solapamiento.

En algunas realizaciones, los clonotipos basados en IgH que se han sometido a hipermutación somática se pueden determinar de la siguiente manera. Una mutación somática se define como una base secuenciada que es diferente de la base correspondiente de una base de referencia (de un segmento relevante, habitualmente V, J o C) y que está presente en un número estadísticamente significativo de lecturas. En una realización, se pueden utilizar lecturas C para encontrar mutaciones somáticas con respecto al segmento J mapeado y al igual las lecturas V para el segmento V. Solamente se utilizan partes de las lecturas C y V que estén mapeadas directamente respecto a los segmentos J o V o que están dentro de la extensión del clonotipo hasta la frontera con ND. De esta manera, se evita la región NDN y no se utiliza la misma 'información de secuencia' para la búsqueda de la mutación que se utilizó previamente para la determinación del clonotipo (para evitar la clasificación errónea como mutaciones, los nucleótidos que están realmente solo recombinados de manera diferente en las regiones NDN). Para cada tipo de segmento, el segmento mapeado (alelo principal) se utiliza como un armazón y todas las lecturas se considera que se han mapeado respecto a este alelo durante la fase de lectura del mapeo. Cada posición de las secuencias de referencia en las que al menos una lectura se ha mapeado, se analiza en cuanto a mutaciones somáticas. En una realización, los criterios para aceptar una base no referenciada como una mutación válida incluye lo siguiente: 1) al menos hay N lecturas con la mutación de base determinada, 2) una lectura con una fracción N/M determinada (donde M es el número total de lecturas mapeadas en esta posición de base) y 3) un corte estadístico basado en la distribución binómica, la puntación Q media de las N lecturas en la base de la mutación así como el número de lecturas (M-N) con una no mutación de la base. Preferentemente, los parámetros anteriores se seleccionan de manera que la tasa de falsos descubrimientos de mutaciones por clonotipo es menor de 1 en 1000, y más preferentemente, menor de 1 en 10000.

Los métodos basados en marcado de secuencias son una alternativa a las estrategias anteriores para la construcción de clonotipos de los datos de secuencia. Los datos de secuencia comprenden normalmente una gran colección de lecturas de secuencia, es decir, secuencias de determinación de bases y puntuaciones de calidad asociadas, a partir de un secuenciador de ADN utilizado para analizar las moléculas inmunitarias. Un desafío clave en la construcción de perfiles de clonotipo es distinguir rápida y precisamente las lecturas de secuencia que contienen diferencias genuinas de las que contienen errores de fuentes no biológicas, tales como las etapas de extracción, secuenciación química, amplificación química, o similares. En una estrategia para la generación de clonotipos, se puede unir una única secuencia marcadora a cada clonotipo en una muestra para ayudar a determinar si las lecturas de secuencia de dichos conjugados se derivan del mismo clonotipo original antes de la amplificación o secuenciación. Las secuencias marcadoras se pueden unir a las moléculas de ácido nucleico combinadas somáticamente para formar conjugados de moléculas-marcador en los que cada ácido nucleico recombinado de dicho conjugado tiene una única secuencia marcadora. Habitualmente, dicha unión se hace después de extraer las moléculas de ácido nucleico de una muestra que contienen células T y/o células B. Preferentemente, dichas secuencias marcadoras únicas se diferencian mucho entre ellas como se determina por mediciones de distancia convencionales para las secuencias tales como, la distancia de Hamming, o similares; por lo tanto, las copias de cada secuencia marcadora en los conjugados molécula-marcador se mantienen más cerca de su secuencia marcadora ancestral que la de cualquier otra secuencia marcadora única, incluso con una alta tasa de errores de secuenciación o amplificación introducidos por las etapas de la invención. Por ejemplo, si se emplean secuencias marcadoras 16-meros y cada uno de dichos marcadores en una conjunto de clonotipos tiene una distancia de Hamming de al menos el cincuenta por ciento, de ocho nucleótidos, de cualquier otra secuencia marcadora en los clonotipos, entonces al menos serían necesarios ocho errores de secuenciación o amplificación para transformar una de dichos marcadores en otro para una mala lectura de una secuencia marcadora (y el agrupamiento incorrecto de una lectura de secuencia de un clonotipo con la secuencia marcadora errónea). En una realización las secuencias marcadoras se seleccionan de tal manera que después de la unión con moléculas de ácido nucleico recombinadas para formar conjugados molécula-marcador, la distancia de Hamming entre los marcadores de los conjugados molécula -marcador sea un número de al menos el veinticinco por ciento de la longitud total de dichas secuencias marcadoras (es decir, cada secuencia marcadora se diferencia de secuencia de cada uno de dichos marcadores en al menos un 25 por ciento de sus nucleótidos); en otra realización, la distancia de Hamming entre dichas secuencias marcadoras es un número al menos un 50 por ciento de la longitud total de dichas secuencias marcadoras.

En un aspecto, la estrategia anterior se implementa por las siguientes etapas: (a) obtener una muestra de un individuo que comprende células T y/o células B; (b) unir las secuencias marcadoras a las moléculas de ácidos nucleicos recombinados de genes del receptor de célula T o genes de inmunoglobulinas de células T y/o células B para formar conjugados de molécula-marcador, en el que sustancialmente cada molécula del conjugado moléculamarcador tiene una única secuencia marcadora; (c) amplificar los conjugados molécula-marcador; (d) secuenciación de los conjugados molécula-marcador; y (e) alinear las lecturas de secuencia de tipo secuencias marcadoras para determinar las lecturas de secuencia que se corresponden con los mismos clonotipos del repertorio. Las muestras que contienen células B o células T se obtienen utilizando técnicas convencionales, como se describe de manera más completa posteriormente. En la etapa de unión de las secuencias marcadoras, las secuencias marcadoras preferentemente no son solo únicas sino también son suficientemente diferentes entre ellas para que la probabilidad de que incluso un gran número de errores de secuenciación o amplificación que transforman una secuencia marcadora en otra sería cercano al cero. Después de unir las secuencias marcadoras, es necesaria la amplificación del conjugado molécula-marcador en casi todas las tecnologías; sin embargo, cuando se emplean tecnologías de secuenciación de molécula única la etapa de amplificación es opcional. Las tecnologías de secuenciación de molécula única incluyen, pero no se limitan a. secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT); secuenciación en nanoporos, o similares, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 7.313.308; 8.153.375; 7.907.800; 7.960.116; 8.137.569; Manrao et al, Nature Biotechnology, 4(8): 2685-2693 (2012); y similares.

En otro aspecto, la invención incluye un método para la determinación del número de linfocitos en una muestra por recuento de secuencias marcadoras únicas. Incluso con las secuencias marcadoras, los clonotipos de los genes de TCRp o IgH particularmente los que incluyen las regiones V(D)J, proporcionan un marcador único por linfocito y sus clones. Cuando los ácidos nucleicos recombinados se obtienen del ADN genómico, entonces el recuento de linfocitos en una muestra as puede estimar por el número de clonotipos únicos que se cuentan después de la secuenciación. Esta estrategia se desmorona cuando haya poblaciones clónicas significativas de linfocitos idénticos asociados con el mismo clonotipo. El uso de secuencias marcadoras supera esta deficiencia y es especialmente útil para proporcionar recuentos de linfocitos que padecen muchos trastornos linfoides, tales como linfomas o leucemias. De acuerdo con un aspecto de la invención, las secuencias marcadoras se pueden utilizar para obtener un recuento absoluto de linfocitos en una muestra independientemente de si hay un clon grande dominante tal como en la leucemia. Dicho método se puede implementar con las etapas (a) obtención de una muestra de un individuo que comprende linfocitos; (b) unir las secuencias marcadoras a moléculas de ácidos nucleicos recombinados de genes del receptor de células T o de genes de inmunoglobulinas de los linfocitos para formar conjugados moléculamarcador, en los que sustancialmente cada molécula de los conjugados molécula-marcador tiene una única secuencia marcadora; (c) amplificar los conjugados de molécula-marcador; (d) secuenciación de los conjugados de molécula-marcador; y (e) hacer el recuento del número de distintas secuencias marcadoras para determinar el número de linfocitos en la muestra.

En algunas realizaciones, las secuencias marcadoras se unen a moléculas de ácido nucleico recombinado de una muestra marcado por muestreo, por ejemplo, como se desvela por Brenner et al, Patente de EE. UU. 5.846.719; Brenner et al, Patente de EE. u U. 7.537.897; Macevicz, Publicación de patente internacional WO 2005/111242; y similares. En el marcado por muestreo, los polinucleótidos de una población que se va a marcar (o marcador de manera única) se utiliza para el muestreo (por enganche, unión, o similares) de secuencias marcadoras de una población mucho mayor. Es decir, si la población de polinucleótidos tiene K miembros (incluidos los replicados del mismo nucleótido) y la población de secuencias marcadoras tiene N miembros, entonces N>>K. En una realización, el tamaño de una población de secuencias marcadoras que se utilizan con la invención es al menos de 10 veces el tamaño de la población de clonotipos en una muestra; en otra realización, el tamaño de una población de secuencias marcadoras que se utiliza en la invención es al menos 100 veces el tamaño de la población de clonotipos en una muestra; y en otra realización, el tamaño de una población de secuencias marcadoras que se utiliza con la invención es al menos de 1000 veces el tamaño de la población de clonotipos en una muestra. En otras realizaciones, el tamaño de la población de secuencia se selecciona de manera que sustancialmente cada clonotipo de la muestra tendrá una única secuencia marcadora, cuando dichos clonotipos se combinan con dicha población de secuencias marcadoras, por ejemplo, en una reacción de unión, tal como una reacción de ligadura, reacción de amplificación, o similares. En algunas realizaciones, sustancialmente cada clonotipo significa que al menos un 90 por ciento de dichos clonotipos tendrá una única secuencia marcadora; en otras realizaciones, sustancialmente cada clonotipo significa que al menos un 99 por ciento de dichos clonotipos tendrá una única secuencia marcadora; en otras realizaciones, sustancialmente cada clonotipo significa que al menos un 99,9 por ciento de dichos clonotipos tendrá una única secuencia marcadora. En muchas muestras de tejido o biopsias, el número de células T o células B puede ser hasta de 1 millón de células; por lo tanto, en algunas realizaciones de la invención que emplean dichas muestras, el número de secuencias marcadoras únicas que se emplean en el marcado por muestreo es al menos de 108 o en otras realizaciones al menos del 109.

En dichas realizaciones, en las que se marcan por muestreo hasta 1 millón de clonotipos, se pueden producir grandes conjuntos de secuencias marcadoras por síntesis combinatoria haciendo reaccionar una mezcla de los cuatro nucleótidos precursores en cada etapa de adición de una reacción de síntesis, por ejemplo, como se desvela en Church, Patente de EE. UU. 5.149.625. El resultado es un conjunto de secuencias marcadoras que tienen una estructura de “NiN²...Nk” donde cada Ni=A, C, G o T y k es el número de nucleótidos en los marcadores. El número de secuencias de marcadores en un conjunto de secuencias marcadoras producidas por dicha síntesis combinatoria es de 4k Por lo tanto, un conjunto de dichas secuencias marcadoras con K al menos de 14, o k en el intervalo de aproximadamente 14 a 18, es apropiado para unir las secuencias marcadoras a una población de 106 miembros de moléculas marcando por muestreo.

Se puede utilizar una variedad de diferentes reacciones de unión para unir marcadores únicos a sustancialmente cada clonotipo de una muestra. En una realización, dicha unión se consigue combinando una muestra que contienen moléculas de ácido nucleico recombinado (que, a su vez, comprende secuencias de clonotipo) con una población o biblioteca de secuencias marcadoras de manera que los miembros de las dos poblaciones de moléculas se pueden combinar aleatoriamente y llegar a asociarse o unirse, por ejemplo, covalentemente. En dichas reacciones de unión al marcador, las secuencias de clonotipo comprenden polinucleótidos de cadena sencilla o doble lineales y las secuencias marcadoras se llevan a cabo por reactivos tales como cebadores de amplificación, tales como cebadores de PCR, adaptadores de ligadura, sondas circularizables, plásmidos y similares. Varios de dichos reactivos capaces de poblaciones que tienen secuencias marcadoras se desvelan en Macevicz, Patente de EE. UU. 8.137.936; Faham et al, Patente de EE. UU. 7.862.999; Landegren et al, Patente de EE. UU. 8.053.188; Unrau y Deugau, Gene, 145: 163-169 (1994); y Church, Patente de EE. UU. 5.149.625.

Análisis del repertorio de TCRp

En este ejemplo, se analizaron las cadenas TCRp. El análisis incluye la amplificación, secuenciación, y análisis de las secuencias de TCRp. Un cebador es complementario a una secuencia común en Cp1 y Cp2, y hay 34 cebadores V capaces de amplificar los 48 segmentos V. Cp1 o Cp2 se diferencian entre ellos en la posición 10 y 14 de la unión J/C. El cebador para los extremos Cp1 y Cp2 en la posición de 16 pb y no tiene preferencia para Cp1 o Cp2. Los cebadores 34 V se modifican de un conjunto original de cebadores desvelado en Van Dongen et al, publicación de patente de EE. UU. 2006/0234234. Los cebadores modificados se desvelan en Faham et al, publicación de patente de EE. UU. 2010/0151471.

Se utiliza el Analizador de Genoma Illumina para secuenciar el amplicón producido por los cebadores anteriores. Se lleva a cabo una amplificación en dos estadios sobre las transcripciones de ARN mensajero (200), como se ilustra en las Fig. 2A-2B, el primer estadio que emplea los cebadores anteriores y un segundo estadio para añadir cebadores comunes para la amplificación puente y la secuenciación. Como se muestra en la FIG. 2A, se lleva a cabo una PCR primaria utilizando en un lado un cebador de 20 pb (202) cuyo extremo 3' está a 16 bases de la unión J/C (204) y que es perfectamente complementario a Cp1 (203) y los dos alelos de Cp2. En la región V (206) de las transcripciones de ARN (200), se proporciona un conjunto de cebadores (212) que contiene secuencias de cebador complementarias de las diferentes secuencias de la región V (34 en una realización). Los cebadores del conjunto (212) también contienen una cola no complementaria (214) que produce el amplicón (216) que tiene un sitio de unión al cebador (218) específicos de los cebadores P7 (220). Después de una PCR múltiple convencional, se formó el amplicón (216) que contiene la parte altamente diversa de la región J(D)V (206, 208, y 210) de las transcripciones de ARNm y los sitios de unión al cebador comunes (203 y 218) para una amplificación secundaria para añadir una secuencia marcadora (221) y los cebadores (220 y 222) para la formación de un agrupamiento por PCR puente. En la PCR secundaria sobre el mismo lado de la matriz se utiliza un cebador (222 en la Fig. 2B y al a que se hace referencia en el presente documento como “C10-17-P5”) que tiene en su extremo 3' la secuencia de las 10 bases más cercanas a la unión J/C, seguido por 17 pb con la secuencia de las posiciones 15-31 de la unión J/C, seguido por la secuencia P5 (224), que tiene un papel en la formación de agrupamiento por la PCR puente en la secuenciación por Solexa. (Cuando el cebador C10-17-P5 (222) se hibrida a la matriz generada por la primera PCR, se crea un bucle de 4 pb (posición 11-14) en la matriz, ya que el cebador se hibrida a la secuencia de las 10 bases más cercanas a la unión J/C y las bases en las posiciones 15-31 de la unión J/C. El bucle de las posiciones 11-14 elimina la amplificación diferencial de matrices que tienen Cp1 o Cp2. La secuenciación se hace entonces con un cebador complementario a la secuencia de las 10 bases más cercanas a la unión J/C y las bases en las posiciones 15-31 de la unión J/C (este cebador se denomina C'). El cebador C10-17-P5 puede purificarse por HPLC con el fin de asegurar que todo el material amplificado tiene extremos intactos y se pueden utilizar eficazmente en la formación del agrupamiento).

En la FIG. 2A, la longitud de la protuberancia sobre los cebadores V (212) tiene preferentemente 13 pb. La PCR primaria se ayuda con una protuberancia más corta (214). De manera alternativa, por seguridad de la PC secundaria, la protuberancia en el cebador V se utiliza en la PCR primaria a condición de que sea posible debido a que la segunda PCR se imprima a partir de esta secuencia. Se investigó el tamaño mínimo de la protuberancia (214) que apoya una PCR secundaria eficaz. Se hicieron dos series de cebadores V (para dos segmentos V diferentes) con tamaños de protuberancia de 10 a 30 con etapas de 2 pb. Utilizando las secuencias sintéticas apropiadas, se llevó a cabo la primera PCR con cada uno de los cebadores en las series y se llevó a cabo la electroforesis en gel para demostrar que todo estaba amplificado.

Como se ilustra en la FIG. 2A, la PCR primaria utiliza 34 cebadores V diferentes (212) que se hibridan a la región V (206) de las matrices de ARN (200) y contenían una protuberancia de 14 pb común en la cola 5'. Las 14 pb es la secuencia parcial de uno de los cebadores de secuenciación Illumina (denominados el cebador de la Lectura 2). El cebador de amplificación secundario (220) en el mismo lado incluye la secuencia P7, un marcador (221), y una secuencia de cebador de la Lectura 2 (223) (este cebador se denomina Lectura2_marcadorX_P7). La secuencia P7 se utiliza para la formación del agrupamiento. El cebador de Lectura 2 y su complemento se utilizan para la secuenciación del segmento V y el marcador, respectivamente. Se crea un conjunto de 96 de estos cebadores con marcadores numerados de 1 a 96 (véase posteriormente). Estos cebadores se purifican por HPLC con el fin de asegurar que todo el material amplificado tiene los extremos intactos y se puede utilizar eficazmente en la formación de agrupamientos.

Como se ha mencionado anteriormente, el cebador de segundo estadio, C-10-17-P5 (222, de la FIG. 2B) tiene homología interrumpida con la matriz generada en la PCR del primer estadio. La eficacia de amplificación que utiliza este cebador se había validado. Un cebador alternativo al C-10-17-P5, denominado CsegP5, tiene una homología perfecta con el cebador C de primer estadio y una cola 5' que tiene el P5. La eficacia de utilizar el C-10-17-P5 y CsegP5 en las matrices de PCR de primer estadio se comparó llevando a cabo un PCR en tiempo real. En varias repeticiones, se descubrió que la PCR utilizando el cebador C-10-17-P5 tenía poca o ninguna diferencia de eficacia en comparación con la PCR que utiliza el cebador CsegP5.

El amplicón (230) que resulta de la amplificación de 2 estadios ilustrados en las Fig. 2A- 2C tiene la estructura que se utiliza normalmente en el secuenciador Illumina como se muestra en la FIG. 2C. Se utilizaron dos cebadores que se hibridan con la mayor parte de la molécula, los cebadores P5 y P7 Illumina para la amplificación de fase sólida de la molécula (formación de agrupamiento). Se hicieron tres lecturas de secuencia por molécula. La primera lectura de 100 pb se hace con el cebador C', que tiene una temperatura de fusión que es apropiada para el procedimiento de secuenciación Illumina. La segunda lectura tiene 6 pb de largo solamente y tiene el fin solamente de identificación de la secuencia marcadora. Se genera utilizando un cebador marcador proporcionado por el fabricante (Illumina). La lectura final es el cebador de Lectura 2, también proporcionado por el fabricante (Illumina). Utilizando este cebador, se genera una lectura de 100 pb en el segmento V comenzando con la 1a secuencia del cebador V de PCR.

Aunque la presente invención se ha descrito en referencia a varias realizaciones ejemplares particulares, los expertos en la técnica reconocerán que se pueden hacer muchos cambios. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones. La presente invención es aplicable a una variedad de implementaciones de sensor y otras materias objeto, además de las expuestas anteriormente.

Definiciones

A menos de que se defina específicamente otra cosa, los términos y símbolos de la química de ácidos nucleicos, bioquímica genética y biología molecular que se utilizan en el presente documento siguen todos los tratados y textos convencionales en el campo, por ejemplo, Kornberg y Baker, DNA Replication, Segunda Edición (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Segunda Edición (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan y Read, Human Molecular Genetics, Segunda Edición (Wiley-Liss, New York, 1999); Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, 6a edición (Saunders, 2007).

“Alineamiento” significa un método de comparación una secuencia de ensayo, tal como una lectura de secuencia, con una o más secuencias de referencia para determinar que secuencia de referencia o que parte de una secuencia de referencia está basada más estrechamente en alguna medición de la distancia de secuencia. Un método ejemplar de alineamiento de secuencias de nucleótidos es el algoritmo de Smith-Waterman. Las mediciones de la distancia pueden incluir la distancia de Hamming, la distancia de Levenshtein, o similares. Las mediciones de la distancia pueden incluir un componente relacionado con valores de calidad de nucleótidos de las secuencias que se van a comparar.

“Amplicón” significa el producto de la reacción de amplificación de un polinucleótido; es decir, una población clónica de polinucleótidos, que puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, que se replican a partir de una o más secuencias de partida. La una o más secuencias de partida pueden ser una o más copias de la misma secuencia, o pueden ser una mezcla de diferentes secuencias. Preferentemente, los amplicones se forman por amplificación de secuencias de partida sencillas. Laos amplicones se pueden producir por una variedad de reacciones de amplificación cuyos productos comprenden replicados de uno o más ácidos nucleicos de partida, o diana. En un aspecto, las reacciones de amplificación producen amplicones son “dirigidos por la matriz” en los que el emparejamiento de bases de los reactantes, sean nucleótidos u oligonucleótidos, tienen complementos en un polinucleótido matriz que son necesarios para la creación de productos de reacción. En un aspecto, las reacciones dirigidas por matriz son extensiones de cebador con una polimerasa de ácido nucleico o ligaduras de oligonucleótidos con una ligasa de ácido nucleico. Dichas reacciones incluyen, pero no se limitan a, reacciones en cadena de polimerasa (PCR), reacciones de polimerasa lineal, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NAS-BAs), amplificaciones de ciclo rotatorio, y similares, desveladas en las siguientes referencias: Mullis et al, Patentes de EE. UU. 4,683,195; 4,965,188; 4,683,202; 4,800,159 (PCR); Gelfand et al, Patente de EE. UU.

5.210.015 (PCR en tiempo real con sondas "taqman"); Wittwer et al, Patente de EE. UU. 6.174.670; Kacian et al, Patente de EE. UU. 5.399.491 ("NASBA"); Lizardi, Patente de EE. UU. 5.854.033; Aono et al, Publicación de patente japonesa JP 4-262799 (amplificaciones circulares rotativos); y similares. En un aspecto, los amplicones producidos en los métodos de la invención se producen por PCR. Una reacción de amplificación puede ser una amplificación en “tiempo real” si está disponible una detección química que permita que un producto de reacción se mida como los progresos de la reacción de amplificación, por ejemplo, la “PCR en tiempo real” descrito posteriormente, o la “NASBA en tiempo real” como se describe en Leone et al, Nucleic Acids Research, 26: 2150-2155 (1998), y referencias similares. Como se utiliza en el presente documento, el término “amplificación “significa llevar a cabo una reacción de amplificación. Una “mezcla de reacción” significa una solución que contienen todos los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción, que puede incluir, pero no se limita am agentes tampón para mantener el pH a un nivel seleccionado durante una reacción, sales, cofactores, neutralizantes y similares.

“Clonotipo” significa una secuencia de nucleótidos recombinado de una célula T o células B que codifica un receptor de célula T (TCR) o receptor de células B (BCR), o una parte del mismo. En un aspecto, una colección de todos los clonotipos distintos de una población de linfocitos de un individuo es un repertorio de dicha población, por ejemplo, Arstila et al, Science, 286: 958-961 (1999); Yassai et al, Immunogenetics, 61: 493-502 (2009); Kedzierska et al, Mol. Immunol., 45(3): 607-618 (2008); y similares. Como se utiliza en el presente documento, “perfil de clonotipo” o “perfil de repertorio”, es una tabulación de clonotipos de una muestra de células T y/o células B (tal como una muestra de sangre periférica que contiene dichas células) que incluye sustancialmente todos los clonotipos del repertorio y sus abundancias relativas. “Perfil de clonotipo”, “perfil de repertorio”, y “repertorio” se utilizan en el presente documento de manera intercambiable. (Es decir, el término “repertorio”, como se expone de manera más completa posteriormente, significa un repertorio medido a partir de una muestra de linfocitos). En un aspecto de la invención, los clonotipos comprenden partes de una cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) o una cadena TCRp. En otros aspectos de la invención los clonotipos se pueden basar en otras moléculas recombinadas, tales como cadenas ligeras de inmunoglobulina o cadenas TCRa, o partes de las mismas.

“Regiones determinantes de complementariedad” (CDR) significa regiones de una inmunoglobulina (es decir, un anticuerpo) o receptores de células T en el que la molécula complementa una conformación de antígeno, determinando de esta manera la especificidad de la molécula y poniéndola en contacto con un antígeno específico. Los receptores de células T y las inmunoglobulinas tienen cada uno tres CDR: La CDR1 y la CDR2 se encuentra en el dominio variable (V), y la CDR3 incluye algunas de V, todos los dominios diversos (D9 (solo cadenas pesadas) y unión (J) y algunos constantes (C).

“Porcentaje homologo”, “porcentaje idéntico”, o términos similares utilizados en referencia a la comparación de una secuencia de referencia y otra secuencia (“secuencia de comparación”) significa que en un alineamiento óptimo entre dos secuencias, la secuencia de comparación es idéntica a la secuencia de referencia en un número de posiciones de subunidades equivalente al porcentaje indicado, siendo las subunidades nucleótidos para comparaciones de polinucleótidos o aminoácidos para las comparaciones de polipéptidos. Como se utiliza en el presente documento, un “alineamiento óptimo” de secuencias que se van a comprar es el que maximiza las coincidencias entre subunidades y minimiza el número de huecos empleados en la construcción de un alineamiento. El porcentaje de identidades se puede determinar con implementaciones de algoritmos disponibles en el mercado, tal como se describe en Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970) (programa "GAP" del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, Genetics Computer Group, Madison, WI), o similares. Otros paquetes de software de la técnica para la construcción de alineamientos y calcular el porcentaje de identidad u otras mediciones de similitud incluyen el programa “BestFit”, basado en el algoritmo de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981) (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI). En otras palabras, por ejemplo, para obtener una secuencia de nucleótidos, o un número de nucleótidos hasta un cinco porciento del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia.

“Sistema de flujo” significa cualquier instrumento o dispositivo que (i) es capaz de obligar a que las partículas o células se muevan en una ruta lineal en una corriente de fluido o a través de una o más estaciones de detección que recogen datos multiparamétricos relacionados con las partículas o células y (ii) es capaz de enumerar o clasificar dichas partículas basándose en los datos multiparamétricos. Los sistemas de flujo tienen una amplia variedad de formas y utilizan una amplia variedad de técnicas para conseguir dichas funciones, como se ejemplifica en las siguientes referencias: Shapiro, Practical Flow Cytometry, Cuarta Edición (Wiley-Liss, 2003), Bonner et al, Rev Sci Instruments, 43404 (1972), Huh et al, Physiol Meas , 26 R73-98 (2005), Ateya et al, Anal Bioanal Chem, 391 1485­ 1498 (2008), Bohm et al, Patente de EE. UU. 7.157.274; Wang et al, Patente de EE. UU. 7.068.874, y similares. Los sistemas de flujo pueden comprender sistemas de fluídica que tengan componentes en los que la corriente de muestra líquida se inserte en una corriente de fluido envolvente de manera que las partículas o células de la muestra de fluido se obligan a moverse en una ruta colineal, que puede tener lugar en una cubeta, otra cámara que sirve como estación de detección, o en una o una boquilla u otra estructura para crear una corriente en chorro de aire, que entonces se puede manipular eléctricamente, por ejemplo, como con los instrumentos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los sistemas de flujo, citómetros de flujo, y clasificadores de flujo y las aplicaciones comunes de los mismos se desvelan en una o más de las siguientes referencias: Robinson et al (Editores) Current Protocols in Cytometry (John Wiley & Sons, 2007); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Cuarta Edición (Wiley-Liss, 2003); Owens et al (Editores), Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice: Quality Assurance for Quantitative Immunophenotyping (Wiley-Liss, 1994); Ormerod (Editor) Flow Cytometry: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); y similares.

“Reacción en cadena de la polimerasa” o “PCR” significa una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas por la extensión simultanea del cebador de cadenas de ADN complementarias. En otras palabras, la PCR es una reacción para hacer múltiples copias o replicados de un ácido nucleico diana flanqueado por sitios de unión al cebador, dicha reacción comprende una o más repeticiones de las siguientes etapas: (i) desnaturalización del ácido nucleico diana, (ii) hibridación de los cebadores a los sitios de unión de los cebadores, y (iii) extensión de los cebadores por una polimerasa de ácido nucleico en presencia de trifosfatos de nucleósido. Habitualmente, la reacción se cicla a través de diferentes temperaturas optimizadas para cada etapa en un instrumento ciclador térmico. Las temperaturas, duraciones de cada etapa y tasas de cambio particulares entre las etapas dependen de muchos factores bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se ejemplifica en las referencias: McPherson et al, editores, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach ( iRl Press, Oxford, 1991 y 1995, respectivamente). Por ejemplo, en una PCR convencional que se utiliza una ADN polimerasa Taq, se puede desnaturalizar un ácido nucleico diana de doble cadena una temperatura > 90 °C, se hibridan los cebadores a una temperatura en el intervalo de 50-75 °C, y los cebadores se extienden a una temperatura en el intervalo de 72-78 °C. El término “PCR” engloba formas derivadas de la reacción, incluyendo, pero sin limitares a, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, y similares. Los volúmenes de reacción varían desde unos cientos de nanolitro, por ejemplo 200 nl, a unos cientos de ml, por ejemplo 200 ml. “PCR de trascripción inversa” o “RT-PCR” significa una PCR que está precedida por una reacción de transcripción inversa que convierte un ARN diana en un ADN de cadena sencilla complementaria, que entonces se amplifica, por ejemplo, Tecott et al, Patente de EE. UU. 5.168.038. “PCR en tiempo real” significa una PCR para la que la cantidad de producto de reacción, es decir, el amplicón, se controla según progresa la reacción. Ha y muchas formas de PCR en tiempo real que se diferencia principalmente en los químicos de detección utilizados para controlar el producto de reacción, por ejemplo, Gelfand et al, Patente de EE. UU. 5.210.015 ("taqman"); Wittwer et al, Patentes de EE. UU. 6.174.670 y 6.569.627 (que intercala colorantes); Tyagi et al, Patente de EE. UU. 5.925.517 (balizas moleculares). Los productos químicos de detección para la PCR en tiempo real se revisan en Mackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002). “PCR anidada” significa una PCR en dos etapas en la que el amplicón de una primera PCR se convierte en la muestra de una segunda PCR utilizando un nuevo conjunto de cebadores, al menos uno de los cuales se une en una localización interior del primer amplicón. Como se utiliza en el presente documento, “cebadores iniciales” en referencia a una reacción de amplificación anidada, significa los cebadores utilizados para generar un primer amplicón, y “cebadores secundarios” significa el uno o más cebadores utilizados para generar un segundo amplicón, o amplicón anidado.

“PCR multiplexada” significa una PCR en la que se llevan a cabo simultáneamente múltiples secuencias diana en la misma mezcla de reacción, por ejemplo, Bernard et al, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999) (PCR en tiempo real de dos colores). Habitualmente, se emplean distintos conjuntos de cebadores para cada secuencia que se va a ampliar. Normalmente, el número de secuencias diana en una PCR múltiple está en el intervalo de desde 2 a 50, o desde 2 a 40, o desde 2 a 30. “PCR cuantitativa” significa una PCR diseñada para medir la abundancia de una o más secuencias diana específicas en una muestra o espécimen. La PCR cuantitativa incluyen la cuantificación absoluta y la cuantificación relativa de dichas secuencias diana. Las mediciones cuantitativas se hacen utilizando una o más secuencias de referencia o referencias internas que se pueden ensayar por separado o en conjunto con una secuencia diana. La secuencia de referencia puede ser endógena o exógena a una muestra o espécimen, y en el último caso puede comprender una o más matrices competidoras. Las secuencias de referencia endógena típica incluyen segmentos o transcripciones de los siguientes genes, p-actina, GAPDH, p²-microglobulina, ARN ribosómico, y similares. Las técnicas para la PCR cuantitativa se conocen bien por los expertos habituados en la técnica, como se ejemplifica en las siguientes referencias: Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126 (1999); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman et al, Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020 (1992); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989); y similares.

“Cebador” significa un oligonucleótido, sea natural o sintético que es capaz, al formar un dúplex con una matriz de polinucleótido de actuar como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico y que se extiende desde su extremo 3' a lo largo de la matriz de manera que se forma un dúplex extendido. La extensión de un cebador se lleva a cabo habitualmente con una polimerasa de ácido nucleico, tal como una ARN o ADN polimerasa. La secuencia de nucleótidos añadida en el procedimiento de extensión se determina por la secuencia del polinucleótido matriz. Habitualmente los cebadores se extienden por una ADN polimerasa. Los cebadores habitualmente tienen una longitud en el intervalo de desde 14 a 40 nucleótidos, o en el intervalo de desde 18 a 36 nucleótidos. Los cebadores se emplean en una variedad de reacciones de amplificación nucleica, por ejemplo, reacciones de amplificación lineal utilizando un único cebado, o reacciones en cadena de polimerasa, empleando dos o más cebadores. Las directrices para la selección de longitudes y secuencias de cebadores para aplicaciones particulares se conocen bien por los expertos habituados en la técnica, como se evidencia por las siguientes referencias: Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2a Edición (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003).

“Puntuación de calidad” significa una medición de la probabilidad de que la asignación de una base en una localización de secuencia particular sea correcta. Es bien conocida una variedad de métodos por los expertos habituados en la técnica para calcular las puntuaciones de calidad en circunstancias particulares, tales como, para las bases determinadas como resultado de diferentes químicas de secuenciación, sistema de detección, algoritmos de determinación de bases, etc. En general, los valores de puntuación de calidad se relacionan monótonamente con probabilidad de determinación de bases correcta. Por ejemplo, una puntuación de calidad, o Q, de 10 puede significar que hay un 90 por ciento de oportunidades de que la base se determine correctamente, una Q de 20 puede significar que hay un 99 por ciento de oportunidades de que la base se determine correctamente, y así. Para algunas plataformas de secuenciación, particularmente las que utilizan químicas de secuenciación por síntesis, las puntuaciones de calidad medias disminuyen en función de la longitud de la lectura de secuencia, de manera que las puntuaciones de calidad al principio de una lectura de secuencia son mayores que las del final de una lectura de secuencia, dicha disminución se debe a fenómenos tales como las extensiones incompletas, las extensiones de sostén directo, pérdida de matriz, pérdida de polimerasa, fallos de protección, fallos de desprotección, y similares.

“Repertorio” o “repertorio inmunitario”, significa un conjunto de secuencias de nucleótido recombinadas distintas que codifican los receptores de células T (TCR) o células B (BCR), o fragmentos de las mismas, respectivamente, en una población de linfocitos de un individuo, en las que las secuencias de nucleótidos del conjunto tienen una correspondencia uno a uno con distintos linfocitos o sus subpoblaciones clónicas para sustancialmente todos los linfocitos de la población. En un aspecto, una población de linfocitos de la que se determina un repertorio se toma de una o más muestras de tejido, tal como una o más muestras de sangre. Se hace referencia a una secuencia de nucleótidos miembro de un repertorio como un “clonotipo”. En un aspecto, los clonotipos de un repertorio comprende cualquier segmento de ácido nucleico común a una población de células T o células B que se ha sometido a recombinación somática durante el desarrollo de TCR o BCR, incluyendo las moléculas precursoras normales o aberrantes (por ejemplo, asociadas con cánceres) de las mismas, que incluyen pero no se limitan a cualquiera de las siguientes: una cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) o subconjuntos de la misma (por ejemplo, una región variable de IgH, una región CDR3, o similares), moléculas de IgH incompletas, una cadena ligera de inmunoglobulina o subconjuntos de la misma (por ejemplo, una región variable, una región CDR, o similar), una cadena a de receptor de células T o subconjuntos de la misma, una cadena p de receptor de células T o subconjuntos de la misma (por ejemplo, una región variable, una CDR3, una región V(D)J, o similares), una CDR (que incluye una CDR1, CDR2, o CDR3 , de cualquiera de TCR o BCR, o combinaciones de dichas CDR), regiones V(D)J de cualquier de TCR o BCR, regiones hipermutadas de regiones variables de IgH, o similares. En un aspecto, los segmentos de ácido nucleico que definen los clonotipos de un repertorio se seleccionan de manera que su diversidad (es decir, el número de secuencias de ácido nucleico distintas en el conjunto) es lo suficientemente grandes para que sustancialmente cada célula T o célula B o clon de las mismas de un individuo tenga una secuencia de ácido nucleico única de dicho repertorio. Es decir, de acuerdo con la invención, un facultativo puede seleccionar para la definición de clonotipos un segmento o región particular de ácidos nucleicos recombinados que codifiquen los TCR o BCR que no reflejen la diversidad completa de una población de células T o células B; sin embargo, preferentemente, los clonotipos se definen de manera que no reflejen la diversidad de la población de células T y/o células B de las que se derivan. Es decir, cada clon diferente de una muestra tiene un clonotipo diferente, (por supuesto, en algunas aplicaciones, habrá múltiples copias de uno o más clonotipos particulares en un perfil, tal como en el caso de muestras de pacientes con leucemia o linfoma). En otros aspectos de la invención, la población de linfocitos correspondiente a un repertorio puede ser de células B circulantes, o puede ser de células T circulantes, o puede ser de subpoblaciones de cualquiera de las poblaciones anteriores, incluyendo, pero sin limitarse a, células T CD4+, o células T CD8+, u otras subpoblaciones definidas por marcadores de superficie celular, o similares. Dichas subpoblaciones pueden adquirirse tomando muestras de tejidos particulares, por ejemplo, médula ósea o ganglios linfáticos, o similares, o clasificando o enriqueciendo células de una muestra (tal como la sangre periférica) basándose en uno o más marcadores de superficie, tamaño, morfología, o similares. En otros aspectos más, la población de linfocitos que se corresponde con un repertorio se puede derivar de tejidos enfermos, tales como tejido tumoral, tejido infectado, o similar. En una realización, un repertorio que comprende cadenas TCRp humanas o fragmentos de las mismas comprende un número de secuencias de nucleótidos distintas en el intervalo de desde 0,1 x 106 a 1,8 x 106, o en el intervalo de desde 0,5 x 106 a 1,5x 106, o en el intervalo de desde 0,8 x 106 a 1,2 x 106. En otra realización, un repertorio que contiene cadenas de IgH humanas o fragmentos de las mismas comprende un número de secuencias de nucleótidos distintas en el intervalo de desde 0,1 x 106 a 1,8 x 106, o en el intervalo de desde 0,5 x 106 a 1,5 x 106, o en el intervalo de 0,8 x 106 a 1,2 x 106. En una realización particular, un repertorio de la invención comprende un conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican sustancialmente todos los segmentos de la región V(D)J de una cadena IgH. En un aspecto, “sustancialmente todos” como se utiliza en el presente documento significa que cada segmento tiene una abundancia relativa del 0,001 por ciento o más; o en otro aspecto, “sustancialmente todos” como se utiliza en el presente documento significa que cada segmento tiene una abundancia relativa del 0,0001 por ciento o más. En otra realización particular, un repertorio de la invención comprende un conjunto de secuencias de nucleótidos que codifica sustancialmente todos los segmentos de la región V(D)J de una cadena TCRp. En otra realización, un repertorio de la invención comprende un conjunto de secuencias de nucleótidos que tiene longitudes en el intervalo de 25-200 nucleótidos e incluye segmentos de las regiones V, D, y J de una cadena TCRp. En otra realización, un repertorio de la invención comprende un conjunto de secuencias de nucleótidos que tiene longitudes en el intervalo de desde 25-200 nucleótidos e incluyen segmentos de las regiones V, D, y J de una cadena IgH. En otra realización, un repertorio de la invención comprende una cantidad de secuencias de nucleótido distintas que es sustancialmente equivalente al número de linfocitos que expresan una cadena IgH distinta. En otra realización, un repertorio de la invención comprende un número de secuencias de nucleótidos distintas que es sustancialmente equivalente al número de linfocitos que expresan una cadena TCRp distinta. En otra realización más “sustancialmente equivalente” significa con en un noventa y nueve por ciento de probabilidad un repertorio de secuencias de nucleótidos incluirá una secuencia de nucleótidos que codifica una IgH o TCRp o una parte de las mismas que tiene o expresa cada linfocito presente con una frecuencia del 0,001 por ciento o más. En otra realización más “sustancialmente equivalente” significa con en un noventa y nueve por ciento de probabilidad un repertorio de secuencias de nucleótidos incluirá una secuencia de nucleótidos que codifica una IgH o TCRp o una parte de las mismas que tiene o expresa cada linfocito presente con una frecuencia del 0,0001 por ciento o más. A los conjuntos de clonotipos descritos en las dos frases anteriores se hace referencia en el presente documento como que representan el “repertorio completo” de secuencias de IgH y/o TCRp. Como se ha mencionado anteriormente, cuando se mide o se genera un perfil de clonotipo (o perfil de repertorio), se obtiene una muestra de linfocitos lo suficientemente grande como para que dicho perfil proporcione una representación razonablemente precisa de un repertorio para una aplicación particular. En un aspecto, se emplean muestras que comprendan de 105 a 107 linfocitos, especialmente cuando se obtienen de muestras de sangre periférica de desde 1-10 ml.

“Lectura de secuencia” significa una secuencia de nucleótidos determinada a partir de una secuencia o corriente de datos generados por una técnica de secuenciación, cuya determinación se hace, por ejemplo, por medio de un software de determinación de bases asociado con la técnica, por ejemplo, un software de determinación de bases de un proveedor comercial de una plataforma de secuenciación de ADN. Una lectura de secuencia incluye habitualmente puntuaciones de calidad para cada nucleótido de la secuencia. Normalmente, las lecturas de secuencia se hacen extendiendo un cebador a lo largo de una matriz de ácido nucleico, por ejemplo, con una ADN polimerasa o una ADN ligasa. Los datos se generan registrando señales, tales como señales ópticas, químicas (por ejemplo, un cambio de pH), o eléctricas, asociadas con dicha extensión. Dichos datos iniciales se convierten en una lectura de secuencia.

“Secuencia marcadora” (o “marcador”) o “código de barras” significa un oligonucleótido que se añade a un polinucleótido o molécula matriz y se utiliza para identificar y/o rastrear el polinucleótido o matriz en una reacción o serie de reacciones. Una secuencia marcadora se puede unir al extremo 3' o 5' de un polinucleótido o matriz o se puede insertar en el interior de icho polinucleótido o matriz para formar un conjugado lineal, al que se hace referencia a veces como “polinucleótido marcado”, o “matriz marcada”, o “conjugado polinucleótido-marcador”, “conjugado molécula-marcador” o similares. Las secuencias marcadoras pueden variar ampliamente de tamaño y composiciones; las siguientes referencias proporcionan directrices para la selección de conjuntos de secuencias marcadoras apropiadas para realizaciones particulares: Brenner, Patente de EE. UU. 5.635.400; Brenner y Macevicz, Patente de EE. UU. 7.537.897; Brenner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 1665-1670 (2000); Church et al, publicación de patente europea 0 303 459; Shoemaker et al, Nature Genetics, 14: 450-456 (1996); Morris et al, publicación de patente europea 0799897A1; Wallace, Patente de EE. UU. 5.981.179; y similares. Las longitudes y composiciones de las secuencias marcadoras pueden variar ampliamente, y la selección de longitudes particulares y/o composiciones depende de varios factores que incluyen, sin limitación, como se utilizan los marcadores para generar una lectura, por ejemplo, mediante una reacción de hibridación o mediante una reacción enzimática, tal como secuenciación; si están marcadas, por ejemplo con un colorante fluorescente o similar, el número de marcadores oligonucleotídicos necesarios para identificar sin ambigüedad un conjunto de polinucleótidos, y similares, y como de diferentes deben ser los marcadores con el fin de asegurar una identificación fiable, por ejemplo, libre de hibridación cruzada o fallo de identificación a partir de errores de secuenciación. En un aspecto las secuencias marcadoras pueden tener cada una longitud en un intervalo de 2 a 36 nucleótidos, o desde 4 a 40 nucleótidos, o de 8 a 20 nucleótidos, o de 6 a 10 nucleótidos, respectivamente. En un aspecto, los conjuntos de secuencias marcadoras se utilizan de manera que cada secuencia marcadora de un conjunto tiene una única secuencia de nucleótidos que se diferencia de la de cualquier otro marcador del mismo conjunto en al menos dos bases; en otro aspecto, los conjuntos de secuencias marcadoras se utilizan de manera que la secuencia de cada marcador de un conjunto se diferencia de la de cualquier otro marcador del mismo conjunto en al menos tres bases.

Un “árbol de secuencia” significa una estructura de árbol de datos para la representación de secuencias de nucleótidos. En un aspecto, una estructura de árbol de datos de la invención es un árbol que se enraíza de manera dirigida que comprende nódulos y extremos que no incluyen ciclos o rutas cíclicas. Los extremos de los nódulos de las estructuras de árbol de datos de la invención están normalmente ordenados. Los nódulos y/o extremos son estructuras que pueden contener, o se asocian con, un valor. Cada nódulo en el árbol tiene un cero o más nódulos hijos, que por convención se muestran por debajo de estos en el árbol. Un nódulo que tiene un hijo se denomina el nódulo parental del hijo. Un nódulo tiene al menos un padre. Los nódulos que no tienen ningún hijo se llaman nódulos hoja. El nódulo superior de un árbol se llama nódulo raíz. Siendo el nódulo más superior, el nódulo raíz que no tendrá padres. Es el nódulo en el que comienzan comúnmente las operaciones en el árbol (aunque algunos algoritmos comienzan en los nódulos hoja y trabajan hasta el final en la raíz). Todos los otros nódulos se pueden alcanzar a partir de estos siguiendo los extremos o enlaces.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la identificación de linfocitos que se han infiltrado en un tejido sólido, que comprende:

la clasificación de una muestra de linfocitos de un tejido accesible de un individuo en al menos dos subconjuntos, en el que dicho tejido accesible es sangre periférica, médula ósea, fluido linfático, líquido sinovial, o líquido cefalorraquídeo de dicho individuo;

la generación de un perfil de clonotipo para cada subconjunto de linfocitos del tejido accesible, en el que cada perfil de clonotipo se genera amplificando ácidos nucleicos recombinados de los linfocitos y secuenciando los ácidos nucleicos aislados de los amplicones resultantes, y en el que cada perfil de clonotipo proporciona una lista de secuencias de clonotipo;

la generación de un perfil de clonotipo a partir de una muestra de tejido sólido, en el que el perfil de clonotipo se genera amplificando ácidos nucleicos recombinados de los linfocitos de la muestra de tejido sólido y secuenciando los ácidos nucleicos aislados de los amplicones resultantes, y en el que el perfil de clonotipo proporciona una lista de secuencias de clonotipo;

la detección de linfocitos de cada subconjunto que se han infiltrado en el tejido sólido identificando una secuencia de clonotipo de un perfil de clonotipo a partir del tejido sólido que está presente en un perfil de clonotipo de un subconjunto de linfocitos del tejido accesible.

2. El método de la reivindicación 1 en el que al menos uno de dichos subconjuntos de linfocitos comprende células T citotóxicas, células T auxiliares, células T reguladoras, células T Th1, células T Th2, células T Th9, células T Th17 y/o células T Tfh.

3. El método de la reivindicación 2 en el que dicha etapa de detección incluye adicionalmente la determinación del número, niveles y/o relaciones de linfocitos de cada uno de los subconjuntos, opcionalmente en el que:

(i) dicho tejido sólido es un tumor sólido, opcionalmente en el que dichos subconjuntos de linfocitos comprenden células T reguladoras y células T citotóxicas, más opcionalmente en el que dicha etapa de detección incluye la determinación de una relación de niveles de células T reguladoras con respecto a células T citotóxicas en dicho tumor sólido, o

(ii) dichos subconjuntos de linfocitos comprenden al menos un subconjunto de células específicas de antígeno.

4. El método de la reivindicación 1 en el que dicho tejido accesible es la sangre periférica de dicho individuo.

5. El método de la reivindicación 1 en el que (i) dicha etapa de detección incluye la enumeración de dichos linfocitos de cada uno de dichos subconjuntos contando sus clonotipos respectivos, o (ii) dicha muestra de dicho tejido sólido comprende múltiples muestras de tejidos tomadas de diferentes localizaciones en dicho tejido sólido.

6. El método de la reivindicación 1 en el que dichos subconjuntos de linfocitos comprenden células T auxiliares y células T citotóxicas.

7. El método de la reivindicación 6 en el que las células T auxiliares son células T reguladoras FoxP3+, opcionalmente en el que dichas células T citotóxicas se identifican por un marcador CD8+ y en el que dichas células T reguladoras se identifican por los marcadores CD4+, CD25+(alto), y CD127(bajo), más opcionalmente en el que dicho tejido sólido es un tumor sólido.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dichos subconjuntos de linfocitos se clasifican en recipientes se parados basándose en uno o más marcadores de superficie celular o marcadores intracelulares, opcionalmente en el que dicha etapa de clasificación de dichos subconjuntos de linfocitos se implementa con un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS).

9. El método de la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos clonotipos de dichos perfiles de clonotipo comprende una parte recombinada de un gen del receptor de células T.

10. El método de la reivindicación 9, en el que cada uno de dichos clonotipos de dichos perfiles de clonotipo comprende al menos una parte de la región V(D)J de un ácido nucleico que codifica una cadena p del receptor de célula T, opcionalmente en el que cada uno de dichos perfiles de clonotipo comprende al menos 1000 clonotipos de al menos 30 nucleótidos, más opcionalmente en el que cada uno de dichos perfiles de clonotipo comprende al menos 104 clonotipos.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dicho tejido sólido es un tejido sólido afectado por una enfermedad autoinmunitaria.

12. El método de la reivindicación 11, en el que al menos uno de dichos subconjuntos de linfocitos se selecciona de entre células T citotóxicas, células T auxiliares, células T reguladoras, células T Th1, células T Th2, células T Th9, células T Th17 y/o células T Tfh y células T específicas de antígeno, y en el que dicha etapa de detección incluye adicionalmente la determinación del número, niveles, y/o relaciones de linfocitos de cada uno de dichos subconjuntos, opcionalmente en el que (i) dichos subconjuntos comprenden células T reguladoras, células T Th1, células T Th2, células T Th9, células T Th17 y/o células T Tfh, y/o al menos un subconjunto de células T específicas del antígeno, o (ii) dicho tejido sólido se selecciona de entre el grupo que consiste en tejido del colon, tejido del intestino delgado, piel, tejido conjuntivo, tejido subcutáneo, tejido pulmonar y tejido renal.

13. El método de la reivindicación 1 en el que dicho tejido sólido es un tejido normal, y en el que al menos uno de dichos subconjuntos de linfocitos se selecciona de entre células T citotóxicas, células T auxiliares, células T reguladoras, células T Th1, células T Th2, células T Th9, células T Th17 y/o células T Tfh y células T específicas de antígeno, y en el que dicha etapa de detección incluye adicionalmente la determinación del número, nivel, y/o relaciones de linfocitos de cada uno de dichos subconjuntos.