ES2676449T3 - Método para el diagnóstico de daño renal agudo - Google Patents

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ES2676449T3 ES12857270.8T ES12857270T ES2676449T3 ES 2676449 T3 ES2676449 T3 ES 2676449T3 ES 12857270 T ES12857270 T ES 12857270T ES 2676449 T3 ES2676449 T3 ES 2676449T3
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Elia Aguado Fraile
Miren Edurne RAMOS MUÑOZ
Angel Manuel CANDELA TOHA
Fernando LIAÑO GARCIA
María Laura GARCIA BERMEJO
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Abstract

La presente invención se refiere a los miRNAs: miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR- 27a. mi-R93 y miR-10a como marcadores de daño renal agudo y a un método y kit para el diagnóstico y/o pronóstico del daño renal agudo mediante dichos marcadores.

Description

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DESCRIPCION
Método para el diagnóstico de daño renal agudo Campo de la invención
La presente invención se encuadra en el campo general de la biomedicina y en particular se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo.
Estado de la técnica
Los miARN son ARN pequeños (22-25 nucleótidos) codificados endógenamente capaces de reconocer ARN mensajeros y así regular negativamente la expresión de proteínas, dentro de complejos de silenciamiento inducido por aRn (RISC) debido a complementariedad total o parcial con su ARNm diana. La mayoría de los miARN los transcribe la ARN Pol II a partir de genes individuales o a partir de transcritos policistrónicos para varios de ellos a la vez. Se generan como pre-miR más largos que se procesan en el núcleo por ribonucleasa III, salen al citoplasma por medio de mecanismos dependientes de exportina-5 y Ran-GTP y se procesan finalmente por otra ribonucleasa III para dar su forma madura en el citoplasma.
Su función es esencial en una amplia gama de procesos incluyendo desarrollo embrionario, respuesta al estrés o regulación estricta de procesos fisiológicos y, por tanto, el mantenimiento de la homeostasis del organismo.
Muy recientemente se ha demostrando que los miARN son reguladores clave en la respuesta celular rápida y precisa ante cualquier tipo de estímulo incluyendo la falta de nutrientes o la hipoxia (Ivan M, Harris AL, Martelli F, Kulshreshtha R. Hypoxia response and microRNAs: no longer two separate worlds. J Cell Mol Med.; 12(5A):1426-31, 2008).
La solicitud de patente WO2011012074 describe una serie de miARN incluyendo, entre ellos, miR-29a, como marcadores plasmáticos para cáncer de hígado, y un método para el diagnóstico y la evaluación de cáncer de hígado basándose en la detección de al menos uno de dichos miARN.
La solicitud de patente WO2009036236 se refiere a una serie de miARN incluyendo, entre ellos, miR-146a, como marcadores plasmáticos para cáncer de hígado y a un método para el diagnóstico y/o la evaluación del diferentes patologías oncológicas basándose en la detección de al menos uno de los microARN descritos.
Akkina, S. et al., “MicroRNAs in kidney function and disease”, Translational Research, abril de 2011, vol. 157, n.° 4, págs. 236-240 y Li, J.Y. et al, “Review: The role of microRNAs in kidney disease”, NEPHROLOGY (CARLTON), septiembre de 2010, vol. 15, n.° 6, págs. 599-608, describen la implicación de miARN en la fisiología y patología renal.
JUAN, D. et al, “Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer”, UROLOGY, abril de 2010, vol. 75, n.° 4, páginas 835-41, describen una serie de miARN como marcadores para cáncer renal.
DENBY et al. (AJP 2011, 179(2):661-672) y YU et al. (J NEPHROL. 2011, 25(4):566-576) dan a conocer que los niveles de expresión de miR-26b se reducen en el tejido renal de modelos de ratón para fibrosis renal progresiva y nefropatía diabética.
El documento WO2011/027019 da a conocer un método para el diagnóstico de daño renal agudo que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un microARN en una muestra.
La insuficiencia renal aguda (IRA) como síndrome se caracteriza por una disminución brusca en el filtrado glomerular en el plazo de días o semanas, que se expresa clínicamente con la incapacidad de excretar productos de desecho nitrogenados y regular la homeostasis de líquidos y electrolitos.
La IRA es uno de los problemas más graves entre las enfermedades renales en el mundo desarrollado ya que supone una elevada mortalidad de aproximadamente el 50%. Aproximadamente el 30% de todos los episodios de IRA se producen en pacientes ingresados en las UCl como resultado de fallo multiorgánico. En este último contexto, la mortalidad aumenta hasta el 80%.
El desarrollo de IRA es también una de las complicaciones más comunes tras intervenciones cardiacas, que ascienden a 30.000 al año en España, y más de un 1% de dichas intervenciones se realizan en este hospital. Prácticamente la totalidad de los pacientes intervenidos desarrollan cierto grado de IRA. De la gravedad de esta IRA posoperatoria depende la evolución a largo plazo de los pacientes, dando como resultado una mortalidad cercana al 60% en aquellos casos que requieran diálisis tras la intervención cardiaca (Candela-Toha A, Elias-Martín E, Abraira V et al. Predicting Acute Renal Failure after Cardiac Surgery: ExternaI Validation of Two New Clinical Scores. Clin J Am Soc Nephrol; 3:1260-1265, 2008). Tanto la cirugía cardiaca como el trasplante renal son dos situaciones “casi”
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experimentales para el estudio de NTA en seres humanos, ya que se conocen el momento y la duración del estímulo isquémico y además pueden monitorizarse. Todas estas estadísticas de morbimortalidad no han cambiado significativamente a lo largo de las últimas décadas y hasta el momento no existe una terapia eficaz para prevenir y/o reducir NTA en todas estas situaciones. Esto se debe, en gran medida, a la falta de marcadores de daño renal más precisos distintos de la determinación de creatinina y urea en suero, utilizados hasta el momento. Estos marcadores convencionales no reflejan directamente el daño celular ni en qué compartimento del tejido renal (túbulo o endotelio) se produce dicho daño, sólo son parámetros indicativos de una función renal alterada resultante del daño (Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, et al., Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Kidney Injury in Humans. Clin Transl Sci.; 1(3):200-208, 2008). De hecho, es posible que pacientes con daño renal subclínico no se identifiquen como tales porque no hay una alteración significativa en los niveles séricos de creatinina y urea. Por tanto, a lo largo de los últimos años están desarrollándose diversos estudios con el fin de identificar y validar nuevos marcadores para IRA tales como NGAL, IL 18, KIM, cistatina C, VEGF o CXCL10, que parecen funcionar como buenos marcadores en poblaciones infantiles sin patologías añadidas significativas pero no en la población adulta (Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, et al., Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Kidney Injury in Humans. Clin Transl Sci. 1 (3):200-208, 2008).
Todo lo descrito anteriormente justifica la necesidad de identificar y validar nuevos biomarcadores más precisos para la evolución del daño renal que sean indicativos del compartimento tisular en el que se produce el daño y del grado del daño y/o la recuperación, cuya determinación sea también rápida, sencilla y sin necesidad de una biopsia del paciente.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica que comprende determinar el nivel de expresión de al menos miR-26b en una muestra de suero o sangre aislada de un sujeto y comparar dicho nivel de expresión con un valor de control, en el que la reducción de dicho nivel de expresión es indicativa de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica.
En la presente invención, daño renal agudo se entiende como cualquier daño provocado por una disminución brusca de la función renal en el plazo de horas o días, como una disminución del filtrado glomerular o una acumulación de productos nitrogenados séricos, o como una incapacidad para regular la homeostasis.
En una realización preferida de la presente invención, la expresión del micro-ARN o los micro-ARN se determina por medio de PCR cuantitativa.
En otra realización preferida de la presente invención, el nivel de expresión del micro-ARN se determina por medio de micromatrices de ARN.
En otra realización preferida, el método de la presente comprende determinar los niveles de expresión de miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 y miR-10a colectivamente. En otra realización más preferida, la reducción del nivel de expresión de al menos uno de los micro-ARN es indicativa de daño renal agudo.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de al menos miR-26b para el diagnóstico de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica en una muestra de suero o sangre aislada de un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 y miR-10a para el diagnóstico de daño renal agudo, colectivamente.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro de un kit para el diagnóstico de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica según el método de las reivindicaciones 1-5, que comprende las sondas y los cebadores requeridos para determinar el nivel de expresión de al menos miR-26b.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra la expresión de miR-26b en suero en pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión de miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
La figura 2 muestra la expresión de miR-29a en suero en pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión de miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a
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individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
La figura 3 muestra la expresión de miR-454 en suero en pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión de miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
La figura 4 muestra la expresión de miR-146 en suero de pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión de miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
La figura 5 muestra la expresión de miR-27a en suero de pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión de miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
La figura 6 muestra la expresión de miR-93 en suero de pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión de miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
La figura 7 muestra la expresión de miR-10a en suero de pacientes con IRA con etiología isquémica (PI) y etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después del diagnóstico, en comparación con la expresión de miARN en dos conjuntos de individuos sanos (sanos). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se detecta la expresión del miARN en todas las muestras (umbral de cruce, CT), con respecto a un microARN sintético usado como control interno de la técnica, b) veces de expresión de miARN en pacientes con IRA con respecto a individuos sanos que se igualan a 1 mediante una fórmula matemática exponencial.
Descripción detallada de la invención
En primer lugar se realizó un experimento de estudio de microARN a gran escala usando ARN obtenido de pacientes con insuficiencia renal aguda con diferentes etiologías. Las muestras usadas para este método consistieron en:
- Dos muestras de pacientes con insuficiencia renal aguda con etiología isquémica en el momento de máximo daño renal, indicado por medio de parámetros de diagnóstico clínico comunes, tales como creatinina sérica.
- Dos muestras de estos mismos pacientes a los 7 ó 10 días después de la insuficiencia renal, cuando se ha recuperado la función del órgano, de nuevo estimada mediante creatinina sérica.
- Dos muestras de un paciente con insuficiencia renal provocada por sustancias nefrotóxicas, una en el momento de máximo daño y la otra cuando recuperó la función renal.
- Una muestra de un paciente que tiene insuficiencia renal provocada por septicemia, tomada en el momento de máximo daño del órgano.
- Dos grupos que consistían en 5 personas sanas, que se usaron como control.
El experimento de estudio de microARN en suero a gran escala se realizó por medio de PCR cuantitativa usando las plataformas Taqman Low Density Array (TLDAs) de Applied Biosystems. Mediante el análisis de los datos obtenidos, se seleccionaron los microARN de interés para el estudio.
Posteriormente se confirmaron los datos de expresión de los microARN seleccionados obtenidos en el experimento anterior. Para ello, se usaron muestras de pacientes distintos de los mencionados anteriormente y consistían en:
- Cuatro pacientes con insuficiencia renal aguda con etiología isquémica, denominados PI1, PI2, PI3, PI4. De cada paciente se usaron muestras a día 0, el momento del diagnóstico, 1, 3, 5 y 7 días después del diagnóstico de
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insuficiencia renal.
- Tres pacientes que tienen insuficiencia renal aguda provocada por sustancias nefrotóxicas, denominados PT1, PT2, pT3. De cada paciente se usaron muestras a día 0, el momento del diagnóstico, 1, 3, 5 y 7 días después del diagnóstico de insuficiencia renal.
- Dos grupos de control, que consistían cada uno en 10 personas sanas.
Para confirmar los datos, se realizó PCR cuantitativa usando sondas individuales para cada microARN de tecnología LNA (Exiqon).
Tal como se muestra en las figuras 1-4, la expresión de miARN en suero disminuye en pacientes con IRA con respecto a los controles sanos.
La figura 5 muestra que la expresión de miR-27a disminuye en pacientes con IRA con respecto a los controles sanos. Es importante indicar que la expresión de miR-27a en el plazo de 7 días fue más variable entre los pacientes y algunos de ellos tenía una tendencia a recuperar valores de expresión de individuos sanos.
La expresión de miR-93 (figura 6) disminuyó en pacientes con IRA con respecto a los controles sanos, y debe indicarse también que el día 7 este miARN mostró una tendencia a recuperar valores cercanos a los controles en algunos pacientes.
La expresión de miR-10a (figura 7) disminuyó en algunos pacientes con IRA con respecto a los controles sanos, esta tendencia no se observó en un paciente isquémico y es de hecho importante indicar que el día 7 se recuperaron los niveles de expresión de miARN en varios pacientes.
Además, se calcularon los valores de área bajo la curva mediante análisis de curvas ROC para determinar la expresión de miARN en diferentes pacientes.
La tabla 1 muestra que estos miARN tenían un valor de diagnóstico de IRA independientemente de la etiología de la IRA, con especificidad y sensibilidad mucho mayores que la creatinina sérica (marcador usado actualmente).
Variables resultado de contraste
Área Error estándar3 Sig. ansintóticab Intervalo de confianza asintótico del 95%
Límite inferior
Límite superior
miR_101_D0
1,000 0,000 0,000 1,000 1,000
miR_210_D0
0,761 0,120 0,043 0,526 0,995
miR_126_D0
0,900 0,061 0,002 0,780 1,020
miR_26b_D0
1,000 0,000 0,000 1,000 1,000
miR_29a_D0
0,757 0,095 0,046 0,572 0,943
miR_146a_D0
1,000 0,000 0,000 1,000 1,000
miR_27a_D0
0,786 0,091 0,027 0,608 0,964
miR_93_D0
0,771 0,099 0,036 0,577 0,965
miR_10a_D0
1,000 0,000 0,000 1,000 1,000
miR_127_D0
0,714 0,122 0,097 0,474 0,954
Tabla 1: Análisis de curvas ROC para los miARN en pacientes con IRA en la UCI el día 0.
Los datos de la tabla 2 demuestran que estos miARN fueron más sensibles y específicos que la creatinina, sugiriendo que a pesar de los valores normales de creatinina, la alteración del riñón persistía, de manera que estos miARN tenían un alto valor de pronóstico con respecto a la evolución de estos pacientes a lo largo del tiempo en alteración renal crónica a largo plazo.
Variables resultado de contraste
Área Error estándara Sig. ansintóticab Intervalo de confianza asintótico del 95%
Límite inferior
Límite superior
miR_101_D7
0,886 0,107 0,003 0,676 1,096
miR 210 D7
0,687 0,133 0,407 0,346 0,869
miR_126_D7
0,729 0,106 0,077 0,520 0,937
miR_26b_D7
0,986 0,019 0,000 0,949 1,022
miR_29a_D7
0,625 0,137 0,333 0,357 0,893
miR_146a_D7
1,000 0,000 0,000 1,000 1,000
miR_27a_D7
0,571 0,118 0,580 0,339 0,804
miR_93_D7
0,364 0,136 0,293 0,094 0,634
miR_10a_D7
1,000 0,000 0,000 1,000 1,000
miR_127_D7
0,829 0,104 0,319 0,424 0,833
Tabla 2: Análisis de curvas ROC para los miARN en pacientes con IRA en la UCI el día 7.
Los datos de la tabla 3 muestran que la alteración en estos miARN indicaba una predisposición a desarrollar IRA 5 isquémica tras cirugía cardiaca.
Variables resultado de contraste
Área Error estándar3 Sig. ansintóticab Intervalo de confianza asintótico del 95%
Límite inferior
Límite inferior
miR101_b
0,899 0,065 0,001 0,772 1,026
miR210_b
0,702 0,112 0,082 0,482 0,911
miR126_b
0,848 0,075 0,003 0,701 0,996
miR26b_b
0,944 0,039 0,000 0,869 1,020
miR29a_b
0,803 0,089 0,009 0,629 0,977
miR146a_b
0,778 0,087 0,017 0,608 0,947
miR27a_b
0,896 0,064 0,001 0,771 1,021
miR93_b
0,934 0,049 0,000 0,838 1,301
miR10a_b
0,697 0,127 0,090 0,448 0,946
miR127_b
0,859 0,068 0,002 0,726 0,991
Tabla 3: Análisis de curvas ROC para los miARN en pacientes tras cirugía cardiaca.
10 Los datos de la tabla 4 muestran que la alteración en estos miARN son indicadores tempranos de desarrollo de IRA tras cirugía cardiaca.
Variables resultado de contraste
Área Error estándara Sig. ansintóticab Intervalo de confianza asintótico del 95%
Límite inferior
Límite inferior
miR101_pi
0,667 0,118 0,154 0,434 0,899
miR210_pi
0,598 0,119 0,402 0,365 0,831
miR126_pi
0,667 0,119 0,154 0,434 0,899
miR26b_pi
0,757 0,101 0,028 0,558 1,955
miR29a_pi
0,561 0,110 0,603 0,344 0,777
miR146a_pi
0,534 0,120 0,769 0,299 0,770
miR27a_pi
0,831 0,091 0,005 0,652 1,009
miR93_pi
0,852 0,078 0,003 0,699 1,004
miR10a_pi
0,836 0,098 0,004 0,644 1,028
miR127_pi
0,751 0,092 0,032 0,570 0,932
Tabla 4: Análisis de curvas ROC para los miARN en pacientes inmediatamente después de cirugía cardiaca. 15

Claims (8)

  2. 2.
    10
  3. 3.
  4. 4.
    15
  5. 5.
    20
  6. 6.
  7. 7.
    25
  8. 8.
    30
    REIVINDICACIONES
    Método para el diagnóstico de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica que comprende determinar el nivel de expresión de al menos miR-26b en una muestra de suero o sangre aislada de un sujeto y comparar dicho nivel de expresión con un valor de control, en el que la reducción de dicho nivel de expresión es indicativa de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica.
    Método para el diagnóstico de daño renal agudo según la reivindicación 1, en donde la expresión del micro- ARN se determina por medio de PCR cuantitativa.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de expresión del micro-ARN se determina por medio de micromatrices de ARN.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además determinar los niveles de expresión de miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 y miR-10a colectivamente.
    Método según la reivindicación 4, en donde la reducción del nivel de expresión de al menos uno de los micro-ARN es indicativa de daño renal agudo.
    Uso in vitro de al menos un miR-26b para el diagnóstico de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica en una muestra de suero o sangre aislada de un sujeto.
    Uso in vitro según la reivindicación 6, que comprende además determinar el nivel de expresión de miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 y miR-10a, colectivamente, para el diagnóstico y pronóstico de daño renal agudo.
    Uso in vitro de un kit para el diagnóstico de daño renal agudo como resultado de etiología isquémica o tóxica según el método de las reivindicaciones 1-5, que comprende las sondas y los cebadores requeridos para determinar el nivel de expresión de al menos miR-26b.
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