CN110951887A - 作为乳腺癌诊治靶标的LncRNA - Google Patents

作为乳腺癌诊治靶标的LncRNA Download PDF

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Abstract

本发明公开了作为乳腺癌诊治靶标的LncRNA，所述LncRNA为LINC02015，本发明首次发现了LINC02015在乳腺癌患者中的表达显著上调，提示LINC02015可作为生物标志物用于乳腺癌的诊断。本发明还公开了抑制LINC02015的表达，可以有效的抑制乳腺癌细胞的增殖，提示LINC02015可作为药物靶点用于治疗乳腺癌。

Description

作为乳腺癌诊治靶标的LncRNA
技术领域
本发明涉及癌症诊断、治疗领域，本发明涉及作为乳腺癌诊治靶标的LncRNA，所述LncRNA是LINC02015。
背景技术
乳腺癌已成为世界上女性中发病率最高的肿瘤，严重影响女性的生命健康。尽管筛查方案和辅助疗法的发展取得了成功，但相当大比例的乳腺癌患者死于癌症转移。乳腺癌诊治的关键在于早发现、早诊断和早治疗。癌基因的激活，或者抑癌基因的失活在肿瘤发生发展过程中起着关键作用。随着大规模、高通量测序技术的推广应用，发现新的癌基因和抑癌基因不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的标准，同时也为寻找新的肿瘤生物治疗靶点奠定基础。
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们本身并不编码蛋白质，而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达水平。lncRNAs最初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，并无生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNAs参与染色质修饰，转录激活，核内运输等多种重要的调控过程。越来越多的研究表明，lncRNAs在肿瘤发生发展中起着举足轻重的作用，这无疑为揭示肿瘤发生发展的机制带来了新的希望。目前针对lncRNA在乳腺癌疾病领域中的研究仍处于起步阶段，因此，筛选能够有效用于预防和治疗肿瘤的lncRNA具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测LINC02015表达差异来诊断乳腺癌的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过抑制LINC02015来治疗乳腺癌的方法。
本发明的目的之三在于提供一种用于筛选治疗乳腺癌的药物的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于治疗乳腺癌的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测LINC02015的产品在制备乳腺癌诊断工具中的用途。
进一步，所述检测LINC02015的产品包括检测LINC02015的表达水平的产品。所述产品包括能够结合LINC02015的核酸。所述核酸能够检测LINC02015的表达水平。
本发明的检测LINC02015的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增LINC02015的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
进一步，所述检测LINC02015的产品可以是检测LINC02015的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断乳腺癌的工具，所述工具能够检测LINC02015的表达水平。所述工具包括能够结合LINC02015的核酸。所述核酸能够检测LINC02015的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断乳腺癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断乳腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知LINC02015的异常与乳腺癌相关也属于LINC02015的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断乳腺癌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中LINC02015的表达水平；
(3)将测得的LINC02015的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，LINC02015表达水平升高，则该受试者被诊断为乳腺癌或患有乳腺癌的风险大。
本发明还提供了一种乳腺癌的治疗方法，所述方法包括抑制LINC02015。
进一步，所述方法包括抑制LINC02015的表达。
本发明还提供了一种癌症药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对癌症模型动物施用测试药物后的某个时期测量LINC02015的表达水平来测定癌症药物改善癌症的效果。更具体地说，当LINC02015的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善癌症的治疗药物。
本发明还提供了一种含有抑制LINC02015的试剂的药物。
本发明还提供了上述试剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明的抑制LINC02015的试剂不受限制，只要是可以抑制LINC02015或涉及LINC02015上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗癌症有效的药物即可。
进一步，所述抑制LINC02015的试剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体。
“反义核酸”指含有与LINC02015转录本互补的序列的核酸。反义核酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与目标序列100％互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核酸可以根据LINC02015转录本信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。
“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpinturn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。
“核酶”指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可以包括锤头、发夹等。
“适体”指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合靶分子即可，可以由例如10至200个核苷酸、优选10至100个核苷酸、更优选15至80个核苷酸、进一步更优选15至50个核苷酸组成。适体可以使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可以采用SELEX(通过指数式富集进行的配体的系统进化)。
本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防癌症的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
在本发明的上下文中，“诊断乳腺癌”既包括判断受试者是否已经患有乳腺癌、也包括判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断乳腺癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在乳腺癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
本发明的包括抑制LINC02015表达试剂的治疗药物可用作新的乳腺癌的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LINC02015在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测siRNA的干扰效率。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1大样本验证差异表达LncRNA
1、样本收集
收集乳腺外科住院治疗的乳腺癌患者60例。纳入标准：(1)病理初步诊断为乳腺癌并知晓病情；(2)年龄≥18周岁；(3)经说明研究目的后同意参与本研究。排除标准：(1)非原发性乳腺癌患者；(2)有心脏、肝脏、肾脏等重要器官功能障碍或其他恶性肿瘤病史的患者。
研究对象全部为女性，年龄28～69岁，平均年龄为(45.60±4.64)岁。
取上述患者的病理组织(包括癌组织和癌旁组织)进行如下实验。
2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、QPCR
1)反应体系
RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却；继续加入5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；
2)逆转录反应条件
25℃5min，42℃60min，70℃5min。
3)聚合酶链式反应
引物设计：
根据Genebank中LINC02015和GAPDH基因序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列SEQ ID NO.1～4所示，其中，LINC02015的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示；GAPDH的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。
配制PCR反应体系：
2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH2O 8.0μl。
PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，72℃5min延伸反应。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图1所示，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中LINC02015水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2抑制LINC02015基因表达
1、siRNA设计合成
针对LINC02015的siRNA序列(siRNA-LINC02015)如SEQ ID NO.5～6所示。以上siRNA序列与通用阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公司提供。
2、乳腺癌细胞的培养与转染
2.1细胞培养
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，以含10％FBS和1％双抗的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×105个/孔，加入细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。
2.2细胞转染
(1)转染前24小时，在培养基中接种细胞，转染时细胞融合度为约70％。铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。
(2)用50μl Opti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM)，轻轻吹吸3次混匀。
(3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl Opti-MEM稀释1μl Lipofectamine2000轻轻吹吸3次混匀，室温下静置5min。
(4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3次混匀，室温下静置20min。
(5)转染复合物加入到细胞板中,前后轻摇细胞板混合均匀。
(6)细胞板置于37℃，5％CO2培养箱中培养4小时后可换鲜培养基。
3、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率
利用QIAGEN细胞提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体操作详见说明书。
逆转录和QPCR步骤同实施例1。
4、结果
结果如图2显示，siRNA-LINC02015能够有效的抑制LINC02015的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 LINC02015表达对乳腺癌细胞增殖能力的测定
1、步骤：
按照实施例3的方法进行细胞转染，转染后不同时间点弃掉旧培养基，每孔加入200μl DMEM培养基，然后加入20μl 5mg/ml的MTT溶液(注意避光)，37℃孵育4h，终止培养，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO溶液，室温充分震荡使结晶溶解。应用酶标仪检测570nm波长处各孔吸光值。
2、结果
结果如表1所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-LINC02015细胞组细胞增殖缓慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，抑制LINC02015表达可用于治疗乳腺癌。
表1 MTT测定细胞增殖统计结果
siRNA-NC siRNA-LINC02015
24h 0.212±0.010 0.201±0.023
48h 0.316±0.012 0.290±0.013
72h 0.493±0.01 0.409±0.012
96h 0.671±0.031 0.543±0.038*
120h 0.970±0.017 0.653±0.027*
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 作为乳腺癌诊治靶标的LncRNA
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taagaagaac aattacct 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atactcactc attatactc 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatgggtgt gaaccatgag aa 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcatggact gtggtcatga g 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugacaauauu ugaugauugg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaucaucaa auauugucac u 21

Claims (10)

1.检测LINC02015的产品在制备诊断乳腺癌的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测LINC02015的产品包括检测LINC02015表达水平的产品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合LINC02015的核酸；所述核酸能够检测LINC02015的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增LINC02015的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.一种诊断乳腺癌的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测LINC02015的表达水平的工具。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合LINC02015的核酸；所述核酸能够检测LINC02015的表达水平。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增LINC02015的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
8.一种治疗乳腺癌的药物，其特征在于，所述药物包含抑制LINC02015的试剂。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述试剂能够抑制LINC02015或涉及其上游或下游途径的物质的表达或活性。
10.LINC02015在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
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