ES2432854B1 - Metodo para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al miRNAs miR-93 como marcadores de daño renal agudo y a un método y kit para el diagnóstico y/o pronóstico del daño renal agudo mediante dichos marcadores.

Description

2 METODO PARA EL DIAGNÓSTICO Y/O PRONÓSTICO DE DAÑO RENAL AGUDO Campo de la invención La presente invención se encuadra en el campo general de la biomedicina y en particular se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal 5 agudo. Estado de la técnica Los miRNAs son RNAs de pequeño tamaño (22-25 nucleótidos) codificados endógenamente capaces de reconocer RNAs mensajeros y así regular negativamente la expresión de proteínas, dentro de complejos de silenciamiento inducido (RISC) por 10 complementaridad total o parcial con su mRNA diana. La mayoría son transcritos por la RNA Pol II desde genes individuales o desde transcritos policistrónicos para varios de ellos a la vez. Se generan como pre-miRs más largos que se procesan en el núcleo por una Ribonucleasa III, salen a citoplasma vía mecanismos dependientes de Exportina-5 y Ran-GTP y allí son finalmente procesados por otra Ribonucleasa III a su 15 forma madura. Su función es esencial en una amplia variedad de procesos incluidos el desarrollo embrionario, la respuesta a estrés o la regulación estricta de procesos fisiológicos y por tanto, el mantenimiento de la homeostasis de los organismos. Muy recientemente se ha demostrando que los miRNAs son reguladores clave en la 20 respuesta celular rápida y precisa ante cualquier tipo de estímulo incluyendo la falta de nutrientes o la hipoxia (Ivan M, Harris AL, Martelli F, Kulshreshtha R. Hypoxia response and microRNAs: no longer two separate worlds. J Cell Mol Med.;12(5A):1426-31, 2008). La solicitud de patente WO2011012074 describe un conjunto de miRNAs, entre los 25 que se incluye el miR-29a como marcadores plasmáticos de cáncer de hígado, y un método de diagnóstico y evaluación del cáncer hepático basado en la detección de al menos uno de ellos. La solicitud de patente WO2009036236 se refiere a un conjunto de miRNAs, entre los que se incluye el miR-146a, como marcadores plasmáticos de cáncer de hígado y un 30 3 método de diagnóstico y/o evaluación del diferentes patologías oncológicas basado en la detección de al menos uno de los microRNAs descritos. Akkina, S. et al. ,MicroRNAs in kidney function and disease, Translational Research, 2011 Apr, Vol. 157, No. 4, pg 236-240 y Li, J.Y. et al., “Review: The role of microRNAs in kidney disease”, NEPHROLOGY (CARLTON), Sep 2010, Vol. 15, No.6, p599-608, 5 describen la implicación de miRNAs en la fisiología y patología renal. JUAN, D. et al., „Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer, UROLOGY, 2010 Apr, Vol.75, No. 4, páginas 835-41, describe un conjunto de miRNAs como marcadoreds de cáncer renal. El Fracaso renal agudo (FRA) como un síndrome caracterizado por una brusca caída 10 en el filtrado glomerular en días o semanas, expresándose clínicamente con la incapacidad de excretar los productos nitrogenados de desecho y regular la homeostasis de líquidos y electrolitos. El FRA representa uno de los problemas más graves dentro de las enfermedades renales en el mundo desarrollado por la elevada mortalidad que conlleva, alrededor del 15 50%. En torno al 30% de todos los episodios de FRA ocurren en los enfermos ingresados en las UCIs, como consecuencia de un fallo multiorgánico. En este último contexto, la mortalidad se eleva al 80%. El desarrollo de FRA es además una de las complicaciones más habituales tras una intervención cardiaca, de las que se realizan unas 30.000/año en España y más de un 20 1% de ellas en nuestro Hospital. Prácticamente la totalidad de los pacientes intervenidos desarrollan cierto grado de FRA. De la gravedad de este FRA post-operatorio depende la evolución a largo plazo de los pacientes, resultando en una mortalidad cercana al 60% en aquellos casos que requieran diálisis tras la intervención cardiaca (Candela-Toha A, Elias-Martin E, Abraira V et al. Predicting Acute Renal 25 Failure after Cardiac Surgery: External Validation of Two New Clinical Scores. Clin J Am Soc Nephrol; 3:1260-1265. 2008). Tanto la cirugía cardiaca como el trasplante renal son dos situaciones “cuasi” experimentales de estudio para la NTA en humanos, ya que se conoce el momento y la duración del estímulo isquémico y además se pueden monitorizar. Todas estas estadísticas de morbi-mortalidad no han variado 30 significativamente en las últimas décadas y hasta el momento, no existe una terapéutica eficaz para la prevención y/o reducción de la NTA en todas estas 4 situaciones. A ello ha contribuido en gran medida la falta de marcadores de daño renal más precisos que la determinación de creatinina y urea en suero, utilizados hasta el momento. Estos marcadores clásicos no reflejan directamente el daño celular ni en que compartimento del tejido renal (túbulo o endotelio) se está produciendo el mismo, tan sólo son parámetros indicativos de una función renal alterada consecuencia del 5 daño (Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, et al., Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Kidney Injury in Humans. Clin Transl Sci. ;1(3):200-208, 2008). De hecho, es posible que pacientes con un daño renal subclínico no sean identificados como tales porque no se haya producido una alteración significativa en los niveles séricos de creatinina y urea. Así, en los últimos años se están desarrollado 10 numerosos estudios tratando de identificar y validar nuevos marcadores del FRA como NGAL, IL18, KIM, Cistatina C, VEGF o CXCL10, que parecen funcionar como buenos marcadores en poblaciones infantiles sin patologías añadidas significativas pero no en población adulta (Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, et al., Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Kidney Injury in Humans. Clin Transl Sci. 15 1(3):200-208, 2008). Todo lo expuesto anteriormente justifica la necesidad de identificar y validar nuevos biomarcadores de evolución de daño renal más precisos e indicativos de qué compartimento tisular y en qué grado se está dañando y/o recuperando, cuya determinación además sea rápida, sencilla y sin necesidad de biopsiar al paciente. 20 Descripción de la invención Así pues en un primer aspecto la presente invención se refiere a un método para obtener datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo que comprende determinar el nivel de expresión del micro-RNA miR-93 en una muestra aislada de un sujeto. 25 En la presente invención por daño renal agudo se entiende a cualquier daño producido por una reducción brusca, en horas o en días de la función renal, a una disminución del filtrado glomerular o un acumulo de productos nitrogenados séricos, o a una incapacidad para regular la homeostasis. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para el 30 diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo (de ahora en adelante método de la presente invención) que comprende determinar el nivel de expresión del micro-RNA 5 miR-93 en una muestra aislada de un sujeto y comparar dicho nivel de expresión con un valor control, donde la alteración de dicho nivel de expresión es indicativo de daño renal agudo. En una realización más particular de la presente invención la muestra a analizar es seleccionada entre sangre, suero u orina. 5 En una realización más particular de la presente invención, la disminución del nivel de expresión de miR-93, en suero con respecto al valor control es indicativo de daño renal agudo. En una realización preferente de la presente invención, la expresión del o de los micro-RNAs se determina mediante PCR cuantitativa. 10 En otra realización preferente de la presente invención, el nivel de expresión del micro-RNA se determina mediante micromatrices de RNA. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso del micro-RNA miR-93, para el diagnóstico y pronóstico del daño renal agudo. En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico y/o 15 pronóstico de daño renal agudo (de ahora en adelante kit de la presente invención) según el método de la presente invención que comprende las sondas y cebadores necesarios para determinar el nivel de expresión del micro-RNA miR-93. En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso el kit de la presente invención, para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo. 20 Descripción de las figuras La figura 1 muestra la expresión del miR-93 en suero de pacientes con FRA de etiología isquémica (PI) y de etiología tóxica (PT) desde el momento de su diagnóstico (DO) hasta 7 días después, en comparación con la expresión del miRNA en dos pooles de individuos sanos (healthy). a) Datos del ciclo de amplificación en el que se 25 detecta la expresión del miRNA en todas las muestras (crossing threshold ,CT), respecto a un microRNA sintético empleado como control interno de la técnica, b) número de veces de la expresión del miRNA en pacientes de FRA respecto a individuos sanos que se igualan a 1, mediante una fórmula matemática exponencial. 6 Descripción detallada de la invención En primer lugar se realizó un experimento de estudio de microRNAs a gran escala empleando RNA obtenido de pacientes con fallo renal agudo de diferentes etiologías. Las muestras empleadas para este procedimiento consistieron en: − Dos muestras de pacientes con fallo renal agudo de etiología isquémica en el 5 momento de máximo daño renal, indicado mediante parámetros de diagnóstico clínico habituales, como creatinina sérica. − Dos muestras de estos mismos pacientes a los 7 ó 10 días después del fallo renal, cuando se ha recuperado la función del órgano, de nuevo estimada mediante creatinina sérica. 10 − Dos muestras de paciente con fallo renal producido por sustancias nefrotóxicas, una en el momento de máximo daño y otra cuando ha recuperado función renal. − Una muestra de paciente que presenta fallo renal producido por sepsis tomada en el momento de máximo daño del órgano. 15 − Dos grupos compuestos de 5 personas sanas, empleados como control. El experimento de estudio masivo de microRNAs en suero se realizó mediante PCR cuantitativa empleando las plataformas Taqman Low Density Array (TLDAs) de Applied Biosystems. Mediante el análisis de los datos obtenidos se realizó una selección de los microRNAs de interés para nuestro estudio. 20 Posteriormente se realizó la confirmación de los datos de expresión de los microRNAs seleccionados obtenidos en el experimento anterior. Para ello se emplearon muestras de pacientes diferentes de las anteriores y consistentes en: − Cuatro pacientes con fallo renal agudo de etiología isquémica, denominados PI1, PI2, PI3, PI4. De cada paciente se han empleado muestras a día 0, 25 momento del diagnóstico, 1, 3, 5 y 7 días después del diagnóstico de fallo renal. − Tres pacientes que presentan fallo renal agudo producido por sustancias nefrotóxicas, denominados PT1, PT2, PT3. De cada paciente se han empleado muestras a día 0, momento del diagnóstico, 1, 3, 5 y 7 días después del 30 diagnóstico de fallo renal. 7 − Dos grupos de controles compuestos cada uno de 10 personas sanas. Para la confirmación de los datos se realizó PCR cuantitativa empleando sondas individuales para cada microRNA de tecnología LNA (Exiqon). Como muestra la figura 1 el miR93 en suero disminuye su expresión en los pacientes de FRA respecto a los controles sanos. 5 El miR-93 (figura 1) disminuyó su expresión en los pacientes de FRA respecto a los controles sanos, destacando además, que este miRNA en día 7 mostró una tendencia a recuperar valores cercanos a los controles en algunos pacientes. Además se calcularon los valores de área bajo la curva por análisis de curvas COR para la expresión de este miRNA en distintos pacientes. 10 La tabla 1 muestra que este miRNA tuvo un valor diagnóstico de FRA independientemente de la etiología del FRA, con especificidad y sensibilidad muy superior a la creatinina sérica (marcador utilizado actualmente). Variables resultado de contraste Área Error tip Sig. asintótica Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior miR-93 D0 0,771 0,099 0,036 0,577 0,965 Tabla 1: análisis de las curvas ROC en pacientes de FRA de UVI a día 0 15 Los datos de la tabla 2 demuestran que este miRNA fue más sensible y específico que la creatinina, sugiriendo que a pesar de los valores normales de creatinina el riñón seguía alterado, de tal forma que estos miRNAs tuvieron un alto valor pronóstico de evolución en el tiempo de estos enfermos hacia alteración renal crónica a más largo plazo. 20 Variables resultado de contraste Área Error tip Sig. asintótica Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior miR-93 D7 0,364 0,138 0,293 0,094 0,634 Tabla 2: análisis de las curvas ROC en pacientes de FRA de UVI a día 7. 8 Los datos de la tabla 3 muestran que la alteración en este miRNA indica una predisposición a desarrollar FRA isquémico tras cirugía cardiaca. Variables resultado de contraste Área Error tip Sig. asintótica Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior miR-93b 0,934 0,049 0,000 0,838 1,031 Tabla 3: análisis de las curvas ROC en pacientes previo a la cirugía cardiaca. 5 Los datos de la tabla 4 muestran que la alteración en este miRNA es indicadortemprano de desarrollo de FRA tras cirugía cardiaca. Variables resultado de contraste Área Error tip Sig. asintótica Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior miR-93D0 0,852 0,078 0,003 0,699 1,004 Tabla 4: análisis de las curvas ROC en pacientes inmediatamente después de la cirugía cardiaca. 10

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   9 1. Método para obtener datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo que comprende determinar el nivel de expresión del micro-RNA miR-93, en una muestra aislada de un sujeto.
2. 2. Método según la reivindicación 1 donde la donde la muestra a analizar es 5 seleccionada entre sangre, suero u orina.
3. 3. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo que comprende el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y comparar dicho nivel de expresión con un valor control, donde la disminución del nivel de expresión de miR-93, en suero con respecto al valor control es indicativo de daño renal agudo. 10
4. 4. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la expresión del micro-RNA se determina mediante PCR cuantitativa.
5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones1-3, donde el nivel de expresión del micro-RNA se determina mediante micromatrices de RNA. 15
6. 6. Uso del micro-RNA miR-93 para el diagnóstico y pronóstico del daño renal agudo. FIGURA 1 a) b)