ES2675586T3 - Plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática - Google Patents

Abstract

Una planta Cichorium con esterilidad masculina citoplásmica que comprenden mitocondria de Lactuca, en donde dicha mitocondria de Lactuca comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos mitocondriales seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, y en donde dicha planta de Cichorium comprende un citoplasma maternalmente obtenido a partir de una planta según el depósito NCIMB 42125.

Description

Plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática

La presente invención se refiere a las plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática (“CMS”) y en particular a plantas de achicoria verde con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de achicoria italiana roja con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de achicoria de hoja roja con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de Treviso con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de Pan de azúcar con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de achicoria blanca con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de endivia Belga con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de achicoria de hoja blanca con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas de endivia con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas C. intybus var. foliosum con esterilidad masculina citoplasmática (CMS); plantas C. endivia con esterilidad masculina citoplasmática (CMS) y plantas C. intybus var. sativum con esterilidad masculina citoplasmática (CMS).

Cichorium está disponible en diversas variedades cultivadas claramente diferentes: como achicoria verde, achicoria italiana roja o achicoria de hoja roja, Treviso, achicoria blanca, pan de azúcar, endivia Belga (hoja blanca), achicoria Catalana (todas las C. intybus var. foliosum), endivia (C. endivia), pero también se conoce la achicoria de raíz (C. intybus var. sativum). Esta última se cultiva por su raíz principal, de la que se obtienen diversos productos como la inulina, saborizantes para la cerveza, sucedáneos del café y también sustratos para la producción de polímeros.

La achicoria de hoja blanca se cultiva inicialmente por su raíz principal, que es forzada a producir en oscuridad la conocida achicoria de hoja blanca, endivia Belga o chicon. Esta imposición se realiza de forma hidropónica o convencional.

Ejemplos de achicoria de hoja (Cichorium intybus var. foliosum) son la achicoria italiana roja (con hojas abigarradas en rojo y verde, en ocasiones con nerviaciones blancas), Treviso, achicoria Catalana y la achicoria de corazón verde. Es típico el sabor amargo en todas las variedades de achicoria. Otro miembro de Cichoridae es la endivia, Cichorium endivia.

Las Cichoridae son parte de las Asteraceae (formalmente Compositae) a las que pertenecen, entre otros, el girasol (Helianthus), la lechuga (Lactuca), Calendula, Aster y Echinacea.

Según los antecedentes de la técnica para semillas de Cichorium disponibles comercialmente (como achicoria italiana roja, Treviso y otras), los híbridos se producen mediante certación.

La certación es un fenómeno botánico por el cual hay una competición entre tubos polínicos, que muestran una diferencia en la velocidad de crecimiento. Los tubos polínicos de una misma planta (autopolinización) crecen más lentamente a lo largo del estilo que los tubos polínicos de otra planta que efectúa polinización cruzada. Este mecanismo se explota para aumentar la proporción de polinización cruzada pero la autopolinización, que resulta en la impureza del híbrido deseado, no puede ser excluida. En la práctica, más del 30% de las semillas producidas consisten en productos de la autofertilización, en otras palabras, plantas endogámicas en vez de plantas híbridas. Con el uso de métodos de limpieza de semillas, este porcentaje puede ser reducido al 10-20%, pero es aún indeseablemente alta.

Un inconveniente adicional del uso de la certación es que durante el mantenimiento de la línea femenina (que presenta certación) las plantas individuales que producen más polen expanden sus genes en la población más eficientemente, lo que resulta en una pérdida potencial de certación tras cierto número de generaciones, es decir, una línea parental inservible.

Además, la certación no está presente en todas las líneas de Cichorium, lo que reduce la combinación de posibilidades para producir híbridos de interés comercial.

Para el cultivo de achicoria en todas las formas descritas anteriormente, será ventajoso tener disponibles híbridos F1 muy, preferiblemente substancialmente uniformes al 100%. Estas variedades híbridas de Cichorium presentan diversas ventajas sobre las líneas disponibles comúnmente ahora.

La ventaja más importante es la excelente uniformidad que un híbrido F1 así presentaría, es decir, una uniformidad substancial del 100%. Esto permite una recolección que puede ser realizada de una sola vez o simultáneamente, además de resultar en una pérdida mínima tras clasificar el cultivo.

Por ejemplo, la achicoria italiana roja consigue un color menos intenso cuando el cultivo es expuesto a altas temperaturas y luz solar intensa durante tiempos prolongados. La posibilidad de recolectar simultáneamente este producto daría como resultado una reducción en las pérdidas para el agricultor.

Cuando la planta Cichorium es muy o substancialmente uniforme al 100% respecto a la composición genética, es decir, el genoma, de la planta Cichorium, hay varias ventajas, tanto para el productor de las semillas como para el agricultor del cultivo.

Cuando se puede suministrar un híbrido F1 muy uniforme, el productor tiene la ventaja de que pueden usarse más combinaciones de líneas parentales, lo que resulta en un intervalo más amplio de híbridos disponibles.

Actualmente, tanto los tratamientos de semillas como la preparación y la comparación o selección de semillas son de poco uso, dado que la uniformidad de los lotes de semillas es demasiado baja. Cuando esté disponibles las semillas de alta calidad de los híbridos muy uniformes deseados, resultarán útiles para las semillas procesos como la preparación y otros tratamientos de la tecnología de la semilla.

Para el agricultor, las ventajas de un híbrido muy uniforme son un periodo corto de recolección y procesamiento del total del cultivo, que consiste en un producto muy homogéneo sin los llamados fuera de tipo. Por esta razón, se requiere menos trabajo para recolectar el cultivo y prepararlo para la venta.

Un híbrido muy o sustancialmente uniforme al 100% tiene una calidad uniforme, especialmente en cuanto al color cuando se considera, p. ej. la achicoria italiana roja. Las variedades ahora disponibles en el mercado no pueden garantizar esta uniformidad.

Finalmente, se aprecia que los híbridos F1 muy uniformes mostrarán mejor germinación de las semillas.

La producción de híbridos de Cichorium endivia (endivia) es imposible según los antecedentes de la técnica actuales; un mecanismo como la certación no está presente en la endivia. Por ello la endivia es un cultivo 100% auto-polinizante que, aunque muestra un alto nivel de uniformidad, presenta una heterosis pobre.

Para mejorar los puntos definidos anteriormente se han realizado muchas investigaciones dirigidas a desarrollar otros métodos para la hibridación en Cichorium. Uno de los métodos se describe en solicitudes de patente hechas por Enza Zaden (NL 1001554) y Florimond Desprez (WO 97/45548) donde un factor citoplasmático para el girasol (Helianthus annuus) se introduce por fusión celular en especies de Cichorium. Esto dio como resultado material reproductor de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática (CMS). Una solicitud similar de patente ha sido presentada por Sakata Seeds (WO 2007/049730), en donde CMS de girasol se transfiere a lechuga, Lactuca sativa.

Otra estrategia más se describe en la solicitud de patente WO 2012/163389 de Az. Agricola T&T, donde la esterilidad masculina recesiva, o genéticamente codificada en el núcleo se induce en Cichorium mediante mutagénesis. Los híbridos F1 producidos con este sistema son, debido al carácter recesivo del rasgo descrito, machos fértiles. Un inconveniente adicional de este sistema es que las líneas maternas de los machos estériles (designadas como ms/ms) deben ser propagadas vegetativamente mediante métodos in vitro o in vivo.

Considerando lo anterior, entre otros objetos, un objeto de la presente invención es producir plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática evitando los anteriores inconvenientes del estado de la técnica.

El objeto anterior, entre otros objetos, ha sido cumplido por la presente invención, produciendo plantas como se describe en las reivindicaciones anexas.

Específicamente, el objeto anterior, entre otros objetos, ha cumplido por la presente invención, según un primer aspecto, mediante plantas de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática que comprenden mitocondrias de Lactuca, en donde las mitocondrias de Lactuca anteriores comprenden al menos una secuencia de ácidos nucleicos mitocondriales seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y en donde dicha planta de Cichorium comprende un citoplasma materno derivado de una planta según el depósito NCIMB 42125.

Se inició un programa de investigación para identificar especies de plantas que podrían servir como donantes válidos para la introducción de esterilidad masculina citoplasmática (CMS) en Cichorium. En este contexto, “válido” también significa que se evitan los inconvenientes del estado de la técnica.

En la lechuga, Lactuca sp., no está presente la CMS. Lactuca y Cichorium pertenecen a la familia de las Asteraceae y dentro de esta familia a la tribu de las Cichorieae o Lactuceae, respectivamente.

La combinación de Lactuca y Cichorium se estudió para determinar si la combinación de los núcleos de Cichorium con el citoplasma de Lactuca daría como resultado un Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática (CMS).

En la lechuga, Lactuca sp., no está presente CMS. Lactuca y Cichorium están relacionadas, ambas pertenecen a la familia de las Asteraceae y, dentro de esta familia, a la tribu de las Cichorieae o Lactuceae; por tanto, esta planta fue elegida como candidata tanto para cruces como para fusiones celulares asimétricas con Cichorium.

Con la Lactuca mencionada anteriormente, la combinación con Cichorium se estudió para determinar si la combinación del núcleo de Cichorium con el citoplasma de Lactuca daría como resultado un Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática. Esta investigación se centró especialmente en varias especies de Lactuca dado que la investigación inicial mostró que el cruce de Cichorium con Lactuca dio como resultado un número –limitado– de semillas. Las plantas que crecieron a partir de estas semillas se identificaron como híbridos tanto por citometría de flujo como por estudios moleculares.

Tras la obtención de este híbrido entre Cichorium y Lactuca será necesario realizar varios retrocruzamientos para recuperar el fondo genético de Cichorium. Con un cultivo como Cichorium se requerirán al menos 8 años para reconstruir el genoma completo de estas especies en el producto de los cruces. Además, un cruce entre distintas especies es muy ineficiente, especialmente en las primeras generaciones, por lo que el total de semillas obtenido inicialmente será muy limitado.

Tras varias generaciones el total de genoma de Lactuca está suficientemente diluido pero una generación consanguínea, producida por autopolinización, se requiere para seleccionar la línea parental genéticamente estable candidata para la producción de híbridos. Sin embargo, dado que este material presentará esterilidad masculina, este último paso de autopolinización es imposible.

Para conseguir una solución a los inconvenientes mencionados anteriormente Bejo Zaden B. V. realizó fusiones celulares asimétricas entre especies de Cichorium y Lactuca sp.

Brevemente, se aislaron protoplastos de ambas especies. Los protoplastos de Cichorium (el aceptor) se trataron con yodoacetamida (IOA) o yodoacetato (IA) para inactivar el citoplasma. Los protoplastos de Lactuca sp. (el donante) se trataron con radiación ionizante para inactivar o destruir el genoma nuclear, pero manteniendo elementos genéticos activos en el citoplasma (cloroplastos y mitocondrias).

Tras una fusión celular mediada por polietilénglicol/Ca2+, se forman una o más células nuevas con el genoma nuclear (y por tanto las características hortícolas) de Cichorium, pero con el citoplasma de Lactuca. Esta fusión se puede realizar bien en tubos de ensayo o en placas Petri. Aquí el polietilénglicol actúa como medio para promover la asociación de las células, un alto pH y los iones Ca2+ son un pre-requisito para la fusión celular efectiva. Se usó un procedimiento de tinción con diacetato de fluoresceína para asegurar que las células resultantes son viables.

Se usó un medio adecuado que comprende agua, sales, vitaminas, azúcares y hormonas vegetales para la formación de callos. Seguidamente, se realizó la regeneración de las plantas promoviendo el nacimiento de brotes que finalmente son enraizados; también estas etapas dependen de la aplicación de hormonas vegetales adecuadas.

Tras la regeneración, se chequea que el contenido en ácido desoxirrubonucleico (ADN) de las plantas sea correcto mediante citometría de flujo. Las plantas diploides que se obtienen como resultado del ensayo son sometidas después a un ensayo molecular para comprobar la presencia de citoplasma de Lactuca. Con este fin se usó la técnica de polimorfismo de microsatélites amplificados al azar (RAMP) para discriminar entre los citoplasmas de Cichorium y Lactuca.

Investigaciones adicionales sobre plantas que contienen el material nuclear de Cichorium combinado con el citoplasma de Lactuca han demostrado que, entre las plantas fusionadas regeneradas, hay plantas individuales que presentan esterilidad masculina que retienen fertilidad femenina, es decir, plantas según la presente invención. La frecuencia con la que dichas plantas se identificaron fue de 1 entre 21 plantas fusionadas originales.

La planta obtenida tenía flores con granos de polen visibles en las anteras pero éstos son de menor tamaño que los granos de polen salvaje y usando una técnica de tinción con diacetato de fluoresceína, se mostró que el polen de la planta híbrida no era viable. Por consiguiente, la F1 de las plantas híbridas son machos estériles. Por tanto, a partir de las plantas fusionadas anteriores, se obtienen las plantas Cichorium presentes con capacidad para producir híbridos 100% puros de Cichorium.

Una muestra representativa de una planta según la presente invención se depositó el 28 de marzo de 2013 en el NCIMB, Fergurson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Gran Bretaña con número de depósito NCIMB 42125.

Según una realización preferida de este primer aspecto, la presente invención se refiere a plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, en donde las plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática son identificables además por un marcador molecular de 1592 bp que usa la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32.

Según otra realización preferida de este primer aspecto, la presente invención se refiere a plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, en donde las plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática son identificables además por un marcador molecular de 293 bp que usa la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34.

Según una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a plantas Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática que tienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez de las presentes secuencias de ácidos nucleicos mitocondriales.

Las plantas según la presente invención se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en achicoria verde, achicoria italiana roja, achicoria de hoja roja, Treviso, achicoria blanca, pan de azúcar, endivia Belga, achicoria de hoja blanca, achicoria Catalana, C. intybus var. foliosum, C. endivia and C. intybus L. var. sativum.

Según un segundo aspecto, la presente invención se refiere a métodos para identificar una planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, el método comprende que se determine en una muestra de dicha planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática una o más de las presentes secuencias mitocondriales, es decir,

secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ySEQ ID NO: 10.

Según un tercer aspecto, la presente invención se refiere a métodos para identificar una planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, el método comprende que se determine en una muestra de dicha planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática un marcador molecular de 1592 bp que usa la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32 y/o un marcador molecular de 293 bp que usa la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34.

Se describen las secuencias de ácidos nucleicos mitocondriales seleccionadas del grupo que consisten en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.

Se describen las plantas de Cichorium y Lactuca con esterilidad masculina citoplasmática, en donde las plantas híbridas con esterilidad masculina citoplasmática comprenden mitocondrias de Lactuca y dicha mitocondria comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos mitocondriales seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

Se describen plantas híbridas con esterilidad masculina citoplasmática que son una planta híbrida con esterilidad masculina citoplasmática según el depósito NCIMB 42125 y/o que comprende mitocondrias derivadas de una planta de Lactuca según el depósito NCIMB 41985.

Se describe el uso de mitocondrias de una planta de Lactuca para la obtención de una planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, el presente uso comprende preferiblemente una fusión de protoplastos de un protoplasto de Lactuca con el genoma nuclear inactivado como donante y un protoplasto de Cichorium con el genoma mitocondrial inactivado como aceptor.

A continuación, la presente invención se describirá además en ejemplos de realización preferida de la presente invención. En los ejemplos se hace referencia a las figuras, en donde:

Figura 1: muestra gráficos de citometría de flujo de: (A) Cichorium intybus L. (arriba a la izquierda); (B) Lactuca sp. (arriba a la derecha); (C) Híbrido 1 (según la presente invención; abajo a la izquierda); y (D) una muestra mezcla de A, B y C (abajo a la derecha);

Figura 2: muestra el resultado de la caracterización de ADN nuclear usando la técnica de polimorfismo de microsatélites amplificados al azar. Desde el carril de la izquierda al carril de la derecha, Cichorium intybus (P155); Lactuca sp. (P157); híbridos 1 a 3 (H1-H3, es decir, plantas híbridas de un cruce entre P155 y P157; las bandas discriminadas se indican;

Figura 3: muestra la representación gráfica del tamaño de polen de Cichorium, Lactuca y la planta de fusión seleccionada, P153. Leyenda para este gráfico:

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Eje X: diámetro de los granos de polen en µm2

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Eje Y: porcentaje de granos de polen presentes en los distintos tamaños;

Figura 4: muestra ARRIBA: Fotografía de una flor de P153, una planta seleccionada de los productos de fusión obtenidos descritos. ABAJO: detalle de las anteras que muestra granos de polen (no funcionales);

Figura 5: muestra ARRIBA: Fotografía de una flor fértil de Cichorium intybus L. ABAJO: detalle de las anteras.

Ejemplos

Ejemplo 1. Esterilización y siembra de las semillas

Semillas tanto del donante (Lactuca sp., depositada en 1 de junio de 2012 en el NCIMB, Ferguson Building, Craibston Estate, Bucksburn, Aberdeen, Gran Bretaña como depósito NCIMB 41985, como del aceptor (Cichorium intybus L.) se sembraron in vitro. Para ello se esterilizaron 100 semillas de cada especie mediante un lavado en 70% de etanol en agua, seguido por un tratamiento con una solución de lejía (1% NaOCl (peso/volumen) + 0,01% Tween80 (volumen/volumen) en agua desmineralizada). Tras un lavado extenso con agua desmineralizada, las semillas se introdujeron en un medio adecuado como ½ Murashige y Skoog (MS)15 y se introdujeron en un cuarto de crecimiento a 25ºC, 16/24 horas de luz. Tras 4 semanas las plantas fueron adecuadas para el aislamiento de protoplastos.

Ejemplo 2. Aislamiento de protoplastos

Se recolectaron hojas jóvenes con la superficie esterilizada de plantas de 4 semanas de vida. Estas hojas se cortaron en fragmentos de 1-2 mm en placas de Petri tratadas para cultivos (Greiner bio-one, producto 664160) con

solución de plasmólisis WS9M. Tras recolectar todo el material, esta solución se reemplazó por 20 ml de solución enzimática que contenía enzimas que degradan la pared celular como la pectinasa y/o celulasa. Tras una incubación durante toda la noche (oscuridad, 25ºC) en un agitador orbital a una velocidad de 30 rpm, el material se tamizó en filtros de 110 µm y 53 µm respectivamente; dichos filtros se lavaron dos veces con 10 ml de solución de lavado.

El filtrado recogido se centrifugó durante 5 minutos a 60xg. Tras resuspender el precipitado en 10 de solución de lavado, se repitió esta etapa de centrifugación. Los protoplastos se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento posterior.

Ejemplo 3. Control de viabilidad

Se realizó una prueba de viabilidad de los protoplastos aislados y de los granos de polen con diacetato de fluoresceína. Para ello, se analizaron muestras de los protoplastos teñidos, tanto del donante como del aceptor, o granos de polen recolectados del donante o de plantas fusionadas seleccionadas, con un microscopio de fluorescencia usando los filtros apropiados, con una ampliación de 10 aumentos (10x).

Las células viables se podían reconocer por el color amarillo-verdoso brillante, las células no viables no fluorescen.

Ejemplo 4. Pre-tratamiento de protoplastos aislados

Se trataron los protoplastos aislados del donante (Lactuca) con una fuente de radiación ionizante adecuada (p. ej. una fuente de radiación Roetgen o gamma). Una dosis adecuada está dentro del intervalo de 250-500 Gray como medida de la energía absorbida. Se inactivaron los orgánulos celulares de protoplastos aislados del aceptor (Cichorium intybus var. foliosum), mediante un tratamiento con una concentración final de yodoacetamida de 10 mM (Proveniente de una solución madre y yodoacetamida al 60 mM) durante 10 minutos a 4ºC. Tras este tratamiento las células se lavaron dos veces con solución de lavado y se centrifugaron a 60xg durante 5 minutos.

Ejemplo 5. Fusión de protoplastos

Se añadieron 1x106 protoplastos por tubo de 10 ml (fondo redondo, Greiner, número de catálogo 163189) en solución de lavado (en una proporción de aceptor : donante de 1:1 ó 1:2).

Tras su centrifugación (5 minutos a 60xg) cada precipitado se resuspendió en 0,3 ml de solución de lavado. Después se añadieron 0,4 ml de solución de polietilénglicol 1500 por tubo de ensayo dejando caer gotas individuales en los tubos; no se permitió mezclado adicional en este punto. Tras incubar durante 30 minutos, se añadieron 0,8 ml de solución de dilución de polientilenglicol, dejándola deslizar despacio por la pared del tubo de ensayo. Se mantuvieron las células durante 10 minutos sin mezclado adicional.

Después de esto, se rellenaron los tubos con solución de CPW-Ca++ hasta un volumen final de 10 ml, se centrifugaron las células sin mezclado adicional durante 5 minutos a 60xg. Después de tres lavados repetitivos con CPW-Ca++ los sedimentos se resuspendieron en medio de cultivo PM1 a una densidad final de 20,000 protoplastos por mililitro.

Ejemplo 6. Cultivo de protoplastos fusionados

Ejemplo 6a. Usando medio de regeneración líquido:

El cultivo se realizó en la oscuridad a 25ºC, reemplazando parcialmente el medio de cultivo cada semana:

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placas de 6 cm: se reemplazaron 3 ml (de 4,5 ml) por 3 ml de medio PM1 de nueva aportación.

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placas de 9 cm: se reemplazaron 5 ml (de 9 ml) por 5 ml de medio PM1 de nueva aportación.

Tan pronto como se observaron las primeras divisiones celulares (estadío celular 2 a 4) el medio de cultivo se reemplazó por medio PM2, este medio también fue reemplazado parcialmente de forma semanal, como se ha descrito aquí anteriormente.

Se colocaron callos de 2 mm de diámetro en medio sólido CRM a 1000 lux. Tan pronto como los callos se volvieron verdes, se aumentó la cantidad de luz hasta aproximadamente 1700 lux. Los callos sin brotes se transferían a medio CRM de nueva aportación cada tres semanas.

Los brotes emergentes se cortaron de los callos, dejando detrás la mayor cantidad posible de callo, y se colocaron en medio MS30 con Gelrite en frascos o placas de Petri. Para promover el enraizamiento, los brotes se cortaron para retirar cualquier callo residual y se transfirieron a medio MS30-Gelrite de nueva aportación.

Ejemplo 6b. Embebidos en alginato:

Partiendo de los protoplastos fusionados que se han descrito en el ejemplo 5, los protoplastos fusionados se resuspendieron en solución A; cada tubo contenía 1x106 protoplastos. Se añadieron 2,5 ml de solución A a cada tubo; después de resuspender cuidadosamente las células, se añadieron 2,5 ml de solución de alginato. Se

colocaron gotas de 1 ml de suspensión en medio sólido B. Al cabo de 1 hora, el medio solidificado que incluía los protoplastos se lavó con medio PM1 y se transfirió a placas que contenían 3 o respectivamente 6 ml de medio PM1 (placas de Petri de 6 ó 9 cm de diámetro, respectivamente). Los cambios de medio adicionales fueron similares a los descritos en el ejemplo 6a.

Tan pronto como los callos alcanzaron un diámetro de 2 mm, se disolvió la matriz de alginato reemplazando el medio de cultivo por solución de citrato de sodio 50 mM. Cada disco de alginato se cortó en 8 piezas y los discos se colocaron en un agitador orbital durante 2 horas (30 rpm).

Los micro-callos se recogieron usando una pipeta y se transfirieron a un tubo de ensayo. Se añadió medio PM2 a este tubo hasta un volumen final de 10 ml y después el tubo se centrifugó durante 5 minutos a 60xg.

Tras lavar dos veces con medio PM2, los callos se colocaron en medio CRM a 1000 lux; los callos que se volvieron verdes se cultivaron además a 1700 lux. Los callos se mantuvieron en este medio y se transfererían, en caso necesario, a medio CRM de nueva aportación cada tres semanas.

Los brotes que emergieron de estos callos se cortaron del callo y se colocaron en medio MS30-Gelrite, bien en placas de Petri o en frascos de cristal, los brotes se transfirieron a medio de nueva aportación de la misma composición hasta que se formaron las raíces. Las plantas enraizadas se colocaron en medio MS30.

Ejemplo 7. Determinación del nivel de ploidía.

Se determinó el nivel de ploidía relativo de plantas resultantes de fusiones celulares o cruces entre plantas de Cichorium y Lactuca. Para ello, se tomó una parte pequeña de tejido de la hoja de 1 cm2 de las plantas examinadas y se troceó con una hoja de afeitar en el tampón para ploidía CyStain© UV (Partec, Múnich, Alemania).

Tras la filtración, se determinó el nivel de ploidía de la muestra usando un citómetro de flujo Partec PA y se comparó con el resultado de las muestras de las plantas de Cichorium y Lactuca. Solamente se reservaron las plantas diploides, resultantes de fusiones celulares.

Las plantas resultantes de cruces entre Cichorium y Lactuca sp. presentan un nivel de ploidía intermedio entre Cichorium y Lactuca sp. (Figura 1).

Ejemplo 8. Caracterización molecular del ADN genómico

Se recolectaron varias semillas resultantes del cruce entre Cichorium (ID = P155) y Lactuca (ID = P157), de las cuales se analizaron tres semillas germinadas como se describe en el ejemplo 7 y se identificaron como plantas híbridas. Para caracterizar más estas plantas, se realizó un análisis molecular.

Se aisló el ADN de estas plantas híbridas putativas y de ambos parentales, siguiendo un procedimiento de aislamiento estándar, comenzando con explantes de hojas de ± 0,3 cm2.

Se realizó un análisis de polimorfismo de microsatélites amplificados al azar en estos ADN aislados con dos oligonucleótidos cebadores que generan polimorfismos entre Cichorium y Lactuca. El resultado mostró inequívocamente que la planta híbrida contenía ADN genómico de ambos parentales, demostrando así que esta planta era además un híbrido genómico entre Cichorium y Lactuca.

Los oligonucleótidos cebadores para la reacción fueron:

Bejop09631 AGTCGGGTGG (SEQ ID NO: 37; cebador de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD)).

Bejop01751 CCAGGTGTGTGTGTGT (SEQ ID NO: 38; cebador de inter-secuencias simples repetitivas (ISSR)).

Condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

2 minutos a 93ºC

40 ciclos de: 30 s a 93ºC -30s a 35ºC –90 s a 72ºC

5 minutos a 72ºC

El calentamiento se realiza a 0,3 ºC/s

Ejemplo 9. Electroforesis en gel de poliacrilamida

Se usó un analizador de ADN Gene ReadIR 4200 (Licor Inc.) para analizar los patrones de los polimorfismos de microsatélites amplificados al azar. Se pueden separar fragmentos de ADN que difieren en 1 par de bases sobre la base de una concentración óptima de acrilamida del 6,5%. Se usaron cebadores marcados (marcas de colorante

infrarrojo) para observar estos fragmentos, una tercera parte del total de cebador directo se reemplazó por un cebador marcado idéntico.

El resultado mostró inequívocamente que las plantas obtenidas contenían ADN genómico de ambos parentales, demostrando así que estas tres plantas (de H1 a H3) eran además híbridos entre Cichorium y Lactuca (Figura 2).

Ejemplo 10. Caracterización del ADN mitocondrial de las plantas fusionadas seleccionadas

Se caracterizó el ADN mitocondrial para demostrar que el citoplasma de Cichorium fue reemplazado por el citoplasma de Lactuca.

Los tampones usados son esencialmente como se describe. Sin embargo, algunos tampones se ajustaron como se indica en la sección de “Soluciones y reactivos”. Todas las etapas experimentales se realizaron con tampones preenfriados y a 4ºC, salvo que se especifique de otro modo.

Se homogenizaron 100 gramos de hojas frescas con un homogenizador en 250 ml de tampón de triturado. El material homogeneizado se filtró mediante vacío a través de 4 capas de algodón y dos capas de malla de nylon (75 µm). El residuo fue homogenizado también usando un mortero y mano de mortero pre-enfriados y filtrado posteriormente como se describe.

Los filtrados se agruparon y centrifugaron durante 10 minutos a 1,000xg; el sobrenadante se volvió a centrifugar a 2,000xg. Finalmente, las mitocondrias se recogieron mediante centrifugación a 16,000xg. El precipitado resultante se resuspendió usando una brocha de pintura en 10 ml de tampón de almacenamiento de ADNasa.

Después de la centrifugación a 2,000xg, el precipitado resultante se pipeteó en un tubo de centrífuga y se añadieron 50 µl de MgCl2 2 M y 200 µl de ADNasa a 5mg/ml. Tras una incubación de una hora, se pipetearon 20 ml de tampón de conservación bajo esta mezcla.

Tras la centrifugación a 14,000xg, el precipitado resultante se resuspendió en 10 ml de tampón de conservación. La suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 16,000xg, el precipitado se disolvió en 600 µl de tampón de lisis y se transfirió a un tubo de ensayo Eppendorf de 1,5 ml. En este lisado que contiene el ADN mitocondrial se disolvió 1 mg de proteinasa K y se añaden 10 µl de solución ARNasa-A. La incubación fue primero de 60 minutos a 37ºC, seguida de 30 minutos de incubación a 65ºC.

Tras esta incubación, el ADN se precipitó añadiendo 200 µl de Acetato potásico 5 M y se mezcló rotando el tubo de ensayo, que se dejó entonces 15 minutos en hielo como máximo. Después se centrifugó durante 10 minutos a 20,000xg a temperatura ambiente. Finalmente, el ADN se extrajo posteriormente con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y cloroformo/alcohol isoamílico. La fase acuosa restante se mezcló con 400 µl de isopropanol y 27 µl de acetato de amonio 7,5 M.

Tras centrifugar durante 10 minutos a 20,000xg (20ºC) el precipitado restante se lavó con 500 µl de etanol al 70% en agua y se volvió a centrifugar durante 2 minutos a 20,000xg (20ºC). Tras secar, el ADN resultante se disuelve en 200 µl de tampón Tris-ácido etilén diaminotetra acético (EDTA).

Se realizó una segunda precipitación del ADN añadiendo 20 µl de acetato de sodio a 7,5 M y 150 µl de isopropanol, la mezcla se mezcló suavemente durante unos pocos segundos.

La siguiente centrifugación es de 10 minutos a 2,000xg (20ºC). El precipitado se lavó con 500 µl de etanol al 70% en agua y se volvió a centrifugar brevemente (2 minutos a 20,000xg (20ºC). El precipitado se secó y se disolvió en 22 µl de agua ultra pura estéril. El almacenaje fue a 4ºC.

Se determinó la pureza y concentración del DNA usando un espectrofotómetro Nanodrop 2000, un fluorímetro Qubit

2.0 y técnicas estándar de electroforesis en gel de agarosa.

La secuencia del ADN mitocondrial aislado se determinó por secuenciación de próxima generación utilizando técnicas de secuenciación generalmente conocidas por aquella persona entrenada en la técnica.

Esta secuenciación dio como resultado la identificación de diversas regiones en donde el ADN mitocondrial (ADNmt) de la planta de Cichorium CMS seleccionada es igual bien a la planta fértil Cichorium original o al donante Lactuca, lo que demuestra que el ADN mitocondrial de la planta de Cichorium CMS seleccionada es un reordenamiento del ADNmt de la planta fértil Cichorium original y del donante Lactuca.

Para ello, se desarrollaron 4 grupos de cebadores de PCR destinados a identificar el ADNmt reordenado único de las plantas fusionadas seleccionadas que llevan al fenotipo CMS. También se desarrollaron grupos de 17 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como una caracterización adicional del producto fusionado seleccionado (Tabla 2). A partir de estos datos se concluye que la planta de Cichorium CMS seleccionada contiene un ADN mitocondrial reorganizado único con fragmentos de ambas líneas parentales que son responsables del carácter CMS de la planta descrita. Los detalles experimentales se muestran en las tablas mencionadas anteriormente.

Tabla 1. Datos para las reacciones de PCR que discriminan entre los parentales para la fusión y los Cichorium CMS seleccionados

Combinación de cebadores

Secuencia del cebador directo Secuencia del cebador reverso Lactuca Cichorium fértil Cichorium CMS Tamaño del fragmento

1

SEQ ID 29 SEQ ID 30 - + + 611 bp

2

SEQ ID 31 SEQ ID 32 + - + 1592 bp

3

SEQ ID 33 SEQ ID 34 + - + 293 bp

4

SEQ ID 35 SEQ ID 36 - + + 107 bp

SEQ ID 29: GCCTCCAGGGTATGATCCTTAA

5 SEQ ID 30: CGAGCACTTATTTGACCTGTGT SEQ ID 31: TGCTAACGAGGTTCAATGATG SEQ ID 32: TTCGATTCAGGATCAAGCCCAG SEQ ID 33: TCGATATTCTTTTCGCGACAGG SEQ ID 34: TTAGGTTATTTCGTTGGTCGCC

10 SEQ ID 35: TTTATAGACAGCGACTCCCTCC SEQ ID 36: ACCTGAAGGGAGTTATGGCATT Las condiciones para esta reacción fueron como sigue: Se aisló el ADN total de tejido de hojas jóvenes como se describe y se trataron con ARNasa A/T1. La integridad del

ADN se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se diluyó el ADN de todas las muestras a 15 ng/µl para

15 las reacciones de PCR. El total de ADN molde fue de 15 ng por reacción de PCR. La PCR para ambas combinaciones de marcadores se llevó a cabo usando Biomix Red (GC Biotech) en reacciones de 20 µl con 10 pmol de cada cebador mencionado anteriormente. Los parámetros de la PCR fueron:

1 minuto a 94ºC 30 ciclos de: 15 s a 94ºC; 15 s a 58ºC; 1 minuto a 72ºC

20 5 minutos a 72ºC Almacenar a 4ºC. Se cargaron 5 µl de las reacciones de PCR en un gel de agarosa al 1% y se separaron usando técnicas estándar,

conocidas por el experto en la técnica.

Tabla 2. Secuencia de los 17 marcadores SNP desarrollados para discriminar entre los parentales para la fusión y la planta fusionada seleccionada. Se indican las secuencias usadas y entre corchetes ([N/N]) está el nucleótido único que difiere entre las plantas como se aclara en las tres columnas a la derecha de esta secuencia. El análisis se realizó por LGC Genomics, ver en www.lgcgenomics.com

SNP SEQ ID

Secuencia Lactuca Cichorium fértil Cichorium CMS

1

CCGAACCGCGCGAAATGGTCGCCTATTACACGGCTCACTAACTCTGCCTG[G/T] AGTGGTGGTACCTATTATTCGTCGGCGGGGGCGGTCCGGCGATAC G T G

2

CTCTTAAGGTTAGTTCTATGCCTCACAACAACTACCTCATAGGTGATTCT[A/C]AA TCCGTCTTTAGATCAGAAGTAGATGCCTCTTCCAGGGCTCTGT A C A

3

GTACCAAATGCTTGGCAATCCTTGGTAGAGCTTATTTATGATTTCGTGCT[G/T]AA CCTGGTAAACGAACAAATAGGGGGTCTTTCCGGAAATGTTAAA T G T

4

TATTGATTACACTCCTTCTCCTACTGCTTCTCCTTATACCCACTAATGTT[A/C]TTC TTCGTCCTACCTTGACTATTGGGAAATTTCCATTCGAGAAAG C A C

5

TGCAGCGTAAACTCCTGCTAAATGAATGCCTTTGCTTTGGCTTTGAAATT[A/C]T GTTCCTGATTCAACTCCTTCATGCCATTGATTGATGCAAGTCTT A C A

6

CTGAATGACCTCTCTCATCTAATCGATCGGTGAAGGATGTCTTTGAAGAT[A/C]A TCTGGTCTGGCTCGTTACCATTAGTTCCTCTCTCTATAGTCGAG A C A

7

CTCTTGTTCTCTTTTCTTAGTTAGGCCCAAGAAAGTACAAGATATAGCTT[G/T]AC TAATATACTAAGATGATAGCTAGAGACTAGAGATGAGAGTGCA G T G

8

TTGGATATTGTACGACAGGATCCCCATCCGTGTTTTCGTTTCGCTAACGA[G/T]A AAGGCCGGAAAGCGTGGGACCTATTTAAGTGACCTGGCCGATGG G T G

9

TTTTTCGTTCCTTCTCTTCGATAAGAATATCGATTTGAAATGATAAAAAT[GjT]CCT CTTTATTCTCTTGTGCTCAGCGAAAGAACTGCCTAAGCATAC G T G

10

GTCCGATCGTCGCTAGAGGCCCGTCGACTATAATACACTGTTCGAAATTT[A/C]T TCGTTTCTGCCGAAACAAAACGGGATTGGCTATCTTAACCTTAG A C A

11

AAGGAAATGATCTTTACATGGAAATGAAAGAATCTGGAGTAATTAATGAA[A/C]AA AATATTCCAGAATCAAAAGTAGCTCTAGTTTACGGTCAGATGA A C C

SNP SEQ ID

Secuencia Lactuca Cichorium fértil Cichorium CMS

12

GGGGCGTCCAAAGAGTCGATCATTTCTGCATGACTCGTGCACT[A/G]CCCCTTC CAATGGGTTTCGAAGATAAAAATCCTTTATTGGCCCAT A G G

13

CATACGCTAAAATTTGTCCCTTTTTAATGCATTTACCCCGCTGAACCTGG[A/G]G TTTTTGATGCATACAAGTATTTTTGTTGGAACGTTGATACATAA G A A

14

AGATAAAAATAACAAGGAATAGAATTTGATTAGTTGGTATTCAAAATATA[C/T]GA TTCAAGTAGTCAAGTCGAGAAAGAGATGGTTGAATCAAAATAA T C C

15

TAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCAGGAACAGGCTCGATTCCATAGCA[G/T]C GCCCTTTGTAACGATCAAGGCTCGTAAGTCCATCGGTCCACACA T G G

16

ACTTTTTATTGGCATTGGAAGCACATTACATTATGGCAGGGTAATGTTTC[A/G]CA GTTTAATGAATCTTCCACTTATTTGATGGGCTGGTTAAGAGAT G A A

17

GGTATGAATAGTTTATCAGTCTGGGCATGGATGTTTTTATTTGGACATCT[G/T]GT TTGGGCTACTGGATTTATGTTTTTAATTTCCTGGCGTGGATAT G T T

Ejemplo 11. Caracterización de los granos de polen

Para ilustrar la diferencia entre la planta de achicoria fértil original y las plantas fusionadas seleccionadas, se realizó un estudio de los granos de polen disponibles. Estudiando la planta fusionada seleccionada P153, fueron visibles granos de polen putativos, sin embargo, tanto un intento de auto-polinización como una tinción con acetato de

5 fluoresceína (ejemplo 3) mostraron que este polen putativo no era funcional.

Ensayos adicionales del polen de Cichorium y de la planta fusionada seleccionada mostraron que los granos de polen de esta última eran significativamente menores. Los granos de polen, resuspendidos en WS9M se visualizaron mediante técnicas normalizadas de campo claro en un microscopio invertido con un objetivo con lente de 10 aumentos y se grabaron con una cámara CCD de 3 MB. Las imágenes digitales de los granos de polen se

10 procesaron y analizaron con Image J (Ransband, W.S., Image J, U.S., National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imageJ.nih.gov/ij/, 1997-2012).

Las imágenes se convirtieron a imágenes de binarias de 8 bit. Los huecos se cerraron, los valores atípicos negros se eliminaron (radio = 10 píxeles), y las proyecciones de los granos de polen que se tocaban entre sí se separaron mediante el comando “divisor” (watershed). Las imágenes resultantes se analizaron con el comando “análisis de

15 partículas” (analyze particles) para obtener las áreas de superficie de las proyecciones de los granos de polen. Los objetos en contacto con el borde de la imagen fueron excluidos. Las medidas se convirtieron en µm2 y se promediaron usando las funciones estadísticas de Microsoft Excel.

Para las plantas fusionadas seleccionadas la superficie polínica varió entre 1150 y 1850 µm2 (desviación típica = 180), para los granos de polen dela planta de Cichorium original, la superficie estimada estuve entre 1550 y 2550

20 µm2 (desviación típica = 226). Más aún, el análisis de la t de Student indicó que la probabilidad de que ambas poblaciones de granos de polen sean iguales está por debajo de 0,01 (Figura 3).

Soluciones y reactivos

Si no se indica lo contrario todas las soluciones fueron tratadas en autoclave (20 minutos a 120ºC).

25 Medio WS9M

Solución enzimática: Medio WS9M enriquecido con:

Celulasa Yakult Onozuka R10

0,2% (p/v)

Pectinasa (Sigma, P4300) pH 5,6-5,7, esterilizada por filtración

0,2% (p/v)

pH 5,6-5,7, esterilizada por filtración

Solución de lavado:

CaCl2.2H2O

13,6 mM

KCl

0,34 M

MES (monohidrato)

2,8 mM

pH 5,8; 640 mOsm/kg

Solución madre de IOA 60 mM: 0,222 g de IOA por 20 ml de solución de lavado

Solución de PEG1500:

PEG1500

40 % (p/v)

Glucosa anhidra (p/v)

0,3 M

CaCl2.2H2O

50 mM

esterilizada por filtración

Solución de dilución de PEG

Glicine

50 mM

glucosa anhidra

0,3 M

CaCl2.2H2O

50 mM

pH 10,5; 520 mOsm/kg; esterilizada por filtración

Solución CPW-Ca++ de 200 ml

Medio CRM

Medio MS (Duchefa; M0222)

4,40 gram

Sacarosa

30 mM

Zeatina

4,56 µM

BA

2,22 µM

Hidrolisado de Caseína (Duchefa; C1301)

300 mg/l

agar (Duchefa; M1002)

8 g/l

pH 5,7

Citrato de sodio 50 mM: solución A, solución de alginato de sodio, medio B: referencia 5 Medio B5 Gamborg: Mezcla para PCR:

Tris-HCl (pH 8,8)

75 mM

NH4SO4

20 mM

Tween20

0,01% (v/v)

MgCl2

2,8 mM

dNTP

0,25 mM

Cebador directo

0,15 µM

Cebador inverso

0,2 µM

ADN Polimerasa Red Hot ® (ABgene, Epsom U.K.)

0,04 unidades/µl

ADN genómico vegetal

∼0,2 ng/µl

Tampón de trituración

Sorbitol

0,35 M

Manitol

0,1 M

Tris-HCl pH 7.6

50 mM

Na2-EDTA

5 mM

BSA

0,2 % (w/v)

PVP

1,0 % (w/v)

Espermidina

0,025 % (w/v)

β mercaptoetanol

0,125 % (v/v)

DIECA

10 mM

Tampón de almacenamiento de ADNasa

Acetato de sodio

5 M

CaCl2.2H2O

1 M

pH 4,5 usando ácido acético;

antes de su uso, se añade un volumen igual de glicerol

Tampón de ADNasa (DB) (4ºC)

Tampón de conservación

Sacarosa

0,6 M

Tris HCl pH 7,2

10 mM

Na2-EDTA

20 mM

DIECA (añadir inmediatamente antes de su uso)

10 mM

Tampón TE

Tris-HCl pH 7,5

50 mM

Na2-EDTA

10 mM

5 mg/ml de ADNasa en tampón de almacenamiento de ADNasa

MgCl2 2 M

Proteinasa K

Solución de ARNasa: Thermo Scientific producto número EN0551 5 M en acetato de potasio

Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1)

Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1)

Acetato de amonio 7,5 M Acetato de sodio 7,5 M pH 4,5-5,2

Abreviaturas: BA: 6-benzil-aminopurina bp: pares de bases

5 BSA: albúmina sérica bovina CMS: con esterilidad masculina citoplásmica

esterilidad masculina citoplásmica DIECA: Dietilditiocarbamato de sodio EDTA: ácido etilén diaminotetraacético

10 FDA: fluoresceína diacetato IOA: yodoacetamida IA: yodoacetato MES: ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico mtDNA: ADN mitocondrial

15 NAA: ácido 1-naftalenoacético ng: nanogramo PCR: reacción en cadena de la polimerasa PEG: polietilenglicol PVP: polivinilpirrolidona

20 RAMP: polimorfismos de microsatélites amplificados al azar SD: desviación típica SNP: polimorfismo de un solo nucleótido

K: G o T)

M: A o C ) códigos de ambigüedad de nucleótidos 25 R: G o A) según las reglas de la IUPAC

Y: T o C)

Listado de secuencias

30 <110> Bejo Zaden B.V.

<120> PLANTA CITOPLASMÁTICA CICHORIUM MASCULINA

<130> 4/2OL49/18

<160> 38

<170> BiSSAP 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca 5

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Lactuca" 10

<400> 1

15 <210> 2

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

20 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Lactuca"

25 <400> 2

<210> 3 30 <211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220> 35 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 3 40

<210> 4

<211> 96 45 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 4

<210> 5 10 <211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220> 15 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 5 20

<210> 6

<211> 96 25 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente 30 <222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 6

<210> 7

<211> 96

<212> ADN 40 <213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 45 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 7

<210> 8

<211> 96 5 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente 10 <222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 8

<210> 9

<211> 96

<212> ADN 20 <213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 25 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 9

<210> 10

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca 35

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca” 40

<400> 10

<210> 11

<211> 96

<212> ADN 5 <213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 10 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 11

<210> 12

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca 20

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca” 25

<400> 12

30 <210> 13

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

35 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

40 <400> 13

<210> 14 45 <211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 14

10 <210> 15

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

15 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

20 <400> 15

<210> 16 25 <211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220> 30 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 16 35

<210> 17

<211> 96 40 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente 45 <222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 17

<210> 18 5 <211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220> 10 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 18 15

<210> 19

<211> 96 20 <212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente 25 <222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 19

<210> 20

<211> 96

<212> ADN 35 <213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 40 <223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 20

<210> 21

<211> 96 5 <212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente 10 <222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 21

<210> 22

<211> 96

<212> ADN 20 <213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 25 <223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 22

<210> 23

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium 35

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium" 40

<400> 23

<210> 24

<211> 96

<212> ADN 5 <213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 10 <223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 24

<210> 25

<400> 25

20 000

<210> 26

<211> 96

<212> ADN 25 <213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 30 <223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 26

<210> 27

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium 40

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium" 45

<400> 27

<210> 28

<211> 96

<212> ADN 5 <213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 10 <223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 28

<210> 29

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales 20

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales" 25

<400> 29

30 <210> 30

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

35 <220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

40 <400> 30

<210> 31 45 <211> 21

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220> 50 <221> fuente

<222> 1..21

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 31 55

<210> 32

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 32

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales" 25

<400> 33

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

35 <220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 34

<210> 35 45 <211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 35 55

<210> 36

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 36

<210> 37

<211> 10

<212> ADN 15 <213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..10 20 <223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador RAPD” /organismo="secuencias artificiales"

<400> 37

<210> 38

<211> 16

<212> ADN

<213> secuencias artificiales 30

<220>

<221> fuente

<222> 1..16

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador iSSR” /organismo="secuencias artificiales" 35

<400> 38

40 Sequence listing

<110> Bejo Zaden B.V.

<120> PLANTA CITOPLASMÁTICA CICHORIUM MASCULINA 45

<130> 4/2OL49/18

<160> 38 50 <170> BiSSAP 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> ADN 55 <213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 60 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 1

<210> 2 5 <211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220> 10 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 2 15

<210> 3

<211> 96 20 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente 25 <222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 3

<210> 4

<211> 96

<212> ADN 35 <213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 40 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 4

<210> 5

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca 50

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca” 55

<400> 5

<210> 6

<211> 96 5 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente 10 <222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 6

<210> 7

<211> 96

<212> ADN 20 <213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 25 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 7

<210> 8

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca 35

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca” 40

<400> 8

45 <210> 9

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

50 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

55 <400> 9

<210> 10

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 10

15

<210> 11

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

25

<400> 11

<210> 12

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

35 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 12

<210> 13 45 <211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 13 55

<210> 14

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 14

<210> 15

<211> 96 15 <212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 15

<210> 16

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96 35 <223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 16

<210> 17

<211> 96

<212> ADN

<213> Lactuca

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo=“ADN” /organismo=“Lactuca”

<400> 17

55 <210> 18

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 18

<210> 19

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 19

25 <210> 20

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

35 <400> 20

<210> 21

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220> 45 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 21

<210> 22

<211> 96 55 <212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 22

<210> 23

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium 10

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium" 15

<400> 23

20 <210> 24

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

25 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

30 <400> 24

<210> 25 35

<400> 25

40 <210> 26

<211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

45 <220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

50 <400> 26

<210> 27 55 <211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220>

<221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 27

<210> 28 10 <211> 96

<212> ADN

<213> Cichorium

<220> 15 <221> fuente

<222> 1..96

<223> /mol_tipo="ADN" /organismo="Cichorium"

<400> 28 20

<210> 29

<211> 22 25 <212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente 30 <222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 29

35 gcctccaggg tatgatcctt aa 22

<210> 30

<211> 22

<212> ADN 40 <213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22 45 <223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 30

cgagcactta tttgacctgt gt 22 50

<210> 31

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencias artificiales 55

<220>

<221> fuente

<222> 1..21

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales" 60

<400> 31

tgctaacgag gttcaatgat g 21

<210> 32

<211> 22 5 <212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 32

15 ttcgattcag gatcaagccc ag 22

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22 25 <223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 33

tcgatattct tttcgcgaca gg 22

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales 35

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 34

ttaggttatt tcgttggtcg cc 22

45 <210> 35

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

55 <400> 35

tttatagaca gcgactccct cc 22

<210> 36

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencias artificiales

<220> 65 <221> fuente

<222> 1..22

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador" /organismo="secuencias artificiales"

<400> 36

5 acctgaaggg agttatggca tt 22

<210> 37

<211> 10

<212> ADN 10 <213> secuencias artificiales

<220>

<221> fuente

<222> 1..10 15 <223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador RAPD” /organismo="secuencias artificiales"

<400> 37

agtcgggtgg 10 20

<210> 38

<211> 16

<212> ADN

<213> secuencias artificiales 25

<220>

<221> fuente

<222> 1..16

<223> /mol_tipo="ADN" /nota=“cebador iSSR” /organismo="secuencias artificiales" 30

<400> 38

ccaggtgtgt gtgtgt 16

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una planta Cichorium con esterilidad masculina citoplásmica que comprenden mitocondria de Lactuca, en donde dicha mitocondria de Lactuca comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos mitocondriales seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:

   5 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, y en donde dicha planta de Cichorium comprende un citoplasma maternalmente obtenido a partir de una planta según el depósito NCIMB 42125.
2. 2. La planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática según la reivindicación 1, en donde dicha planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática es identificable además por un marcador molecular de 1592 bp usando la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32.

   10 3. La planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática es identificable además por un marcador molecular de 293 bp usando la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34.
3. 4. La planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha al menos una secuencia de ácidos nucleicos mitocondriales es al menos dos, al menos tres, al menos

   15 cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez secuencias de ácidos nucleicos mitocondriales.
4. 5. La planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha planta de Cichorium se selecciona del grupo que consiste en achicoria verde, achicoria italiana roja, achicoria de hoja roja, Treviso, achicoria blanca, pan de azúcar, endivia Belga, achicoria de hoja blanca, achicoria

   20 Catalana, C. intybus var. foliosum, C. endivia, y C. intybus var. sativum.
5. 6. Un método para identificar una planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, donde dicho método comprende determinar en una muestra de dicha planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática una o más secuencias de ácidos nucleicos mitocondriales seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y

   25 SEQ ID NO: 10
6. 7. Un método para identificar una planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática, donde dicho método comprende determinar en una muestra de dicha Planta de Cichorium con esterilidad masculina citoplasmática un marcador molecular de 1592 bp usando los cebadores de amplificación de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32 y/o un marcador molecular de 293 bp usando los marcadores de amplificación de ácidos nucleicos SEQ

   30 ID NO: 33 ySEQ ID NO: 34.