EA032108B1

EA032108B1 - Способы получения обладающих цитоплазматической мужской стерильностью растений petroselinum crispum, обладающие цитоплазматической мужской стерильностью растения petroselinum crispum, их семена и их растительные части

Info

Publication number: EA032108B1
Application number: EA201590996A
Authority: EA
Inventors: Корнелис Глас; Николас Йоханнес Дол; Витте Ван Каппеллен; Альбертус Йоханнес Мария Схрейвер
Original assignee: Бейо Заден Б.В.
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2019-04-30
Also published as: HRP20180807T1; AU2012395191A1; HUE038376T2; ES2675995T3; PL2922958T3; EA201590996A1; EP2922958A1; TR201810193T4; UA116221C2; EP2922958B1; RS57258B1; AU2012395191B2; US20150296734A1; WO2014079498A1; US10021848B2; NZ709007A

Abstract

Данное изобретение относится к способам получения обладающих цитоплазматической мужской стерильностью растений Petroselinum crispum, обладающим цитоплазматической мужской стерильностью растениям Petroselinum crispum и к семенам, клеткам, тканям и частям указанного растения. Конкретно данное изобретение относится к способу получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, содержащему слияние первых протопластов, полученных из растения Foeniculum vulgare Mill., имеющих, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, со вторыми протопластами, полученными из растения Petroselinum crispum, имеющими, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифицированный ядерный геном, и регенерацию из слитых протопластов обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum.

Description

Данное изобретение относится к способам получения обладающих цитоплазматической мужской стерильностью растений РеГгозейпит спзрит, обладающим цитоплазматической мужской стерильностью растениям РеГгозейпит спзрит и к семенам, клеткам, тканям и частям указанного растения. Конкретно данное изобретение относится к способу получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Рейозейпит спзрит, содержащему слияние первых протопластов, полученных из растения Еоешси1ит уи1даге М111., имеющих, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, со вторыми протопластами, полученными из растения РеГгозейпит спзрит, имеющими, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифицированный ядерный геном, и регенерацию из слитых протопластов обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения РеГгозейпит спзрит.

Данное изобретение относится к способам получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Рейоке1шит сйкрит. обладающим цитоплазматической мужской стерильностью растениям Рейокейпиш сйкрит и к семенам. клеткам. тканям и частям указанного растения.

Рейокейпиш сйкрит или петрушка принадлежит к семейству зонтичные или сельдерейные. Членами этого семейства являются плосколистная петрушка (Р. сйкрит уаг. пеаро1йапит). петрушка с закручивающимися листами (Р. сйкрит уаг. сйкрит) и петрушка НатЬигд или корневая петрушка (Р. сйкрит уаг. 1иЬегокит).

Петрушка листового типа часто применяется в качестве гарнира и имеет типичный аромат. вызванный типичными летучими маслами. подобными миристицину. и флавоноидами в виде апиина.

Корневая петрушка имеет длинный. мясистый. белый стержневой корень. обычно применяемый в качестве овоща или используемый в супах или рагу. Корень богат каротином. витаминами В2 и С. Листья растения готовят подобно листовой петрушке. Корневая петрушка особенно популярна в Германии. Австрии. Венгрии и России. В Западной Европе эта культура в настоящее время является заново открываемой. особенно в органическом плодоводстве.

Другими членами семейства зонтичные являются. например. пастернак (Ракйпаса кайуа). морковь (Эансик саго1а Ь.). сельдерей (Аршш дгауео1епк Ь.). фенхель (Гоешси1ит уи1даге МШ.). тмин (Сагит сагу1). анис (Р1трте11а ашкит). укроп (АпеШит дгауео1епк) и кориандр (Сойаийгит кайуит).

Для культивации петрушки в настоящее время доступны только перекрестноопыляющиеся кроссбредные сорта. В результате отсутствия мужской стерильности или. например. самонесовместимости сельскохозяйственной культуры невозможно образование Г1 гибридов.

Г1 гибриды в целом обладают преимуществами над перекрестноопыляющимися культурами. В соответствии с руководством Рйпар1ек οί Р1аШ Сепейск апб Вгеейтд Ьу 6. АсциааН (В1аск\\'е11 РиЬйкй1пд. Ι8ΒΝ-13: 978-1-4051-3646-4; 2007; сйар!ег 18) гибридный сорт представляет собой Г1 приплод планированного скрещивания между инбредными линиями. Критическое требование к производству гибридов заключается в том. что родители должны быть неидентичными. Эта дивергенция придает гибридам их превосходящие характеристики из-за задействования гетерозиса или гибридной силы. Гибридная сила может быть определена как увеличение размера. силы. плодородия и общей производительности гибридного растения по сравнению со средней производительностью двух родительских растений (1Ь1б. радек 334-335).

Пригодность Г1 гибридов для петрушки считается имеющей преимущество над существующими в настоящее время перекрестноопыляющимися кроссбредными сортами по ряду причин. Г1 гибриды по сравнению с доступными перекрестноопыляющимися сортами обычно имеют улучшенную всхожесть. более высокие урожайности. большую силу и/или высокое единообразие.

В целом Г1 гибриды сельскохозяйственной культуры могут быть продуцированы с применением обладающих мужской стерильностью родительских линий. которые являются. по существу. неспособными самоопыляться и применяются в качестве материнских линий. Альтернативой. известной для культур Вгаккка. является применение самонесовместимых растений. которые не могут самоопыляться и. следовательно. это делает возможным производство Г1 гибридов.

Обладающие мужской стерильностью родительские линии предоставляют генетическую композицию потомства. так как наследование признаков. по сути. фиксировано. Половина ядерного генетического материала потомства. т. е. ядерного генома. происходит от мужской родительской линии (обладающей мужской фертильностью). тогда как другая половина ядерного генетического материала потомства. т.е. ядерного генома. происходит от женской (обладающей мужской стерильностью) родительской линии. из которой получено семя Г1.

Растения петрушки. однако. обычно являются как мужскими. так и женскими (т.е. однодомными). и отсутствие обладающих мужской стерильностью родительских растений. таких как в перекрестноопыляющихся кроссбредных сортах. делает невозможным на 100% достоверное предсказание генетической структуры или (ядерного) генотипа потомства. По меньшей мере. некоторое потомство в отсутствие обладающих мужской стерильностью растений в результате самоопыления содержит генетический материал или ядерный геном. происходящий только из одной родительской линии.

Термин гибрид. Г1 гибрид или цибрид часто применяется в данной области для обозначения того. что растения. к которым это относится. являются гетерозиготными. по меньшей мере. по нескольким (коммерчески интересующим) генотипическим признакам. Обычно гибрид. Г1 гибридный или цибрид обозначается в данной области как содержащий гетерозиготный ядерный геном.

Мужская стерильность у растений обычно относится к цитоплазматической мужской стерильности. в которой определяющий генетический фактор расположен в цитоплазме. Для многих растений продемонстрировано. что этот определяющий генетический фактор находится в митохондриях и обычно заключает в себе мутацию в митохондриальной ДНК.

Митохондрии наследуются потомством через яйцеклетку или. другими словами. женским наследованием и не посредством пыльцы или. другими словами. мужским наследованием. Цитоплазматическую мужскую стерильность также обозначают в данной области абревиатурой ЦМС.

В некоторых растениях помимо цитоплазматической мужской стерильности также наблюдается

- 1 032108 ядерная (мужская) стерильность. Для ядерной (мужской) стерильности, в отличие от цитоплазматической кодируемой стерильности, генетический фактор в ядерном геноме или ДНК ядра ответствечает за наблюдаемую стерильность. Эта ядерная стерильность может относиться к мужской, женской или общей стерильности.

Оба типа стерильности, т.е. цитоплазматическая мужская стерильность и ядерная (мужская) стерильность могут быть легко определены. Цитоплазматическая мужская стерильность наследуется только через женскую родительскую линию. В отличие от этого, в качестве неотъемлемого результата присутствия в ядре ядерная стерильность обычно проявляет наследование по Менделю.

Посредством применения ЦМС перекрестное опыление будет приводить в результате к на 100% чистым или настоящим Р1 гибридам. В отличие от этого, при применении нормальных однодомных растений петрушки в следующем поколении будет происходить некоторый процент самоопыления.

Фенхель является разновидностью семейства сельдерейные, в котором ЦМС является общим признаком, применение Р1 гибридов для фенхеля является общеизвестным. В фенхеле не известен ни один ген, который восстанавливает фертильность; следовательно, он является идеальным источником ЦМС.

Было продемонстрировано, что возможно получить скрещивание между петрушкой и фенхелем. Другими словами, скрещивание, в котором одна родительская линия, опылитель, является петрушкой и другая родительская линия является ЦМС фенхелем. Однако это скрещивание оказалось очень неэффективным. Вместо ожидаемого количества из по меньшей мере 2500 семян только очень ограниченное количество семян могло быть получено посредством цветения этих растений в присутствии мясных мух. Также большинство этих семян являлись нежизнеспособными. После прорастания семени требуемое потомство действительно было получено.

Хотя, в конечном счете, при помощи эмбрионального спасения это полученное потомство могло быть скрещено в дальнейшем с петрушкой, тем самым уменьшая количество ядерного генома фенхеля, после нескольких генераций возвратного скрещивания требовалась инбредная генерация, осуществляемая самоопылением.

С применением инбредной генерации, по сути, возможно отбирать потомство, имеющее требуемый фенотип (геном петрушки без характеристик фенхеля). Несмотря на это, большое количество поколений все еще будет содержать небольшие количества фенхеля ДНК, приводя к нежелательной характеристике или признакам в полученном гибриде. Нельзя предсказать, в какой временной точке эта остающаяся ДНК фенхеля будет элиминирована из ядерного генома.

Однако в данном случае для обладающего цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) фенхеля требуемая инбредная генерация гибрида фенхель-петрушка невозможна из-за того, что растения, необходимые для этого, обязательно являются обладающими мужской стерильностью, следовательно, осуществление инбредной генерации технически невозможно.

Принимая во внимание среди прочего вышеприведенные преимущества Р1 гибридов, такие как улучшенная всхожесть, более высокие урожайности, большая сила и/или более высокое единообразие, в данной области существует потребность в предоставлении цитоплазматических, обладающих мужской стерильностью (ЦМС) растений Рс1го5с1йшт сг^рипъ.

Соответственно среди прочих задач задача данного изобретения заключается в удовлетворении этой потребности.

Вышеприведенная потребность среди прочих потребностей удовлетворена в соответствии с первым аспектом данного изобретения предоставлением способа, как определено в п.1 прилагаемой формулы изобретения.

Особым образом вышеприведенная потребность среди прочих потребностей удовлетворена в соответствии с первым аспектом данного изобретения посредством способа для предоставления обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Ре1Ю8е1тит сгорит, содержащего

a) предоставление первых протопластов, полученных из растения, выбранного из группы, состоящей из Эаисих саго1а Ь., Роешси1иш уи1даге МШ., Лрщт дгауео1еи8 Ь. и РаЪтаса кайуа Ь., где первые разновидности протопластов имеют, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму по сравнению с растительными клетками, из которых они произведены; эти первые протопласты могут также быть обозначены как донорные протопласты;

b) предоставление вторых протопластов, полученных из растения Ре1го8е1тит спирит, в котором вторые протопласты имеют, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифицированный ядерный геном по сравнению с растительными клетками, из которых они произведены; эти вторые протопласты могут также быть обозначены как акцепторные протопласты;

c) слияние указанных первых и вторых протопластов с получением слитого продукта между акцепторным протопластом и донорным протопластом;

ά) получение обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Ре1го8е1тит сгщрит из слитого продукта указанной первой и второй разновидности протопластов и необязательно

е) получение гибрида скрещиванием полученного обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Ре1го8е1тит сгщрит по этапу (ά) с однодомным растением Р. сгорит.

В контексте данного изобретения растительный гибрид, гибрид Р1 или цибрид являются растения

- 2 032108 ми, которые содержат, по меньшей мере, гетерологичные или чужеродные органеллы, такие как митохондрии или хлоропласты. Другими словами, этот растительный гибрид, гибрид Р1 или цибрид содержит органеллы, происходящие из другого растительного сорта, и эти органеллы не обнаруживаются в этих растениях в природе. Растительный гибрид, гибрид Р1 или цибрид могут также быть обозначены как растения, которые, по меньшей мере частично, содержат цитоплазму, которая происходит или получена из другого сорта или разновидности.

Генотип ядра растений в соответствии с данным изобретением, по существу, является идентичным одному из родительских растений, а именно акцепторному растению. Однако ДНК цитоплазмы растений в соответствии с данным изобретением отличается от этого родительского растения. Эта цитоплазма, по меньшей мере частично, получена от другого родительского растения, донорного растения. Это другое родительское растение является растением другого сорта или разновидности, чем первое родительское растение.

Технологии и способы для предоставления протопластов, т.е. растительных клеток с, по меньшей мере частично, удаленной клеточной стенкой известны в данной области. В целом протопласты получают расщеплением выделенных растительных клеток или тканей со смесью подходящих разрушающих полисахарид ферментов, таких как целлюлазы, пектиназы и/или ксиланазы.

Технологии и способы слияния или комбинирования имеющихся протопластов известны в данной области. Слияние протопластов, например, может быть обеспечено комбинированием имеющихся протопластов в смеси и впоследствии подверганием этой смеси электрошоку или подверганием этой смеси композиции, содержащей полимер, такой как полиэтиленгликоль, и катион, такой как Са²⁺, со щелочным рН.

Технологии и способы для предоставления растения из имеющегося слитого продукта известны в данной области. Имеющийся слитый продукт может, например, быть стимулирован применением гормонов для генерирования клеточных стенок, для формирования каллуса впоследствии и регенерирования в полноценные растения. Предоставление необязательно может содержать, как, например, в случае предоставления Р1 гибрида, один или более общепринятых этапов скрещивания, предпочтительно с сортами петрушки, представляющими коммерческий интерес.

Термин инактивированный ядерный геном в контексте данного изобретения обозначает ядерный геном, который больше не способен к митозу и/или мейозу. Другими словами, протопласт или растительная клетка, произведенная из него, с инактивированным ядерным геномом больше не являются способными к клеточному делению. Данная инактивация ядерного генома, например, может быть обеспечена посредством применения радиационной обработки данных протопластов с рентгеновской (X) или гамма (γ) радиацией. Альтернативно ядро клетки может быть удалено ультрацентрифугированием в градиенте плотности.

Термин инактивированная цитоплазма в контексте данного изобретения обозначает, что органеллы в цитоплазме больше не способны к участию в клеточном делении. Другими словами, протопласт или растительная клетка, произведенная из него, с инактивированной цитоплазмой больше не является способной к клеточному делению. Данная инактивация цитоплазмы, к примеру, может быть обеспечена посредством подвергания данных протопластов реагентам, таким как йодацетамид или йодацетат.

Термин немодифицированная цитоплазма в контексте данного изобретения обозначает, что цитоплазма, по существу, подобна цитоплазме исходной клетки. Другими словами, протопласты с немодифицированной цитоплазмой рассматриваются как первоначальная цитоплазма, независимо от клетки, из которой произведен протопласт.

Термин немодифицированный ядерный геном в контексте данного изобретения обозначает, что ядерный геном, по существу, подобен ядерному геному исходной клетки. Другими словами, протопласты с немодифицированным ядерным геномом рассматриваются как обладающие первоначальным ядерным геномом, независимо от ядерного генома клетки, из которой произведен протопласт.

Посредством применения данного способа кодируемая ядром генетическая композиция или ядерный геном вторых протопластов, по существу, не изменяется. В результате обладающее цитоплазматической мужской стерильностью растение Рс1го5с1пшт епкрит предоставляется непосредственно, без необходимости в дальнейших (возвратных) этапах скрещивания.

Однако дополнительные этапы скрещивания могут быть применены для добавления дополнительных (представляющих коммерческий интерес) признаков данному обладающему цитоплазматической мужской стерильностью растению Ре1то8е1тит сгорит. Эти скрещивания также охватываются данным изобретением при условии, что потомство сохраняет цитоплазматическую мужскую стерильность.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения донорное растение, выбранное из группы, состоящей из Иаисик сато!а Ь., Роешси1ит уи1даге М111., Лрштп дгауео1еп§ Ь. и Ракйпаса δηΐίνη Ь., имеет фенотип с цитоплазматической мужской стерильностью.

В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления данного способа способ дополнительно после этапа (с) или (б) содержит отбор диплоидных слитых продуктов и/или диплоидных растений.

В ряде случаев некоторые слитые продукты и/или растения, полученные после слияния протопла- 3 032108 стов, имеют уровень девиантной плоидности, такой как тетраплоидный, октаплоидный и иногда анеуплоидный уровень. Эти девиации часто в результате приводят к нежелательным растениям, таким как обладающие женской стерильностью растения. Следовательно, выгодно отбирать только такой слитый продукт и/или растения, например проточной цитометрией, которые с точки зрения содержания ядерной ДНК являются подобными диплоидному акцепторному растению.

Дополнительно проточная цитометрия предоставляет возможность детектировать и впоследствии элиминировать встречающиеся генетические девиации, такие как неожиданный и нежелательный ядерный геномный материал от первых протопластов, обнаруживаемых в слитом продукте.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления данного способа вышеприведенные описанные первые протопласты получены из Роешси1ит уи1дате М111., предпочтительно из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Роешси1ит уи1дате М111.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления данного способа вышеприведенные описанные первые протопласты, имеющие, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, получают подверганием ионизирующей радиации, предпочтительно гамма-радиации, с дозой по меньшей мере 200 Гр, предпочтительно по меньшей мере 300 Гр и более предпочтительно по меньшей мере 400 Гр.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления данного способа вышеприведенные описанные вторые протопласты имеют, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, неинактивированный ядерный геном посредством подвергания воздействию йодацетамида, предпочтительно в концентрации по меньшей мере 5 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 10 мМ, наиболее предпочтительно по меньшей мере 15 мМ.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного способа этап (с) содержит опосредованное полиэтиленгликолем слияние протопластов.

Данный способ преимущественно предоставляет обладающие мужской цитоплазматической стерильностью растения Ребохебиит спхрит. Следовательно, в соответствии с дальнейшим аспектом данное изобретение относится к обладающему цитоплазматической мужской стерильностью растению Ре1тохебиит спхрит, получаемому по данному способу, содержащему митохондрии и/или хлоропласты, полученные из растения, предпочтительно обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения, выбранного из группы, состоящей из Эансих сато!а Ь., Роешси1ит уи1дате М111., Аршт дтауео1еих Ь. и Рахбиаса хабуа Ь, предпочтительно содержащего митохондрии и/или хлоропласты, полученные из Роешси1ит уи1дате М111.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого аспекта первый протопласт получен из растения Роешси1ит уи1дате М111. с номером доступа ЫС1МВ 42055 (депонировано 26 сентября, 2012 в ЫС1МВ Ыб, Регдихои Вш1бтд, Сга1Ьх1опе Ех(а1е, ВискхЬити, АЬегбееи АВ21 9Уа, ИК) и/или второй протопласт получен из растения РеГтохебиит спхрит уаг. 1иЬетохит с номером доступа ЫС1МВ 42056 (депонировано 26 сентября, 2012 в ЫС1МВ Ыб).

В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение относится к применению обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Ребохебиит спхрит в соответствии с данным изобретением для предоставления Р1 гибридов РеГтохебиит спхрит.

В соответствии с еще одним другим аспектом данное изобретение относится к семенам, частям растения, тканям или клеткам, полученным из или происходящим из имеющегося растения ЦМС петрушки, как описано выше.

В соответствии с еще одним другим аспектом данное изобретение относится к применению цитоплазмы, полученной из растения, предпочтительно обладающего мужской цитоплазматической стерильностью, выбранного из группы, состоящей из Эансих сато!а Ь., Роешси1ит уи1дате М111., Аршт дтауео1еих Ь. и Рахбиаса хабуа Ь., предпочтительно Роешси1ит уи1дате М111., для предоставления обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Ребохебиит спхрит.

Данное изобретение в дальнейшем подробно описано в следующих примерах предпочтительных вариантов осуществления. В примерах осуществлены ссылки на прилагаемые фигуры.

Фиг. 1 демонстрирует изображение гель-электрофореза продуктов амплификации. Треки 1 и 2 демонстрируют беглецов, т.е. растения из клеточного слияния, демонстрирующие модель цитоплазмы петрушки; треки 3-8, 10 и 11 демонстрируют слитые растения в соответствии с данным изобретением, таким образом это является петрушкой с цитоплазмой фенхеля; трек 9 демонстрирует маркер ДНК 100 п.о.; треки 12-15 демонстрируют первоначальный акцепторный материал петрушки и треки 16 и 17 демонстрируют донорный материал фенхеля.

Фиг. 2 демонстрирует репрезентативную проточную цитограмму фенхеля.

Фиг. 3 демонстрирует репрезентативную проточную цитограмму петрушки.

Фиг. 4 демонстрирует репрезентативную проточную цитограмму гибрида из фенхеля и петрушки в соответствии с данным изобретением.

Примеры.

Пример 1. Общий протокол.

Семена Р. спхрит уат. ТиЬегохит (акцептор), а также семена донорного растения стерилизовали по

- 4 032108 следующей обработкой с горячей водой, промывкой с 70% этанолом и обработкой с разбавленным бытовым отбеливателем. После споласкивания семян стерильной водой семена проращивали на М830 или подобной среде.

Использовали только черешки из проростков. Протопласты выделяли обработкой материала после предварительного плазмолиза с разрушающими клеточную стенку ферментами, такими как пектиназа и целлюлаза в плазмолизирующем растворе. После фильтрации и центрифугирования протопласты доноров обрабатывали гамма радиацией. Протопласты акцепторов обрабатывали йодацетамидом (ΙΟΑ). Обе разновидности протопластов комбинировали и впоследствии сливали. Во время полиэтиленгликоль(ПЭГ)-опосредованного слияния протопласты не перемешивали, для того чтобы избежать нарушение процесса слияния.

После слияния ПЭГ постепенно вымывали и протопласты заливали в альгинат. Срезы отвердевшей среды с альгинатом, которые включали в себя слитые протопласты, переносили в жидкую среду, стимулирующую клеточное деление. В этой среде присутствовали сахар в виде глюкозы и гормоны в виде 2,4Ό, зеатина и им подобного.

После появления каллуса микрокаллусы удаляли из отвердевшей среды с альгинатом и переносили в среду для роста твердого каллуса. После достижения диаметра 8 мм и некоторой степени позеленения каллусы переносили на среду для регенерации. Регенерированные каллусы переносили на свежую среду для регенерации каждые 3 недели. На этой среде развивались черенки стебля и иногда соматический зародыш. Развившиеся черенки стебля помещали в среду ΒΒν для укоренения. Соматический зародыш помещали в среду для роста зародыша и впоследствии помещали на М830 или подобную среду.

Во время переноса из среды для клеточного деления (СРР) посредством среды для роста (СРРЭ) в среду для регенерации (М2+) и, в конечном счете, среду М830 осмотическая концентрация среды постепенно снижалась.

Уровень плоидности полученных растений исследовали посредством определяющей относительное содержание ДНК проточной цитометрии образца листа. Растения с относительным содержанием ДНК, которое соответствует содержанию ДНК в первоначальных растениях петрушки, сохраняли, все другие растения уничтожали.

Сохраненные растения в дальнейшем анализировали посредством применения молекулярных биологических технологий. С применением ДНК, выделенных из листа, проверяли наличие требуемых митохондрий (т.е. от донора) посредством праймеров для ПЦР, являющихся специфичными к митохондриальной ДНК фенхеля. Растения с цитоплазмой акцепторов (которые можно было считать беглецами) выбраковывали.

Остающиеся растения поддерживали скрещиваниями в тепличных и полевых условиях с исследованием их практической применимости. Характеристиками, представляющими интерес, являлись мужская стерильность, формирование семени и качество растения.

Пример 2. Поверхностная стерилизация семени.

Каждое из семян корневой петрушки (РеГгокейпит спкрит уаг. ШЬегокит) в качестве акцептора и из фенхеля (Роешси1ит уи1даге М111.) в качестве донора помещали в отдельные чайные сита. Сита помещали в водяную баню с 50°С на 10 мин. Впоследствии чайные сита погружали в смесь, состоящую из 70% этанола и 30% воды на 10 с. За этим следовала 20 мин обработка с 0,3% (мас./об) ЫаОС1+0,01% Т\уееп 80. Эту и все следующие обработки выполняли в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха.

Впоследствии чайные сита с семенами промывали 3 раза со стерильной водой в течение 1, 3 и 5 мин соответственно.

Пример 3. Посев стартового материала для выделения протопластов.

Семена акцептора и донора отбирали из чайных сит примера 2 в стерильных условиях и помещали в среду М830 в стеклянные контейнеры. Контейнеры с 8 семенами в каждом помещали в помещение с микроклиматом при 25°С (16 ч света, 4000 люкс). После от 3 до 5 недель проросшие растения были пригодны для выделения протопластов.

Пример 4. Выделение протопластов.

Черешки проросших акцепторных растений собирали в чашках Петри диаметром 9 см с 15 мл МЬР. Когда все черешки были собраны, эти черешки разрезали на куски со средней длиной 1,5 мм.

Черешки проросших донорных растений также собирали и разрезали в МЬР. Однако когда количества доступного материала было недостаточно (к примеру, в результате слабого прорастания семени), добавляли сами листья.

Раствор МЬР удаляли аспирацией и замещали на 20 мл свежего раствора фермента в расчете на чашку Петри. Этот раствор фермента имеет очень специфичную силу тяжести по отношению к протопластам. Чашки Петри инкубировали при 25°С в течение ночи в темноте. Их помещали на орбитальный встряхиватель с амплитудой 15 мм и скоростью 30 об./мин. После этого инкубирования суспензии фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 110 мкм и 53 мкм соответственно. Фильтрат переносили в 12 мл пробирки для центрифугирования, в которые переносили 8 мл фильтрата в расчете на пробирку.

На этот слой суспензии фермент-протопласты осторожно пипетировали 3 мл промывочного раствора

- 5 032108 \У5 (с более низкой специфической силой тяжести) с последующим центрифугированием в течение 7 мин при 100хд. После центрифугирования полосы чистых протопластов были различимы в пробирках на границе раздела фермента и промывочного раствора. Разрушенные протопласты. клеточные стенки и им подобное собирали на дне пробирки.

Полосу. содержащую протопласты. собирали с применением пипетки и в новые пробирки собирали максимальное количество 4 мл суспензии. В эти пробирки добавляли дополнительный промывочный раствор \¥5 до конечного объема 12 мл. Пробирки центрифугировали снова с течение 7 мин при 100хд. и впоследствии промытые протопласты становились различимы в виде осадка на дне пробирки. Жидкий супернатант декантировали и протопласты осторожно ресуспендировали в конечном объеме промывочного раствора \¥5 11 мл.

Из каждой суспензии (донорной и акцепторной) отбирали 1 мл в качестве контроля. Образец этого контроля подвергали обсчету с применением гемоцитометра для определения общего количество выделенных протопластов.

Пробирку с протопластами доноров заворачивали в алюминиевую фольгу и помещали на лед. Гамма облучение выполняли с применением радиации с дозой 400 Гр. После радиации образец культивировали отдельно в качестве контроля.

Протопласты акцептора обрабатывали следующим образом: из соответствующего стокового раствора в \У5 ΙΟΑ добавляли до конечной концентрации 15 мМ. Инкубирование выполняли при комнатной температуре. Инкубирование прекращали центрифугированием протопластов. декантированием супернатанта и ресуспендированием протопластов в промывочном растворе ν5. Общее количество времени инкубирования составляло 15 мин. включая время центрифугирования.

Впоследствии акцепторные протопласты промывали один раз с промывочным раствором \У5 при помощи центрифугирования. После этой обработки ΙΟΑ отбирали контрольный образец обрабатываемых клеток и культивировали отдельно.

Пример 5. Слияние протопластов.

Протопласты из обеих суспензий протопластов смешивали в соотношении 1 акцептор:2 донорных протопласта. Эту суспензию распределяли в достаточное количество 10 мл пробирок для анализов таким образом. что в каждой тестовой пробирке содержался 1 млн протопластов.

После центрифугирования (7 мин при 100хд) объем доводили до 0.3 мл. К этой суспензии протопластов добавляли 400 мкл раствора ПЭГ. Предоставляли пробиркам с протопластами возможность отстаиваться 30 мин без возмущающего воздействия. Впоследствии добавляли 800 мкл разбавляющего раствора ПЭГ с последующим этапом ожидания 15 мин.

Затем в каждую пробирку добавляли 5 мл раствора СР\У/Са с последующим центрифугированием (7 мин при 100хд. без замедления впоследствии). Супернатант осторожно декантировали и осадок ресуспендировали в 5 мл свежего раствора СР\У/Са и центрифугировали снова в тех же условиях.

После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 10 мл раствора установленного раствора А в расчете на пробирку. Клетки промывали при помощи центрифугирования. ресуспендировали в уравновешенном растворе А и центрифугировали снова. как описано выше. В конечном счете. клетки комбинировали в одной или. когда необходимо. в большем количестве 50 мл пробирок для анализа и ресуспендировали в уравновешенном растворе А до достижения плотности 400000 клеток на мл.

К этой суспензии добавляли равный объем раствора альгината и впоследствии суспензию высевали частями по 800 мкл на маленькие чашки Петри (ф 6 см) с раствором В. После 1 ч капли затвердевали изза полимеризации альгината.

Пример 6. Регенерация.

Альгинатные срезы со слитыми протопластами промывали в среде СРР и переносили на чашки Петри со свежей средой СРР. Применяли 5 мл среды СРР в расчете срез 800 мкл. Еженедельно полную среду обновляли удалением старой среды аспирацией и добавлением свежей среды на чашки Петри. После приблизительно 3 недель были генерированы каллусы. В момент. когда эти каллусы достигали диаметра приблизительно 3 мм. их удаляли из альгината. Для этого срезы разрезали на 8 частей и среду замещали 15 мл 50 мМ №-1-цитратного раствора. Чашки Петри помещали на орбитальный встряхиватель с амплитудой 15 мм и скоростью 30 об/мин.

После 1 ч альгинатный матрикс разрушали и каллусы высвобождали. собирали при помощи центрифугирования (7 мин при 100хд) и помещали на твердую среду СРРЭ. После 1 недели адаптации чашки Петри помещали на свет. Каждые 3 недели растущие каллусы переносили на свежую среду. В момент. когда каллусы зеленели и достигали диаметра приблизительно 8 мм. их помещали на среду для регенерации М2+. Каждые 3 недели среду обновляли переносом каллусов на новые чашки Петри с той же средой.

Стеблевые черенки. которые генерировались на среде. подвергали ускорению в среде ΒΒ\ν. Появлявшийся соматический зародыш помещали в среду М820-СА3. Зрелые растения. выращенные на этой среде. переносили в среду М820. Когда укорененные растения достигали 3-листовой стадии. их переносили в почву для дальнейшего развития в теплице.

- 6 032108

Пример 7. Проточная цитометрия.

Уровень плоидности регенерированных растений определяли проточной цитометрией. С этой целью образец известного диплоидного растения измеряли в качестве стандарта и образцы регенерированных растений сравнивали с ним. Для каждого растения отбирали часть 1 см² листа и разрезали в буфере □АР! (Раг1ес, Мипз1ег, Оегтапу) с применением лезвия бритвы.

Образец фильтровали с применением фильтра 30 мкм СеПТпсз® (Раг1ес) и измеряли с Раг1ес РА (Раг1ес, Мип81ег, Оегтапу). Результаты продемонстрировали относительную величину плоидности по отношению к контролю. В дальнейшей экспериментальной работе применяли только растения с диплоидной моделью корневой петрушки.

Пример 8. Молекулярные исследования.

Для растений с доказанным диплоидным характером определяли наличие фрагмента ДНК, представляющего интерес (из цитоплазмы фенхеля и, следовательно, относящегося к требуемому признаку ЦМС).

Образец листа или каллуса с массой от 100 до 200 мг замораживали в пробирке эппендорф при -20°С. После размораживания образец размельчали в 350 мкл буфера для экстракции ДНК. Впоследствии добавляли дополнительное количество 350 мкл буфера для экстракции ДНК. После центрифугирования (10 мин при 10000хд) супернатант декантировали и осадок переносили в 125 мкл буфера для экстракции ДНК. После этого посредством смешивания добавляли 175 мкл буфера для ядерного лизиса и 60 мкл 10% Νлаурилсаркозина.

Эту смесь инкубировали при 65°С в течение 20 мин с последующей экстракцией с 50-100 мкл смеси хлороформ: изоамиловый спирт. Экстракт центрифугировали при 10000хд в течение 10 мин и супернатант переносили в новую пробирку эппендорф. 500 мкл изопропанола с температурой -20°С добавляли в эту пробирку для анализа и пробирку центрифугировали при 10000хд в течение 2 мин.

После декантирования супернатанта осадок промывали с 100 мкл 70% этанола (4°С) и после высушивания осадок растворяли в 125 мкл буфера ТЕ. В конечном счете этот раствор ДНК разбавляли (10х) стерильной водой.

Выделенную цитоплазматическую ДНК анализировали посредством технологии ПЦР на наличие характерного фрагмента. Для каждой комбинации донор-акцептор разрабатывали протокол для обеспечения отчетливого различения между обоими возможными партнерами по слиянию.

Таблица 1. Комбинация праймеров, приводящая к полиморфизму для петрушки (акцептор) по сравнению с несколькими донорами цитоплазмы.

Донор:	Фенхель Г. уи1даге	Морковь Ό. сагоЪа	Сельдерей А. 4ΧΗνβο1βη3	Пастернак Р. заЪл/уа
ДНК	2 мкл	2 мкл	2 мкл	2 мкл
10х ПЦР буфер Ιηνί-Ьгодеп	2,5 мкл	2,5 мкл	2,5 мкл	2,5 мкл
50 мМ МдС1₂	2,4 мкл	2,4 мкл	1,2 мкл	1,2 мкл
ΝΤΡ’ з	0,3 мкл	0,3 мкл	0, 6 мкл	0,3 мкл
Праймер (1 мкл, 5 пМ)	Р3558	Р3558	Р10987	Р11087
Праймер (1 мкл, 5 пМ)	Р7054	Р7054	Р10988	Р10988
Н₂О	15,7 мкл	15,7 мкл	16,6 мкл	16,9 мкл
Р1аД1пит Тад	0,1 мкл	0,1 мкл	0,1 мкл	0,1 мкл
Программа	ИР1	ИР1	ИР2	ИР2
Расщепление	ΜηΙΙ	ΗίηΕΊ	Тад!	А1и1

- 7 032108

Программа ^Р1

1	93°С	2 мин
2	62°С	1 мин
3	72°С	1,75 мин
4	93°С	30 секунд
5	62°С	1 мин
6	72°С	1,75 мин
7	Повторение 39 раз
	этапов 4-	6
8	72°С	5 мин
9	20°С	2 0 мин
	Программа \\'Р2

1	94°С	5 мин
2	50°С	1 мин
3	72°С	1 мин
4	94°С	30 секунд
5	50°С	1 мин
б	72°С	2 мин
7	Повторение	2 9 раз
	этапов 4-6
8	72°С	5 мин
9	20°С	2 0 мин

Таблица 2. Расщепление амплифицированных продуктов

	ΜηΙΙ	ΗίηΕΙ	Тад1	А1и1
ДНК		5 мкл	5 мкл	5 мкл	5 мкл
ΝΕΒ буфер 2	(10х)	1,2 мкл	1,2 мкл	-	1,2 мкл
ΝΕΒ буфер 3	(Юх)	-	-	1,2 мкл	-
раствор В5А	(100х)	0,12 мкл	-	0,12 мкл	-
фермент		2 единицы	2 единицы	2 единицы	2 единицы
Н₂О		5,48 мкл	5, 60 мкл	5,58 мкл	5,60 мкл
Температура расщепления		37°С	37°С	65°С	37°С

Расщепление происходит в течение 8 ч при 37°С.

Таблица 3. Последовательность применяемых праймеров

Р3558	5’-СААААСТАТСААААССТССАСС-3’
Р7054	5’-ССТТТТТТСАТСССССТССАСС-3’
Р10987	5’-СССААТСТТТААССААСАСАТСС-3’
Р10988	5’-АТСТСТСССТСССТСАССТТСС-3’
Р11087	5’-СТАССАТАСААТТССТСССТССС-3’

Пример 9. Гель-электрофорез. В случае если различия в размере между фрагментами маркера являются достаточно большими, различия в модели полос индивидуальных растений можно визуализиро- 8 032108 вать. например. посредством гель-электрофореза. Применяемые агарозные гели были составлены из 1.5%-агарозного буфера ТАЕ и обеспечены бромидом этидия для визуализации полос ДНК с применением УФ света. Иллюстративные результаты такого гель-электрофореза полученных амплификацией продуктов продемонстрированы на фиг. 1. Фиг. 1 демонстрирует. что растения в соответствии с данным изобретением (треки 3-8. 10 и 11) обеспечивали цитоплазматическую амплификацию продукта с идентичным размером продукта амплификации донорного растения фенхеля. тогда как продукт амплификации акцепторного растения корневой петрушки отсутствовал. Соответственно это демонстрирует. что фенотипически корневые растения петрушки в соответствии с данным изобретением имеют цитоплазму. полученную из фенхеля.

Пример 10. Гибриды.

Десять выбранных корневых растений петрушки Л0666 и десять обладающих мужской стерильностью растений фенхеля 1531 яровизировали в незамораживаемой камере в течение зимы. Весной эти растения переносили вместе в теплицу. После визуальной проверки первых соцветий фенхеля на мужскую стерильность растения выделяли в непроницаемой для насекомых камере. В эти камеры помещали куколок крылатых насекомых. обеспечивая наличие крылатых насекомых для опыления. Когда необходимо.

вводили новых куколок крылатых насекомых до тех пор. пока растения не завершали цветение.

Семена собирали после созревания обладающих мужской стерильностью растений фенхеля. Неопыленное соцветие контрольного растения фенхеля не формировало семя. Это демонстрирует. что эти растения являлись действительно обладающими мужской стерильностью. Из всех собранных 39 семян только 1 семя проросло. Проточноцитрометрический и молекулярный анализ продемонстрировал. что это растение действительно являлось промежуточным между фенхелем и корневой петрушкой. Результаты проточноцитрометрического анализа продемонстрированы на фиг. 2-4. где третье изображение демонстрирует гибридный характер идентифицированного растения.

Композиция сред.

Если не указано иное. среды и растворы. приведенные ниже для тканевого культивирования. являлись подвергнутыми автоклавированию (при 120°С в течение 20 мин).

Среда М320, М530 в расчете на литр

Соли М3, включая витамины

4,40 грамма

Сахароза гезр. 30 граммов

Агар ЦагсЫп граммов рН 5, 8

Раствор фермента.

Раствор ЕКИ, содержащий:

Целлюлаза Р.10

1,5%

Мацерозим

0, 1% рН 5,6; стерилизован фильтром ν5.

Ь. Мепс/е1. Е. №ду. Ζ. Κΐκκ и Р. Ма11да. ТЕеог. Арр1. 6епе1 70: 590-594 (1981).

граммов грамма

0,075 грамма

0,188 грамма

Глицин

2,7 грамма

0,368 грамма мОсм/кг;

- 9 032108

СРИ/Са⁺⁺

СРЭД 10 х сток

Маннит

СаС1₂-2Н₂О рН 5,7; 530 мОсм/кг; стерилизован фильтром

200 мл мл

13,3 грамма

1,47 грамма

СРV 10х стоковый раствор.

Ргеагкоп, Е. М., Ро^ег, I. В., Сосктд Е. С. Оесе1ортеп1а1 Вю1оду, 33, 130-137 (1973).

Уравновешенный раствор А 250 мл

СаС1₂-2Н₂О

36,8 мг

Маннит

19,7 грамма рН 5,8, автоклавирован

Раствор альгината; раствор В.

В. Ватт, К. ΒοΙιιιιίιίΐ апб Е. ^Итйгег. Мо1. Оеп. Оепе!. 217: 6-12 (1989).

мм Ыа-цитратный раствор, МЕР, ΕΚν, СРР и СРР10.

К. Пика, V. 81богоу апб С. Ти1тапк: ТЬеог. Арр1. Оепе!. 93 809-815 (1996).

Среду СРР дополняли с 0,2 мг/л 2,4Ό и 0,1 мг/л зеатина.

Среду СРРП дополняли с 0,1 мг/л ΝΑΑ и 0,2 мг/л зеатина.

М2+ среда в расчете на литр;

IX. Vаηбетоо^!е1е, б.Р. ВШагб, I. Воисаиб апб Т.Оакраг (1994). Меб. Рас. Рапс1Ьои\у\у. Ишу. Оеп! 59: 1455-1459 (1994).

Описанная среда М2 дополнена с 20 мг/л аденинсульфата и обозначена М2+.

в расчете на литр

Среда ВВИ

Соли М3 (ОисЬеРа агС МО221)

4,40 грамма

Сахароза граммов

ΙΑΑ мг

Агар РагсЫп граммов рН 6, 0

М320-САЗ в

расчете на литр

Соли М3 (ОисЬеРа агС МО221)

4,40 грамма

Сахароза граммов

СА₃ мг

Агар ОагсЫп граммов рН 5, 8

ДНК буфер для экстракции.

0,35 М сорбит.

0,1 М основание Трис (рН 7,5).

0,005 М Ыа₂-ЕОТА.

0,02 М ЫаН8О₃ (свежедобавленный). Буфер для ядерного лизиса.

0,2 М основание Трис (рН 7,5).

0,05 М Ыа₂-ЕОТА.

М ЫаС1.

2% СТАВ (цетилтриметиламмония бромид). Хлороформ: изоамиловый спирт.

объема хлороформа + 1 объем изоамилового спирта. ТЕ буфер.

мМ Трис-ЫаОН (рН 8,0).

мМ Ыа₂-ЕОТА.

ΝΕΒ буфер 2, ΝΕΒ буфер 3 и раствор В8А.

Получали у Νο'\ν Епд1апб Вю1аЬ§, 1рк^1'сК, МА01938, И8А.

ТАЕ буфер (конечные концентрации).

мм трис-уксусная кислота, рН 8,5.

мМ Νι.-ΕΙ )ТА.

Агароза 1,5% (мас./об).

Бромид этидия 0,5 мкг/мл.

- 10 032108

	СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>	Ве)о БаЗеп Β.ν.
<120>	СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ОБЛАДАЮЩИХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ

РАСТЕНИЙ РЕТНОБЕЫЫиМ СК1БРБМ, ОБЛАДАЮЩИХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ РАСТЕНИЙ РЕТНОБЕЫЫиМ СКТБРБМ И СЕМЯН И ИХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЧАСТЕЙ

<130>	4/2ЫЛ60/17
<160>	5
<170>	В1ББАР 1.0
<210> <211> <212> <213>	1 22 ДНК искусственные последовательности

<220> <221> <222> <223>	источник 1..22 /тип молекулы=ДНК /замечание=последовательность праймера р3558 /организм=искусственные последовательности
<400>	1

саааадЬаЬд аааадсЬдда дд 22

<210> <211> <212> <213>

2 22 ДНК искусственные последовательности

<220> <221> <222> <223>	источник 1..22 тип молекулы=ДНК /замечанием¹ последовательность праймера р7054 /организм=искусственные последовательности
<400>	2

ссЬЬЬЬЬЬда ЬсссдсЬдда дд 22

<210> <211> <212> <213>

3 23 ДНК искусственные последовательности

<220> <221> <222> <223>	источник 1..23 /тип молекулы=ДНК /замечанием¹ последовательность праймера р10987 /организм=искусственные последовательности
<400>	3

сссааЬсЬЬЬ ааддаадада Ьсд 23 <210> 4 <211> 22 <212> ДНК

- 11 032108 <213> искусственные последовательности <220>

<221> источник <222> 1..22 <223> /тип молекулы=ДНК /замечание=последовательность праймера р10988 /организм=искусственные последовательности <400> 4 аГдГсГссдГ сдсГдасдГГ сд <210> 5 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственные последовательности <220>

<221> источник <222> 1..23 <223> /тип молекулы=ДНК /замечание=последовательность праймера р11087 /организм=искусственные последовательности <400> 5 дГасдаГада аГГссГсддГ дсд 23

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Ре1го8е1шит стщрит. включающий слияние первых протопластов. полученных из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Еоешси1ит уи1дате МШ.. имеющих. по существу. инактивированный ядерный геном и. по существу. немодифицированную цитоплазму. со вторыми протопластами. полученными из растения Ре1го8е11иит стщрит. имеющими. по существу. инактивированную цитоплазму и. по существу. немодифицированный ядерный геном;

регенерацию из слитых протопластов растения РеЧокейпит сгщрит. обладающего цитоплазматической мужской стерильностью.
2. Способ по п.1. в котором указанные первые протопласты получены из растения Еоешси1ит уи1даге М111 ΝΟΙΜΒ 42055.
3. Способ по любому из пп.1. 2. в котором указанные вторые протопласты получены из растения РеЧокейпит сгорит уаг. ТиЬетокит ΝΟΙΜΒ 42056.
4. Способ по любому из пп.1-3. в котором слияние протопластов опосредованно полиэтиленгликолем.
5. Растение Ре1го5е1йшт сгорит. полученное способом по любому из пп.1-4. обладающее цитоплазматической мужской стерильностью и содержащее митохондрии и/или хлоропласты. из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Еоешси1ит уи1дате Μί11 ΝΟΙΜΒ 42055.
6. Растение Ре1го5е1йшт сгорит по п.5. представляющее собой РеЧокеНпит сгАрит уаг. шЬегоыип.
7. Растение РеЧокеНпит сгАрит по п.5. представляющее собой РеЧокеНпит сгАрит уаг. сгАрит.
8. Растение РеЧокейпит сгАрит по п.5. представляющее собой РеЧокейпит сгАрит уаг. пеаро1йапит.
9. Растение Ре1го5е1йшт спкрит по любому из пп.5-8. где растение РеЧокейпит сгАрит является гибридом.
10. Части растения. в том числе семена или ткани. полученные из растения по любому из пп.5-9.

- 12 032108

Трек: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 1617