ES2675995T3 - Métodos para proporcionar plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas, plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas y semillas y partes de estas plantas - Google Patents

Abstract

Un método para proporcionar una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática, en donde el método comprende: a) proporcionar primeros protoplastos a partir de una planta Foeniculum vulgare Mill., en donde los primeros protoplastos tienen un genoma nuclear sustancialmente inactivado y un citoplasma sustancialmente no modificado; b) proporcionar segundos protoplastos obtenidos a partir de una planta Petroselinum crispum en donde los segundos protoplastos tienen un citoplasma sustancialmente inactivado y un genoma nuclear sustancialmente no modificado; c) fusionar dichos primeros y segundos protoplastos; d) obtener una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática a partir del producto de fusión de dichos primeros y segundos protoplastos, y en donde dichos primeros protoplastos se obtienen a partir de Foeniculum vulgare Mill. con número de acceso de acceso NCIMB 42055.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPICION

Métodos para proporcionar plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas, plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas y semillas y partes de estas plantas

Descripción

La presente invención se refiere a métodos para proporcionar plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas, plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas, y a semillas, células, tejidos y partes de dichas plantas.

La planta Petroselinum crispum o perejil pertenece a la familia de las Umbelíferas o Apiáceas. Los miembros de esta familia son el perejil de hoja lisa (P. crispum var. neapolitanum), perejil de hoja rizada (P. crispum var. crispum) y el perejil de Hamburgo o perejil de raíz (P. crispum var. tuberosum).

El perejil de tipo hoja es a menudo utilizado como un aderezo y tiene un sabor típico producido por aceites volátiles como miristicina y flavonoides como apiina.

El perejil de raíz tiene una raíz pivotante larga, carnosa y blanca que generalmente se sirve como verdura o se utiliza en sopas o guisos. La raíz es rica en caroteno, vitaminas B2 y C. Las hojas de la planta se preparan de modo similar al perejil de tipo hoja. El perejil de raíz es especialmente popular en Alemania, Austria, Hungría y Rusia. En Europa Occidental se ha redescubierto el cultivo, particularmente en horticultura orgánica.

Otros miembros de la familia de las Umbelíferas son, por ejemplo, la chirivía (Pastinaca sativa), zanahoria (Daucus carota L.), ajo (Apium graveolens L.), hinojo (Foeniculum vulgare Mill ), alcaravea (Carum carvi), anís (Pimpinella anisum), eneldo (Anethum graveolens), y cilantro (Coriandrum sativum).

Para el cultivo de perejil, actualmente, solo se dispone de variedades cruzadas de polinización abierta. Como resultado de la ausencia de esterilidad masculina o, por ejemplo, auto-incompatibilidad del cultivo, es imposible desarrollar híbridos F1.

Los híbridos F1 en general tienen ventajas sobre los cultivos de polinización abierta. De acuerdo con el manual “Principles of Plant Genetics and Breeding” de G. Acquaah (Blackwell Publishing, ISBN-13: 978-1-4051-3646-4; 2007; capítulo 18), un cultivar híbrido es la descendencia F1 de un cruzamiento planificado entre líneas endogámicas. Un requerimiento crítico de la producción de híbridos es que las líneas parentales no son idénticas. Esta divergencia otorga a los híbridos su desempeño superior, debido a la explotación de heterosis o vigor híbrido. El vigor híbrido puede definirse como el aumento en tamaño, vigor, fertilidad y desempeño general de una planta híbrida con respecto al desempeño promedio de las dos líneas parentales (Ibid. páginas 334-335).

La disponibilidad de los híbridos F1 en perejil se considera ventajosa de muchas maneras sobre las actuales variedades de cruzamiento de polinización abierta. Los híbridos F1, cuando se comparan con las variedades de polinización abierta disponibles, en general tienen una brotación mejorada, mayores rendimientos, mayor vigor y/o una alta uniformidad.

En general, los híbridos F1 de un cultivo pueden producirse mediante el uso de líneas parentales estériles masculinas que son, en forma inherente, incapaces de experimentar autopolinización y se utilizan como líneas maternas. Una alternativa, conocida por ejemplo a partir de los cultivos de Brassica, es el uso de plantas auto- incompatibles que no pueden auto-polinizarse y, por lo tanto, hacen posible la producción de híbridos F1.

Las líneas parentales estériles masculinas proporcionan control sobre la composición genética de la progenie debido a que la herencia de rasgos es, en principio, fija. La mitad de un material genético nuclear de progenie, es decir, el genoma nuclear, se origina a partir de la línea parental masculina (masculino fértil), mientras que la otra mitad de un material genético nuclear de progenie, es decir, el genoma nuclear, se origina a partir de la línea parental femenina (masculino estéril) a partir de la cual se recolecta la semilla F1.

Las plantas de perejil, sin embargo, son generalmente tanto masculinas como femeninas (es decir, monoicas) y la ausencia de plantas parentales estériles masculinas, tal como en variedades de cruzamiento de polinización abierta, hace que sea imposible una predicción 100% fidedigna de la composición genética, o del genotipo (nuclear) de la progenie. Al menos una parte de la progenie, en ausencia de plantas estériles masculinas, como resultado de la autopolinización, comprenden el material genético, o el genoma nuclear, que se origina solamente a partir de una línea parental.

El término híbrido, híbrido F1 o cíbrido se utiliza a menudo en la técnica para indicar que las plantas en cuestión son heterocigóticas para al menos algunos rasgos genotípicos (comercialmente interesantes). En general, en la técnica se indica que un hibrido, híbrido F1 o cíbrido comprende un genoma nuclear heterocigótico.

La esterilidad masculina en plantas generalmente se refiere a esterilidad masculina citoplasmática, en donde el factor genético determinante se encuentra en el citoplasma. Para muchas plantas se demuestra que este factor

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

genético determinante se encuentra comprendido en la mitocondria y generalmente incluye una mutación en el ADN mitocondrial.

Las mitocondrias son solamente heredadas por la progenie a través de una célula huevo o, en otras palabras, por herencia femenina, y no mediante el polen, o, en otras palabras, por herencia masculina. La esterilidad masculina citoplasmática es también denominada en la técnica con la abreviatura CMS.

En algunas plantas, además de la esterilidad masculina citoplasmática, también se observa esterilidad (masculina) nuclear. Para la esterilidad (masculina) nuclear, al contrario de la esterilidad codificada citoplasmática, un factor genético en el genoma nuclear, o el ADN del núcleo, es responsable de la esterilidad observada. Esta esterilidad nuclear puede relacionarse con esterilidad masculina, femenina o general.

Ambos tipos de esterilidad, es decir, la esterilidad masculina citoplasmática y la esterilidad (masculina) nuclear, pueden ser fácilmente diferenciadas. La esterilidad masculina citoplasmática es heredada solamente a través de la línea parental femenina. Por el contrario, como resultado inherente de su presencia en el núcleo, la esterilidad nuclear generalmente muestra una herencia mendeliana.

A través del uso de CMS, la polinización cruzada producirá un 100% de híbridos F1 “puros” o “verdaderos”. Por el contrario, mediante el uso de plantas de perejil monoicas normales, cierto porcentaje de autopolinización tendrá lugar en la próxima generación.

El hinojo es una especie dentro de la familia de las Apiáceas en donde la CMS es un rasgo común, y el uso de híbridos F1 en hinojo es en general conocido. En el hinojo, no se conocen genes que restauren la fertilidad; por lo tanto es este una fuente ideal de CMS.

Se ha demostrado que fue posible obtener un cruzamiento entre perejil e hinojo. En otras palabras, un cruzamiento en donde una línea parental, el polinizador, es perejil y la otra línea parental es hinojo CMS. Sin embargo, este cruzamiento pareció ser muy ineficaz. En lugar de la cantidad esperada de al menos 2500 semillas, solamente pudo obtenerse una cantidad muy limitada de semillas mediante la floración de estas plantas en presencia de moscardas. La mayoría de estas semillas fueron asimismo no-viables. Después de la germinación de las semillas, se obtuvo efectivamente la progenie deseada.

Aunque finalmente sea asistida por rescate embrionario, esta progenie obtenida puede ser después cruzada con perejil, con lo que se diluye la cantidad de genoma nuclear de hinojo, y después de varias generaciones de cruzamientos se requiere una generación endogámica, mediante autopolinización.

Mediante el uso de una generación endogámica, en principio es posible seleccionar progenie con el fenotipo deseado (un genoma de perejil sin características de hinojo). A pesar de esto, un gran número de generaciones todavía comprenderá pequeñas cantidades de ADN de hinojo, con las características o rasgos no deseados en el híbrido obtenido. No puede predecirse en qué punto en el tiempo este ADN de hinojo remanente será eliminado del genoma nuclear.

Sin embargo, con el presente caso de hinojo estéril masculino citoplasmático (CMS), la generación endogámica requerida de un híbrido de hinojo-perejil no es posible debido a que las plantas necesarias para esto seguramente son estériles masculinos, lo que, por lo tanto, hace que una generación endogámica sea técnicamente imposible.

Considerando, entre otras, las ventajas anteriores de los híbridos F1, tal como brotación mejorada, mayores rendimientos, más vigor y/o mayor uniformidad, existe la necesidad en la técnica de proporcionar plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas (CMS). De acuerdo con esto, es un objeto de la presente invención, entre otros, satisfacer esta necesidad.

Dicha necesidad, entre otras, se ve cumplida de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, al proporcionar un método tal como se define en la reivindicación 1 que se adjunta.

Específicamente, la necesidad antes mencionada, entre otras, es satisfecha de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención mediante un método para proporcionar una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática, en donde dicho método comprende:

a) proporcionar primeros protoplastos obtenidos a partir de una planta seleccionada entre el grupo que consiste en Daucus carota L., Foeniculum vulgare Mill., Apium graveolens L., y Pastinaca sativa L., en donde la primera especie de protoplastos tiene un genoma nuclear sustancialmente inactivado y un citoplasma sustancialmente no modificado cuando se compara con las células de plantas de las que provienen; estos primeros protoplastos pueden también denominarse protoplastos donantes;

b) proporcionar segundos protoplastos obtenidos de una planta Petroselinum crispum, en donde los segundos protoplastos tienen un citoplasma sustancialmente inactivo y un genoma nuclear sustancialmente no modificado cuando se compara con las células de planta de las que provienen; estos segundos protoplastos pueden también denominarse protoplastos aceptores;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

c) fusionar dichos primeros y segundos protoplastos para proporcionar un producto de fusión entre el protoplasto aceptor y el protoplasto donante;

d) obtener una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática a partir del producto de fusión de dichas primeras y segundas especies de protoplastos, y en donde dichos primeros protoplastos se obtienen de Foeniculum vulgare Mill. con número de acceso NCIMB 42055.

Dentro del contexto de la presente invención, las plantas híbridas, híbridas F1 o cíbridas son plantas que al menos comprenden orgánulos heterólogos o foráneos tal como mitocondria o cloroplastos. En otras palabras, estas plantas híbridas, híbridas F1 o cíbridas comprenden orgánulos que se originan a partir de otra variedad de planta y estos orgánulos no se encuentran en estas plantas de forma natural. Las plantas híbridas, híbridas F1 o cíbridas pueden también ser definidas como plantas que comprenden al menos parcialmente un citoplasma que se origina, o se obtiene, a partir de otra variedad o especie.

El genotipo del núcleo de las plantas de acuerdo con la presente invención es sustancialmente idéntico a una de las plantas madre, tal como la planta aceptora. Sin embargo, el ADN del citoplasma de las plantas de acuerdo con la presente invención se desvía de esta planta madre. Este citoplasma es al menos parcialmente obtenido a partir de otra planta madre, la planta donante. Esta otra planta madre es una planta de otra variedad o especie distinta de la primera planta madre.

Las técnicas y métodos para proporcionar protoplastos, es decir, células de planta con una pared celular al menos parcialmente separada, son conocidos en el estado de la técnica. En general, los protoplastos se obtienen por digestión de células vegetales aisladas, o tejidos, con una mezcla de enzimas degradantes de polisacáridos adecuados, tales como celulasas, pectinasas y/o xilanasas.

Las técnicas y métodos para fusionar, o combinar, los presentes protoplastos son conocidos en el estado de la técnica. La fusión de protoplastos puede, por ejemplo, proporcionarse combinando los protoplastos presentes en una mezcla y posteriormente exponiendo esta mezcla a electroshock o exponiendo esta mezcla a una composición que comprende un polímero, tal como glicol de polietileno, y un catión, tal como Ca2+, con un pH alcalino.

Las técnicas y métodos para proporcionar plantas a partir del presente producto de fusión son conocidos en el estado de la técnica. El presente producto de fusión puede, por ejemplo, ser estimulado mediante el uso de hormonas para generar paredes celulares, para posteriormente formar callos y regenerarse en plantas completas. Opcionalmente, como es, por ejemplo el caso de proporcionar un híbrido F1, la provisión puede comprender una o más etapas de cruzamiento convencional, preferentemente con variedades de perejil de interés comercial.

El término “genoma nuclear inactivado”, dentro del contexto de la presente invención, se refiere a un genoma nuclear que ya no es capaz de experimentar mitosis ni/o meiosis. En otras palabras, un protoplasto, o una célula vegetal obtenida a partir del mismo, con un “genoma nuclear inactivado” ya no es capaz de experimentar división celular. La presente inactivación del genoma nuclear puede, por ejemplo, proporcionarse mediante el uso de un tratamiento de radiación de los presentes protoplastos con rayos Rontgen (X) o gamma (y). Alternativamente, el núcleo de la célula puede ser separado por ultracentrifugación en un gradiente de densidad.

El término “citoplasma inactivado”, dentro del contexto de la presente invención, indica que los orgánulos en el citoplasma ya no son capaces de participar en la división celular. En otras palabras, un protoplasto, o una célula vegetal obtenida a partir del mismo, con un “citoplasma inactivado” ya no es capaz de experimentar división celular. La presente inactivación del citoplasma puede proporcionarse, por ejemplo, sometiendo los presentes protoplastos a la acción de reactivos tales como yodoacetamida o yodoacetato.

El término “citoplasma no modificado”, dentro del contexto de la presente invención, indica que el citoplasma es sustancialmente similar al citoplasma de la célula de partida. En otras palabras, los protoplastos con un “citoplasma no modificado” son considerados como el citoplasma original, que no es posible distinguir de la célula a partir de la cual se obtiene el protoplasto.

El término “genoma nuclear no modificado”, dentro del contexto de la presente invención, indica que el genoma nuclear es sustancialmente similar el genoma nuclear de la célula de partida. En otras palabras, se considera que los protoplastos con un “genoma nuclear no modificado” poseen el genoma nuclear original, que no es posible distinguir del genoma nuclear de la célula a partir de la cual se obtiene el protoplasto.

A través del uso del presente método, la composición genética codificada nuclear, o genoma nuclear, de los segundos protoplastos no cambia sustancialmente. Como resultado, se proporciona directamente una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática, sin necesidad de posteriores etapas de (retro)cruzamiento.

Sin embargo, pueden utilizarse etapas de cruzamiento adicionales para agregar otros rasgos (de interés comercial) a la presente planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática. Estos cruzamientos están también comprendidos dentro de la presente invención, siempre que la progenie permanezca estéril masculina citoplasmática.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Según la presente invención, la planta donante es Foeniculum vulgare Mili. , y tiene un fenotipo estéril masculino citoplasmático.

Según otra realización preferida del presente método, el método además comprende, después de la etapa (c) o (d), seleccionar los productos de fusión diploides y/o plantas diploides.

En una cantidad de casos, algunos productos y/o plantas de fusión obtenidos después de la fusión de protoplastos tienen un nivel de desviación de ploidía, tal como un nivel tetraploide, octaploide y algunas veces aneuploide. Estas desviaciones a menudo dan como resultado plantas no deseadas, tales como plantas estériles femeninas. Por lo tanto, es ventajoso seleccionar solamente aquellos productos y/o plantas de fusión, por ejemplo por citometría de flujo, que son, con respecto a su contenido de ADN nuclear, similares a la planta aceptora diploide.

Además, la citometría de flujo proporciona la posibilidad de detectar y posteriormente eliminar los casos de desviaciones genéticas, tal como material genómico nuclear inesperado y no deseado de los primeros protoplastos que aparece en el producto de fusión.

Según otra realización preferida del presente método, los primeros protoplastos descritos aquí anteriormente que tienen un genoma nuclear sustancialmente inactivado y un citoplasma sustancialmente no modificado, se obtienen mediante exposición a radiación ionizante, preferentemente una dosis de radiación gamma, de al menos 200 Gray (Gy), preferentemente al menos 300 Gray, y más preferentemente al menos 400 Gy.

Según otra realización preferida del presente método, los segundos protoplastos descritos aquí anteriormente tienen un citoplasma sustancialmente inactivado y un genoma nuclear sustancialmente no inactivado a través de exposición a yodoacetamida, preferentemente en una concentración de al menos 5 mM, más preferentemente al menos 10 mM, más preferentemente al menos 15 mM.

Según una realización preferida del presente método, la etapa (c) comprende fusión de protoplastos mediada por polietilenglicol.

El presente método, de forma ventajosa, proporciona plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas. En consecuencia, según otro aspecto, la presente invención se refiere a plantas Petroselinum crispum estériles masculinas citoplasmáticas que se obtienen mediante el presente método, y que comprenden mitocondria y/o cloroplastos obtenidos a partir de Foeniculum vulgare Mill. con número de acceso NCIMB 42055 (depósito realizado el 26 de septiembre de 2012 en NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9 Ya, Reino Unido) y/o el segundo protoplasto que se obtiene a partir de una planta Petroselinum crispum var. tuberosum con número de acceso NCIMB 42056 (depósito realizado el 26 de septiembre de 2012 en NCIMB Ltd).

Según otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática según la presente invención para proporcionar híbridos F1 de Petroselinum crispum.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a semillas, partes, tejido o células de plantas que se obtienen o se originan de la presente planta de perejil CMS según se describe anteriormente.

Según otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso del citoplasma obtenido a partir de una Foeniculum vulgare Mill estéril masculina citoplasmática para proporcionar una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática.

La presente invención se describe además en detalle en los siguientes ejemplos de las realizaciones preferidas. En los ejemplos, se hace referencia a las figuras adjuntas, en donde:

Figura 1: muestra una imagen de una electroforesis en gel de productos de amplificación. Las

calles 1 y 2 muestran “evadidas”, es decir, plantas a partir de una fusión celular que

muestran un patrón de citoplasma de perejil; las calles 3-8, 10 y 11 muestran plantas de fusión según la presente invención, es decir, perejil con un citoplasma de hinojo; la calle 9 muestra una escalera 100 bp de ADN; las calles 12- 15 muestran el material aceptor de perejil original y las calles 16 y 17 muestran el material donante de hinojo;

Figura 2: muestra un citograma de flujo representativo de hinojo;

Figura 3: muestra un citograma de flujo representativo de perejil;

Figura 4: muestra un citograma de flujo representativo de un híbrido de hinojo y perejil de acuerdo

con la presente invención.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplos

Ejemplo 1: Protocolo general

Se esterilizaron semillas de Pl crispum var. tuberosum (aceptora) así como semillas de una planta donante mediante un tratamiento posterior con agua caliente, lavando con etanol al 70%, y un tratamiento con lejía doméstica diluida. Después de enjuagar las semillas con agua estéril, las semillas se hicieron germinar en un medio MS30 o similar.

Solamente se utilizaron los peciolos de las plántulas. Se aislaron los protoplastos mediante tratamiento del material después de pre-plasmólisis con enzimas degradantes de la pared celular, tal como pectinasa y celulasa, en una solución plasmolisante. Después de filtrar y centrifugar, los protoplastos del donante se trataron con radiación gamma. Los protoplastos del aceptor se trataron con yodoacetamida (IOA). Ambas especies de protoplastos se combinaron y subsiguientemente se fusionaron. Durante la fusión mediada por polietilenglicol (PEG), los protoplastos no fueron sometidos a agitación, a fin de evitar la disrupción del proceso de fusión.

Después de la fusión, se separó el PEG gradualmente por lavado y los protoplastos se embebieron en alginato. Se transfirieron cortes de medio solidificado de alginato, que incluyen los protoplastos fusionados, a un medio líquido que estimulaba la división celular. Este medio incluía azúcar tal como glucosa y hormonas tales como 2.4D, zeatina y similares.

Después del brote de callos, se sacaron micro-callos del medio solidificado de alginato y se transfirieron a un medio sólido de crecimiento de callos. Una vez alcanzado el diámetro de 8 mm y cierto grado de enverdecimiento, los callos se transfirieron a un medio de regeneración. Los callos en regeneración se transfirieron a medio de regeneración de nueva aportación cada 3 semanas. En este medio se desarrollaron gajos de tallo y algunas veces embriones somáticos. Los gajos de tallo desarrollados se pusieron en un medio de enraizamiento BBW. Los embriones somáticos se pusieron en un medio de crecimiento embrionario y posteriormente se pusieron en un medio MS30 o similar.

Durante la transición desde el medio de división celular (CPP) vía el medio de desarrollo (CPPD) hasta el medio de regeneración (M2+) y finalmente el medio MS30, el valor osmótico del medio se redujo gradualmente.

El nivel de ploidía de las plantas obtenidas se examinó mediante determinación del contenido de ADN relativo por citometría de flujo de una muestra de hojas. Las plantas con un contenido de ADN relativo que corresponde al contenido de ADN de las plantas de perejil originales fueron retenidas; todas las otras plantas fueron destruidas.

Las plantas retenidas fueron posteriormente analizadas mediante el uso de técnicas de biología molecular. Usando ADN aislado de una hoja, se verificó la presencia de la mitocondria deseada (es decir, del donante) mediante cebadores de PCR que son específicos para ADN mitocondrial de hinojo. Las plantas con el citoplasma del aceptor (que pueden considerarse como “evadidas”) fueron descartadas.

Las plantas restantes se mantuvieron por cruzamientos y, en las condiciones de invernadero y campo, fueron examinadas con respecto a su viabilidad. Las características de interés fueron esterilidad masculina, formación de semillas y calidad de la planta.

Ejemplo 2: Esterilización superficial de semillas

Las semillas de perejil enraizado (Petroselinum crispum var. tuberosum) como aceptor y de hinojo (Foeniculum vulgare Mill.) como donante se pusieron cada una en coladores de té separados. Los coladores se pusieron en un baño de agua a 50°C durante 10 minutos. Subsiguientemente, los coladores de té se sumergieron en una mezcla que consistió en 70% de etanol y 30% de agua durante 10 segundos. Esto fue seguido por un tratamiento de 20 minutos con 0,3% (peso/volumen) de NaOCl + 0,01% de Tween80. Éste y todos los tratamientos siguientes se realizaron en una campana de flujo laminar.

Subsiguientemente, los coladores de té con semillas se lavaron 3 veces con agua estéril, durante 1, 3 y 5 minutos, respectivamente.

Ejemplo 3: Siembra del material de partida para aislamiento de protoplastos

Se sacaron las semillas del aceptor y del donante de los coladores de té del ejemplo 2 en condiciones estériles y se pusieron en medio MS30 en recipientes de vidrio. Los recipientes, con 8 semillas cada uno, se pusieron en un ambiente climatizado a 25°C (16 horas luz, 4000 Lux). Después de 3 a 5 semanas, las plantas germinadas fueron adecuadas para aislamiento de protoplastos.

Ejemplo 4: Aislamiento de protoplastos

Los peciolos de las plantas aceptoras germinadas se recolectaron en una placa Petri de 9 cm de diámetro con 15 mL de MLP. Cuando todos los peciolos fueron recolectados, estos peciolos se cortaron en porciones con una longitud promedio de 1,5 mm.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

También se recolectaron y se cortaron los peciolos de las plantas donantes germinadas en MLP. Sin embargo, cuando la cantidad de material disponible fue insuficiente (por ejemplo como resultado del brote deficiente de la semilla), se añadieron las propias hojas.

La solución MLP se retiró por aspiración y se reemplazó por 20 ml de solución de enzimas de nueva aportación por placa Petri. Esta solución de enzimas tiene un alto peso específico con relación a los protoplastos. Las placas Petri se incubaron a 25°C durante toda la noche en la oscuridad; se pusieron en un agitador orbital con una amplitud de 15 mm y una velocidad de 30 rpm. Después de esta incubación, las suspensiones se filtraron a través de filtros de nailon con un tamaño de poro de 110 |im y 53 |im respectivamente. El filtrado se transfirió a tubos de centrifugación de 12 ml, transfiriéndose 8 ml de filtrado por tubo.

Sobre esta capa de suspensión de enzima-protoplastos, cuidadosamente se pipetearon 3 ml de solución de lavado W5 (con un peso específico más bajo), seguido por una centrifugación de 7 min. a 100 x g. Después de centrifugar, las bandas de protoplastos puros fueron visibles en los tubos (en la interface de enzima y solución de lavado). Los protoplastos dañados, las paredes celulares y similares se recolectaron en el fondo del tubo.

La banda que contenía protoplastos se recolectó utilizando una pipeta y se recolectó un máximo de 4 ml de suspensión en tubos nuevos. A estos tubos se agregó solución de lavado adicional W5 hasta un volumen final de 12 ml. Los tubos se centrifugaron nuevamente durante 7 min. a 100 x g y, posteriormente, los protoplastos lavados se hicieron visibles como un sedimento en el fondo del tubo. El líquido sobrenadante se vertió y los protoplastos se resuspendieron cuidadosamente en 11 ml de solución de lavado W5 en volumen final.

De cada suspensión (donante y aceptor) se separó 1 ml como control; una muestra de este control se sometió a recuento utilizando un hemocitómetro para determinar el número total de protoplastos aislados.

El tubo con protoplastos del donante se envolvió en lámina de aluminio y se colocó en hielo. Se aplicó radiación gamma utilizando una dosis de 400 Gy de radiación. Después de la irradiación, se cultivó una muestra separadamente como control.

Los protoplastos del aceptor se trataron de la siguiente manera: a partir de una solución madre adecuada en W5, IOA se agregó a una concentración final de 15 nM. La incubación se realizó a temperatura ambiente; la incubación se terminó por centrifugación de los protoplastos, vertiendo el sobrenadante y resuspendiendo los protoplastos en solución de lavado W5. La cantidad total de tiempo de incubación fue de 15 minutos, incluyendo el tiempo de centrifugación.

Posteriormente, los protoplastos aceptores se lavaron una vez con la solución de lavado W5 por centrifugación. Después de este tratamiento con IOA, se toma una muestra de control de las células tratadas y se cultiva separadamente.

Ejemplo 5: Fusión de protoplastos

A partir de ambas suspensiones de protoplastos, los protoplastos se mezclaron en una relación de protoplastos de 1 aceptor: 2 donantes. Esta suspensión se dividió en tubos de ensayo de 10 ml suficientes, de manera que cada tubo de ensayo contenía 1 millón de protoplastos.

Después de centrifugar (7 minutos a 100 x g), el volumen se ajustó a 0,3 ml. A esta suspensión de protoplastos, se agregaron 400 |il de solución PEG. Los tubos con protoplastos se dejaron reposar durante 30 minutos sin alteraciones. Posteriormente, se agregaron 800 |il de la solución de dilución PEG, seguido por una etapa de espera de 15 min.

A continuación, se agregaron 5 ml de solución CPW/Ca++ a cada tubo seguido por centrifugación (7 min a 100 x g; sin posterior frenado). El sobrenadante se vertió cuidadosamente y el sedimento se resuspendió en 5 ml de solución CPW/Ca++ de nueva aportación y se centrifugó nuevamente bajo las mismas condiciones.

Después de retirar el sobrenadante, el sedimento se resuspendió en solución A ajustada a razón de 10 ml por tubo. Las células se lavaron por centrifugación, se resuspendieron en la solución A ajustada y se centrifugó nuevamente tal como se ha descrito anteriormente. Finalmente, las células se combinaron en uno o, cuando fue necesario, más tubos de ensayos de 10 ml y se resuspendieron en solución A ajustada hasta que se alcanzó una densidad de 400.000 células por ml.

A esta suspensión, se agregó un volumen igual de solución de alginato y, posteriormente, la suspensión se depositó en placas en porciones de 800 |il sobre pequeñas placas Petri (6 cm de diámetro) con solución B. Después de 1 hora las gotitas se solidificaron por polimerización de alginato.

Ejemplo 6: Regeneración

Los cortes de alginato con protoplastos fusionados se lavaron en el medio CPP y se transfirieron a placas Petri con medio CPP de nueva aportación; se utilizaron 5 ml de medio CPP por porción de 800 ml. Semanalmente, el medio

5

10

15

20

25

30

35

40

completo fue renovado retirando el medio antiguo por aspiración y agregando medio de nueva aportación a las placas Petri. Después de aproximadamente 3 semanas, se generaron callos. En el momento en que alcanzaron un diámetro de aproximadamente 3 mm, estos callos se sacaron del alginato. Con este objetivo, los cortes se trocearon en 8 partes y el medio se reemplazó por 15 ml de solución 50 mM de Na-citrato. Las placas Petri se pusieron en un agitador orbital con una amplitud de 15 mm y una velocidad de 30 rpm.

Después de 1 hora, la matriz de alginato se había roto y los callos fueron liberados y recolectados por centrifugación (7 min. a 100 x g) y se pusieron en un medio CPPD sólido. Después de 1 semana de habituación las placas Petri se expusieron a la luz. Cada 3 semanas, los callos en desarrollo fueron transferidos a medio de nueva aportación. En el momento en que los callos se volvieron verdes y alcanzaron un diámetro de alrededor de 8 mm, éstos fueron colocados en medio de regeneración M2+. Nuevamente, cada 3 semanas el medio fue renovado mediante transferencia de los callos a nuevas placas Petri con el mismo medio.

Los cortes de tallos que se generaron en el medio se enraizaron en medio BBW. Los embriones somáticos que brotaron se pusieron en medio MS20-GA3. Las plantas maduras que se desarrollaron en este medio se transfirieron a medio MS20. Cuando las plantas enraizadas alcanzaron el estadio de 3 hojas, fueron transferidas al suelo para posterior desarrollo en un invernadero.

Ejemplo 7: Citometría de flujo

El nivel de ploidía de las plantas regeneradas se determinó por citometría de flujo. A tal efecto, una muestra de una planta diploide conocida se midió como un patrón, y las muestras de las plantas regeneradas se compararon con el mismo. Para cada planta, se tomó y se cortó un trozo de 1 cm2 de la hoja en tampón DAPI (Partee, Munster, Alemania) usando una cuchilla de afeitar.

La muestra se filtró utilizando un filtro Celltrics® de 30 |im y se midió con un Partec PA (Partec, Munster, Alemania). Los resultados proporcionaron un valor de ploidía relativo con relación al control. Solamente las plantas con un patrón de perejil enraizado diploide se utilizaron para posterior trabajo experimental.

Ejemplo 8: Determinaciones moleculares

Para las plantas con carácter diploide demostrado, se determinó la presencia del fragmento de ADN de interés (de citoplasma de hinojo y por lo tanto relacionado con el rasgo CMS deseado).

Se congeló una muestra de hoja, o callo, con un peso de 100 a 200 mg en un tubo Eppendorf a -20°C. Después de descongelar, la muestra se trituró en 350 |il de tampón de extracción de ADN. Posteriormente, se agregó una cantidad adicional de 350 |il de tampón de extracción de ADN. Después de la centrifugación (10 min. a 10000 x g) el sobrenadante se decantó y el sedimento se transfirió a 125 |il de tampón de extracción de ADN; después de mezclar completamente 175 |il de solución tampón de lisis nuclear y 60 |il de N-lauril sarcosina al 10%.

Esta mezcla se incubó a 65°C durante 20 minutos, seguido por extracción con 50-100 |il de cloroformo:alcohol isoamílico. El extracto fue centrifugado a 10.000 x g durante 10 min. y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf. Se agregaron 500 |il de isopropanol de -20°C a este tubo de ensayo y el tubo fue centrifugado a 10.000 x g durante 2 min.

Después de decantar el sobrenadante, el sedimento se lavó con 100 |il de etanol al 70% (4°C) y, después de secar, el sedimento se disolvió en 125 |il de tampón TE. Finalmente, esta solución de ADN se diluyó (10 x) con agua estéril.

El ADN citoplasmático aislado se analizó por técnicas de PCR con respecto a la presencia del fragmento caracterizante. Para cada combinación de donante-aceptor, se desarrolló un protocolo que proporcionaba una clara discriminación entre ambos copartícipes de fusión posibles.

Tabla 1. Combinación de cebadores que producen un polimorfismo para perejil (aceptor) comparado con varios donantes de citoplasma.

Donante

Hinojo F. vulgare Zanahoria D. carota Ajo A. Graveolens Chirivía P. sativa

ADN

2 |il 2 |il 2 |il 2 |il

Invitrogen 10x tampón PCR

2,5 |il 2,5 |il 2,5 |il 2,5 |il

MgCl2 50 mM

2,4 |il 2,4 |il 1,2 |il 1,2 |il

NTP

0,3 |il 0,3 |il 0,6 |il 0,3 |il

Cebador (1 |il, 5 pM)

P3558 P3558 P10987 P11087

Cebador (1 |il, 5 pM)

P7054 P7054 P10988 P10988

H2O

15,7 |il 15,7 |il 16,6 |il 16,9 |il

Platinum Taq

0,1 |il 0,1 |il 0,1 |il 0,1 |il

Programa

WP1 WP1 WP2 WP2

Digestión

MnlI HinFI TaqI AluI

programa WP1

1

93 °C 2 min

2

62 °C 1 min

3

72 °C 1.75 min

4

93 °C 30 segundos

5

62 °C 1 min

6

72 °C 1,75 min

7

repetir pasos 4-6 39 veces

8

72 °C 5 min

9

20 °C 20 min

programa WP2

1

94 °C 5 min

2

50 °C 1 min

3

72 °C 1 min

4

94 °C 30 segundos

5

50 °C 1 min

6

72 °C 2 min

7

repetir pasos 4-6 29 veces

8

72 °C 5 min

9

20 °C 20 min

Tabla 2 Digestión de productos de amplificación MnlI

HinFI TaqI AluI

ADN

5 |il 5 |il 5 |il 5 |il

Tampón NEB 2 (10)

1,2 |il 1,2 |il - 1,2 m

Tampón NEB 3 (10 x)

- - 1,2 |il -

5

10

15

20

25

30

Solución BSA (100 x)

0,12 |il 0,12 |il

Enzima

2 unidades 2 unidades 2 unidades 2 unidades

H2O

5,48 |il 5,60 |il 5,58 |il 5,60 |il

Digestión- temperatura

37°C 37°C 65°C 37°C

La digestión tuvo lugar durante 8 horas a 37°C. Tabla 3. Secuencia de los iniciadores utilizados

P3558

5'- CAAAAGTATGAAAAGCTGGAGG-3'

P7054

5'- CCTTTTTTGATCCCGCTGGAGG-3'

P10987

5'- CCCAATCTTTAAGGAAGAGATCG-3'

P10988

5'- ATGTCTCCGTCGCTGACGTTCG-3'

P11087

5'- GTACGATAGAATTCCTCGGTGCG-3'

Ejemplo 9: Electroforesis en gel

Cuando la diferencia de tamaño entre los fragmentos de un marcador es suficientemente grande, las diferencias en patrones de banda de las plantas individuales pueden visualizarse por, por ejemplo, electroforesis en gel. Los geles de agarosa utilizados estaban compuestos de 1,5% agarosa en tampón TAE y provistos de bromuro de etidio para la visualización de las bandas de ADN mediante el uso de rayos UV. Los resultados representativos de dicha electroforesis en gel de los productos de amplificación obtenidos se muestran en la Figura 1. La Figura 1 muestra que las plantas según la presente invención (calles 3-8, 10 y 11) proporcionaron un producto de amplificación citoplasmático con un tamaño idéntico al del producto de amplificación de la planta donante de hinojo, mientras que el producto de amplificación de la planta aceptora de perejil enraizada estuvo ausente. En consecuencia, esto demuestra que las plantas de perejil enraizadas fenotípicas según la presente invención tienen citoplasma obtenido a partir del hinojo.

Ejemplo 10: Híbridos

Diez plantas de perejil enraizadas seleccionadas J10666 y diez plantas e hinojo estériles masculinas J531 fueron vernalizadas en un recinto libre de helada durante el invierno. En la primavera, estas plantas fueron transferidas juntas a un invernadero. Después de la inspección visual de las primeras inflorescencias de hinojo con respecto a esterilidad masculina, las plantas fueron aisladas en un reciento hermético a los insectos. En estos recintos se pusieron pupas de moscas que proporcionaron moscas para polinización. Cuando era necesario, se introducían nuevas pupas de moscas hasta que las plantas terminaban de florecer.

Las semillas se recolectaron después de la maduración de las plantas de hinojo estériles masculinas. La inflorescencia no polinizada de las plantas de control de hinojo no proporcionó semillas. Esto demostró que estas plantas eran en verdad estériles masculinas. De la totalidad de 39 semillas recolectadas solamente germinó 1 semilla. La citometría de flujo y el análisis molecular demostraron que esta planta fue efectivamente un intermedio entre hinojo y perejil enraizado. Los resultados del análisis citométrico de flujo se muestran en las Figuras 2 a 4, en donde la tercera imagen demuestra el carácter híbrido de la planta identificada.

Composición del medio

A menos que se indique de otro modo, los medios y soluciones para cultivo de tejido que se indican a continuación fueron sometidos a autoclave (a 120°C durante 20 min.).

Medio MS20, MS30 por litro

Sales MS que incluyen vitaminas (Duchefa, Haarlem, NL, art M0221)

Sacarosa

Agar Daichin

4,40 gramos 20 resp. 30 gramos 8 gramos

pH 5,8

Solución de enzimas Solución EKW que comprende:

Celulasa R10

1,5%

Macerozima

0,1%

pH 5,6; filtro estéril

W5

L. Mencel, F, Nagy, Z. Kiss y P. Maliga. Theor. Appl. Genet 70:

en co o en co 4^ CO 00

Solución PEG

50 ml

PEG6000

15 gramos

Sacarosa 2 gramos

CaCl2.2H20

0,075 gramos

pH 5,7; filtro estéril

Solución de dilución PEG

50 ml

Glicina

0,188 gramos

Glucosa (sigma)

2,7 gramos

CaCl2.2H20

0,368 gramos

pH 10,5 (ajustado con 10 N KOH); 520 mOsm/kg; filtro estéril

CPW/Ca++

200 ml

CPW 10x solución madre

20 ml

Manitol

13,3 gramos

CaCl2.2H2O

1,47 gramos

pH 5,7; 530 mOsm/kg; filtro estéril

CPW 10x solución madre

Frearson, E. M., Power, J. B., Cocking E. C. Developmental Biology, 33, 130-137 (1973)

Solución ajustada A

250 ml

CaCl2.2H2O

36,8 mg

Manitol

19,7 gramos

pH 5,8; autoclave

10

15

Solución de alainato: solución B

B.Damm, R. Schmidt y L. Willmitzer. Mol. Gen. Genet. 217: 6-12 (1989)

Solución 50 nM de Na-citrato, MLP, EKW, CPP y CPPD

R. Dirks, V. Sidorov y C. Tulmans: Theor. Appl. Genet. 93: 809-815 (1996).

El medio CPP se completa con 0,2 mg/l 2,4D y 0,1 mg/l zeatina.

El medio CPPD se completa con 0,1 mg/l NAA y 0,2 mg/lzeatina.

Medio M2 + por litro:

J.L. Vandemoortele, J. P. Billard, J. Boucaud y T. Gaspar (1994). Med. Fae. Landbouww. Univ. Gent 59: 1455-1459 (1994).

El medio M2 que se describe se completa con 20 mg/l de sulfato de adenina y se indica como M2+.

Medio BBW

Por litro

Sales MS (Duchefa art M0221)

4,40 gramos

Sacarosa

20 gramos

IAA

2 mgramos

Agar Daichin

8 gramos

pH 6,0

MS20-GA3

Por litro

Sales MS (Duchefa art M0221)

4,40 gramos

Sucrose

20 gramos

GA3

1 mgramo

Agar Daichin

8 gramos

pH 5,8

Tampón de extracción de ADN sorbitol 0,35 M Tris-base 0,1 M (pH 7,5)

Na2-EDTA 0,005 M

NaHSO3 0,02 M (agregado nuevo)

Tampón Nucleo-lisis Tris-base 0,2 M (pH 7,5)

Na2-EDTA 0,05 M NaCl 2 M

2% de CTAB (bromuro de amonio cetiltrimetilo)

Cloroformo:alcohol isoamílico

24 volúmenes de cloroformo + 1 volumen de alcohol isoamílico Tampón TE

Tris-NaOH 10 mM (pH 8,0)

5 Na2-EDTA 1 mM

Tampón NEB 2, tampón NEB 3 y solución BSA

Obtenido a partir de New England Biolabs, Ispwich, MA01938, EE.UU.

10 Tampón TAE (concentraciones finales)

ácido Tris-acético 40 mM, pH 8,5 Na2-EDTA 2 mM 1,5% de garosa (peso/volumen)

0,5 |ig/ml de bromuro de etidio 15

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un método para proporcionar una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática, en donde el método comprende:

   a) proporcionar primeros protoplastos a partir de una planta Foeniculum vulgare Mill., en donde los primeros protoplastos tienen un genoma nuclear sustancialmente inactivado y un citoplasma sustancialmente no modificado;

   b) proporcionar segundos protoplastos obtenidos a partir de una planta Petroselinum crispum en donde los segundos protoplastos tienen un citoplasma sustancialmente inactivado y un genoma nuclear sustancialmente no modificado;

   c) fusionar dichos primeros y segundos protoplastos;

   d) obtener una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática a partir del producto de fusión de dichos primeros y segundos protoplastos, y

   en donde dichos primeros protoplastos se obtienen a partir de Foeniculum vulgare Mill. con número de acceso de acceso NCIMB 42055.
2. 2. El método según la reivindicación 1, que además comprende, después de la etapa (c) o (d), seleccionar las plantas o productos de fusión diploides, preferentemente plantas o productos de fusión de Petroselinum crispum diploides.
3. 3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dichos primeros protoplastos que tienen un genoma nuclear sustancialmente inactivado y un citoplasma sustancialmente no modificado se obtienen a través de exposición a una dosis de radiación, preferentemente una dosis de radiación gamma, de al menos 200 Gy, preferentemente al menos 300 Gy, y más preferentemente al menos 400 Gy.
4. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los segundos protoplastos se obtienen a partir de Petroselinum crispum var. tuberosum con el número de acceso NCIMB 42056.
5. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichos segundos protoplastos tienen un citoplasma sustancialmente inactivado y un genoma nuclear sustancialmente no inactivado a través de la exposición a yodoacetamida, preferentemente en una concentración de al menos 5 mM, más preferentemente al menos 10 mM, y lo más preferentemente al menos 15 mM.
6. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa (c) comprende fusión de protoplastos mediada por polietilenglicol.
7. 7. Una planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática que se puede obtener mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende mitocondria y/o cloroplastos obtenidos a partir de una planta Foeniculum vulgare Mill. estéril masculina citoplasmática con número de acceso NCIMB 42055.
8. 8. La planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática según la reivindicación 7, en donde dicha planta es una planta Petroselinum crispum var. tuberosum.
9. 9. La planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática según la reivindicación 7, en donde dicha planta es una planta Petroselinum crispum var. crispum.
10. 10. La planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática según la reivindicación 7, en donde dicha planta es una planta Petroselinum crispum var. neapolitanum.
11. 11. La planta Petroselinum crispum estéril masculina citoplasmática según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicha planta es un híbrido.
12. 12. Semillas, partes, tejido o células de plantas obtenidos a partir de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

    imagen1

    Figura 1

    imagen2

    imprimir

    Archivo: 73170

    Pico Indice Modo Promedio Area % Area % CV

    D2.ll.ll 10:43:40

    lr000

    48,98

    338

    75,78 4,59

    1605 células/ml

    Recuento total: 446

    Recuento controlado: 78 (17,49%)

    300

    recuento

    250

    1 50

    100

    160

    200

    300

    360

    <100

    4o0 FL1600 partee

    100

    GANANCIA PAR.

    VELOCIDAD [nl/s

    1,30

    LAMP [h

    68,6

    377,5

    599

    TASA

    1/s

    Diluido

    1,000

    Figura 2

    imagen3

    Indice Modo Promedio Area %Area %CV

    Archivo: 73168

    rico

    1,000

    21

    22,39

    7,81

    25,68
13. 02.11.1110:40:09

    19974

    células/ml

    4,000

    98

    98,53

    521

    61,42

    2,79

    Recuento total: 1011

    Recuento controlado: 71 (7,02%)

    300 -

    recuento

    ZOO

    A DO

    too

    1B0

    230

    250

    300

    350

    450 FL1500

    partee

    GANANCIA PAR.

    U-L VELOCIDAD [iil/Sl

    1,30

    LAMP hl

    68,5

    999

    TASA

    [1 'S]

    Diluido 1.000

    imprimir

    Figura 3

    imagen4

    Figura 4