HUT78057A - "Polima" CMS citoplazmát tartalmazó, magas és alacsony hőmérsékleten citoplazmikusan hímsteril Brassica oleracea növények - Google Patents

Description

A találmány tárgyát képezi egy eljárás citoplazmikusan hímsteril Brassica oleracea növények előállítására. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással előállított, magas és alacsony hőmérsékleten hímsteril, Polima CMS-citoplazmát tartalmazó Brassica oleracea növények.

A terménynövények termelékenységének fokozására érdekében a növénynemesítők általában olyan fajtákat fejlesztenek ki, amelyek bizonyos kívánatos tulajdonságokkal (pl. megnövelt magasság, nagyobb növekedési sebesség, fokozott hozam, stb.) bírnak. Ennek megvalósításának egyik módja, hogy egy növénybe - kiváló növényvonal létrehozása céljából a kívánt tulajdonságot biztosító genetikai anyagot juttatunk be, majd a kiváló vonalakat keresztezzük, és ezáltal olyan Fi generációs hibrideket kapunk, amelyek a kívánt tulajdonságokat hordozzák. Az ilyen kiváló hibridek számos módon előállithatók..

A kiváló hibridek létrehozásának egyik elterjedt módja, hogy az egyik szülői vonalként hímfertilis vonalat alkalmazunk. A hímsteril vonalak alkalmazása - a növény keresztbeporzásának szabályozása révén - a hibrid

13002 KB a ·· ·

- 2 vetőmagvak gazdaságosabb termelését teszi lehetővé. A keresztbeporzás a nőivarú szülő önbeporzásának megakadályozásával szabályozható. A hímsteril növények nem termelnek pollent, így, ha egy növényt hímsterillé teszünk, olyan géndonor növénnyel keresztezhető, amely a kívánt tulajdonságokat hordozza.

A hímsterilitás kialakításának egyik módja a citoplazmikus hímsterilitás alkalmazása. Jelenlegi ismereteink alapján úgy tartjuk, hogy a citoplazmikus hímsterilitást (CMS) szabályozó genetikai faktorok a citoplazmában találhatók, különösen, ha a mitokondriális génekről van szó.

A Brassica nemzetségben a három leggyakoribb citoplazmikus hímsterilitási rendszer a következő:

1) a Raphanus sativus Ogura hímsterilítási citoplazmája;

2) a Brassica napus Polima hímsterilitási ,citoplazmája; és

3) a Brassica napus Nap hímsterilitási citoplazmája.

A Brassica fajokban a citoplazmikus hímsterilitás keresztezéssel örökíthető át. Az utódnövény citoplazmája a nőivarú növényből származik, így a nőivarú CMS-növényekkel végzett keresztezés citoplazmikus hímsterilitású utódokat eredményez. A keresztezéssel létrehozott utódok sejtmagi génjei azonban heterozigóták, emiatt - sejtmagi tulajdonságokra nézve - homozigóta CMS-vonal előállítása céljából hat-nyolc generáción keresztül visszakeresztezésre van szükség. Más módon, a citoplazmikus hímsterilitású

- 3 növényvonalak protoplasztfúzióval is létrehozhatók. A protoplasztfúziós eljárás során egy - gazdasági szempontból kívánatos tulajdonságokat hordozó - növényből származó protoplasztot egy CMS-vonal protoplasztjával fuzionálhatnak. A CMS-vonal sejtmaganyagát a fúzió előtt eltávolítják vagy inaktiválják, így az csak a citoplazmát örökíti át. Az így kapott citoplazmikus hibrid (ún. cibrid) CMScitoplazmát hordoz és hímsteril. Például, az 5 254 802 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Ogura CMS citoplazmát tartalmazó - protoplasztfúzióval létrehozott Brassica oleracea növényeket írnak le.

A Polima CMS citoplazmát különböző növényváltozatokban [pl. téli típusú repcében (Brassica napus)] alkalmazták citoplazmikus hímsterilitás létrehozására [ld. Barsby és mtsai.: Plánt Science 53, 243 (1987)}. Á Polima CMS-citoplazma alkalmazásával létrehozott citoplazmikus hímsterilitás kifejeződésével kapcsolatos egyik lényeges probléma, hogy a Polima” citoplazmát befolyásolják a környezeti feltételek [Fan és mtsai.: Can. 3. Plánt Sci. 66, 221 (1985)]. Ismeretes, hogy a Polima CMS citoplazmát tartalmazó hímsteril növények a szabadban magas hőmérséklet hatására fertilissé válnak [Fan és mtsai., ld. fentebb; valamint Fu, T.D.: Encarpia Cruciferea Nevsletter 6, 6 (1981)].

A találmány szerinti megoldás értelmében Polima CMScitoplazmát tartalmazó Brassica oleracea növényeket állítunk elő, amelyek magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt hímsterílek, megtermékenyülési képességük pedig kiváló. A találmány szerinti Brassica oleracea növények hagyományos keresztezés! eljárásokkal állíthatók elő. A különböző Brassica típusok további keresztezésekkel vagy visszakeresztezésekkel, illetve protoplasztfúzióval fejleszthetők ki.

A találmány szerinti Brassica oleracea növények hagyományos keresztezés! eljárásokkal történő előállítása céljából a 87110-es Brassica caunpestris fajtát (cultivar) 87101-es Brassica oleracea fajtával keresztezzük. A keresztezés eredményeként kapott magvakat összegyűjtjük, elültetjük és növényeket nevelünk belőlük. A létrejött növények Brassica napus fajba tartoznak, és haploíd kromoszómakészletűek, ezért a növények kromoszómatartalmát colchicinnel végzett kezeléssel meg kell kettőzni.

A 87118-as Brassica napus fajtával és a 87101-es Brassica oleracea fajta egy második fajok közötti (interspecifikus) keresztezést végzünk, s az ebből a keresztezésből kapott magvakat szintén összegyűjtjük, elültetjük és növényeket nevelünk belőlük. Az előző keresztezéshez hasonlóan, a kapott növények szintén Brassica napus fajba tartoznak, és haploid kromoszómakészletűek, ezért kromoszómátartalmuk megkettőzése érdekében colchicinnel kezeljük őket.

Ezt követően a második fajok közötti keresztezés eredményeként létrejött Brassica napus növényeket a Polima” CMS-citoplazmát tartalmazó - 87102-es Brassica napus fajtával keresztezzük, a létrejött magvakat összegyűjtjük, elültetjük, és növényeket nevelünk belőlük. A • ·

- 5 kifejlődött növények szintén Brassica napus fajúak, és Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak.

Az így kapott növényeket az első fajok közötti keresztezéssel létrehozott Brassica napus növényekkel keresztezzük, a létrejött magvakat összegyűjtjük, elültetjük, és növényeket nevelünk belőlük. A kifejlődött növények szintén Brassica napus fajúak, Polima” CMS-citoplazmát tartalmaznak, és hímsterilek.

Ezeket a növényeket normális Brassica oleracea növényekkel keresztezzük. A keresztezés eredményeként létrejött becőtermésekből - embriómentés céljából összegyűjtjük a magvakat, mivel az ilyen fajok közötti keresztezésekből képződő embriók az érettség elérése előtt általában elcsökevényesednek. Az embriómentési eljárás alkalmazásával különböző fajok keresztezéséből származó hibrid növények állíthatók elő. A kapott Fi generációs hibrid növények a nőivarú Brassica napus növénytől Polima” CMS-citoplazmát örökölnek, míg sejtmagi DNS-tartalmuk a Brassica napus (N=19) és a Brassica oleracea (N=9) sejtmagi DNS-ének kombinációja.

Az így kapott növényeket visszakeresztezzük a Brassica oleracea-vel. A kialakuló becőtermésekben ezúttal is megvizsgáljuk a magvak jelenlétét, majd azokat embriómentés céljából - összegyűjtjük. Az embriókat az előző keresztezésnél leírtak szerint regeneráljuk. A kapott növények Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak, és kromoszómaszám tekintetében közbenső terméknek tekinthetők. E ··

- 6 növények sejtmagi DNS-tartalma a Brassica napus és a Brassica oleracea sejtmagi DNS-tartalmának kombinációja.

A kapott növényeket ezután visszakeresztezzük a Brassica oleracea-vel. A növényeken kialakult becőterméseket ezúttal is összegyűjtjük, és magvak jelenlétére vizsgáljuk. A magokat elültetjük, s növényeket nevelünk belőlük. A kifejlődő növények Brassica oleracea fajúak, himsterilek, és Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak.

Adott esetben a hímsteril Brassica oleracea növények különféle Brassica típusok létrehozása érdekében - tovább keresztezhetők, illetve visszakeresztezhetők. A kialakult becőterméseket ebben az esetben is összegyűjtjük és magok jelenlétére vizsgáljuk, majd a magokat elvetjük, és növényeket nevelünk belőlük. A kifejlődött növények Brassica oleracea fajúak, Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak, és hímsterilek.

A különféle Brassica típusok protoplasztfúzióval is előállithatók, melynek során egy - Polima CMS-citoplazmát és inaktivált sejtmagokat tartalmazó - hímsteril Brassica oleracea növényből származó protoplasztot egy - gazdasági szempontból kívánatos tulajdonságokat hordozó - Brassica növényből származó protoplaszttal fúzionáltatunk. A fúzió után az allogén sejteket CMS Brassica növényekké regeneráljuk. Az igy kapott növények hímsterilek és Polima CMScitoplazmát tartalmaznak. A regenerált CMS Brassica növények tartalmazzák a Polima citoplazmát, és egyéb gazdasági szempontból kívánatos tulajdonságokat hordozó Brassica növényekkel történő keresztezésekre alkalmazhatók.

• · · ·»

-ία következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az 1. ábrán a - Polima CMS-donorként alkalmazott 904005-1-es Brassica oleracea változat, illetve a CMSsajátság befogadóiként alkalmazott Brassica oleracea tenyészvonalak sejtmagi DNS-ének BglI-endonukleázzal készített emésztményének E5-próbával végzett hibridizáltatása eredményét (hibridizációs mintázat) mutatjuk be. Az

1. oszlopban a λ-fág HindlII-mal emésztett DNS-fragmensei (molekulatömeg-standard); a 2. és 3. oszlopban a 904005-1es Brassica oleracea változat (Polima CMS-donor) DNS-ének mintázata; a 4. és 5. oszlopban a K14-es Brassica oleracea (befogadó) vonal DNS-ének mintázata; a 6. és 7. oszlopban pedig a DE70-es Brassica oleracea (befogadó) vonal DNS-ének mintázata látható.

A 2. ábrán egy Polima-donor CMS-növény és egy befogadó tenyésznövény mitokondriális DNS-ének BglIIendonukleázzal készített emésztményének CMS BRAS4 próbával végzett hibridizáltatásának eredményét (hibridizációs mintázat) mutatjuk be. A 8. és 18. oszlopban a λ-fág HindlII-mal emésztett DNS-fragmensei (molekulatömegstandard); az 1-7. oszlopokban a 904005-1-es Brassica oleracea változat (Polima CMS-donor) DNS-ének mintázata; a 9-17. oszlopokban a K14-es Brassica oleracea (befogadó) vonal DNS-ének mintázata; a 19-24. oszlopokban pedig a DE70-es Brassica oleracea (befogadó) vonal DNS-ének mintázata látható.

Ismeretes, hogy a - Polima citoplazmát tartalmazó citoplazmikus hímsterilitású Brassica napus növények ·· ·

- 8 érzékenyek a környezeti feltételekre, ami azt jelenti, hogy az ilyen növények - bizonyos hőmérsékleti feltételek mellett - elveszítik sterilitásukat. Például, korábbi vizsgálatokkal kimutatták, hogy a Polima citoplazmát tartalmazó, citoplaz-mikus hímsterilitású Brassica hapus növények magas hőmérsékleten csak részlegesen sterilek [Fan és mtsai.: Can. J. Plánt Sci. 66, 221 (1985)].

A találmány tárgyát Polima citoplazmát tartalmazó, citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények képezik, amelyek magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt himsterilek, és megtermékenyülésí képességük kiváló. Az ilyen növények további keresztezésével és visszakeresztezésével különböző - citoplazmikus hímsterilitású Brassica típusok fejleszthetők ki.

Nemesítés! program

A találmány szerinti Brassica oleracea növények kifejlesztésére hagyományos növénynemesítési eljárásokat alkalmaztunk. A következőkben a találmány szerinti Brassica oleracea növények előállítására alkalmazott nemesitési programot ismertetjük. A programot egy 87110-es Brassica canpestris (=Brassica rapa) vonalba (n=10) tartozó növény és egy 87101-es Brassica oleracea vonalba (N=19) tartozó növény keresztezésével kezdtük. A 8711-es vonalat a Centre fór Plánt Research-tól (CRPO; P.O. Box 16, 6700 AA,

Vageningen, Hollandia), IVT 86007 paar 3MS jelzésű vonalként kaptuk. Ez a vonal genetikailag hímsteril. A ·· *

87110-es vonal - a Budapesti Szerződés értelmében - 1995. augusztus 23-án az American Type Culture Collection-nél (ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852), 97246-os deponálási számon lett letétbe helyezve. A 87101es vonal a Crucifer Genetics Cooperative-tól (CrGC; Department of Plánt Pathology, 1630 Linden Drive, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin) CrCG #3-3 (Ccc) néven szerezhető be. A 87101-es vonal egy gyors fejlődési ciklusú Brassica oleracea vonal. A keresztezés után a növényeden becőtermések (s bennük magvak) fejlődtek. A terméseket összegyűjtöttük, magvak jelenlétére vizsgáltuk, majd a magokat elültettük. A kikelt növények haploid Brassica napus ac (N=19) növények voltak, melyeket a kromoszómaszám megkettőzése céljából colchicinnel kezeltük. A colchicines kezelést követően diploid aacc genommal (2n=38) rendelkező mesterséges Brassica napus növényeket kaptunk, melyeket 87116-os vonalnak neveztünk el.

Egy második Brassica caropestris vonalat, a 87118-ast (amely a 8711-essel azonos tulajdonságokkal bír) szintén kereszteztünk a 87101-es vonallal. A 87118-as vonalat a CPRO-tól IVT 86017 paar 3MS néven szereztük be. A 87118as vonal - a Budapesti Szerződés értelmében - 1995. augusztus 23-án az American Type Culture Collection-nél (ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852), 97247-es deponálási számon lett letétbe helyezve. Az előző keresztezéshez hasonlóan, az ebből a keresztezésből származó magvakat összegyűjtöttük és elvetettük. A ·* ·

- 10 kifejlődött növényeket a kromoszómák megkettőzése céljából colchicinnel kezeltük. A colchicines kezelést követően aacc genommal rendelkező mesterséges Brassica napus növényeket kaptunk, melyeket 87119-es vonalnak neveztünk el.

A 87119-es vonal növényeit ezután - Polima” CMScitoplazmát tartalmazó - 87102-es jelzésű hímsteril

Brassica napus (aacc) növénnyel kereszteztük. A 87102-es vonal a Crucifer Genetics Cooperative-tól CrCG #5-4 (AClaacc) néven szerezhető be. Ez a vonal egy gyors fejlődési ciklusú - Polima CMS-citoplazmát hordozó Brassica napus vonal. A képződött becőterméseket összegyűjtöttük, és magvak jelenlétére vizsgáltuk. A magokat elültettük, s a kifejlődött növényeket 88102-nek neveztük el. Ez a vonal Brassica napus fajba tartozik, aacc genommal rendelkezik, és Polima CMS-citoplazmát tartalmaz.

Ezután a 87116-os vonalat a 88102-es vonallal kereszteztük, a kifejlődött becőterméseket összegyűjtöttük, s magvak jelenlétére vizsgáltuk. A magokat elültettük, s a kifejlődő Brassica napus (aacc) növényeket 88125-tel jelöltük. A Brassica napus (aacc) a Brassica oleracea N=9 (cc genom) és a Brassica rapa N=10 (aa genom) közötti «

amfidiploid faj. A 88125-ös vonal Polima CMS-citoplazmát tartalmaz és hímsteril.

Ezt követően a 88125-ös (aacc) vonalat egy normális hímfertilitású brokkolinövénnyel, a Brassica oleracea-vel (cc) kereszteztük. Szakember számára kézenfekvő, hogy ehhez a keresztezéshez bármilyen hímfertilis Brassica oleracea növény alkalmazható. A kifejlődött becőterméseket össze11 gyűjtöttük és magvak jelenlétére vizsgáltuk. Ha a termésekben voltak magvak, embriómentést végeztünk, amit azért kellett végrehajtani, mert az ilyen fajok közötti keresztezésből származó embriók az érettség elérése előtt elcsökevényesednek, embriómentés alkalmazásával azonban interspecifikus hibridek állíthatók elő.

Az embriómentés során a becőtermésből eltávolítjuk az embriót. Ezt előnyösen olyan stádiumban végezzük, amikor az embrió a lehető legnagyobb méretű (általában a beporzás után 18-19 nappal). Az embriómentés természetesen korábbi vagy későbbi időpontban is elvégezhető, amikor a maghéj még nincs megkeményedve.

Az embriómentést úgy kezdjük, hogy a terméseket 10 %os hipoklorát-oldatban (pl. nátrium- vagy káliumhipoklorát-oldatban) fertőtlenítjük, és steril vízzel háromszor (2, 5, illetve 10 perc elteltével) leöblítjük őket.

Ezt követően a terméseket hosszanti irányban felvágjuk, a magvakat kivesszük, és az embriókat mikroszkóp alatt kiszabadítjuk a magokból. Ezután az embriókat megfelelő - fejlődést elősegítő - táptalajra (pl. a 11. példában leírt BLKC-táptalajrá) helyezzük? erre a célra bármilyen, fejlődést elősegítő táptalaj alkalmazható. Az embriókat 20 °C-on 16 órás, 4500 Lux fényerősségű megvilágítással legalább két hétig inkubáljuk. A gyökerek kifejlődése után a csíranövényeket mielőbb talajba ültetjük.

• *

- 12 Az Fi generációs növényeket 88132-1-től 88132-84-ig terjedő számokkal azonosítottuk. Ezek a növények a nőivarú Brassica napus növényből származó Polima CMS-citoplazmát tartalmazzák; sejtmag! DNS-tartalmuk pedig Brassica napusból (N=19) és Brassica oleracea-ből (N=9) származó sejtmagi DNS kombinációja. A növények lényegében kevert genomot tartalmaznak. Kevert jellegük miatt a növények himsterilek és - részlegesen - meddők voltak. A hímstériIrtást a nőivarú szülőből (88125-ös Brassica napus) származó Polima CMS-citoplazma eredményezi.

A 88132-1-estől 88132-84-esig terjedő növények k'özül a közel normális (aacc vagy cc) DNS-tartalmú egyedek kiválasztása céljából fenotípusos szelekciót alkalmaztunk, ami lehetővé teszi, hogy kiválasszuk a (cc genomot hordozó) Brassica napus-hoz leginkább hasonlító növényeket. Az rendellenes DNS-tartalmú növények látható jellemzőkben különböznek a normális DNS-tartalmú növényektől. A kiválasztott növényeket normális brokkolinövénnyel vagy karfiolnövénnyel (Brassica oleracea; cc) visszakereszteztük (1. visszakeresztezés) . Szakember számára kézenfekvő, hogy erre a célra bármilyen Brassica oleracea növény alkalmazható. A visszakeresztezés eredményeként kapott magvakkal embriómentést végeztünk, s az embriókból kifejlődött növényeket 89015-tól 89040-ig, illetve 89046-tól 89056-ig terjedő számokkal jelöltük. Ezek a növények kromoszómaszám tekintetében intermedierek, és Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak. E növények sejtmagi DNS-tartalma ezúttal is Brassica napus-ból és Brassica oleracea-ből származó

- 13 sejtmagi DNS kombinációja. A növények hímsterilek (Polima CMS) és részlegesen meddők (kromoszómaszám) voltak.

A 89015-tól 89040-ig, illetve 89046-tól 89056-ig terjedő számozású növények közül a közel normális DNStartalmúak kiválasztása céljából fenotípusos szelekciót végeztünk. A kiválasztott növényeket normális brokkolinövénnyel vagy karfiolnövénnyel (Brassica oleracea; cc) visszakereszteztük (2. visszakeresztezés), azonban szakember számára kézenfekvő, hogy erre a célra bármilyen Brassica oleracea növény alkalmazható. A visszakeresztezés eredményeként becőtermésekét kaptunk, melyek magjai közül néhány nem igényelt embriómentést. Ezeket a magokat összegyűjtöttük és elültettük, s a kifejlődött növényeket 89070-től 89141-ig terjedő számokkal jelöltük. E növények többsége Brassica oleracea-ra jellemző normális kromoszómakészletet (2N=18), valamint Polima” citoplazmát tartalmazott, és himsteril volt. E növények virágai csökkent számú portokot és szirmot tartalmaztak, és magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt himsterilek voltak, miközben normális megtermékenyülési képességük volt.

Ezek a növények egyéb Brassica típusokkal (pl., brokkolival, karfiollal, vörös-, fehér- vagy fodroslevelű káposztával, kelbimbóval, karalábéval, kelkáposztával, stb.) keresztezhetők, miáltal további citoplazmikus himsterilitású vonalak jönnek létre. Például, a Polima” CMS növényekkel végzett visszakeresztezéssel vagy protoplasztfúzióval különféle Brassica típusok hozhatók létre.

- 14 További keresztezések; szelektálás! eljárások himsterilitásra, megtermékenytthetőségre és vírágmorfolóqiára

A fenntartó” amelyeket a szülői vonal

A 89015-től 89640-ig, a 89046-tól 89056-ig, valamint a 89070-től 89141-ig terjedő sorszámú növényeket normális brokkoli és/vagy karfiolnövényekkel kereszteztük, és szántóföldre ültettük. A kifejlődött becőterméseket összegyűjtöttük és magvak jelenlétére vizsgáltuk. A magvakat összegyűjtöttük és elvetettük, oly módon, hogy felváltva Polima-steril növényekből álló sorok és fenntartó brokkoli sorok kerüljenek egymás mellé vonalon olyan növényeket értünk, keresztezéseknél a hímsteril nőivarú sterilitását megtartó utódok létrehozására alkalmazzuk. A fenntartó növények fertilisek, de egyébként genetikailag azonosak azokkal a CMS növényekkel, amelyekkel - hímsteril vonalból magok termelése érdekében - együtt vannak nevelve (általában váltakozó sorokban). Megfelelő ideig végzett nevelés után a hímsterilitást, jó megtermékenyíthetőséget és a legjobb virágmorfológiát (azaz megfelelő sziromméretet) mutató növények kiválasztása céljából természetes szelekciót végeztünk (méhekkel/legyekkel, kiválasztott növényeket CPO-1, CPO-2, stb azonosítottuk. Ezek a növények Brassica oleracea fajúak és hímsterilek voltak, Polima CMS-citoplazmát tartalmaztak, és jó megtermékenyíthetőségi képességet mutattak.

Megfelelő nevelési idő után a hímsteril, jó stb.‘) . A jelöléssel megtermékenyíthetőségű, CPO számozású növényeket klónoztuk és - fenntartó növénnyel együtt - kalitkába helyeztük. Ez azt jelenti, hogy a növények köré - a szántóföldön lévő más növényekkel rovarok közvetítésével bekövetkező keresztbeporzás elkerülése érdekében - hálósátort vagy kalitkát állítunk fel, és a sátor vagy kalitka belsejébe méhkaptárt vagy más rovarkolóniát telepítünk. A kifejlődő becőterméseket összegyűjtöttük és a magokat elvetettük. A magokból Brassica oleracea fajba tartozó növények fejlődtek ki, amelyek Polima CMS-citoplazmát tartalmaztak, és hímsterilek, ugyanakkor jó megtermékenyülési képességűek voltak.

Protoplasztfúzió

A különféle Brassica típusok protoplasztfúzióval is előállíthatók. A protoplasztok Polima CMS-citoplazmát tartalmazó, hímsteril Brassica oleracea növényekből nyerhetők. Protoplasztfúzió céljára a fentebb leírt nemesítési programmal előállított Brassica oleracea növények (pl. a CPO sorozat 89070-től 89111-ig terjedő sorszámú növényei) alkalmazhatók. A protoplasztfúzió - agglutinációt okozó polietilén-glikol (PEG) alkalmazásával, fúziós puffer (a membránok fúzióját elősegítő nagy pH-jú oldat) jelenlétében valósítható meg. Az ilyen szomatikus hibridizáció a Sundberg és mtsai. [Plánt Science 43, 155 (1986); melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni] által leírt - interspecifikus hibridek előállítására vagy módosítására alkalmas - feltételek alkalmazásával valósít• ί’ * · » * <♦» »» *♦·» 4» ható meg. A protoplasztfúzió a polietilén-glikol alkalmazásán alapuló módszeren kívül más eljárásokkal is végrehajtható. Például, a protoplasztok elektromos erőtérű indukciós technikával is fuzionáltathatók egymással [ld. Koop és mtsai.: ”Ei_ectric Field-Induced Fusion and Cell Reconstruction vith Preselected Single Protoplasts and Subprotoplasts of Higher Plants; Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, szerk.: Neuman és mtsai., 355-365. old. (1989); melyet teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekinteni]. Ezenfelül, a protoplasztfúzió dextrán és polivinil-alkohol alkalmazásával is megvalósítható [ld. Hauptmann és mtsai.: Carrot x Tobacco Somatic Cell Hybrids Selected by Amino Acid Analóg Resistance Complementation, 6. Nemzetközi Protoplaszt Szimpózium, Bázel, 1983. augusztus 12-16.; mely forrást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni].

Amennyiben a protoplasztfúziót polietilén-glikollal hajtjuk végre, a következő eljárást alkalmazzuk.

A protoplasztfúziót előnyösen mosóoldatban (V5'; ld. később) végezzük, amely ozmotikumot, például szénhidrátot (mannitolt, szorbitolt, glükózt vagy szacharózt), valamint kálium- és kalciumsókat tartalmaz. A mosóoldat pH-ja 5,2től 10-ig terjed, előnyösen 5,7. A különböző eredetű protoplasztokat összekeverjük és az elegyet betöményítjük, előnyösen 10⁵ és 10⁸ protoplaszt/ml sűrűségűre.

A protoplaszt-elegyet ezután legalább 10 percig állni hagyjuk, hogy a protoplasztok a Petri-csésze aljára süllyedjenek. Az elegyet ezután - előnyösen 1500-6000 kD molekulatömegű - polietilén-glikollal (PEG) kezeljük. Általában akkor érünk el jó eredményt, ha 18,8 % (m/m) polietilén-glikolt tartalmazó vizes oldatot alkalmazunk, amelyben a W5’-oldat és a polietilén-glikolos fúziós oldat (PFS) térfogataránya 10:1-től 1:1-ig terjed. A PFS-oldat előnyösen ozmotikumot és kalciumsót tartalmaz. A protoplasztokat - a sejtek törékenységétől függően - 15-20 percig tartjuk a PFS-oldatban.

A protoplasztokat, például, háromszor mosóoldattal (W5^T) mossuk,' mely mosóoldat - a PFS-nél kisebb ozmolarítást biztosító koncentrációban - ozmotikumot (pl. glükózt), valamint kálium-, nátrium- és kalciumsókat tartalmaz. A fuzionáltatást 16 °C és 20 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 18 °C-on végezzük. A fúziós elegyben a polietilén-glikol koncentrációját az egymást követő mosási lépésekben fokozatosan csökkentjük (ld. pl.

6. példa). Az egyes mosási lépéseknek legalább öt percig kell tartaniuk, hogy - a sejtek szétrepedésének elkerülése érdekében - a protoplasztok lassan vegyék át a közeg kisebb ozmolaritását. A mosási lépések elvégzése után a fuzionáltatott protoplasztok mennyiségének 10⁵-10⁶ protoplaszt/ml tartományban kell lenni. A kapott fúziós termékek nem fuzionáltatott szülői protoplasztok jelenlétében vagy optikai szelekciót kővetően regenerálhatók a tenyészetből. Az optikai szelekciót a sejtek mikro-manipulációjával, például, a növényi heterokarion manuális izolálására és azonosítására Patnaik és mtsai. által leírt eljárás szerint [Plánt Science Letters 24, 105 (1982); melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni] végezzük.

A szelektálás! eljárás alkalmazásakor a szülői protoplasztokat, például, fluoreszcens színezékkel (pl. fluoreszcein-diacetáttal) festjük. Amennyiben hipokotileredetű protoplasztok festésére fluoreszcein-diacetátot alkalmazunk, a protoplasztok UV-fényben sárgák lesznek. A levelekből származó protoplasztok kloroplasztiszokat tartalmaznak, amelyek UV-fényben vörös auto-fluoreszcenciát mutatnak.

A kapott fúziós termékeket megfelelő - a protoplaszt növekedéséhez jól kiegyensúlyozott tápanyagforrást tartalmazó - tenyésztő tápközegben tenyésztjük. A tápközeg mikroés makroelemeket, vitaminokat, aminosavakat és kevés szénhidrátot (különböző cukrokat, például glükózt) tartalmaz. A glükóz egyszerre szénforrásként és ozmotikumként szolgál. A tenyésztő tápközeg növényi hormonokat (auxinokat és citokint) is tartalmaz, melyek a sejtosztódást és a gyökérképződést szabályozzák. A megfelelő auxinok közé tartozik a naftil-ecetsav (NAA), a 2,4-diklór-fenoxiecetsav (2,4-D) és az indol-ecetsav (IAA). Az alkalmazható citokinek közé tartozik a benzil-amino-pirin (BAP), a zeatín (Zea) és a gibberellinsav (GA3) . A sejtosztódás beindítására általában - BAP-vel kombinálva - NAA-t és 2,4D-t alkalmazunk. Az auxin/citokin aránynak ezután nagynak, például, egynél nagyobbnak kell lennie. A fúziós kezelés után két vagy három nappal a tápközeget agarózt tartalmazó tenyésztő tápközeggel (BP) helyettesítjük, amelybe a fúziós termékek és a szülői protoplasztok beágyazódnak.

nap múlva az auxinok koncentrációját - auxint egyáltalán nem vagy lényegesen kisebb mennyiségben tartalmazó - tenyésztő tápközeg hozzáadásával csökkentjükÁltalában 3-4 hét elteltével csillag alakú mikrokalluszok képződnek, melyeket - a hajtásképződés beindítása érdekében - regeneráló tápközegre helyezünk át (előnyösen oly módon, hogy a tenyésztő tápközeg és a regeneráló tápközeg összetételi és fizikai különbségeihez történő alkalmazkodás érdekében először egy köztes regeneráló tápközegen inkubáljuk őket). A hajtásképződés elősegítése céljából a regeneráló tápközegben az auxin/citokin arányt előnyösen alacsony (pl. 1:10 alatti) értékre kell állítani. A haj tásképzés szempontjából előnyös, ha az NAA auxint Zea vagy BAP citokinnel kombinálva alkalmazzuk. A ”Br és K3 regeneráló tápközeg a tenyésztő tápközeghez képest szegényebb összetételű, vagyis kevesebb vitamint és szénforrást (csak szacharózt és xilózt) tartalmaznak, továbbá nem tartalmaznak aminosavakat. Ezenkívül, a regeneráló tápközeg nagyobb viszkozitású, mint a tenyésztő tápközeg. A ”Br regeneráló tápközeg szilárd táptalaj, amely 2,4-D-t, NAA-t és BAP-t tartalmaz, és az auxin:citokin arány egynél kisebb. A K3 tápközeg zeatint, GA₃-at és - a hajtásfejlődés elősegítése érdekében - ezüst-nitrátot tartalmaz.

A Br táptalajon végzett két hetes regenerálást követően a hozzávetőleg 3 mm átmérőjű kalluszokat - kis fc* ·*

- 20 szacharózkoncentrációjú - K3 regeneráló tápközegre helyeztük át. Ebben a stádiumban a hajtások két-három héten belül kifejlődnek. A hajtásokat alaptáptalajon (pl. ”B5), további hormonok hozzáadása nélkül gyökerezhetjük. A kapott csíranövények sejtmagi DNS-ét és mitokondriális DNS-ét önmagában ismert eljárással (például, a fúziós termékek és a szülői vonalak DNS-ének megfelelő restrikciós endonukleázzal végzett emésztésével, és az így kapott DNSmintázat összehasonlításával) azonosíthatjuk.

Az eljárásunkban kiindulási anyagként alkalmazott Brassica oleracea protoplasztok és egy Polima CMS Brassica oleracea növény inaktivált protoplasztjai a megfelelő növényi sejtekből, önmagában ismert eljárással állíthatók elő. Sejtfalmentes sejteket, azaz protoplasztokat zöld növényi anyagból (pl. levelekből) vagy fehér növényi anyagból (pl. etiolált csíranövényekből), Glimelius - hipokotil-protoplasztok regenerálására leírt eljárása szerint [Physiologia Plantarum 61, 38 (1984); melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni] állíthatunk elő. Amennyiben a fúziós termékeket optikai szelekcióval kívánjuk kiválasztani, a kiindulási anyagokat előnyösen zöld növényi anyagból választjuk ki, vagy amennyiben fehér növényi anyagból származnak, a szelekció elősegítése céljából megfelelő festést alkalmazunk. A Polima CMS Brassica oleracea növény inaktivált protoplasztjait - a Polima CMS Brassica oleracea növényi sejteket vagy protoplasztokat illetően 21 önmagában ismert eljárással, például, besugárzással hozzuk létre.

A sejtmag sugárzással történő inaktiválását gamma-, UV- vagy röntgensugarak alkalmazásával valósíthatjuk meg. Röntgensugárzás alkalmazása esetén a sejtmag inaktiválását általában kb. 10 krad dózissal 3-20 percig végzett besugárzással érjük el. A megfelelő röntgensugár-dózist például a protoplaszt-populáció 100 %-ának elpusztításához szükséges minimális röntgensugárzás meghatározásával állapíthatjuk meg: az elpusztult sejtek százalékos arányát a tenyészetben

10-20 nap elteltével kialakult telepek száma alapján becsülhetjük meg.

Ahogy fentebb említettük, a fuzionáltatás után az allogén sejteket CMS-citoplazmát tartalmazó Brassica oleracea növényekké regeneráljuk. A kifejlődött növények később más Brassica oleracea növényekkel keresztezhetők.

A találmány szerinti Brassica oleracea növények kiindulási anyagként alkalmazhatók egyéb - Polima” CMS citoplazmát tartalmazó - Brassica oleracea változatok in vitro és/vagy keresztezés! eljárásokkal történő előállítására. Az in vitro és a keresztezés! eljárások szakember számára jól ismertek.

A következőkben a találmány szerinti eljárás gyakorlati megvalósítása során alkalmazott oldatok összetételét ismertetjük.

• · e· * « » · »· »♦ *··♦

- 22 A) Enzimoldat (1 liter) g mannitol;

0,0272 g KH₃PO₄;

0,1 g KNO₃;

0,246 g MgSO₄-7H₂O;

0,0008 g KI;

0,00025 g CuSO₄‘5H₂O;

1.4 g CaCl₂'2H₂O;

1,1 g MES;

g Celluláz RIO;

g Macarozyme (pH=5,8).

B) Mosóoldat (W5) (1 liter)

18.4 g CaCl₂’2H₂O;

4,91 g NaCl;

0,372 g KC1;

0,901 g glükóz; pH = 5,8.

C) Mosóoldat (¥5') (1 liter)

18,4 g CaCl_z-2H₂O;

4,91 g NaCl;

0,372 g KC1;

0,901 g glükóz;

9,76 g MES (pH = 5,8).

D) CPV 16S (1 liter)

160 g szacharóz;

0,0272 g KH₃PO₄;

·»* ·· *ί·*

- 23 0,1 g ΚΝΟ₃;

1,45 g CaCl₂'2H₂O;

0,246 g MgSO4-2H₂O;

0,0008 g KI;

0,000025 g CuSO₄ ^-5H₂O; pH = 5,5-5,8.

E) Polietilén-glikolos fuzionáltató oldat (PFS)

18,8 % PEG (4000 D);

0,06 M CaCl₂’2H₂O;

0,1 M mannitol;

0,025 M glicin;

% (V/V) DMSO.

F) SPA oldat (1 liter) g SeaPlaque agaróz; 100 g szacharóz.

• ·”· ί ·\ »» ·» *·♦· ·* ·«

- 24 1. táblázat

Az MS tápközegek összetétele (ntg/1)

Komponens	8P	MAC	Br	K3	B5	MS
KNO2	959	956	1556	1556	3000	1900
NH4NO3	600	600	250	250	—	1650
MgSO4'2H2O	300	300	250	250	250	370
KH2PO4	164	164	-	-	-	170
CaCl2-2H2O	600	600	300	300	150	440
KC1	300	300	-	-	-	-
(NH4)2SO4	-	-	134	134	134	-
K	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75	0,83
MnSO4’4H2O	10	10	10	10	10	22,3
H2BO3	3	3	3	3	3	6,2
ZnSO4’2H2O	2	2	2	2	2	8,6
NaMo04'2H20	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
CuSO4'4H2O	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
CoC12'6H20	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Fe-EDTA	40	40	40	40	40	43
Tiamin-HCl	10	10	10	10	10	0,1
Piridoxin-HCl	1	1	1	1	1	1
Nikotinsav	1	1	1	1	1	1
Nátrium-piruvát	20	20	—	—	—	-
Citromsav	40	40	-	-	-	-
Maleinsav	40	40	-	-	-	-
Fumársav	40	40	-	-	-	-
Gli cin	-	-	-	-	-	2
Xilóz	-	-	< 250	-	-	-

- 25 1. táblázat (folytatás) ···· ·· *·

Komponens	8P	MAC	Br	K3	B5	MS
Inozitol	100	-	—	—	-	100
Szacharóz	50000	80000	40000	10000	20000	* *
Glükóz	40000	-	-	-	-	—
Kazein-	250	250	-	-	-	-
hidrolizátum
Agaróz	-	-	16000	-	-	-
Ag ar	-	-	-	8000	8000	8000
NAA	0,1	0,1	0,1	-	-	-
2,4-D	1	0,2	0,1	-	-	-
Zeatin	-	-	-	0,26	-	—
BAP	0,5	0,5	0,5	-		-
ga3	-	-	-	0,006	-	-
AgNO3	-	-	-	5	-	-

** ld. a példákban

A továbbiakban a· találmány szerinti megoldást kísérleti példákon keresztül szemléltetjük.

1. példa

Magsterilizálás és csiráztatás

Polima CMS-citoplazmát tartalmazó Brassica oleracea brokkolínövény magjait (a továbbiakban B. oleracea 9040051) kb. 10 másodpercre 70 %-os alkoholba’ mártottuk, és 20 °C-on kétszer 10 percig 1,5 %-os nátrium-hipoklorit• · · « i 4 · ·*· ·» ··»· «· r>·

- 26 oldatban sterilizáltuk. Ezt követően a magokat steril desztillált vízben alaposan leöblítettük, majd - 3 % szacharózt tartalmazó, hormonok nélküli - MS tápközegre (ld. 1. táblázat) helyeztük. Steril zöld növények előállítása érdekében a magokat - 25 °C nappali és 20 °C éjszakai hőmérsékleten, 16 órás megvilágítási periódussal, 8000 lux fényerővel üvegtégelyekben inkubáltuk. A steril hajtásokat műanyag edényekben, azonos feltételek mellett neveltük. A protoplasztok izolálására alkalmas fehér hajtások (pl. hípokotilok) előállítása érdekében a magvakat 25 °C-on, sötétben, Petri-csészékben inkubáltuk.

1/a példa

A 9Q40Q5-l-es magokat eredményező keresztezések

A 904005-1-es jelzés a 904005-ös vonal 1-es növényéből származó magokra vonatkozik. A 904005-ös vonalat a 8927312-es Polima CMS növény normális fertilitású brokkolinövénnyel végzett visszakeresztezésével kaptuk.

A 892731-2 a - 89094-2-es Polima” CMS növény normális fertilitású brokkolinövénnyel végzett visszakeresztezéséből származó - 892731-es vonal 2-es növényéből származó magvakat jelöli.

A 89094-2 a - 89022-es Polima CMS növény normális fertilitású brokkolinövénnyel végzett visszakeresztezéséből származó - 89094-es vonal 2-es növényéből származó magvakat jelöli.

A 89022-4 a 89022-es vonal 4-es növényéből származó magvakat jelöli.

2. példa

A DE70-.es Brassica oleracea fajta magjait az 1. példában leírt eljáráshoz hasonlóan sterilizáltuk és csíráztattuk. A DE70-es fajta egy teljes mértékben fertilis karfiolvonal, amelyet szülői vonalként alkalmaztunk, a protoplasztfúzió céljára azonban bármilyen tipikus Brassica oleracea növény alkalmazható.

3. példa

Protoplasztok izolálása

Az 1. példában leírtak szerint előállított négy hetes hajtások leveleit apró darabokra vágtuk, és enzimoldatban 40-es percenkénti fordulatszámmal működtetett síkkeverőn 25 °C-on 16 óra hosszat inkubáltuk. A szuszpenziót 40 pm lyukbőségű nylonszitán átszűrtük, majd kétharmadnyi térfogatú CPV 16S oldattal - percenként 817 fordulattal 5 percig centrifugálva - mostuk, ami az ép protoplasztok flotálását eredményezi. A protoplasztokat összegyűjtöttük, és - percenként 708 fordulattal 5 percig centrifugálva - W5 oldattal kétszer mostuk. A protoplasztokat a fúziós kísérletekben történő felhasználás előtt V5 oldatban 1 χ 10⁵ protoplaszt/ml sűrűségre hígítottuk.

A 2. példában előállított növényi anyag 6-8 napos hipokotiljait a 3. példában leírtak szerint izoláltuk, azzal a különbséggel, hogy az enzimes kezelés során az oldathoz 3 gg/ml koncentrációban fluoreszcein-diacetátot ·» »* • · · • · · · • · · • · · · · »

4. példa

adtunk, miáltal - manuális szelekcióra és a	fúziós
gyakoriság meghatározására alkalmas - festett	proto-
plasztokat kaptunk.
5. példa A protoplasztok sugárkezelése	*
A 3. példában leírt eljárással frissen	izolált

protoplasztokat 6 cm-es Petri-csészében 2-3 ml W5-oldatba helyeztük. A protoplasztokat röntgensugárzó készülék (Baltograph CE100) alkalmazásával, 20 percig 3500 Gy dózissal sugárkezeltük. A besugárzás után az inaktivált protoplasztokat - percenként 708 fordulattal 5 percig centrifugálva - V5-oldattal mostuk. A protoplaszt-elegyet a fúziós kísérletekben történő felhasználás előtt V5-oldatban 1 x 10^s protoplaszt/ml sűrűségűre hígítottuk.

- 29 6. példa

Fúziós eljárás

A 4. és 5. példában leírtak szerint kezelt protoplasztokát 1:3 arányban - V5-oldatban 1 x 10⁵ protoplaszt/ml sűrűségben - összekevertük. Az így kapott elegy három 100 μΙ-es cseppjét 6 cm-es, bevonat nélküli Petricsészébe cseppentettük, és a protoplasztokat 5-10 percig hagytuk leülepedni. A három csepp középpontjába - az agglutináció indukálása céljából - 15 percre 300 μΐ PFSoldatot adtunk. Ezután az elegyhez 300 μΐ V5-oldatot adtunk, majd ezt 10 perc, valamint újabb 5 perc elteltével megismételtük. A V5-oldatot kétszeresére betöményített 8Ptápközeggel helyettesítettük, és a protoplasztokat 25 °Con, sötétben 1-3 napig tenyésztettük.

7. példa

A 6. példában előállított teljes fúziós elegyet 25 °Con, sötétben 1-3 napig tenyésztettük. A sejteket percenként 548 fordulattal, 5 percig végzett centrifugálással - összegyűjtöttük, és a sejtelegyet kétszeresére töményített 8P-tápközeggel 1 x 10⁵ protoplaszt/ml sűrűségre hígítottuk. Az elegyhez azonos térfogatú, kézmeleg SPAtápközeget adtunk, és a sejteket öt 100 μΙ-es cseppben bevonattal ellátott - Petri-csészébe cseppentettük. A csészékbe öt 100 μΙ-es cseppben táplálósejteket is adtunk. Két hét elteltével a táplálósejteket tartalmazó cseppeket eltávolítottuk, és a Petri-csészékbe 2 ml MAC-tápközeget adtunk. Két hét múlva a cseppeket szilárd Br-táptalajra szélesztettílk, majd újabb két-három hét elteltével a különálló telepeket szilárd K3-táptalajt tartalmazó Petri' csészébe helyeztük át. A mikrokalluszokat 25 °C-on, kis fényerősség mellett (2500 lux), 18 órás megvilágítási periódussal tenyésztettük.

8. példa

A fúziós termékek szelektálása és szaporítása

A fuzionált sejteket (melyek vizuálisan a kettős fluoreszcencia jelenléte alapján ismerhetők fel) mikromanipulátor alkalmazásával összeszedtük. A hibrid sejteket 100 μΙ-es agaróz-cseppekben (1 % SeaPlaque) - 2000-50000 protoplaszt/ml sűrűségben - tenyésztettük. A cseppeket táplálósejtekkel együtt folyékony ápoló (nurse) tenyészeti rendszerbe (Costar-Transwell col) helyeztük, és 25 °C-on sötétben inkubáltuk. Két hét múlva a cseppeket szilárd Br-táptalajra szélesztettük. A képződött kis kalluszokat szilárd K3-táptalajra helyeztük át, és 25 «’Con, kis fényerősség (2500 lux) mellett 18 órás megvilágítási periódussal tenyésztettük.

9. példa

Növények regenerálása

A 7. és 8. példában leírtak szerint előállított, 2-5 mm átmérőjű kalluszokat friss K3-táptalajra helyeztük át, és 25 °C-on normális fényintenzitással (8000 lux), 16 órás megvilágítási periódussal inkubáltuk. A kis hajtásokat - 1 % szacharózt tartalmazó, hormonmentes - B5-táptalajra tettük, és ugyanezen a táptalajon gyökereztettük.

10. példa

A fúziós termékek molekuláris analízise

a) Sejtmagi DNS-összetétel

A fúziós termék sejtmagi DNS-ének összetételét specifikus DNS-próbák alkalmazásával karakterizáltuk. Az ESpróba (amely karfiol sejtmagi DNS-ből származó 820 kb-os BglI-fragmenst tartalmazó klón) a Polima CMS-donor Brassica oleracea változat, valamint a citoplazmikus hímsteril sajátság akceptoraként alkalmazott Brassica oleracea tenyészvonalak sejtmagi DNS-ének endonukleázos emésztményében különböző DNS-fragmensekkel hibridizálódik (ld. 1. ábra).

b) Mitokondriális DNS-összetétel

A fúziós termék mitokondriális DNS-ének összetételét

CMS Bras 4 DNS alkalmazásával karakterizáltuk. Ez a klón karfiol mitokondriális DNS-ből származó, 1950 bp-os BglII32 fragmens. E klón alkalmazásával a CMS Polima mitokondriális DNS-sel hibridizáltatva 4 kb-os sávot, az akceptor tenyészvonalakból (pl. DE70) származó mitokondriális DNS-sel hibridizáltatva pedig 6 kb-os sávot detektáltunk (ld. 2. ábra).

A karakterizálást egy 500 bp-os DNS-fragmens - 94RSO1 és 94RSO2 láncindító (primer) alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakciós amplífikációjával is elvégeztük. A 94RSO1 primer szekvenciája: 5’-GAA CCA ACT GCT TTC ACA CCG3'; a 94RSO2 reverz primer szekvenciája pedig: 5*-CTT GGC TCT CTG CGA ATG TC-3’.

A CMS Polima mitokondriális DNS-ból sikerült 500 bpos fragmenst amplifikálni, az akceptor vonalak (pl. a DE70) mitokondriális DNS-éből azonban nem.

11. példa

Embriómentés

Az embriókat általában a beporzás után 18-19 nappal távolitottuk el a magokból. Az embriómentés végrehajtásához olyan becőtermésekre van szükség, amelyek a lehető legnagyobb embriókat tartalmazzák, melyeken a maghéj még nem keményedétt meg.

Az embrió eltávolítása előtt a becőterméseket fertőtleníteni kell. A terméseket kb. 20 percre 10 %-os kloridoldatba (pl. nátrium- vagy kálium-klorid oldatba) helyezzük, majd desztillált vízzel háromszor (2, 5 és 10 perc elteltével) leöblítjük őket.

Az embriómentéshez a becőterméseket hosszanti irányban felnyitjuk, eltávolítjuk a fejlődő magvakat, és az embriót mikroszkóp alatt kivesszük a magból.

Miután az embriót kimetszettük a magból, megfelelő növesztő tápközegre helyezzük. Erre a célra bármilyen - az embrió növekedését elősegítő - tápközeg, például (3 % szacharózt, 0,4 mg/1 tiamint és 0,2 mg/1 IDA-t tartalmazó MS-tápközeg) alkalmazható.

12. példa

A citoplazmikus hlmstériIrtás# (CMS) Brassica oleracea növények sterilitásának fenntartása magas és alacsony hőmérsékleten

Annak meghatározása érdekében, hogy a - Polima CMScitoplazmát tartalmazó - citoplazmikusan hímsteril növények magas és alacsony hőmérsékleten hímsterilek maradnak-e, a 915095-ös, 915107-es, 915100-as és 915144-es brokkoli fajtákat vöröskáposztával hibridizáltuk (a 100 %-os hibriditás ellenőrzése céljából). A 915095-915144 fajtákat vöröskáposztával kereszteztük. Amikor e fajtákat normális brokkoli fenntartó vonalakkal poroztuk be, s ‘a megérett magokat elvetettük, a kifejlődött csíranövények hipokotilja és levele zöld volt. Ha ezeket a fajtákat vöröskáposztával kereszteztük, a hibrid magvak intermedierek voltak, és a kifejlődött csíranövények erőteljes autocián-expressziót (bíbor elszíneződés) mutattak, miközben a beltenyésztett növények zöld színűek maradtak. A 915095-ös, 915107-es,

- 34 915100-as és 915144-es fajták magjait elültettük, és mindegyik fajtából húsz növényt - vöröskáposzta növényekkel együtt - műanyaggal borított kalitkákba helyeztünk. Nyáron a kalitkákban a nappali hőmérséklet 15 °C és 40 °C között változott. A 915095-ös, 915107-es, 915100-as és 915144-es fajtákból betakarított magvak mintáit elvetettük, s valamennyi kifejlődött növény hibrid volt, ami az önmegtermékenyítés hiányát, valamint azt jelzi, hogy a Polima” CMS-citoplazma nem szivárgott ki” ezekből a növényekből. Egyik növény esetében sem tapasztaltunk részleges hímsterilitást.

A 915095-ös, 915107-es, 915100-as és 915144-es fajtákat eredményező keresztezéseket a következőkben mutatjuk be.

88125 x brokkoli [=bc (brokkoli porzó vonal)]

4,

88132 x be

89022 x	be	89036 χ be	89046 x be
89094	X	be	89102 x be	89083 x be	89133 x	be
				Φ
892731	X	be	892733 x be	892736 x be	892737	x be
				Φ	4·
904005	X	be	904006 x be	904008 x be	904045	x be

915095 915100 915107 915144 • · ·

- 35 Amennyiben egy keresztezésből kettő vagy több nyíl indul ki (88132 x be) , úgy mindegyik nyíl egy különböző genotípusú brokkolival végzett keresztezést jelent.

13. példa

Megtermékenyíthetőség

Az alábbiakban a CMS Polima típusok brokkolival· végzett manuális keresztezésével kapott maghozamokat soroljuk fel. Az adatok azt mutatják, hogy a CMS Polima” típusok maghozama nagyobb, mint a beltenyésztett brokkolinövényeké. Ezt az okozza, hogy az ismételt beltenyésztés befolyásolja a fertilitást. Jobb összehasonlítást végeztünk az Fi generációs brokkolinövények, illetve a CMS Ogura növények keresztezésével. Az eredmények azt mutatják, hogy a CMS Polima növények maghozama azonos nagyságrendű a másik két keresztezésből származó maghozammal.

Brokkolinövények maghozama 1991-94-ben (kézi beporzás)

Év	Keresztezés típusa	Egy keresztezésből származó magok száma
1991	(CMS Polima x brokkoli)Fi	114 (n=4)
	(Beit.* brokkoli x brokkoli)Fi	64 (n=23)
	(Brokkoli Fi x brokkoli)Fi	116 (n=45)
1992	(CMS Polima x brokkoli)Fi	146 (n=66)
	(Beit. brokkoli x brokkoli)Fi	100 (n=76)
	(Brokkoli Fi x brokkoli)Ft	135 (n=28)
	(CMS Ogura x brokkoli)Fi	140 (n=32)
1993	(CMS Polima x brokkoli)Fi	79 (n=41)
	(Beit. brokkoli x brokkoli)Fi	53 (n-70)
	(Brokkoli Fi x brokkoli)Fi	80 (n=35)
	(CMS Ogura x brokkoli)Fi	144 (n=5)
1994	(CMS Polima x brokkoli)Fi	93 (n=9)
	(Beit. brokkoli x brokkoli)Fi	47 (n=50)
	(Brokkoli Fi x brokkoli)Fi	84 (n=35)
	(CMS Ogura x brokkoli)Fi	74 (n=9)
	Súlyozott átlagok:
	(CMS Polima x brokkoli)Fi	115 (n=120)
	(Beit. brokkoli x brokkoli)Fi	60 (n=227)
	(Brokkoli Fi x brokkoli)Fi	103 (n=143)
	(CMS Ogura x brokkoli)Fi	(127) (<n=40))

* Beit. = beltenyésztett

Bár a találmány szerinti megoldást a találmány előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, szakember

- 37 számára kézenfekvő, hogy a gyakorlati megvalósítás során végrehajthatók bizonyos módosítások, anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen módosítások az igényelt oltalmi körön belül maradnak.

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények előállítására, amelyek magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt hímsterilek, és Polima CMScitoplazmát tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy

   a) a 87110-es Brassica canpestris fajtát 87101-es Brassica oleracea fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   b) a magokból Brassica napus növényeket regenerálunk, amelyek haploid kromoszómakészletet tartalmaznak;

   c) a (b) lépésben kapott növények kromoszómaszámát megkétszerezzük, miáltal diploid kromoszómakészletű Brassica napus növényeket kapunk;

   d) a 87118-as Brassica campestris fajtát 87101-es Brassica oleracea fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   e) a magokból Brassica napus növényeket regenerálunk, amelyek haploid kromoszómakészletet tartalmaznak;

   f) az (e) lépésben kapott növények kromoszómaszámát megkétszerezzük, miáltal diploid kromoszómakészletű Brassica napus növényeket kapunk;

   g) az (f) lépésben kapott növényeket a Polima CMScitoplazmát tartalmazó 87102-es Brassica napus fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   h) a növényeket Polima CMS-citoplazmát tartalmazó Brassica napus növényekké regeneráljuk;

   • ·· · • · ·

   i) a (c) lépésben kapott növényeket a (h) lépésben kapott növényekkel keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   j) a növényeket Polima CMS-citoplazmát tartalmazó hímsteril Brassica napus növényekké regeneráljuk;

   k) a (j) lépésben kapott növényeket egy Brassica oleracea fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   l) a magokból eltávolítjuk az embriókat, és az embriókból Fi generációs növényeket regenerálunk, amelyek hímsterilek és CMS-citoplazmát tartalmaznak;

   m) az 1. lépésben kapott növényeket egy Brassica oleracea fajtával visszakeresztezzük, és összegyűjtjük a visszakeresztezésből származó magvakat;

   n) a magokból eltávolítjuk az embriókat, és az embriókból Fi generációs növényeket regenerálunk, amelyek hímsterilek és CMS-citoplazmát tartalmaznak;

   p) az (n) lépésben kapott növényeket Brassica oleracea fajtával visszakeresztezzük, és összegyűjtjük a visszakeresztezésből származó magvakat;

   q) a kapott magokból Polima” CMS-citoplazmát tartalmazó, hímsteril Brassica oleracea növényeket regenerálunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésekként a (q) lépésben kapott növényeket Brassica oleracea növénnyel keresztezzük; a keresztezés eredményeként kapott magokat összegyűjtjük; és a magokból ♦ · ., *· · ·♦ ·· · · · »· · • ··· · · ··· • · · · » · ··· ·· ···· ·· ·»

   Polima CMS-citoplazmát tartalmazó, hímsteril Brassica oleracea növényeket regenerálunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Brassica oleracea növényként karfiolt, kelbimbót, káposztát, kelkáposztát, karalábét vagy brokkolit alkalmazunk.
4. 4. Eljárás citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények előállítására, amelyek magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt hímsterilek, és Polima” CMSci toplazmát tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy

   a) az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hímsteril, Polima CMS-citoplazmát tartalmazó, magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt sterilen maradó Brassica oleracea növényből származó protoplasztot fúzionáltatunk; és

   b) a kapott allogén sejteket Polima citoplazmát tartalmazó, citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növényekké regeneráljuk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Brassica oleracea növényként karfiolt, kelbimbót, káposztát, kelkáposztát, karalábét vagy brokkolit alkalmazunk.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a Polima citoplazmát tartalmazó, citoplazmikus hímsterilitású, regenerált Brassica oleracea növényeket gazdasági szempontból kívánatos tulajdonságokat hordozó Brassica oleracea növényekkel keresztezzük.

   • · · · · »· · • ··♦ # » ·»· • · * · · · ··· ♦* ··♦· ·· ·

   - 41 7. Citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények, amelyek az 1. igénypont szerinti eljárással vannak előállítva; magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt sterilek; és Polima” CMS-citoplazmát tartalmaznak.

   8. Citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények, amelyek a 4. igénypont szerinti eljárással vannak előállítva; magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt sterilek; és Polima” CMS-citoplazmát tartalmaznak.

   9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti növények, amelyek a következő fajták lehetnek: karfiol, kelbimbó, káposzta, kelkáposzta, karalábé vagy brokkoli.

   A meghatalmazott:

   ♦ *· * *<

   • · · * · »· <

   • ··* · · ··· • · · · · · ··· ·< ·»·· «· ·♦

   - 38 SZABADALMI IGÉNYPONTOK (módosított)

   1. Eljárás citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények előállítására, amelyek magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt hímsterilek, és Polima CMScitoplazmát tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy

   a) a 87110-es Brassica campestris fajtát 87101-es Brassica oleracea fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   b) a magokból Brassica napus növényeket regenerálunk, amelyek haploíd kromoszómakészletet tartalmaznak;

   c) a (b) lépésben kapott növények kromoszómaszámát megkétszerezzük, miáltal diploid kromoszómakészletű Brassica napus növényeket kapunk;

   d) a 87118-as Brassica campestris fajtát 87101-es Brassica oleracea fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   e) a magokból Brassica napus növényeket regenerálunk, amelyek haploid kromoszómakészletet tartalmaznak;

   f) az (e) lépésben kapott növények kromoszómaszámát megkétszerezzük, miáltal diploid kromoszómakészletű Brassica napus növényeket kapunk;

   g) az (f) lépésben kapott növényeket a Polima CMScitoplazmát tartalmazó 87102-es Brassica napus fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   • ·- ♦· « ·♦ ·· » · 9 99 9 • ··· « · ··· • · · · 9 9

   999 99 ·«·· ·· 9 +

   - 39 h) a növényeket Polima CMS-citoplazmát tartalmazó Brassica napus növényekké regeneráljuk;

   i) a (c) lépésben kapott növényeket a (h) lépésben kapott növényekkel keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   j) a növényeket Polima CMS-citoplazmát tartalmazó hímsteril Brassica napus növényekké regeneráljuk;

   k) a (j) lépésben kapott növényeket egy Brassica oleracea fajtával keresztezzük, és összegyűjtjük a keresztezés eredményeként kapott magvakat;

   l) a magokból eltávolítjuk az embriókat, és az embriókból Fi generációs növényeket regenerálunk, amelyek hímsterilek és CMS-citoplazmát tartalmaznak;

   m) az 1. lépésben kapott növényeket egy Brassica oleracea fajtával visszakeresztezzük, és összegyűjtjük a visszakeresztezésből származó magvakat;

   n) a magokból eltávolítjuk az embriókat, és az embriókból Fi generációs növényeket regenerálunk, amelyek hímsterilek és CMS-citoplazmát tartalmaznak;

   o) az (n) lépésben kapott növényeket Brassica oleracea fajtával visszakeresztezzük, és Összegyűjtjük a visszakeresztezésből származó magvakat;

   p) a kapott magokból Polima CMS-citoplazmát tartalmazó, hímsteril Brassica oleracea növényeket regenerálunk.

   2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésekként a (q) lépésben kapott növényeket

   Brassica oleracea növénnyel keresztezzük; a keresztezés • ♦ ·· J «4.

   ·* · · « ·· * • *«« · ♦ ·»· • · · ♦ » · eredményeként kapott magokat összegyűjtjük; és a magokból Polima CMS-citoplazmát tartalmazó, hímsteril Brassica oleracea növényeket regenerálunk.

   3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Brassica oleracea növényként karfiolt, kelbimbót, káposztát, kelkáposztát, karalábét vagy brokkolit alkalmazunk.

   4. Eljárás citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények előállítására, amelyek magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt hímsterilek, és Polima CMScitoplazmát tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy

   a) az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hímsteril, Polima CMS-citoplazmát tartalmazó, magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt sterilen maradó Brassica oleracea növényből származó protoplasztot gazdasági szempontból kívánatos tulajdonságokat hordozó Brassica oleracea növényből származó protoplaszttal fúzionáltatunk, hogy allogén sejteket hozzunk létre; és

   b) a kapott allogén sejteket Polima citoplazmát tartalmazó, citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növényekké regeneráljuk.

   5. A 4. igénypont szerinti eljárás; azzal jellemezve, hogy Brassica oleracea növényként karfiolt, kelbimbót, káposztát, kelkáposztát, karalábét vagy brokkolit alkalmazunk.

   6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a Polima citoplazmát tartalmazó, citoplazmikus hímsterilitású, regenerált Brassica oleracea növényeket gazdasági szempontból kívánatos tulajdonságokat hordozó Brassica oleracea növényekkel keresztezzük.
7. 7. Citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények, amelyek az 1. igénypont szerinti eljárással vannak előállítva; magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt sterilek; és Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak.
8. 8. Citoplazmikus hímsterilitású Brassica oleracea növények, amelyek a 4. igénypont szerinti eljárással vannak előállítva; magas és alacsony hőmérsékleten egyaránt sterilek; és Polima CMS-citoplazmát tartalmaznak.
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti növények, amelyek a következő fajták lehetnek; karfiol, kelbimbó, káposzta, kelkáposzta, karalábé vagy brokkoli.
10. 10. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímsteril Brassica oleracea növényből' származó protoplasztként inaktivált sejtmagokat tartalmazó protoplasztot alkalmazunk.
11. 11. Magvak, amelyek a 7. igénypont szerinti növényből származnak.
12. 12. Magvak, amelyek a 8. igénypont szerinti növényből származnak.