TR201810215T4 - Si̇toplazmi̇k erkek steri̇l cichorium bi̇tki̇leri̇. - Google Patents

Si̇toplazmi̇k erkek steri̇l cichorium bi̇tki̇leri̇. Download PDF

Info

Publication number
TR201810215T4
TR201810215T4 TR2018/10215T TR201810215T TR201810215T4 TR 201810215 T4 TR201810215 T4 TR 201810215T4 TR 2018/10215 T TR2018/10215 T TR 2018/10215T TR 201810215 T TR201810215 T TR 201810215T TR 201810215 T4 TR201810215 T4 TR 201810215T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
cytoplasmic male
male sterile
plants
seq
cichorium
Prior art date
Application number
TR2018/10215T
Other languages
English (en)
Inventor
Rosalien De Jong Elizabeth
Dorien Haarsma Adriana
Van Cappellen Witte
Glas Cornelis
Anthonius Zutt Nicolaas
Johannes Maria Schrijver Albertus
Original Assignee
Bejo Zaden Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bejo Zaden Bv filed Critical Bejo Zaden Bv
Publication of TR201810215T4 publication Critical patent/TR201810215T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/021—Methods of breeding using interspecific crosses, i.e. interspecies crosses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/023—Male sterility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/02—Flowers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium bitkileri ve özellikle sitoplazmik erkek steril (CMS) yeşil hindiba bitkileri; sitoplazmik erkek steril (CMS) radiçi bitkileri; sitoplazmik erkek steril (CMS) kırmızı yapraklı hindiba bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) Treviso bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) beyaz hindiba bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) kelle şekeri bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) Belçika hindibası bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) yabani marul bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) Katalonya bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) C. intybus var. foliosum bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) C. endivia bitkileri ve sitoplazmik erkek steril (CMS) C. intybus L. var. sativum bitkileri ile ilgilidir. Mevcut buluş ayrıca, sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium bitkilerinin ve Cichorium bitkilerinde sitoplazmik erkek sterilitesini (CMS) sağlayan mitokondriyal nükleik asit dizilerinin tanımlanmasına yönelik yöntemler ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME SITOPLAZMIK ERKEK STERIL CICHORIUM BITKILERI Mevcut bulus, sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium bitkileri ve özellikle sitoplazmik erkek steril (CMS) yesil hindiba bitkileri; sitoplazmik erkek steril (CMS) radiçi bitkileri; sitoplazmik erkek steril (CMS) kirmizi yaprakli hindiba bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) Treviso bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) kelle sekeri bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) beyaz hindiba bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) Belçika hindibasi bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) yabani marul bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) Katalonya bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) endive bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) C. intybus var. foliosum bitkileri, sitoplazmik erkek steril (CMS) C. endivia bitkileri ve sitoplazmik erkek steril (CMS) C. intybus L. var. sati'vum bitkileri ile ilgilidir. Mevcut bulus ayrica, sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium bitkilerinin tanimlanmasina yönelik yöntemler ile ilgilidir.
Cichorium yesil hindiba, radiçi veya kirmizi yaprakli hindiba, Treviso, beyaz hindiba, kelle sekeri, Belçika hindibasi (yabani marul), Katalonya (tüm C. intybus var. fo/iosum), endive (C. endivia) olarak birkaç ayri islenmis formda temin edilmektedir, ancak kök hindiba (C. intybus L. var. sativum) da bilinmektedir. Sonraki, inülin, bira için aroma, kahve ikameleri gibi birkaç ürünün ve ayrica polimer üretimine yönelik substratlarin derive edildigi kazik köküne yönelik yetistirilmektedir.
Yabani marul baslangiçta kazik kökü için yetistirilmektedir, daha sonra bu iyi bilinen yabani marul, Belçika hindibasi veya hindiba üretmek için karanlikta turfanda yetistirilmektedir. Bu turfanda yetistirme hidroponik olarak veya klasik olarak yapilmaktadir.
Yaprakli yabani hindibalarin (Cichorium intybus var.foliosum) örnekleri, radiçi (renk renk kirmizi ve yesil yapraklara, bazen beyaz damarlara sahiptir), Treviso, Katalonya ve yesil göbekli hindibadir. Tüm hindiba varyeteleri için biraz aci bir tat tipiktir. Cichorieae'nin bir diger üyesi endive, Cichorium endivia'dir.
Cichoriae, digerlerinin yani sira ayçiçegi (He/ianthus), marul (Lactuca),Ca/endula, Aster ve Echinacea'nin dahil oldugu Asteraceae'nin (daha önce Compositae) bir parçasidir.
Ticari olarak temin edilebilir Cichorium tohumlarina (radiçi, Treviso ve digerleri gibi) yönelik teknigin bilinen durumu kullanilarak sertasyon ile melezler üretilmektedir.
Sertasyon, büyüme hizinda bir farklilik gösteren polen tüpleri arasinda bir yarisin oldugu botanik bir olaydir. Ayni bitkiye ait polen tüpleri (kendiliginden tozlasma), bir diger çapraz tozlasan bitkinin polen tüplerine göre stil açisindan daha yavas bir sekilde büyümektedir. Bu mekanizma, melezlemenin payini arttirmak üzere kullanilmaktadir ancak istenilen melezin safsizligi ile sonuçlanan kendiliginden fertilizasyon hariç tutulamamaktadir. Uygulamada, üretilen tohumun %30'a kadari kendiliginden fertilizasyonun ürünlerinden, diger bir deyisle melez bitkileri yerine dogal bitkilerden olusmaktadir.
Tohum temizleme yöntemlerinin kullanilmasi ile bu yüzde %10-20'ye düsürülebilmektedir, ancak halen istenmeyen bir sekilde yüksektir.
Bu sertasyonu kullanmanin ek bir kusuru, disi hattinin (sertasyona sahip) korunmasi sirasinda daha fazla polen elde eden ayri bitkilerin, birçok nesil sonrasinda potansiyel sertasyon kaybi, diger bir deyisle kullanissiz ata hatti ile sonuçlanan seklinde popülasyondaki genlerini daha etkili bir sekilde yaymasidir.
Ayrica sertasyon, tüm Cichorium hatlarinda bulunmamaktadir, dolayisiyla ticari olarak ilgi çekici melezleri üretmek üzere kombinasyon olasiliklarini azaltmaktadir.
Dolayisiyla, yukarida açiklanan formlarin tamaminda hindiba kültürüne yönelik yüksek oranda, tercihen büyük ölçüde %100 homojen F1 melezlerinin temin edilebilir olmasi avantajli olacaktir. Bu melez Cichorium varyeteleri, su anda yaygin temin edilebilir irklara göre birkaç avantaja sahiptir.
En önemli avantaj, bu tür bir F1 melezinin sunacagi üstün homojenlik, diger bir deyisle büyük ölçüde olarak tek seferde veya es zamanli olarak gerçeklestirilebilen bir hasadi saglamaktadir. Örnegin radiçi, ürünün yüksek sicakliklara ve uzun süre boyunca yogun gün isigina maruz kalmasindan dolayi renk açisindan daha az yogun hale gelmektedir. Bu ürünü es zamanli olarak hasat etme olasiligi yetistiren kisi için bir kayip azalmasi ile sonuçlanmaktadir.
Cichorium bitkisi, Cichorium bitkisinin genetik bilesimine, diger bir deyisle genomuna göre yüksek oranda veya büyük ölçüde %100 homojen oldugunda, tohumlarin bir üreticisi ve ürünün yetistiricisi için birkaç avantaji olmaktadir.
Bir yüksek oranda homojen Fl melezi saglanabildiginde, üretici temin edilebilir melezlerin daha genis bir araligi ile sonuçlanan sekilde ata hatlarinin daha fazla kombinasyonunun kullanilabilmesi avantajina sahiptir.
Mevcut olarak, ön çimlendirme ve benzeri olarak tohum islemi veya tohum seçimi, tohumdaki homojenligin çok düsük olmasindan dolayi az kullanilmaktadir. Istenilen yüksek oranda homojen melezin yüksek kalitede tohumlari temin edilebilir oldugunda ön çimlendirme ve tohumlarin diger tohum-teknolojik islemleri gibi süreçler kullanisli hale gelmektedir.
Yetistirici için, bir yüksek oranda homojen melezin avantajlari sözde cansiz türler olmadan bir oldukça homojen üründen olusan toplam ürünün hasta edilmesi ve islenmesine yönelik kisa bir periyottur. Bu nedenle, ürünü hasat etmek ve bunu satisa hazirlamak üzere daha az emek gerekmektedir.
Bir yüksek oranda veya büyük ölçüde %100 homojen melez, örnegin radiçi göz önüne alindiginda özellikle renk için tutarli bir kaliteye sahiptir. Pazarda temin edilebilir varyeteler bu tutarli kaliteyi garanti edememektedir.
Son olarak, yüksek oranda homojen F1 melezlerinin tohumlarin daha iyi ortaya çikisini gösterecegi belirtilebilmektedir.
Cichorium endivia (endive) için, teknigin bilinen durumu ile melezlerin üretimi imkansizdir; sertasyon olan bir mekanizma endivede bulunmamaktadir. Bu nedenle endive %100 kendiliginden tozlasan üründür, yüksek seviyede homojenlik göstermesine ragmen zayif bir heteroza sahiptir.
Yukarida belirtilen noktalari gelistirmek amaciyla Cichorium'da melezlemeye yönelik diger yöntemler gelistirmek için daha fazla arastirma gerçeklestirilmektedir. Yöntemlerden biri Enza Zaden (NL açiklanmaktadir, burada ayçiçeginden (Helianthus annuus) bir sitoplazmik faktör hücre füzyonu ile Cichorium türlerine uygulanmaktadir. Bu ise, sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium islak materyali yapilmaktadir, burada ayçiçeginden CMS Lactuca sativa olan marula aktarilmaktadir. açiklanmaktadir, burada bir resesif veya genetik olarak çekirdek kodlanmis erkek sterilitesi, mutajenez ile Cichorium'da indüklenmektedir. Bu sistem ile üretilen F1 melezleri, açiklanan özelligin resesif karakterinden dolayi erkek fertildir. Bu sistemin bir diger kusuru, erkek steril ana hatlarin (ms/ms olarak belirtilmektedir), in vitro veya in vivo yöntemler ile vejetatif olarak yayilmasinin gerekmesidir.
Yukaridakiler göz önüne alindiginda, diger amaçlarin yani sira mevcut bulusun bir amaci, önceki teknigin yukaridaki kusurlarinin üstesinden gelen sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri saglamaktir.
Diger amaçlarin yani sira yukaridaki amaç, ekli istemlerde açiklanan bitkilerin saglanmasi ile mevcut bulus tarafindan karsilanmistir.
Spesifik olarak, diger amaçlarin yani sira yukaridaki amaç, bir birinci açiya göre Lactuca mitokondrisi içeren sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri ile mevcut bulus tarafindan karsilanmistir, burada söz konusu Lactuca mitokondrisi, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No.
, SEQ ID No. 6, SEQ lD No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 ve SEO ID No.10'dan olusan gruptan seçilen en az bir mitokondriyal nükleik asit dizisini içermektedir ve burada söz konusu Cichorium bitkisi, NCIMB 42125 tevdisine göre bir bitkiden maternal olarak derive edilen bir sitoplazmayi içermektedir.
Cichori'um'a sitoplazmik erkek sterilitesi (CMS) uygulamasina yönelik uygun bir donör olarak görev görebilen bitki türlerini tanimlamak üzere bir arastirma programi baslatilmistir. Bu baglamda "uygun" ayni zamanda önceki teknigin dezavantajlarinin üstesinden gelindigini ifade etmektedir.
Lactuca sp. olan marulda hiçbir CMS bulunmamaktadir. Lactuca ve Cichori'um, Asteracecie familyasina ve bu familya içerisinde sirasiyla Cichorieae veya Lactuceae oymagina aittir.
Lactuca ve Cichorium kombinasyonu, Cichorium çekirdeklerinin Lactuca sitoplazmasi ile bir kombinasyonunun bir sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium ile sonuçlanip sonuçlanmayacagini belirlemek üzere çalisilmistir.
Lactuca sp. olan marulda hiçbir CMS bulunmamaktadir. Lactuca, her ikisi de Asteraceae familyasina ve bu familya içerisinde sirasiyla Cichorieae veya Lactuceae oymagina ait olan Cichorium ile ilgilidir; bu nedenle bu bitki, Cichorium ile melezlere ve asimetrik hücre füzyonlarina yönelik bir aday olarak seçilmistir.
Yukarida bahsedilen Lactuca ile Cichorium kombinasyonu, Cichorium çekirdeklerinin Lactuca sitoplazmasi ile bir kombinasyonunun bir sitoplazmik erkek steril (CMS) Cichorium ile sonuçlanip sonuçlanmayacagini belirlemek üzere çalisilmistir. Bu arastirma, baslangiç arastirmasinin Cichorium ile Lactuca melezlemesinin - sinirli - miktarda tohum ile sonuçlandigini ögretmesinden dolayi özellikle birkaç Lactuca türüne yönelik amaçlanmistir. Bu tohumlardan yetistirilen bitkiler, moleküler çalismalar ve akis sitometrisi ile melez olarak kabul edilmistir.
Cichorium ve Lactuca arasindaki melezin elde edilmesinin ardindan, Cichorium'un genetik yapisini geri kazanmak üzere birkaç melezleme gerçeklestirmek gerekli olacaktir. Cichorium gibi bir ürün ile, melezlerin ürünündeki bu türün tam genomunu yeniden olusturmak en az 8 yil alacaktir. Bundan sonra ayri türler arasindaki bir melez, özellikle ilk nesillerde oldukça verimsizdir, yani elde edilen tohumlarin miktari baslangiçta oldukça sinirli olacaktir.
Birkaç nesil sonra Lactuca genomunun miktari yeterli bir sekilde seyreltilmektedir, ancak kendiliginden tozlasma ile olusturulan bir dogal neslin, melez üretimine yönelik genetik olarak stabil aday ata hattini seçmesi gerekmektedir. Ancak, bu materyalin erkek steril olmasindan dolayi bu son kendiliginden tozlasma adimi imkansizdir.
Yukarida bahsedilen kusurlara yönelik bir çözüm saglamak üzere Bejo Zaden B.V., Cichorium türü ve Lactuca sp. arasinda asimetrik hücre füzyonlari gerçeklestirmistir.
Kisaca, her iki türden protoplastlar izole edilmistir. Cichorium'dan{alici) protoplastlar, sitoplazma inaktivasyonuna yönelik iyodoasetamid (IOA) veya iyodoasetat (IA) ile islenmistir. Lactuca sp. (donör) protoplastlari, çekirdek genomunu inaktive etmek veya yok etmek için iyonize edici radyasyon ile islenmistir, ancak sitoplazmadaki aktif genetik elementler (kloroplastlar ve mitokondri) korunmustur.
Bir PEG/Cal*aracili hücre füzyonunun ardindan, Cichorium'un çekirdek genomuna, ancak Lactuca sitoplazmasina sahip bir veya birkaç yeni hücre olusturulmaktadir. Bu füzyon, test tüplerinde veya petri kaplarinda gerçeklestirilebilmektedir. Burada PEG, hücrelerin birlesmesini arttirmak üzere bir araç olarak görev görmektedir; hücrelerin gerçek füzyonuna yönelik yüksek bir pH ve Ca2+ iyonlari bir ön gereksinimdir. Bir FDA boyama prosedürü, ortaya çikan hücrelerin canli olmasini saglamak üzere kullanilmaktadir.
Su, tuzlar, vitaminler, sekerler ve bitki hormonlarini içeren uygun bir ortam, kalluslarin olusumunu arttirmak üzere kullanilmistir. Daha sonra, bitkilerin rejenerasyonu, nihai olarak köklenen sürgünlerin ortaya çikisini arttirarak gerçeklestirilmistir; ayrica bu asamalar, uygun bitki hormonlarinin uygulanmasina baglidir.
Rejenerasyonun ardindan, elde edilen bitkiler akis sitometrisi kullanilarak dogru bir DNA içerigine yönelik denetlenmistir. Bu denetlemeden ortaya çikan diploid bitkiler, daha sonra Lactuca sitoplazmasinin varligini saglamak üzere bir moleküler teste tabi tutulmustur. Bu amaçla, Cichorium ve Lactucci sitoplazmasi arasinda ayrim yapmak üzere bir RAMP teknigi kullanilmistir.
Lactuca sitoplazmasi ile kombine edilen Cichorium çekirdek materyalini içeren bitkiler üzerindeki daha fazla arastirma, rejenere olan füzyon bitkileri arasinda disi fertilitesini korurken erkek steril olan ayri bitkilerin, diger bir deyisle mevcut bulusa göre bitkilerin meydana geldigini göstermistir. Bu bitkilerin tanimlanma sikligi 21 orijinal füzyon bitkisinde yaklasik 1'dir.
Elde edilen bitki, anterler üzerinde görünür polen taneciklerine sahip çiçeklere sahiptir, ancak bunlar dogal tip polen taneciklerinden daha küçüktür ve bir FDA boyama teknigi kullanilarak melez bitkinin poleninin canli olmadigi gösterilmistir. Buna göre F1 melez bitkileri erkek sterildir. Dolayisiyla, yukaridaki füzyon bitkilerinden Cichorium'un %100 saf melezlerini üretmek üzere uygun olan mevcut Cichorium bitkileri elde edilmektedir.
NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, BK'de tevdi edilmistir.
Bu birinci açinin tercih edilen bir düzenlemesine göre mevcut bulus, sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri ile ilgilidir, burada sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri ayrica, SEQ ID No. 31 ve SEQ ID No. 32 kullanilarak 1592 bp'lik bir moleküler markör ile tanimlanabilmektedir.
Bu birinci açinin tercih edilen bir diger düzenlemesine göre mevcut bulus, sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri ile ilgilidir, burada sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri ayrica, SEQ ID No. 33 ve SEQ ID No. 34 kullanilarak 293 bp'lik bir moleküler markör ile tanimlanabilmektedir. Özellikle tercih edilen bir düzenlemeye göre mevut bulus, en az iki, en az üç, en az dört, en az bes, en az alti, en az yedi, en az sekiz, en az dokuz veya on mevcut mitokondriyal nükleik asit dizisine sahip sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkileri ile ilgilidir.
Mevcut bulusa göre bitkiler, tercihen yesil hindiba, radiçi, kirmizi yaprakli hindiba, Treviso, beyaz hindiba, kelle sekeri, Belçika hindibasi, yabani marul, Katalonya, C. intybus var. foliosum, C. endivi'a ve C. intybus L. var. Sat/'vum'dan olusan gruptan seçilmektedir.
Bir ikinci açiya göre mevcut bulus, bir sitoplazmik erkek steril Cichori'um bitkisinin tanimlanmasina yönelik yöntemler ile ilgilidir, yöntem söz konusu sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin bir numunesinde mevcut mitokondriyal dizilerden, diger bir deyisle SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEO` ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 ve SEQ ID No. 10'dan olusan gruptan seçilen nükleik asit dizilerinden biri veya birkaçinin belirlenmesini içermektedir.
Bir üçüncü açiya göre mevcut bulus, bir sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin tanimlanmasina yönelik yöntemler ile ilgilidir, yöntem söz konusu sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin bir numunesinde nükleik asit amplifikasyon primerleri SEQ lD No. 31 ve SEQ ID No. 32 kullanilarak 1592 bp'lik bir moleküler markörün ve nükleik asit amplifikasyon markörleri SEQ lD No. 33 ve SEQ ID No. 34 kullanilarak 293 bp'lik bir moleküler markörün belirlenmesini içermektedir. lD No. 15, SEO` ID No. 16 ve SEQ ID No. 17'den olusan gruptan seçilen mitokondriyal nükleik asit dizileri açiklanmaktadir.
Cichori'um ve Lactuca'nin sitoplazmik erkek steril melez bitkileri açiklanmaktadir, burada sitoplazmik erkek steril melez bitkileri, Lactuca mitokondrisini içermektedir ve söz konusu mitokondri SEQ ID No.
SEQ ID No. 9 ve SEQ ID No. 10'dan olusan gruptan seçilen en az bir mitokondriyal nükleik asit dizisini içermektedir.
Sitoplazmik erkek steril melez bitkileri ve NCIMB 42125 tevdisine göre bir sitoplazmik erkek steril melez bitki açiklanmaktadir ve bu, NCIMB 41985 tevdisine göre bir Lactuca bitkisinden derive edilen mitokondriyi içermektedir.
Bir sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi elde edilmesine yönelik bir Lactuca bitkisinin mitokondrisinin kullanimi açiklanmaktadir, mevcut kullanim tercihen donör olarak Lactuca'nin bir protoplastinin ve alici olarak Cichorium'un bir mitokondriyal genom inaktive edilmis protoplastinin bir protoplast füzyonunu içermektedir.
Asagida mevcut bulus, mevcut bulusun tercih edilen düzenlemelerinin örneklerinde daha fazla açiklanacaktir. Örneklerde sekillere referans yapilmaktadir, burada: Sekil 1: (A) Cichori'um intybus L. (sol üst); (B) Lactuca sp. (sag üst); (C) Melez 1 (mevcut bulusa göre; sol alt),' ve (D) A, B ve C'nin bir karisik numunesinin (sag alt) akis sitogramlarini göstermektedir; Sekil 2: RAMP teknigi kullanilarak çekirdek DNA'sinin bir moleküler karakterizasyonunun sonucunu göstermektedir. Sol seritten sag seride Cichorium intybus (P155); Lactuca sp. (P157); melezler 1 ila 3 (H1-H3, diger bir deyisle P155 ve P157 arasindaki bir melezlemenin melez bitkileri; ayirt edici bantlar belirtilmektedir; Sekil 3: Cichorium, Lactuca ve seçilen füzyon bitkisi P153'ün polen boyutunun bir grafik temsilini göstermektedir. Bu grafige yönelik açiklama: - X ekseni: polen taneciklerinin um2 cinsinden çapi 0 Y ekseni: ayri boyutlarda bulunan polen taneciklerinin yüzdesi; Sekil 4: ÜSTTE: elde edilen açiklanan füzyon ürünlerinden seçilen bir bitkinin bir çiçeginin fotografini; ALTTA: polen taneciklerini gösteren (fonksiyonel olmayan) anterlerin detayini göstermektedir, Sekil 5: ÜSTTE: Cichorium intybus L'nin bir fertil çiçeginin fotografini; ALTTA: anterlerin detayini göstermektedir. ÖRNEKLER Örnek 1. Tohumlarin sterilizasyonu ve eki/mesi Donörclen (Lactuca sp., NCIMB 41985 tevdisi olarak NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, BK'de 1 Haziran 2012'de tevdi edilmistir ve alicidan (Cichorium i'ntybus L.) tohumlar in vitro ekilmistir. Bu amaçla her bir türden 100 tohum, su içinde %70 etanol içinde durulama ile sterilize edilmistir ve daha sonra bir beyazlatma solüsyonu (demineralize su içinde %1 (w/v) NaOCI + %0.01 (v/v) Tween80 ile isleme tabi tutulmustur. Sterilize demineralize su içinde tam bir durulamanin ardindan tohumlar, 1/zMSlS olarak uygun bir ortama yerlestirilmistir ve 25°C'de ve 16/24 saat isikta bir büyüme odasina yerlestirilmistir. 2 hafta sonra bitkiler, protoplast izolasyonuna yönelik uygun hale gelmistir. Örnek 2. Protoplastlarm izolasyonu 4 haftalik bitkilerin genç, yüzeyi sterilize edilmis yapraklari toplanmistir. Bu yapraklar, plazmoliz solüsyonu WS9M içinde TC kalitesinde petri kaplari (Greiner Bio-One, ürün 664160) içinde 1 - 2 mm'lik parçalara kesilmistir. Tüm materyalin toplanmasinin ardindan bu solüsyon, pektinaz ve/veya selülaz gibi hücre duvari degrade edici enzimler içeren 20 ml enzim solüsyonu ile degistirilmistir. 30 rpm'lik bir hiza sahip bir orbital çalkalayici üzerinde bir gece inkübasyonun (karanlik, 25°C) ardindan materyal, sirasiyla bir 110 ve bir 53 um filtre üzerinde elenmistir; bu filtratlar 10 ml yikama solüsyonu ile iki kez durulanmistir.
Toplanan filtrat, 60 x 9'de 5 dakika santrifüjlenmistir. Pelletin 10 ml yikama solüsyonunda resü5panse edilmesinin ardindan bu santrifüjleme adimi tekrarlanmistir. Protoplastlar daha fazla isleninceye kadar buz üzerinde tutulmustur. Örnek 3. Viyabilite kontrolü Izole edilmis protoplastlarin ve polen taneciklerinin viyabilitesine yönelik bir denetim FDA ile gerçeklestirilmistir. Bu amaçla, donör ve alicidan boyanmis protoplastlarin veya donör veya seçilen füzyon bitkilerinden toplanan polen taneciklerinin numuneleri uygun filtreler, 10X büyütme kullanilarak bir floresans-mikroskop ile denetlenmistir.
Canli hücreler bir parlak sari-yesil renk ile taninabilmektedir, canli olmayan hücreler parlamamaktadir. Örnek 4. Izole edilmis protoplastlarin ön islemi Donörden (Lactuca) izole edilen protoplastlar, uygun bir iyonize edici radyasyon kaynagi (örnegin bir Röntgen veya gama radyasyonu kaynagi) ile islenmistir. Uygun bir doz, absorbe edilen enerjinin bir ölçümü olarak 250 - 500 Gray araligindadir. Alicidan (Cichorium intybus var.fo/iosum) izole edilen protoplastlardan hücresel organeller, 4°C'de 10 dakika boyunca 10 mM'Iik bir nihai konsantrasyonda lOA (bir 60 mM IOA stok solüsyonundan temin edilmistir) ile inaktive edilmistir. Bu islemin ardindan hücreler, yikama solüsyonu ile iki kez yikanmistir ve 5 dakika boyunca 60 x g'de santrifüjlenmistir.
Elde edilen protoplastlarin füzyonu ve ardisik rejenerasyonu, sirasiyla örnek 5 ve Sa'da (sivi ortamda kültür) ve 5 ve 6b'de (sodyum aljinat kullanilarak kati ortama gömülmüstür) açiklandigi üzere iki alternatif sekilde gerçeklestirilebilmektedir. Örnek 5. Protoplastlarin füzyonu Yikama solüsyonuna 10 ml tüp (yuvarlak tabanli, Greiner, katalog numarasi 163189) 1 x 106 protoplast (1:1 veya 2:1 olan alicirdonör oraninda) eklenmistir.
Santrifüjlemenin (60*g'de 5 dakika) ardindan her bir pellet, 0.3 ml yikama solüsyonu içinde resüspanse edilmistir. Daha sonra, test tüpü basina 0.4 ml PEG1500 solüsyonu, ayri damlalarin tüpler içine düsmesine izin verilerek eklenmistir; burada daha fazla karistirmaya izin verilmemistir. 30 dakika sabit bekletmenin ardindan 0.8 ml PEG seyreltici solüsyon, test tüpü duvarina yavas bir sekilde akitilarak eklenmistir. Daha fazla karistirma olmadan hücreler 10 dakika birakilmistir.
Bunun ardindan tüpler, CPW-Ca” solüsyonu ile 10 ml'lik bir nihai hacme doldurulmustur, daha fazla karistirma olmadan hücreler 60*g'de 5 dakika santrifüjlenmistir. CPW-Ca++ solüsyonu ile üç ardisik yikamanin ardindan pelletler, 20.000 protoplast/ml'lik bir nihai yogunluk saglayan PM1 kültür ortaminda resüspanse edilmistir. Örnek 6.Kaynasik protoplastlarm kültürü Örnek 60 sivi rejenerasyon ortamlarinm kullanilmasi: Kültürleme 25°C'de karanlikta gerçeklestirilmistir, her hafta kültür ortami kismen degistirilmektedir. - 6 cm kap: 3 ml (4.5 ml içinden) 3 ml taze PM1 ortami ile degistirilmektedir o 9 cm kap: 5 ml (9 ml içinden) 5 ml taze PM1 ortami ile degistirilmektedir Hücre bölünmeleri gözlenir gözlenmez (2 ila 4 hücre asamasi) kültür ortami PM2 ortami ile degistirilmistir, ayrica bu ortam yukarida açiklandigi üzere haftalik bazda kismen degistirilmektedir. 2 mm çapindaki kalluslar 1000 Iükste kati CRM ortami üzerine yerlestirilmistir. Kalluslar yesile döner dönmez isik miktari yaklasik olarak 1700 Iükse yükseltilmistir. Sürgün içermeyen kalluslar üç haftada bir taze CRM ortamina aktarilmistir.
Ortaya çikan sürgünler, geride mümkün oldugu kadar kallus birakilarak kallustan kesilmistir ve kavanozlardaki veya petri kaplarindaki MS30-gelrite ortami üzerine yerlestirilmistir. Köklenmesi arttirmak üzere sürgünler, herhangi bir kalinti kallusu gidermek üzere kesilmistir ve taze MS30-gelrite ortamina aktarilmistir. Örnek 5'te açiklandigi üzere kaynasik protoplastlardan baslayarak protoplastlar, her bir tüpü 1 x 106 protoplast içeren solüsyon A içinde resüspanse edilmistir. Her bir tüpe, 2.5 ml solüsyon A eklenmistir; hücrelerin dikkatli bir sekilde resü5panse edilmesinin ardindan 2.5 ml sodyum aljinat solüsyonu eklenmistir. 1 ml süspansiyon damlalari kati ortam B üzerine yerlestirilmistir. 1 saat sonra protoplastlari içeren katilasmis ortam, PM1 ortami ile durulanmistir ve 3 ve 6 ml PM1 ortami içeren kaplara (sirasiyla 6 veya 9 cm çapinda petri kaplari) aktarilmistir. Diger ortam degisiklikleri örnek 6a'da açiklanana benzerdir.
Kalluslar 2 mm2lik bir çapa ulasir ulasmaz aljinat matriksi, kültür ortaminin 50 mM sodyum sitrat solüsyonu ile degistirilmesi ile çözünmüstür. Her bir aljinat diski 8 parçaya kesilmistir ve kaplar 2 saat (30 rpm) boyunca bir orbital çalkalayici üzerine yerlestirilmistir.
Mikro kalluslar, bir pipet kullanilarak toplanmistir ve bir test tüpüne aktarilmistir. Bu tüpe, 10 mI'Iik bir nihai hacme PMZ ortami eklenmistir ve daha sonra tüp 60*g'de 5 dakika santrifüjlenmistir.
PMZ ortaminin iki kez yikanmasinin ardindan kalluslar, 1000 Iükste CRM ortami üzerine yerlestirilmistir; yesile dönen kalluslar 1700 Iükste daha fazla büyütülmüstür. Kalluslar bu ortamda tutulmustur ve gerekli olmasi durumunda üç haftada bir taze CRM ortamina aktarilmistir.
Bu kalluslar üzerinde ortaya çikan sürgünler, kallustan kesilmistir ve petri kaplarindaki veya cam kavanozlardaki MS30-gelrite ortami üzerine yerlestirilmistir; sürgünler kökler olusuncaya kadar ayni bilesimdeki taze ortama aktarilmistir. Köklenmis bitkiler M530 ortamina yerlestirilmistir. Örnek 7. Ploid seviyesinin belirlenmesi Cichorium ve Lactuca bitkileri arasindaki hücre füzyonu veya melezlemelerden kaynaklanan bitkilerden ilgili ploid seviyesi belirlenmistir. Bu amaçla, 1 cmz'lik küçük bir yaprak dokusu parçasi incelenen bitkilerden alinmistir ve CyStain® UV Ploid tamponunda (Partec, Münster, Almanya) birjilet ile dogranmistir.
Filtrasyonun ardindan numunenin ploid seviyesi, bir Partec PA akis sitometresi kullanilarak belirlenmistir ve Cichorium ve Lactuca bitkilerinden numunelerin sonucu ile karsilastirilmistir.
Yalnizca hücre füzyonundan kaynaklanan diploid bitkileri korunmustur.
Cichorium ve Lactuca sp.arasindaki melezlerden kaynaklanan bitkiler Cichorium ve Lactuca sp. arasinda orta bir ploid seviyesine sahiptir (Sekil 1). Örnek 8. Genomik DNA'nin moleküler karakterizasyonu Cichorium (ID = P155) ve Lactuca (ID = P157) arasindaki melezlemeden kaynaklanan birkaç tohum hasat edilmistir, bunlar içinden üç çimlenmis tohum, örnek 7'de açiklandigi gibi analiz edilmistir ve melez bitkiler olarak tanimlanmistir. Bu bitkileri daha fazla karakterize etmek üzere bir moleküler analiz gerçeklestirilmistir.
Bu varsayilan melez bitkilerden ve her iki atadan, ± 0.3 cmZ'Iik yaprak eksplantlarindan baslayarak bir standart izolasyon prosedürü takip edilerek DNA izole edilmistir.
Bu izole edilmis DNA üzerinde, Cichorium ve Lactuca arasindaki polimorfizmleri olusturan iki primer ile bir RAMP analizi gerçeklestirilmistir. Sonuç, tartismasiz bir biçimde melez bitkinin her iki atanin genomik DNA'sini içerdigini göstermistir, dolayisiyla bu bitkinin aslinda Cichorium ve Lactuca arasindaki bir genomik melez oldugunu göstermistir.
Bu reaksiyona yönelik kullanilan primerler sunlardir: PCR kosullari: 2 dakika 93 °C dakika 72 °C lsitma 0.3°C/saniye olarak gerçeklestirilmistir. Örnek 9. Poliakri'lamid jel elektroforezi RAMP modellerini analiz etmek üzere bir “Gene ReadIR kullanilmistir. %65 akrilamidlik bir optimum konsantrasyona bagli olarak boyut olarak 1 baz çifti farklilik gösteren DNA parçalari ayrilabilmektedir. Bu parçalari tahmin etmek üzere etiketlenmis (lRDye etiketleri) primerler kullanilmistir, ileri primerin miktarinin üçte biri bir etiketlenmis, özdes primer ile degistirilmistir.
Sonuç, tartismasiz bir sekilde elde edilen bitkilerin her iki atanin genomik DNA'sini içerdigini göstermistir, dolayisiyla bu üç bitkinin (H1 ila H3) aslinda Cichorium ve Lactuca arasindaki melezler oldugunu göstermistir (Sekil 2). Örnek 10. Seçilen füzyon bitkisinin mitokondriyal DNA 'sinin karakterizasyonu Mitokondriyal DNA, Cichoriumsitoplazmasinin aslinda Lactucasitoplazmasi ile degistirildigini göstermek üzere karakterize edilmistir.
Kullanilan tamponlar aslinda açiklandigi gibidir. Ancak bazi tamponlar, "Solüsyonlar ve kimyasallar" bölümünde belirtildigi üzere ayarlanmistir. Tüm deney adimlari, aksi belirtilmedikçe önceden sogutulmus tamponlar ile ve 4°C'^de gerçeklestirilmistir. 100 gram taze yaprak, 250 ml GB tamponunda bir karistirici ile buz üzerine homojenize edilmistir.
Homojenat, 4 tülbent katmani ve 2 naylon mes katmani (75 um) üzerinde vakum ile filtrelenmistir.
Kalinti, bir önceden sogutulmus havan ve tokmak kullanilarak daha fazla homojenize edilmistir ve daha sonra açiklandigi gibi filtrelenmistir. santrifüjlenmistir. Son olarak mitokondri, 16.000 xg'de santrifüjleme ile toplanmistir. Ortaya çikan pellet, 10 ml DNAz saklama tamponunda bir boya firçasi kullanilarak resüspanse edilmistir. 2.000 x g'de santrifüjlemenin ardindan ortaya çikan üst faz, bir santrifüj tüpüne pipetlenmistir; 50 pl ZM MgCIz ve 200 pl 5 mg/ml DNAz eklenmistir. Bir saat inkübasyonun ardindan 20 ml raf tamponu bu karisim altinda pipetlenmistir. 14.000 xg'de santrifüjlemenin ardindan ortaya çikan pelet, 10 ml raf tamponu içinde resüspanse çözünmüstür ve bir 1.5 ml Eppendorf test tüpüne aktarilmistir. Mitokondriyal DNA içeren bu Iizat içinde 1 mg proteinaz K çözünmüstür ve 10 ul RNAz-A solüsyonu eklenmistir. Inkübasyon ilk olarak 37°C'de 60 dakikadir ve akabinde 65°C'de 30 dakika inkübasyondur.
Bu inkübasyonun ardindan DNA, 200 pl 5 M KAc eklenmesi ile çöktürülmüstür ve test tüpünün ters döndürülmesi ile karistirilmistir ve bu, buz üzerinde maksimum 15 dakika birakilmistir. Daha sonra oda sicakliginda 20.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme yapilmistir. Son olarak DNA, fenoI/kloroform/izoamilalkol ve kloroform/izoamilalkol ile ekstrakte edilmistir. Geriye kalan su fazi 400 ul izopropanol ve 27 (il 7.5 M amonyumasetat ile karistirilmistir. etanol ile yikanmistir ve 20.000 x g'de (20°C) 2 dakika yeniden santrifüjlenmistir. Kurutmanin ardindan ortaya çikan DNA, 200 pl TE tamponu içinde çözünmüstür.
Bir ikinci DNA çöktürmesi, 20 (il 7.5 M Na-Asetat ve 150 pl izopropanol eklenmesi ile gerçeklestirilmistir, karisim birkaç saniye boyunca nazik bir sekilde karistirilmistir. yikanmistir ve kisaca (20.000 x g'de (20°C) 2 dakika) yeniden santrifüjlenmistir. Pellet kurutulmustur ve 22 (il steril, ultra saf su içinde çözünmüstür. Saklama 4°C'dedir.
DNA'nin safligi ve konsantrasyonu, bir Nanodrop 2000 Spektrofotometre, bir Qubit 2.0 Florometre ve standart agaroz jel elektroforezi teknikleri kullanilarak belirlenmistir.
Izole edilmis mitokondriyal DNA'nin dizisi, teknikte uzman kisilerce genel olarak bilinen dizileme teknikleri kullanilarak Sonraki Nesil Dizileme ile belirlenmistir.
Bu dizileme, seçilen CMS Ci'chorium bitkisinin mitokondriyal DNA'sinin orijinal fertil Cichorium bitkisi ve Lactuca donörünün mtDNA'sinin bir yeniden düzenlemesi oldugunu kanitlayarak seçilen CMS Cichori'um bitkisinin mitokondriyal DNA'sinin (mtDNA) orijinal fertil Cichori'um bitkisi veya Lactuca donörüne esit oldugu birkaç bölgenin tanimlanmasi ile sonuçlanmistir, Bu amaçla, CMS fenotipine neden olan seçilen füzyon bitkisinin essiz, yeniden düzenlenen mtDNA'sini tanimlamak üzere PCR primerlerinin 4 kümesi gelistirilmistir. Ayrica, seçilen füzyon ürününün bir diger karakterizasyonu olarak 17 SNP'Iik bir küme gelistirilmistir (Tablo 2). Bu veriden, seçilen CMS Cichorium bitkisinin açiklanan bitkinin CMS karakterinden sorumlu olan her iki ata hattin parçalarina sahip bir benzersiz, yeniden düzenlenmis mitokondriyal DNA içerdigi sonucu çikarilmistir.
Deney detaylari, yukarida bahsedilen tablolarda gösterilmektedir.
Tablo 1. Füzyon atalari ve seçilen CMS Cichorium arasinda ayrim yapan PCR reaksiyonlar/na yönelik Primer Ileri Geri Lactuca Fertil Cichori'um CMS Cichorium Parça kombinasyonu primer primer boyutu SEQ ID 33: TCGATATFCTTTTCGCGACAGG Bu reaksiyona yönelik PCR kosullari asagidaki gibidir: toplam DNA açiklandigi gibi genç yaprak dokusundan izole edilmistir ve RNAzA/Tl ile islenmistir. DNA bütünlügü agaroz jel elektroforezi ile dogrulanmistir. Tüm numunelerde DNA, PCR reaksiyonlarina yönelik 15 ng/iil'ye seyreltilmistir. Kalip DNA miktari PCR reaksiyonu basina 15 ng'dir. Her iki markör kombinasyonuna yönelik PCR, yukarida bahsedilen her bir primerden 10 pmol ile 20 pl reaksiyonlarda Biomix Red (GC Biotech) kullanilarak gerçeklestirilmistir. PCR parametreleri su sekildedir: 1 dakika 94 °C dakika 72 °C 4 “C'de saklama.
Bes ul PCR reaksiyonlari, bir %1 agaroz jel üzerine yüklenmistir ve teknikte uzman kisilerce bilinen standart teknikler kullanilarak ayrilmistir.
Tablo 2: Her iki füzyon atasi ve seçilen füzyon bitkisi arasinda ayrim yapmak Üzere gelistirilen 17 SNP markörünün dizisi. Kullanilan diziler belirti/mektedir ve kösebentler ([ N/ NJ) arasinda bu dizinin üç sütun saginda açiklanan bitkiler arasinda farklilik gösteren tekli nükleotid bulunmaktadir. Analiz LGC Genomics tarafindan gerçeklestirilmisti'r, bakiniz www.lgcgenomics.com.
SNP Fertil Cicho CMS Cic Dizi Lactuca SEQ ID rium horium CTCTTAAGGTTAGTTCTATGCCTCACAACAACTACCTCATAG CTI'l'CCG GAAATGTTAAA GTCCGATCGTCGCTAGAGGCCCGTCGACTATAATACACTGT CATACGCTAAAATITGTCCCTTTTTAATGCATITACCCCGCT AGATAAAAATAACAAGGAATAGAATTTGATTAGTTGGTAT Örnek 11. Polen taneciklerinin karakterizasyonu Orijinal fertil hindiba bitkisi ve seçilen füzyon bitkisi arasindaki farkli göstermek üzere mevcut polen taneciklerinden bir çalisma yapilmistir. Seçilen füzyon bitkisi P153'ün çalisilmasi ile varsayilan polen tanecikleri görünürdür; ancak hem denenen kendiliginden fertilizasyon ve FDA'Ii bir leke (Örnek 3) bu varsayilan polenin fonksiyonel olmadigini göstermistir.
Cichori'um ve seçilen füzyon bitkisinin poleninin daha fazla test edilmesi, sonraki polen taneciklerinin önemli ölçüde daha küçük oldugunu ögretmistir. WSQM içinde süspanse edilen polen tanecikleri, bir 10x objektif lens ile bir ters çevrilmis mikroskop üzerinde düzenli parlak alan teknikleri kullanilarak görüntülenmistir ve bir 3 MB CCD kamera ile kaydedilmistir. Polen taneciklerinin dijital görüntüleri islenmistir ve ImageJ yazilimi (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, ABD, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012) kullanilarak analiz edilmistir.
Görüntüler, 8-bit ikili görüntülere dönüstürülmüstür. Delikler kapatilmistir, koyu renk aykiri degerler çikarilmistir (çap = 10 piksel) ve birbirine dokunan polen tanecigi çikintilari ”bosaltma” komutu kullanilarak ayrilmistir. Ortaya çikan görüntüler, polen tanecigi çikintilarinin yüzey alanlarini elde etmek üzere ”partikülleri analiz et” komutu ile analiz edilmistir. Görüntünün kenarina degen nesneler çikarilmistir. Microsoft Excel istatistik fonksiyonlari kullanilarak ölçümler umz'ye dönüstürülmüstür ve bunlarin ortalamasi alinmistir. göstermistir, orijinal Cichorium bitkisi polen taneciklerine yönelik belirlenen yüzey 1550 ve 2550 pm2 (SD = 226) arasindadir. Ayrica student T-test analizi, polen taneciklerinin her iki popülasyonunun esit olmasi olasiliginin 0.01'in altinda oldugunu belirtmistir (Sekil 3).
Solüsvorilar ve kimyasallar.
Aksi belirtilmedikçe tüm solüsyonlar otoklavlanmistir (120°C'de 20 dakika) 1/2 MSlS V2 MS ortami Duchefa; M0233 2.28 g/I MS ortami Duchefa; M0222 - Sukroz 15 g/l Agar Duchefa; M1002 7 g/l Gelrite Duchefa; 61101 - pH 5.8 W$9M ortami KH2P04 MES (monohidrat) Mannitol pH 5.6; 580 mOsm/kg Enzim solüsyonu: Asagidakiler ile desteklenen WS9M ortami: Yakult Selülaz Onozuka R10 Pektinaz (Sigma, P4300) pH 5.6-5.7, filtre steril M530 MS30-gelrite 4.40 g/I 4.40 g/l g/l 30 g/I 7 g/I - - 7.5 g/l .8 5.8 0.20 mM 2.8 mM Yikama solüsyonu: C8Ci2.2HzO MES (monohidrat) 60 mM IOA stok solüsyonu: 20 ml yikama solüsyonu basina 0.222 g IOA PEGISOO solüsyonu: Glukoz anhidröz (w/v) filtre steril PEG seyreltme solüsyonu Glukoz anhidröz CaCI2.2HZO 13.6 mM 0.34 M 2.8 mM .8; 640 mOsm/kg 40 % (w/v) pH 10.5; 520 mûsm/kg; filtre steril CPW-Ca** solüsyonu 200 ml x CPW tuzlari stok (ref. 3) 20 ml Mannitol 0.365 M CRM ortami pH 5.7; 530 mOsm/kg; filtre steril Su kroz Zeatîn Kültür ortamlari PM1 PM2 CaCl2.2 H20 1.5 mM 1.5 mM KH2P04 0.62 mlVI 0.62 mM Gambc›rg4 BS mikro 100X stok 5 ml/I 5 ml/l FeNaEDTA 0.11 mlVI 0.11 mM Gamborg BS vitaminleri (Duchefa; 11.2 11.2 60415) mgram/I mgram/l Glutamin 2.57 mM 5.14 mM Sukroz 14.6 mM 14.6 mM Mannitol 0.41 0.30 M BA 4.44 uM - Kazeinhidrolizat - mgram/l pH 5.5-5.6 5.5-5.6 530 400 ozmolarite m05m/kg mOsm/kg Filtre steril Filtre steril MS ortami (Duchefa; M0222) 4.40 gram 4.56 uivi BA 2.22 uM kazeinhidrolizat (Duchefa; C1301) 300 mgram/l pH 5.7 Sodyum sitrat 50 mIVI: solüsyon A, sodvum aliinat solüsvonu, ortam B: ref. 5 Gamborg BS ortamlari: PCR karisimi: Tris-HCI (pH 8.8) 75 mM NH4SO4 20 mM MgClz 2.8 mM dNTP'Ier 0.25 mM Ileri primer 0.15 uM Geri primer 0.2 uM Red Hot ® DNA Polimeraz (ABgene, Epsom 0.04 B.K.) ünite/ul genomik bitki DNA'si ~0.2 ng/pl GB (Ögütme tamgonui Sorbitol 035 M mannitol 0.1 M Tris-HCI pH 7.6 50 mM Naz-EDTA 5 mM spermidin %0.025 (w/v) ß merkaptoetanol %0.125 (v/v) DIECA 10 mM DNaz saklama tamgonu: Sodyumasetat 5 M asetîk asit kullanilarak pH 4.5; kullanim öncesi esit hacimde gliserol eklenmektedir DNaz Tamponu (081 (4 °C) DIECA (kullanimdan hemen önce eklenmektedir) Raf Tamgonu !SBI Sukroz Tris HCI pH 7.2 Naz-EDTA DIECA (kullanimdan hemen önce eklenmektedir) TE tamponu Tris-HCl pH 7.5 50 mM Naz-EDTA 10 mM DNaz saklama tamponunda 5 mg/ml DNaz 2 M MgClz Proteinaz K RnazA solüsyonu: Thermo Scientific ürün no. EN0551 5 M KAC FenoI/kloroform/izoamilalkol (25:24zl) kloroform/izoamilalkol (24:1) 7.5 M NH4-Asetat 7.5 M Na-Asetat pH 4.5-5.2 Kisaltmalar: BA 6 benzilaminopürin Bp baz çiftleri BSA bovin serum albümin CMS sitoplazmik erkek steril sitoplazmik erkek sterilitesi DIECA Na-dietilditiyokarbamat EDTA etilen diamintetra asetik asit FDA floresin diasetat lOA iyodoasetamid MES 2-(N-morfolino)etansülf0nik asit mtDNA mitokondriyal DNA NAA 1-naftalenasetik asit Ng nanogram PCR polimeraz zincir reaksiyonu PEG polietilen glikol PVP polivinilpirolidon RAMP Rastgele Çogaltilmis Mikro-uydu Polimorfizmi SD standart sapma SNP tekli nükleotid polimorfizmi K G veya T) M A veya C) nükleotid belirsizlik kodlari R G veya A) lUPAC kurallarina göre Y T veya C) DIZI LISTESI <110> Bejo Zaden B.V. <120> SITOPLAZMIK ERKEK ClCHORIUM BITKISI <160> 38 <170> BISSAP 1.0 <210> 1 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 1 <210> 2 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 2 <210> 3 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Lactuca" <400> 3 <210> 4 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 4 <210> 5 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Lactuca" <400> 5 <210> 6 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222>1u96 <223> /mol_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 6 <210> 7 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak (222› 1.96 <223> /mol_type="DNA" /0rganîzma="Lactuca” <400> 7 <210> 8 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 8 <210> 9 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 9 <210> 10 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 10 <210> 11 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Lactuca" <400> 11 <210> 12 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 12 <210> 13 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Lactuca" <400> 13 <210> 14 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 14 <210> 15 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Lactuca" <400> 15 <210> 16 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 16 <210> 17 <211> 96 <212> DNA <213> Lactuca <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /0rganizma="Lactuca" <400> 17 <210> 18 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Cichorium" <400> 18 <210> 19 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Cichorium" <400>19 <210> 20 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Cichorium" <400> 20 <210> 21 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /organizma="Cichorium" <400> 2 1 <210> 22 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Cichorium" <400> 22 <210> 23 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /mol_type="DNA" /0rganizma="Cichorium" <400> 23 <210> 24 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorium <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0I_type="DNA" /0rganizma="Cichorium" <400> 24 <210> 25 <400> 25 <210> 26 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorîum <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0l_type="DNA" /0rganîzma="Cichorium" <400> 26 <210> 27 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorîum <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0l_type="DNA" /organizma="Cichorium" <400> 27 <210> 28 <211> 96 <212> DNA <213> Cichorîum <220> <221> kaynak <222> 1..96 <223> /m0l_type="DNA" /0rganizma="Cichorium" <400> 28 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /m0l_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 29 gcc;cc;ggg La;gaLçcL; da <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /m0l_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 30 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..21 îgagaarffa fngaCîYgT gr <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 3 1 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 32 ticgaitang gaîCang3CC ag <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /m0l_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 33 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /m0l_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences” <400> 34 Hacmi-l ari kagit nargi- nc; n( <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 35 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..22 <223> /mol_type=“DNA" /note="primer" /0rganizma="artificial sequences" <400> 36 <210> 37 <211> 10 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222>1u10 <223> /m0l_type="DNA" /note="RAPD primer" /0rganizma="artificial sequences" act:: gaaggg agfîafçga: H <400> 37 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> yapay diziler <220> <221> kaynak <222> 1..16 <223> /m0l_type="DNA" /note="iSSR primer" /organizma="artîficial sequences" <400> 38

Claims (8)

  1. ISTEMLER Lactuca mitokondrisi içeren sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi olup, burada söz konusu Lactuca mitokondrisi SEQ ID No. 1, SEQ ID No.
  2. 2, SEQ ID No.
  3. 3, SEQ ID No.
  4. 4, SEQ ID No.
  5. 5, SEQ ID No.
  6. 6, SEQ lD No.
  7. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 ve SEO ID N0.10'dan olusan gruptan seçilen en az bir mitokondriyal nükleik asit dizisini içermekte ve burada söz konusu Cichorium bitkisi, NCIMB 42125 tevdisine göre bir bitkiden maternal olarak elde edilmis bir sitoplazmayi içermektedir. Istem 1'e göre sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi olup, burada söz konusu sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi ayrica, SEQ ID No. 31 ve SEQ ID No. 32 kullanilarak 1592 bp'lik bir moleküler markör ile tanimlanabilmektedir. Istem 1 veya istem 2'ye göre sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi olup, burada söz konusu sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi ayrica, SEQ ID No. 33 ve SEO ID No. 34 kullanilarak 293 bp'lik bir moleküler markör ile tanimlanabilmektedir. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi olup, burada söz konusu en az bir mitokondriyal nükleik asit dizisi en az iki, en az üç, en az dört, en az bes, en az alti, en az yedi, en az sekiz, en az dokuz veya on mitokondriyal nükleik asit dizisidir. Istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisi olup, burada söz konusu Cichorium bitkisi yesil hindiba, radiçi, kirmizi yaprakli hindiba, Treviso, beyaz hindiba, kelle sekeri, Belçika hindibasi, yabani marul, Katalonya, C. intybus var. foiiosum, C. endivia ve C. intybus L. var. Sati'vum'dan olusan gruptan seçilmektedir. Bir sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin tanimlanmasina yönelik yöntem olup, söz konusu yöntem söz konusu sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin bir numunesinde SEQ SEQ ID No.
  8. 8, SEQ lD No. 9 ve SEO ID No.10'dan olusan gruptan seçilen bir veya birkaç mitokondriyal nükleik asit dizisinin belirlenmesini içermektedir. Bir sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin tanimlanmasina yönelik yöntem olup, söz konusu yöntem söz konusu sitoplazmik erkek steril Cichorium bitkisinin bir numunesinde nükleik asit amplifikasyon primerleri SEQ ID No. 31 ve SEO ID No. 32 kullanilarak 1592 bp'lik bir moleküler markörün ve nükleik asit amplifikasyon markörleri ve/veya SEQ lD No. 33 ve SEO ID No. 34 kullanilarak 293 bp'lik bir moleküler markörün belirlenmesini içermektedir.
TR2018/10215T 2013-08-14 2013-08-14 Si̇toplazmi̇k erkek steri̇l cichorium bi̇tki̇leri̇. TR201810215T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2013/067014 WO2015022023A1 (en) 2013-08-14 2013-08-14 Cytoplasmic male sterile cichorium plants
EP13752882.4A EP3032941B1 (en) 2013-08-14 2013-08-14 Cytoplasmic male sterile cichorium plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201810215T4 true TR201810215T4 (tr) 2018-08-27

Family

ID=49034081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/10215T TR201810215T4 (tr) 2013-08-14 2013-08-14 Si̇toplazmi̇k erkek steri̇l cichorium bi̇tki̇leri̇.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10015942B2 (tr)
EP (1) EP3032941B1 (tr)
JP (1) JP6268292B2 (tr)
CN (1) CN105611826A (tr)
AR (1) AR097112A1 (tr)
AU (1) AU2013398123B2 (tr)
BR (1) BR112016002635B1 (tr)
CA (1) CA2919129C (tr)
ES (1) ES2675586T3 (tr)
MX (1) MX356183B (tr)
PL (1) PL3032941T3 (tr)
PT (1) PT3032941T (tr)
RU (1) RU2016108879A (tr)
TR (1) TR201810215T4 (tr)
WO (1) WO2015022023A1 (tr)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0771523B2 (en) * 1995-11-02 2006-06-07 Enza Zaden Beheer B.V. A cytoplasmic male sterile vegetable plant cell of the compositae family and also a method for obtaining such a plant
NL1001554C2 (nl) 1995-11-02 1996-08-02 Enza Zaden De Enkhuizer Zaadha Cytoplasmatisch mannelijk steriele plant van een groentegewas van de familie der Compositae, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant.
FR2749321B1 (fr) 1996-05-31 1998-08-21 Florimond Desprez Veuve Et Fil Genome vegetal recombine, mitochondrie et cellule le contenant, et procede de selection d'une sterilite male cytoplasmique chez une plante du genre cichorium
CN101522896B (zh) * 2005-10-26 2016-09-07 坂田种苗株式会社 莴苣属的胞质杂种植物和其生产方法
WO2012163389A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Az. Agricola T.&T. Produce Di Tiozzo Silvano Cichorium spp. male sterile mutants

Also Published As

Publication number Publication date
ES2675586T3 (es) 2018-07-11
BR112016002635B1 (pt) 2022-03-03
BR112016002635A2 (pt) 2017-09-12
JP6268292B2 (ja) 2018-01-24
MX356183B (es) 2018-05-17
PL3032941T3 (pl) 2018-08-31
EP3032941B1 (en) 2018-04-18
CA2919129C (en) 2020-02-11
JP2016529894A (ja) 2016-09-29
EP3032941A1 (en) 2016-06-22
WO2015022023A1 (en) 2015-02-19
PT3032941T (pt) 2018-05-25
AR097112A1 (es) 2016-02-17
US20160165825A1 (en) 2016-06-16
CN105611826A (zh) 2016-05-25
US10015942B2 (en) 2018-07-10
AU2013398123A1 (en) 2016-02-18
CA2919129A1 (en) 2015-02-19
AU2013398123B2 (en) 2019-07-18
MX2016001876A (es) 2016-07-26
RU2016108879A (ru) 2017-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Collonnier et al. Source of resistance against Ralstonia solanacearum in fertile somatic hybrids of eggplant (Solanum melongena L.) with Solanum aethiopicum L
Khan et al. Establishment of genetic fidelity of in vitro raised banana plantlets
WO2010010096A2 (fr) Procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes, par gynogenèse
ES2941684T3 (es) Plantas del género Diplotaxis portadoras de una androesterilidad citoplasmática
Gniech Karasawa et al. Gametic embryogenesis through isolated microspore culture in Corylus avellana L.
WO2020213728A1 (ja) 生長性が改良された細胞質雄性不稔Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ植物
Hsie et al. Determining the genetic stability of micropropagated sugarcane using inter-simple sequence repeat markers
WO2021230257A1 (ja) レバウジオシドｍ含有比の高いステビア植物及びそのスクリーニング方法
Trong et al. Karyotype analysis of Korean Lilium maximowiczii Regal populations
Ravi et al. Genome elimination by tailswap CenH3: in vivo haploid production in Arabidopsis thaliana
Yan et al. Cytogenetic studies of chrysanthemum: A review
Pereira et al. Cytological characterization of Brazilian green dwarf coconut (Cocos nucifera L.) via meiosis and conventional and differential karyotyping
ES2711627T3 (es) Marcadores genéticos para resistencia a orobanca en girasol
KR101959732B1 (ko) 이질4배체 감귤 특이적 ssr 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도
Hussain et al. Development of breeding populations from interspecific hybrids between Trifolium repens L. and T. occidentale Coombe
WO2020209265A1 (ja) 花芽形成能の低いステビア植物
TR201810215T4 (tr) Si̇toplazmi̇k erkek steri̇l cichorium bi̇tki̇leri̇.
Squirrell et al. Cell lines and plants obtained after protoplast fusions of Rosa+ Rosa, Rosa+ Prunus and Rosa+ Rubus
Landey Influence of micropropagation through somatic embryogenesis on somaclonal variation in coffee (Coffea arabica): assessment of variations at the phenotypical, cytological, genetic and epigenetic level
Taliaferro et al. Morphologic, cytogenetic, and enzymatic variation in tissue culture regenerated plants of apomictic old-world bluestem grasses (Bothriochloa sp.)
Guadagna Exploring the use of wild relatives in potato breeding through integrated cytogenetic and genomic approaches
EA032108B1 (ru) Способы получения обладающих цитоплазматической мужской стерильностью растений petroselinum crispum, обладающие цитоплазматической мужской стерильностью растения petroselinum crispum, их семена и их растительные части
Sattler Cytogenomics in Coffea L.
Sebolt et al. Utilization of the S-locus as a genetic marker in cherry to differentiate among different pollen donors
Montalt Assessment of citrus reproductive biology for seedless mandarin production and its interaction with temperature