ES2668964T3 - Extracto que contiene equol, método para la producción del mismo, método para la extracción de equol y alimento que contiene equol - Google Patents

Extracto que contiene equol, método para la producción del mismo, método para la extracción de equol y alimento que contiene equol Download PDF

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Takao Taki
Toshiaki Matsumoto
Izumi Hanya
Takuma Imada
Kunihiko Matsuoka
Takuya Kishimoto
Yuko Uchiyama
Hiromasa Tsuneishi
Machiko Tsuji
Tania Valdes-Gonzalez
Kentaro Tadano
Kyoko Kameda
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Abstract

Un material alimenticio que comprende un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y masa de cacao.

Description

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DESCRIPCION
Extracto que contiene equol, método para la producción del mismo, método para la extracción de equol y alimento que contiene equol
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un material alimenticio que contiene equol y un alimento que contiene equol. TÉCNICA ANTERIOR
Las isoflavonas (isoflavonas de soja: daidzeína, genisteína, gliciteína) contenidas en las sojas tienen estructuras similares al estradiol, y tienen acciones antiestrogénicas asociadas a la unión a receptores de estrógeno (denominados en lo sucesivo ER) y acciones de tipo estrógeno. Los estudios epidemiológicos realizados alguna vez y los estudios de intervención de isoflavonas de soja sugieren que tienen efectos preventivos debido a sus acciones antiestrogénicas sobre el cáncer de mama, cáncer de próstata y otros cánceres dependientes de hormonas y efectos de mejora debido a sus acciones de tipo estrógeno sobre trastornos menopáusicos, osteoporosis posmenopáusica e hiperlipidemia.
Recientemente, se ha señalado que el componente activo de los efectos fisiológicos de estas isoflavonas de soja puede ser un metabolito de daidzeína, es decir, equol. Más específicamente, se ha informado que el equol tiene una capacidad para unirse a ER (especialmente a ERp) superior a las isoflavonas de soja y que tiene una capacidad de transición sorprendentemente alta para dirigirse a órganos tales como tejidos de mama y próstata (Documentos no de patente 1 a 4). Además, un estudio de casos y testigos informa que hay significativamente menos pacientes que produzcan equol en los pacientes de cáncer de mama y cáncer de próstata. Se examinaron los efectos de las isoflavonas de soja que mejoran la densidad ósea y el metabolismo de los lípidos con respecto a mujeres posmenopáusicas clasificadas en dos grupos: aquellas que producen equol y aquellas que no. Se observó una mejora significativa en aquellas que producían equol.
El equol es producido por el metabolismo de la daidzeína por bacterias entéricas. Las capacidades para producir equol varían entre individuos, y el porcentaje de japoneses que producen equol es supuestamente de aproximadamente el 50 %. Es decir, aproximadamente el 5o % de los japoneses no son capaces de producir equol (individuos no productores de equol). Un individuo tal no puede disfrutar de ningún beneficio fisiológico útil
basándose en la acción del equol, aunque ingieran sojas y alimentos de soja procesados. Por tanto, con el fin de
conseguir beneficios fisiológicos útiles basados en la acción del equol en un individuo no productor de equol, se cree que la ingestión del propio equol es eficaz.
Documento no de patente 1: Morito K, Hirose T, Kinjo J, Hirakawa T, Okawa M, Nohara T, Ogawa S, Inoue S, Muramatsu M, Masamune Y. Interaction of phytoestrogens with estrogen receptors a and p. Biol Pharm Bull 24(4): 351-356, 2001
Documento no de patente 2: Maubach J, Bracke ME, Heyerick A, Depypere HT, Serreyn RF, Mareel MM, Keukeleire DD. Quantitation of soy-derived phytoestrogens in human breast tissue and biological fluids by high- performance liquid chromatography. J Chromatography B 784: 137-144, 2003
Documento no de patente 3: Morton MS, Chan PSF, Cheng C, Blacklock N, Matos-Ferreira A, Abranches- Monteiro L, Correia R, Lloyd S, Griffiths K. Lignans and isoflavonoids in plasma and prostatic fluid in men:
Samples from Portugal, Hong Kong, and the United Kingdom. Prostate 32: 122-128, 1997
Documento no de patente 4: Tammy EH, Paul DM, Paul GF, Robert D, Stephen B, Kenneth J, Ray M, Lorraine GO, Kristiina W, Holly MS, Karen JG. Long-term dietary habits affect soy isoflavone metabolism and accumulation in prostatic fluid in caucasian men. J Nutr 135: 1400-1406, 2005.
El documento EP 1 025 850 A1 describe una composición que comprende un sustrato que contiene daidzeína y una cepa de microorganismo capaz de metabolizar la daidzeína en equol. Se identifica el extracto de hipocótilo de soja como un posible sustrato que contiene daidzeína en el párrafo.
El documento JP 5 176711 A describe un alimento que comprende componentes de soja fermentada. En un ejemplo, la soja es fermentada con Bacillus natto con posterior aislamiento del antioxidante NT-100F aislado.
El documento JP 2006 296434 A describe una composición que contiene bacterias de ácido láctico para producir equol. Se identifican extracto de hipocótilo de soja, sojas fermentadas y leche de soja fermentada como fuentes de daidzeína a partir de las cuales puede producirse equol.
El documento JP 2006 504409 A describe una composición que contiene equol. Establece que el equol puede producirse por fermentación, seguido de extracción con un alcohol de bajo peso molecular tal como metanol, etanol, propano o isopropanol a un valor de pH de 3,5 a 5,5, en la que la relación de alcohol con respecto a agua para la extracción es de 40:60 a 95:5.
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El documento JP 2006 508942 A también describe una composición que contiene equol. Establece que el equol puede producirse por fermentación, seguido de extracción con un alcohol de bajo peso molecular tal como metanol, etanol, propano o isopropanol a un valor de pH de 3,5 a 5,5, en la que la relación de alcohol con respecto a agua para la extracción es de 40:60 a 95:5.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Problemas a resolver por la invención
Los presentes inventores han encontrado que el hipocótilo de soja fermentado obtenido fermentando hipocótilo de soja con un microorganismo productor de equol es utilizable como material alimenticio que contiene equol. El hipocótilo de soja fermentado contiene no solo equol, sino también isoflavona, saponina y componentes derivados de soja útiles similares. El hipocótilo de soja fermentado logra tales efectos fisiológicos eficaces atribuibles a estos componentes útiles, y, por tanto, es utilizable en material funcional. Los presentes inventores también encontraron que el hipocótilo de soja fermentado es útil como material reducido en alérgenos, debido a que se reducen los alérgenos atribuibles al hipocótilo de soja en él. El hipocótilo de soja fermentado encontrado por los presentes inventores presenta efectos fisiológicos atribuibles a los componentes útiles, y es hipoalergénico y, por tanto, es utilizable en material alimenticio funcional.
A diferencia, el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado varía dependiendo de los tipos de hipocótilo de soja usados para la producción del hipocótilo de soja fermentado, tipos de microorganismo productor de equol, etc., pero es generalmente aproximadamente del 1 % en peso. Si puede proporcionarse un material con un elevado contenido de equol, llegan a estar disponibles diversos tipos de alimentos que contienen equol en respuesta a la diversificación de alimentos. Sin embargo, el propio hipocótilo de soja fermentado no es un producto conocido, y todavía no ha sido encontrado método eficaz para extraer eficientemente el componente que contiene equol útil de hipocótilo de soja fermentado.
El hipocótilo de soja fermentado, que es una sustancia que contiene equol obtenida por el método de fermentación descrito anteriormente, es más seguro que el obtenido por un método de síntesis química, y adecuado para producción industrial. Sin embargo, las sustancias que contienen equol obtenidas por dicho método de fermentación contienen metabolitos distintos de equol y diversos componentes derivados de materiales de partida que quedan en él. Dependiendo del tipo de material de partida usado para la fermentación, la sustancia que contiene equol obtenida por un método de fermentación puede contener material que podría llegar a ser un alérgeno. Por tanto, con el fin de usar un equol como aditivo para alimentos o fármacos, se requiere una técnica no solo para producir un equol, sino también para purificar la sustancia que contiene equol para obtener un equol altamente puro. Sin embargo, todavía no se ha informado de muchas técnicas para refinar el equol, existe una necesidad de establecer una técnica, que sea industrialmente aplicable y por la que un equol pueda purificarse fácilmente y eficientemente.
El hipocótilo de soja fermentado tiene amargor atribuible al hipocótilo de soja o equol. Por tanto, debe prestarse suficiente atención al aroma del alimento resultante cuando el hipocótilo de soja fermentado se usa como un material alimenticio. El hipocótilo de soja fermentado es un material alimenticio novedoso que no ha sido informado antes, y no se conoce qué método es eficaz para mejorar los aromas del mismo. En particular, cuando el hipocótilo de soja fermentado se usa como un material para dulces horneados, tiende a experimentar un deterioro del aroma después de ser sometido a una etapa de horneado. Por tanto, presentar buen aroma es un objeto técnico muy difícil.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un material alimenticio obtenido fermentando un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol con un microorganismo productor de equol, en el que el aroma mejora. Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un producto alimenticio que contenga un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y presente excelente aroma (en particular, dulces horneados). Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar diversas formas de alimentos que contienen un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Medios para resolver el problema
Los presentes inventores realizaron una intensiva investigación para lograr los objetivos anteriores y encontraron que sometiendo un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol a extracción usando una disolución acuosa de etanol como extrayente, puede extraerse eficientemente un componente que contiene equol útil del hipocótilo de soja fermentado. Los presentes inventores encontraron además que sometiendo secuencialmente el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol a extracción usando una disolución acuosa de etanol y etanol, puede reducirse el contenido de saponina que produce un sabor astringente, amargor, un sabor acre y sabores desagradables similares, mientras que se extrae eficazmente el equol y gliciteína.
Los presentes inventores también encontraron que puede obtenerse un equol altamente puro suspendiendo un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en una disolución acuosa que tiene un pH de 2 a 6, recogiendo materia insoluble, y entonces sometiendo el residuo insoluble resultante a extracción usando una disolución acuosa de etanol.
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Los presentes inventores encontraron además que puede obtenerse eficientemente y fácilmente un equol altamente puro realizando las siguientes etapas (1) a (5):
Etapa (1): someter una sustancia que contiene equol a extracción usando una disolución acuosa de etanol; Etapa (2): someter el extracto resultante a extracción adicional usando etanol;
Etapa (3): someter el extracto resultante a extracción usando hexano;
Etapa (4): someter el residuo insoluble resultante a extracción usando una mezcla de hexano y éter; y
Etapa (5): someter el extracto líquido resultante a cromatografía en columna de gel de sílice, y obtener una fracción que contiene equol.
Los presentes inventores encontraron además que puede obtenerse eficientemente y fácilmente un equol altamente puro realizando las siguientes etapas (i) a (iii):
(i) someter la sustancia que contiene equol a extracción usando un disolvente orgánico específico o un disolvente orgánico acuoso, y concentrar el extracto líquido resultante;
(ii) someter el concentrado de equol resultante a cromatografía en columna de gel de sílice, y obtener una fracción que contiene equol; y
(iii) eliminar el disolvente de la fracción que contiene equol resultante, y recristalizar el residuo resultante.
Los presentes inventores también encontraron que en un material alimenticio obtenido dispersando un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto en masa de cacao, puede reducirse el amargor atribuible al hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y puede mostrarse excelente aroma. Los presentes inventores también encontraron que el material alimenticio es utilizable en diversos alimentos, que incluyen dulces horneados, afectar adversamente el aroma.
Los presentes inventores desarrollaron satisfactoriamente diversos productos alimenticios en los que se añade un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto.
La presente invención se ha llevado a cabo basándose en estos hallazgos y alguna mejora añadida a los mismos.
La presente invención proporciona los siguientes materiales alimenticios, y alimentos usando tales materiales alimenticios.
Punto 4-1. Un material alimenticio que comprende un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y masa de cacao.
Punto 4-2. El material alimenticio según el Punto 4-1, en el que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se dispersa en masa de cacao.
Punto 4-3. El material alimenticio según el Punto 4-1 o Punto 4-2, en el que el material alimenticio contiene 10 a 2000 partes en peso de masa de cacao por 100 partes en peso de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Punto 4-4. El material alimenticio según uno cualquiera de los Puntos 4-1 a 4-3, en el que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se obtiene fermentando hipocótilo de soja con un microorganismo productor de equol.
Punto 4-5. El material alimenticio según el Punto 4-4, en el que el microorganismo productor de equol es un microorganismo que puede metabolizar al menos un compuesto de daidzeína seleccionado del grupo que consiste en glucósido de daidzeína, daidzeína y dihidrodaidzeína para producir equol.
Punto 4-6. El material alimenticio según uno cualquiera de los Puntos 4-1 a 4-5, que toma una forma de polvo, una forma granulada, una forma de viruta, o una forma de tipo lámina.
Punto 4-7. Un alimento que contiene equol que comprende un material alimenticio de uno cualquiera de los Puntos 4-1 a 4-6.
Punto 4-8. El alimento que contiene equol según el Punto 4-7, que es un dulce horneado o un postre congelado.
EFECTOS DE LA INVENCIÓN
El método para producir un extracto que contiene equol puede producir un extracto que contiene equol que es útil en material alimenticio funcional extrayendo eficazmente componentes que contienen equol útiles del hipocótilo de soja
fermentado que contiene equol. Sometiendo secuencialmente un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol a extracción usando una disolución acuosa de etanol y etanol, es obtenible un extracto que contiene equol que contiene una alta concentración de equol y gliciteína, con una cantidad reducida de saponina que causa un sabor desagradable. Por consiguiente, el extracto que contiene equol puede añadirse a alimentos sin afectar 5 adversamente el sabor.
El método de purificación hace posible obtener fácilmente y eficientemente un equol altamente puro a partir de la sustancia que contiene equol. En particular, el método de purificación hace posible equol altamente puro incluso cuando la sustancia que contiene equol contenga isoflavonas cuya estructura es similar a la del equol eliminando estas isoflavonas. Por consiguiente, el método de purificación puede ser adecuadamente empleado en la obtención 10 de equol a partir de un material fermentado que contiene equol que contiene una gran proporción de isoflavonas.
Además, el material alimenticio obtenido dispersando un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto en masa de cacao tiene amargor reducido y presenta excelente aroma, aunque contenga un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto. El material alimenticio de la presente invención puede usarse en diversos alimentos sin afectar adversamente el aroma. Cuando se añade material alimenticio convencional a un 15 dulce horneado en una forma granulada o una forma de viruta, los componentes en el material alimenticio tienden a difundir en todo el dulce horneado en la etapa de horneado, y puede no obtenerse un aroma deseable. En el material alimenticio de la presente invención, el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se cubre con masa de cacao. Por tanto, incluso cuando el material alimenticio de la presente invención se añada a un dulce horneado en una forma granulada o una forma de viruta, puede suprimirse la difusión de los componentes eficaces dentro del 20 material alimenticio y puede obtenerse un aroma deseable.
Los beneficios fisiológicos útiles del alimento de la presente invención pueden ser disfrutados basándose en la actividad fisiológica útil del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto.
El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto tiene alérgenos derivados de hipocótilo de soja reducidos, y por tanto el material alimenticio y los diversos alimentos de la presente invención puede ser tomados 25 con seguridad por o administrados a personas que padecen soja alergia.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
Lo siguiente detalla la presente invención.
1. Método de producción para extracto que contiene equol
El método de producción de un extracto que contiene equol usando un hipocótilo de soja fermentado que contiene 30 equol como material. El método de producción para el extracto que contiene equol se divide en los siguientes Métodos de producción I y II. Lo siguiente detalla un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol usado como material del método, y describe en detalle los Métodos de producción I y II.
Hipocótilo de soja fermentado que contiene equol
En el método de producción para el extracto que contiene equol, se usa un hipocótilo de soja fermentado que 35 contiene equol como material de partida. Lo siguiente describe un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol es un tipo de un hipocótilo de soja fermentado producido fermentando un hipocótilo de soja usando un microorganismo productor de equol.
El microorganismo productor de equol usado para la producción del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol está seleccionado de microorganismos que tienen la capacidad (actividad metabólica) de producir equol 40 metabolizando al menos un compuesto de daidzeína seleccionado del grupo que consiste en glucósido de daidzeínas, daidzeína y dihidrodaidzeína. Ejemplos de los glucósidos de daidzeína aquí incluyen daidzina, malonildaidzina y acetildaidzina.
El microorganismo productor de equol no está limitado y puede ser cualquier microorganismo que tenga la siguiente capacidad. Por ejemplo, puede usarse cualquier microorganismo públicamente conocido, o cualquier 45 microorganismo obtenido por un método de cribado general. Se sabe que tales microorganismos productores de equol existen en los microorganismos que pertenecen a Lactococcus, tales como Lactococcus garvieae; microorganismos que pertenecen a Streptococcus, tales como Streptococcus intermedius o Streptococcus constellatus; o microorganismos que pertenecen a Bacteroides tales como Bacteroides ovatus. Entre los diversos tipos de microorganismo productor de equol, la presente invención prefiere las bacterias de ácido láctico que 50 pertenecen a Lactococcus o Streptococcus, adicionalmente prefiere las bacterias de ácido láctico que pertenecen a Lactococcus, y en particular, las bacterias de ácido láctico que pertenecen a Lactococcus garvieae. Los microorganismos productores de equol pueden aislarse de, por ejemplo, heces humanas, basándose en el índice de la existencia de una propiedad productora de equol. Los inventores de la presente invención depositaron alguna bacteria identificada que había sido aislada de heces humanas; concretamente, Lactococcus 20-92 (FERM BP- 55 10036), Streptococcus E-23-17 (FERM BP-6436), Streptococcus A6G225 (FERM BP-6437) y Bacteroides E-23-15
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(FERM BP-6435), que están disponibles para ser usadas como los microorganismos productores de equol. Entre éstas, la presente invención prefiere particularmente Lactococcus 20-92.
El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se produce usando hipocótilo de soja como material de fermentación. El hipocótilo de soja designa una parte correspondiente a la plúmula o la radícula en la germinación de la soja, y se sabe que contiene una gran cantidad de compuestos de daidzeína tales como glucósidos de daidzeína o daidzeína. El hipocótilo de soja usado en la presente invención no está limitado por el distrito productor de la soja o si está procesada o sin procesar, a menos que los compuestos de daidzeína internos no estén significativamente perdidos. Por ejemplo, el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol puede ser un hipocótilo crudo, o puede ser uno aislado de soja calentada, secada o hervida con vapor, o uno obtenido calentando, secando o hirviendo con vapor el hipocótilo que se aísla de soja sin procesar. Además, el hipocótilo de soja puede procesarse por desengrasado o desproteinización. La forma del hipocótilo de soja no está particularmente limitada, y puede estar en forma de polvo, trozos, o granos pulverizados o fragmentados. El hipocótilo de soja en polvo es particularmente preferible debido a su eficiente producción de equol. La fermentación de hipocótilo de soja se lleva a cabo ajustando primero el contenido de agua del hipocótilo de soja añadiendo una cantidad apropiada de agua, y luego inoculando el microorganismo productor de equol al hipocótilo.
La cantidad de agua añadida al hipocótilo de soja se ajusta dependiendo del tipo de microorganismo productor de equol o el tipo de fermentador. La relación de agua con respecto al hipocótilo de soja al comienzo de la fermentación es 400 a 4.000 partes en peso, preferentemente 500 a 2.000 partes en peso, adicionalmente preferentemente 600 a 1.000 partes en peso, basado en 100 partes en peso (peso seco) del hipocótilo de soja.
Además, si fuera necesario, pueden añadirse algunos aditivos al hipocótilo de soja como material de partida en la fermentación para mejorar la eficiencia de fermentación o el aroma del producto. Ejemplos de los aditivos incluyen fuentes de nitrógeno tales como un extracto de levadura, polipeptona, o un extracto de carne; fuentes de carbono tales como glucosa o sacarosa; sales inorgánicas tales como fosfato, carbonato o hidrosulfato; vitaminas; y componentes nutricionales tales como aminoácido. Particularmente, si se usa un microorganismo productor de equol para convertir arginina en ornitina (denominado en lo sucesivo un "microorganismo productor de ornitina/equol"), se añade arginina al hipocótilo de soja antes de la fermentación de manera que la sustancia fermentada contenga ornitina. En este caso, la cantidad de arginina es, por ejemplo, aproximadamente 0,5 a 3 partes en peso, basado en 100 partes en peso (peso seco) del hipocótilo de soja. El microorganismo productor de ornitina/equol puede obtenerse por un método de cribado públicamente conocido usando un índice de la capacidad productora de equol y la capacidad de conversión de arginina en ornitina. El microorganismo productor de ornitina/equol puede seleccionarse del grupo de Lactococcus garvieae, tipificado por Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036).
Además, el pH del material de fermentación (una sustancia que contiene hipocótilo de soja) no está particularmente limitado dentro de un intervalo para que crezca el microorganismo productor de equol; sin embargo, para asegurar la excelente proliferación del microorganismo productor de equol, el pH del material de fermentación se encuentra preferentemente dentro de aproximadamente 6 a 7, más preferentemente aproximadamente 6,3 a 6,8.
Además, puede añadirse la isoflavona que contiene los compuestos de daidzeína anteriormente mencionados al material de fermentación (una sustancia que contiene hipocótilo de soja). Tal inclusión de isoflavona en el material de fermentación aumenta el contenido de equol del hipocótilo de soja fermentado, mejorándose así la utilizabilidad del hipocótilo de soja fermentado.
La fermentación del hipocótilo de soja se lleva a cabo en condiciones apropiadas según la característica de crecimiento de los microorganismos productores de equol. Por ejemplo, se usan cuando los microorganismos productores de equol enumerados anteriormente, la fermentación del hipocótilo de soja se lleva a cabo en condiciones anaerobias.
La temperatura de fermentación no está limitada dentro de un intervalo apropiado para que crezca el microorganismo productor de equol. La temperatura es generalmente 20 a 40 °C, preferentemente 35 a 40 °C, y más preferentemente 36 a 38 °C.
El tiempo de fermentación se determina dependiendo de la cantidad de producción deseada de equol, la cantidad residual de compuestos de daidzeína, el tipo del microorganismo productor de equol o similares. El tiempo de fermentación es generalmente 1 a 10 días, preferentemente 2 a 7 días, y adicionalmente preferentemente 3 a 5 días.
En el hipocótilo de soja fermentado obtenido mediante la fermentación en las condiciones anteriores, el equol producido se acumula, y así puede expresarse la actividad fisiológico útil del equol. El contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado varía dependiendo del tipo de microorganismo productor de equol o las condiciones de fermentación. El contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado es generalmente 1 a 20 mg, preferentemente 2 a 12 mg, y más preferentemente 5 a 8 mg, por gramo (peso seco) del hipocótilo de soja fermentado.
Aparte del equol, el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol también contiene diversas isoflavonas tales como compuestos de daidzeína que incluyen daidzina, malonildaidzina, acetildaidzina, daidzeína o dihidrodaidzeína (estos componentes se denominan "compuestos de daidzeína", en lo sucesivo); compuestos de genisteína que
incluyen malonilgenistina, acetilgenistina, genisteína, dihidrogenisteína (estos componentes se denominan "compuestos de genisteína", en lo sucesivo); o compuestos de gliciteína que incluyen glicitina, malonilglicitina, acetilglicitina, gliciteína, dihidrogliciteína (estos componentes se denominan "compuestos de gliciteína" en lo sucesivo). La isoflavona también expresa las actividades fisiológicas útiles. El contenido de cada isoflavona (incl.
5 equol) en el hipocótilo de soja fermentado es generalmente 5 a 20 mg, preferentemente 5 a 15 mg, y más preferentemente 8 a 15 mg, por gramo (peso seco) del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Además, el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol también se diferencia de los hipocótilos de soja generales en términos de la composición de isoflavonas distintas de equol. Particularmente, el contenido total de compuestos de genisteína en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol es preferentemente no superior al 10 15% en peso, y más preferentemente no superior al 12% en peso. Con un bajo contenido de compuestos de
genisteína tal, el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol es más ventajoso que el hipocótilo de soja no fermentado en términos de la composición de isoflavonas. Obsérvese que los compuestos de genisteína son tipos de isoflavona y son compuestos químicos que son sospechosos de alteración endocrina, y existe una necesidad de reducción en las concentraciones de compuestos de genisteína en el alimento (Young HJ, Jodi F, Kimberly FA, 15 Daniel RD, William GH. Effects of dietary daidzein and its metabolite, equol, at physiological concentrations on the growth of estrogen-dependent human breast cancer (MCF-7) tumors implanted in ovariectomized athymic mice. Véase Carcinogenesis 127(4):856-863, 2006).
Lo siguiente es un ejemplo de composición de isoflavonas del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (la unidad "mg" representa la cantidad total de cada isoflavona por gramo (peso seco) del hipocótilo de soja 20 fermentado).
Equol: 1 a 20 mg, preferentemente 2 a 12 mg
Compuestos de daidzeína: 0,1 a 30 mg, preferentemente 0,1 a 1,5 m
Compuestos de genisteína: 0,05 a 2,5 mg, preferentemente 0,05 a 2 mg
Compuestos de gliciteína: 0,1 a 4 mg, preferentemente 2 a 3,5 mg.
25 Lo siguiente es un ejemplo de relación de composición de las isoflavonas en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (la unidad "% en peso" representa una relación con respecto a la cantidad total de isoflavonas en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol).
Equol: 30 al 75 % en peso, preferentemente 40 al 70 % en peso, más preferentemente 45 al 70 % en peso
Compuestos de daidzeína: 1 al 20 % en peso, preferentemente 2 al 15 % en peso, más preferentemente 4 al 30 12 % en peso
Compuestos de genisteína: 0,1 al 20 % en peso, preferentemente 1 al 15 % en peso, más preferentemente 1 al 10 % en peso
Compuestos de gliciteína: 10 al 50 % en peso, preferentemente 15 al 35 % en peso, más preferentemente 25 al 35 % en peso.
35 Como este hipocótilo de soja fermentado que contiene equol tiene una composición de isoflavonas particular que no se encuentra en ningún estado de la técnica, puede definirse como una sustancia que contiene isoflavonas especificada por la anterior composición de isoflavonas.
Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) es particularmente preferido como microorganismo productor de equol en la producción del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol que tiene la anterior composición de isoflavonas.
40 El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol también contiene saponina derivada del hipocótilo de soja. El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol generalmente contiene saponina en una cantidad de 10 a 80 mg, preferentemente 20 a 50 mg, y más preferentemente 30 a 40 mg, por gramo (en peso seco) del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Además, como se ha descrito anteriormente, la ornitina está contenida en el hipocótilo de soja fermentado producido 45 a partir de la fermentación con un microorganismo productor de ornitina/equol después de añadir arginina al hipocótilo de soja. El contenido de ornitina del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol es 5 a 20 mg, preferentemente 8 a 15 mg, y más preferentemente 9 a 12 mg, por gramo (peso seco) del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol obtenido mediante fermentación en las anteriores condiciones 50 puede usarse directamente después de la fermentación como un material del método de producción, o puede secarse después de la fermentación para ser un sólido seco antes de ser usado como el material del método de producción.
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Además, el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol obtenido mediante fermentación en las condiciones anteriores puede someterse a procesamiento previo, tal como desgrasado, antes de la siguiente Etapa I-1. El desgrasado puede realizarse por un método usando hexano como extrayente.
1-1. Método de producción I
En el Método de producción I, la producción del extracto que contiene equol se lleva a cabo llevando a cabo la Etapa I-1, que se describe a continuación.
Etapa I-1
El Método de producción I para producir el extracto que contiene equol comprende una Etapa I-1 de extraer un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol usando una disolución acuosa de etanol como extrayente, y recoger el extracto líquido.
La concentración de etanol de la disolución acuosa de etanol (una disolución mixta de etanol y agua) usada en la Etapa I-1 es generalmente del 20 al 98 % en vol, preferentemente 45 al 95 % en vol, y más preferentemente 65 al 85 % en vol. Cumpliendo este intervalo de concentración, llega a ser posible extraer componentes útiles que incluyen equol del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
La extracción en la Etapa I-1 usa una disolución acuosa de etanol en una cantidad de, por ejemplo, 1 a 1000 partes en peso, preferentemente 2 a 500 partes en peso, más preferentemente 5 a 20 partes en peso, por parte en peso (peso seco) del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Las condiciones de extracción de la Etapa I-1 no están particularmente limitadas, y puede usarse un método de extracción por inmersión en caliente o frío, método de percolación o similares. Más específicamente, se añade una disolución acuosa de etanol al hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos un minuto a temperatura ambiente, preferentemente durante 5 minutos a 48 horas a temperatura ambiente.
Después de tal extracción, el extracto líquido se aísla para obtener un extracto que contiene equol. La recogida del extracto líquido se realiza por un método públicamente conocido, tal como filtración o centrifugación.
El extracto líquido así aislado en la Etapa I-1 contiene componentes útiles que incluyen equol y gliciteínas, y la cantidad de aceite es inferior a aquella en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol. El extracto líquido así obtenido en la Etapa I-1 puede ser directamente incorporado en un alimento o medicina como un extracto líquido que contiene equol, o puede ser solidificado eliminando el extrayente antes de incorporarlo en un alimento o medicina. Además, el extracto líquido así obtenido en la Etapa I-1, ya sea en forma de un extracto líquido o sólido que contiene equol, puede someterse a refino del equol.
El extracto líquido aislado en la Etapa I-1 contiene equol, gliciteínas y saponina, que puede causar astringencia desagradable, amargor, o acridez. Así, es preferible someter el extracto líquido aislado en la Etapa I-1 a la siguiente Etapa I-2 para eliminar la saponina y aumentar la concentración de componentes útiles, que incluyen equol.
Etapa I-2
La Etapa I-2 comprende eliminar el extrayente del extracto líquido obtenido en la Etapa I-1, llevar a cabo otra extracción usando etanol como extrayente, y recoger un extracto.
En la Etapa I-2, la eliminación del extrayente del extracto obtenido en la Etapa I-1 puede realizarse por un método públicamente conocido tal como secado.
El sólido obtenido por la eliminación del extrayente del extracto obtenido en la Etapa I-1 (este sólido puede ser denominado en lo sucesivo "Material sólido") se somete a extracción usando etanol como extrayente. El etanol usado como extrayente en la Etapa I-2 puede ser etanol libre de agua que, sin embargo, puede contener inevitablemente vapor.
La extracción en la Etapa I-2 usa, por ejemplo, 1-1000 partes en peso, preferentemente 5-500 partes en peso, y más preferentemente 5-20 partes en peso de etanol, por parte en peso (peso seco) del material sólido.
La condición en la extracción de la Etapa I-2 no está particularmente limitada, y puede realizarse por un método de extracción por inmersión en caliente o frío, método de percolación o similares. Más específicamente, el etanol se añade al material sólido y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos un minuto a temperatura ambiente, preferentemente durante 5 minutos a 48 horas a temperatura ambiente. La extracción de la Etapa I-2 puede combinarse con tratamiento supersónico para aumentar la tasa de recogida de equol.
Después de tal extracción, el extracto se aísla para obtener un extracto que contiene equol. La recogida del extracto se realiza por un método públicamente conocido, tal como filtración o centrifugación.
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El extracto así aislado en la Etapa I-2 contiene una mayor cantidad de componentes útiles que incluyen equol y gliciteínas, y una cantidad reducida de saponina. La utilidad de este extracto es, por tanto, superior a la del extracto obtenido en la Etapa I-1. El extracto así obtenido en la Etapa I-2 puede ser directamente incorporado en un alimento o medicina como un extracto líquido que contiene equol, o puede ser solidificado eliminando el extrayente antes de ser incorporado en un alimento o medicina. El extracto así obtenido en la Etapa I-2, ya sea en forma de un extracto líquido o sólido que contiene equol, puede someterse a refino del equol. Obsérvese que, con el fin de mejorar la estabilidad durante la conservación del extracto que contiene equol, es más preferible solidificar el extracto líquido eliminando el extrayente.
Composición y uso de extracto que contiene equol obtenido por el Método de producción I
El contenido de equol del extracto líquido obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 es 0,2 al 40 % en peso, preferentemente 0,4 al 24 % en peso, y más preferentemente 1 al 16 % en peso, basado en la cantidad total de un producto sólido seco (100% en peso). El contenido de gliciteína del extracto líquido obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 es 0,01 al 8 % en peso, preferentemente 0,08 al 5 % en peso, y más preferentemente 0,2 al 3 % en peso, basado en la cantidad total de un producto sólido seco.
El extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 contiene equol a una alta concentración, y expresa las actividades útiles basadas en equol. Más específicamente, el extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 tiene un efecto de prevenir o tratar diversas enfermedades o síntomas que incluyen trastornos menopáusicos, osteoporosis, hipertrofia prostática, y síndrome metabólico; o para la reducción del nivel de colesterol en sangre, blanqueamiento de la piel, granos, control intestinal, obesidad y diuresis. Como las actividades útiles son así expresadas, el extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 puede incorporarse en alimento o medicinas.
Cuando se usa para un alimento, el extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 se incorpora frecuentemente en bebidas, gránulos, gránulos finos, cápsulas, comprimidos, polvo, productos lácteos, gomas, gominolas, pudín, barritas, y otros diversos alimentos secos. El alimento que contiene el extracto que contiene equol puede usarse como producto alimenticio general, y también como alimento natural especificado, complemento nutricional, alimento funcional, alimento sin valor o similares. Particularmente, cualquier alimento que contenga el hipocótilo de soja fermentado es útil como complemento nutricional. Obsérvese que los detalles de los alimentos que contienen los extractos que contienen equol obtenidos en la Etapa I-1 o Etapa I-2 se describen después.
Cuando el extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 se incorpora en un alimento, la proporción del extracto que contiene equol en el alimento varía dependiendo del tipo de alimento, el contenido de equol, la edad y sexo del consumidor, el efecto deseado, etc. Normalmente, la cantidad total (base de peso seco) del extracto que contiene equol es 0,1 a 90 g, por 100 g de alimento.
Cuando se usa para una especialidad farmacéutica, el extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 se incorpora frecuentemente en comprimidos, píldoras, polvo, líquidos, suspensiones, emulsiones, gránulos, cápsulas, o supositorios. Una especialidad farmacéutica tal que contiene el extracto que contiene equol tiene un efecto de prevenir o tratar diversas enfermedades o síntomas que incluyen trastornos menopáusicos (dolencias menopáusicas indeterminadas, osteoporosis, hiperlipidemia), osteoporosis, hipertrofia prostática y síndrome metabólico; o para la reducción del nivel de colesterol en sangre, blanqueamiento de la piel, granos, control intestinal, obesidad y diuresis. Particularmente, la especialidad farmacéutica que contiene el extracto que contiene equol es adecuada para la prevención o el tratamiento de dolencia indeterminada o síntomas posmenopáusicos (por ejemplo, osteoporosis, trastorno menopáusico) de mujeres de mediana edad.
La dosis de la especialidad farmacéutica que contiene el extracto que contiene equol obtenido en la Etapa I-1 o Etapa I-2 no puede ser uniformemente definida, ya que varía dependiendo del contenido de equol en el extracto que contiene equol, edad, peso, síntoma del objeto o el número de dosis. La dosificación para un adulto por día normalmente se corresponde con la cantidad (peso seco) del extracto que contiene equol de 1 a 2000 mg, preferentemente 5 a 1000 mg, y más preferentemente 40 a 50 mg. Es particularmente preferible determinar la dosis del extracto que contiene equol de manera que se administren 2 a 30 mg de equol por día.
1-2. Método de producción II
El Método de producción II produce un extracto líquido que contiene equol llevando a cabo la siguiente Etapa II-1 y Etapa II-2. Lo siguiente detalla el Método de producción II.
Etapa II-1
El método de producción II suspende primero un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en agua, añade un ácido a la suspensión para ajustar el pH a un intervalo de 2 a 6, y aísla un residuo insoluble (Etapa II-1). En otras palabras, en la Etapa II-1, un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se suspende en una disolución acuosa (pH 2 a 6) que contiene un ácido, a partir de aquí se recoge un residuo insoluble.
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En la Etapa II-1, un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se suspende en agua, y se añade un ácido a la suspensión para ajustar el pH a un intervalo de 2 a 6.
El ácido usado en la Etapa II-1 puede ser un ácido orgánico o un ácido inorgánico. El ácido orgánico no está limitado, en tanto que sea ajustable al anterior intervalo de pH. Ejemplos del ácido orgánico incluyen ácidos cítricos, ácidos L-tartáricos, ácidos fumáricos, ácidos L-ascórbicos, ácidos glucónicos, ácidos acéticos, ácidos lácticos, ácidos DL-málicos, ácidos oxálicos, ácidos fórmicos, ácidos propiónicos, ácidos butanoicos y ácidos de metanosulfona. Similarmente, el ácido inorgánico no está limitado, en tanto que sea ajustable al anterior intervalo de pH. Ejemplos del ácido inorgánico incluyen ácidos clorhídricos, ácidos sulfúricos, ácidos nítricos y ácidos fosfóricos. Entre ellos, se prefieren los ácidos acéticos, ácidos clorhídricos y ácidos sulfúricos.
En la Etapa II-1, la cantidad de agua en la que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se suspende es, por ejemplo, 3 a 30 partes en peso, más preferentemente 5 a 20 partes en peso, por parte en peso (peso seco) de un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
En la Etapa II-1, un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se mezcla en una disolución acuosa de pH 2 a 6, y la disolución se agita o se deja que repose a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, más preferentemente 2 a 24 horas.
Tal tratamiento deja equol como una parte del residuo insoluble, y el equol puede obtenerse recogiendo el residuo insoluble usando un método públicamente conocido tal como filtración o centrifugación.
El residuo insoluble así obtenido en la Etapa II-1 se somete entonces a la siguiente Etapa II-2.
Etapa II-2
El residuo insoluble así obtenido en la Etapa II-1 se somete a otra extracción usando una disolución acuosa de etanol como extrayente. El extracto líquido resultante se aísla (Etapa II-2).
El residuo insoluble obtenido en la Etapa II-1 puede someterse a la Etapa II-2, independientemente de si es un producto seco o un producto húmedo. Sin embargo, cuando el residuo insoluble es un producto húmedo, es preferible ajustar el contenido de agua de la disolución acuosa de etanol (descrita después) en vista del contenido de agua medido de la materia insoluble.
La concentración de etanol de la disolución acuosa de etanol (una disolución mixta de etanol y agua) usada en la Etapa II-2 es, por ejemplo, 50 al 95 % en vol, más preferentemente 70 al 90 % en vol. Con este intervalo de concentración, puede ser eficientemente realizada la extracción del equol obtenido del residuo insoluble en la Etapa II-2.
La extracción en la Etapa II-2 usa una disolución acuosa de etanol en una cantidad de, por ejemplo, 2 a 30 partes en peso, más preferentemente 4 a 10 partes en peso, por parte en peso (peso seco) del residuo insoluble obtenido en la Etapa II-1.
La condición en la extracción en la Etapa II-2 no está particularmente limitada, y puede usarse el método de extracción por inmersión en caliente o frío, método de percolación o similares. Más específicamente, se añade una disolución acuosa de etanol al residuo insoluble obtenido en la Etapa II-1, y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, preferentemente 1 minuto a 50 horas a temperatura ambiente.
Después de tal extracción, el extracto líquido se aísla para obtener una fracción que contiene equol. La recogida del extracto se realiza por un método públicamente conocido tal como filtración o centrifugación.
Debido a la inclusión del equol concentrado, el extracto líquido así aislado en la Etapa II-2 contiene equol a una alta concentración y componentes útiles tales como compuestos de gliciteína, el extracto es más útil que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol. El extracto líquido obtenido en la Etapa II-2 puede ser directamente incorporado en un alimento o medicina como un extracto líquido que contiene equol, o puede procesarse en polvo eliminando el extrayente antes de incorporarlo en un alimento o medicina. El extracto líquido así obtenido en la Etapa II-2, ya sea en forma de un extracto líquido o sólido que contiene equol, puede someterse a refino del equol. Obsérvese que, con el fin de mejorar la estabilidad durante la conservación del extracto que contiene equol, es más preferible solidificar el extracto líquido eliminando el extrayente.
La eliminación del extrayente del extracto líquido obtenido en la Etapa II-2 puede realizarse en las mismas condiciones que en la Etapa I-2 del Método de producción 1; sin embargo, la eliminación se realiza preferentemente por secado por pulverización.
Composición y uso del extracto que contiene equol obtenido por el Método de producción II
Secando el extracto líquido obtenido en el Método II (el extracto líquido obtenido en la Etapa II-2 anterior), es posible aislar equol con una tasa de recogida del 90 % o mayor. Así se obtiene polvo que contiene equol que contiene equol diez veces superior al equol en un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol. Con este alto contenido de
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equol, el polvo que contiene equol expresa más eficazmente las actividades útiles derivadas del equol. El fin o método de uso del polvo que contiene equol obtenido en el Método II es el mismo que el del polvo que contiene equol obtenido en el Método I.
2. Método de purificación de equol
El método de purificación de equol se divide en los siguientes Métodos de purificación 1 y 2. Lo siguiente detalla un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol que va a ser refinado por el método de purificación y describe en detalle los Métodos de purificación 1 y 2.
Sustancia que contiene equol
En el método de purificación, la sustancia que contiene equol que va a someterse al proceso de purificación no está limitada, en tanto que contenga equol. Por ejemplo, la sustancia que contiene equol usada para el método puede ser un producto de reacción que contiene equol generado por síntesis química, o una sustancia fermentada que contiene equol producida por fermentación. La sustancia fermentada que contiene equol obtenida mediante la fermentación contiene muchos tipos de isoflavona similar en estructura al equol. Sin embargo, como el método puede separar ventajosamente equol de isoflavona de una manera eficiente, una sustancia fermentada que contiene equol es adecuada para una sustancia que contiene equol para el método de purificación.
Lo siguiente explica una sustancia fermentada que contiene equol.
La sustancia fermentada que contiene equol se produjo mediante un método de fermentación públicamente conocido usando un microorganismo productor de equol. Más específicamente, un microorganismo con la capacidad (actividad metabólica) para producir equol metabolizando al menos un compuesto de daidzeína seleccionado del grupo que consiste en glucósido de daidzeínas, daidzeína y dihidrodaidzeína, se inocula en un material de fermentación (material que va a someterse a la fermentación) que contiene las daidzeínas. La muestra se fermenta entonces (cultiva) en las condiciones adecuados para cultivar el microorganismo. La sustancia fermentada resultante contiene equol.
El microorganismo productor de equol está seleccionado de la lista de "Hipocótilo de soja fermentado que contiene equol" en la Sección "1. Método de producción para extracto que contiene equol".
El material de fermentación que contiene compuestos de daidzeína no está limitado por otros factores; sin embargo, el material es preferentemente autorizado por su seguridad como material alimenticio. Ejemplos del material de fermentación que contiene compuestos de daidzeína incluyen sojas, hipocótilo de soja, extracto de hipocótilo de soja, tofú, tofú frito, leche de soja, sojas fermentadas, salsa de soja, pasta de judías, un tempeh, y un trébol rojo o su extracto, alfalfa o su extracto. Un material de fermentación adecuado que contiene compuestos de daidzeína es un hipocótilo de soja debido a su alto contenido de daidzeína.
Además, una isoflavona que contiene cualquiera del compuesto de daidzeína anteriormente descrito puede añadirse de antemano al material de fermentación que contiene los compuestos de daidzeína. Con esta adición adicional de isoflavona al material de fermentación, aumenta el contenido de equol de la sustancia fermentada resultante.
Además, según se requiera, pueden usarse algunos aditivos en el material de fermentación que contiene compuestos de daidzeína para mejorar la eficiencia de fermentación, etc. Ejemplos de los aditivos incluyen fuentes de nitrógeno tales como un extracto de levadura, polipeptona, o un extracto de carne; fuentes de carbono tales como glucosa o sacarosa; sales inorgánicas tales como fosfato, carbonato o hidrosulfato; vitaminas; y componentes nutricionales tales como aminoácido.
Se determinan diversas condiciones de fermentación que incluyen contenido de agua, tiempo, temperatura, atmósfera en la producción de una sustancia fermentada que contiene equol dependiendo del tipo del microorganismo productor de equol, el tipo del material de fermentación, la cantidad de producción de equol, la cantidad residual de compuestos de daidzeína, o similares.
Para la sustancia que contiene equol usada para el método de purificación, es particularmente preferible el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol descrito en la sección "1. Método de producción para extracto que contiene equol".
2-1. Método de purificación 1
El Método de purificación 1 refina el equol llevando a cabo las siguientes Etapas 1-1 a 1-5.
Etapa 1-1
El método de purificación lleva a cabo la extracción con respecto a una sustancia que contiene equol usando una disolución acuosa de etanol como extrayente, y entonces recoge el extracto líquido resultante (Etapa 1-1).
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Una concentración de etanol típica de la disolución acuosa de etanol usada en la Etapa 1-1 es 20 al 98 % en vol, preferentemente 45 al 95 % en vol, y más preferentemente 45 al 60 % en vol. Asegurando esta concentración de etanol, es posible extraer eficientemente equol de la sustancia que contiene equol.
La extracción en la Etapa 1-1 usa una disolución acuosa de etanol en una cantidad de, por ejemplo, 1 a 1000 partes en peso, preferentemente 2 a 500 partes en peso, más preferentemente 5 a 20 partes en peso, por parte en peso (peso seco) de la sustancia que contiene equol.
Las condiciones en la extracción en la Etapa 1-1 no están particularmente limitadas, y puede usarse un método de extracción por inmersión en caliente o frío, método de percolación o similares. Más específicamente, una disolución acuosa de etanol se añade a la sustancia que contiene equol, y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos un minuto a temperatura ambiente, más preferentemente 5 minutos a 48 horas a temperatura ambiente.
Después de tal extracción, el extracto líquido se aísla para obtener una fracción que contiene equol. La recogida del extracto líquido se realiza por un método públicamente conocido tal como filtración o centrifugación.
El extracto líquido así aislado en la Etapa 1-1 contiene una cantidad reducida de aceite en la sustancia que contiene equol, e isoflavona que incluye compuestos de gliciteína y saponina, además de equol.
El extracto líquido así obtenido en la Etapa 1-1 se somete a la siguiente Etapa 1-2.
Etapa 1-2
Después de eliminar el extrayente del extracto líquido obtenido en la Etapa 1-1, el residuo se somete a extracción usando etanol como extrayente, y el extracto líquido se aísla (Etapa 1-2).
En la Etapa 1-2, la eliminación del extrayente del extracto líquido obtenido en la Etapa 1-1, y otra extracción del residuo así obtenido usando un etanol, y la recogida del extracto líquido se llevan a cabo en las mismas condiciones que aquellas de la Etapa I-2 del Método de producción I en la sección "1. Método de producción para extracto que contiene equol".
El extracto líquido recogido en la Etapa 1-2 contiene una cantidad reducida de saponina, y contiene isoflavona que incluye compuestos de gliciteína, además de equol. El extracto líquido así obtenido en la Etapa 1-2 se somete a la siguiente Etapa 1-3.
Etapa 1-3
Después de eliminar el extrayente del extracto líquido obtenido en la Etapa 1-2, el residuo se suspende en hexano para aislar una materia insoluble (Etapa 1-3).
En la Etapa 1-3, la eliminación de extrayente del extracto líquido obtenido en la Etapa 1-2 puede realizarse por un método públicamente conocido tal como destilación a presión reducida, secado o similares.
El extrayente se elimina del extracto líquido obtenido en la Etapa 1-2, y se añade hexano al residuo (en lo sucesivo ocasionalmente denominado "segundo residuo de material") para suspender el residuo en hexano.
La extracción en la Etapa 1-3 usa hexano en una cantidad de 1 a 50 partes en peso, y más preferentemente 5-10 partes en peso, por parte en peso (peso seco) del segundo residuo de material.
Las condiciones para la extracción en la Etapa 1-3 no están particularmente limitadas. Por ejemplo, puede adoptarse un método de extracción por inmersión en caliente o frío. Más específicamente, se añade hexano al segundo residuo de material, y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente, preferentemente 3 minutos a una hora a temperatura ambiente.
Después de tal suspensión usando hexano, se extrae equol como una materia insoluble. Por tanto, recogiendo la materia insoluble, se obtiene un extracto que contiene equol. La recogida del residuo insoluble se realiza por un método públicamente conocido tal como filtración o centrifugación.
Mediante la Etapa 1-3, se eliminan impurezas solubles en lípido del extracto líquido obtenido en la Etapa 1-2. El residuo insoluble obtenido en la Etapa 1-3 se somete a la siguiente Etapa 1-4.
Etapa 1-4
La Etapa 1-4 comprende someter los residuos insolubles obtenidos en la Etapa 1-3 a extracción usando una disolución mixta de hexano y éter como extrayente, y recoger el extracto líquido resultante (Etapa 1-4).
El éter, como uno de los componentes del extrayente usado en la Etapa 1-4, no está particularmente especificado. Ejemplos del éter incluyen dimetil éter, metil etil éter y dietil éter, y pueden usarse individualmente o en combinación. Entre ellos, el dietil éter es particularmente preferido debido a su eficiencia de refino del equol.
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La relación de mezcla de la disolución mixta de hexano y éter usada en la Etapa 1-4 no está particularmente limitada; sin embargo, para obtener equol de pureza deseada, la relación de hexano con respecto a éter en volumen es 10:90 a 20:80, y preferentemente 30:70 a 25:75.
La extracción en la Etapa 1-4 usa la disolución mixta de hexano y éter en una cantidad de 50 a 5000 partes en peso, más preferentemente 200 a 1000 partes en peso, por parte en peso (peso seco) del residuo insoluble obtenido en la Etapa 1-3.
Las condiciones para la extracción en la Etapa 1-4 no están particularmente limitadas. Por ejemplo, puede adoptarse un método de extracción por inmersión en caliente o frío o método de percolación. Más específicamente, la disolución mixta de hexano y éter se añade a la materia insoluble obtenida en la Etapa 1-3, y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente, preferentemente 15 minutos a 30 horas a temperatura ambiente.
Después de tal extracción, el extracto líquido se aísla para obtener equol. La recogida del extracto líquido se realiza por un método públicamente conocido tal como filtración o centrifugación.
Etapa 1-5
El extracto líquido obtenido en la Etapa 1-4 se somete a cromatografía en gel de sílice para obtener una fracción que contiene equol (Etapa 1-5).
La Etapa 1-5 puede adoptar cualquier tipo de cromatografía en gel de sílice que usa columnas separadas que contienen cada uno gel de sílice como carga. Ejemplos de cromatografía en columna de gel de sílice incluyen cromatografía en columna abierta que causa un flujo de disolvente por caída por gravedad, cromatografía ultrarrápida que hace un flujo de disolvente usando una bomba y cromatografía de líquidos de alto rendimiento. La cromatografía en columna abierta y la cromatografía ultrarrápida son particularmente preferidas, ya que pueden ser fácilmente llevadas a cabo de una manera industrial. Cuando se lleva a cabo cromatografía en columna de gel de sílice, es preferible usar una disolución mixta de hexano y éter como fase móvil (disolvente de desarrollo) para mejorar adicionalmente el grado de refino del equol. El éter usado para la fase móvil no está limitado. Ejemplos del éter incluyen dimetil éter, metil éter y dietil éter, y pueden usarse únicamente o en combinación. Para mejorar el grado de refino del equol, el éter es preferentemente el mismo que el usado para la disolución mixta de hexano y éter en la Etapa 1-4. En la elución de equol usando cromatografía en columna de gel de sílice en la Etapa 1-5, es preferible usar una disolución mixta de hexano y éter idéntica en composición a la usada en la Etapa 1-4 como la fase móvil inicial, y la relación de éter aumenta gradualmente según el método de gradiente. Un aumento tal de la relación de éter en la fase móvil causa que el equol se separe de otras impurezas, junto con la fase móvil en la que el hexano y el éter se mezclan a 40:60 a 20:80, más preferentemente 30:70 a 25:50. A partir de aquí, la fracción que contiene equol que ha sido eluida por cromatografía en columna de gel de sílice se aísla para obtener equol altamente puro. Entonces, el extrayente se elimina de la fracción que contiene equol por un método públicamente conocido tal como destilación a presión reducida, secado o similares. Esto elimina la mayoría de las impurezas de la fracción, dejando así un equol sólido altamente puro.
2-2. Método de purificación 2
Etapa 2-1
El Método de purificación 2 lleva a cabo la extracción con respecto a una sustancia que contiene equol usando, como extrayente, un disolvente orgánico o un disolvente orgánico acuoso de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en acetato de etilo, alcohol, acetona, dioxano, acetonitrilo, dietil éter y tolueno, y luego concentra el extracto líquido (Etapa 2-1).
En la Etapa 2-1, el extrayente puede ser un disolvente orgánico de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en acetato de etilo, alcohol, acetona, dioxano, acetonitrilo, dietil éter y tolueno. Sin embargo, para garantizar la eficiente extracción del equol, es más preferible usar un disolvente orgánico acuoso que se obtenga añadiendo agua al disolvente orgánico anteriormente mencionado.
Ejemplos del alcohol usado como extrayente incluyen metanol, etanol, alcohol isopropílico y alcohol n-propílico.
Una concentración típica del disolvente orgánico acuoso es 80 al 99 % en vol, preferentemente 90 al 97 % en vol. Asegurando esta concentración, es posible obtener un extracto líquido con un alto contenido de equol.
Un extrayente preferible usado en la Etapa 2-1 es acetato de etilo acuoso.
Las condiciones de extracción no están particularmente limitadas, y puede usarse un método de extracción por inmersión en caliente o frío o similares. Más específicamente, se añade un extrayente a la sustancia que contiene equol, y la mezcla se deja reposar o se agita durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, más preferentemente durante 1 hora a 50 horas a temperatura ambiente.
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Las condiciones en la extracción de la Etapa 1-1 tampoco están particularmente limitadas, y puede usarse un método de extracción por inmersión en caliente o frío, método de percolación o similares.
Después de tal extracción, el equol sacado en el extracto líquido se aísla por un método de división sólido-líquido públicamente conocido tal como filtración o centrifugación. El extracto líquido obtenido se concentra entonces, por ejemplo, a presión reducida para obtener un concentrado de equol. El concentrado de equol así obtenido se somete a la siguiente Etapa 2-2.
Etapa 2-2
El concentrado de equol obtenido en la Etapa 2-1 se somete a cromatografía en columna de gel de sílice para obtener una fracción que contiene equol (Etapa 2-2).
En la Etapa 2-2, el concentrado de equol obtenido en la Etapa 2-1 puede ser directamente sometido a cromatografía en columna de gel de sílice.
Además, si la extracción en la Etapa 2-1 se lleva a cabo con un disolvente acuoso que contiene alcohol, se añade una cantidad equivalente de acetato de etilo y agua que es 5 a 10 veces en volumen el extracto líquido concentrado a este concentrado, y la fracción de acetato de etilo se separa y se concentra para ser sometida a cromatografía en columna. Esta cromatografía en columna en la Etapa 2-2 puede ser cualquier tipo de cromatografía que use columnas separadas que contienen cada una gel de sílice como carga. Ejemplos de cromatografía en columna de gel de sílice incluyen cromatografía en columna abierta que causa un flujo de disolvente por caída por gravedad, cromatografía ultrarrápida que hace un flujo de disolvente usando una bomba y cromatografía de líquidos de alto rendimiento. La cromatografía en columna abierta y la cromatografía ultrarrápida son particularmente preferidas, ya que pueden ser fácilmente llevadas a cabo de una manera industrial.
En la cromatografía en columna de gel de sílice en la Etapa 2-2, es preferible usar una disolución mixta de un disolución de etil éter o acetato de etilo (Disolución A, en lo sucesivo) y una disolución de n-hexano, éter de petróleo o n-heptano (Disolución B, en lo sucesivo) como fase móvil. La relación de Disolución B en la disolución mixta es 2 a 50 partes en volumen, más preferentemente 3 a 10 partes en volumen, por parte en el volumen de Disolución A.
El extracto líquido obtenido en la Etapa 2-1 es así sometido a cromatografía en columna de gel de sílice para aislar la fracción que contiene equol.
La fracción que contiene equol obtenido en la Etapa 2-2 se somete a la Etapa 2-3 Etapa 2-3
El disolvente se elimina de la fracción que contiene equol obtenida en la Etapa 2-2, y el residuo resultante se somete a recristalización. Entonces se aíslan los cristales precipitados (Etapa 2-3).
La eliminación de un disolvente de la fracción que contiene equol obtenida en la Etapa 2-2 puede realizarse por un método de eliminación de disolvente públicamente conocido, tal como concentración a presión reducida.
El disolvente usado para la recristalización en la Etapa 2-3 no está particularmente limitado, en tanto que pueda usarse para la recristalización de equol. Un disolvente típico es una disolución mixta de etanol y agua (disolución acuosa de etanol), acetato de etilo, una disolución mixta de acetato de etilo y hexano, o una disolución mixta de etanol y hexano. La disolución mixta de acetato de etilo y hexano y la disolución acuosa de etanol son particularmente preferibles. Más específicamente, la disolución mixta de acetato de etilo y hexano normalmente contiene acetato de etilo y hexano a una relación en volumen de 10:1 a 1:10. La concentración de etanol de la disolución acuosa de etanol usada para la recristalización normalmente es del 30 al 90 % en vol, preferentemente del 40 al 70 % en vol. Llevando a cabo la recristalización usando la disolución mixta de acetato de etilo y hexano o una disolución acuosa de etanol ajustada a la concentración anterior, se aumenta además la pureza del equol resultante.
La recristalización en la Etapa 2-3 puede llevarse a cabo usando un método general. Por ejemplo, un disolvente para la recristalización se añade al residuo que resultó de la eliminación del disolvente de la fracción que contiene equol obtenida en la Etapa 2-2, y el residuo se disuelve en el disolvente calentando. La disolución se enfría entonces para precipitar cristales de equol. Para facilitar además o acelerar la cristalización de equol, pueden inocularse semillas de cristales de equol en la muestra.
La condición de temperatura en la cristalización se determina según el punto de ebullición y el punto de congelación del disolvente. Generalmente, el residuo se disuelve a aproximadamente el punto de ebullición del disolvente, y los cristales precipitan a aproximadamente 0 a 25 °C.
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3. Material alimenticio
La presente invención proporciona además un material alimenticio en el que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto se dispersa en masa de cacao. Lo siguiente describe los detalles, tales como los ingredientes, del material alimenticio de la presente invención.
Hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y extracción del mismo
El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol usado para el material alimenticio de la presente invención es el mismo que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol descrito anteriormente en la sección "1. Método de producción para extracto que contiene equol". El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol puede usarse para el material alimenticio de la presente invención inmediatamente después de la fermentación, o después de secarse en un sólido seco según se requiera. Para mejorar la estabilidad durante la conservación del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, es más preferible solidificar el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol por secado por aire calentado o similares. El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol secado por aire puede ser adicionalmente procesado en polvo según se requiera.
El extracto del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol designa un extracto que contiene equol que resulta de la extracción con disolvente con respecto al hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El extracto del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol no está particularmente limitado; sin embargo, el extracto es preferentemente el extracto que contiene equol obtenido por el método descrito anteriormente en la sección "1. Método de producción para extracto que contiene equol", más preferentemente el extracto que contiene equol obtenido por el Método de producción I descrito anteriormente. El extracto del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol puede usarse en un estado líquido; sin embargo, es más preferible solidificar el extracto líquido eliminando el extrayente.
El material alimenticio de la presente invención puede contener ya sea el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o el extracto del mismo; sin embargo, se prefiere nutricionalmente el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Masa de cacao
La masa de cacao es un material alimenticio principalmente usado como un ingrediente del chocolate. La masa de cacao se obtiene por el procesamiento de judías de cacao con fermentación, torrefacción y molienda. La masa de cacao usada como material alimenticio de la presente invención no está particularmente limitada, en tanto que esté autorizada su seguridad como material alimenticio.
Proporción de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo y masa de cacao
En el material alimenticio de la presente invención, la proporción del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo y masa de cacao no está limitada; sin embargo, con el fin de mejorar el aroma del alimento más preferentemente, la proporción de masa de cacao es generalmente 10 a 2000 partes en peso (peso seco), preferentemente 20 a 900 partes en peso, más preferentemente 20 a 400 partes en peso, basado en 100 partes en peso del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo. Particularmente, si se usa el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, la proporción de masa de cacao es generalmente 100 a 2000 partes en peso (peso seco), preferentemente 200 a 900 partes en peso, y más preferentemente 200 a 400 partes en peso, basado en 100 partes en peso del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo.
El material alimenticio de la presente invención puede consistir solo del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo y masa de cacao, pero también puede contener otros ingredientes como se detalla más adelante. La proporción en suma del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo y la masa de cacao es del 40 al 100 % en peso, preferentemente 60 al 95 % en peso, y más preferentemente 70 al 95 % en peso, basado en la cantidad en bruto del material alimenticio de la presente invención. Ajustando así la proporción de los ingredientes, puede expresarse eficazmente la bioactividad útil derivada del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, y el alimento tendrá un buen aroma.
Ingredientes arbitrarios
En tanto que no se alteren los efectos de la invención, el material alimenticio de la presente invención puede contener diversos ingredientes, además de (a) el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo, y (b) la masa de cacao.
Ejemplos de ingredientes adecuados para el material alimenticio de la presente invención incluyen edulcorantes tales como azúcar, trehalosa, acesulfamo K, xilitol, sucralosa, eritritol, aspartamo y jarabe de almidón; aceites y grasas tales como manteca de cacao o aceites vegetales; emulsionantes tales como lecitina de soja; perfume; preparaciones de perfume; leche; y agua.
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Forma del material alimenticio
La forma del material alimenticio de la presente invención no está particularmente limitada, y puede ser una forma de polvo, gránulo, viruta, o lámina, dependiendo de la forma del producto objetivo del alimento. Para hacer buen uso de la característica de textura del material alimenticio de la presente invención en el producto, el material alimenticio se procesa preferentemente en forma de un gránulo o una viruta, particularmente preferentemente un gránulo o una viruta de aproximadamente 30 a 1000 mg por trozo.
Método de producción para material alimenticio de la presente invención
El material alimenticio de la presente invención se prepara mezclando el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo, masa de cacao, y otros ingredientes necesarios a una temperatura donde se disuelve la manteca de cacao en la masa de cacao (preferentemente 30 a 50 °C), y luego enfriando y solidificando la mezcla. Como resultado, se prepara el material alimenticio de la presente invención en el que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se dispersa en la masa de cacao. Según se requiera, el material alimenticio de la presente invención se somete a pulverización, trituración, tamizado o similares para ser formado en una forma deseada. Alternativamente, el material alimenticio de la presente invención puede moldearse usando granulación por extrusión durante la producción.
Uso de material alimenticio
El material alimenticio de la presente invención puede incorporarse en diversos tipos de alimentos, como un material de partida de un alimento que contiene equol, o como un aditivo alimentario. La presente invención también proporciona tales alimentos que contienen equol preparados a partir del material alimenticio anteriormente descrito.
El alimento que contiene equol de la presente invención no está particularmente limitado, e incluye dulces horneados y postre congelados.
Ejemplos de los dulces horneados incluyen diversos galletas de arroz glutinoso; galletas de arroz tales como obleas o gofres; galletitas; galletas; galletas de soda; pasteles; tartas; donuts; y pan. Ejemplos de los postres congelados incluyen helado, granizado y polos de hielo.
Entre ellos, los dulces horneados son una de las formas adecuadas de alimento que contiene equol. Particularmente, un dulce horneado hecho de polvo de soja contiene no solo equol, sino también otros componentes útiles derivados de la soja; por tanto, el dulce horneado es altamente útil, proporcionando un efecto de mantenimiento de la salud superior.
Un ejemplo preferido del dulce horneado hecho de polvo de soja contiene polvo de soja, huevo y mantequilla, pero no trigo. El polvo de soja que va a usarse para este tipo de galleta se procesa preferentemente calentando o similares para desactivar o disminuir las lipoxigenasas y para eliminar o reducir el olor de la soja. Un dulce horneado tal puede producirse, por ejemplo, usando 0 a 35 partes en peso de huevo, 10 a 65 partes en peso de mantequilla, 0,1 a 50 partes en peso del material alimenticio de la presente invención, y otros ingredientes, por 100 partes en peso de polvo de soja. Estos ingredientes se mezclan con una cantidad apropiada de agua para preparar la masa. La masa se forma entonces en una forma predeterminada, y se hornea a aproximadamente 60 a 250 °C durante 2 a 60 minutos.
La proporción del material alimenticio de la presente invención en el alimento que contiene equol no está particularmente limitada, y se ajusta dependiendo del contenido de equol en el material alimenticio de la presente invención, la forma del alimento que contiene equol o similares. La proporción del material alimenticio de la presente invención es generalmente 3 al 30 % en peso, preferentemente 5 al 20 % en peso, y más preferentemente 5 al 8 % en peso, basado en la cantidad total de los materiales del alimento que contiene equol.
Además, la proporción de equol en el alimento que contiene equol es generalmente 0,002 al 0,1 % en peso, preferentemente 0,004 al 0,05 % en peso, y más preferentemente 0,005 al 0,03 % en peso, basado en la cantidad total de los materiales del alimento que contiene equol. Asegurando esta proporción del material alimenticio de la presente invención, la bioactividad útil derivada del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se expresa en el alimento, mientras que se mantiene el buen aroma del alimento que contiene equol.
El alimento que contiene equol se produce mezclando el material alimenticio de la presente invención con una cantidad predeterminada de los otros ingredientes, y sometiendo la mezcla a formación, horneado, enfriamiento, etc., dependiendo de la forma objetivo del producto alimenticio. El alimento que contiene equol se prepara a partir de un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, y contiene diversos materiales de bioactividad útiles que incluyen equol, expresando así diversas bioactividades o actividades farmacológicas. Por tanto, el alimento que contiene equol es útil no solo como alimento general, sino también como alimento para uso de salud especificado, complemento nutricional, alimento funcional, alimento sin valor o similares. El alimento que contiene el hipocótilo de soja fermentado es particularmente útil como producto nutracéutico.
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Por ejemplo, el alimento que contiene equol tiene un efecto para prevenir o tratar diversas enfermedades o síntomas que incluyen trastornos menopáusicos, osteoporosis, hipertrofia prostética y síndrome metabólico; o para la reducción del nivel de colesterol en sangre, blanqueamiento de la piel, granos, control intestinal, obesidad y diuresis. Particularmente, el alimento que contiene equol es adecuado para la prevención o el tratamiento de dolencia indeterminada o síntomas posmenopáusicos (por ejemplo, osteoporosis, trastorno menopáusico) de mujeres de mediana edad.
El consumo del alimento que contiene equol por día se determina dependiendo del contenido de equol en el alimento, edad, peso, síntoma del consumidor, o el número de dosis.
4. Alimentos de diversas formas
La presente invención proporciona además diversas formas de alimento que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol. Ejemplos de los alimentos de la presente invención incluyen bebidas, complementos dietéticos, alimentos cremosos, postres, dulces, aliños, alimentos envasados en retorta, productos de carne procesados, pastas de pescado, productos de huevo procesados, alimentos enlatados, panes, postres congelados, alimentos de soja procesados, productos de arroz cocinado y sopa.
Lo siguiente explica en detalle el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y cada forma de alimento proporcionado por la presente invención.
Hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y extracto del mismo
El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol usado para la presente invención es el mismo que el usado en la sección "3. Material alimenticio".
El alimento de la presente invención puede contener cualquiera de los puntos de la lista anterior de hipocótilos de soja fermentados que contienen equol.
Formas de alimento
El hipocótilo de soja fermentado que contiene equol es eficaz en prevenir o tratar diversas enfermedades o síntomas que incluyen trastornos menopáusicos, osteoporosis, hipertrofia prostática y síndrome metabólico; o para la reducción del nivel de colesterol en sangre, blanqueamiento de la piel, granos, control intestinal, obesidad y diuresis. Particularmente, el alimento que contiene equol es adecuado para la prevención o el tratamiento de dolencias indeterminadas o síntomas posmenopáusicos (por ejemplo, osteoporosis, trastornos menopáusicos) de mujeres de mediana edad. Por consiguiente, las diversas formas de alimento de la presente invención pueden proporcionarse en alimentos funcionales eficaces para aquellas enfermedades o síntomas. Más específicamente, el alimento de la presente invención que contiene hipocótilo de soja fermentado no solo es útil como un alimento general, sino también útil como un alimento para uso de salud especificada, un complemento nutricional, un alimento funcional, un alimento dietética sin valor o similares. El alimento de la presente invención que contiene hipocótilo de soja fermentado es particularmente útil como complemento nutricional.
Lo siguiente explica ejemplos específicos de las formas de alimento de la presente invención.
(1) Bebida
La presente invención proporciona una bebida que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
La bebida de la presente invención puede ser cualquier tipo de bebida; sin embargo, es adecuado para bebidas que contienen zumo de frutas; bebidas que contienen zumo de verduras; bebidas carbonatadas tales como agua con gas, refresco de cola, una bebida carbonatada que contiene zumo de frutas, ginger ale, soda; refrescos tales como una bebida isotónica; bebidas de café tales como café o café con leche; tés tales como té de estilo inglés, té verde o té oolong; cacao; bebidas de bacterias de ácido láctico; bebidas de leche tales como leche de vaca, leche aromatizada con frutas, o bebidas de leche agria; bebidas alcohólicas tales como cerveza, shochu (bebida destilada), whisky, cócteles o shochu mezclado con soda.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada bebida de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado o extracto del mismo, el tipo de bebida, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en la bebida es generalmente 0,02 al 15% en peso, preferentemente 0,1 al 1 % en peso, y más preferentemente 0,2 a 0,5 % en peso (peso seco).
(2) Complemento dietético
La presente invención proporciona un complemento dietético que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
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La forma del complemento dietético de la presente invención no está limitada, e incluye una cápsula blanda, un comprimido, polvo o similares, entre los que una cápsula blanda es particularmente preferida. La cápsula blanda o polvo está preferentemente contenido en una cápsula en una cantidad predeterminada.
Una de las realizaciones adecuadas de la cápsula blanda de la presente invención es una cápsula blanda que contiene gelatina, agua y glicerina que tiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol. La cápsula blanda puede contener además otros aditivos tales como aceite de soja, cera de abeja, lecitina o p-carotina.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada complemento dietético de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de complemento, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado o extracto del mismo en el complemento dietético es 2 al 100 % en peso (peso seco).
(3) Alimento cremoso
La presente invención proporciona un alimento cremoso que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo.
El alimento cremoso de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir nata montada, natillas, crema de mantequilla, nata fresca y crema para el café.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada alimento cremoso de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado el tipo de alimento cremoso, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el alimento cremoso es generalmente del 0,03 al 5 % en peso, preferentemente del 0,15 al 1 % en peso, y más preferentemente del 0,3 al 0,5 % en peso (peso seco).
(4) Postre
La presente invención proporciona un postre que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El postre no está particularmente limitado y puede incluir yogurt, gelatina, pudín, mousse o similares.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada postre de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado el tipo de postre, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el postre es generalmente del 0,03 al 5 % en peso, preferentemente del 0,15 al 1 % en peso, y más preferentemente del 0,3 al 0,5 % en peso (peso seco).
(5) Tentempié
La presente invención proporciona un tentempié que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El tentempié no está particularmente limitado y puede incluir cualquier dulce occidental o japonés que incluye dulces horneados o al vapor. Ejemplos del tentempié de la presente invención incluyen dulces, chupa-chups, caramelos, pretzel, pastillas, gomas, chocolates, galletas, dulces de judía, oblea, galletas de queso, gominolas, galletas de arroz habituales y Suhama (dulce tradicional japonés), dulces secos y Yokan (gelatina de judía azuki), bollo de mermelada de judía al vapor, bollos de almidón de helecho, bizcochos, rellenos de pastel de manzana, tentempié salados y galletas de arroz glutinoso. Entre ellos, una de las realizaciones adecuadas del tentempié es un dulce horneado que contiene harina de soja.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada tentempié de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado o extracto del mismo, el tipo de tentempié, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el tentempié es generalmente del 0,01 al 99 % en peso, preferentemente 0,04 al 36 % en peso, y más preferentemente 0,08 al 18 % en peso (peso seco).
(6) Aliños
La presente invención proporciona un aliño que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El aliño no está particularmente limitado y puede incluir salsa barbacoa, salsa para Kabayaki (marisco asado), aliño de calamares chinmi, ketchup, tsuyu (sopa), aderezo, salsa de sésamo, aliños para tentempiés y salsa de soja.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada aliño de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de aliño, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el aliño es generalmente del 0,04 al 40 % en peso, preferentemente 0,2 al 8 % en peso, y más preferentemente 0,4 al 4 % en peso (peso seco).
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(7) Alimento envasado en retorta
La presente invención proporciona un alimento envasado en retorta (alimento en bolsa de retorta) que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El alimento envasado en retorta no está particularmente limitado y puede incluir diversos materiales de aliño que incluyen una premezcla de salsa para salsa de curry, salsa de arroz guisado, guiso, salsa de carne o salsa blanca; una premezcla para donburi de estilo chino, donburi de ternera y donburi de pollo y huevo; una premezcla para Ma- po Dou-fu (tofú con salsa basada en chile y judía), y una premezcla para Kamameshi (un plato de arroz japonés cocinado con diversos tipos de carne, marisco y verduras).
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada alimento envasado en retorta de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de alimento envasado en retorta, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en alimento envasado en retorta es generalmente del 0,003 al 4 % en peso, preferentemente 0,01 al 0,8 % en peso, y más preferentemente 0,03 al 0,4 % en peso (peso seco).
(8) Producto de carne procesada
La presente invención proporciona un producto de carne procesada que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El producto de carne procesada de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir salchichas (secas, semi-secas, de Bolonia, vienesas, ahumadas), pasta de hígado, beicon, tocino de paleta, jamón, filete para hamburguesa y albóndigas.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada producto de carne procesada de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de producto de carne procesada, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el producto de carne procesada es generalmente del 0,02 al 0,4 % en peso, preferentemente 0,1 al 0,8 % en peso, y más preferentemente 0,2 al 0,4 % en peso (peso seco).
(9) Producto de pasta de pescado
La presente invención proporciona un producto de pasta de pescado que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El producto de pasta de pescado de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir pasta de pescado cocido y tubos de pastel de pescado.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada producto de pasta de pescado de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de producto de pasta de pescado, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el producto de pasta de pescado es generalmente del 0,03 al 5 % en peso, preferentemente 0,1 al 1 % en peso, y más preferentemente 0,3 al 0,5 % en peso (peso seco).
(10) Producto de huevo procesado
La presente invención proporciona un producto de huevo procesado que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El producto de huevo procesado de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir tortilla enrollada japonesa, tortilla japonesa gruesa, tortilla al estilo occidental y huevos revueltos.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada producto de huevo procesado de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de producto de huevo procesado, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el producto de huevo procesado es generalmente del 0,03 al 5 % en peso, preferentemente 0,1 al 1 % en peso, y más preferentemente 0,3 al 0,5 % en peso (peso seco).
(11) Alimento enlatado
La presente invención proporciona un alimento enlatado que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El alimento enlatado de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir fruta enlatada tal como naranjas enlatadas o melocotones enlatados; marisco enlatado tal como atún enlatado o sardinas enlatadas; mermelada enlatada; sopa enlatada; y salsa enlatada.
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El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada alimento enlatado de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de alimento enlatado, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el alimento enlatado es generalmente del 0,03 al 5 % en peso, preferentemente 0,1 al 1 % en peso, y más preferentemente 0,3 al 0,5 % en peso (peso seco).
(12) Pan
La presente invención proporciona pan que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El pan de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir una hogaza de pan, pan francés, pan relleno, pan de melón, pan de mermelada de judías, pan de crema, pan de mermelada, panecillos y croissants.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada pan de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de pan, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el pan es generalmente del 0,01 al 50 % en peso, preferentemente 0,05 al 0,6 % en peso, y más preferentemente 0,1 al 0,3 % en peso (peso seco).
(13) Postre congelado
La presente invención proporciona un postre congelado que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El pan de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir helado y sorbete.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada postre congelado de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de postre congelado, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en el postre congelado es generalmente del 0,03 al 5 % en peso, preferentemente 0,1 al 1 % en peso, y más preferentemente 0,3 al 0,5 % en peso (peso seco).
(14) Alimento de soja procesado
La presente invención proporciona un alimento de soja procesado que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
El alimento de soja procesado de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir tofú, tofú frito grueso, tofú a la plancha mezclado con verduras, piel de leche de soja, sojas fermentadas y leche de soja.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada alimento de soja procesado de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de alimento de soja procesado, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del
hipocótilo de soja fermentado en el alimento de soja procesado es generalmente del 0,03 al 0,5 % en peso,
preferentemente 0,1-1 % en peso, y más preferentemente 0,3-0,5 % en peso (peso seco).
(15) Producto de arroz cocinado
La presente invención proporciona un producto de arroz cocinado que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol. El producto de arroz cocinado de la presente invención no está particularmente limitado y puede incluir arroz frito, pilaf, gruel de arroz, arroz glutinoso al vapor con castaña, arroz blanco cocinado, arroz con alubias rojas y arroz al vapor con carne y verduras.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada producto de arroz cocinado de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de producto de arroz cocinado, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del
hipocótilo de soja fermentado en el producto de arroz cocinado es generalmente del 0,01 al 2,5% en peso,
preferentemente 0,02 al 0,5 % en peso, y más preferentemente 0,04 al 0,25 % en peso (peso seco).
(16) Sopa
La presente invención proporciona sopa que contiene el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
La sopa de la presente invención no está particularmente limitada y puede incluir sopa de crema de maíz, consomé, minestrone, sopa de cebolla y potaje.
El contenido del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en cada sopa de la presente invención no está limitado, y se determina individualmente según el contenido de equol en el hipocótilo de soja fermentado, el tipo de sopa, el efecto esperado o similares. Por ejemplo, el contenido del hipocótilo de soja fermentado en la sopa es
generalmente del 0,02 al 15 % en peso, preferentemente 0,1 al 1 % en peso, y más preferentemente 0,2 al 0,5 % en peso (peso seco).
Ejemplos
Lo siguiente explica más específicamente la presente invención con referencia a ejemplos de referencia, ejemplos 5 etc. La presente invención no está limitada, sin embargo, a estos ejemplos.
Ejemplos de referencia 1-1 a 1-3
Producción de hipocótilo de soia fermentado que contiene equol
Se mezclaron polvo de hipocótilo de soja, arginina y agua para preparar una disolución de hipocótilo de soja (material) que tenía una composición como se muestra en la Tabla 1. Se inoculó una cepa de Lactococcus 20-92 10 (FERM BP-10036) en esta disolución de hipocótilo de soja de 5 ml, y la muestra se sometió a cultivo estacionario durante 96 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. Después de eso, la disolución de fermentación resultante (disolución de cultivo) se esterilizó calentando durante un minuto a 100 °C, seguido de secado a 80 °C. El producto secado se procesó en un polvo usando un homogeneizador para obtener polvo de hipocótilo de soja fermentado.
La Tabla 1 muestra el número de células viables y el pH del cultivo después de 96 horas de cultivo, la cantidad de 15 polvo de hipocótilo de soja fermentado recogido y el contenido de equol del polvo de hipocótilo de soja fermentado. A partir de los datos, se muestra que la fermentación de polvo de hipocótilo de soja usando bacterias productoras de equol produce equol con alta eficiencia.
Tabla 1
Ej. de ref. 1-1 Ej. de ref. 1-2 Ej. de ref. 1-3
Polvo de hipocótilo de soja (peso seco) 0,25 g 0,5 g 0,75 g
Composición de disolución de hipocótilo de soja (material)
Arginina 0,005 g 0,005 g 0,005 g
Agua
Cantidad apropiada Cantidad apropiada Cantidad apropiada
Cantidad total 5 ml 5 ml 5 ml
pH 6,75 ± 0,03 6,54 ± 0,02 6,39 ± 0,03
Resultado analítico del líquido fermentado
Número de bacterias viables de líquido fermentado (log ufc/ml) 7,9 ± 0,1 8,2 ± 0,1 8,3 ± 0,2
pH del líquido fermentado 7,00 ± 0,03 6,88 ± 0,01 6,76 ± 0,02
Equol 3,85 mg (-) 3,44 mg (-) 5,38 mg (48,9 % en peso)
Análisis de la composición de polvo de hipocótilo de soja fermentado en términos de isoflavona
Compuestos de daidzeína n. d. (-) n. d. 1,18 mg (10,7 % en peso)
Compuestos de genisteína
n. d. (-) n. d. 1,45 mg (13,2 % en peso)
Compuestos de gliciteína n. d. (-) n. d. 3,00 mg (27,2 % en peso)
20 Cada ejemplo se realizó usando tres lotes de polvo de hipocótilo de soja (N=3). En el análisis de la composición de isoflavonas en la tabla, el valor a la izquierda indica un contenido (mg) de cada isoflavona por gramo del hipocótilo de soja fermentado, y el valor en el paréntesis a la derecha indica la relación (% en peso) de cada isoflavona con respecto a la cantidad de isoflavona en bruto (100 % en peso) en el hipocótilo de soja fermentado. "n.d." indica que la medición no se hace, y "-" en el paréntesis indica que el cálculo no se hace.
Ejemplo de referencia 1-4
Producción de hipocótilo de soia fermentado que contiene equol
Se inoculó una cepa de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) a una disolución de 5 ml de hipocótilo de soja que contenía 10% en polvo de polvo de hipocótilo de soja y 0,1 % en peso de arginina, y la muestra se sometió a 5 fermentación llevando a cabo cultivo estacionario durante 96 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. Después de eso, la disolución de fermentación resultante (disolución de cultivo) se esterilizó calentando durante un minuto a 100 °C, seguido de secado a 80 °C. El producto secado se procesó en polvo usando un homogeneizador para obtener polvo de hipocótilo de soja fermentado.
Se analizaron los componentes respectivos del polvo de hipocótilo de soja ("Pre-fermentación" en la Tabla 2 y Tabla 10 3) y del polvo de hipocótilo de soja fermentado ("Pos-fermentación" en la Tabla 2 y Tabla 3). La Tabla 2 muestra un
análisis con respecto a la isoflavona de soja, y la Tabla 3 muestra un análisis con respecto a los componentes nutricionales. Estas tablas muestran que el hipocótilo de soja fermentado obtenido por la fermentación de hipocótilo de soja usando una cepa de Lactococcus 20-92 tiene un alto contenido de equol. Además, el contenido de oligosacáridos para oligosacáridos tales como rafinosa o estaquiosa sigue sustancialmente igual después de la 15 fermentación, que indica que la fermentación no influyó en el contenido de oligosacáridos. Mientras tanto, las tablas muestran que la arginina se convirtió en ornitina por la fermentación. Por consiguiente, añadiendo arginina al hipocótilo de soja antes de la fermentación usando una cepa de Lactococcus 20-92, la sustancia fermentada resultante no solo contiene equol, sino también ornitina.
Tabla 2
Isoflavonas de soja Por 100 g
Componente
Pre-fermentación Pos-fermentación
Equol
N.D. 632,0 mg
Daidzina
566,4 mg 29,7 mg
Malonildaidzina
124,9 mg N.D.
Acetildaidzina
364,8 mg 25,4 mg
Daidzeína
7,1 mg 24,4 mg
Dihidrodaidzeína
N.D. 49,4 mg
Genistina
111,7 mg 3,2 mg
Malonilgenistina
35,1 mg, N.D.
Acetilgenistina
146,1 mg 3,7 mg
Genisteína
0,9 mg 22,5 mg
Dihidrogenisteína
N.D. 112,0 mg
Glicitina
331,7 mg 53,6 mg
Malonilglicitina
65,0 mg N.D.
Acetilglicitina
169,2 mg 34,8 mg
Gliciteína
19,1 mg 292,3 mg
Dihidrogliciteína
N.D. 8,2 mg
Isoflavonas totales
1942,0 mg 1291,2 mg
N.D. se refiere a "No detectado"
Componente nutricional
Por 100 g
Componente
Pre-fermentación Pos-fermentación
Humedad
3,2 g 6,2 g
Proteína
38,1 g 38,3 g
Grasa
13,0 g 14,5 g
Ceniza
4,3 g 4,0 g
Sacárido
30,9 g 26,8 g
Fibra dietética
10,5 g 10,2 g
Energía
414 kcal 411 kcal
Sacarosa
7,95 g 7,42 g
Rafinosa
1,37 g 1,34 g
Estaquiosa
9,04 g 8,38 g
Ácidos grasos trans
N.D. N.D.
Fosfolípidos (como estearol y lecitina)
3,33 g 2,92 g
Arginina libre
881 mg 12 mg
Ornitina libre
N.D. 1,06 g
Sapogenol de soja A
N.D. N.D.
Sapogenol de soja B
N.D. N.D.
Saponina de soja
3,6 g 3,8 g
N.D. se refiere a "No detectado"
Ejemplos de referencia 1-5 a 1-11
Producción de hipocótilo de soia fermentado que contiene equol
5 En estos ejemplos, se produjo polvo de hipocótilo de soja fermentado (Ejemplos de referencia 1-5 a 1-11) del mismo modo que en los Ejemplos de referencia 1-3, excepto que se usaron siete lotes de polvo de hipocótilo de soja diferentes de los tres lotes del Ejemplo de referencia 1-3. Las composiciones de isoflavona en el hipocótilo de soja fermentado obtenido se analizaron como se muestra en la Tabla 4. Este resultado también muestra que cada uno de los hipocótilos de soja fermentados de los Ejemplos de referencia 1-5 a 1-11 tiene un alto contenido de equol con 10 proporción de isoflavonas que no se logró por ninguna técnica conocida.
Tabla 4
Proporciones de isoflavonas
Equol
Compuestos de daidzeína Compuestos de genisteína Compuestos de gliciteína
Ej. de ref. 1-5
6,51 mg (62,2 % en peso) 0,71 mg (6,8 % en peso) 0,53 mg (5,1 % en peso) 2,71 mg (25,9 % en peso)
Ej. de ref. 1-6
6,25 mg (61,3 % en peso) 0,48 mg (4,7 % en peso) 0,35 mg (3,4 % en peso) 3,12 mg (30,6 % en peso)
Ej. de ref. 1-7
5,38 mg (48,9 % en peso) 1,18 mg (10,7 % en peso) 1,45 mg (13,2 % en peso) 3,00 mg (27,2 % en peso)
5
10
15
20
25
30
35
40
Proporciones de isoflavonas
Equol
Compuestos de daidzeína Compuestos de genisteína Compuestos de gliciteína
Ej. de ref. 1-8
6,43 mg (63,4 % en peso) 0,61 mg (6,0 % en peso) 0,48 mg (4,7 % en peso) 2,62 mg (25,8 % en peso)
Ej. de ref. 1-9
6,05 mg (64,2 % en peso) 0,51 mg (5,4 % en peso) 0,30 mg (3,2 % en peso) 2,57 mg (27,3 % en peso)
Ej. de ref. 1-10
6,11 mg (65,6 % en peso) 0,37 mg (4,0 % en peso) 0,10 mg (1,1 % en peso) 2,74 mg (29,4 % en peso)
Ej. de ref. 1-11
6,3 mg (60,9 % en peso) 0,49 mg (4,73 % en peso) 0,37 mg (3,6 % en peso) 3,19 mg (30,8 % en peso)
El valor de la columna superior indica un contenido (mg) de cada isoflavona por gramo del hipocótilo de soja fermentado, y el valor en la columna inferior indica la relación (% en peso) de cada isoflavona con respecto a la cantidad de isoflavonas en bruto (100 % en peso) en el hipocótilo de soja fermentado.
Ejemplo 1 de experimento de referencia
Prueba de confirmación de alérgenos
Se sabe que el hipocótilo de soja contiene alérgenos que incluyen Gym4, Gm30K, Gm28K, mezcla de 7S globulina (p-conglicina), oleosina e inhibidores de tripsina. Se examinó la existencia de alérgenos en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol producido en el Ejemplo de referencia 1-1 usando la siguiente prueba.
Primero, se añadió una cantidad apropiada del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol obtenido en el Ejemplo de referencia 1-1 a un tampón de extracción (Tris HCl, pH 7,5, que contiene EDTA 1 M y una cantidad apropiada de inhibidor de la proteasa). La muestra se agitó bien para extraer un componente soluble en agua. La disolución resultante se filtró para eliminar el contenido de sólidos para obtener un extracto líquido. Todas las proteínas contenidas en este extracto líquido se detectaron usando un sistema de ensayo de proteínas (Bio-Rad). Además, se detectaron los principales alérgenos (Gym4, Gm30K, Gm28K, mezcla de 7S globulina, oleosina e inhibidor de tripsina) contenidos en el extracto líquido usando transferencia Western. Además, para comparación, la detección de proteína total y alérgeno se llevó a cabo del mismo modo usando polvo de cotiledón de soja y polvo de hipocótilo de soja, en lugar del hipocótilo de soja fermentado.
Las FIG. 1 a 3 muestran el resultado. La FIG. 1 muestra el resultado para la detección de proteína total; la FIG. 2 muestra el resultado para la detección de Gym4, Gm30K y Gm28K; y la FIG. 3 muestra el resultado para la detección de mezcla de 7S globulina, oleosina e inhibidor de tripsina.
Estos resultados muestran que el contenido del principal alérgeno de una soja o un hipocótilo de soja se reduce en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
Ejemplo 1: Producción de extracto que contiene equol
Ejemplo 1-1: Producción de extracto que contiene equol por el Método de producción I
Se añadió un gramo del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol producido en las mismas condiciones que en los Ejemplos de referencia 1 a 3 a 20 ml del extrayente según la Tabla 5; y se realizaron 120 minutos de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, el residuo ("Residuo 1", en lo sucesivo) se retiró por centrifugación para aislar un extracto líquido ("Extracto líquido 1-1", en lo sucesivo). A continuación, el Extracto líquido 1-1 se evaporó a sequedad usando un evaporador, se añadieron 5 ml de etanol al mismo, y se realizaron 10 minutos de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, el residuo ("Residuo 2", en lo sucesivo) se retiró por centrifugación para aislar un extracto líquido ("Extracto líquido 1-2", en lo sucesivo). El Extracto líquido 1-2 se evaporó entonces a sequedad usando un evaporador para obtener un extracto sólido.
Además, se añadieron otros 20 ml de extrayente de la misma composición al Residuo 1, y se realizaron 120 minutos de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, el residuo se retiró por centrifugación para aislar un extracto líquido (Extracto líquido 2-1, en lo sucesivo). El Extracto líquido 2-1 se evaporó entonces a sequedad usando un evaporador. Se añadieron 5 ml de etanol al mismo, y se realizaron 10 minutos de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, el residuo se retiró por centrifugación para aislar un extracto ("Extracto líquido 2-2", en lo sucesivo). El Extracto líquido 2-2 se evaporó a sequedad usando un evaporador para obtener un extracto sólido.
Nombre del extrayente
Composición del extrayente
25Et
Disolución de etanol que contiene 25 % en vol de etanol y 75 % en vol de agua purificada
50Et
Disolución de etanol que contiene 50 % en vol de etanol y 50 % en vol de agua purificada
75Et
Disolución de etanol que contiene 75 % en vol de etanol y 25 % en vol de agua purificada
100Et
100 % en vol de etanol
Se sometieron los Extractos líquidos 1-1 y 1-2, Extractos líquidos 2-1 y 2-2 y el Residuo 2 a análisis de cromatografía en capa fina (CCF) (como fase móvil se usó hexano: cloroformo: acetato de etilo =1:1:1 (relación en volumen) para la detección de equol; y se usó acetato de etilo:propanol:cloroformo:metanol:0,9 % de KCl=25:25:25:10:9 (relación
5 en volumen) para la detección de saponina) para medir el contenido de saponina y el contenido de equol. Se midieron el peso del extracto sólido obtenido del Extracto líquido 1-2 y su concentración de equol. Las FIGS. 4 a 7 y la Tabla 6 muestran los resultados. La FIG. 4 muestra los resultados del análisis por CCF de los contenidos de equol en los Extractos líquidos 1-2 y 2-2; la FIG. 5 muestra los resultados del análisis por CCF de los contenidos de saponina en los Extractos líquidos 1-2 y 2-2; la FIG. 6 muestra los resultados del análisis por CCF de los contenidos 10 de equol en el Extracto líquido 1-2 y el Residuo 2; y la FIG. 7 muestra los resultados del análisis por CCF de los contenidos de saponina en el Extracto líquido 1-2 y el Residuo 2.
Según las figuras, se encontró que cuando el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se sometió a extracción usando etanol, el extracto contuvo una gran cantidad de aceite, y la tasa de recuperación de equol fue baja.
15 A diferencia, cuando el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se sometió a extracción usando un etanol acuoso, se suprimió la inclusión de aceite, y aumentó la tasa de recuperación de equol. Particularmente, fue evidente que el usar una disolución acuosa de etanol que tiene una concentración de etanol del 75 % en vol aumenta significativamente la tasa de recogida de equol. Además, también se encontró que la extracción usando un etanol al 75 % en vol minimiza la extracción de componentes de grasa. Además, según el hecho de que se detectó 20 la saponina en una cantidad concentrada en el Residuo 2, la saponina puede eliminarse sin reducir la cantidad de equol sometiendo el residuo, que se obtuvo eliminando disolvente del Extracto líquido 1-1, a extracción usando etanol.
Tabla 6
Hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL Extracto sólido recogido del Extracto líquido 1-2
Tipo de extracto
Cantidad usada para la extracción (g) Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Peso seco (mg) Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Tasa de recogida de EQL (%) Tasa de concentración de EQL
25Et
1 5,38 0,54 43 1,78 4,14 33,1 7,7
50Et
1 5,38 0,54 36 2,68 7,44 49,8 13,8
75Et
1 5,38 0,54 121 5,56 4,60 103,4 8,5
100Et
1 5,38 0,54 146 1,50 1,03 27,9 1,9
EQL representa equol. La "tasa de concentración" representa la tasa de concentración de EQL del extracto sólido cuando se supone que la concentración de EQL en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL es 1.
Ejemplo 1-2
Producción de extracto que contiene equol por el Método de producción I
5 En este ejemplo, se produjo polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en las mismas condiciones que en el Ejemplo de referencia 1-3, excepto que se usó un lote diferente de polvo de hipocótilo de soja.
Se añadieron 30 g del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol a 150 ml de una disolución acuosa al 70 % en vol de etanol (100 ml que consisten en etanol y 30 ml de agua) o 150 ml de una disolución acuosa al 90 % en vol de etanol (100 ml que consisten en etanol y 10 ml de agua); y se realizaron ocho horas de agitación a 10 temperatura ambiente. Después de retirar el residuo por filtración, el residuo se lavó con 20 ml de disolución acuosa de etanol que tenía la misma composición que la del extrayente. El filtrado y el líquido después de lavar se recogieron para obtener un extracto líquido. El extracto líquido se concentró a presión reducida para obtener un extracto sólido.
Se midieron el peso del extracto sólido obtenido y el peso de equol contenido en él, y las concentraciones de 15 daidzeína, dihidrodaidzeína, genisteína, dihidrogenisteína, glisteína, dihidroglisteína, como se muestra en las Tablas 7 y 8.
Tabla 7
Resultados de la extracción para la disolución al 70 % en vol de etanol
Hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL Extracto sólido recogido
Peso
Cantidad para la extracción (g) 30 Peso seco (mg) 8000
EQL
Contenido de EQL(mg) Concentración de EQL (% en peso) Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Tasa de recogida de EQL (%) Tasa de concentración de EQL
161,40
0,54 158,98 1,98 96,5 3,7
DZN
Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Tasa de recogida de DZN (%) Tasa de concentración de DZN (%)
6,00
0,02 0,00 0,00 0,0 0,0
DHD
Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Tasa de recogida de DHD (%) Tasa de concentración de DHD (%)
9,00
0,03 0,09 0,00 0,00 0,00
GNT
Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Tasa de recogida de GNT (%) Tasa de concentración de GNT (%)
6,90
0,02 0,31 0,00 4,5 0,2
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
32,7
0,11 6,96 0,09 21,3 0,5
GLI
Contenido de GLI (mg) Concentración de GLI (% en peso) Contenido de GLI (mg) Concentración de GLI (% en peso) Tasa de recogida de GLI (%) Tasa de concentración de GLI (%)
62,70
0,21 33,17 0,41 52,9 2,0
Resultados de la extracción para la disolución al 70 % en vol de etanol
Hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL Extracto sólido recogido
Peso
Cantidad para la extracción (g) 30 Peso seco (mg) 8000
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
0,9
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
EQL representa equol; DZN representa daidzeína; DHD representa dihidrodaidzeína; GNT representa genisteína; DHG representa dihidrogenisteína; GLI representa glisteína; y DHG representa dihidroglisteína.
El contenido de isoflavonas (mg) indica el peso en bruto de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja 5 fermentado que contiene EQL (material: 30 g) o en el extracto aislado obtenido (8000 mg); y la concentración de isoflavonas (% en peso) indica la proporción de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL (material) o en el extracto aislado obtenido. La "Tasa de concentración" representa la tasa de concentración de cada componente en el extracto sólido cuando se supone que la concentración del componente en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL es 1.
10 Tabla 8
Resultados de la extracción para la disolución al 90 % en vol de etanol
Hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL Extracto sólido recogido
Peso
Cantidad para la extracción (g) 30 Peso seco (mg) 4100
EQL
Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Tasa de recogida de EQL (%) Tasa de concentración de EQL
161,40
0,54 158,13 3,89 98,0 7,2
DZN
Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Tasa de recogida de DZN (%) Tasa de concentración de DZN (%)
6,00
0,02 0,00 0,00 0,0 0,0
DHD
Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Tasa de recogida de DHD (%) Tasa de concentración de DHD (%)
9,00
0,03 0,12 0,00 1,3 0,1
GNT
Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Tasa de recogida de GNT (%) Tasa de concentración de GNT (%)
6,90
0,02 0,34 0,01 4,9 0,4
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
32,7
0,11 6,89 0,17 21,1 1,4
GLI
Contenido de Concentración de Contenido Concentración de Tasa de Tasa de
5
10
15
20
25
30
Hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL Extracto sólido recogido
Peso
Cantidad para la extracción (g) 30 Peso seco (mg) 4100
GLI (mg) GLI (% en peso) de GLI (mg) GLI (% en peso) recogida de GLI (%) concentración de GLI (%)
62,70
0,21 32,64 0,80 52,1 3,8
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
0,9
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
EQL representa equol; DZN representa daidzeína; DHD representa dihidrodaidzeína; GNT representa genisteína; DHG representa dihidrogenisteína; GLI representa glisteína; y DHG representa dihidroglisteína.
El contenido de isoflavonas (mg) indica el peso en bruto de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL (material: 30 g) o en el extracto aislado obtenido (4100 mg); y la concentración de isoflavonas (% en peso) indica la proporción de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL (material) o en el extracto aislado obtenido. La "Tasa de concentración" representa la tasa de concentración de cada componente en el extracto sólido cuando se supone que la concentración del componente en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL es 1.
Las tablas muestran que, llevando a cabo extracción en un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol usando una disolución acuosa de etanol, la tasa de recogida de equol aumenta y también se recogió glisteína. Mientras tanto, las concentraciones de otras isoflavonas fueron todas muy bajas en este extracto.
Ejemplo 1-3
Producción de extracto que contiene equol por el Método de producción I
En este ejemplo, se produjo polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en las mismas condiciones que en el Ejemplo de referencia 1-3, excepto que se usó un lote diferente de polvo de hipocótilo de soja.
Se mezclaron 50 g del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol con 7 ml de agua purificada, y entonces se mezclaron además con 250 ml de n-hexano; y se realizaron siete horas de agitación a temperatura ambiente. Se aisló residuo insoluble por filtración, y se realizaron siete horas de secado a 60 °C para obtener polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol desgrasado.
Se añadieron 20 g del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol desgrasado a 100 ml de una disolución acuosa al 80% en vol de etanol (100 ml que consisten en etanol y 20 ml de agua) o 100 ml de una disolución acuosa al 90 % en vol de etanol (100 ml que consisten en etanol y 10 ml de agua), y se realizaron catorce horas de agitación a temperatura ambiente. Después de retirar el residuo por filtración, el residuo se lavó usando 10 ml de una disolución acuosa de etanol que tenía la misma composición que la del extrayente. El filtrado y el líquido después de lavar se aislaron para obtener un extracto líquido.
El extracto líquido se secó durante seis horas a 60 °C para obtener un extracto sólido.
Se midieron el peso del extracto sólido obtenido y el peso de equol contenido en él, y las concentraciones de daidzeína, dihidrodaidzeína, genisteína, dihidrogenisteína, glisteína, dihidroglisteína, como se muestra en las Tablas 9 y 10.
Polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado Extracto sólido recogido
Peso
Cantidad para la extracción (g) 20 Peso seco (mg) 4000
EQL
Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Tasa de recogida de EQL (%) Tasa de concentración de EQL
107,60
0,54 114,89 2,88 106,8 5,3
DZN
Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Tasa de recogida de DZN (%) Tasa de concentración de DZN (%)
4,00
0,02 0,00 0,00 0,0 0,0
DHD
Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Tasa de recogida de DHD (%) Tasa de concentración de DHD (%)
6,00
0,03 0,10 0,00 1,7 0,1
GNT
Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Tasa de recogida de GNT (%) Tasa de concentración de GNT (%)
4,60
0,02 0,28 0,01 0,01 0,4
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
32,7
0,11 6,96 0,13 21,3 0,9
GLI
Contenido de GLI (mg) Concentración de GLI (% en peso) Contenido de GLI (mg) Concentración de GLI (% en peso) Tasa de recogida de GLI (%) Tasa de concentración de GLI (%)
41,80
0,21 24,03 0,60 57,5 2,9
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
0,6
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
EQL representa equol; DZN representa daidzeína; DHD representa dihidrodaidzeína; GNT representa genisteína; DHG representa dihidrogenisteína; GLI representa glisteína; y DHG representa dihidroglisteína.
5 El contenido de isoflavonas (mg) indica el peso total de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado (material: 20 g) o en el extracto recogido (4000 mg); y la concentración de isoflavonas (% en peso) indica la proporción de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado (material) o en el extracto recogido. La "Tasa de concentración" representa la tasa de concentración de cada componente en el extracto sólido cuando se supone que la concentración del componente en 10 el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado es 1.
Polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado Extracto sólido recogido
Peso
Cantidad para la extracción (g) 20 Peso seco (mg) 2200
EQL
Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Contenido de EQL (mg) Concentración de EQL (% en peso) Tasa de recogida de EQL (%) Tasa de concentración de EQL
107,60
0,54 106,88 4,81 99,3 8,9
DZN
Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Contenido de DZN (mg) Concentración de DZN (% en peso) Tasa de recogida de DZN (%) Tasa de concentración de DZN (%)
4,00
0,02 0,00 0,00 0,0 0,0
DHD
Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Contenido de DHD (mg) Concentración de DHD (% en peso) Tasa de recogida de DHD (%) Tasa de concentración de DHD (%)
6,00
0,03 0,10 0,00 1,7 0,2
GNT
Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Contenido de GNT (mg) Concentración de GNT (% en peso) Tasa de recogida de GNT (%) Tasa de concentración de GNT (%)
4,60
0,02 0,21 0,01 0,01 0,4
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
32,7
0,11 6,96 0,21 21,3 1,5
GLI
Contenido de GLI (mg) Concentración de GLI (% en peso) Contenido de GLI (mg) Concentración de GLI (% en peso) Tasa de recogida de GLI (%) Tasa de concentración de GLI (%)
41,80
0,21 21,97 0,99 52,6 4,7
DHG
Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Contenido de DHG (mg) Concentración de DHG (% en peso) Tasa de recogida de DHG (%) Tasa de concentración de DHG (%)
0,6
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
EQL representa equol; DZN representa daidzeína; DHD representa dihidrodaidzeína; GNT representa genisteína; DHG representa dihidrogenisteína; GLI representa glisteína; y DHG representa dihidroglisteína.
5 El contenido de isoflavonas (mg) indica el peso en bruto de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado (material: 20 g) o en el extracto recogido (2200 mg); y la concentración de isoflavonas (% en peso) indica la proporción de cada isoflavona contenida en el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado (material) o en el extracto recogido. La "Tasa de concentración" representa la tasa de concentración de cada componente en el extracto sólido cuando se supone que la concentración del componente en 10 el hipocótilo de soja fermentado que contiene EQL desgrasado es 1.
Las tablas muestran que la alta tasa de recogida de equol obtenida en el Ejemplo 1-2 fue garantizada incluso cuando se desgrasó el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol de antemano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 1-4
Producción de extracto que contiene equol por el Método de producción II
En este ejemplo, se produjo polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (concentración de equol = 6,2 mg/g) en las mismas condiciones que en el Ejemplo de referencia 1-3, excepto que se usó un lote diferente de polvo de hipocótilo de soja.
Se suspendieron 80 g del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en 900 ml de agua. Se añadieron 5 ml de ácido acético a la suspensión mientras que se agitaba, hasta que el pH fue aproximadamente 4,0. Después de 24 horas de reposo a temperatura ambiente, se recogió el residuo insoluble por filtración, y se secó. Así se obtuvieron 50,33 g de residuo insoluble.
Entonces, se añadieron 250 ml de una disolución acuosa de etanol (concentración de etanol = 75 % en vol) a 50,33 g de residuo insoluble, y se realizaron dos días de agitación a temperatura ambiente. Después de eliminar el residuo por filtración a presión reducida, se recogió el filtrado. El filtrado se evaporó a sequedad dando un sólido con un evaporador para obtener 7,53 g de polvo que contiene equol.
La concentración de equol del polvo que contiene equol obtenido fue 60,0 mg/g, que fue aproximadamente diez veces la concentración de equol (6,2 mg/g) del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol que se usó como material de partida. La tasa de recuperación de equol fue del 91 %.
Ejemplos 2: Purificación de equol
Ejemplo 2-1: Método de purificación 1 de equol
Se produjo polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (concentraciones de equol = 6,2 mg/g) en las mismas condiciones que en el Ejemplo de referencia 1-3, excepto que se usó un lote diferente de polvo de hipocótilo de soja.
Se añadieron 10 g del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol a 50 ml de una disolución acuosa al 50 % en vol de etanol, y se realizaron dos horas de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, el residuo ("Residuo 1", en lo sucesivo) se retiró por centrifugación (2500 rpm, 25 minutos) para aislar un extracto líquido ("Extracto líquido A-1", en lo sucesivo). A continuación, se añadieron 50 ml de una disolución acuosa al 50 % en vol de etanol al Residuo 1, y se realizó una hora de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, el residuo se retiró por centrifugación (2500 rpm, 25 minutos) para aislar un extracto líquido ("Extracto líquido A-2", en lo sucesivo). Los Extractos A-1 y A-2 se mezclaron y luego se evaporaron a sequedad usando un evaporador para obtener un sólido residual ("Sólido residual 1", en lo sucesivo).
Entonces, se añadieron 10 ml de etanol al Sólido residual 1, y se realizaron 30 minutos de agitación a temperatura ambiente bajo tratamiento supersónico. A partir de aquí, el residuo se retiró por centrifugación (1000 rpm, 10 minutos) para aislar un extracto líquido ("Extracto líquido B", en lo sucesivo). El Extracto líquido B se evaporó a sequedad usando un evaporador para obtener aproximadamente 1 g de un sólido residual ("Sólido residual 2", en lo sucesivo).
A continuación, se añadieron 10 ml de hexano a 1 g del Sólido residual 2, y se realizaron 30 minutos de agitación a temperatura ambiente. Entonces, el extracto líquido se retiró por centrifugación (1000 rpm, 10 minutos) para recoger 0,3 g de residuo insoluble.
Se añadieron 2 ml de una disolución mixta de hexano y dimetil éter (hexano: dimetil éter = 2:3 (relación en volumen)) a los 0,3 mg de residuo insoluble obtenido, y se realizaron 30 minutos de agitación a temperatura ambiente. Entonces, el residuo se retiró por centrifugación (1.000 rpm, 10 minutos) para recoger un extracto líquido. El extracto líquido obtenido se sometió a cromatografía en gel de sílice en las siguientes condiciones.
Columna: Una columna de 2 cm de diámetro interno, llena con gel de sílice.
Fase móvil:
200 ml de una disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 40:60 (relación en volumen));
200 ml de una disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 30:70 (relación en volumen));
200 ml de una disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 25:75 (relación en volumen));
200 ml de una disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 20:80 (relación en volumen));
y 200 ml de hexano se suministraron secuencialmente.
Se recogió cada elución de 50 ml de la columna. La fracción eluida por la disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 40:60 (relación en volumen)) y la disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter =
5
10
15
20
25
30
25:75 (relación en volumen)) contuvo 40 mg de equol (tasa de recuperación = 80 %), y la pureza de equol fue del 99,9 % por sólido seco. La FIG. 8 muestra el análisis de CCF de la fracción eluida usando cromatografía en gel de sílice. Como se muestra en la figura, la fracción eluida por la disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 30:70 (relación en volumen)) y la disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano: dietil éter = 25:75 (relación en volumen)) contuvo equol con alta pureza. La Tabla 11 detalla las muestras suministradas a los carriles de la FIG. 8.
Tabla 11
Carril en FIG. 8
Detalles de las muestras
Carril 1
Producto estándar de equol
Carril 2
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano:dietil éter=40:60 (relación de capacidad) oscila entre 0 y 50 ml
Carril 3
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano:dietil éter=40:60 (capacidad de relación) oscila entre 50 y 100 ml
Carril 4
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (Hexano: Dietil éter=30: 70 (capacidad de relación) oscila entre 0 y 50 ml
Carril 5
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano:dietil éter=30:70 (capacidad de relación) oscila entre 50 y 100 ml
Carril 6
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano:dietil éter=25:75 (capacidad de relación) oscila entre 0 y 50 ml
Carril 7
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano:dietil éter=25:75 (capacidad de relación) oscila entre 50 y 100 ml
Carril 8
Fracción de elución obtenida mientras que la cantidad de elución de disolución mixta de hexano y dietil éter (hexano:dietil éter=20:80 (capacidad de relación) oscila entre 0 y 50 ml
Ejemplo 2-2: Método de purificación 2 de equol
Se produjo polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (concentración de equol = 6,2 mg/g) en las mismas condiciones que en el Ejemplo de referencia 1-3, excepto que se usó un lote diferente de polvo de hipocótilo de soja.
Se añadieron 100 g del polvo de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol a 500 ml de una disolución acuosa al 95 % en vol de acetato de etilo, y se realizaron cuatro horas de agitación a temperatura ambiente. A partir de aquí, se retiró el residuo insoluble por filtración para recoger un extracto. El residuo insoluble separado se lavó con 80 ml de acetato de etilo, y el líquido después de lavar se mezcló con el filtrado, y la mezcla se concentró a presión reducida para recoger 12 g de materia oleosa. La materia oleosa se sometió a cromatografía en gel de sílice.
Columna: Una columna de 2 cm de diámetro interno, llena con 70 g de gel de sílice usando hexano.
Fase móvil: Suministrada con 500 ml de hexano, y una disolución mixta de acetato de etilo y hexano (acetato de etilo: hexano = 1:5 (relación en volumen)) posteriormente.
El disolvente se separó por destilación del disolvente de elución que contiene equol así recogido, y se obtuvieron 630 mg de un sólido cristalino amarillo.
El sólido cristalino se añadió a 2 ml de acetato de etilo y se disolvió calentando a 80 °C. Se añadieron 8 ml de hexano al mismo y se realizaron 30 minutos de agitación mientras que se enfriaba la mezcla con hielo para precipitar cristales de equol. Los cristales de equol obtenidos se recogieron por filtración, y se lavaron con hexano. Entonces los cristales se secaron para obtener 530 mg de sólido que contiene equol (cristales de color amarillo pálido).
Además, se añadieron 530 mg de sólido que contiene equol a 4 ml de disolución acuosa de etanol (concentración de etanol = 62,5% en vol), y se calentaron a 80 °C para disolverse en la disolución. La disolución se dejó reposar durante doce horas a 10 °C para recristalizar el equol, y entonces se filtró y secó. Como resultado, se obtuvieron 390 mg de cristales de equol con forma de aguja blancos.
El ángulo de rotación [a]D25 de los cristales de equol obtenidos fue -21,6° en un etanol a 25 °C. El punto de fusión fue 188-190 °C. Se confirmó que el equol obtenido fue casi el 100 % puro.
5
10
15
20
25
Ejemplo 3: Material alimenticio que contiene un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o extracto del mismo, y alimentos que contienen el material alimenticio
Ejemplo 3-1 Producción de material alimenticio que contiene un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y masa de cacao
Se mezcló un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol producido en las mismas condiciones que en los Ejemplos de referencia 1-3 con masa de cacao que había sido disuelta por calor a una relación de 1:3 (relación de peso). La mezcla se enfrió para obtener un material alimenticio en el que un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se dispersa en masa de cacao.
El sabor del material alimenticio así producido fue evaluado por 10 panelistas, con el resultado de que todos los panelistas llegaron a la conclusión de que se suprimió el sabor amargo derivado del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, y el material alimenticio poseyó un aroma agradable.
Ejemplo 3-2 Material alimenticio que contiene un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol
Se mezcló un extracto sólido ("extracto 75Et", en lo sucesivo) obtenido evaporando el Extracto líquido 2-1 producido en el Ejemplo 1-1 usando 75Et con masa de cacao que había sido disuelta por calor a una relación de 1:24 (relación de peso). La mezcla se enfrió para obtener un material alimenticio en el que un extracto 75Et se dispersó en masa de cacao.
El sabor del material alimenticio así producido fue evaluado por 10 panelistas, con el resultado de que todos los panelistas llegaron a la conclusión de que se suprimió el sabor amargo derivado del extracto 75Et, y el material alimenticio poseyó un aroma agradable.
Ejemplo 3-3 Dulces horneados
Se mezclaron los ingredientes mostrados en la Tabla 12, y la mezcla se formó en un rectángulo (aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm x 10 cm) y se horneó en un horno a 180 °C para producir un dulce horneado.
El sabor del dulce horneado así producido fue evaluado por 10 panelistas, con el resultado de que todos los panelistas llegaron a la conclusión de que se suprimió el sabor amargo derivado del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, y el dulce horneado poseyó un agradable aroma a chocolate y un sabor agradable original.
Tabla 12
Proporción (% en peso)
Material alimenticio en forma de viruta obtenido en el Ejemplo 3-1 (aproximadamente 0,1 g por viruta)
5
Harina de soja
25
Pasas
c.s.
Mantequilla
c.s.
Azúcar
c.s.
Huevo
c.s.
Cáscara de naranja
c.s.
Piña
c.s.
Dextrina indigerible
c.s.
Masa de cacao
c.s.
Almendras en rebanadas
c.s.
Polvo de cacao
c.s.
Sal
c.s.
Levadura en polvo
c.s.
Proporción (% en peso)
Aroma
c.s.
Total
100
Ejemplo comparativo 3-1: Dulce horneado
Se produjo un dulce horneado en las mismas condiciones que en el Ejemplo 3-3, excepto que se mezcló 1 g del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol producido en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1-3 con 5 5 g de virutas de chocolate en lugar del material alimenticio en forma de viruta obtenido en el Ejemplo 3-1.
El sabor del dulce horneado así producido fue evaluado por 10 panelistas, con el resultado de que todos los panelistas llegaron a la conclusión de que desapareció el sabor agradable y permaneció el sabor amargo derivado del hipocótilo de soja fermentado que contiene equol en todo el dulce.
Ejemplo 3-4: Dulce horneado
10 Se produjo un dulce horneado en las mismas condiciones que en el Ejemplo 3-3, excepto por la inclusión de la misma cantidad de material alimenticio en forma de viruta obtenido en el Ejemplo 3-2 en lugar de los materiales alimenticios en forma de viruta obtenidos en el Ejemplo 3-1.
El sabor del dulce horneado así producido fue evaluado por 10 panelistas, con el resultado de que todos los panelistas llegaron a la conclusión de que se suprimió el sabor amargo derivado del extracto 75Et, y el dulce 15 horneado poseyó un aroma de chocolate agradable y un sabor agradable original.
Ejemplo 4 Alimento que comprende material de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol o su extracto
Ejemplo 4-E Tentempié
En lo sucesivo, se dan ejemplos de producción específicos del tentempié según la presente invención.
Ejemplo 4-E-25 Chocolate
20 Se produjo chocolate según un método de producción general de chocolate, usando los ingredientes de la siguiente
composición.
Material de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (Ejemplo de referencia 1-3) 4,00 (g)

Masa de cacao 40,00

Manteca de cacao 25,00

Azúcar en polvo reducida 50,00

Sucralosa 0,03

Lecitina 0,40

Vainillina 0,05
Ejemplo 4-E-26 Chocolate
Se produjo chocolate en las mismas condiciones que en el Ejemplo 4-E-25, excepto que se usó, en lugar del material de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, 0,5 g del extracto sólido preparado en el Ejemplo 1-1 25 evaporando el Extracto líquido 1-2 obtenido usando 75Et a sequedad.
Ejemplo 4-E-67 Dulce horneado que contiene harina de soja
Se mezclaron una cantidad del 1,25% en peso de material de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol (Ejemplo de referencia 1-3) y 25% en peso de harina de soja, además de pasas, mantequilla, azúcar, huevo, cáscara de naranja, piña, dextrina difícil de digerir, masa de cacao, rebanadas de almendra, polvo de cacao, sal de 30 mesa, levadura en polvo y aromas en una cantidad adecuada. La mezcla resultante (100% en peso) se formó entonces en un rectángulo (aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm x 10 cm) usando un molde que iba a ser horneado en un horno a 180 °C, produciendo así un dulce horneado que contiene harina de soja.
5
10
15
20
25
Ejemplo 4-E-68 Dulce horneado que contiene harina de soja
Se produjo dulce horneado que contiene harina de soja en las mismas condiciones que en el Ejemplo 4-E-67, excepto que se usó, en lugar del material de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol, 0,25 partes en peso del extracto sólido preparado en el Ejemplo 1-1 evaporando el Extracto líquido 1-2 obtenido usando 75Et a sequedad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un electroferograma que muestra las proteínas totales contenidas en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol obtenido en el Ejemplo de referencia 1-1, cotiledón de soja y el hipocótilo de soja.
La FIG. 2 es un electroferograma que muestra los resultados de la detección de los principales alérgenos (Gym4, Gm30K y Gm28K) contenidos en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol obtenido en el Ejemplo de referencia 1-1, cotiledón de soja y el hipocótilo de soja.
La FIG. 3 es un electroferograma que muestra los resultados de la detección de los principales alérgenos (mezcla de 7S globulina, oleocina e inhibidor de tripsina) contenidos en el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol obtenido en Ejemplo de referencia 1-1, cotiledón de soja y el hipocótilo de soja.
La FIG. 4 muestra los resultados del análisis por CCF que indican los contenidos de equol de los Extractos líquidos 1-2 y 2-2 en el Ejemplo 1-1.
La FIG. 5 muestra los resultados del análisis por CCF que indican los contenidos de saponina de los Extractos líquidos 1-2 y 2-2 en el Ejemplo 1-1.
La FIG. 6 muestra los resultados del análisis por CCF que indican los contenidos de equol de los Extractos líquidos 1-2 y el Residuo 2 en el Ejemplo 1-1.
La FIG. 7 muestra los resultados del análisis por CCF que indican los contenidos de saponina de los Extractos líquidos 1-2 y el Residuo 2 en el Ejemplo 1-1.
La FIG. 8 muestra los resultados del análisis por CCF de disoluciones eluidas por cromatografía en columna de gel de sílice en el Ejemplo 2-1.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un material alimenticio que comprende un hipocótilo de soja fermentado que contiene equol y masa de cacao.
  2. 2. El material alimenticio según la reivindicación 1, en el que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se dispersa en masa de cacao.
    5 3. El material alimenticio según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que contiene 10 a 2000 partes en peso de
    masa de cacao por 100 partes en peso de hipocótilo de soja fermentado que contiene equol.
  3. 4. El material alimenticio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el hipocótilo de soja fermentado que contiene equol se obtiene fermentando un hipocótilo de soja con un microorganismo productor de equol.
    10 5. El material alimenticio según la reivindicación 4, en el que el microorganismo productor de equol es un
    microorganismo que puede metabolizar al menos un compuesto de daidzeína seleccionado del grupo que consiste en glucósidos de daidzeína, daidzeína y dihidrodaidzeína para producir equol.
  4. 6. El material alimenticio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que toma una forma de polvo, una forma granulada, una forma de viruta, o una forma de tipo lámina.
    15 7. Un alimento que contiene equol que comprende un material alimenticio expuesto en una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 6.
  5. 8. El alimento que contiene equol según la reivindicación 7, que es un dulce horneado o un postre congelado.
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