ES2664974T3 - Formulación estabilizada de premezcla de pienso de ivermectina - Google Patents

Abstract

Una premezcla para un pienso para animales que presenta una vida útil prolongada que comprende: a) del 0,04 al 5 % (p/p) de al menos un compuesto de avermectina; b) un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende: i) del 5 al 15 % (p/p) de un tensioactivo en el que dicho tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en aceite de ricino hidrogenado polioxilo 40, aceite de ricino PEG-50, glicérido de maíz PEG-60, aceite de almendra PEG-60, aceite de almendra de palma PEG-40 y aceite de maíz PEG-60; ii) del 5 al 25 % (p/p) de una cera en la que dicha cera se selecciona del grupo que consiste en monoglicéridos destilados, tribehenato de glicerilo, trimiristato de glicerilo y coco-glicéridos hidrogenados; iii) del 0,1 al 2 % (p/p) de un antioxidante en el que dichos antioxidantes se seleccionan del grupo que consiste en hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido ascórbico, metabisulfito sódico, galato de propilo, tiosulfato sódico y una mezcla de los mismos; iv) del 60 al 80 % (p/p) de un vehículo farmacéuticamente aceptable en el que dicho vehículo se selecciona del grupo que consiste en mazorcas de maíz molidas finas, piedra caliza triturada y granos secos; c) un estabilizante farmacéuticamente aceptable en una cantidad efectiva para ajustar el pH de la formulación de premezcla en un intervalo de 4 a 6 para disminuir la descomposición catalizada por ácido o base del al menos un compuesto de avermectina, en el que dicho estabilizante es ácido cítrico anhidro presente en una cantidad del 0,3 al 1,5 % (p/p); y d) opcionalmente, una cantidad efectiva de al menos un compuesto regulador del crecimiento de insectos seleccionado del grupo que consiste en mepreno, piriproxifeno, hidropreno, ciromazina, lufenurón, 1-(2,6-difluorobenzoil)-3-(2-fluoro-4-(trifluorometil)) fenilurea, novalurón y una mezcla de los mismos.

Description

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Descripción

REDUCCIÓN HIPERÓNICA DE LESIONES POR ENFRIAMIENTO SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta aplicación es una continuación en parte de la solicitud de patente de los EE. UU. 09/771,221, presentada el 26 de enero de 2001 que reivindica prioridad bajo 35 U.S.C.§119 de la Solicitud Provisional No. US 60/178,157, presentada el 26 de enero de 2000.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere en general al campo de la crioconservación. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para prevenir lesiones causadas por enfriamiento y calentamiento de tejidos y para reducir la toxicidad de soluciones de vitrificación reduciendo la cantidad de crioprotector necesario para vitrificar y para facilitar la introducción y el lavado rápidos del crioprotector sin toxicidad o lesión osmótica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Durante el enfriamiento y calentamiento de tejidos o células en soluciones crioprotectoras, las células y tejidos a menudo sufren lesiones. Agregar y eliminar el crioprotector también puede inducir lesión, particularmente si el proceso de adición y lavado es prolongado, pero también si la dilución es demasiado rápida. Sería deseable en la técnica proporcionar un método que permita a) la adición rápida de crioprotectores, b) enfriamiento rápido o lento sin shock por enfriamiento o lesiones por enfriamiento, y c) dilución rápida del crioprotector sin choque osmótico después del recalentamiento del sistema vivo.

Existen muchas formas de dañar los sistemas vivos al enfriarse a temperaturas bajo cero y, posteriormente, al calentarse a temperaturas bajo cero. Si el sistema está congelado, puede dañarse mecánicamente por hielo intracelular o extracelular, o por las consecuencias de cambios en la composición de la parte no congelada del ambiente semicongelado. Si el sistema está vitrificado, estas fuentes de lesión pueden desaparecer, pero son posibles otras formas de lesión.

El "choque térmico" (también llamado a veces choque frío) es una lesión causada por el enfriamiento rápido per se, y se reduce al reducir la velocidad de enfriamiento. Se ha afirmado que existe una lesión por choque térmico (véase Fahy et al., En Cell Biology of Trauma, J. J. Lemasters y C. Oliver, Eds, CRC Press, 1995, pp. 333-356) dentro de una estrecha ventana de temperatura entre 0°C y aproximadamente -20°C en la corteza renal de conejo, pero no por debajo, pero actualmente se cree que no es un problema importante, aunque las tasas de enfriamiento rápido son deseables para la vitrificación a fin de reducir la probabilidad de formación de hielo y toxicidad crioprotectora.

Otra posible fuente de lesiones es la "lesión por frío", que es una forma poco conocida de lesiones causados por la exposición a bajas temperaturas per se. La lesión por enfriamiento es, a fines prácticos, esencialmente no dependiente de la velocidad de enfriamiento (excepto para sistemas pequeños, que pueden escapar de la lesión por frío a velocidades de enfriamiento muy rápidas), sino que depende principalmente de la temperatura absoluta a la que se enfría el sistema. Dicho de otra manera, el shock térmico es causado por una refrigeración rápida y es reducida o eliminada por una refrigeración lenta, y la lesión por enfriamiento no es eliminada por refrigeración rápida, excepto tal vez posiblemente a tasas de refrigeración muy altas.

Otra forma de lesión relacionada con la vitrificación (crioconservación sin formación de hielo al enfriar) es la desvitrificación. A medida que la temperatura en un sistema vitrificable se aproxima a la temperatura de transición vítrea, en general puede producirse la nucleación. Cuando el sistema se calienta, los núcleos formados en las proximidades de la temperatura de transición vítrea (Tg), que no pueden aumentar mientras el sistema permanece por debajo de la Tg, pueden aumentar y producir lesiones tanto intracelulares como extracelulares.

Otra forma de referirse a la lesión que tiene lugar al enfriar per se y que no se caracteriza formalmente como que representa un choque térmico o una lesión por frío es simplemente denominar dicha lesión como "lesión por enfriamiento".

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Las principales barreras para la crioconservación por vitrificación son la toxicidad crioprotectora, la lesión por frío y la desvitrificación. La toxicidad crioprotectora se ha reducido en gran medida con inventos recientes que implican la utilización de agentes formadores de vidrio débiles y análisis qv* y ya no es un factor limitante principal para los sistemas celulares. Debido a que la desvitrificación puede reducirse utilizando crioprotectores de baja toxicidad, bloqueadores de hielo y calentamiento rápido, también es actualmente una preocupación cada vez menor. La lesión por enfriamiento, sin embargo, sigue siendo un problema sustancial y en gran parte difícil de resolver, que es difícil de abordar en parte debido a su origen desconocido. Aunque se han realizado estudios sobre la bioquímica de la lesión por enfriamiento en sistemas naturales, no se sabe nada sobre las fuentes de lesión por frío en células que no sufren lesión por enfriamiento a 0°C y que se han cargado con concentraciones vitrificables de crioprotectores y se han enfriado a cero temperaturas por debajo de cero grados. Por lo tanto, sería particularmente valioso poder eludir las lesiones por enfriamiento para mejorar los resultados de la vitrificación.

En la técnica se conoce un método patentado para tratar la lesión por frío en tales sistemas (véanse las patentes de los Estados Unidos 5,962,214 y 5,723,282). Fahy demostró que los riñones o las láminas de riñón expuestas a concentraciones altas pero sub vitrificables de crioprotectores a 0°C se dañaron gravemente al enfriarse a entre -20 y -30°C. Encontró que al utilizar concentraciones más bajas de crioprotectores permeantes antes del enfriamiento, la sensibilidad a la lesión por frío podría eliminarse a estas temperaturas. Se podría introducir crioprotector adicional por difusión o por perfusión a entre -20 y - 25°C, con toxicidad reducida o eliminada (véase también Fahy et al., En Cell Biology of Trauma, JJ Lemasters y C. Oliver, Eds, CRC Press, 1995, págs. 333-356, pero especialmente la Figura 8, página 353, y su descripción, y Khirabadi y col., Cryobiology 31: 597, 1994, y Cryobiology 32: 543-544, 1995.

Sorprendentemente, se descubrió que este método de la técnica anterior tenía un defecto fatal: cuando los tejidos protegidos a aproximadamente -25°C utilizando el método se enfriaban posteriormente a Tg, en realidad sufrían lesiones mucho más graves que si se hubieran enfriado directamente desde 0°C. (Kihirabadi et al., Cryobiology 37: 447, 1998). La falta de permeación del crioprotector adicional a -25°C se descartó como causa de la lesión por enfriamiento, ya que duplicar el tiempo de equilibrio a -25°C tuvo un efecto mínimo o nulo sobre la lesión por enfriamiento, aunque exacerbó en gran medida la lesión tóxica a - 25°C. Por lo tanto, cualesquiera que sean sus virtudes, este método de la técnica anterior es insostenible.

Fahy et al. explicaron la base de su método de la técnica anterior de la siguiente manera (ver la referencia de Cell Biology of Trauma, págs. 351-352). "Los eritrocitos humanos normalmente no experimentan un choque frío cuando se enfrían a 0°C, pero se vuelven susceptibles al choque frío por exposición a soluciones hipertónicas antes del enfriamiento... Si se introduce la misma hipertonicidad a una temperatura inferior a 10°C, las células permanecen ilesas a la temperatura de exposición o al enfriamiento posterior. El método para evitar el choque frío, entonces, es enfriarse a través del intervalo de temperatura crítica en presencia de bajas concentraciones [baja tonicidad] y aumentar la concentración [tonicidad] solo después de que este intervalo crítico de temperatura haya sido atravesado de manera segura."

“En el caso del riñón de conejo, sabíamos que la contracción osmótica de las células tubulares es inducida por la exposición a VS4 y V52, y que la contracción celular parece ser necesaria para la lesión por choque frío en los glóbulos rojos. Dado que los riñones se enfriaron a -30°C en VS4 con una vida útil de alrededor del 60% del tiempo y los riñones se enfriaron a -30°C en V52 vida compatible 0% del tiempo, parecía que una concentración no muy por debajo de la concentración del 49% p/v de VS4 debería evitar el shock por enfriamiento por completo."

Al describir los resultados de un experimento diseñado para probar la analogía entre la lesión por choque térmico en glóbulos rojos y la lesión por enfriamiento en láminas de riñón de conejo, Fahy et al. concluyen (de la misma referencia):" Por lo tanto, parece ser que la analogía entre lesión por enfriamiento en tejido renal de conejo y shock por enfriamiento en eritrocitos humanos es válida."

WO 98/09514 A describe un método de vitrificación que comprende las fases de preparar una solución de co-solutos no permeantes de vitrificación (aminoácidos, betaínas, carbohidratos u otros co-solutos no permeantes que disminuyen de forma efectiva el potencial químico de los crioprotectores permeables en soluciones acuosas), un crioprotector permeante y un crioprotector no permeante (polivinilpirrolidona, polietileno, glicol, dextrano, almidón hidroxi etil, ficol, etc.), poner en contacto una muestra con la solución de vitrificación y almacenar la muestra a una temperatura ambiente. El método también incluye la fase de rehidratar la muestra conservada en una solución de rehidratación preparada en forma de solución de almacenamiento de vitrificación.

WO 97/45010 A describe un método de vitrificación que comprende las fases de cargar de forma gradual o escalonada una muestra con un protector permeante poniendo en contacto la muestra con soluciones que inlcuyen un protector y un co-soluto no permeable que limita la cantidad de protector que penetra en las

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células del espécimen biológico. El método incluye asimismo la fase de descargar (rehidratación) la muestra poniendo en contacto la muestra con una o más soluciones de rehidratación que tienen concentraciones progresivamente inferiores tanto del protector como del co-soluto, de manera que el protector es eliminado de las células de la muestra.

EP 0306132 A2 describe un método de vitrificación, en que el material biológico que comprende estructuras incluidas den la membrana está protegido contra la lesión por frío. El método se caracteriza porque comprende la reducción de la tensión entre las membranas.

US 2001/039004 A1 describe un método para enfriar, recalentar y eliminar el crioprotector de las células vivas reduciendo la lesión y se presenta la criotoxicidad. El método se caracteriza por un medio hipertónico, que se utiliza para reducir tanto la toxicidad del crioprotector como la lesión por enfriamiento.

Por lo tanto, está claro que aunque se ha prestado mucha atención al problema de evitar la lesión por enfriamiento en el pasado, aún se necesita un método para prevenir dicha lesión.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se dirige a métodos para reducir o eliminar las lesiones por enfriamiento durante la crioconservación por vitrificación de sistemas vivos tal como se define en las reivindicaciones.

Existen métodos en la técnica anterior que implican el uso de polímeros u otros impermeantes para facilitar la vitrificación. En estos métodos, los polímeros se utilizan para mejorar la tendencia a la vitrificación en lugar del crioprotector extra penetrante. Sin embargo, en ninguno de estos métodos el polímero se utiliza con el propósito de inhibir la lesión por enfriamiento (en oposición a la lesión causada por la formación de hielo, que, según las definiciones en el presente documento, no constituye una lesión por enfriamiento). Debido a esto, ningún método de la técnica anterior ha logrado una crioconservación óptima, porque, como se describe aquí, la inclusión de demasiado polímero puede negar la protección contra la lesión por enfriamiento, o incluso causar una lesión por enfriamiento adicional en comparación con la no utilización de polímeros, mientras que la utilización de muy poco impermeante puede no alcanzar la protección máxima, y no se ha tomado conciencia de que la lesión por enfriamiento se modifica por los cambios en la concentración del polímero, por lo que la lesión por enfriamiento ha variado al azar con cambios no guiados en las condiciones experimentales. Por lo tanto, la presente invención permite lograr la crioconservación óptima optimizando el nivel de hipertonicidad y el método para introducir y eliminar la hipertonicidad a fin de optimizar la negación de la lesión por enfriamiento, una oportunidad que antes no era posible. Además, ningún método anterior ha utilizado polímeros, otros impermeantes o cambios en la concentración de la solución transportadora para obtener beneficios mediante la simulación de congelación y descongelación. En el presente documento se describe un método para enfriar células vivas en medios vitrificables sin engendrar lesión por enfriamiento per se. Sorprendentemente, el método logra la eliminación casi total de las lesiones por frío o enfriamiento usando un planteamiento que es opuesto a los métodos anteriores. El presente método logra la reducción o eliminación de la lesión aumentando la tonicidad del medio a mayor que la isotónica antes del enfriamiento. Otra forma de realización es la utilización de un medio hipertónico para reducir tanto la toxicidad crioprotectora como la lesión por frío, en la que el medio hipertónico se agrega y elimina de una manera que simula los efectos de la congelación y la descongelación. En una forma de realización adicional, el medio hipertónico evita lesiones por enfriamiento a temperaturas bajo cero. Otra forma de realización es la utilización de un medio hipertónico para reducir el tiempo requerido para eliminar el crioprotector de las células vivas, en que el lavado acelerado del crioprotector se logra simulando la descongelación (dilución simultánea del medio hipertónico y el crioprotector). Una forma de realización adicional es la utilización de un medio hipertónico para proteger las células vivas del choque de dilución, en que la protección se logra mediante la presencia del medio hipertónico antes de la dilución y se mantiene por dilución simultánea del crioprotector y el medio en proporciones aproximadamente similares. En una forma de realización adicional, el método proporciona dos etapas de tratamiento con medios hipertónicos, en los que la tonicidad de la primera etapa y la tonicidad de la segunda etapa pueden diferir, pero en las que la tonicidad en ambas etapas excede a la isotónica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la viabilidad de láminas corticales renales de conejo congeladas sometidas a congelación simulada en DMSO (D) o en Veg (V) a diversas concentraciones. La viabilidad se mide por relaciones K/Na del tejido después de la restauración del metabolismo activo. Cada barra representa 6-12 láminas individuales.

La Figura 2 muestra las proporciones K/Na de láminas expuestas a concentraciones vitrificables de crioprotectores con o sin simulación de congelación, y enfriadas con o sin uso previo del método de simulación de congelación para añadir crioprotector (elevación simultánea de la solución de

vehículo y concentración de crioprotector). Se usaron dos soluciones de vitrificación, V 16 y C40, y los efectos de todos los tratamientos se compararon solo con la exposición a la solución del vehículo (Con). Cada barra representa 12 sectores diferentes.

La Figura 3 muestra la lesión asociada al enfriamiento en las láminas en una solución de 5 vitrificación que tiene una tonicidad de 1.7X. La línea punteada muestra el nivel de lesión causado

en una solución IX a aproximadamente -20°C.

La Figura 4 muestra la tonicidad óptima para reducir las lesiones causadas por enfriamiento hasta -22°C.

La Figura 5 muestra los efectos de dos tipos de tratamientos hipertónicos sobre lesiones causadas 10 por enfriamiento a -100 ° o inferior.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE

Se presenta un método inicial para añadir y eliminar crioconservador con mayor velocidad y mayor seguridad y conveniencia, simulando, sin congelarse, los eventos que tienen lugar durante la congelación y descongelación de células vivas y/o tejido. Este método utiliza la hipertonicidad del medio y un retorno a 15 la isotonicidad del medio para agregar y eliminar crioprotectores. Como resultado, la concentración de los crioprotectores necesarios para la vitrificación puede reducirse, y/o puede reducirse el tiempo de exposición total requerido para tratar adecuadamente el sistema con crioprotectores, reduciendo de este modo la toxicidad de la solución de vitrificación. Este método se ha ampliado para lograr la eliminación de lesión por enfriamiento a temperaturas bajo cero en soluciones crioprotectoras sin congelación al aumentar la 20 tonicidad del medio antes del enfriamiento, aumentando o sin aumentar la concentración de los constituyentes de la solución del vehículo. Los métodos de la técnica anterior implicaban disminuir la concentración de crioprotectores y, por lo tanto, la tonicidad transitoriamente efectiva del medio, antes del enfriamiento. Esto protege contra lesiones a temperaturas más altas (por encima de -30°C), pero agrava las lesiones a temperaturas más bajas (por debajo de -30°C). Sin embargo, en el presente documento se 25 muestra que, sorprendentemente, al aumentar la tonicidad, las células se protegen a temperaturas bajo cero más altas e inferiores, sin la necesidad de reducir la concentración de crioprotectores para reducir la lesión por enfriamiento.

DEFINICIONES DE TONICIDAD Y DE LOS EFECTOS DE LAS SOLUCIONES SOBRE LA TONICIDAD

El término "tonicidad" se refiere a un efecto observado de los solutos sobre el volumen de una célula 30 expuesta a una solución que contiene los solutos. Las soluciones pueden ser hipotónicas, isotónicas o hipertónicas de forma permanente o transitoria dependiendo de su concentración y de la capacidad de los solutos en la solución para atravesar la membrana celular y entrar y salir de la célula.

Si el volumen de la célula en su estado natural no se cambia transfiriendo la célula a una solución, se dice que la solución es "isotónica". "Esto significa que la solución tiene la misma tonicidad, o concentración 35 osmótica efectiva, que la solución intracelular.

Si el volumen de la célula aumenta al transferirse a la solución, se dice que la solución es "hipotónica". Esto significa que su concentración osmótica efectiva es inferior a la de la solución intracelular.

Si el volumen de la célula disminuye al transferirse a la solución, se dice que la solución es "hipertónica" o efectivamente más concentrada osmóticamente que la solución intracelular.

40 Si los solutos en la solución no impregnan la célula, y si, durante el transcurso del tiempo de la observación, los solutos intracelulares no se escapan de la célula, entonces la tonicidad de la solución depende únicamente de la concentración osmótica total de la solución. En el cuerpo, los solutos extracelulares se vuelven efectivamente impermebles por la "bomba" de sodio-potasio-ATPasa, y la concentración osmótica de los fluidos extracelulares es de aproximadamente 285 mOsm (285 miliosmolal), medida por la depresión 45 del punto de congelación {punto de fusión equivalente a 0.285 osmolal x (-1.86°C/osmolal = -0.53°C). Por lo tanto, una solución isotónica es aquella que tiene una osmolalidad efectiva de alrededor de 285 mOsm, aunque 300 mOsm a menudo se pueden tomar como una aproximación adecuada. Una solución hipertónica tendrá una concentración efectiva mayor de aproximadamente 285-300 mOsm, y una solución hipotónica tendrá una concentración efectiva menor de aproximadamente 285-300 mOsm.

50 Si se coloca una célula en una solución de 300 mOsm de dimetilsulfóxido, un soluto de permeación, comenzará a hincharse. Debido a que los solutos permeables pueden ingresar en la célula y ejercer un efecto osmótico igual en ambos lados de la membrana celular, dichos solutos no tienen efecto neto sobre el volumen celular, una vez que han alcanzado el equilibrio. Por lo tanto, están efectivamente ausentes. Por lo tanto, colocar una célula en una solución de 300 mOsm de dimetilsulfóxido es similar al efecto de colocar

una célula en agua pura. Debido a que el volumen celular depende de la osmosis, que es el movimiento del agua desde una alta concentración de agua a las regiones de menor concentración de agua, una célula que se coloca en el agua se hinchará. Sin embargo, el dimetilsulfóxido es menos permeable a una célula que el agua y, por lo tanto, las células colocadas en dimetilsulfóxido (DMSO) se hincharán más lentamente 5 que las células colocadas en agua pura.

Una célula colocada en una solución de 600 mOsm de DMSO se encogerá inicialmente, no se hinchará, debido al hecho de que la membrana celular es más permeable al agua que lo es a DMSO. En el caso extremo de permeabilidad muy baja pero finita a DMSO, la célula perderá la mitad de su agua al contacto con 600 mOsm de DMSO para aumentar la concentración celular al doble de la concentración inicial (300 10 miliosmoles/kg de agua se convierte en 600 miliosmoles por kg de agua si la cantidad de kg de agua se reduce a la mitad debido a la exosmosis). Después, sin embargo, la penetración de DMSO continuará y el volumen de la célula aumentará. Cuando la célula alcanza su volumen isotónico, contendrá aproximadamente 300 mOsm de DMSO y 300 mOsm de soluto intracelular, equilibrando la presión osmótica de la solución extracelular de 600 mOsm. Cuando el volumen de la célula se duplica, contendrá 150 mOsm 15 de soluto intracelular y 450 mOsm de DMSO. La inflamación tenderá a continuar hasta que la concentración de soluto intracelular se reduzca a cero, lo que solo puede ocurrir cuando el volumen celular alcanza el infinito. El punto es que los solutos permeables como el DMSO pueden ser transitoriamente hipertónicos en el corto plazo, a pesar de que son el equivalente osmótico del agua (hipotónico) una vez que se ha permitido un período de tiempo para la penetración.

20 Si se coloca una célula en una solución que contiene 300 mOsm de DMSO y 300 mOsm de soluto impermeantes, la contracción inicial de la célula será la misma que en el caso de la transferencia de la célula a 600 mOsm de DMSO en agua, porque la osmolalidad extracelular es la misma en ambos casos. Sin embargo, cuando la célula vuelva al volumen isotónico, contendrá 300 mOsm de DMSO y 300 mOsm de soluto intracelular, lo que equilibrará los 300 mOsm de DMSO y 300 mOsm de solución extracelular 25 impermeante osmóticamente, y no se producirán más cambios en el volumen celular. Este ejemplo ilustra la necesidad de una "solución de soporte" o "solución de vehículo" para utilizar en la adición y eliminación de crioprotectores permeables. La solución de vehículo "transporta" o administra el crioprotector a la célula de manera que la célula permanecerá en su volumen isotónico después de que el crioprotector haya penetrado completamente.

30 La tonicidad de la solución transportadora determinará el volumen de la célula en presencia de crioprotector de la misma manera que los impermeantes controlan el volumen de la célula en ausencia de crioprotector, una vez que cesan los flujos de crioprotectores. Tal como demostró Meryman (Cryobiology 19: 565-569, 1982), se establece una tonicidad normal en presencia de crioprotectores utilizando impermeantes a los mismos gramos por volumen de solución de unidad (% p/v) o moles por unidad de volumen de solución 35 (molaridad) unidades de concentración como sería apropiado en ausencia del crioprotector. Esto es lógico porque es el volumen celular lo que se desea controlar y establecer un nivel dado de osmoles por unidad de volumen fuera de la célula dará como resultado el mismo nivel de osmoles por unidad volumen dentro de la célula, suponiendo que los crioprotectores permeantes penetran completamente y ocupan la misma fracción de volumen en la solución tanto intracelular como extracelularmente, una suposición generalmente 40 válida.

En base a estas definiciones, las enseñanzas de la técnica anterior pueden traducirse ahora en lo que se refiere a la prevención de la lesión por enfriamiento en sistemas altamente crioprotegidos (sistemas que contienen concentraciones vitrificables o casi vitrificables de crioprotectores).

Los glóbulos rojos se colocan en medios fuertemente hipertónicos (al menos aproximadamente de 4 a 5 45 veces más concentrados de lo normal, designados como 4-5X) a temperatura ambiente y se enfrían a 0°C cuando alcanzan los 10°C. Sin embargo, si están expuestos a las soluciones 4-5X a 0°C después de un enfriamiento previo a 0°C en una solución isotónica (1X), no se lisan. Además, si los glóbulos rojos se exponen a soluciones 4-5X a 0°C y a continuación se enfrían a temperaturas bajo cero sin congelación, tampoco se lisan. Por lo tanto, el choque térmico en los glóbulos rojos es un hecho específico que tiene 50 lugar a 10°C y solo cuando la tonicidad de la solución es alta. La alta tonicidad causa lesiones por choque térmico, pero solo a temperaturas más altas. Por lo tanto, si se desea enfriar los glóbulos rojos a bajas temperaturas en soluciones de alta tonicidad, primero deben enfriarse en soluciones de baja tonicidad para evitar el choque térmico.

El método de la técnica anterior de los sistemas crioprotegidos muestra que la hipertonicidad transitoria 55 experimentada por las células colocadas en crioprotectores concentrados los sensibiliza a la lesión por enfriamiento de la misma manera que las soluciones hipertónicas permiten el choque térmico en los glóbulos rojos. Por lo tanto, la reducción de la concentración de crioprotectores y, por lo tanto, la

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concentración efectiva transitoriamente hipertónica de la solución crioprotectora, antes de enfriar por debajo de 0°C, elimina la lesión por enfriamiento.

En la presente descripción, se descubre sorprendentemente que una estrategia completamente diferente resulta tanto factible como más efectiva que el método de la técnica anterior.

EJEMPLOS

En contradicción directa con el método de la técnica anterior, el presente método logra la eliminación de la lesión por enfriamiento así como otros objetivos aumentando, no disminuyendo, la tonicidad del medio antes del enfriamiento. Existen dos variantes del método. En la primera variante, el medio se hace hipertónico al aumentar la concentración de la solución del vehículo simultáneamente con un aumento en la concentración del (de los) crioprotector(es). En la segunda variante, el medio se vuelve hipertónico añadiendo soluto(s) impermeante(s) no tóxicos, y el(los) soluto(s) impermeante(s) no tóxico(s) no necesitan ser agregados al mismo tiempo que el crioprotector(s) permeante (el término "crioprotector" tal como se utiliza en este documento, puede referirse tanto a un solo crioprotector como a una mezcla de diferentes crioprotectores). En ambas variantes del método de protección hipertónica, se pueden reducir los requisitos de crioprotectores permeantes, se puede reducir el tiempo de exposición a crioprotectores permeantes y se puede lograr una dilución más rápida y segura de los crioprotectores después de la utilización, así como una protección contra la lesión inducida por enfriamiento. También son posibles diversas combinaciones de las dos variantes principales del método de protección hipertónica.

La adición de solutos impermeantes a crioprotectores antes del enfriamiento bloquea la lesión por enfriamiento sin la necesidad de reducir la concentración de crioprotectores para evitar la lesión por enfriamiento. Además, en la presente memoria descriptiva se reconocen dos regímenes térmicos para la reducción hipertónica de la lesión por enfriamiento, y se incluyen medios para optimizar la reducción de la lesión por enfriamiento mediante el uso de protección hipertónica optimizada sobre ambos regímenes térmicos.

La primera variante de estos métodos es un método en el que la solución de vehículo para crioprotectores se puede concentrar más para reducir la concentración de agentes permeantes necesarios para la vitrificación y facilitar el lavado rápido de los crioprotectores, en analogía a los procesos de congelación -la dilución mediada por concentración y descongelación tanto del vehículo como del crioprotector durante la congelación y descongelación normales.

El ámbito de la invención se define por medio de las reivindicaciones adjuntas.

Los siguientes ejemplos ilustran diversos medios de practicar el método de la presente invención. EJEMPLO 1

Tolerabilidad de tonicidad enorme en presencia de grandes concentraciones de crioprotectores y tolerabilidad de cambios de pasos enormes positivos y negativos en la tonicidad junto con grandes cambios en la concentración de crioprotectores

La Figura 1 muestra los efectos de simular la congelación de láminas corticales renales de conejo de 0.5 mm de grosor en DMSO al 10% p/v o en Veg al 10% p/v (Veg es una mezcla de DMSO (3.10 M), formamida (3.10 M) y glicol de etileno (2.71 M) en proporciones que se describen a continuación y se explican en la patente US6395467. En esta figura y todas las demás, las "viabilidades" de las láminas están indicadas por las proporciones K/Na del tejido. La relación K/Na se mide en todos los casos después de la restauración de las condiciones fisiológicas in vitro durante 90 minutos utilizando métodos estándar y publicados.

Los dos grupos superiores de barras muestran los efectos de la exposición al 10% de DMSO o al 10% de Veg. solamente. Estas concentraciones son inocuas, y la viabilidad es el 100% de la de las láminas de tejido fresco. Los datos del 10% de crioprotectores (DMSO o Veg) representan lo que las láminas experimentarían en el momento en que comienza la congelación.

El siguiente grupo de barras desde la parte superior de la figura es otro control, que muestra los efectos de exponer láminas al 20% p/v de Ve. solamente sin congelación simulada. Nuevamente, las proporciones K/Na están en el intervalo esperado para el tejido fresco no tratado.

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Los resultados clave son los tres grupos de barras restantes, etiquetados como "20%/40%", "hasta 40% D" y "hasta 40% V".

En el primero de estos grupos, "20%/40%", la simulación supuso que las láminas se congelaron en un 20% de Veg. hasta que la concentración total de Veg. alcanzó el 40% o, en otras palabras, hasta que el volumen líquido de la solución se redujo a la mitad del volumen inicial. En dicha situación, la solución de vehículo, RPS-2 (menos calcio y magnesio) también se concentraría por un factor de dos. Después de la exposición a esta solución, las láminas se transfirieron de 40% de Veg. en 2X RPS-2 a 20% de Veg. en 1X rPS-2.

Sorprendentemente, este grupo no demostró esencialmente toxicidad a pesar de la exposición a una solución de vehículo concentrada por un factor de dos a 0°C (todas las exposiciones se realizaron a 0°C).

En el siguiente grupo, "hasta 40% D", la simulación fue de congelación en 10% de DMSO hasta una concentración total de 40% de DMSO, lo que significa que, en este caso, el vehículo RPS-2 también se concentró cuatro veces. En este experimento, las láminas expuestas al 40% de DMSO se diluyeron, después de esta exposición, de nuevo a la solución de referencia inicial en un solo paso, sin ningún "tampón osmótico" como por ejemplo manitol añadido para compensar la dilución del crioprotector. En otras palabras, las láminas se transfirieron desde 40% p/v de DMSO en 4X RPS-2 a 10% de DMSO en 1X RPS- 2. Después de esta dilución inicial, el crioprotector restante se lavó en presencia de manitol 300 mM como un tampón osmótico, de acuerdo con los métodos publicados previamente. Este grupo resultó dañado, pero esto no es sorprendente porque se sabe que el 40% de DMSO es muy tóxico.

El grupo final etiquetado "hasta el 40% V" es más notable. En este grupo, la simulación fue de congelación en 10% de Veg a una concentración total de 40% de Veg, lo que significa que, de nuevo, el vehículo RPS- 2 también se concentró cuatro veces. A continuación, las láminas se transfirieron desde 40% de Veg en 4X RPS-2 a 10% de Veg en 1X RPS-2 en un paso, y el 10% de Veg se lavó gradualmente con 300 mM de manitol como un tampón osmótico. Sorprendentemente, este grupo no mostró toxicidad demostrable atribuida ni al Veg mismo ni al vehículo concentrado ni a la abrupta reducción de 4 veces en la concentración tanto en el Veg como en el RPS-2 al diluirse del 40% de Veg y 4X RPS-2 al 10% de Veg en 1X RPS-2 en un solo paso. Por lo tanto, la congelación y descongelación simulada es una forma aceptable de añadir rápidamente y eliminar rápidamente grandes concentraciones de crioprotector.

Generalmente, en la técnica anterior, cuando llega el momento de eliminar altas concentraciones de crioprotector de una célula o tejido u órgano, es necesario aumentar la tonicidad del medio añadiendo una cantidad extra de soluto impermeante, como manitol o sacarosa, para evitar que las células se hinchen debido a la reducción en la concentración de crioprotector extracelular. El ejemplo 1 muestra la viabilidad de un planteamiento opuesto: la reducción de la tonicidad conjuntamente con la reducción de la concentración de crioprotectores, una nueva técnica.

En la Figura 1, las barras grises y oscuras se refieren cada una de ellas a seis sectores duplicados tratados como subgrupos separados. Tal como resulta evidente a partir de la inspección de la figura, ambos conjuntos duplicados de cortes para cada tratamiento estuvieron de acuerdo, validando los resultados promedio generales para cada grupo, que son proporcionados por las barras blancas.

En el Ejemplo 2, se determinó que las concentraciones de crioprotectores que pueden vitrificar debido a la incorporación de una solución de vehículo 2X tienen una toxicidad aceptable y suprimen profundamente la lesión por enfriamiento.

EJEMPLO 2

Vitrificación con una solución de vehículo 2X con crioprotector

La literatura publicada anterior ha indicado que la lesión por frío en el riñón probablemente se deba a la contracción celular causada por la penetración incompleta de agentes crioprotectores en las células renales. Por lo tanto, exponer las láminas a una solución de vitrificación que contiene una solución de vehículo 2X antes del enfriamiento brusco a -20°C provocaría una lesión por frío peor que enfriando las láminas a la misma temperatura de la misma manera, pero en presencia de una solución de vehículo 1X. De hecho, se observó exactamente lo contrario. Los resultados se proporcionan en la Figuras 2 y en la Tabla 1.

En la Figura 2, las láminas se expusieron a dos soluciones de vitrificación o solo a la solución del vehículo, como sigue:

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"Con" se refiere a controles expuestos solo a RPS-2 a 02C.

V16 se refiere a la exposición durante 20 min a 0 C a una solución de vitrificación conocida como "V16", una solución que es ventajosa en vista de su muy alta estabilidad frente a la congelación al enfriar y al calentar y a la vista de su baja toxicidad. V16 es lo mismo que el 55% p/v de solutos Veg en 1X RPS-2, excepto que se agrega 2% de DMSO a la fórmula. Se añadió V16 en pasos de 1/16, 1/8, 1/4, 1/2 y con plena capacidad, a continuación se diluyó, en presencia de manitol 300 mM a lo largo de todo el proceso, a 1/2, 3/8, 1/4, 1/8, 1/16 y 0% de plena capacidad, a continuación se retornó a 1X RPS-2 sin manitol. La concentración de RPS-2 fue 1X durante todo el procedimiento. Cada paso fue de 20 minutos de duración.

"V2X" se refiere a la exposición a una solución que contiene 52% p/v de solutos Meg (DMSO, formamida y etilenglicol, en las proporciones estándar) en una solución de vehículo 2X RPS-2 y, como de costumbre, a 0°C durante 20 min. Esta solución se introdujo introduciendo primero, en una serie de pasos estándar (habitualmente, 1/16, 1/8, 1/4 y 1/2, de la concentración final de capacidad plena de los crioprotectores permeantes), la mitad de la capacidad plena de concentración de crioprotector y, a continuación, transfiriendo láminas a la solución de concentración completa que contiene 2X RPS-2 (menos Ca y Mg). Las láminas se diluyeron a 1/2 de la plena capacidad y a 1X de RPS-2 en una etapa posterior, se introdujo a continuación manitol 300 mM para una dilución adicional del crioprotector. Todos los pasos fueron de 20 minutos de duración.

El grupo "C16" es un grupo que se enfrió bruscamente a -20°C transfiriendo láminas de V16 a 0°C (después de 20 minutos a esa temperatura) a V16 a -20°C, y manteniéndolas a -20°C durante 20 minutos.

El grupo "C2X" se trató de manera idéntica, excepto que la solución crioprotectora fue la solución "V2X" en lugar de la solución "V16".

Finalmente, el último grupo implicó un experimento híbrido entre el mejor método conocido en la técnica anterior para evitar lesiones por enfriamiento y la utilización actual de una solución de vehículo hipertónica (mayor que 1X). En este grupo, las láminas se expusieron solo al 40% de Veg a 0°C durante 20 min, en 1X RPS-2, y a continuación se transfirieron a la solución V2X preenfriada a -20°C y se mantuvieron durante 20 min a esa temperatura como en los otros grupos de enfriamiento.

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TABLA 1

Tratamiento

Tonicidad K/Na SEM % de control

Controles (1X RPS-2)

1X 4.93 .21 100

V16 (Veg* en 1X RPS-2 + 2% p/v DMSO)

1X 4.27 .14 86.6

V2X (Veg reducido en 3% p/v en 2X RPS-2)

2X 4.66 .19 94.6

C16 (V16 refrigerado a - 20°C)

1X 3.04 .15 61.7

C2X (V2X refrigerado a -20°C)

2X 4.33 .23 87.9

C40 (40% p/v de Veg CPA a 0°C y a continuación transferencia a V2X a -20°C)

1X 2X 3.68 .14 74.6

* Veg = 16.84% p/v de etilenglicol más 13.96% p / v de formamida más 24.2% p/v de DMSO (concentración total = 55.00% p/v); V2X contiene los mismos solutos reducidos por un factor de 52/55; 40% p/v Veg CPA consiste en los mismos solutos reducidos por un factor de 40/55.

Los resultados, tal como se indica en la Figura 2, son extraordinarios. En primer lugar, tal como se ha señalado anteriormente, el grupo V16 obtuvo unos muy buenos resultados, proporcionando una relación K/Na promedio de 4.22 frente a la relación de control de 4.83, que representa la recuperación del 87% de la viabilidad de control (ver también la documentación tabular). Sin embargo, el grupo V2X consiguió unos resultados todavía mejores, alcanzando el 96% de la viabilidad de control (tercera barra desde abajo, K/Na = 4.64). Las láminas de enfriamiento en V16 a -20°C llevaron a la caída esperada en la viabilidad (K/Na de 3.05, que representa solo el 63% de la viabilidad de control). Pero las láminas de enfriamiento en V2X a - 20°C produjeron una relación K/Na de 4.34, o 89.9% de la viabilidad de control. Finalmente, utilizar tecnología de la técnica anterior para eludir lesiones por enfriamiento, es decir, enfriar láminas en una concentración menor de crioprotector para evitar la lesión por enfriamiento mediada por contracción celular, pero enfriarlas sumergiéndolas en V2X, que es hipertónico (concentración de solución de vehículo superior a 1X), dio como resultado un K/Na aproximadamente a mitad de camino entre los resultados del enfriamiento en el vehículo 1X (el grupo C 16) y los resultados del enfriamiento en el vehículo 2X (el grupo C2X). Por lo tanto, resultó perjudicial enfriar desde el 40%, 1X en comparación con el enfriamiento desde el 52%, 2X, en total contradicción con la técnica anterior. Además, resulto más beneficioso refrigerar en una solución 2X incluso comenzando desde la solución inicial al 40%, 1X, en oposición a la refrigeración en una solución 1X, nuevamente en contradicción con la técnica anterior. Estos datos forman la base experimental inicial para la utilización de soluciones hipertónicas para reducir o eliminar la lesión por enfriamiento.

EJEMPLO 3

Los resultados sorprendentes que se muestran en la Tabla 1 se confirmaron y ampliaron mediante la evaluación del nivel umbral de hipertonicidad necesario para la supresión de la lesión por enfriamiento. Tal como se muestra en la Tabla 2, el umbral de protección es asombrosamente bajo, y parece estar cerca de 1.2X.

TABLA 2

Crioprotector * y temperatura

Tonicidad K/Na SEM % de control

Ninguno (1X portador LM5), 0°C

1.0X 7.37 0.13 100

Veg-3% D(1)F en LM5, 0°C

1.0X 7.48 0.20 101

Veg-3% D(1 )F en 1.5X LM5, 0°C

1.5X 7.38 0.23 100

Veg-3% D(1)F en 1X LM5, 0°C, transferido al mismo a-20 C

1.0X 5.37 0.10 72.9

Veg-3% D(1)F en 1.2X LM5, O°C Transferido al mismo a-20 C

1.2X 6.75 0.15 91.7

Veg-3% D(1 )F en 1.5X LM5, 0°C, transferido al mismo a-20 C

1.5X 7.17 0.15 97.3

* Veg-3% D(1)F = 16.84% p/v etilenglicol más 12,86% p/v formamida más 22,3% p/v DMSO. Este fue el experimento 00-024, llevado a cabo el 31 de agosto de 2000. Todas las soluciones fueron expuestas durante 20 minutos a 0°C antes de la refrigeración, y después de la refrigeración se mantuvieron en las mismas soluciones durante 20 min adicionales. 12 muestras en cada grupo, como en la mayoría de los 5 experimentos informados en este documento. Todos los grupos se cargaron a crioprotector de potencia media en LM5 isotónico, a continuación se transfirieron a crioprotector de plena capacidad en la tonicidad establecida de LM5 y se lavaron utilizando crioprotector de media capacidad más manitol 300 mM en la primera etapa de lavado. Se agregaron concentraciones más bajas que la mitad de potencia y se eliminaron como 1/16, 1/8 y 1/4 de las soluciones de concentración total, y también se utilizó una solución 3/8 de la 10 concentración total en la fase de lavado. Todas las soluciones de lavado contenían manitol 300 mM.

La Tabla 3 muestra que el factor que rige la respuesta al enfriamiento es principalmente el nivel de hipertonicidad, independientemente de cómo se establezca. En esta tabla, el efecto de aumentar las concentraciones de todos los solutos de solución portadora (excepto para Ca2+ y Mg2+, que se omiten regularmente de soluciones superiores a 1X y en soluciones que contienen crioprotectores para evitar 15 problemas de solubilidad) se compararon con el efecto de agregar polímeros no penetrantes a la solución. Tal como se puede apreciar, los resultados son similares entre los dos planteamientos. Las tonicidades de los aditivos impermeantes de la Tabla 3 se proporcionan en detalle en la Tabla 4.

TABLA 3: Prevención de la lesión por refrigeración polímeros crioprotectores

Crioprotector * y temperatura

Tonicidad K / Na SEM % de control

Controles no tratados en LM5, 0°C

1.0X 7.19 0.14 100

Veg-3% D(1)F en 1X LM5, 0°

1.0X 6.88 0.16 96

Veg-3% D(1 )F en 1.5X LM5, 0°

1.5X 6.58 0.16 91.5

Veg-3% D(1)F más 0.7 Polímeros X, a 0°C (en 1X LM5)

1.7X 6.92 0.16 96.3

Veg-3% D(1 )F en 1.5X LM5, transferido al mismo a -20°C

1.5X 7.31 0.21 102

Veg-3% D(1)F en 1X LM5 más 0.7X polímeros, transferidos al mismo a -20°C

1.7X 6.48 0.14 90.1

20 * Veg-3% D(1)F = 16.84% p/v etileno glicol más 12.86% p/v de formamida más 22.3% p/v de DMSO. Los

polímeros 0,7X son PVP al 7% p/v de peso molecular medio de 5,000 ("PVP 5000") más 1% p/v de X1000 (un producto de alcohol poli vinílico comercializado por 21 st Century Medicine, 10844 Edison Court, Rancho Cucamonga, CA 91730;
http://www.21CM.com) y decaglicerol al 1% p/v. Este fue el experimento 00-025. Todas las soluciones expuestas durante 20 minutos a 0°C antes del enfriamiento, y después del 25 enfriamiento se mantuvieron en las mismas soluciones durante 20 min adicionales. Los grupos consisten en 12 muestras cada uno. La hipertonicidad estuvo presente solo en el crioprotector de plena capacidad, mientas que otras soluciones eran isotónicas. PVP 5000 es un polímero particularmente efectivo para promover la vitrificación, y tanto X1000 como el decaglicerol son antinucleadores útiles para la promoción de la vitrificación.

30 TABLA 4: Algunas osmolalidades y tonicidades de referencia útiles

Solución

ity Tonicidad (X)

LM5

285 +/- 3mOsm 1.0

LM5 + 1% p/v de decaglicerol

319 mOsm 1.12

LM5 + 7% p/v PVP 5,000

417 mOsm 1.46

LM5 + 7% p/v PVP 5,000 + 1% p/v X1000 + 1% p/v decaglicerol

478 mOsm 1.68

LM5 + 1% p / v X1000 +1 % p / v decaglicerol

346 mOsm (calculado) 1.21 (calculado)

* La composición de LM5 contiene 90 mM de glucosa, 45 mM de manitol, 7.2 mM de K2HPO4, 1 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 5mM de glutationa reducida, 28.2 mM de KCl, 10 mM de NaHCO3 y 1 mM de

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Adenina HCl, y se describe en la Patente n° US2002076687, "Una solución ventajosa de portador para concentraciones vitrificables de crioprotectores, y mezclas crioprotectoras compatibles", Fahy et al.

EJEMPLO 5

Protección contra la lesión por enfriamiento a temperaturas inferiores a -20°C

Los datos de la Figura 2 y de las Tablas 2 y 3 muestran una reducción de casi el 30% de la relación K/Na por enfriamiento, en relación con lo que se obtuvo con la misma solución crioprotectora 1X en 0°C. Esto es cuantitativamente lo mismo que la caída informada anteriormente en la corteza renal del conejo para una solución crioprotectora diferente (por ejemplo, en Fahy et al., en Cell Biology of Trauma, JJ Lemasters y C. Oliver, Eds, CRC Press, 1995, pp. 333-356) y está de acuerdo con muchas observaciones no publicadas. Además, se sabe que las lesiones por enfriamiento se vuelven aún más graves a temperaturas inferiores a -20°C. Por lo tanto, en experimentos adicionales, la falta de lesión a temperaturas en las que se espera una lesión se toma como evidencia para la respuesta exitosa de la lesión por enfriamiento.

Se realizaron muchos experimentos con la solución final enumerada en la Tabla 3, que tiene una tonicidad de 1,7X, incluyendo experimentos que investigan los efectos de temperaturas inferiores a 20°C. En la Figura 3 se da un resumen de los resultados de estos experimentos. Cada tipo de símbolo en la Figura 3 refleja un experimento separado hecho en un día separado. En la mayoría de los experimentos con temperaturas inferiores a -20°C, la exposición a baja temperatura se logró enfriando las láminas en contenedores en lugar de transfiriendo láminas sin protección a soluciones preenfriadas tal como se hizo para experimentos a - 20°C. Esto fue necesario por la solidificación de estas soluciones no congelantes a medida que las temperaturas se acercan a la temperatura de transición vítrea. Por lo tanto, la Figura 3 no solo extiende la observación de la supresión hipertónica de la lesión por enfriamiento a temperaturas más bajas, sino que también extiende la observación a tasas moderadas de enfriamiento (aproximadamente 2-20°C/min).

Mientras que una tonicidad de 1.7X es capaz de suprimir en gran medida la lesión por enfriamiento a -20 °C, no puede suprimir las lesiones por enfriamiento a temperaturas más bajas. La lesión continúa aumentando hasta que la temperatura alcance alrededor de -70°C a -90°C, y no aumenta aún más a temperaturas más bajas. A pesar de que no se suprimen todas las lesiones, la viabilidad retenida a -135°C, que está por debajo de la temperatura de transición vítrea de la solución, es similar a la viabilidad registrada a -20°C para las soluciones enfriadas a una tonicidad de 1X (representada por el trazo de la línea discontinua al 68% de recuperación, que es el 71% del valor inicial de -96% a 0°C, que refleja los niveles informados en las Tablas 1 y 2). La capacidad de posponer una lesión que normalmente se ve a -20°C por debajo de la temperatura de transición vítrea es un avance notable.

La Figura 3 también indica indirectamente que la lesión por enfriamiento es bioquímica y no es un artefacto de formación de hielo. (La nucleación del hielo tiene una probabilidad cero por encima del punto de fusión de la solución crioprotectora, que es cercana a -40°C, y aumenta solo cerca de la temperatura de transición vítrea, o por debajo de -100°C, un patrón opuesto al patrón de la lesión por enfriamiento. La falta de asociación de lesión con formación de hielo es evidencia de que los resultados no son un artefacto de protección inadecuada del tejido de la formación de hielo, sino que representan un efecto biológico real y demuestran una atenuación real del mismo.

Además, dado que estas conclusiones pertenecen incluso a tejidos que han sido vitrificados (la temperatura de transición vítrea estimada para esta solución es de aproximadamente -123°C), de la Figura 3 se desprende que todas las lesiones causadas por la vitrificación y el recalentamiento se pueden atribuir a la combinación de lesión por enfriamiento y toxicidad crioprotectora, ambos abordados por la presente invención. Esto pone el significado de la presente invención en una perspectiva clara.

EJEMPLO 6

Intervalo de tonicidad óptima para suprimir la lesión por refrigeración a alta temperatura

La Figura 3 implica que 1.7X no es la tonicidad óptima para suprimir la lesión por refrigeración, porque la lesión por enfriamiento ya es aparente a -20°C, en contraste con los efectos informados para 1.5X soluciones en las Tablas 2 y 3. Por lo tanto, resultó útil definir el intervalo de tonicidad óptimo para la protección contra lesiones por enfriamiento a alta temperatura y baja temperatura.

La Figura 4 muestra una recopilación de datos de muchos experimentos en los que se enfriaron muchas soluciones crioprotectoras diferentes de 0°C a aproximadamente -22°C a diferentes tonicidades. Cada símbolo representa la media de 12 láminas corticales renales de conejo. Para simplificar, se omiten las barras de error, que suelen ser de +/- 5%.

En base a estos experimentos, parece que la tonicidad óptima para la protección es de alrededor de 1.2 veces isotónica a alrededor de 1.5 veces isotónica. La protección neta es visible a tonicidades de 2.2X, pero esta tonicidad parece estar cerca del límite externo de utilidad. Varias soluciones en el intervalo de 2 - 2.2X se excluyeron debido a las bajas relaciones K/Na antes del enfriamiento (exposición a 0°C que produce

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relaciones K/Na inferiores al 90% del control); puede ser que las tonicidades más altas puedan tener efectos perjudiciales cuando los niveles de fondo de los crioprotectores son lo suficientemente altos como para ser vitrificables. En cualquier caso, parece que las mejores tonicidades para usar a temperaturas más altas son de 1.2 a 1.5X.

En la Figura 4, el triángulo negro grande trazado en 1.2X representa la elevación de la tonicidad al aumentar la concentración de la solución de alimentación. Los cuadrados en 1.2X reflejan experimentos en los que la tonicidad se elevó mediante la inclusión de polímero al 2% p/v (decaglicerol + X1000, 1% de cada uno). Los triángulos blancos corresponden a experimentos en los que la tonicidad se elevó por adición de polímero al 2% p/v a 0°C en una concentración de crioprotector, y las láminas se transfirieron posteriormente a soluciones crioprotectoras más concentradas a la misma tonicidad 1.2X a -22°C. Contrariamente al último experimento de la Tabla 1, en el cual las láminas también se transfirieron a una concentración mayor de crioprotector a una temperatura más baja, pero comenzando en 1X, los triángulos blancos documentan que se retuvo la protección completa cuando la tonicidad de los componentes no permeantes fue efectiva antes del enfriamiento y se mantuvo constante durante el cambio en la concentración de crioprotectores. En todos los demás casos que se muestran en la figura, tanto la tonicidad como la concentración de crioprotector se mantuvieron constantes de 0°C a -22°C.

EJEMPLO 7

Tonicidades óptimas para suprimir la lesión por enfriamiento lento a temperaturas de -100°C e inferiores, y métodos efectivos que implican dos etapas de exposición hipertónica para la optimización de la supresión de lesiones por refrigeración

Los resultados presentados anteriormente indican que el óptimo de tonicidad es bastante estrecho tanto a altas como a bajas temperaturas. La Figura 5 proporciona más información sobre el locus del óptimo y sobre una estrategia para ampliar el óptimo. La Figura 5 muestra los resultados de dos tipos de experimentos: Primero, la Figura 5 muestra los resultados de soluciones de enfriamiento que tienen tonicidades de 1.7, 1.8, 2.1 y 2.2 veces isotónicas (círculos grises). Hay una clara tendencia a la baja a medida que aumenta la tonicidad, lo que sugiere que las tonicidades por debajo de 1.7 arrojarán mejores resultados que los ya muy buenos resultados presentados en la Figura 3. En segundo lugar, se informan los resultados de muchos experimentos (puntos blancos y negros) en los que se usó una tonicidad para enfriar a aproximadamente - 22°C, y a continuación la tonicidad se elevó antes de un enfriamiento más profundo (permitiendo al menos 20 minutos para que la tonicidad más alta fuera experimentada por las láminas de tejido de 0.5 mm de espesor a -22°C). En un caso extremo, cambiar de 2.0X a 2.7X a -22°C antes de enfriar a -100°C (punto trazado a 2.7X) permitió una buena recuperación, mientras que se prevería una recuperación deficiente utilizando un protocolo en el que 2.7X está presente a todas las temperaturas desde 0°C hasta -100°C, basándose en los puntos grises que se muestran en la figura. En un caso más moderado, las muestras se enfriaron a -22°C en tonicidades que varían de 1.2X a 2X (1.2X a 1.5X en todos los casos menos uno) y a continuación se cambió a 1.7X antes de un enfriamiento adicional (puntos negros trazados a 1.7X) funcionó en promedio mejor que las muestras que fueron enfriadas en 1.7X desde cero grados hasta las temperaturas finales (puntos grises a 1.7X). Esta estrategia puede ser útil para soluciones de vitrificación que pueden requerir mayores tonicidades que las óptimas para la inhibición de la lesión por enfriamiento, ya que algunos de los efectos perjudiciales de estas tonicidades supraóptimas pueden negarse utilizando tonicidades más bajas a temperaturas más altas antes de saltar a la tonicidad final necesaria. En cualquier caso, la utilización del planteamiento de tonicidad en dos pasos (en el que la primera tonicidad fue de 1.2X) arrojó recuperaciones consistentemente superiores al 70% para 1.6X y al 80% para 1.5X, con una única recuperación de casi el 90% para 1.4X, y con una recuperación del 95% para una solución cuya tonicidad final fue de 1.5X. En el último caso, la temperatura final fue de -130°C, y la solución utilizada para enfriar a esta temperatura fue Veg -3% D(1)F + 7% de acetol + 1 % X1000 + 4% de decaglicerol en una solución de vehículo LM5. Estos resultados se comparan favorablemente con la recuperación de ~25-30% obtenible después de la vitrificación en VS41A y la recuperación de ~50-60% obtenible con las soluciones descritas en la Patente de Estados Unidos n° US6395467. En base a los datos en las Figuras 3, 4 y 5, resultó evidente que una buena tonicidad para enfriar a aproximadamente -22°C podría estar en el medio del intervalo entre 1.2X y 1.5X. En consecuencia, se realizó el siguiente experimento. En la descripción del experimento a continuación, todos los porcentajes son porcentaje peso/volumen (% p/v, o gramos por decilitro).

Tratamiento de Grupo

1 Controles (solución portadora LM5 solamente)

2 Exponer a la siguiente solución durante 20 minutos a 0°C:

Veg-3% D(1)F,

más 1% X1000 más 2.5% de decaglicerol (1.35 veces tonicidad)

3 Exponer a la misma solución como en el grupo 2 de la misma manera, pero a continuación se transfiere a una solución a -22°C que contenga los ingredientes anteriores pero que contenga también un 7% de acetol y un 1.5% de decaglicerol adicional, y mantener esa solución durante 30 minutos para equilibrarla (1.35X salta a 1.5X).

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4 Igual que el grupo 3, pero utilizando 7% de etilenglicol en lugar de 7% de acetol

5 Igual que el grupo 3, pero frío hasta -1102C.

La solución utilizada en los grupos 3 y 5 es virtualmente estable al calentarse a una velocidad de 5°C/minuto (solo el 0.2% de la masa de la solución puede cristalizar a este coeficiente de calentamiento). La solución utilizada en los grupos 4 y 6 es estable al calentarse a una velocidad de 2.9°C/min, basándose en el mismo criterio. En consecuencia, estas soluciones son aplicables a sistemas grandes como órganos y tejidos de ingeniería.

Los resultados del experimento anterior son los siguientes:

TABLA 5

Grupo

K/Na % de Control SEM en % de Control

1

5.60 100 2.23

2

5.86 104.6 2.51

3

4.87 86.9 2.20

4

5.34 95.3 1.25

5

4.89 87.3 1.93

Los resultados de la Tabla 5 indican que una solución 1.35X es inocua a 0°C, y que el enfriamiento de la misma en dos soluciones de vitrificación produjo una alta recuperación de -22°C, que en un caso llegó al 95%. El enfriamiento adicional en la solución 1.5X a -110°C no produjo lesión más allá de lo observado a - 15 22°C para la primera solución de vitrificación. Se está llevando a cabo otra variación de este experimento,

en la que se mantiene la tonicidad a 1.35X a temperaturas tanto altas como bajas, y se espera que produzca buenos resultados.

Resumen

Estos ejemplos indican que, a diferencia de la técnica anterior, el enfoque de hipertonicidad puede eliminar 20 hasta el 95% de toda lesión asociada con la exposición de tejidos vivos a concentraciones vitrificables, enfriarlas por debajo de la temperatura de transición vitrea, recalentarlas y eliminar el crioprotector, y que la técnica se refiere a los protocolos de enfriamiento rápido y lento. Por lo tanto, la presente invención hace que la perspectiva de la crioconservación de estructuras grandes y delicadas, como por ejemplo órganos y tejidos de ingeniería, se acerque drásticamente a la realización práctica. Además, los protocolos óptimos 25 para el cambio de tonicidad en dos pasos no se han definido con precisión, pero dicho ajuste de precisión se habilita en base a la presente descripción. Además, los ejemplos presentados en este documento pueden no definir con precisión la tonicidad óptima para todos los sistemas vivos. Sin embargo, el método de hipertonicidad puede practicarse para todos los sistemas vivos basándose en la presente descripción, ya que el intervalo óptimo de tonicidad se puede encontrar para cualquier sistema vivo basado en los ejemplos 30 proporcionados en este documento de la capacidad de identificar dicho intervalo para un sistema. De manera similar, los límites osmóticos tolerables para los diversos sistemas vivos pueden variar, pero todos los sistemas pueden someterse al protocolo de simulación de congelación para determinar cuáles son los límites para sistemas específicos. Los límites osmóticos para muchas células son ampliamente conocidos. Además, para combatir la lesión por enfriamiento, se anticipa que, en los ejemplos del presente documento, 35 el nivel más deseable de hipertonicidad será generalmente menor que el límite osmótico superior del sistema. Otras variaciones de las formas de realización preferentes serán evidentes para un experto en la técnica con referencia a las siguientes reivindicaciones.

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   DESCRIPCION

   Composición de tinta que comprende pigmentos ópticamente variables, uso de la composición, pigmento ópticamente variable y método para el tratamiento de dicho pigmento

   La invención se relaciona con pigmento variable ópticamente pasivado, un método para la preparación de dicho pigmento ópticamente variable pasivado, una composición de tinta que comprende dicho pigmento ópticamente variable pasivado, el uso de dicha composición de tinta, y un documento que lleva una marca hecha con dicha composición de tinta.

   Las tintas que contienen pigmento ópticamente variable como un rasgo público de seguridad son ampliamente usadas en billetes y documentos de valor, con objeto de protegerlos de la falsificación mediante equipos de reproducción a color generalmente disponibles, tales como aparatos de copiado a color, escaners e impresoras.

   Un tipo común de pigmento ópticamente variable se basa en una estructura de interferencia óptica en capas. Típicamente la estructura de interferencia tiene por lo menos una capa reflectora metálica, por lo menos una capa dieléctrica transparente y por lo menos una capa metálica semitransparente. Los metales como aluminio, oro, cobre o plata son usados como la capa reflectora metálica, los compuestos químicos como fluoruro de magnesio, dióxido de silicio u óxido de aluminio son usados como la capa dieléctrica transparente y metales como cromo o níquel son usados como la capa metálica semitransparente.

   La luz blanca incidente es refleja parcialmente en la capa superficial semitransparente del pigmento, y parcialmente en la capa metálica subyacente. La diferencia en la ruta óptica entre ambas partes de luz reflejada, da como resultado la interferencia constructiva o destructiva, dependiendo de la longitud de onda, es decir aumenta la reflectividad para ciertas longitudes de onda y la reduce para otras. Esta discriminación espectral es percibida por el ojo humano como la aparición de color. Para diferentes ángulos de visión, la diferencia en la ruta óptica cambia, lo cual hace que el material en capas exhiba color dependiente del ángulo.

   Los pigmentos ópticamente variables son manufacturados usualmente mediante deposición al vacío de las diferentes capas requeridas, sobre una red flexible. Después de la deposición del número deseado de capas, se retira la pila de capas de la red, bien sea disolviendo la red en un solvente adecuado, o mediante el arrastre del material ópticamente variable de la red. El material ópticamente variable es así desintegrado hasta hojuelas que tienen que ser procesadas adicionalmente para ajustar la aplicación propuesta, por ejemplo mediante trituración, molienda, etc. El producto resultante consiste en hojuelas planas con bordes rotos y formas irregulares y diferentes relaciones de aspecto. La hojuela tiene dos superficies planas paralelas, que muestran dichas propiedades de interferencia.

   El término "relación de aspecto" define la relación entre la extensión de la hojuela en las dimensiones planas del espesor de la pila de capas de interferencia. La primera es generalmente del orden de 5 a 40 pm, mientras la última es generalmente del orden de 1 pm.

   Una realización práctica de la hojuela de pigmento ópticamente variable se basa en una pila simétrica de Cr / MgF2 / Al / MgF2 / Cr, donde el espesor de las capas de absorción de cromo es 3.5 nm, el de la capa dieléctrica de MgF2 está entre 200 y 600 nm, y el de la capa reflectora de aluminio es aproximadamente 60 nm. Las capas superficiales de cromo constituyen adicionalmente una protección eficiente de las capas subyacentes de MgF2 y Al contra el ataque químico.

   Sin embargo, en el área de bordes rotos, las capas interiores de la pila son accesibles y no están cubiertas por ninguna capa protectora. Por razones ambientales, las formulaciones de tinta a base de agua son usadas y requeridas ahora ampliamente. Sin embargo, al valor de pH de tintas a base de agua, puede ocurrir corrosión de ciertos materiales del pigmento ópticamente variable.

   Por ejemplo, las formulaciones de tinta que contienen emulsiones acrílicas transmitidas por agua tienen generalmente un valor de pH en el intervalo de 7.0 a 8.5. Bajo estas condiciones, el aluminio puede ser atacado, en particular la presencia de grupos carboxílicos y otros agentes químicos que forman complejos con el ión Al3+. Simultáneamente se libera hidrógeno gaseoso, soplando la estructura de interferencia de las hojuelas, destruyendo el efecto de color ópticamente variable. El fluoruro de magnesio de las capas dieléctricas puede ser disuelto también en agua, lo cual destruye también el pigmento de interferencia, y así el efecto de color ópticamente variable.

   Los documentos de EEUU 5527848 y 5658976 describen la pasivación de pigmentos ópticamente variables, mediante tratamiento de las hojuelas de pigmento con soluciones de sales metálicas de metal de transición y de tierras raras, las cuales crean un recubrimiento delgado sobre la superficie del pigmento. Los documentos de EEUU 5545677, 5552458 y 5498781 y EP 0688833 describen la pasivación de pigmentos ópticamente variables, mediante la modificación de los pigmentos en una reacción química con un grupo funcional silano. Estos pigmentos

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   modificados son usados para preparar una formulación de recubrimiento pigmentada.

   El documento EP 1 090 963 A1 describe que sobre la superficie de un pigmento escamoso con un brillo perlino, un óxido metálico hidratado y uno o más fosfatos son recubiertos uno después de otro. Los óxidos metálicos están presentes para actuar como un aglutinante entre el pigmento escamoso y el fosfato. El pigmento en sí mismo no es cubierto por un fosfato. Dicho documento no aborda el problema de la sensibilidad a la corrosión.

   El documento EP-A-0 984 043 A1 está relacionado con el problema de la sensibilidad a la corrosión de la capa reflectora de un pigmento ópticamente variable. A este respecto, este documento sugiere usar como un material para la capa reflectora una aleación de Al en lugar de un metal tal como Al. No se menciona el problema de la corrosión de una capa adicional de dichos pigmentos ópticamente variables, es decir de la capa dieléctrica.

   En Müller, Tenside Surf. Det 37(2000), 241-244, se describe el efecto de tensioactivos específicos para pigmentos de aluminio y pigmentos de zinc, pero no para pigmentos ópticamente variables.

   El documento US 6,127,462 está relacionado con soluciones estables de epoxi silano. Dicho documento no está relacionado con la resistencia a la corrosión de pigmentos ópticamente variables.

   El documento WO 93/03103 A1 está relacionado con composiciones químicas a base de agua para impresión para serigrafía. Dicho componente no se relaciona con la resistencia a la corrosión de pigmentos ópticamente variables.

   Bleikom (SPIE Vol. 33314 (1998), 223-230, describe la estructura de pigmentos ópticamente variables. en particular, Bleikolm establece que tales pigmentos ópticamente variables comprenden una pila de interferencia de varias capas de una capa reflectora (tal como aluminio), capas dieléctricas (tales como difluoruro de magnesio) y capas semitransparentes (tales como capas de cromo). Bleikolm guarda silencio respecto al suministro de una capa de pasivación sobre cualquiera de dichas capas.

   El documento WO 00/22049 A1 se relaciona con una composición de tinta que comprende dos tipos diferentes de pigmentos ópticamente variables. Dicho documento guarda silencio respecto al suministro de una capa de pasivación sobre cualquiera de dichos pigmentos ópticamente variables.

   Es un objeto de la presente invención proteger pigmentos ópticamente variables del tipo mencionado, con objeto de reducir o inhibir la oxidación de sus capas metálicas y la disolución de sus capas dieléctricas. La naturaleza química de los diferentes materiales de la construcción de varias capas de Cr / MgF2 / Al / MgF2 / Cr de dichos pigmentos ópticamente variables requiere de manera notable una selección específica del agente de pasivación.

   Es un objeto adicional de la presente invención usar tales pigmentos protegidos en composiciones de tinta. Un objeto particular de la presente invención es una formulación de tinta de serigrafía a base de agua, que contiene un sistema de pasivación para dichos pigmentos ópticamente variables.

   Estos y otros objetos son logrados por la invención de acuerdo con las reivindicaciones independientes.

   Una composición de tinta de acuerdo con la invención comprende un sistema aglutinante orgánico, agua, y un pigmento seleccionado del grupo de pigmentos de interferencia que comprenden una pila en capas de diferentes materiales, en la que por lo menos una de las capas es una capa reflectora hecha de Al que tiene por lo menos una superficie químicamente expuesta y por lo menos una de las capas es una capa dieléctrica hecha de MgF2 que tiene por lo menos una superficie químicamente expuesta, y por lo menos una de las capas es una capa metálica semitransparente hecha de Cr, y dichos materiales comprenden uno o más metales y/o compuestos metálicos inorgánicos, donde dicho metal y/o compuesto metálico inorgánico es sensible a la corrosión y en la que por lo menos la superficie químicamente expuesta de dicha capa reflectora y dicha capa dieléctrica al borde de dicha pila de capas están sustancialmente cubiertas por un agente de pasivación, que es seleccionado del grupo de ésteres orgánicos y ésteres orgánicos fluorados de ácido fosfórico, que tienen la fórmula estructural:

   (Rf-CH2-CH2-O)xP(O)(OH)y

   en la que: Rf = F-(CF2-CF2)z

   x = 1 o 2

   y = 2 o 1

   x + y = 3

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   El término "tensioactivo" describe compuestos químicos que combinan dos diferentes tipos de funcionalidades

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   químicas, es decir una parte hidrófoba, llamada la "cola" del tensioactivo, y que es soluble en solventes con baja polaridad (tales como hidrocarburos), y una parte polar o hidrofílica, llamada la "cabeza" del tensioactivo, la cual es soluble en solventes con elevada polaridad (tal como agua). La "cabeza" del tensioactivo puede ser cargada (aniónico o catiónico) o puede estar sin carga. Un tensioactivo puede tener más de una cabeza y/o más de una cola.

   Los tensioactivos son así capaces de disolver entidades polares en un medio no polar mediante el ensamble sobre la superficie de la entidad polar, con la cabeza polar del tensioactivo apuntando a la entidad y la cola no polar del tensioactivo apuntando al medio no polar. De manera similar, los tensioactivos pueden disolver también entidades no polares (tales como grasa) en un medio polar (tal como agua).

   Un tensioactivo puede consistir en un grupo ácido fosfórico como la "cabeza" y una cadena orgánica (por ejemplo un hidrocarburo o un hidrocarburo fluorado) como la "cola" o las "colas". Dichos grupos de cola pueden estar unidos al ácido fosfórico mediante esterificación, dando como resultado fosfatos. El ácido fosfórico puede suministrar hasta tres grupos hidroxilo para la esterificación. Además, el ácido fosfórico parcialmente esterificado actúa como un amortiguador a través de la cantidad de grupos hidroxilo con protón y sin protón. Esto permite usarlos como agentes de control de pH.

   Además, los grupos hidroxilo y el átomo de oxígeno de los fosfatos son capaces de actuar como agentes formadores de complejos hacia los iones metálicos electrofílicos. "Formadores de complejos" indica aquí una interacción electrostática entre un ligando nucleofílico (grupos hidroxilo y/o átomos de oxígeno del ácido fosfórico) y un catión electrofílico, tal como H+, Mg2+, Al3+, etc., dando como resultado un enlace químico (unión) del ligando al catión. La unión de un ligando a un catión puede dar como resultado bien sea un complejo molecular, donde un catión está completamente rodeado por ligandos, o en un complejo superficial, donde un catión es parte de una superficie sólida (óxido, fluoruro, etc.), que tiene su lado libre, expuesto ocupado por uno o más ligandos.

   Los agentes de pasivación para pigmentos ópticamente variables de los tipos mencionados anteriormente, son hallados en el grupo de los ésteres orgánicos y ésteres orgánicos fluorados de ácido fosfórico que tienen la fórmula estructural:

   (Rf-CH2-CH2-O)xP(O)(OH)y en la que: Rf = F-(CF2-CF2)z x = 1 o 2

   y = 2 o 1 x + y = 3

   Z = 1 a 7.

   De modo sorprendente se halló que estos ésteres de ácido fosfórico (fosfatos), que son conocidos y están comercialmente disponibles como tensioactivos, exhiben excelentes propiedades de unión a los diferentes materiales de pigmentos ópticamente variables del tipo Cr / MgF2 / Al / MgF2 / Cr.

   De acuerdo con la invención, la composición de tinta comprende pigmentos ópticamente variables en los que las capas reflectoras están hechas de Al. Este metal exhibe propiedades adecuadas para la preparación de los pigmentos ópticamente variables y además excelentes propiedades como capas reflectoras. Las moléculas mencionadas de tensioactivo de fosfato son notablemente capaces de unirse firmemente a estos iones metálicos a través de la "cabeza" de fosfato, y así proteger (pasivar) la hojuela de pigmento ópticamente variable contra el ataque adicional por las sustancias químicas reactivas de los alrededores (formulación de tinta) por sus “colas” de hidrocarburo o de fluorohidrocarburo.

   La pasivación del pigmento ópticamente variable puede ser realizada por dos vías. En una primera vía, la composición de tinta comprende el agente de pasivación, y el pigmento ópticamente variable no tratado es añadido directamente a esta composición de tinta. Sin embargo, en una segunda vía también es posible tratar previamente el pigmento ópticamente variable con el agente de pasivación, antes de la incorporación del pigmento dentro de la composición de la tinta.

   En ambos casos, de acuerdo con la invención, se halló que es benéfica la adición de un exceso del agente de pasivación a la tinta de composición, con objeto de proteger cualquier superficie fresca que, por ejemplo, pueda aparecer durante una operación de mezcla.

   De acuerdo con la invención, la composición de tinta comprende pigmentos ópticamente variables que tienen capas dieléctricas hechas de MgF2. Se halló que el catión metálico de este compuesto se une firmemente a los grupos

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   fosfato de cabeza del tensioactivo.

   Por ello, la invención permite el uso en medios corrosivos, tales como composiciones de tinta a base de agua, de pigmentos altamente reflectores pero sensibles a la corrosión.

   Particularmente, puede lograrse una pasivación estable, dado que la composición de tinta comprende un agente de pasivación seleccionado del grupo de ásteres orgánicos y ásteres orgánicos fluorados de ácido fosfórico, que tienen la siguiente fórmula estructural genérica:

   (Rf-CH2-CH2-O)xP(O)(OH)y en la que: Rf = F-(CF2-CF2)z x = 1 o 2 y = 2 o 1 x + y = 3

   Z = 1 a 7

   El subíndice x indica el número de colas de la molécula de tensioactivo; el subíndice y indica el número de grupos hidroxilo disponibles para la formación de complejo con iones metálicos. La suma de los subíndices x y y es siempre tres. La selección de x y y define también las propiedades del grupo cabeza del tensioactivo. El subíndice z indica el número de entidades (CF2CF2) que están conectadas con la unidad CH2CH2O uniendo la cola al grupo cabeza del tensioactivo. La elección de z selecciona además propiedades específicas del tensioactivo respecto a solubilidad en diferentes solventes. Se halló que las moléculas de tensioactivo de la fórmula estructural descrita, que tienen un z que varía de uno a siete, tienen propiedades adecuadas para el uso propuesto como un agente de pasivación para pigmentos ópticamente variables en formulaciones de tinta.

   En una realización preferida de la invención, una composición de tinta contiene el agente de pasivación en una cantidad de 0.5 a 15 % en peso, referida al peso del pigmento ópticamente variable. De modo más preferido está en una cantidad de 1.5 a 6.5 % en peso y una cantidad incluso más preferida es 2.5 a 5.0 % en peso del peso del pigmento ópticamente variable. Se halló que estas cantidades de agente de pasivación eran suficientes para proteger los pigmentos por lo menos con una capa doble de moléculas de tensioactivo, y son por ello capaces de cubrir las capas de metal o dieléctrica del pigmento de manera eficiente contra el ambiente corrosivo de la formulación de tinta. Se encontró también que cantidades similares a las descritas eran suficientes en el tratamiento directo del pigmento ópticamente variable, con objeto de cubrir su superficie activa y obtener pigmento ópticamente variable pasivado de manera ordenada.

   Otro aspecto de la invención es una composición de tinta que comprende pigmento ópticamente variable pasivado y que tiene un valor de pH entre 7.0 a 9.0. Se prefiere un valor de pH para la composición de tinta entre 7.3 y 8.5 y se prefiere más un pH entre 7.5 y 8.0. El valor de pH permite el uso de menores cantidades de agente de pasivación mientras se mantiene la estabilidad a la corrosión de los pigmentos ópticamente variables y se mantienen todavía excelentes propiedades de la composición de tinta antes de la impresión.

   Una realización adicional de la invención es una composición de tinta en la que el agente de pasivación es disuelto en un solvente orgánico. El uso de agentes de pasivación disueltos suministra una mejor disponibilidad de las moléculas de tensioactivo para cubrir la superficie de los pigmentos ópticamente variables y por ello una mejora en el cubrimiento de la superficie.

   En una realización preferida de la invención, el solvente orgánico para disolver el agente de pasivación en la composición de tinta es seleccionado de entre el grupo de glicoléteres o el grupo de glicoles. Estos compuestos suministran una excelente solubilidad de dichos tensioactivos.

   Un aspecto adicional de la invención es una composición de tinta que comprende pigmento ópticamente variable pasivado y un sistema aglutinante que comprende una emulsión de copolímero acrílico o uretano acrílico, un agente de entrecruzamiento, opcionalmente un catalizador y opcionalmente otros aditivos. Las emulsiones de copolímero acrílico o uretano acrílico son seleccionadas de modo que la emulsión es soluble en álcalis. Esta selección permite manufacturar una composición estable de tinta sin el riesgo de precipitación de la emulsión de copolímero de la composición.

   Además, se selecciona una emulsión de copolímero acrílico o de uretano acrílico, que tiene un valor Tg en el intervalo de temperatura de -10° a 50°C. El valor Tg de “transición vítrea" define el intervalo de temperatura dentro del cual la emulsión cambiará desde un estado casi sólido o altamente viscoso (vítreo) a un estado de baja viscosidad (fluido). Se ha hallado que el valor Tg tiene una influencia importante en la capacidad de procesamiento

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   de la composición de tinta durante la impresión.

   El "agente de entrecruzamiento" es un componente que es capaz de construir una red tridimensional de polímero mediante reacción bien sea con otros componentes de la composición de tinta, o con otras moléculas de agente de entrecruzamiento. En el contexto de este documento "curado" indica la reacción de secado o solidificación o polimerización de la tinta impresa después de imprimir, de manera que la tinta ya no puede i) ser retirada del sustrato y ii) formar pilas con otros sustratos colocados sobre la tinta impresa. Adicionalmente, el curado ejecuta una pasivación de la tinta impresa contra diferentes tipos de tratamientos (agua, solventes, ácidos, bases, etc.) dentro de límites especificados.

   El término "injerto" indica la unión estable de la molécula de agente de entrecruzamiento a las moléculas de polímero de las emulsiones de copolímero acrílico o uretano acrílico. Las moléculas modificadas (injertas) tendrán casi las mismas propiedades físicas que antes de la reacción de injerto.

   El "catalizador" es un compuesto químico que reduce el umbral de activación para un tipo especificado de reacción y por ello promueve dicha reacción. El catalizador permanecerá en la misma composición química después de la reacción, comparado con antes de ella. Debido a este hecho, un catalizador es requerido sólo en pequeñas cantidades.

   "Aditivos" comprende aquellos compuestos y materiales que son usados para ajustar parámetros físicos y químicos de la composición de tinta, tales como el valor de pH, la viscosidad, la consistencia, las propiedades de espuma, las propiedades lubricantes, etc.

   En una realización preferida, la composición de tinta comprende una emulsión de copolímero acrílico o de uretano acrílico del sistema aglutinante, que es seleccionado del grupo de polímeros que tienen propiedades de autoentrecruzamiento. Estas propiedades abren la posibilidad de construir una red interconectada que encierra las partículas de pigmento, de modo que ellas adquieren resistencia mejorada contra los tratamientos químicos y físicos.

   En una realización adicional preferida, la composición de tinta comprende un agente de entrecruzamiento del sistema de aglutinante, que es seleccionado del grupo de alcoxi silanos sustituidos (R1)y(R2O)zSi (en la que R1, R2 son diferentes sustituyentes, y + z = 4), preferiblemente del grupo de trialcoxi silanos monosustituidos (y = 1, z = 3). Los sustituyentes R1, R2 del agente de entrecruzamiento comprenden dos funcionalidades químicas diferentes, en las que la primera funcionalidad R1 es seleccionada de modo que reacciona antes de la impresión y en la que la segunda funcionalidad R2 es seleccionada para ejecutar el curado de la tinta impresa.

   La primera funcionalidad suministra la posibilidad de injertar la emulsión de copolímero acrílico o uretano acrílico con una molécula de agente de entrecruzamiento que es capaz de reaccionar en un segundo paso, sobre una inicialización adicional (segunda funcionalidad). Esto puede ser hecho mediante una corta elevación de la temperatura, la cual inicia la liberación de protones mediante la descomposición de compuestos introducidos por la neutralización de la emulsión, y que inicia en consecuencia el curado de la película de tinta impresa. "Funcionalidades químicas" indica que un compuesto químico contiene un grupo de átomos que soportan un tipo específico preferido de reacción, por ejemplo grupos -OH o -SH son capaces de reaccionar con ácidos para formar ésteres, con la ayuda de un catalizador. Las diferentes funcionalidades químicas son bien conocidas por una persona experta en la técnica. Usando una elección seleccionada de condiciones (por ejemplo temperatura, solvente, etc.) la persona experta en la técnica es capaz de controlar la reacción de compuestos químicos que contienen más de una funcionalidad química, de modo que reacciona sólo una de las funcionalidades químicas.

   En una realización incluso más preferida de la composición de tinta, el agente de entrecruzamiento del sistema aglutinante es seleccionado de entre el grupo de trietoxisilanos monosustituidos, preferiblemente del grupo de trietoxisilanos epoxi-cicloalifáticos y del grupo de glicidil-trietoxisilanos. Un grupo etoxi como sustituyente R2 suministra un grupo reactivo que puede ser hidrolizado bajo condiciones controladas y que es susceptible de reaccionar con otros componentes de la formulación de tinta o con el sustrato. La entidad epoxi como sustituyente R1 es capaz de reaccionar con grupos funcionales de la emulsión de copolímero acrílico o uretano acrílico, creando una red formada previamente, antes del proceso de impresión.

   Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición de tinta que comprende una cantidad de agente de entrecruzamiento en un intervalo entre 0.25 y 3.0 % en peso, referida al peso total de la composición. Una composición preferida de tinta comprende una cantidad de agente de entrecruzamiento entre 0.5 y 2 % en peso y una composición de tinta incluso más preferida comprende una cantidad de agente de entrecruzamiento entre 1 y 2 % en peso. Se encontró que las cantidades descritas imparten suficiente resistencia a la tinta impresa y curada.

   Preferiblemente la composición de tinta contiene pigmento ópticamente variable en cantidades que varían entre 10 y 25 % en peso del peso total de la composición. Se prefiere una composición de tinta con una cantidad de pigmento ópticamente variable de 12 a 20 % en peso y se prefiere incluso más una cantidad de 15 a 18 % en peso.

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   Las cantidades divulgadas de pigmento ópticamente variable dan como resultado una composición de tinta que exhibe una excelente cobertura de color y ofrece la posibilidad de fácil detección visual y/o en máquina de las propiedades ópticas de la tinta impresa y curada.

   De acuerdo con la invención, se usan pigmentos de interferencia de capa delgada ópticamente variables, los cuales se caracterizan porque la superficie de dicho pigmento está cubierta con un agente de pasivación. Dicho agente de pasivación es seleccionado de entre el grupo de ésteres orgánicos y ésteres orgánicos fluorados de ácido fosfórico (fosfatos) que tienen la fórmula estructural:

   (Rf-CH2-CH2-O)xP(O)(OH)y en la que: Rf = F-(CF2-CF2)z x = 1 o 2 y = 2 o 1 x + y = 3

   Z = 1 a 7.

   Como ya se mencionó anteriormente, el tensioactivo actúa primariamente como un mediador entre los componentes hidrofílico e hidrófobo, y puede así por ejemplo, disolver grasa en agua o viceversa. Aparte de ser tensioactivo, el grupo cabeza de fosfato del tensioactivo es un buen formador de complejos y por ello es susceptible de unirse en sí mismo a iones metálicos y a superficies que contienen iones metálicos.

   Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para la pasivación de pigmentos ópticamente variables, donde dicho método incluye los siguientes pasos:

   1. a) suministre un agente de pasivación o una solución de dicho agente de pasivación y disuélvalo en un solvente orgánico;
2. 2. b) añada agua a la solución resultante del paso a) y mezcle completamente;
3. 3. c) ajuste el pH de la mezcla hasta un valor entre 7.3 y 8.5; preferiblemente entre 7.5 y 8.0;
4. 4. d) disperse pigmento ópticamente variable en la mezcla obtenida en el paso (c).

   La disolución del agente de pasivación en un solvente orgánico, seguida por la adición de agua y ajuste de pH suministra un tensioactivo disperso en solución. El ajuste del valor de pH antes de la adición del pigmento ópticamente variable evita o reduce el riesgo de una posible reacción de la forma ácida del tensioactivo con el pigmento ópticamente variable. Este método permite reducir a un mínimo la cantidad de tensioactivo necesario, para pasivar las superficies del pigmento ópticamente variable.

   En una realización preferida de la invención, el método de pasivación de pigmentos ópticamente variables comprende el uso de dicho agente de pasivación en cantidades que varían entre 0.5 y 15 % en peso referidas al peso total del pigmento ópticamente variable. Se prefieren más cantidades que están entre 1.5 y 6.5 % en peso e incluso se prefieren más cantidades que están entre 2.5 a 5.0 % en peso. Como ya se mencionó anteriormente, estas cantidades permiten una excelente cobertura de superficie de las hojuelas de pigmento.

   Otro aspecto de la invención se refiere a un método de pasivación de pigmentos ópticamente variables, en el que el solvente orgánico es seleccionado de entre el grupo de glicol éteres o del grupo de glicoles. Se encontró que estos tipos de solventes permiten la adecuada solvatación del tensioactivo.

   Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un método de pasivación de pigmentos ópticamente variables en el que el valor de pH de la solución que contiene el agente de pasivación es ajustado preferiblemente a un pH de 7.3 a 8.5 y más preferiblemente ajustado a un pH de 7.5 a 8.0. Se halló que estos valores dan como resultado cantidades mínimas de especies corrosivas, es decir ácido fosfórico e ion hidróxido, poblando la solución de pasivación, y permiten por ello usar una cantidad mínima de agente de pasivación respecto al pigmento ópticamente variable, y todavía lograr una eficiente pasivación.

   Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de dicha composición de tinta que comprende dichos pigmentos ópticamente variables pasivados para impresión en serigrafía, flexo o huecograbado a base de agua. Tradicionalmente, aquellas técnicas de impresión están notablemente atadas a grandes cantidades de solventes orgánicos que son añadidos a la tinta, con objeto de obtener la baja viscosidad requerida para aplicación, y que tiene que evaporarse después de la impresión. Las tintas a base de agua se basan en emulsiones de polímero en

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   agua y evitan por ello potenciales riesgos de salud para los trabajadores de impresión, mientras son al mismo tiempo amigables con el medio ambiente. Las formulaciones de tinta a base de agua son casi incompatibles con pigmentos ópticamente variables, en que tienen una vida útil muy corta, debido a la degradación del pigmento. La presente invención permite formular tintas a base de agua, que contienen pigmentos ópticamente variables mientras tienen vida útil comparable a las tintas a base de solvente, que contienen los mismos pigmentos.

   Un aspecto adicional de la invención se refiere a la marcación de un documento que es obtenido mediante impresión de la composición de tinta de la invención, por serigrafía, flexo o huecograbado. Las marcas que contienen el pigmento ópticamente variable pasivado exhiben excelente resistencia contra los agentes químicos y físicos, comparadas con marcas similares que contienen el mismo pigmento ópticamente variable pero no pasivado. Las marcas que contienen pigmento ópticamente variable pasivado exhiben también rasgos ópticos mejorados (tales como lo indican los valores medidos de croma y desplazamiento de color) comparados con las marcas que contienen pigmentos ópticamente variables que no son pasivados. También mejora la estabilidad de largo plazo del color de las impresiones que contienen pigmento ópticamente variable pasivado.

   Un aspecto adicional de la invención se requiere a un documento que lleva la marca obtenida mediante impresión con una tinta de acuerdo con la invención.

   La invención será explicada ahora en más detalle mediante ejemplos no limitantes respecto a la pasivación de pigmentos ópticamente variables y a composiciones de tinta que son dadas para propósitos de ilustración.

   Lista de abreviaturas:

   •Imicure EMI-24 (Air Products) 2-etil-4-metilimidazol

   •AMP-95 (Angus Chemie GmbH) 2-amino-2-metil-1-propanol, solución al 95%

   •DMA Fluka (N,N'-dimetiletanolamina)

   •Neocryl XK-11 NeoResins/ Avecia •Neocryl XK-14 NeoResins/ Avecia •Neocryl BT-9 NeoResins/ Avecia •Neocryl BT-20 NeoResins/ Avecia •Armorez CR2900 Westvaco

   •CoatOSil®1770 Witco Co.beta-(3,4-epoxiciclohexil) etiltrietoxisilano •CoatOSil® Y-11988 Witco Co emulsión al 40% de CoatOSil® 1770 en agua •CX-100 NeoResins/ Avecia compuesto de poliaziridina •Zonyl® UR Dupont fluorotensioactivo Pasivación de pigmentos ópticamente variables

   Los pigmentos ópticamente variables (OVP) usados en los ejemplos descritos comprenden 3 materiales diferentes, notablemente una película delgada de aluminio (Al), una capa dieléctrica de fluoruro de magnesio (MgF2) y una capa muy delgada de cromo (Cr). Se sabe que bajo condiciones alcalinas el aluminio es atacado por el agua, de acuerdo con la ecuación química:

   2 Al + 6 H2O + 2 OH' ^ 2 [Al(OH)4]- + 3 H2.

   A su vez el fluoruro de magnesio, MgF2, es ligeramente soluble en agua. El análisis cualitativo y cuantitativo de residuos solubles en agua (Mg, Al, Cr) de los pigmentos ópticamente variables fueron obtenidos usando espectrometría de absorción atómica, un método analítico bien conocido por los expertos en la técnica. Las concentraciones de Mg, Al y Cr solubles fueron así medidas en las soluciones sobrenadantes obtenidas después de dispersar pigmento ópticamente variable en agua a pH = 8.5. A continuación se hizo seguimiento a la evolución de dichas concentraciones, durante un período de tiempo de 2 meses.

   Ejemplo I

   Pasivación directa en agua:

   5

   10

   15

   20

   25

   Se disuelven 1.4 g de la forma ácida del agente de pasivación Zonyl®UR en 10 mL de butilglicol. Se diluye la solución hasta 100 mL con agua desionizada. Se ajusta el pH con DMA (N,N'-dimetiletanolamina). Se dispersan 5 g de OVP en 95 g de la solución descrita anteriormente (muestra 1) a T = 25°C. Se filtra la dispersión de OVP después de 1 día, 1, 2, 3 semanas y 2 meses. Se diluyen los filtrados hasta 200 mL, y se analizan por EAA. Como una referencia, el mismo procedimiento es ejecutado sobre OVP no pasivado (Referencia 1).

   Resultados del análisis EAA de OVP pasivado y no pasivado en solución de pH 8.5 a tiempos de reacción variables.

   t/días

   1 7 14 21 60

   OVP pasivado (muestra 1)

   Mg*

   3.0 3.5 4.0 4.0 6.0

   Al*

   0.84 0.28 0.62 0.60 2.11

   Cr*

   1.22 1.49 1.43 1.38 1.51

   OVP no pasivado (Referencia 1)

   Mg*

   24.0 27.0 25.0 27.0 31.5

   Al*

   1.67 0.91 0.98 0.60 1.03

   Cr*

   0.02 0.01 0.03 0.05 0.00

   *: Concentraciones de átomos en ppm

   El agente de pasivación reduce la concentración de Mg y Al a un valor de pH de 8.5, comparado con las muestras no pasivadas, excepto para la concentración de Al a los 60 días de tiempo de reacción. La concentración de Cr es más alta que la del OVP que no ha sido pasivado. El agente de pasivación parece formar complejos y estabilizar los iones Cr en la solución.

   Las moléculas del agente de pasivación se disponen a sí mismas en varias capas y crean así una barrera hidrófoba que evita que las moléculas de agua alcancen la superficie de OVP e hidraten MgF2. Se cree que cuando están hidratando al MgF2, las moléculas de agua causarían el hinchamiento de la capa dieléctrica y perjudicarían o destruirían el desplazamiento óptico. Estas varias capas evitan además la oxidación de Al causada por el ataque de iones hidróxido.

   Ejemplo II

   Se disuelven 0.5 g de Zonyl®UR en 6 g de dipropileneglicol metiléter y se completa a 100 g con agua desionizada. Se añade AMP-95 para ajustar el pH a 8.5 a T = 25°C. Se dispersan 15 g de OVP verde a azul con 85 g de aquella solución (muestra 2). Se prepara una referencia sin aditivo de pasivación a pH=8.5 (Referencia 2). Después de 24 horas se filtra la dispersión, se lava completamente con agua desionizada, pero no se seca, y se dispersa nuevamente la muestra de OVP en soluciones del mismo pH : 1. con Zonyl®UR (muestra 3) y 2. Sin Zonyl® UR (muestra 4). Se miden las concentraciones de Mg, Al y Cr usando EAA después de 24 horas y 2 semanas de acuerdo con el mismo procedimiento.

   Resultados del análisis por EAA de muestras 2 (S2), 3 (S3), 4 (S4) y referencia 2 (R2) a tiempos variables de reacción.

   Mg*/pH=8.5 Al*/pH=10 Cr*/pH=8.5

   S2 S3 S4 R2 S2 S3 S4 R2 S2 S3 S4 R2

   1 d

   3.0 10.5 11. 0 10. 0 4.7 2 4.1 9 9.5 8 8.8 2 1.2 2 0.0 2 0.0 1 0.0 2

   Mg*/pH=8.5 Al*/pH=10 Cr*/pH=8.5

   S2 S3 S4 R2 S2 S3 S4 R2 S2 S3 S4 R2

   14 d

   4.0 19.2 5 19. 0 15. 0 4.2 2 2.0 9 1.5 6 1.0 1.4 3 0.0 4 0.0 2 0.0 3

   *: Concentraciones de átomos en ppm

   El método descrito usa una relación de Zonyl®UR a OVP verde/azul que es seis veces más baja comparada con muestra 1, por ello los valores de concentraciones son diferentes.

   La fina dispersión de Cr metálico en forma de hojuelas o agrupaciones nanoscópicas actúa en la presencia de 5 agente de pasivación como una ayuda muy efectiva de humectación y dispersión. Estas nanopartículas de Cr provienen del “polvo” causado por la operación de trituración durante la fabricación de OVP. El agente de pasivación se despega del "polvo" de la superficie del OVP y lo dispersa en agua de una manera muy efectiva. Las nanopartículas son demasiado pequeñas para ser separadas por filtración. El Cr ya no está presente en solución cuando el OVP es filtrado, lavado y colocado nuevamente en las mismas condiciones. Sin embargo, la 10 concentración de Cr es muy baja [Cr]<1.5 ppm.

   Ejemplo III

   Pasivación indirecta en una solución no acuosa

   Se disuelven 0.5 g de Zonyl®UR en 6.0 g de dipropileneglicol metiléter y se añade 0.14 g de AMP-95 para neutralizar el aditivo de pasivación. Se añade esta solución al OVP (15 g). La mezcla es realizada manualmente 15 con objeto de lograr una buena humectación, y se deja la mezcla por 24 horas. Se añaden 7.22 g de esta mezcla que contiene 5 g de OVP puro, a una solución acuosa (total: 100 g) a pH = 8.5 y T = 25°C. Se separa por filtración la dispersión después de 24 horas y 2 semanas, se completan las soluciones a 200 mL y se analizan por EAA (Muestra 5).

   20 Resultados del análisis por EAA de muestras 1 (S1) y 5 (S5) y referencia 1 (R1) a tiempos variables de reacción.

   Mg*/pH=8.5 Al*/pH=10.0 Cr*/pH=8.5

   S1 R1 S5 S1 R1 S5 S1 R1 S5

   1 d

   3.0 30.2 14.5 4.72 0.88 1.07 1.22 0.0 0.03

   14 d

   4.0 19.75 18.25 4.22 0.42 1.22 1.43 0.0 0.03

   *: Concentraciones de átomos en ppm

   Con una concentración igual de OVP, a pH=8.5, la concentración inicial de Mg (14.5 ppm) es mucho mayor después de 24 horas, comparada con la muestra 1 (3 ppm), pero significativamente inferior a una referencia sin pasivación (30.2 ppm). Las concentraciones de Mg tienden a alcanzar el mismo valor después de 2 semanas (19.75 25 ppm).

   Ejemplo IV

   Influencia de diferentes concentraciones de Zonyl®UR:

   Se añaden 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1 y 2g de Zonyl®UR a 6 g de dipropileneglicol metiléter, se ajusta el valor de pH a 8.5 con AMP-95. Se añade agua adicional para completar la solución a 85 g. Se dispersan 15 g de OVP verde/azul 30 (muestra 6) o 15 g de Chromaflair® magenta/oro (muestra 7) en esta solución. Se separan por filtración OVP pasivado o Chromaflair® pasivado después de 24 horas y 2 meses respectivamente, se completan las soluciones a 200 mL y se analizan por EAA.

   Los pigmentos Chromaflair® han sido tratados térmicamente para detener la hidrólisis en condiciones climáticas difíciles (desarrollado para la industria de los carros).

   Concentraciones resultantes de Mg para diferentes cantidades de Zonyl®UR a pH 8.5 y a T=25°C:

   0 % 0.1 % 0.25 % 0.5 % 1 % 2 %

   Muestra 6

   1 día

   24.0 6.0 3.5 2.0 2.5 4.0

   60 días

   31.5 12.32 10.33 5.82 3.28 3.78

   Muestra 7

   1 día

   9.5 3.1 1.1 1.6 2.2 4.1

   60 días

   34.88 23.88 9.71 6.5 2.13 3.78

   5 Como puede verse a partir de la tabla, la concentración de Mg depende de la concentración de Zonyl®UR. La concentración óptima está comprendida entre 0.25 y 1%, idealmente en 0.5%. La relación OVP/Zonyl®UR debería mantenerse entre 1.5 y 6.5.

   Para OVP con 0.5% de Zonyl®UR, la concentración de Mg se divide por 12 dentro de 24 horas. Después de 2 meses la concentración de Mg aumenta pero es todavía cinco veces inferior a 0.5% de Zonyl®UR y ocho veces a 10 1% que sin Zonyl®UR.

   Para Chromaflair®, con 0.5 % de Zonyl®UR la concentración de Mg se divide por 6 dentro de 24 horas. Después de 2 meses la concentración de Mg aumenta pero es todavía 5 veces inferior a 0.5% de Zonyl UR y 16 veces a 1% que sin Zonyl®UR.

   La concentración de Mg es dos veces inferior con un pigmento Chromaflair® comparado con un pigmento OVP.

   15 Ejemplo V

   Composiciones de tinta a base de agua de un componente con pigmentos ópticamente variables pasivados para aplicación en impresión rotativa de serigrafía.

   Las tintas a base de agua para serigrafía con desplazamiento de color o pigmento ópticamente variable son aplicadas sobre papel de billete de seguridad usando un equipo de recubrimiento automático manual (barra de 20 recubrimiento manual bar no 3, espesor de película húmeda de 24 pm). Se seca la tinta aplicada por 30 segundos a 80°C y se revisa la adhesión con una uña de dedo.

   Las resistencias química y física son medidas normalmente con solventes, sangrado ácido y alcalino a temperatura ambiente o temperatura elevada, maceración húmeda (=WC) y maceración seca (=DC), fricción húmeda (=WR) y fricción seca (=DR), pruebas de lavandería (especificaciones establecidas por INTERPOL en la 5a Conferencia

   25 Internacional sobre Moneda y Falsificación en 1969, o por los métodos de prueba de Bureau of Engraving and

   Printing como se establece en BEP-88-214 (TN) sección M5). Las resistencias a lavandería, fricción húmeda y sangrado alcalino son normalmente las de logro más difícil.

   Las pruebas de maceración húmeda y seca fueron ejecutadas en un instrumento IGT. Se enrolla e introduce en un tubo una impresión de aproximadamente 5x5 cm. El rollo de papel es triturado en el tubo usando una pieza metálica 30 que tiene el mismo diámetro. Se analiza la pieza de papel y se enrolla nuevamente en otra dirección (a 90°).

   Después de 4x, se gira la impresión al otro lado. Se repite la operación 4x (húmedo) o 8x (seco). La prueba húmeda

   es realizada en las mismas condiciones usando una impresión que ha sido sumergida en agua por 10 minutos.

   Las pruebas de fricción fueron realizadas con un instrumento Prüfbau. Condiciones: pruebas de fricción seca, 100 x con un peso de 610 g y pruebas de fricción húmeda después de haber sumergido las muestras por 10 minutos en 35 agua.

   La primera prueba de lavandería, llamada solución de lavandería con agitación, es ejecutada usando un reactor de 1L, que comprende un agitador mecánico, una manta de calentamiento, que contiene 500mL de agua, 2.5g de polvo industrial de lavandería (Persil, Henkel o equivalente) y 5 g de Na2CO3. Se colocan en el reactor tres

   muestras impresas (cuadrados con borde de 5x5 cm), se agita y se calienta por 30 minutos. Se lavan las muestras usando agua destilada y se secan por 2 horas a 40°C. El resultado es estimado sobre un promedio de tres muestras. La agitación mecánica lenta y elevada temperatura de esta prueba es la ilustración de una prueba química específica.

   5 La segunda prueba de lavandería, llamada prueba de máquina de lavado, es ejecutada usando una máquina estándar de lavado (Lavamat W 1020, AEG) con 2 kilogramos de tela de algodón y 100 mL de polvo de lavandería (Persil, Henkel). Se colocan las muestras impresas (cuadrados con borde de 5x5cm) en bolsas individuales de algodón. La prueba de lavandería es realizada a 95°C por 40 minutos. El resultado es estimado sobre un promedio de tres muestras. La buena mezcla en bolsas individuales y la elevada temperatura es la ilustración de una prueba 10 física específica.

   La alteración de la tinta es estimada visualmente de acuerdo con la siguiente escala:

   Nota

   Alteración visual de la quinta

   6

   Sin alteración

   5

   0-20%

   4

   20-33%

   3

   33-50%

   2

   50-66%

   1

   66-80%

   0

   80-100%

   Las muestras 8 y 10 consisten en pigmentos ópticamente variables pasivados. Las muestras 9 y 11 contienen los mismos pigmentos ópticamente variables, pero en un estado no pasivado. Las muestras de tinta son preparadas 15 siguiendo este procedimiento:

   Muestra 8:

   1. Pasivación de pigmento in situ en agua:

   Propilenglicolmetiléter

   6.0

   Zonyl UR

   0.5

   Agua

   22.0

   OVP verde/azul

   15.0

   AMP-95

   0.25

   A una solución de Zonyl®UR en propilenglicolmetiléter se añade agua a 50°C. Además, se añade OVP a 20 temperatura ambiente durante la mezcla y se mantiene el pH entre 7.5-8.0 con AMP-95. Se dispersa lentamente el pigmento OVP (500 rpm) usando un mezclador de laboratorio, durante 30 minutos.

   Preparación de la tinta:

   Neocrl XK-11

   48.0

   Jonwax 22

   3.0

   Byk 024 (BYK-Chemie)

   1.9

   Byk 025 (BYK-Chemie)

   0.1

   Aerosil 200 (BYK-Chemie)

   1.0

   CoatOSil 1770 Witco Co.

   1.0

   Silwet L-7608 Witco Co.

   0.1

   Se introducen todos los componentes en la dispersión de OVP y se agita por 5 minutos a 1000-1500 rpm. Se mide el pH y se ajusta a 7.5-8.0 si es necesario con AMP-95. Se añaden CoatOSil®1770 y Silwet L-7608 como una 5 mezcla a la tinta bajo buena mezcla a1500 rpm por 15 minutos.
5. 2. Ajuste de la viscosidad:

   Agua

   1.7

   Rheolat 278

   0.55

   Se añade cuidadosamente el espesante (Rheolat 278) con objeto de obtener una viscosidad entre 250±50 mPa.s. Si es necesario, se añade AMP-95 para mantener el pH entre 7.5-8.0.

   10 Se fabrica la misma tinta sin el agente de pasivación Zonyl®UR (muestra 9). Se prepara de la misma forma también una tinta usando un pigmento ChromaflairMR (magenta a oro) con y sin Zonyl®UR (Ejemplos 10 y 11).

   Resultados de la composición de tinta con pigmentos ópticamente variables pasivados y no pasivados.

   Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10 Muestra 11

   meses

   LWM* LSS* LWM* LSS* LWM* LSS* LWM* LSS*

   0

   5,5 5,75 4,5 5,25 5,35 5,25 4,3 5,25

   1

   2,3 5,7 3,7 5,5 5,2 5,6 4,3 5,3

   2

   1 5,5 2,3 5,7 4,75 5 4,1 5,5

   * LWM: lavandería con máquina de lavado; LSS: solución de lavandería + agitación

   Ejemplo VI

   15 Estabilidad de una composición de tinta para aplicación en prensa rotativa por serigrafía, respecto a la polimerización.

   Se evalúa la viscosidad de las muestras 8 a 11 después de tiempos definidos. Se prepara una serie adicional de muestras de acuerdo con el ejemplo V, excepto que antes del paso tres de la preparación (ajuste de la viscosidad) se madura la composición de tinta durante la noche (muestras 12 a 15).

   0 d 7 d 14 d 30 d 60 d 90 d

   25°C

   S8

   220 735 735 835 870 980

   S9

   250 915 850 870 930 955

   S10

   260 490 460 480 510 615

   S11

   250 760 725 785 850 840

   40°C

   S8

   220 880 900 1090 1575 2540

   S9

   250 4150 4525 gel. gel. gel.

   S10

   260 600 545 7354 695 850

   S11

   250 840 820 1660 gel. gel.

   25°C

   0 d 1 d 2 d 58 d 84 d 198 d

   S12

   290 365 370 435 450 755

   S13

   265 290 300 355 360 530

   S14

   265 310 320 320 415 700

   S15

   290 305 340 440 430 690

   gel. = la tinta formó gel y no fue posible la medición de la viscosidad.

   Estabilidad al desplazamiento de color

   Se mantienen a 25 °C las tintas de las muestras 12 a 15 y se aplican sobre papel de billete de banco usando un aparato manual automático de recubrimiento (barra No 3, velocidad 3). el primer color es medido a 0° (ángulo 5 especular) con iluminación a 22.5° y el segundo color es medido a 67.5° con iluminación a 45° usando un gonioespectrómetro desarrollado especialmente para mediciones colorísticas de tintas ópticamente variables (gonioespectrómetro Codec WI-10 5&5 de Phyma GmbH. Austria). Se toma el promedio de cinco mediciones sobre tres impresiones diferentes. Se registran los valores colorísticos (L*, a*, b*, C*, h* y AE*) para cada ejemplo de tinta y se realiza después del envejecimiento. Los matices h* de tintas de serigrafía de OVIMR a base de agua (la 10 diferencia colorística entre la tinta impresa después de n días y la tinta impresa después de la manufactura) son más estables por envejecimiento usando un agente de pasivación que sin él.

   Resultados de mediciones de matiz h*

   Primer ángulo (0°)

   0 d 1 d 2 d 6 d 13 d 22 d 28 d 56 d 84 d

   S12

   117.2 3 117.1 9 116.9 9 116.8 2 115.9 8 116.3 0 116.0 7 115.8 9 116.5 5

   Primer ángulo (0°)

   0 d 1 d 2 d 6 d 13 d 22 d 28 d 56 d 84 d

   S13

   116.8 3 116.1 3 116.0 7 114.7 9 114.8 1 114.9 8 114.7 4 114.4 0 114.8 0

   S14

   313.9 7 313.7 1 313.3 3 313.2 0 312.5 5 313.4 3 131.0 6 312.5 1 313.4 5

   S15

   131.1 9 131.0 3 312.2 4 312.3 1 311.2 1 312.2 5 312.3 6 311.0 6 311.8 6

   Segundo ángulo (67.5°)

   S12

   277.0 1 276.9 2 276.0 7 276.3 4 275.3 7 275.5 4 275.4 8 274.9 0 275.2 9

   S13

   276.2 0 275.7 1 275.3 7 274.1 9 273.8 6 273.8 7 273.7 9 273.1 6 273.1 5

   S14

   121.9 6 121.9 7 121.1 8 121.0 3 120.2 7 120.8 1 120.4 3 120.0 1 121.1 2

   S15

   120.3 6 120.2 9 119.4 8 119.3 2 117.8 8 118.5 3 118.5 6 116.9 7 118.0 3

   Ejemplo VII

   Preparación de tintas a base de agua de un componente con OVP pasivado para aplicación en impresión plana por serigrafía.

   5 Muestra 16

   1. Pasivación in situ de pigmento en agua:

   Proglide DMM

   6.0

   Zonyl UR

   0.5

   Agua

   18.5

   OVP verde/azul

   15.0

   AMP-95

   0.25

   Se disuelve Zonyl®UR en Proglide DMM (propilenglicoldimetiléter) a 50°C y se añade agua. Se añade OVP a temperatura ambiente cuando se mezcla y se mantiene el pH entre 7.5-8.0 con AMP-95. Se dispersa lentamente 10 (500 rpm) el pigmento OVP usando un mezclador de laboratorio, por 30 minutos.
6. 2. Preparación de la tinta:

   Tego foamex 800

   1.0

   Jonwax 22

   3.0

   Neocryl BT-20

   50.0

   AMP-95

   1.0

   Se añade el agente antiespumante y cera y se mezcla por 5 minutos a 1000 rpm. luego, se introduce simultáneamente emulsión acrílica soluble Neocryl BT-20 directamente dentro de la dispersión de OVP con AMP-95 y se agita por 5 minutos a 1000-1500 rpm con objeto de alcanzar un pH comprendido entre 7.5-8.0.
7. 3. Adición de agente de entrecruzamiento:

   CoatOSil®1770

   2.0

   Silwet L-7608

   0.2

   5

   Se añaden CoatOSil®1770 y Silwet L-7608 como una mezcla a la tinta bajo buena mezcla, a 1500 rpm por 30 minutos. Se deja la tinta durante la noche antes de la corrección de viscosidad.
8. 4. Ajuste de la viscosidad:

   Aerosil 200

   1.0

   Agua

   0.25

   Acrysol RM-8

   1.3

   Total

   100.00

   10 Se añade cuidadosamente el espesante (Acrysol RM-8) con objeto de obtener una viscosidad de 800±50 mPa.s. Si es necesario, se añade AMP-95 para mantener el pH entre 7.5-8.0.

   Se produce la misma tinta sin el agente de pasivación Zonyl® UR (muestra 17). Se preparan dos formulaciones idénticas de tinta con el pigmento OVP magenta-verde (muestra 18 con Zonyl®UR y muestra 19 sin Zonyl®UR).

   Las tintas preparadas (muestras 16-19) son mantenidas a 25°C y aplicadas sobre papel de billetes de banco 15 usando un aparato de recubrimiento manual automático (barra No 3, velocidad 3). El primer color es medido a 0° (ángulo especular) con iluminación a 22.5° y el segundo color es medido a 67.5° con iluminación a 45°. Se toma el promedio de cinco mediciones sobre tres impresiones diferentes. Se registran los valores colorísticos (L*, a*, b*, C*, h* y AE*) para cada ejemplo de tinta y se revisan después de envejecimiento. Por ejemplo, el AE* de tintas para serigrafía de OVIMR a base de agua (la diferencia colorística entre la tinta impresa después de n días y la tinta 20 impresa después de fabricación) son más estables por envejecimiento usando un agente de pasivación en ambos ángulos de vista.

   Resultados de mediciones de AE*.

   Primer ángulo (0°)

   1 d 2 d 5 d 7 d 14 d 21 d 28 d 57 d 84 d

   S16

   1.82 1.94 0.96 1.72 1.20 1.54 1.09 2.27 1. 67

   S17

   0.98 2.01 2.55 2.67 3.29 3.1 2.69 3.08 2.63

   S18

   0.53 0.19 1.29 1.48 1.23 1.99 2.03 1.99 1.36

   S19

   0.74 0.60 1.78 4.24 5.35 5.45 5.61 5.99 6.79

   Segundo ángulo (67.5°)

   Primer ángulo (0°)

   1 d 2 d 5 d 7 d 14 d 21 d 28 d 57 d 84 d

   S16

   0.89 0.66 2.13 2.22 2.01 3.33 1.74 2.13 2.14

   S17

   1.25 1.29 3.81 4.53 6.12 5.35 5.98 6.11 5.93

   S18

   0.78 0.40 2.46 1.73 3.71 2.59 3.93 3.58 3.68

   S19

   1.22 0.85 2.08 3.07 3.64 4.55 4.78 5.70 5.92