ES2663248T3

ES2663248T3 - Mutaciones del gen de PIK3CA en cánceres humanos

Info

Publication number: ES2663248T3
Application number: ES15150891.8T
Authority: ES
Inventors: Yardena Samuels; Victor Velculescu; Kenneth W. Kinzler; Bert Vogelstein
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-02-18
Publication date: 2018-04-11
Anticipated expiration: 2025-02-18
Also published as: CA2560696A1; JP2018153189A; JP5894110B2; PT1730303E; WO2005091849A2; AU2011200600B2; JP7001735B2; JP7169315B2; PL3296407T3; DK1730303T3; LT3296407T; JP2018023400A; PT3556866T; EP2896703A2; US20200248275A1; JP6694543B2; CA2560696C; EP2497836B1; JP6695381B2; US10704105B2

Abstract

Método para identificar agentes quimioterápicos candidatos, que comprende las etapas de: poner en contacto un mutante activado de p110α (SEQ 5 ID NO: 3) con un compuesto de prueba, en el que el mutante activado contiene una mutación activante en su dominio cinasa correspondiente a los nt 2095-3096 de SEQ ID NO: 2, en su dominio helicoidal correspondiente a los nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2, o en su dominio P85BD correspondiente a los nt 103-335 de SEQ ID NO: 2; medir la actividad de p110α; identificar un compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato si inhibe la actividad de p110α.

Description

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Mutaciones del gen de PIK3CA en cánceres humanos CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de métodos terapéuticos para el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las PI3K son lípido cinasas que funcionan como transductores de señales aguas abajo de receptores de la superficie celular y median rutas importantes para el crecimiento, la proliferación, la adhesión, la supervivencia y la motilidad celulares (1, 2). Aunque se ha observado aumento de la actividad de PI3K en muchos tumores colorrectales y otros (3, 4), no se ha identificado ninguna mutación intragénica de PI3K.

Se ha notificado anteriormente que miembros de la ruta de PIK3 están alterados en cánceres, por ejemplo, el gen supresor de tumores PTEN (15, 16), cuya función es revertir la fosforilación mediada por PI3k (17, 18). Se ha notificado la reduplicación o amplificación de las regiones cromosómicas que contienen PIK3CA y AKT2 en algunos cánceres humanos (2, 19, 20), pero los genes que son las dianas de tales acontecimientos genéticos a gran escala no se han definido ni pueden definirse fácilmente.

El documento WO 98/31324, Zhang et al (Cancer Research, 63 (14), 4225-4231), Ma et al (Oncogene, 19 (23), 2739-2744) y Shayesteh et al (Nature Genetics, 21 (1), 99-102) dan a conocer la amplificación del gen de PIK3Ca o la sobreexpresión del ARNm de PIK3CA en células cancerosas. Philip et al (Cancer Research, 61 (2), 7426-7429) sugieren que tumores humanos pueden albergar mutaciones somáticas en genes de P13K. Lu et al., Rev. Clin. Exp. Hematology, 7, 205 - 228, 2003 comenta la selección como diana de la ruta de PI3K-AKT para la terapia del cáncer. Sin embargo, no hay ninguna descripción en estos documentos de una mutación activante en el dominio cinasa, dominio helicoidal o el dominio P85BD de P110a.

BREVE SU MARIO DE LA INVENCIÓN

En una primera realización, se proporciona un método para identificar agentes quimioterápicos candidatos según el método de la reivindicación 1 adjunta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Detección de mutaciones en PIK3CA Ejemplos representativos de mutaciones en los exones 9 y 20. En cada caso, se obtuvo el cromatograma de secuencia superior de tejido normal y los tres cromatogramas de secuencia inferiores de los tumores indicados. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones de cambio de sentido. Las alteraciones de nucleótidos y aminoácidos se indican por encima de la flecha.

Figura 2. Distribución de mutaciones en PIK3CA Las flechas indican la ubicación de mutaciones de cambio de sentido, y los recuadros representan dominios funcionales (p85BD, dominio de unión a p85; RBD, dominio de unión a Ras; dominio C2; dominio helicoidal; dominio cinasa). El porcentaje de mutaciones detectado dentro de cada región en cánceres se indica a continuación.

Figuras 3A-3C. Aumento de la actividad lípido cinasa de p110a mutante. Se transfectaron células NIH3T3 con vector vacío o con constructos de vector que contenía o bien p110a de tipo natural o bien p110a mutante (H1047R) tal como se indica por encima de los carriles. Se realizaron inmunoprecipitaciones con o bien IgG control o bien anticuerpos policlonales anti-p85. (Figura 3A) La mitad de los inmunoprecipitados se sometieron a un ensayo de PI3- cinasa usando fosfatidilinositol como sustrato. “PI3P” indica la posición de PI-3-fosfato determinada con marcadores de fosfatidilo patrón y “Ori” indica el origen. (Figura 3B) La otra mitad de los inmunoprecipitados se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo anti-p110a. (Figura 3C) Los lisados celulares de células transfectadas contenían cantidades similares de proteína total tal como se determina mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-tubulina a. Se observaron resultados idénticos a los mostrados en esta figura en tres experimentos de transfección independientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El agrupamiento de mutaciones dentro de PIK3CA lo convierten en un excelente marcador para la detección temprana o para el seguimiento de la progresión de la enfermedad. Las pruebas centradas en las regiones agrupadas producirán la mayor parte de los alelos mutantes.

La secuencia que codifica para PIK3CA humana se notifica en la bibliografía y se muestra en SEQ ID NO: 1. Esta es la secuencia de un individuo particular en la población de seres humanos. Los seres humanos varían entre sí en sus

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secuencias génicas. Estas variaciones son muy mínimas, produciéndose algunas veces a una frecuencia de aproximadamente 1 a 10 nucleótidos por gen. Existen formas diferentes de cualquier gen particular dentro de la población humana. Estas formas diferentes se denominan variantes alélicas. Las variantes alélicas a menudo no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada; tales variantes se denominan sinónimas. Incluso si cambian el aminoácido codificado (no sinónimas), la función de la proteína no se ve afectada normalmente. Tales cambios son evolutiva o funcionalmente neutros. Cuando se hace referencia a PIK3CA humana en la presente solicitud, se pretende que todas las variantes alélicas se abarquen por el término. La secuencia de SEQ ID NO: 1 se proporciona meramente como ejemplo representativo de una secuencia humana de tipo natural. La invención no se limita a esta forma alélica individual de PIK3CA Para los fines de determinar una mutación, pueden compararse las secuencias de PIK3CA determinadas en una muestra de prueba con una secuencia determinada en un tejido diferente del ser humano. Una diferencia en la secuencia en los dos tejidos indica una mutación somática. Alternativamente, puede compararse la secuencia determinada en un gen de PIK3CA en una muestra de prueba con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Puede identificarse una diferencia entre la secuencia de muestra de prueba y SEQ ID NO: 1 como una mutación. Pueden someterse a prueba tejidos que se sospecha que son cancerosos, como también muestras corporales que puede esperarse que contengan células descamadas de tumores o células de cáncer. Las muestras corporales adecuadas para las pruebas incluyen sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, aspirado del pezón, saliva y líquido cefalorraquídeo.

Las mutaciones en PIK3CA se agrupan en los exones 9 (SEQ ID NO: 4) y 20 (SEQ ID NO: 5). Se producen otras mutaciones, pero estos dos exones parecen ser los puntos activos para las mutaciones. Muchas mutaciones se producen en el dominio helicoidal de PIK3CA (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2) y en su dominio cinasa (nt 2095-3096 de SEQ ID NO: 2). Menos se producen en el dominio P85BD de PIK3CA (nt 103-335 de SEQ ID NO: 2). Se han encontrado mutaciones en los exones 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 18 y 20. Puede someterse a prueba cualquier combinación de estos exones, opcionalmente junto con pruebas en otros exones. Las pruebas para detectar mutaciones pueden realizarse a lo largo de la secuencia codificante completa o pueden centrarse en las zonas en la que se ha encontrado que se agrupan las mutaciones. Se producen zonas activas particulares de mutaciones en las posiciones de nucleótido 1624, 1633, 1636 y 3140 de la secuencia que codifica para PIK3CA

Se han encontrado mutaciones de PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de tumores. Por tanto, puede someterse a prueba cualquiera de una variedad de tumores para detectar mutaciones de PIK3CA Estos tejidos incluyen, sin limitación: tejido colorrectal, tejido cerebral, tejido gástrico, tejido de mama y tejido pulmonar.

Puede detectarse cualquier tipo de mutación intragénica. Éstas incluyen mutaciones por sustitución, mutaciones por deleción y mutaciones por inserción. Es probable que el tamaño de las mutaciones sea pequeño, del orden de 1 a 3 nucleótidos. Las mutaciones que pueden detectarse incluyen, pero no se limitan a, G1624A G1633A C1636A A3140G, G113A T1258C, G3129T, C3139T y G2702T. Puede someterse a prueba cualquier combinación de estas mutaciones.

Las mutaciones que se encuentran en PIK3CA parecen ser mutaciones activantes. Por tanto, pueden usarse regímenes terapéuticos que implican la inhibición de la actividad o expresión de p110a para inhibir la progresión de un tumor en un ser humano. Las moléculas inhibidoras que pueden usarse incluyen oligonucleótidos antisentido o constructos antisentido, una molécula que comprende una región de unión a anticuerpo y moléculas de ARNip. Las moléculas que comprenden una región de unión a anticuerpo pueden ser anticuerpos completos, regiones variables de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpo, conjugados de anticuerpo, etc. Las regiones de unión a anticuerpo pueden pero no necesitan unirse a los epítopos contenidos dentro del dominio cinasa (nt 2095-3096 de SEQ ID NO: 2) de PIK3CA, el dominio helicoidal (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2) de PIK3CA o el dominio P85BD (nt 103-335 de SEQ ID NO: 2) de PIK3CA

Pueden usarse constructos antisentido, oligonucleótidos antisentido, constructos de interferencia de ARN o moléculas de ARN de dúplex de ARNip para interferir con la expresión de PIK3CA Normalmente, al menos 15, 17, 19 ó 21 nucleótidos del complemento de la secuencia de ARNm de PIK3CA son suficientes para una molécula antisentido. Normalmente al menos 19, 21, 22 ó 23 nucleótidos de PIK3CA son suficientes para una molécula de interferencia de ARN. Preferiblemente, una molécula de interferencia de ARN tendrá una proyección en 3' de 2 nucleótidos. Si la molécula de interferencia de ARN se expresa en una célula a partir de un constructo, por ejemplo a partir de una molécula de horquilla o a partir de una repetición invertida de la secuencia de PIK3CA deseada, entonces la maquinaria celular endógena creará las proyecciones. Pueden prepararse moléculas de ARNip mediante síntesis química, transcripción in vitro o digestión de ARNbc largo mediante ARNasa III o Dicer. Éstas pueden introducirse en las células mediante transfección, electroporación u otros métodos conocidos en la técnica. Véanse Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521; Hutvagner G et al., RNA: Nature abhors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12: 225-232; Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interferíng RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A Salvaterra P y Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M y Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA Bernstein E, Hannon GJ y Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in

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Pueden suministrarse moléculas de interferencia de ARN o antisentido in vitro a células o in vivo, por ejemplo, a tumores de un mamífero. Pueden usarse medios de suministro típicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede lograrse el suministro a un tumor mediante inyecciones intratumorales. Pueden usarse otros modos de suministro sin limitación, incluyendo: suministro intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, local durante cirugía, endoscópico, subcutáneo y oral. En un modelo de ratón, la interferencia de ARN o el ARN antisentido puede administrarse a una célula tumoral in vitro, y la célula tumoral puede administrarse posteriormente a un ratón. Pueden seleccionarse vectores para propiedades deseables para cualquier aplicación particular. Los vectores pueden ser virales o de plásmido. Los vectores adenovirales son útiles a este respecto. Pueden usarse promotores específicos de tejido, específicos del tipo de célula o regulables de otro modo para controlar la transcripción de las moléculas de polinucleótido inhibidoras. También pueden usarse portadores no virales tales como liposomas o nanoesferas.

Usando la proteína p110a, un experto habitual en la técnica puede generar fácilmente anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Pueden ser quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Pueden usarse cualquier derivado o fragmento funcional de un anticuerpo incluyendo Fab, Fab', Fab2, Fab'2, y regiones variables de cadena sencilla. Pueden usarse siempre que el fragmento o derivado conserve la especificidad de unión para la proteína. Pueden someterse a prueba anticuerpos para determinar su especificidad de unión comparando la unión a un antígeno apropiado con la unión a un antígeno o mezcla de antígenos irrelevantes en un conjunto de condiciones dado. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferiblemente 10 veces más que al antígeno o mezcla de antígenos irrelevantes, entonces se considera que es específico.

En la técnica se conocen técnicas para preparar tales anticuerpos de parcial a completamente humanos y puede usarse cualquiera de tales técnicas. Según una realización particularmente preferida, se preparan secuencias de anticuerpos completamente humanos en un ratón transgénico que se ha modificado por ingeniería genética para expresar genes de anticuerpos de cadenas pesadas y ligeras humanas. Se han preparado múltiples cepas de tales ratones transgénicos que pueden producir diferentes clases de anticuerpos. Pueden fusionarse células B de ratones transgénicos que están produciendo un anticuerpo deseable para preparar líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo deseado. Véanse por ejemplo, Nina D. Russel, Jose R. F. Corvalan, Michael L. Gallo, C. Geoffrey Davis, Liise-Anne Pirofski. Production of Protective Human Antipneumococcal Antibodies by Transgenic Mice with Human Immunoglobulin Loci Infection and Immunity. Abril de 2000, págs. 1820-1826; Michael

L. Gallo, Vladimir E. Ivanov, Aya Jakobovits y C. Geoffrey Davis. The human immunoglobulin loci introduced into mice: V (D) and J gene segment usage similar to that of adult humans European Journal of Immunology 30: 534-540, 2000; Larry L. Green. Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies Journal of Immunological Methods 231 11-23, 1999; Yang X-D, Corvalan JrF, Wang P, Roy CM-N y Davis CG. Fully Human Anti-interieukin-8 Monoclonal Antibodies: Potential Therapeutics for the Treatment of Inflammatory Disease States. Journal of Leukocyte Biology vol. 66, págs. 401-410 (1999); Yang X-D, Jia X-C, Corvalan JRF, Wang P, CG Davis y Jakobovits A Eradication of Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy. Cancer Research vol. 59, número 6, págs. 1236-1243 (1999); Jakobovits A Production and selection of antigen-specific fully human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig loci. Advanced Drug Delivery Reviews vol. 31, págs: 33-42 (1998); Green L y Jakobovits A Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes. J. Exp. Med. Vol. 188, número 3, págs.: 483-495 (1998); Jakobovits A The long-awaited magic bullets: therapeutic human monoclonal antibodies from transgenic mice. Exp. Opin. Invest. Drugs vol. 7(4), págs.: 607-614 (1998); Tsuda H, Maynard-Currie K, Reid L, Yoshida T, Edamura K, Maeda N, Smithies O, Jakobovits A Inactivation of Mouse HPRT locus by a 203-bp retrotransposon insertion and a 55-kb gene-targeted deletion: establishment of new HPRT-Deficient mouse embryonic stem cell lines. Genomics vol. 42, págs: 413-421 (1997); Sherman-Gold, R. Monoclonal Antibodies: The Evolution from '80s Magic Bullets To Mature, Mainstream Applications as Clinical Therapeutics. Genetic Engineering News vol. 17, número 14 (agosto de 1997); Mendez M, Green L, Corvalan J, Jia X-C, Maynard-Currie C, Yang X-d, Gallo M, Louie D, Lee D, Erickson K, Luna J, Roy C, Abderrahim H, Kirschenbaum F, Noguchi M, Smith D, Fukushima A Hales J, Finer M, Davis C, Zsebo K, Jakobovits A Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nature Genetics vol. 15, págs.: 146-156 (1997); Jakobovits A Mice engineered with human immunoglobulin YACs: A new technology for production of fully human antibodies for autoimmunity therapy. Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System vol. IV, págs.: 194.1-194.7 (1996); Jakobovits A Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology vol. 6, n.° 5, págs.: 561-566 (1995); Mendez

M, Abderrahim H, Noguchi M, David N, Hardy M, Green L, Tsuda H, Yoast S, Maynard-Currie C, Garza D, Gemmill R, Jakobovits A Klapholz S. Analysis of the structural integrity of YACs comprising human immunoglobulin genes in

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También pueden prepararse anticuerpos usando técnicas de presentación en fago. Tales técnicas pueden usarse para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. También pueden usarse Fv de cadena sencilla según sea conveniente. Pueden prepararse a partir de ratones transgénicos vacunados, si se desea. Pueden producirse anticuerpos en cultivo celular, en fago o en diversos animales, incluyendo pero sin limitarse a vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios.

Los anticuerpos pueden marcarse con un resto detectable tal como un átomo radiactivo, un cromóforo, un fluoróforo o similar. Tales anticuerpos marcados pueden usarse para técnicas de diagnóstico, o bien in vivo, o bien en una muestra de prueba aislada. Los anticuerpos también pueden conjugarse, por ejemplo, con un agente farmacéutico, tal como un fármaco quimioterápico o una toxina. Pueden unirse a una citocina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para acoplarse a anticuerpos para lograr un efecto antitumoral incluyen citocinas, tales como interleucina 2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para su uso en terapia fotodinámica, incluyendo tetrasulfonato de ftalocianina de aluminio (III), hematoporfirina y ftalocianina; radionúclidos, tales como yodo-131 (131I), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re) y renio-188 (188Re); antibióticos, tales como doxorubicina, adriamicina, daunorubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina y carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales y otras, tales como toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas, enterotoxina A estafilocócica, toxina abrina-A ricina A (ricina A desglicosilada y ricina A nativa), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra china (Naja naja atra) y gelonina (una toxina vegetal); proteínas inactivantes de ribosomas de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una proteína inactivante de ribosomas producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteína inactivante de ribosomas de Saponaria offícinalis) y ARNasa; inhibidores de tirosina cinasas; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes antitumorales (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican para toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, tales como F(ab).

Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente y podrán preparar tales derivados de anticuerpos, ya que se conocen bien en la técnica. Los anticuerpos pueden ser citotóxicos por sí mismos, o pueden usare para suministrar agentes citotóxicos a ubicaciones particulares en el cuerpo. Los anticuerpos pueden administrarse a individuos que lo necesitan como forma de inmunización pasiva.

Dado el éxito de los inhibidores de proteína cinasas de molécula pequeña, pueden desarrollarse inhibidores específicos o no específicos de p110a para el tratamiento del gran número de pacientes con estas mutaciones o cánceres en general. Claramente, es posible desarrollar inhibidores de PI3K de amplio espectro, tal como se documenta mediante estudios de LY294002 y wortmanina (2, 21, 22). Los datos sugieren que merecería la pena el desarrollo de inhibidores más específicos que seleccionen como diana p110a pero no otras PI3K.

Pueden identificarse agentes quimioterápicos candidatos como agentes que inhiben la actividad o expresión de p110a. Los compuestos de prueba pueden ser sintéticos o producirse de manera natural. Puede identificarse previamente como que tienen actividad fisiológica o no. Las pruebas sobre agentes quimioterápicos candidatos pueden realizarse en sistemas libres de células o en células completas. Puede someterse a prueba la actividad de p110a mediante cualquier medio conocido en la técnica. Éstos incluyen los métodos enseñados en las referencias 2, 22 y en Truitt et al., J Exp. Med., 179, 1071-1076 (1994). La expresión puede monitorizarse determinando la proteína o el ARNm de PI3KCA Pueden usarse métodos de anticuerpos tales como inmunotransferencia de tipo Western para determinar la proteína. Puede usarse transferencia de tipo Northern para medir el ARNm. Pueden usarse otros métodos sin limitación. Cuando se somete a prueba para determinar agentes quimioterápicos, la p110a usada en el ensayo puede ser una forma de tipo natural o una forma activada. La forma activada puede contener una mutación por sustitución seleccionada del grupo que consiste en B542K, E545K, Q546K y H1047R. Además, pueden someterse a prueba inhibidores para determinar su especificidad por o bien p110a o bien una forma activada de p110a. Pueden realizarse pruebas comparativas frente a enzimas similares incluyendo PIK3CB, PIK3CG, PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3C3, ATM, ATR, FRAP1, LAT1-3TM, SMG1, PRKDC y TRRAP para determinar la especificad relativa por la enzima p110a.

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Una vez que se identifica una mutación activante intragénica, no sinónima en una secuencia que codifica para PIK3CA en un tejido de prueba de un paciente, puede usarse esa información para tomar decisiones terapéuticas. Pacientes con tales mutaciones son buenos candidatos para la terapia con un inhibidor de p110a. Tales inhibidores pueden ser específicos o generales para la familia de inhibidores. Tales inhibidores incluyen LY294002 y wortmanina. Tales inhibidores incluyen además moléculas que comprenden una región de unión a anticuerpo específica para p110a. Tales moléculas se comentaron anteriormente.

Pueden proporcionarse conjuntos de cebadores para amplificar y/o secuenciar PIK3CA en kits o ensamblarse a partir de componentes. Los conjuntos útiles incluyen pares de cebadores directos e inversos opcionalmente combinados con cebadores de secuenciación. Los cebadores directos se muestran en SEQ ID NO: 6 a 158. Los cebadores inversos se muestran en SEQ ID NO: 159 a 310. Los cebadores de secuenciación se muestran en: SEQ ID NO: 311 a 461. Pueden envasarse pares o tripletes o combinaciones de estos pares o tripletes y usarse juntos para amplificar y/o secuenciar partes del gen de PIK3CA Pueden envasarse pares en recipientes individuales o divididos. Pueden proporcionarse instrucciones para usar los cebadores según los métodos de la presente invención en cualquier medio que sea conveniente, incluyendo papel, electrónico o una dirección de Internet.

EJEMPLOS

Ejemplo 1-Este ejemplo demuestra que el gen de PIK3CA es la diana predominante de mutaciones en esta familia génica

Para evaluar si PI3K están implicadas genéticamente en tumorigénesis, se examinaron directamente las secuencias de ADN de miembros de esta familia génica en cánceres colorrectales.

Las subunidades catalíticas de PI3K se dividen en tres clases principales dependiendo de su especificidad de sustrato (5). Adicionalmente, un conjunto de proteínas relacionadas más lejanamente, incluyendo miembros de la familia mTOR, constituyen una cuarta clase (6). Se usaron modelos de Markov escondidos para identificar 15 genes humanos que contenían dominios cinasa relacionados con los de PI3K conocidas en el genoma humano (7). Éstas comprendían siete PI3K, seis miembros de la subfamilia mTOR y dos genes similares a PI3K no caracterizados (tabla 1).

Tabla 1. Genes de PI3K analizados

Nombre del gen: N.° de registro de Celera N.° de registro de Genbank Nombres alternativos Grupo*

PIK3CA: hCT1640694 NM 006218 p110-alfa Clase IA

PIK3CB: hCT7084 NM 006219 PIK3C1, p110-beta Clase 1A

PIK3CD: hCT2292011 NM 005026 p110-delta Clase IA

PIK3CG: hCT7976 NM 002649 PI3CG, P13K-gamma Clase IB

PIK3C2A: hCT2270768 NM 002645 CPK, PI3-K-C2A, PI3K-C2alfa Clase II

PIK3C2B: hCT7448 NM 002646 C2-PI3K, PI3K-C2beta Clase II

PIK3C2G: hCT1951422 NM 004570 PI3K-C2-gamma Clase II

PIK3C3: hCT13660 NM 002647 Vps34 Clase III

ATM: hCT29277 NM 000051 AT1, ATA, ATC, ATD, ATE, ATDC Clase IV

ATR: hCT1951523 NM 001184 FRP1, SCKL, SCKL1 Clase IV

FRAP1: hCT2292935 NM 004958 FRAP, MTOR, FRAP2, RAFT1, RAPT1 Clase IV

SMG1: hCT2273636 NM 014006 ATX, LIP, KIAA0421 Clase lV

PRKDC: hCT2257127 NM 006904 p350, DNAPK, DNPK1, HYRC1, XRCC7 Clase IV

TRRAP: hCT32594 NM 003496 TR-AP, PAF400 Clase IV

ninguno: hCT2257641 ninguno Clase IV '

ninguno: hCT13051 ninguno Clase IV

*Los genes de PI3K se agrupan en las clases descritas anteriormente (S3,S4). Las clases I, II y III comprenden subunidades catalíticas de PI3K, mientras que la clase IV comprende genes similares a PI3K incluyendo miembros de las subfamilias mTOR (diana de rapamicina), ATM (ataxia telangiectasia mutada) y dNaPK (proteína cinasa dependiente de ADN), así como dos genes no caracterizados anteriormente.

Se examinaron inicialmente 111 exones que codificaban para los dominios cinasa pronosticados de estos genes (tabla 2). Se amplificaron los exones y se secuenciaron directamente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN genómico de 35 cánceres colorrectales (8). Sólo uno de los genes (PIK3CA) contenía alguna mutación somática (es decir, específica de tumor).

Nombre del gen y el exón hCT2270768-Ex21 hCT2270768-Ex22 hCT2270768-Ex23 hCT2270768-Ex24 hCT2270768-Ex25 hCT2270768-Ex26 hCT2270768-Ex27-1 hCT13660-Ex16 hCT13660-Ex17 hCT13660-Ex18 hCT13660-Ex19 hCT13660-Ex20 hCT13660-Ex21 hCT13660-EX12 hCT13660-Ex23 hCT13660-Ex24 hCT13660-Ex25-1 hCT32594-Ex66-2 hCT32594-Ex67-1 hCT32594-Ex67-2 hCT32594-Ex68 hCT32594-Ex69-1 hCT32594-Ex69-2 hCT32594-Ex70 hCT32594-Ex71 hCT32594-Ex72-1 hCT32594-Ex72-2 hCT7976-Ex5 hCT7976-Ex6 hCT7976-Ex7 hCT7976-Ex8 hCT7976-Ex9 hCT7976-Ex1 0 hCT7976-Ex11-1 hCT7976-Ex11-2 hCT7448-Ex21 hCT7448-Ex22 hCT7448-Ex23 hCT7448-Ex24 hCT7448-Ex25

Cebador directo'

TTccagcctgggTaacaaag

CCTGACCTCAGGT GTTCT GC TGCAC ATTCTGCACGTGTATC TCCCAGTTTGTATGCTATTGAGAG TGGAAATTCAAAAGTGTGTGG CACTAATGAACCCCTCAAGACTG TCCTTGGCAAAGTGACAATC CTCTCACATACAACACCATCTCC ATGTATCTCATTGAAAACCCAAC TCCCAAAGTGCT GGGATT AC CCTATGACAT AAAT GC CAGT AC AAAC TCTTTT GTTCAGTCAGCATCTCTC TTGAGAATTCAGATGAGAAACCAG GAAGGCCACTCTCAAACCTG TCAAG GCTTGC ATTTC ATT G TTCCACACTCCAAAGAATGC AATTGCAATCCTCTTGGTAGC GCCAAGACCAAGCAACTCC ATAAACGACCGCTGGCCTAC GT ACATCC GGGGAC AC AAT G ACCGGGTTCTTCCAGCTAAG CAATGCGTGCGTTAAATCTG CCCAATGCCACGGACTAC ATCCAGCTGGCTCTGATAGG CTGGTGCT GAAACTCGACTG GTCTCGTTCTCTCCCTCACG CACAACCTCGCCCAGTTC AGCATCACCCTCAGAGCATAC TGCCATACCTCTTAGGCACTTC C GAC AG AGC AAGATT CCATC AGATTGCCATCTGAGGAAGG GCATGGAGAGGAAGTGAACC T GGC CAGAGAGTTTGATTTAT G CCCTCAATCTCTTGGGAAAG TGGTTTCTTCTC ATGGAC AGG GGGT GTC CAC ACTTCTC AGG CCGGAAGAAACAATGAGCAG GGTGTGAGCTGAGTGAGC AG GTGGGAATGACCTTCCTTTC GGATGAACAGGCAGATGTGAG

Cebador inverso2 CGT CAGAAC AAGACCCTGTG CCCGGCCACTAAGTT ATTTTTC CTGCCATTAAATGCGTCTTG C TTT GGGCC TTTT T CATT C C TGTCTGGCTTATTTCACACG AACTTTTGAC AGCCT ACT AT GTGC GACCATTC AT G AAAGAAAC AAGC CCATGTACCGGTAACAAAAGAAG TGAGCTTTCTAGGATCGTACCTG GCAGGAAGGTCCAACTT GTC ATCTTCAACT GCGAACATGC AAGC ATC AAT GACT ACTTT AATCAAC TCC CAAAGTGCTGGG ATT AC TTGTTGCCTTTGTCATTTTG AT GTGACT GTGGGC AGGAAC GCTGGT GAGAT GTCAAAACG TCAACATATTACTTCCTCCAGAACTC TTCTCCCATGTCAGGGAATC GACCCT CAAAGGCT AACGT G TCCCTGGT CAGCAC AGACT AC AGCT GTCTCATTTCCACCATC CGCGTC GTTT AT GT C AAAT C CGCGTC GTTT AT GT C AAAT C CAT AAC ACAC AG GGG TGCTG GAACT GGGCGAGGTTGT G TCCCTTTCTTACACGCAAAC CAGTTCCGCCTGTACATTCAC AGCGCTCCTGCTTTCAGTC GTCTTGGCGCAGATC ATC AC TTTT GTCACCAGTTGAAATGC GACT GGGAAAAAGCATGAGC C GGT GATCAT AAT ATT GT C ATT GT G GGAAGT GTGGGCTT GTCTTC TGCACAGTCCATCCTTTGTC AAT GCCAGCTTTCACAATGTC GGCCAAGACC ACATGGTAAG TCCTACATTAAGACAGCATGGAAC TGCCTCCCTTTT AAGGCT ATC AGGTCCTTCTGCCAACAAAG CGTCTTCTCTCCTCCAATGC

Cebador de secuenciación3

aAAGgggaAAtgcgtaggaC

TCCCAAAGTGCT GGGATT AC CCAGAACTT AAAGTGAAATTT AAAAAG GC GAGGC AAAACAC AAAGC TTGGAAATGGCTGTACCTCAG TACTTGAGCAGCCCACAGG AAAGGAATGAAAGTGGTTTTT GTC TGCAATGT AAT AGTTTTCCAAGG CAGC AAATGAACT AAGCCAC AG TGCTATACTATTTGCCCACAAAAC GAATGC ATTTATTC AGAGATGAGG TGCTAGACACTTGCTGGTCAC TTGAT ATT AAAGTTGC AC AAACTGC T CAATTGT GT GAC ATATCACCTACC TCACTGTAGAAATCC AAGTACC AC TCTGCATCAGTTTGATTCTGC AATGCACTTTTTATTTTATTAG GAAAAGTGCCGGTTCTT GAG GCCTACACAGTCCGTTTTCC AGAGGAGCGTGT GTT GCAG ACTCTGACGGTGGAGCTGAG GCTCTTGGTGCTAAGTTAAAGAGG ATCCAGCTGGGTCTGATAGG TGAACAGCCAGATCCTCTCC GTCCCACCTTGTTAGGAAGC TGGCATTCT GAAAACGGTTC GCAAACAGCCTGGACAATC CACATATTTCTGTCCCCTGTTG TGTGGTTCTTTGGAGCACAG CCAAGGT AC ATTTCGGAAAAC ACCAGCCCTTTCCTCTTGTC TTCTTCCTCATGCCATTGTG GTGGCATCT GGCTGTCATC CAATTAGTTTTCCTTGAGCACTCC TCTTCTTTATCCAGGACATCTGTG CCTGGGAGAGGTCTGGTTC GGCAGCATCTTGGTCTGAAG GAGCACTTGGGAGACCTGAG AGGGAAGCATGAGCACAGTC TGAGTTCTGTCT GGCTGTGG

hCT7448-Ex26 hCT7448-Ex27 hCT7448-Ex28-1 hCT1951523-Ex39-2 hCT1951523-Ex40 hCT1953523-Ex41 hCT1951523-Ex42 hCT1951523-Ex43 hCT2257127-Ex76 hCT2257127-Ex77-1 hCT2257127-Ex77-2 hCT2257127-Ex78 hCT2257127-Ex79-1 hCT2257127-Ex79-2 hCT2257127-Ex80 hCT2257127-Ex81 hCT2257127-Ex82 hCT2257127-Ex83-1 hCT2257127-Ex83-2 hCT2257127-Ex84 hCT2257127-Ex85 hCT1951422-Ex19 hCT1951422-Ex20 hCT1951422-Ex21 hCT1951422-Ex22 hCT1951422-Ex23 hCT1951422-Ex24 hCT1951422-Ex25 hCT1951422-Ex26 hCT13051-Ex5 hCT13051-Ex6 hCT13051-Ex7 hCT13051-Ex8 hCT13051-Ex9 hCT2282983-Ex40 hCT2282983-Ex41 hCT2282983-Ex42 hCT2282983-Ex43 hCT2282983-Ex44-1 hCT2282983-Ex44-2 hCT2292935-Ex46 hCT2292935-Ex47 hCT2292935-Ex48

AGCCCCTTCTATCCAGTGTG TGCCCACAGCATCTGTCTAC ATTGTGTGCCAGTCATTTGC TTC C AC ATT AAGC ATG AGC AC GAC AGTCATTGTTTTCAT AGGTCAT AG CCACAT AGT AAGCCTTC AAT GAC T G AAAAAT GTTCCTTTATTCTTG TCTGAGAACATTCCCTGATCC TCAGCTCTCTAATCCTGAACTGC AGC AG AG AAG AAAC AT AT ACC AT CATTTTGGGAAAGGAGGTTC ATT ACAGGCGT GAGCCACT G TTTGGCACT GTCTTC AGAGG AGAGGGAACACCCTTTCCTG TAT AGC GTTGT GC C C ATG AC TCCTGCCTCTTTGCTATTTTTCAATG TTGCCTCAGAGAGATCATCAAG TAGGGGCGCT AATCGT ACT G TCTGATATGCATCAGCCACTG T G ATTTC AAGGG AAGC AG AG T GT AGAAAGC AAGGCTGCTC ACCCCAAAGTCATCCAAGTG AAAGGCTCCAGTTGATGGAC CCATTAAAACCACTCTAAGTCAGG AAGCCTCCTCCAGAAAAGAAG CCCTCCTGTCCACTGAGATG TCTCAAGCT GCCTCACAATG AAAG AC ATTGC CATGC AAAC TTGTTGGGCTCCAAATAAAC CCCTGGAGTGCTTACATGAG GACTTT AT AAAC ACTCG AC ATT AG AGC AT GATGACCTCTGGCAGGAC GAATCAACCGTC AGCGTGTC CTGGCACCGGGG AAAAC AGAG TGGACATCGACTACAAGTCTGG TCCTTGGGGTTTTGAAGAAG AAGGC CTTC C AG ACTCTTGC CCTCTTTGTTTTTCCCTACCG CTTC C AC AGT G GGG GT AC AG GAC AC AAC GGC AAC ATT AT GCTG C ATTC C AAAGC ATCTGGTTTTAC TT GT G AGG AAC G TGT G ATT AGG C TGGGC AACAGAGC AAGAC

GGT ATTCAGTT GGGGCTC AG TGTATCCACGTGGTCAGCTC ACAGGACGCTCGGTCAAC TTGC C ATC AGT AC AAATG AGTTT AG TTCCTGCTTTTTAAGAGTGATCTG AG GAAGGAAGGGATGGAAAC AGAAACCACTCATGAAAA CGCATT ACT AC AT GATCCACT G TGTCACAGAAAGCATGAGACC AGAAAT AACTGTC AAT ATCCCAGT ATCAC TCATT AAACATTT AGT AAT GTGTGCTC AG GC AAC AG GGC AAG ACTC CCTGAAAGGGAGAAT AAAAGG CCTGAAAGGGAGAAT AAAAGG T ATTG AC C C AGC C AGC AG AC TAT ATT GAGACTC AAAT ATCGA TGATGC ATATCAG AGCGTGAG TTCAATGACCATGACAAAACG TTCAATGACCATGACAAAACG TGGTTTTC AAGC AG AC AATCC TCCTCCTCAATGAAAGCAGAG CAATGTGATCCCAACT GGTC TT ATT GC C AAT TGG AGTT TGG TTCTGTTGGCTTATCATTTTTG C C C AGAAACT AAAT AAAATGC AG AATC AAATTTGTTGC ATT AAAAATC GTTTTCTCATTCCTTTCTCTTCC TTTGGGAAAGGGAACACAAG GATTTTTCCTTGGAACATCCTC CGGGG ATC AG ATTTGCTATG TAGGGGGTCATCCTCAGGTC GTCTTCCCCTGCTCAATCAC GAC ACGTTGT GGGCC AGCCAGT CTGCCGGTTATCTTCGGACACGTT TGAGT GAGGGCAGACAGATG TGGC AC C T G AAC C AT GT AAG CGTACATGCCGAAGTCTGTC GCCCTGGTTTTAACCCTTAAC CCAGCTCCAGCTTCTGACTC TTGT GTTTTCTT GGAGAC AG C AAT G AGC AT GGG AG AG AT G TGGAGTTTCTGGGACTACAGG CCTTCTTCAAAGCT GATTCTCTC

TG AT G AGGG AT G AG GG AAAC AG GGT T AGG G AGC C T AGC TG TCCTTGGAACACCCCTGTC CAGTCATGAT ACCTACACTTCC ATC CAACTCTGAAATAAAAGCAATCTGG TTCTTTGGTTATGAAATGAACAATC TTGAAT AAAAGT AGATGTTTCTT GTCC TACC AAGAAT AT AAT ACGTTGTT ATGG CGGCTTCTGGC AC AT AAAAC CCATTGAGCACTCCATTCATTAC CCCTGGGAATCTGAAAGAATG TGGGCCGTRGTCTCAT AT AC CACTCTGGCTTTTCCCTCTG AGGTC ATG AATGGGATCCTG C AT AT TGC TT GGC GTC C AC TCTTGGTGATCTTTGCCTTTG TCATC AAGATT ATTCGAT ATTTGAGTC CGAGAAAGTAAAGTGCCTGCTG CGGGATT GGAGAC AGACATC GAGGAT GCTGCCATTT GTG C ATGCT AAC AG AGTGTC AAG AGC CGAATTCTTTTTGCCATTTC AAAGTCTGC AAGGGGCTATG TCAGGCT AGAAAT GT ATCC AAGG AAAGG AAAGGGGT AATCCAG TTT ACTTTTT ATGATT ACCTCTGATGC AAAG AAAATT C AAAT G AAAAT AAGT C G CATGC AAACTT GGGTCT AGAT G TTGGCTTTTTCCCCTCATAC TAAAGCCTTTCCCAGCTCAG CCTGCTGCTTCCACAGGAC CATGGACGTCCTGTGGAAG GTGTCCCATTCATCCTCACC AAC AGAGGAGGCGCT GAAG GCCTCACCCTACCCATCC AGATTGCT GGGGTTCCTTTC CCACCTCACTCCATCTCT GG TGGGGTAAGTTCCCTGAGTG TAC AG AGC C AG GG AG AGTGC TATCATCCAC ATCGGTCAGC TTTGGGAC AAGT AATTGTT ATT AGC TTGAAT GCAGTGGTGCTCTC TCTGCCTGTGTTCTGAGCTG

hCT2292935-Ex49 hCT2292935-Ex50 hCT2292935-Ex51 hCT2292935-Ex52 hCT2292935-Ex53 hCT2292935-Ex54 hCT2292935-Ex55 hCT2292935-Ex56 hCT2292935-Ex57 hCT2292935-Ex58-1 hCT2273636-Ex35-1 hCT2273636-Ex35-2 hCT2273636-Ex36-1 hCT2273636-Ex36-2 hCT2273636-Ex37-1 hCT2273636-Ex37-2 hCT2273636-Ex38 hCT2273636-Ex39 hCT2273636-Ex40-1 hCT2273636-Ex40-2 hCT2273636-Ex41 hCT7084-Ex17 hCT7084-Ex18 hCT7084-Ex19 hCT7084-Ex20 hCT7084-Ex21 hCT7084-Ex22 hCT7084-Ex23 hC77084-Ex24-1 hCT2257641 -Ex1 -56 hCT2257641 -Ex1 -57 hCT2257641 -Ex1 -58 hCT2257641 -Ex1 -59 hCT2257641 -Ex1 -60 hCT2257641 -Ex1 -61 hCT29277-Ex55 hCT29277-Ex56 hCT29277-Ex57 hCT29277-Ex58 hCT29277-Ex59 hCT29277-Ex60 hCT29277-Ex61 hCT29277-Ex62

TCCCTTCTCCTTTGGCTATG ATAGCACCACTGCCTTCCAG TGCAGAAGT GGAGGTGGAG AACCCAAGCT GCTTCCTTTC AGTCCTGCCCTGATTCCTTC CCCACCCACTTATTCCTGAG TTTCCCCTTT AGGGT AGGT AGG C GGAC AT AG AGG AAGG ATTGC TGGCC AAACTTTTC AAATC C TGGGAGAGCTCAGGGAATAC TCCCAAAGTGCT GGGATT AC TTGGCTGCCATGACTAACAC GCTCTCAGTGT GCCTCAT GG AAGAAACACCCCGGTTCC AAATTT AGTTGAGT AAT GAGAGAATGC GT AAAATT GGCCCTGCTTT G CAT AACCACATGCAGCAACC AATTGGCCTT GGAGACAGAC TTCATGT GAGC AGGT ATGCT G TTGTGTACGACCCTCTGGTG TTTGT AC AGT G G AGGC AAC G C AGCTGGTT AT GT GTGTTT AT GG TGTCCTCATGGTTGCTTTTC CAGGGACATGCTATCCAAAG TGGT GGAACTT GTGTTTTTCC TCATACGGTTTTGGCAGCTC AC AGAGGGAGAAGGGCTCAG TGGG AC AATTTTCGC AGAAG ATGAAGCATGCTGCCTGATG GGGGGCCTTT AGAAGG AAG TGGAGTTCCTGAGAAATGAGC AGAGGGAACACCCTTTCCTG C ATG ATGTTGG AGCTT AC ATGC CGGGATT GGAGAC AGACATC C ATC ATG GT AC AC GC ACTC C CTCAATCAGAGCCTGAACCAC CCCGGCCTAAAGTT GT AGTTC TGGGAG ACTGTC AAGAGGT G TTCCTCCAAGGAGCTTT GTC TTCCCTGTCCAGACTGTTAGC C C GGTT ATGC AC ATC ATTT AAG GC AGC C AG AGC AG AAGT AAAC TCTAATGAAAGCCCACTCT GC

CGCTCTACAGCCAATCACAG TGGC ATC AC AATC AAT AGG G CTCCAAGGGGGTT AG AGTCC CAGGAAACC AGGTCAGAAGT G TTTTTGCAGAAAGGGGTCTTAC GCCCACCCCACTCTAGAAAC TGGAACCTTTTCTGCTCAAAG AGCT GCATGGTGCCAAAG AT AAC AAT GGGC AC ATGC AG GGTC ATTCTTC C ATC AGC AAG C AC AC C C AC ACTC AC AC AAAG GGCACT GCAGGCT AAT AATG GGGACCTCAAGTCTTTTCCTTC GGGACCTCAAGTCTTTTCCTTC GGAAGG GAAGGAGGAC AAAC CGTCTCAAACTACCAAGTCTGG C AC C C AGT GC TGTTTC AATG CGCCGCATAATGTGTAAAAC TGCCAT ATTT AACT GCCATTTC TGCCAT ATTT AACT GCCATTTC GCAGTCACT GAGAC AGCTTTT ATC TAAGCAT AGCCTCGG AG AAC GGACCATT AAT AGCT ACCTTCCTG AG GC AAG AC AAC AT ATTT G AAAG AAG GGC T AT GTG T C ATTT TGT TC C ATC AAGC AAGC AAAC AAATG AATTCCCCCAAAAGCTTCC TTCCCTCCTGGCTAAGAACC AAAAGC AG AGGG AATC ATC G TCCCATTCATGACCTGGAAG GGCCCGCTTT AAGAG ATC AG CATGCCCAAAGTCGATCC ACACATCCATGGTGTTGGTG TGCCACAGCCACATAGTCTC TTCTATCTGCAGACTCCCACAG GG AAAAG AAAGC AG G AG AAGC AAAT GGAGAAAAGCCTGGTTC AAGCAATCCTCCCACCTTG CCTTCCTTTTTCACTCACACAC TGATTT AAT AAT GAAGAT GGGTTGG ACTC AGTACCCCAGGCAGAG TCAAACTCCTGGGCTCAAAC CAGCCACATCCCCCTATG

GAACTCAGCTCTGCCTGGAC GCGAGACTCGGTCTC AAAAG ATCGTTTGCCAACTCCTAGC AATC AGTGCAGGTGATGCAG ACATGGCCTGTGTCTGCTTC GACT GGAAG AAAAT AACCAAGTTTC GGC AGGCGTT AAAGGAAT AG AAAAACAGGGCACCCATTG TTAAGCCCAC AGGG AAC AAG TGTC AGACCTTGGCCTTTTC TCTTCTGAAAAAT GGAGGAAGTC GCTCTTCCTGGGGAAGTCTC CAGTTTTTGACTGCCACTGC TCCATGCTCGACACTATTCTG TTC TAC TTTAC ATAC AAAAG GC ACTC AGTTGGGCTTAGCCTGGATG AGTATCACGTCCATGTTGGAG CAATGTTT GCTTT GAAAAAGG TGAGC AAAACCTGTGGAATG TTT GCTGGTGCTGTCTATGG GGATGTGCAAAATGTTCTTCTG GGG AGC AG GTGTT ATTG ATTG GGTGAGGAGTTTTCCCAAGC AGC AC AG AGTTTGTT AATGTTTTT AG GCTGACTTCTATTGGGAGC ATAC CAGAGGTATGGTTTGGGTCTC TGGGGGTCT AGG ACT AT GGAG GCTGTGTTTTCTTAATTTCCTGTATG CAGCCTCCTGCAGACTTT G CATTTTGGGAAAGGAGGTTC C GGTC AGT AT GACGGT AGGG AGGTC ATG AATGGGATCCTG GGCGCT AATCGT ACT GAAAC TATGGTGGCC ATGGAGACTG AGGAGCCCTCCTTTGATTG GGCCAGTGGTATCTGCTGAC AAG AC AAAATC C C AAAT AAAGC AG ATTGGTTT GAGT GCCCTTTG AAAAT GCTTT GCACT GACTCTG TTCATCTTTATTGCCCCTATATCTG TT AAAG AT T AT AC C AAGTC AGT GGTC CATGTGGTTTCTTGCCTTT G AAGC AT AGGCTC AGC AT ACT AC AC

- 10 -

hCT29277-Ex63 hCT29277-Ex64-1 NM005026Ex17 NM005026Ex18 NM005026Ex19 NM005026Ex20 NM005026Ex21 NM005026Ex22 hCT1640694-Ex1 -1 hCT1640694-Ex1 -2 hCT1640694-Ex1 -3 hCT1640694-Ex2-1 hCT1640694-Ex2-2 hCT1640694-Ex3-1 hCT1640694-Ex3-2 hCT1640694-Ex4-1 hCT1640694-Ex4-2 hCT1640694-Ex5 hCT1640694-Ex6 hCT1640694-Ex7 hCT1640694-Ex8 hCT1640694-Ex9 hCT1640694-Ex10 hCT1640694-Ex11 hCT1640694-Ex12 hCT1640694-Ex13 hCT1640694-Ex14 hCT1640694-Ex15 hCT1640694-Ex16 hCT1640694-Ex17 hCT1640694-Ex18 hCT1640694-Ex19 hCT1640694-Ex20-1 hCT1640694-Ex20-2

AAGTGTGCATGATGTTTGTTCC GAT GAC CAAGAAT GC AAAC G ATCATCTTTAAG AAC GGGGATGG CCTCAGATGCT GGT GCCG TCTTCATGCCTTGGCTCTGG TCC GAGAGAGT GGGC AG GT A GGGCAGGTTT GTGGGTCAT GGAACTGGGGGCTCTGGG GTTTCT GCTTT GGGACAACCAT CTCCACGACCATCATCAGG CCCCCTCCATCAACTTCTTC TCATC AAAAATTTGTTTTAACCTAGC TTCTGAACGTTTGTAAAGAAGCTG GCAGCCCGCTCAGAT AT AAAC TCTGAAAATCAACCATGACTGTG TCTTGTGCTTCAACGTAAATCC TCTCAACTGCCAATGGACTG TAGTG GATGAAGGC AGC AAC TGCCTTTTCCAATC AATCTC GGGGAAAAAGGAAAGAAT GG TTTGCTGAACCCTATTGGTG GATTGGTTCTTTCCTGTCTCT G ACCTTTTGAAC AGC ATGC AA AAAACACCCTTAACATTATTTCCATAG TTT ATTCT AGATCCAT AC AACTTCCTTT CTGAAACTCAT GGT GGTTTT G GAGTGTTGCT GCTCTGT GTT G GGATTCCTAAATAAAAATTGAGGTG TTGCTTTCCTGAAGTTTCTTTTG GGGGAAAGGC AGTAAAGGTC TCCTTATTCGTTGTCAGTGATTG CATGGT GAAAGAC GATGGAC TGGGGT AAAGGGAATC AAAAG TTGC AT AC ATT C GAAAG AC C

'SEQ ID NO 2SEQ ID NO 3SEQ ID NO

6 a 165 (cebadores directos)

166 a 325 (cebadores inversos)

326 a 485 (cebadores de secuenciación)

TGCCTTCTTCCACTCCTTTC AAGAGTGAAAGCAGAGATGTTCC ACTAAGCCTCAGGAGCAGCCT GATACTTGGGGAAGAGAGACCTACC GAGGGGAGAGGAGGGGGAG CACAAACCTGCCCACATTGC CCTGGGCGGCTCAACTCT AGGC GTT TCC GTTT ATGGC CTGCTTCTTGAGTAACACTTACG GATTACGAAGGTATTGGTTTAGACAG GGTGTT AAAAAT AGTT CCATAGTTCG TATAAGCAGTCCCTGCCTTC TATAAGCAGTCCCTGCCTTC CTGGGCGAGAGTGAGATTCC AT GAACCCAGGAGGCAGAG CGGAGATTTGGATGTTCTCC CGGAGATTTGGATGTTCTCC TTTGTAGAAATGGGGTCTTGC AATTCCTGAAGCTCTCCCAAG TGCTGAACCAGTCAAACTCC TTGCAATATTGGTCCTAGAGTTC C CACAAAT AT CAATTT AC AAC CATT G TGGAAATAATGTTAAGGGTGTTTTT TCTGCATGGCCGATCTAAAG AAAGTTGAGAAGCTC ATC ACTGGTAC TGGTTCCAAATCCT AATCT GC TTGAGGGTAGGAGAATGAGAGAG CATGC ATATTTC AAAG GTC AAG TCAAGTAAGAGGAGGATATGTCAAAG CATC AAATATTTC AAAGGTT GAGC GTCAAAACAAAT GGCACACG TT ACAGGC ATGAACCACCAC CCTATGCAATCGGTCTTTGC GGGGATTTTTGTTTTGTTTTG

CCCATCAACTACCATGTGACTG GGTCCTGTTGTC AGTTTTTC AG GGTCCTGGGGT GCTCCTAGA TCCTCAACTGAGCCAAGTAGCC TGTGTCCTCCATGTTCTGTTGG TGGCCCCTCTGCCTAGCA CCACTGCTGGGTCCTGGG GAATAGAGAGCTTTTCCTGAGATGC GATTCATCTTGAAGAAGTTGATGG ACTTGATGCCCCCAAGAATC CTCAAGAAGCAGAAAGGGAAG TCTACAGAGTTCCCTGTTTGC GCTGTGGATCTTAGGGACCTC AAAAAGC ATTTCTGATATG GATAAAG TCGAAGTATGTTGCTATCCTCTG AAAAT AAT AAGC ATC AGC ATTTGAC TT ATTCC AGAC GC ATTTC CAC TTTGAGTCTATCGAGTGTGTGC TTCCTGTTTTTCGTTT GGTTG TGAATTTTCCTTTTGGGGAAG TGGATC AAATC C AAAT AAAGT AAGG TTGCTTTTTCT GT AAATCATCT GTG TATTTC ATTT ATTT AT GTGGAC GAAGTT AAGGC AGT GTTTT AGATGG ACCAGT AAT ATCCACTTTCTTTCT G TTT ATTGGATTTCAAAAAT GAGT G TCTCATGTGAGAAAGAGATTAGC AG TGGCTTTCAGTAGTTTTCATGG CATGTGATGGCGTGATCC AGGAATAC ACAAAC ACCGACAG TGCACCCTGTTTTCTTTTCTC TGGACAAGTAATGGTTTTCTCTG T GACATTT GAGC AAAGAC CTG TTTGTTTTGTTTTGTTTTTT

Se analizaron entonces todos los exones codificantes de PIK3CA en 199 cánceres colorrectales adicionales, revelando mutaciones en un total de 74 tumores (32%) (tabla 3 y ejemplos en la figura 1).

Mutaciones de PIK3CA * Tipo de tumor#

Exón: Nucleótido Aminoácido Dominio funcional Colon GBM Gástrico Mama Pulmón Páncreas Medulo- . , Adenomas blastomas Total

Exón 1: C112T R38C p85 1 1

Exón 1: G113A R38H p85 2 2

Exón 1: G263A R88Q p85 1 1

Exón 1: C311G P104R p85 1 1

Exón 1: G317T G106V p85 1 1

Exón 1: G323C R108P p85 1 1

Exón 1: del332-334 delK111 -1

Exón 2: G353A G118D 1 1

Exón 2: G365A G122D 1 1

Exón 2: C370A P124T 1 1

Exón 4: T1035A N345K C2 1 1

Exón 4: G1048C D350H C2 1 1

Exón 5: T1132C C378R C2 1 1

Exón 7: T1258C C420R C2 2 2

Exón 7: G1357C E453Q C2 1 1

Exón 9: C1616G P539R Helicoidal 1 1

Exón 9: G1624A E542K Helicoidal 9 1 10

Exón 9: A1625G E542G Helicoidal 1 1

Exón 9: A1625T E542V Helicoidal 1 1

Exón 9: G1633A E545K Helicoidal 21 1 22

Exón 9: A1634G E545G Helicoidal 1 1

Exón 9: G1635T E545D Helicoidal 1 1

Exón 9: C1636A Q546K Helicoidal 5 5

Exón 9: A1637C Q546P Helicoidal 1 1

Exón 12: C1981A Q661K Helicoidal 1 1

Exón 13: A2102C H701P Helicoidal 1 1

Exon18: G2702T C901F Cinasa 1 1 2

Exón 18: T2725C F909L Cinasa 1 1

Exón 20: T3022C S1008P Cinasa 1 1

Exón 20: A3073G T1025A Cinasa 1 1

Exón 20: C3074A T1025N Cinasa 1 1

Exón 20: G3129T M1043R Cinasa 2 2

Exón 20: C3139T H1047Y Cinasa 2 2

Exón 20: A3140G H1047R Cinasa 15 2 1 18

Exón 20: A3140T H1047L Cinasa 1 1

Exón 20: G3145A G1049S Cinasa 1 1

Tumores con mutaciones: 74 4 3 1 1 0 0 2

N.° de muestras examinadas: 234 15 12 12 24 11 12 76

Porcentaje de tumores con mutaciones: 32% 27% 25% 8% 4% 0% 0% 3%

*Nucleótido numerado del exón y carga de aminoácido que resulta de la mutación. La posición de nucleótido se refiere a la posición con la secuencia codfiicante, en la que la posición 1 corresponde a la primera posición del codón de iniciación. Se describen dominios funcionales en la leyenda de la figura 1. *Número de mutaciones no sinónimas observadas en tumores indicados. Cánceres de colon, colorrectales; GBM, glioblastomas; gástrico, cánceres gástricos; mama, cánceres de mama; pulmón, cánceres de pulmón; páncreas, cánceres pancreáticos; meduloblastomas; adenomas, tumores colorrectales benignos. Se mostró que todas las mutaciones clasificadas eran somáticas excepto cinco cánceres colorrectales y un glioblastoma en los que no estaba disponible tejido normal correspondiente. Se identificaron mutaciones en 58 de 201 cánceres colorrectales competentes para reparación de apareamientos erróneos (MMR), y 16 de 33 cánceres colorrectales deficientes para MMR. Los tumores somáticos con mutaciones de PIK3CA contenían mutaciones en KRAS o BRAFmientras que otros no, lo que sugiere que estos genes funcionan a través de rutas independientes. Siete tumores contenían dos alteraciones somáticas. Además de las 92 mutaciones no sinónimas registradas en la tabla, se detectaron 3 alteraciones sinónimas.

5

10

15

20

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30

35

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65

Ejemplo 3-Este ejemplo demuestra que las mutaciones en PIK3CA se producen de manera tardía en la tumorigénesis.

Para determinar el momento de las mutaciones de PIK3CA durante la progresión neoplásica, se evaluaron 76 tumores colorrectales premalignos de diverso tamaño y grado de displasia. Sólo se encontraron dos mutaciones de PIK3CA (E542K y E542V), ambas en adenomas muy avanzados mayores de 5 cm de diámetro y de tipo tubulovelloso. Estos datos sugieren que las anomalías de PIK3CA se producen en estadios relativamente tardíos de neoplasia, cerca del momento en que los tumores comienzan a invadir y metastatizarse.

Ejemplo 4-Este ejemplo demuestra mutaciones de PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de cáncer.

Se evaluó entonces PIK3CA para detectar alteraciones genéticas en otros tipos de tumores (tabla 1). Se identificaron mutaciones en cuatro de quince (27%) glioblastomas, tres de doce (25%) cánceres gástricos, uno de trece (8%) cánceres de mama y uno de veinticuatro (4%) cánceres de pulmón. No se observaron mutaciones en once cánceres pancreáticos o doce meduloblastomas. En total, se observaron 89 mutaciones, de las cuales todas menos 3 eran heterocigotas.

Ejemplo 5-Este ejemplo demuestra la naturaleza no aleatoria de las alteraciones genéticas observadas.

El número absoluto de mutaciones observadas en PIK3CA en cinco tipos de cánceres diferentes sugiere fuertemente que estas mutaciones son funcionalmente importantes. Esta conclusión está respaldada por dos conjuntos de pruebas independientes adicionales. En primer lugar, el análisis de la razón de mutaciones no sinónimas con respecto a sinónimas es una buena medida de selección durante la progresión tumoral, ya que es poco probable que las alteraciones silenciosas ejerzan una ventaja de crecimiento. La razón de mutaciones no sinónimas con respecto a sinónimas en PIK3CA era de 89 a 2, muy superior a la razón 2:1 esperada por casualidad (P<1x10-4). En segundo lugar, la prevalencia de cambios no sinónimos ubicados en los dominios auxiliar y catalítico de PI3K era de ~120 por Mb de ADN tumoral, más de 100 veces superior que la de la frecuencia de mutación de fondo de alteraciones no funcionales observadas en el genoma de células cancerosas (P<1x10-4) (9).

Aunque los efectos de estas mutaciones sobre la función cinasa no se ha sometido a prueba aún experimentalmente, sus posiciones y naturaleza dentro de PIK3CA implican que es probable que sean activantes. No se observaron mutaciones de truncamiento y >75% de las alteraciones se producían en dos agrupaciones pequeñas en los exones 9 y 20 (tabla 2 y figura 1). Los residuos afectados dentro de estas agrupaciones están altamente conservados evolutivamente, conservando su identidad en ratón, rata y pollo. El agrupamiento de mutaciones de cambio de sentido somáticas en dominios específicos es similar al observado para mutaciones activantes en otros oncogenes, tales como RAS (10), BRAF (11, 12), p-catenina (13) y miembros del tirosina quinoma (14).

Estos datos genéticos sugieren que PIK3CA mutante es probable que funcione como un oncogén en cánceres humanos .

Ejemplo 6-Este ejemplo demuestra que la amplificación génica de PIK3CA no es común.

El análisis de PCR cuantitativa de PIK3CA en 96 cánceres colorrectales no mostró pruebas de amplificación génica, lo que sugiere que alteraciones de copias de genes no son un mecanismo significativo de activación de este tipo de tumor. Los cebadores usados fueron:

PI3K hCT1640694 20-1F en tiempo real (intrón)

TTACTTATAGGTTTCAGGAGATGTGTT (SEQ ID NO: 486); y

PI3K hCT1640694 20-1R en tiempo real

GGGTCTTTCGAATGTATGCAATG (SEQ ID NO: 487)

La lista de secuencias adjunta al final de esta solicitud contiene las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 1 = secuencia codificante sólo (nt 13 a 3201 de SEQ ID NO: 2)

SEQ ID NO: 2 = secuencia de ARNm (NM_006218)

SEQ ID NO: 3 = secuencia de proteína (NP_006209)

SEQ ID NO: 4 = exón 9

SEQ ID NO: 5 = exón 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

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65

SEQ ID NO: 6 a 165 = cebadores directos

SEQ ID NO: 166 a 325 = cebadores inversos SEQ ID NO: 326 a 485 = cebadores de secuenciación SEQ ID NO: 486 y 487 cebadores de amplificación Bibliografía y notas

1. R. Katso et al, Annu Rev Cell Dev Biol 17, 615-75 (2001).

2. I. Vivanco, C. L. Sawyers, Nat Rev Cancer 2, 489-501 (julio, 2002).

3. W. A. Phillips, F. St Clair, A D. Munday, R. J. Thomas, C. A Mitchell, Cancer 83, 41-7 (1 de julio de 1998).

4. E. S. Gershtein, V. A Shatskaya, V. D. Ermilova, N. E. Kushlinsky, M. A. Krasil'nikov, Clin Chim Acta 287, 59-67 (septiembre, 1999).

5. B. Vanhaesebroeck, M. D. Waterfield, Exp Cell Res 253, 239-54 (25 de noviembre de 1999).

6. S. Djordjevic, P. C. Driscoll, Trends Biochem Sci 27, 426-32 (agosto, 2002).

7. Se identificaron las subunidades catalíticas de PI3K mediante análisis de dominios de PI3K InterPro (IPR) (IPR000403) presentes dentro de la secuencia del genoma humano del borrador de Celera. Esto dio como resultado la identificación de 15 PI3K y genes relacionados con PI3K. El dominio cinasa del gen de PIK3CD no estaba representado en el borrador actual de la secuencia del genoma humano y por tanto no se incluyó en este estudio.

8. Se extrajeron secuencias para todos los exones y secuencias intrónicas adyacentes anotados que contenían el dominio cinasa de PI3K identificadas de la secuencia del genoma humano del borrador de Celera (dirección URL: www servidor central, nombre del dominio celera.com). Los números de registro de Celera y Genbank de todos los genes analizados están disponibles en la tabla 1. Se diseñaron cebadores para la amplificación y secuenciación por PCR usando el programa Primer 3 (dirección URL: http tipo de archivo, wwwgenome. wi.mit.edu servidor central, cgi- bin nombre del dominio, directorio del cebador, primer3_
www.cgi subdirectorio), y se sintetizaron por MWG (High Point, NC) o IDT (Coralville, IA). Se realizaron la amplificación y secuenciación por PCR en ADN tumoral de líneas celulares de pase temprano o tumores primarios tal como se describió previamente (12) usando un aparato de secuenciación automatizado de 384 capilares (Spectrumedix, State College, PA). Se ensamblaron las trazas de secuencias y se analizaron para identificar posibles alteraciones genómicas usando el paquete de software Mutation Explorer (SoftGenetics, State College, PA). De los exones extraídos, el 96% se analizaron satisfactoriamente. Se proporcionan en la tabla S 1 las secuencias de todos los cebadores usados para la amplificación y secuenciación por PCR.

9. T. L. Wang et al, Proc Natl Acad Sci USA 99, 3076-80. (2002).

10. J. L. Bos et al, Nature 327, 293-7 (1987).

11. H. Davies et al., Nature (9 de junio de 2002).

12. H. Rajagopalan et al, Nature 418, 934. (2002).

13. P. J. Morin et al, Science 275, 1787-90 (1997).

14. A Bardelli et al, Science 300, 949 (9 de mayo de 2003).

15. J. Li et al, Science 275, 1943-7 (1997).

16. P. A Steck et al, Nat Genet 15, 356-62 (1997).

17. T. Maehama, J. E. Dixon, J Biol Chem 273, 13375-8 (29 de mayo de 1998).

18. M. P. Myers et al, Proc Natl Acad Sci USA 95, 13513-8 (10 de noviembre de 1998).

19. L. Shayesteh et al, Nat Genet 21,99-102 (enero, 1999).

20. J. Q. Cheng et al, Proc Natl Acad Sci USA 89, 9267-71 (1 de octubre de 1992).

Claims

1.: Método para identificar agentes quimioterápicos candidatos, que comprende las etapas de:

5: poner en contacto un mutante activado de p110a (SEQ ID NO: 3) con un compuesto de prueba, en el que el mutante activado contiene una mutación activante en su dominio cinasa correspondiente a los nt 2095-3096 de SEQ ID NO: 2, en su dominio helicoidal correspondiente a los nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2, o en su dominio P85BD correspondiente a los nt 103-335 de SEQ ID NO: 2;

10: medir la actividad de p110a; identificar un compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato si inhibe la actividad de p110a.

2. 15: Método según la reivindicación 1, en el que el mutante activado de p110a comprende una mutación por sustitución seleccionada del grupo que consiste en E542K, E545K, Q546K y H1047R.

3.: Método según la reivindicación 1, en el que se identifica el compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato para tratar tumores con una mutación activante de p110a.

20 4.: Método según la reivindicación 1, en el que se identifica el compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato para tratar tumores con una mutación por sustitución de PIK3CA

5.: Método según la reivindicación 1, en el que se identifica el compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato para tratar tumores con una mutación activante de PIK3CA en su dominio cinasa

25: (nt 2095-3096 de SEQ ID NO: 2).

6.: Método según la reivindicación 1, en el que se identifica el compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato para tratar tumores con una mutación activante de PIK3CA en su dominio helicoidal (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2).

30 7.: Método según la reivindicación 1, en el que se identifica el compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato para tratar tumores con una mutación activante de PIK3CA en su dominio P85BD (nt 103-335 de SEQ ID NO: 2).

35 8.: Método según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

40: poner en contacto el compuesto de prueba con una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en: PIK3CB, PIK3CG, PIK3C2A PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3C3, A-TM, ATR, FRAP1, LAT1-3TM, SMGI, PRKDC y TRRAP; identificar un compuesto de prueba como agente quimioterápico candidato específico si inhibe una o más de dichas enzimas menos de lo que inhibe p110a.

9. 45: Método según la reivindicación 8, en el que un compuesto de prueba que inhibe PIK3CB, PIK3CG, PIK3C2A PIK3C2B, PIK3C2G y PIK3C3 menos de lo que inhibe p110a (PIK3CA) se identifica como agente quimioterápico candidato altamente específico.

10.: Método según la reivindicación 8, en el que un compuesto de prueba que inhibe p110a más de lo que inhibe PIK3CB y PIK3CG se identifica como altamente específico.

50 11.: Método según la reivindicación 1, en el que se realiza la etapa de puesta en contacto en un sistema libre de células.

12.: Método según la reivindicación 1, en el que se realiza la etapa de puesta en contacto en células completas.

imagen1

Exón 20 (dominio cinasa)

Exón 9 (dominio helicoidal)

Normal

G1633A (E545K)

C3139T (H1047Y)

Hx155

(tumor)

Co71

(tumor)

A1634G (E545G)

A3140G (H1047R)

Hx92

(tumor)

Hx37

(tumor)

C1636A (Q545K)

A3140T (H1047L)

Hx125

(tumor)

Mx10

(tumor)

Fig. 1

imagen2

Vector Tipo natural H1047R

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*+p110a

<■ Cadena pesada

imagen4

imagen5