WO2018181863A1 - 異なる複数の目的遺伝子の評価方法 - Google Patents

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真路 高阪
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating different target genes, a cancer detection marker identified by the evaluation method, a differentiation-inhibiting mutation detection marker, a drug sensitivity or resistance marker, and the like.
  • Approval for first-line treatment with anticancer drugs gefitinib, erlotinib, or afatinib for advanced lung cancer currently includes mutations in classical / sensitive EGFR genes such as deletion mutations or point mutations (L858R) in exon 19 Need to exist (Non-patent Document 1).
  • TKI EGFR tyrosine kinase inhibitor
  • TKIs first generation EGFR tyrosine kinase inhibitors
  • gefitinib and erlotinib are not very effective against the low frequency EGFR mutations
  • Non-patent literature 7
  • the main mechanism involved in resistance to gefitinib and erlotinib has been attributed to the T790M mutation of the EGFR gene, which can be overcome by treatment with osimertinib (Non-patent Document 8).
  • treatment with osimertinib is not effective against C797 complex mutation
  • insertion in exon 20 is also involved in EGFR TKI insensitive mutation. As described above, it is known that many mutations in the EGFR gene strongly affect the sensitivity of anticancer agents.
  • An object of the present invention is to provide a method for evaluating the functions of a plurality of different target genes, for example, a canceration ability, and a method for evaluating the sensitivity of a subject having each target gene to a drug.
  • Another object of the present invention is to provide a marker for cancer detection identified by the above method, a drug sensitivity or drug resistance marker, and means for detecting these markers.
  • the present inventors mixed and cultured a plurality of host cells in which a polynucleotide containing a tag sequence and a polynucleotide containing a target gene linked thereto was inserted into genomic DNA, and cultivated the polynucleotide derived from the host cells after the cultivation. It was found that the relative cell number of each host cell after culturing was determined by quantification based on the above, and based on that, a plurality of different target genes could be individually and comprehensively evaluated. In addition, the present inventors have found a novel cancer detection marker, a drug sensitivity marker, and the like based on this method, and completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects. (1) a step of inserting a polynucleotide comprising a tag sequence and a target gene linked thereto or a fragment thereof into the genomic DNA of a host cell; Mixing a plurality of host cells into which different polynucleotides are inserted, Culturing the mixed host cells; A step of extracting genomic DNA from the cultured host cell, Quantifying each of the polynucleotides in the extracted genomic DNA based on the tag sequence; Determining a relative cell number after culturing of host cells having each polynucleotide based on the quantitative value of the polynucleotide; A method for evaluating a plurality of different target genes.
  • the target gene contains a reference gene, and the relative cell number after culturing of the host cell having a polynucleotide containing the reference gene is used as a reference value;
  • the method according to (1) comprising a step of comparing.
  • the method according to (2) further comprising a step of evaluating that the target gene has canceration ability when the relative number of cells after the culture is higher than a reference value.
  • (4) performing the culture step under differentiation-inducing conditions, The method according to (2), further comprising a step of evaluating that the target gene is a differentiation suppressing gene when the relative number of cells after the culture is higher than a reference value.
  • the method according to (1) or (2) wherein the culturing step is performed in a test environment.
  • the target gene is an oncogene
  • the culture step is performed in the presence of an anticancer agent
  • the sensitivity of each oncogene to the anticancer agent is determined based on the relative number of cells after the culture.
  • the method as described in (6) including the process to evaluate.
  • the anticancer drug is a low molecular compound and / or an antibody drug.
  • the method described in (7) or (8) is performed once for a plurality of anticancer agents or a plurality of times independently, and each oncogene is based on the obtained anticancer drug sensitivity results.
  • a method for determining an anticancer agent comprising a step of determining an anticancer agent effective against the disease.
  • the target gene is a tumor suppressor gene
  • the host cell is a cell from which the tumor suppressor gene has been deleted
  • the culture step is a treatment that causes a disorder that can be repaired by the cancer suppressor gene to the host cell.
  • the method according to (6) wherein (11) The method according to (10), wherein the drug is a PARP inhibitor.
  • the target gene comprises a complex mutant gene comprising a plurality of mutations relative to a wild type gene.
  • the quantification step is performed based on the number of reads in the next generation sequence.
  • the culturing step is performed in vivo using a non-human animal.
  • EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of H304Y, P741L, S752-I759del, H773Y, A767V, V786M, L838P, E865K, A871G, G874S, V802I, and S1153I, which is a marker for cancer detection The marker.
  • a cancer detection marker comprising L62R and G719S (trans), R108K and L858R (trans), A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746-S752> V (trans), A289T and L858R (cis), A289T and L858R (trans), V292L and L858R (cis), V292L and L858R (trans), S306L and L858R (cis), S306L and L858R (cis), S306L and L858R (trans), L703I and L858R (cis), L703I and L858R (Trans), I706T and G719A (cis), I706T and G719A (trans), E709A and G719C (cis), E709A and G719C (trans), E709A and G719S (cis), E709A and G719S (cis), E709A
  • a cancer detection marker comprising a polynucleotide encoding an EGFR protein having a mutation defined in (17) or (18).
  • the fusion protein according to (20) comprising a deleted and / or substituted amino acid sequence.
  • a marker for detecting a differentiation-suppressing mutation comprising the fusion protein according to (20) or (21) or the polynucleotide according to (22).
  • An EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance marker comprising an EGFR protein having an A839T mutation.
  • a cancer detection marker comprising a BRCA2 protein having a selected mutation, or a polynucleotide encoding the protein.
  • a kit comprising a primer set, a probe, an aptamer, an antibody, or any one of them for detecting the marker according to any one of (17) to (19) and (23) to (37).
  • a method for assisting in determining the presence or absence of a differentiation-suppressing mutation or the possibility of cancer in a sample obtained from a subject comprising the step of detecting the marker according to (23).
  • a method for assisting discrimination of cetuximab sensitivity comprising a step of detecting the marker according to (24) or (25) in a sample obtained from a subject.
  • a method for assisting discrimination of drug sensitivity comprising a step of detecting at least one marker according to any one of (26) to (36) in a sample obtained from a subject.
  • the present invention it is possible to quickly and accurately and comprehensively evaluate functions such as canceration ability of a plurality of different target genes and sensitivity or resistance of a cell having each target gene to a drug. Furthermore, based on the various markers identified by the method of the present invention, it is possible to evaluate the presence or absence of cancer, the possibility of cancer, drug sensitivity, and the like.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing one embodiment of a method for evaluating a plurality of target genes different in the present invention.
  • Fig. 3 shows various tyrosine kinase inhibitors (hereinafter referred to as TKIs) against a pool of 16 Ba / F3 cells expressing active EGFR mutants (11) or other oncogenic proteins (5). It is a figure which shows the result of having tested.
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • each TKI-treated Ba / F3 cell was compared to a vehicle-treated subject to calculate the growth inhibition of each cell clone.
  • the drugs used are gefitinib, erlotinib, afatinib, osmeltinib, rosiretinib, crizotinib, alectinib, and puromycin.
  • the vertical axis indicates the drug concentration (in order from the top row, 0.0001 ⁇ M, 0.0005 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.005 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.05 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M).
  • FIG. 4 shows the sensitivity of cells expressing A839T, L858R, and EGFR protein with T790M and C797S to gefitinib, erlotinib, afatinib, and osimertinib.
  • the horizontal axis represents drug concentration (nM), and the vertical axis represents cell viability (%).
  • FIG. 5-1 shows the sensitivity of cells expressing wild-type EGFR (WT) or EGFR protein having each mutation to gefitinib, erlotinib, afatinib, osmeltinib, and rosiretinib.
  • the vertical axis indicates the drug concentration (in order from the top row, 0.0001 ⁇ M, 0.0005 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.005 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.05 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M).
  • FIG. 6-1 shows the sensitivity of cells expressing EGFR protein having each mutation to gefitinib, erlotinib, afatinib, and osimertinib.
  • the vertical axis indicates the drug concentration (in order from the top row, 0.0001 ⁇ M, 0.0005 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.005 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.05 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M).
  • the relative survival rate is expressed in shades, and the darker the color, the lower the survival rate. It is a continuation leaf of Figure 6-1.
  • FIG. 7 shows the results of evaluating cells expressing EGFR protein containing single and complex mutations in the 3T3 focus formation assay. The darker the color of the solution, the more the cells proliferate, suggesting that the mutation has carcinogenic potential. GFP indicates green fluorescent protein, and Wt indicates evaluation of cells expressing a protein having wild type EGFR.
  • Single is a protein containing the mutation shown in the left column of the table
  • Cis is a protein containing L858R (in the cis position) in addition to the mutation shown in the left column of the table
  • Trans is a mutation shown in the left column of the table.
  • FIG. 8-1 shows the sensitivity of cells expressing EGFR protein having each mutation to cetuximab.
  • the vertical axis shows the drug concentration (0.001 ⁇ g / mL, 0.01 ⁇ g / mL, 0.1 ⁇ g / mL, 1 ⁇ g / mL, 10 ⁇ g / mL, 100 ⁇ g / mL in order from the top row), and the horizontal axis shows each mutation. It shows that the cell which has was used.
  • the relative survival rate is expressed in shades, and the darker the color, the lower the survival rate. It is a continuation leaf of Drawing 8-1.
  • FIG. 9 shows the result of evaluation of VUS or conflictingconfinterpretations mutations registered in Clinvar by the MANO-B method.
  • the present invention relates to a method for evaluating a plurality of different target genes (hereinafter also simply referred to as “the evaluation method of the present invention”).
  • the lower limit of the range of “plurality” is not particularly limited, but may be, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more, 50 or more, 100 or more.
  • the upper limit of the “plurality” range is not particularly limited, but may be, for example, 1000 or less, 500 or less, or 300 or less.
  • the type of “target gene” is not particularly limited. Since the method of the present invention can evaluate the proliferation rate and / or survival rate of cells, the target gene may be a gene that affects the proliferation rate and / or survival rate of cells.
  • genes that affect cell growth rate and / or survival rate include, for example, oncogenes, tumor suppressor genes, genes involved in apoptosis, genes involved in cell aging, differentiation (under differentiation-inducing conditions) Examples include suppressor genes, genes involved in stem cell maintenance, drug sensitivity or resistance genes (in the presence of drugs), stress sensitivity or resistance genes (in a stress environment), and the like.
  • oncogenes include EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, epidermal growth factor receptor) gene, ALK (anaplastic lymphoma ⁇ ⁇ ⁇ kinase) gene, RAS gene (KRAS gene, NRAS gene, HRAS gene), and RET (REarranged during Transfection) Genes and the like.
  • tumor suppressor genes include BRCA1, BRCA2, TP53, MSH2, MSH6, MLH1, APC, NF1, INK4A, PTEN, and RB1.
  • Both the wild type and mutant gene of the target gene may have a function to be evaluated, or either the wild type or mutant type of the target gene may have a function to be evaluated.
  • the term “mutation” means having a trait that is different from the majority (wild type) of the population, and the term “mutant” means substances such as nucleic acids and proteins having such a trait. Means. In general, mutations are identified by comparing the base sequence of a gene in a subject or the amino acid sequence of a protein with their sequence in a healthy wild type.
  • the type of mutation is not limited.
  • a mutation at the gene level that is, a mutation on the base sequence
  • a nonsense mutation in which the codon of the amino acid is changed to a stop codon a missense in which substitution of the base in the codon causes amino acid substitution
  • Mutations addition deletion mutations in which addition and / or deletion of amino acids is caused by addition and / or deletion of bases within codons, and frameshift mutations in which the codon reading frame is shifted by insertion or deletion of bases, etc.
  • Non-synonymous mutations are included.
  • Silent mutations (synonymous mutations) in which the nucleotide sequence is mutated but the amino acid is not varied are also included in the mutation of the present specification.
  • fusion mutations formed by the fusion of one gene with another gene, and exon skipping that results in transcripts excluding some exons.
  • the mutation of the target gene may be a mutation with known significance or VUS (Variant of uncertain significance).
  • the target gene can include a plurality of mutants of one gene such as an oncogene.
  • the target gene may include a complex mutation including a plurality of mutations with respect to one wild type gene.
  • the number of the plurality of mutations included in the complex mutation is not limited, and may be 2, 3, or 4, for example.
  • the target gene evaluation method of the present invention comprises a step of inserting a polynucleotide containing a tag sequence and a target gene linked thereto or a fragment thereof into genomic DNA of a host cell (insertion step), and a plurality of different polynucleotides inserted therein A step of mixing the host cells (mixing step), a step of culturing the mixed host cells (culturing step), a step of extracting genomic DNA from the host cells after the cultivation (extraction step), and the poly in the extracted genomic DNA A step of quantifying each of the nucleotides based on the tag sequence (quantitative step), and a step of determining a relative cell number after culturing of the host cell having each polynucleotide based on the quantitative value of the polynucleotide (determination) Step) as an essential step.
  • the evaluation method of the present invention includes, as an optional step, the target gene contains a reference gene, and the host cell having a polynucleotide containing the reference gene is used as a reference value for the relative number of cells after culturing.
  • a step of comparing the relative number of cells after culturing the cells may be included after the determination step.
  • the evaluation method of the present invention optionally includes a step of evaluating a target gene (evaluation step) by comparison with a reference value obtained in the comparison step or by comparison with another target gene in addition to the comparison step. Further included after the determination step or the comparison step.
  • FIG. 1 An embodiment of the evaluation method of the present invention will be described with reference to FIG.
  • a polynucleotide containing a target gene with a tag sequence is inserted into the genomic DNA of a host cell, these cells are mixed, and then a part of the cell is arbitrarily taken out to make a sample of Day 0.
  • the mixed cells are cultured under an arbitrary condition (for example, normal culture conditions or drug treatment conditions) for an appropriate period, and then genomic DNA is extracted from the cells to amplify and quantify the nucleic acid region containing the tag sequence.
  • the relative number of cells having the target gene is determined based on the quantitative value. When determining the relative number of cells, it may optionally be standardized by the value of Day 0 (before culture).
  • the method for evaluating a plurality of target genes different in the present invention can be used for, for example, evaluating the presence or absence of canceration ability, evaluating the presence or absence of a differentiation-suppressing gene, and evaluating the sensitivity of an oncogene to an anticancer agent. it can.
  • Insertion process a polynucleotide containing the tag sequence and the target gene or fragment thereof linked thereto is inserted into the genomic DNA of the host cell.
  • tag sequence or “barcode sequence” means a unique identification sequence attached to each target gene or a fragment thereof.
  • the tag sequence may be directly linked to the target gene or indirectly linked via another sequence such as a spacer sequence.
  • each polynucleotide in the genomic DNA can be quantified based on the tag sequence in a quantification step described later.
  • the length of the tag sequence is not limited, but is preferably long enough to identify each target gene.
  • the nucleotide length of the tag sequence may be, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 8 or more, and may be 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, or 10 or less.
  • a unique tag sequence can be attached to each of 4 n types of target genes.
  • the method of inserting the target gene into the genomic DNA of the host cell is not limited, and can be performed using methods known to those skilled in the art. Examples of such methods include a method using a viral vector such as a retroviral vector or a lentiviral vector, a method using a recombinase such as Cre-Lox, a method of introducing a gene using a transposase such as Piggy Bac Transposon Vector System, TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) (see, for example, WO2011 / 072246), CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated protein 9) (eg, Hendel A.
  • TALEN Transcription activator-like effector nuclease
  • CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated protein 9
  • the polynucleotide is inserted into the genomic DNA of the host cell in a state where the target gene can be expressed.
  • the “state in which the target gene can be expressed” means a state in which the target gene is present together with regulatory sequences necessary for its expression and the target gene is expressed. Regulatory sequences include promoters, enhancers, terminators, S-D (Shine Dalgarno) sequences or ribosome binding sites, replication origins, poly A sites, and the like. These regulatory sequences may be endogenous (endogenous) in the genomic DNA of the host cell, or exogenous one that has been artificially inserted into the host cell genome in the insertion step together with the target gene. May be.
  • the target gene may be inserted into the genome of the host cell together with a selection marker such as a drug resistance gene, and after the insertion, the cell into which the target gene has been introduced may be selected using this selection marker.
  • the type of host cell is not limited, but preferably mammals, for example primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats and mice, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep and goats, and dogs and cats
  • a pet animal such as a human cell, preferably a human cell.
  • Examples of cells that can be used in the evaluation method of the present invention include established cells such as HEK293 cells, 3T3 cells, Ba / F3 cells, and CHO cells, and primary cultured cells.
  • the cells to be used can be appropriately selected according to the target gene to be evaluated in consideration of the presence / absence of a disease, the presence / absence of mutation, and / or the tissue derived from the disease.
  • the cultured cells may be wild-type cells, or specific genes such as oncogenes, tumor suppressor genes, genes involved in apoptosis, genes involved in cell aging, differentiation-suppressing genes, maintenance of stem cell nature Mutant cells obtained by knocking out or deleting genes related to, drug sensitivity or resistance genes, stress sensitivity or resistance genes, etc. may also be used.
  • the evaluation method of the present invention may be performed using two or more different cells, and the function of the target gene for a plurality of cells may be evaluated. In order to eliminate this, it is preferable to perform the insertion step on the same cell line and use it in the subsequent mixing step.
  • the mixing step a plurality of host cells into which polynucleotides containing different target genes are inserted in the insertion step are mixed.
  • some of the cells immediately after mixing may be collected as standardized cells. By standardizing the result of the host cell after the culturing step described later with the result of the standardized cell, the difference in the mixing ratio of the number of cells in the mixing step can be corrected.
  • the host cells mixed in the mixing step are cultured under appropriate conditions.
  • the culture step may be performed by setting culture conditions such as medium components, temperature, pH, humidity, CO 2 concentration, etc. to normal conditions known to those skilled in the art, or may be performed in a specific test environment.
  • “Test environment” means a specific condition for testing a gene of interest of the present invention, for example, in the presence of a test substance, for example, a drug such as an anticancer drug, under the condition of inhibiting or promoting differentiation, Examples include stress conditions such as stress and temperature stress.
  • the period of the culture process is not particularly limited.
  • the culture process may be, for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 1 week or more, 2 weeks or more, 3 months or less, 2 months or less 1 month or less, or 2 weeks or less, for example, 3 days or more and 2 weeks or less.
  • the culturing step can be performed in either in vitro or in vivo, but is more preferably performed in vitro from the viewpoint of simplicity of the test.
  • the host cells mixed in the mixing process may be transplanted into a non-human animal, for example, a laboratory animal such as a rat and a mouse, and may be subjected to an extraction process described later after a certain period of time. .
  • genomic DNA is extracted from the host cells after culturing in the culturing step (and optionally, host cells after the mixing step and before the culturing step) by a conventional method.
  • Methods for extracting genomic DNA are known to those skilled in the art. For example, methods described in Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press may be referred to.
  • the genome can be obtained using a general phenol chloroform extraction method or a commercially available kit such as PureLink (registered trademark) Genomic DNA (Thermo Fisher Scientific) or Mag ExtractorTM-Genome- (TOYOBO).
  • PureLink registered trademark
  • Genomic DNA Thermo Fisher Scientific
  • Mag ExtractorTM-Genome- TOYOBO
  • DNA can be extracted.
  • the extracted DNA can be used for PCR as it is or after purification.
  • an appropriate tissue or organ may be collected from a non-human animal transplanted with host cells, and then genomic DNA may be extracted by the above method.
  • Quantitative process In the quantification step, the amount of the polynucleotide contained in the genomic DNA extracted in the extraction step is quantified based on the tag sequence to obtain a quantitative value.
  • a “quantitative value” is a measured value obtained by a quantitative method.
  • the quantitative value may be an absolute value such as capacity and weight, or may be a relative value with respect to a reference value.
  • the quantification step can be performed by a quantification method known to those skilled in the art, for example, a quantification method using a probe, or semi-quantitative PCR or Real-time PCR using a specific primer. From the standpoint of performance, it is preferable to perform based on the number of reads in the next generation sequence.
  • Next-generation sequencing is a method for acquiring sequence information using a next-generation sequencer, and is characterized by being able to perform a huge number of sequencing reactions in parallel compared to the Sanger method (for example, Rick Kamps et al. , Int. J. Mol. Sci., 2017, 18 (2), p. 308 and Int. Neurourol. J., 2016, 20 (Suppl. 2), S76-83).
  • sample preparation (step (1)) is performed.
  • the nucleic acid to be analyzed is fragmented enzymatically or mechanically in accordance with the read length of the next-generation sequencer.
  • an adapter sequence necessary for the subsequent sequencing step is added.
  • the specific gene region may be enriched by PCR or the like. Enrichment of the gene region is performed by an amplification step of 4 to 12 cycles, for example.
  • sequencing step (2) is performed.
  • the details of the sequencing step vary depending on the type of next-generation sequencer, but typically, the sequencing reaction is performed by connecting to a substrate via an adapter sequence and using the adapter sequence as a priming site.
  • the sequencing reaction is performed by connecting to a substrate via an adapter sequence and using the adapter sequence as a priming site.
  • the sequence reaction see, for example, Rick Kamps et al (supra).
  • process (3) data output.
  • a collection of sequence information obtained by the sequencing reaction is obtained.
  • the output data can be further analyzed to yield more meaningful results.
  • the number of reads refers to the amount of amplification of an amplification product having a specific sequence.
  • the number of reads in a region containing a specific tag sequence by the next generation sequence can be regarded as the relative amount of the target gene to which the tag sequence in the genomic DNA is linked.
  • the PCR step it is particularly preferable to subject the nucleic acid region containing the tag sequence to PCR for the next-generation sequence. This is because the PCR step can not only add adapter sequences necessary for next-generation sequencing, but also enrich the region containing the tag sequence and increase detection sensitivity.
  • the determining step the relative cell number after culturing of the host cell having each polynucleotide is determined based on the quantified value of the polynucleotide determined in the quantifying step.
  • each polynucleotide in the genomic DNA is quantified, so that it is not affected by the difference in expression level, unlike the case of quantifying mRNA or protein. Therefore, each quantitative value of the polynucleotide reflects the number of cells after culturing of the host cell having each polynucleotide.
  • the number of cells in the mixing step is obtained by partially collecting the cells immediately after mixing in the mixing step as standardized cells and normalizing the number of host cells obtained in the determination step after culturing with the number of host cells immediately after mixing. The difference in the mixing ratio can be corrected.
  • the comparison step is an arbitrary step that can be included after the determination step in the evaluation method of the present invention.
  • the target gene includes a reference gene.
  • the “reference gene” means a gene that serves as a reference for evaluating the function of the target gene, and the type thereof is not limited. Negative control genes that are known to be free (eg wild type genes that do not have canceration potential) and positive control genes that are known to have a positive or negative effect on cell proliferation (eg cancer Gene, drug susceptibility gene or drug resistance gene).
  • the relative cell number after culturing of the host cell having the polynucleotide containing the reference gene is used as a reference value and compared with the relative cell number after culturing of the host cell determined in the determination step.
  • the reference gene is not included, for example, the target gene can be evaluated by comparison with another target gene, but the target gene can be more accurately evaluated by comparison with the reference gene.
  • the evaluation step is an arbitrary step that can be included after the determination step or after the comparison step in the evaluation method of the present invention.
  • the target gene is evaluated by comparison with the reference value obtained in the comparison step or by comparison with another target gene.
  • the target gene when the reference gene is the negative control gene and the relative number of cells after culturing of the host cell having the polynucleotide containing the target gene is higher than the reference value, the target gene has cancerigenic potential. Can be evaluated.
  • the reference gene when the reference gene is the positive control gene, when the relative number of cells after culturing of the host cell having the polynucleotide containing the target gene is about the same as the reference value, the target gene has a cancer-causing ability. Can be evaluated.
  • the evaluation method of the present invention can be used as a method for identifying a cancer (candidate) gene.
  • the culturing step is performed under differentiation-inducing conditions, and a mutation that is observed to proliferate even under the differentiation-inducing condition can be evaluated as a differentiation-inhibiting mutation, for example, a differentiation-inhibiting mutation having canceration ability.
  • the relative cells after culturing under differentiation-inducing conditions of host cells having a polynucleotide containing the gene of interest When the number is higher than the reference value, it can be evaluated that the target gene has the ability to suppress differentiation.
  • the reference gene is a positive control gene that is known to affect differentiation
  • the relative cell number after culturing under the differentiation-inducing conditions of a host cell having a polynucleotide containing the target gene is determined. When it is almost the same as the reference value, it can be evaluated that the target gene has canceration ability.
  • the evaluation method of the present invention can be used as a method for identifying a differentiation-suppressing (candidate) gene.
  • a differentiation inhibiting (candidate) gene can be identified based on the differentiation inhibiting ability score calculated by the following formula.
  • Target gene A differentiation inhibition score (AI X ⁇ T X ) / (A X ⁇ TI X )
  • AI X the number of reads of the tag sequence attached to the target gene A in the cells collected on Day X after differentiation induction
  • T X total number of reads for all tag sequences in cells recovered on Day X
  • a X the number of reads of the tag sequence attached to the target gene A in the cells collected on Day X
  • TI X total number of reads of all tag sequences in cells collected on Day X after differentiation induction.
  • the differentiation suppression ability score indicates that the higher the value, the higher the differentiation inhibition ability of the target gene.
  • the evaluation method of the present invention can be used for evaluating sensitivity or resistance to a drug.
  • the drug sensitivity score can be calculated by the following calculation formula.
  • Suitable agents include anticancer agents such as low molecular compounds and / or antibodies.
  • anticancer agents such as low molecular compounds and / or antibodies.
  • low molecular weight compounds that act as anticancer agents are EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI) such as gefitinib (gefitinib), erlotinib, afatinib, asimatintinib, rosiretinib (rosiretinib), crizotinib ), And alectinib, and an example of an antibody that acts as an anticancer agent is EGFR antibody cetuximab.
  • TKI EGFR tyrosine kinase inhibitors
  • an antibody that acts as an anticancer agent is EGFR antibody cetuximab.
  • the target gene is an oncogene.
  • the culturing step is performed in the presence of an anticancer agent, and the sensitivity of each oncogene to the anticancer agent based on the relative number of cells after the culture (or A step of assessing resistance).
  • Sensitivity or resistance to an anticancer drug can be determined by comparison with a reference gene (for example, a wild-type gene) or another target gene.
  • a reference gene for example, either a drug sensitivity gene or a drug resistance gene can be used.
  • drug sensitivity or resistance can be evaluated based on cell viability at a specific drug concentration without including a reference gene.
  • drug sensitivity or resistance can be determined based on the survival rate at the drug concentration by appropriately determining the drug concentration in consideration of the type of drug and the drug concentration in the living body.
  • the anticancer agent is the above low molecular weight compound, for example, the cellularity at a drug concentration of 0.0001 ⁇ M to 10 ⁇ M, 0.0005 ⁇ M to 5 ⁇ M, 0.001 ⁇ M to 1 ⁇ M, 0.005 ⁇ M to 0.5 ⁇ M, or 0.01 ⁇ M to 0.1 ⁇ M
  • drug sensitivity or resistance can be evaluated.
  • the anticancer drug is an antibody
  • 0.001 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL for example, 0.01 ⁇ g / mL to 10 ⁇ g / mL, or 0.1 Drug sensitivity or resistance can be assessed based on cellular viability at a concentration of ⁇ g / mL to 1 ⁇ g / mL.
  • the cell having the target gene is It can be determined that there is drug resistance.
  • cell viability is low at these drug concentrations, for example, when the cell viability is 50% or more, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, or 0%, the target gene It can be judged that cells having a drug sensitivity.
  • the sensitivity can be further classified into “narrow sensitivity” in which the probability that the drug is effective is high and “partial sensitivity” in which the probability that the drug is effective is inferior to that in the narrow sense.
  • the narrow sense sensitivity, partial sensitivity, and resistance of each drug can be determined as follows based on, for example, IC90 (drug concentration at which cell growth is inhibited by 90%).
  • IC90 ⁇ 0.1 ⁇ M is narrowly sensitive
  • 0.1 ⁇ M ⁇ IC90 ⁇ 0.5 ⁇ M is partially sensitive
  • IC90> 0.5 ⁇ M is considered to be resistant Can do.
  • IC90 ⁇ 0.005 ⁇ M is narrowly sensitive
  • 0.005 ⁇ M ⁇ IC90 ⁇ 0.01 ⁇ M is partially sensitive
  • IC90> 0.01 ⁇ M is considered as resistance.
  • rosiretinib it is possible to establish a system in which narrowly sensitive in the case of IC90 ⁇ 0.1 ⁇ M, partially sensitive in the case of 0.1 ⁇ M ⁇ IC90 ⁇ 1 ⁇ M, and in the case of IC90> 1 ⁇ M.
  • cetuximab it can be considered as narrowly sensitive when IC90 ⁇ 1 ⁇ g / mL, partially sensitive when 1 ⁇ g / mL ⁇ 9090 ⁇ 100 ⁇ g / mL, and resistant when IC90> 100 ⁇ g / mL.
  • the target gene is a cancer suppressor gene such as a BRCA1 gene or a BRCA2 gene.
  • the host cell may be a cell lacking a gene of interest, such as a tumor suppressor gene.
  • the culturing step can be performed under a treatment that causes the host cell to have a disorder that can be repaired by the tumor suppressor gene.
  • treatments that cause damage to the host cell that can be repaired by tumor suppressor genes include PARP (poly (ADP-ribose) polymerase) inhibitors and cytotoxic anticancer agents (eg, platinum anticancer agents) And drugs such as cisplatin, carboplatin, etc.) and radiation treatment.
  • the evaluation method of the present invention may include a step of evaluating each tumor suppressor gene based on the relative number of cells after the culture. For example, since a cell into which a functional tumor suppressor gene has been introduced has a repair ability, the number of cells does not decrease even when a drug such as PARP is added. On the other hand, cells into which a function-deficient tumor suppressor gene has been introduced have no repair ability, so the addition of a drug such as PARP reduces the relative number of cells. According to such criteria, each tumor suppressor gene can be evaluated based on the relative number of cells after culture.
  • the present invention relates to a method for determining an anticancer agent.
  • the anticancer agent determination method of the present invention performs a method for evaluating the sensitivity of the drug for a plurality of anticancer agents, and determines an effective anticancer agent for each cancer gene based on the obtained results.
  • the process of carrying out is included.
  • the method for evaluating drug sensitivity may be performed for a plurality of anticancer agents at a time by performing the culturing step in the presence of the plurality of drugs. Thereby, the sensitivity with respect to a combination drug or a combination therapy can be evaluated.
  • the method for evaluating drug sensitivity may be performed independently for each drug, and the sensitivity may be independently evaluated for a plurality of drugs. Thereby, the sensitivity of each drug can be compared, and a more sensitive drug can be determined. In this case, in order to widely verify various drug sensitivities of each gene, it is preferable that the mechanism of action of each drug is different. In particular, the present inventor has found that the sensitivity of each oncogene to an antibody and the sensitivity to a low molecular weight compound are greatly different. Therefore, by evaluating the sensitivity of both the antibody and the drug, a more appropriate drug Can be selected.
  • the present invention relates to a marker for cancer detection.
  • the cancer detection marker means a factor that serves as an index for detecting cancer.
  • the cancer detected by the cancer detection marker of the present invention is not limited, and examples thereof include brain tumor, pharyngeal cancer, thyroid cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, and pancreas. Cancer, kidney cancer, small intestine cancer, colon cancer, bladder cancer, prostate cancer, cervical cancer, ovarian cancer, lymphoma, or melanoma, preferably lung cancer.
  • the cancer detection marker of the present invention preferably a lung cancer detection marker is from A767V, A871G, E865K, G874S, H304Y, H773Y, L838P, P741L, S1153I, and S752-I759del, V786M, and V802I. It consists of an EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of or a polynucleotide encoding the protein.
  • the EGFR protein preferably includes the amino acid sequence of human EGFR protein represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding EGFR protein preferably includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the substitution mutation is represented by the symbol “X 1 a 1 X 2 ”, which indicates that the X 1 amino acid at the a 1 position is changed to the X 2 amino acid when the starting methionine is positioned at position 1 in the amino acid sequence of the protein. Means replaced.
  • the above A767V in the EGFR protein means that leucine at position 767 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • symbol notation of an amino acid in this specification follows the normal amino acid notation method.
  • the insertion mutation is represented by the symbol “X 1 a 1 -X 2 a 2 insX 3 ”. This is between the X 2 amino acids of X 1 amino acids and a 2-position of a 1-position of the protein, X 3 amino acid insertion: means that it is (ins insert).
  • X 3 may be two or more amino acid residues.
  • K745-E746insVPVAIK in EGFR protein indicates that valine, proline, valine, alanine, isoleucine and lysine are inserted between lysine at position 745 and glutamic acid at position 746 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. means.
  • the deletion mutation is represented by the symbol “X 1 a 1 -X 2 a 2 del” or “delX 1 a 1 -X 2 a 2 ”.
  • L747-A750del in the EGFR protein means that alanine at position 750 is deleted from leucine at position 747 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the deletion substitution mutation is represented by the symbol “X 1 a 1 -X 2 a 2 > X 3 ”. This means that the X 2 amino acid at the a 2 position is substituted with the X 3 amino acid from the X 1 amino acid at the a 1 position of the protein. X 3 amino acids may be two or more amino acid residues.
  • the “deletion substitution mutation” means a mutation in which one or more amino acids in the original amino acid sequence are replaced with different one or more amino acids. Deletion substitution mutations can be distinguished from normal substitution mutations in that the number of deleted amino acid residues is different from the number of amino acid residues after substitution.
  • E709-T710> D in the EGFR protein means that threonine at position 710 is deleted from glutamic acid at position 709 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is substituted with aspartic acid.
  • E746-A750> IP means that alanine at position 750 is deleted from glutamic acid at position 746 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is substituted with isoleucine and proline.
  • the marker for cancer detection of the present invention comprises an EGFR protein having a complex mutation or a polynucleotide encoding the protein.
  • a compound mutation refers to a plurality of different mutations present in one wild-type gene.
  • compound mutations including two or more mutations such as “X 1 a 1 X 2 and X 3 a 2 X 4 ” or “X 1 a 1 X 2 + X 3 a 2 X 4 ”, It is expressed as a combination of the above mutation symbols.
  • This X 1 amino acids in a 1 of the protein is substituted with X 2 amino acids
  • X 3 amino acids of a 2-position means that it is substituted with X 4 amino acids.
  • R108K and L858R in the EGFR protein means that R (arginine) at position 108 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with K, and L at position 858 is substituted with R.
  • a cis type containing a plurality of mutations in one gene of the same chromosome and a trans type containing different mutations in alleles on different chromosomes.
  • a cis-type compound mutation is represented by (cis)
  • a trans-type compound mutation is represented by (trans).
  • the cancer detection marker of the present invention is L62R and G719S (trans), R108K and L858R (trans), A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746.
  • the marker for cancer detection of the present invention is R2659G, N3124I, L2604P, W31C, E2663K, W2626R, D3073G, G2609D, P2329L, D2913H, P2639L, S3291C, D23V, I2664M, K485 *, L997 *, Q1502 *, K1984 *, C2535 *, and W2970 *, preferably a BRCA2 protein having a mutation selected from the group consisting of R2659G, N3124I, L2604P, W31C, E2663K, W2626R, D3073G, G2609D, and P2329L, or the protein It consists of the encoding polynucleotide.
  • the BRCA2 protein preferably includes the amino acid sequence of the human BRCA2 protein represented by SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding BRCA2 protein preferably includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the nonsense mutation is represented by the symbol “X 1 a 1 *”, and this indicates that the nucleotide encoding the X 1 amino acid at position a 1 when the starting methionine is positioned at position 1 in the amino acid sequence of the protein. , Meaning a substitution with a nucleotide encoding a stop codon.
  • the above K485 * in the BRCA2 protein means that the nucleotide encoding lysine at position 485 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is substituted with a nucleotide encoding a stop codon.
  • the present invention relates to a fusion protein of COL1A2 (collagen type I alpha 2) protein and DCAF6 (DDB1 and CUL4 associated factor 6) protein, or a polynucleotide encoding the fusion protein.
  • the origins of COL1A2 protein and DCAF6 are not particularly limited, but preferably mammals, for example primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats and mice, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep and goats, and Pets such as dogs and cats, preferably humans.
  • COL1A2 protein is preferably, for example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more with respect to the amino acid sequence of human COL1A2 protein represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. , A polypeptide comprising an amino acid sequence having 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity.
  • the COL1A2 protein may be a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide encoding the COL1A2 protein is preferably a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, for example, 70% or more, 80% relative to the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the polynucleotide may contain a nucleotide sequence having the identity of 90% or more, preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the polynucleotide encoding the COL1A2 protein may be a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are added, deleted, and / or substituted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the identity value relating to the amino acid sequence and the base sequence indicates a value calculated with default settings using software (for example, FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates identity between a plurality of sequences. .
  • software for example, FASTA, DANASYS, and BLAST
  • identity is determined, see, for example, Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977 and Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990 .
  • the range of “one or more” is 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, or 1 or 2 It is a piece.
  • the DCAF6 protein is preferably, for example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more with respect to the amino acid sequence of the human DCAF6 protein represented by SEQ ID NO: 5 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the DCAF6 protein may be a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide encoding the DCAF6 protein is preferably a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, for example, 70% or more, 80% relative to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the polynucleotide may contain a nucleotide sequence having the identity of 90% or more, preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the polynucleotide encoding DCAF6 protein may be a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are added, deleted, and / or substituted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein is not limited as long as it has the ability to suppress differentiation.
  • a part of the COL1A2 protein is included on the N-terminal side of the fusion protein, and a part of the DCAF6 protein is included on the C-terminal side of the fusion protein.
  • the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein is preferably 70% or more of the amino acid sequence of the fusion protein of human COL1A2 protein and human DCAF6 protein represented by SEQ ID NO: 7, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, It may be a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity.
  • the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein may be a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the polynucleotide encoding the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein is preferably a base sequence represented by SEQ ID NO: 8 encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, for example, against the base sequence represented by SEQ ID NO: 8,
  • the polynucleotide may comprise a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity.
  • polynucleotide encoding the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein is a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are added, deleted, and / or substituted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 It may be.
  • the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein may have differentiation inhibiting ability, for example, ability to inhibit differentiation into muscle cells and / or canceration ability resulting from differentiation inhibiting ability
  • the fusion protein or the fusion A polynucleotide encoding a protein can be used as a marker for detecting a differentiation-suppressing mutation or a marker for detecting a cancer such as lung cancer.
  • the marker for detecting a differentiation-suppressing mutation means a factor that serves as an index for detecting a differentiation-suppressing mutation.
  • the invention relates to drug sensitivity markers or drug resistance markers.
  • the drug sensitivity marker means a factor serving as an index for evaluating the sensitivity to the drug
  • the drug resistance marker refers to a factor serving as an index for evaluating the resistance to the drug.
  • the drug sensitivity marker or drug resistance marker of the present invention can be used to select an appropriate drug.
  • the drug sensitivity marker or the resistance marker can be determined based on, for example, a reference gene (for example, a wild type gene) or another target gene based on the evaluation method of the present invention.
  • the drug sensitivity or resistance marker for the EGFR protein can be determined based on the wild type (WT) based on FIG. 5 or FIG. 6 of the present specification.
  • WT wild type
  • a protein having a mutation with higher cell viability than WT or a polynucleotide encoding the protein can be used as a gefitinib sensitivity marker.
  • mutations include L62R, R108K, A289D, H304Y, P596L, G719C, G719S, S720F, K745-E746insVPVAIK, E746-A750> IP, E746-P753> VS, E746-T751> V, L747-A750 > P, L747-A750del, L747-P753> Q, L747-P753> S, L747-T751> P, L747-T751> S, L747-T751del, T751-I759> N, S752-I759del, V765M, R776C, R776H , V786M, V802I, R831H, R831L, V834M, H835L, P848L, L858R, A864T, A871G, A871T, G873E, G874S,
  • gefitinib based on FIG. 5 or FIG. 6, a protein having a mutation with lower cell viability than WT or a polynucleotide encoding the protein can be used as a gefitinib resistance marker.
  • mutations include E709-T710> D, E709A, E709G, V769-D770insASV, V769L, D770-N771insSVD, N771-P772insN, H773-V774insH, H773-V774insPH, H773L, V774-C775insHV, V774M, T790M , Mutations selected from the group consisting of T7900M and C797S, V851I, and T854A.
  • erlotinib, afatinib, osmeltinib, and rosiretinib can also be used to determine sensitivity or resistance markers for each drug based on FIG. 5 or FIG.
  • drug sensitivity or resistance can be determined based on the survival rate at the drug concentration by appropriately determining the drug concentration in consideration of the type of drug and the drug concentration in the living body.
  • the anticancer agent is the above low molecular weight compound, for example, the cellularity at a drug concentration of 0.0001 ⁇ M to 10 ⁇ M, 0.0005 ⁇ M to 5 ⁇ M, 0.001 ⁇ M to 1 ⁇ M, 0.005 ⁇ M to 0.5 ⁇ M, or 0.01 ⁇ M to 0.1 ⁇ M
  • drug sensitivity or resistance can be evaluated.
  • the anticancer drug is an antibody
  • 0.001 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL for example, 0.01 ⁇ g / mL to 10 ⁇ g / mL, or 0.1 Drug sensitivity or resistance can be assessed based on cellular viability at a concentration of ⁇ g / mL to 1 ⁇ g / mL.
  • cell viability is high at these drug concentrations, for example, when the cell viability is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100%, the cell having the target gene is It can be determined that there is drug resistance.
  • cell viability is low at these drug concentrations, for example, when the cell viability is 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, or 0%, the cell having the target gene is It can be determined that there is drug sensitivity.
  • gefitinib based on FIG. 5 or FIG. 6, for example, a protein having a mutation with low cell viability at 0.05 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, or 0.5 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M, or a polynucleotide encoding the protein is used.
  • a protein having a mutation with high cell viability at 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, or 1 ⁇ M, preferably 0.5 ⁇ M, or a polynucleotide encoding the protein It can be used as a resistance marker.
  • Examples include mutations selected from the group consisting of V774-C775insHV, V774M, T790M, T7900M and C797S, V851I, and T854A.
  • erlotinib is 0.05 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, or 0.5 ⁇ M, preferably a mutation colored at 0.1 ⁇ M, afatinib and osimertinib is 0.0005 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, or 0.005 ⁇ M
  • a mutation colored at 0.001 ⁇ M a protein having a mutation colored at 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, or 5 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M for rosiretinib, or a polynucleotide encoding the protein, respectively It can be used as a sensitivity marker for other drugs.
  • erlotinib is 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, or 1 ⁇ M, preferably a mutation that is not colored at 0.5 ⁇ M, afatinib and osmeltinib are 0.001 ⁇ M, 0.005 ⁇ M, or 0.01
  • a mutation that is not colored at 0.1 ⁇ g / mL, 1 ⁇ g / mL, 10 ⁇ g / mL, or 100 ⁇ g / mL, preferably 1 ⁇ g / mL, can be used as a sensitivity marker.
  • mutations that are colored can be used as resistance markers.
  • the sensitivity marker can be further classified into a “narrowly sensitive marker” having a high probability that a drug is effective and a “partial sensitivity marker” having a low probability that a drug is effective compared to the sensitivity.
  • the narrow-sense sensitivity marker, partial sensitivity marker, and resistance marker of each drug can be determined as follows based on, for example, IC90 (90% inhibitory concentration of cells).
  • a mutation that results in IC90 ⁇ 0.1 ⁇ M is a narrowly sensitive marker
  • a variation that is 0.1 ⁇ M ⁇ IC90 ⁇ 0.5 ⁇ M is a partial sensitivity marker
  • a mutation that results in IC90> 0.5 ⁇ M It can be.
  • a mutation with IC90 ⁇ 0.005 ⁇ M can be used as a narrowly sensitive marker
  • a mutation with 0.005 ⁇ M ⁇ IC90 ⁇ 0.01 ⁇ M can be used as a partial sensitivity marker
  • a mutation with IC90> 0.01 ⁇ M can be used as a resistance marker.
  • IC90 ⁇ 0.1 ⁇ M is a narrowly sensitive marker
  • 0.1 ⁇ M ⁇ IC90 ⁇ 1 ⁇ M is partly sensitive
  • IC90> 1 ⁇ M is used as a resistance marker.
  • the narrow-sense, partially sensitive, and resistance markers for gefitinib, erlotinib, afatinib, osmeltinib, and rosiretinib, defined according to this definition, are shown below.
  • the narrow-sense susceptibility markers for gefitinib include R108K and L858R (cis), A216T, A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746-S752> V (trans), A289T and L858R (cis), V292L and L858R ( cis), V292L and L858R (trans), S306L, S306L and L858R (cis), S306L and L858R (trans), L703I and L858R (cis), L703I and L858R (trans), E709A and G719C (trans), E709G and L858R (Trans), E709V and L858R (cis), K714R and L858R (cis), K714R and L858R (trans), L718Q and L858R (trans), G719C, S720F, S720F and L858R (cis),
  • Errotinib's narrowly sensitive markers include R108K and L858R (cis), R108K and L858R (trans), A216T, A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746-S752> V (trans), A289T and L858R ( cis), A289T and L858R (trans), V292L and L858R (cis), V292L and L858R (trans), S306L, S306L and L858R (cis), S306L and L858R (trans), L703I and L858R (cis), L703I and L858R (Trans), E709A and G719C (cis), E709A and G719C (trans), E709G and L858R (trans), E709K and L858R (cis), E709K and L858R (trans), E709V and L858R (cis), E
  • Some erlotinib susceptibility markers include L62R, R108K, R222C, R252C, A289D, A289T, A289V, V292L, H304Y, S492R, P596L, G598V, L703I, L703P, I706T and G719A (trans), E709A and L858R (cis) , E709A and L858R (trans), E709K, E709V, K714R, G719A, G735S, P741L, I744M, I744M and L858R (cis), K745-E746insVPVAIK, L747S, T751I, P753S, D761-E762insEAFQ, A763-Y764insMEA , S768I, S768I and G719A (trans), S768I and G719C (trans), S768I and
  • Resistance markers for erlotinib include L62R and G719S (trans), I706T and G719A (cis), E709-T710> D, E709A, E709A and G719S (cis), E709A and G719S (trans), E709G, L718Q, L718Q and L858R (Cis), S768I and G719A (cis), S768I and G719S (cis), S768I and G719S (trans), V769L, N771-P772insN, N771-P772insN, H773L, V774M, T790M and G719A (cis), T790M and G719A ( trans), V851I, T854A, L861Q and G719A (cis), L861R and G719A (cis), G873E, and EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of
  • Afatinib narrowly sensitive markers include L62R, R108K, R108K and L858R (cis), R108K and L858R (trans), A216T, A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746-S752> V (trans), R222C, R252C, A289D, A289T, A289T and L858R (cis), A289T and L858R (trans), A289V, V292L, V292L and L858R (cis), V292L and L858R (trans), H304Y, S306L, S306L and L858R (cis) , S306L and L858R (trans), S492R, P596L, G598V, L703I, L703I and L858R (cis), L703I and L858R (trans), L703P, I706T and G719A (trans
  • Examples of the sensitivity marker for afatinib include EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of T751I, S768I, V769L, H773L, V774M, G779S, T854A, A859T, and G873E, or a polynucleotide encoding the protein. It is done.
  • the narrow-sense susceptibility markers for osimertinib include L62R, R108K, R108K and L858R (cis), R108K and L858R (trans), A216T, A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746-S752> V (trans), R222C, R252C, A289D, A289T, A289T and L858R (cis), A289T and L858R (trans), A289V, V292L, V292L and L858R (cis), V292L and L858R (trans), H304Y, S306L and L858R (cis), S306L And L858R (trans), S492R, P596L, G598V, L703I and L858R (cis), L703I and L858R (trans), L703P, E709A and G719C (trans), E
  • Some susceptibility markers for osimertinib include L62R and G719S (trans), I706T and G719A (cis), I706T and G719A (trans), E709-T710> D, E709A, E709A and G719C (cis), E709G, E709K, E709V , K714R, G719A, I744M, S768I, S768I and G719A (trans), S768I and G719C (cis), S768I and G719C (trans), S768I and G719S (cis), S768I and G719S (trans), S768I and L858R (trans) EGFR having a mutation selected from the group consisting of D770-N771insSVD, T790M and E746-A750del (trans), L838V, L861Q and G719A (trans), L861R, L
  • Resistance markers for osmeltinib include S306L, L703I, E709A and G719S (cis), E709A and L858R (cis), L718Q, L718Q and L858R (cis), L718Q and L858R (trans), S768I and G719A (cis), T790M and EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of E746-A750del (cis), T790M and G719A (cis), C797S, L861Q and G719A (cis), E865K, A871T, and A1118T and E746-A750del (trans), or Examples thereof include a polynucleotide encoding the protein.
  • Rosiretinib's narrowly sensitive markers include E746-A750> IP, E746-P753> VS, E746-T751> V, L747-A750> P, L747-A750del, L747-P753> Q, L747-P753> S, L747-T751 > P, L747-T751> S, L747-T751del, T751-I759> N, S752-I759del, H835L, L858R, A871T, EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of A1118T, or encoding the protein A polynucleotide is mentioned.
  • Some susceptibility markers for rosiretinib include R108K, R222C, R252C, A289D, A289T, H304Y, P596L, L62R, G719A, G719C, G719S, G735S, K745-E746insVPVAIK, L747S, T751I, D761-E762insEAFQ, V765M, H773L, V765M, H773L -An EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of C775insHV, V774M, V786M, T790M, P798H, R831H, L833F, V851I, K860I, L861Q, G873E, G874S, and S1153I, or a polynucleotide encoding the protein It is done.
  • Rosiretinib resistance markers include A289V, S492R, G598V, L703P, E709-T710> D, E709A, E709G, E709K, E709V, S720F, P741L, P753S, A763-Y764insFQEA, A767V, S768I, V769-D770insASV, V769L , D770-N771insSVD, N771-P772insN, H773-V774insH, H773-V774insPH, H773Y, R776C, R776H, G779S, C797S, V802I, R831L, L833V, V834L, V834M, V843I, P848L, T865A, T8 An EGFR protein having a mutation selected from the group consisting of A871G, or a polynucleo
  • a mutation with IC90 ⁇ 1 ⁇ g / mL is a narrowly sensitive marker
  • a mutation with 1 ⁇ g / mL ⁇ IC90 ⁇ 100 ⁇ g / mL is a partially sensitive marker
  • a mutation with IC90> 100 ⁇ g / mL is a resistance marker.
  • cetuximab's narrowly sensitive, partially sensitive, and resistant markers as defined according to this definition.
  • L62R, L62R and L858R narrowly sensitive markers
  • R108K, R108K and L858R cis
  • A216T A289D
  • A289T A289T and L858R
  • A289V A289V
  • V292L V292L and L858R (cis)
  • H304Y S306L, P596L, G598V, R669Q, E709A, E709A and G719C (trans)
  • Resistance markers for cetuximab include L62R and G719S (trans), L62R and L858R (trans), R108K and L858R (trans), A216T and E746-S752> V (cis), A216T and E746-S752> V (trans), A289T And L858R (trans), S306L and L858R (cis), S306L and L858R (trans), S492R, R669Q and L858R (cis), R669Q and L858R (trans), L703I, L703I and L858R (cis), L703I and L858R (trans ), I706T and G719A (cis), I706T and G719A (trans), E709-T710> D, E709A and G719C (cis), E709A and G719S (cis), E709A and G719S (trans), E709A and L858
  • the present invention relates to an EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance marker comprising an EGFR protein having an A839T mutation or a polynucleotide encoding the protein.
  • EGFR tyrosine kinases include gefitinib, erlotinib, afatinib, and osimertinib.
  • the present invention provides a means for detecting the above-described cancer detection marker, differentiation-suppressing mutation detection marker, drug sensitivity marker, or drug resistance marker, such as a primer set, probe, aptamer, or antibody, or these It relates to a kit containing any of the above. These can be easily designed by those skilled in the art according to the marker.
  • the primer set is not particularly limited as long as it can specifically detect the above-mentioned various markers, particularly the protein or gene mutation part of each marker, for example, when the marker is a mutation of EGFR protein, (1)
  • the forward primer consists of nucleotides comprising 14 to 30 bases of SEQ ID NO: 2, for example, 16 to 28 bases, preferably 18 to 26 bases, and the reverse primer is a continuous sequence complementary to the sequence of SEQ ID NO: Consisting of nucleotides containing 14 to 30 bases, such as 16 to 28 bases, preferably 18 to 26 bases, or (2) the forward primer hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a complementary sequence of SEQ ID NO: 2.
  • nucleotides containing 14-30 bases such as 16-28 bases, preferably 18-26 bases
  • the reverse primer hybridizes to the nucleic acid consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions. Consisting of nucleotides containing a sequence of bases, for example 16-28 bases, preferably 18-26 bases, Includes forward and reverse primers.
  • a primer set can be prepared in the same manner based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, or 8.
  • stringent conditions means conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • known hybridization conditions can be used. For example, it may be appropriately determined with reference to Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • stringent conditions may be set according to the hybridization method temperature and the salt concentration contained in the solution, and the temperature and the salt concentration contained in the solution in the washing step of the hybridization method. More detailed stringent conditions include, for example, a sodium concentration of 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and a temperature of 42 to 68 ° C., preferably 42 to 65 ° C. More specifically, 5 ⁇ SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate) and a temperature of 42 ° C can be mentioned.
  • the probe for detecting a polynucleotide encoding the marker is not particularly limited as long as it can detect the marker, particularly a protein or gene mutation part of the marker.
  • the marker is an EGFR protein mutation
  • it is preferably composed of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a sequence complementary to 20, preferably 30, a base sequence.
  • a probe can be similarly prepared based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6 or 8. In this case, it is particularly preferable to prepare a probe that can detect the fusion part of COL1A2 protein and DCAF6 protein.
  • Primers and probes can be prepared by known methods known to those skilled in the art, and are not limited, but can be prepared by, for example, chemical synthesis methods.
  • An aptamer for the above marker can be prepared by a known method, for example, a SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • SELEX systematic evolution of ligands by exponential enrichment
  • a nucleic acid molecule bound to a target molecule is selected from a pool consisting of a random sequence region and nucleic acid molecules having primer binding regions at both ends, amplified after recovery, and then transferred to the nucleic acid pool of the next round.
  • This is a method of selecting a nucleic acid having a stronger binding force to a target molecule by repeating a series of cycles of several to several tens of rounds (for example, Tuerk C, Gold L (1990) Science 249 (4968): 505- See 510).
  • the antibody that specifically binds to the marker may be any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a recombinant antibody, and a synthetic antibody.
  • Polyclonal antibody refers to a group of a plurality of immunoglobulins that recognize and bind different epitopes of the same antigen. Polyclonal antibodies can be obtained from the animal's serum after immunization of the animal with the target molecule as an antigen.
  • “Monoclonal antibody” refers to a group of clones of a single immunoglobulin.
  • a monoclonal antibody can be produced, for example, by using a hybridoma obtained by isolating a B cell producing an antibody from an immunized animal and fusing it with a myeloma cancer cell.
  • recombinant antibody means an antibody produced by combining amino acid sequences of antibodies from different animals such as chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • synthetic antibody means an antibody synthesized by a chemical method or a recombinant DNA method, and includes single-chain Fv (scFv: single chain Fragment of variable region), diabody, Examples include triabody and tetrabody.
  • the kit of the present invention may contain, for example, a buffer, an enzyme, and instructions for use in addition to the primer set, probe, aptamer, or antibody.
  • the present invention relates to a method for assisting in determining the presence or absence of cancer or the possibility of cancer.
  • the type of cancer that is identified as affected in this embodiment is not limited, for example, brain tumor, pharyngeal cancer, thyroid cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, and kidney. Cancer, small intestine cancer, colon cancer, bladder cancer, prostate cancer, cervical cancer, ovarian cancer, lymphoma, or melanoma, preferably lung cancer.
  • This method includes a step (detection step) of detecting a cancer detection marker or a differentiation-inhibiting mutation detection marker described in the present specification in a sample obtained from a subject.
  • the detection method in the detection step is not limited, and may be detected using a means for detecting the marker, for example, a primer set, a probe, an aptamer, an antibody, or a kit containing any of these, or the next generation. You may detect by the sequence analysis by a sequencer.
  • the method determines that the subject has cancer or is highly likely to have cancer when the cancer detection marker described in the present specification is detected.
  • the process (determination process) to include is included as an arbitrary process.
  • the species of the subject is not limited, but preferably mammals, for example, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats and mice, livestock such as pigs, cows, horses, sheep, and goats. Animals and pets such as dogs and cats, preferably humans.
  • sample means a biological sample subjected to the method of the present invention.
  • samples that can be used in the present invention include, but are not limited to, cells or tissues isolated from living organisms.
  • tissues include cancerous lesions such as brain, pharynx, thyroid, lung, breast, esophagus, stomach, liver, pancreas, kidney, small intestine, large intestine, bladder, prostate, uterus, ovary, preferably lung.
  • biopsy samples of these tissues can be used.
  • the present invention relates to a method for assisting in determining the presence or absence of a differentiation-suppressing mutation.
  • This method includes a step (detection step) of detecting a differentiation-suppressing mutation detection marker described herein in a sample obtained from a subject.
  • the detection method in the detection step is not limited and may be detected using a means for detecting the above-described marker for detecting a differentiation-suppressing mutation, for example, a primer set, a probe, an aptamer, an antibody, or a kit containing any of these. Alternatively, it may be detected by sequence analysis using a next-generation sequencer.
  • the method further comprises a step (determination step) for determining that the subject has a differentiation-suppressing mutation when the differentiation-suppressing mutation detection marker described in the present specification is detected. Included as a process.
  • the present invention relates to a method for assisting discrimination of drug sensitivity (or resistance) such as an anticancer drug.
  • the method includes a step (detection step) of detecting a drug sensitivity or resistance marker described herein in a sample obtained from a subject.
  • the detection method in the detection step is not limited, and may be detected using a means for detecting the drug sensitivity or resistance marker, such as a primer set, a probe, an aptamer, an antibody, or a kit containing any of these. Alternatively, it may be detected by sequence analysis using a next-generation sequencer.
  • the method determines that the subject has drug sensitivity when the drug sensitivity marker described herein is detected and / or the drug resistance marker described herein.
  • the step of determining that the subject has drug resistance is included as an optional step.
  • This method can evaluate drug sensitivity or resistance of a subject and select an appropriate drug based on the evaluation.
  • the invention relates to a cell population.
  • the cell population of the present invention includes at least two, for example, three or more, 4 or more different cells containing a polynucleotide that constitutes a marker for detecting cancer, a marker for detecting differentiation-suppressing mutation, a drug sensitivity or resistance marker described herein.
  • a polynucleotide that constitutes a marker for detecting cancer, a marker for detecting differentiation-suppressing mutation, a drug sensitivity or resistance marker described herein.
  • 5 or more, 7 or more, 10 or more, 20 or more, 50 or more, and 500 or less, 200 or less, or 100 or less are included.
  • each of these polynucleotides is linked to a unique tag sequence.
  • a cell population can be used in the evaluation method of the present invention.
  • the insertion step and the mixing step can be omitted.
  • HEK Human Embryonic kidney 293 cells and mouse 3T3 fibroblasts were obtained from the American Type Culture Collection and Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM-F12) supplemented with 10% FBS (both Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA).
  • DMEM-F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12
  • FBS both Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA
  • Ba / F3 cells were cultured in RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% FBS and mouse IL-3 (20 U / mL; Sigma, St. Louis, MO).
  • CDNA encoding the EGFR mutant was prepared using QuickChange II Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.) And ligated to pcx5-bleo. Moreover, EML4-ALK (Manabu Soda et al., Nature, 2007, 448, pp. 561-566), KIF5B-RET (Takashi Kohno1 et al., Nature medicine, 2012, 18 (3), pp.
  • KRAS G12V
  • CD74-ROS1 Kengo Takeuchi et al., Nature medicine, 2012, 18 (3), pp.378-381
  • EGFR E746-A750del
  • EGFR L858R
  • BRAF V600E
  • ERBB2 V777L
  • Retrovirus and Transduction into Cell Line The recombinant plasmid prepared as described above was introduced into HEK293 cells together with a packaging plasmid (Takara Bio, Shiga, Japan) to obtain recombinant retrovirus particles.
  • a packaging plasmid Tela Bio, Shiga, Japan
  • 4 ⁇ g / mL polybrene Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA was used to infect 3T3 cells with ecotropic recombinant retrovirus for 24 hours, and 5% calf serum was added.
  • the cells were further cultured for 2 weeks in supplemented DMEM-F12. Cell transformation was assessed by phase contrast microscopy or staining with Giemsa solution.
  • Genomic DNA derived from cell lysate contains barcode sequence by PCR using 5'-TGGAAAGGACCTTACACAGTCCTG-3 '(SEQ ID NO: 10) and 5'-GACTCGTTGAAGGGTAGACTAGTC-3' (SEQ ID NO: 11) primers The region was amplified. PCR conditions are as follows. Initial denaturation: 95 ° C for 3 minutes Denaturation: 95 ° C for 15 seconds Annealing: 60 ° C for 30 seconds Extension: 72 ° C for 60 seconds Number of cycles: 30 Final extension: 10 min at 72 ° C
  • the amplified PCR product was purified using AMPure® beads (Beckman® Coulter, ® Brea, ® CA).
  • a sequencing library was generated using NEB NextUltra DNA Library Prep Kit (NEB, Ipswich, MA) according to the manufacturer's recommendations. The quality of the library was evaluated with a Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) and an Agilent 2200 TapeStation system.
  • the library was sequenced by Illumina MiSeq (300 cycles) using Reagent Kit V2 to generate 150 bp paired-end reads.
  • sequence reads contained the following sequence including the barcode sequence: 5'-CTAGACTGCCNNNNNNGGATCACTCT-3 '(SEQ ID NO: 12) (where N is any nucleotide) and its complementary sequence.
  • the amount of each mutant was estimated by counting the number of reads in these barcode sequences.
  • the DMSO-treated cell mixture was used as a reference control for scaling the signal of each cell clone. Therefore, the signal from each treated cell line is calculated as 100 ⁇ (median number of reads) / (median number of reads in DMSO control). The median number of leads is from 3 independent experiments.
  • mice were injected subcutaneously according to the animal use protocol approved by the committee. Starting 5 days after cell line injection, mice were treated with EGFR TKI erlotinib (50 mg / kg body weight) or vehicle control (1% sodium carboxymethylcellulose) once a day for 16 days by tube feeding.
  • EGFR TKI erlotinib 50 mg / kg body weight
  • vehicle control 1% sodium carboxymethylcellulose
  • Tumors were excised and each tumor was cut into 4 sites.
  • the relative abundance of each cell clone was determined by the MANO method: ie, for each sample, the number of barcodes from the cell mixture used for injection was used to determine the number of barcodes for each cell line ( A X / T X ). These relative cell numbers were used to calculate the relative contribution of each cell line to the tumor.
  • Target gene A proliferation ability score (A X ⁇ T 0 ) / (A 0 ⁇ T X )
  • Drug sensitivity score of target gene A (AD X ⁇ T X ) / (A X ⁇ TD X )
  • a 0 total number of reads for all barcodes in cells recovered at Day 0
  • a 0 number of barcode reads assigned to gene A of interest in cells collected on Day 0
  • T X total number of barcode reads in cells collected on Day X
  • AD X number of barcode reads assigned to gene A of interest in cells collected on Day X after drug administration
  • TD X total number of total barcode reads in cells collected on Day X after drug administration.
  • Alamar Blue cell viability assay After incubating the cells in a 96 well plate (containing 100 ⁇ L medium per well), 10 ⁇ L alamarBlue (Thermo Fisher Scientific) was added and fluorescence (excitation 530 nm, emission 590 nm) was measured at each time. Wells without cells were used as negative controls. Adjustment of the fluorescence gain for all wells was made for the wells with maximum fluorescence intensity.
  • EML4-ALK, KIF5B-RET, KRAS (G12V), CD74-ROS1, EGFR (E746-A750del) or EGFR (L858R) cDNA were introduced into Ba / F3 cells. Subsequently, only the cells into which EGFR (L858R) cDNA was introduced were changed in the number of cells (100 to 20000 cells) and mixed with 20,000 cells each of which had been introduced with the other 5 types of cDNA. Subsequently, genomic DNA was isolated from the cell mixture and subjected to PCR and next generation sequencing.
  • the number of reads of the barcode sequence corresponding to Ba / F3 cells introduced with 5 types of cDNA other than EGFR (L858R) was constant in the mixture, whereas EGFR (L858R) mixed by changing the number of cells
  • the tumorigenicity assay was performed in vivo by the MANO method using 3T3 cells.
  • Green fluorescent protein (GFP) or wild type EGFR, ERBB2 or MET was depleted 11 days after transplantation, but cells expressing EGFR (L858R) or EGFR (E746-A750del) were gradually growing at the same time ( Data not shown). Such a result is consistent with the result of the in vitro assay.
  • TKI tyrosine kinase inhibitors
  • Ba / F3 cells expressing EGFR were resistant to first and second generation EGFR TKIs (gefitinib, erlotinib, and afatinib), but third generation EGFR TKIs (osimertinib and rosiretinib) It was sensitive. In contrast, cells expressing EGFR (T790M / C797S) were also resistant to the third generation EGFR TKI.
  • crizotinib a TKI for ALK and ROS1 suppresses the growth of cells expressing EML4-ALK or CD74-ROS1, and other inhibitors for ALK and RET, alectinib, are EML4-ALK or KIF5B-RET. Proliferation was inhibited ( Figure 3).
  • Example 2 Evaluation of EGFR VUS (Variants of Unknown Significance) by MANO method> The materials and methods are as described in “1. Cell lines” to “5. In vitro MANO method” in Example 1. However, EGFR VUS was used as an evaluation target as follows.
  • the EGFR VUS used for evaluation in both BaF3 cells and 3T3 cells is as follows: R108K, R252C, T263P, A289D, A289T, A289V, H304Y, S492R, P596L, G598V, L62R, L703P, E709-T710> D, E709A , E709G, E709K, E709V, G719A, G719C, G719S, S720F, G735S, P741L, K745-A750> T, K745-A750del, K745-E746insVPVAIK, K745-E749del, E746-A750> IP, E746-P753> VS, E746 -P753del, E746-T751> V, L747-A750> P, L747-A750del, L747-P753> Q, L7
  • A1118T was evaluated only in BaF3 cells, and E746-E749del and R222C were evaluated in 3T3 cells (the total number of EGFR mutants evaluated was 101). Moreover, wild type EGFR and GFP were included as controls.
  • the mutations found to have a stronger carcinogenic potential in 3T3 cells or Ba / F3 cells compared to wild type are as follows: L62R, R108K, R222C, R252C, A289D, A289T, A289V, H304Y, S492R, P596L, G598V, L703P, E709-T710> D, E709A, E709G, E709K, E709V, G719A, G719C, G719S, S720F, G735S, P741L, K745-E746insVPVAIK, E746-A750> IP, E746-P753> VS, E746- T751> V, L747-A750> P, L747-A750del, L747-P753> Q, L747-P753> S, L747-T751> P, L747-T751> S, L747
  • Example 3 Evaluation of sensitivity of cells having carcinogenic mutation to small molecule compound by MANO method> Subsequently, the TKI (small molecule compound) sensitivity of each EGFR mutant was calculated using the MANO method. As shown in FIG. 5, the L858R and E746-A750del mutants were shown to be sensitive to either TKI, but the T790M, C797S, T790M / C797S, and T854A substitutions and exon 20 insertions were found to be Tolerant to. These results indicate that the MANO method is consistent with the sensitivity data from previous studies.
  • extracellular domain mutations (exons 2-15), E709 mutations (exon 18), exon 19 missense mutations, V769L (exon 20), and V851I (exons) compared to deletion of L858R or exon 19 21) were all insensitive to TKI.
  • the sensitivity of exon 20 insertion was reduced in osimertinib and rosiretinib, but N771-P772insN changes resulted in higher sensitivity compared to the other mutants (FIG. 5).
  • Example 4 Evaluation of compound mutation by MANO method> The materials and methods are as described in “1. Cell lines” to “5. In vitro MANO method” in Example 1. However, EGFR complex mutation was used as an evaluation target. (result) When the drug sensitivity score was similarly calculated by the MANO method for the complex mutation, it was shown that the complex mutation shown in FIG. 6 also has canceration ability (data not shown). In addition, a drug sensitivity test was performed on this complex mutation, and it was shown that the sensitivity to the drug differs for each mutation (Fig. 6).
  • Example 5 Evaluation of sensitivity of cells having carcinogenic mutation to antibody drug by MANO method> The materials and methods are as described in “1. Cell lines” to “5. In vitro MANO method” in Example 1. However, EGFR single mutation or compound mutation was targeted for evaluation, and an antibody drug (cetuximab) was used as the drug. (result) The same experiment was performed using an antibody drug (cetuximab), and the drug sensitivity score was calculated. As a result, it was shown that the sensitivity to the antibody drug was significantly different from the sensitivity to the small molecule compound (FIG. 8). It was also clarified that the sensitivity of antibody drugs varies greatly from domain to domain and from mutation to mutation (Fig. 8).
  • Example 6 Evaluation of differentiation-suppressing oncogene by MANO-D (MANO-Differentiation) method> Materials and Methods Materials and methods are as described in “1. Cell line” to “5. In vitro MANO method” in Example 1.
  • the genes with the following different tags (GFP, BRD3-NUT (French CA et al., Oncogene, 2008 3; 27 (15), pp.2237-42)) and the fusion gene of COL1A2 and DCAF6 (SEQ ID NO: 8)), and differentiation-inducing transcription factor MYOD1 or RFP (Red fluorescent protein, control) using Tet-On Advanced expression induction system (Clontech) pTRE cloned MYOD1 or RFP -Tight Vector and pTet-On Advanced Vector were transfected and introduced into target cells according to the manufacturer's protocol. After mixing the cells, the cells were cultured for 14 days under cell differentiation inducing conditions (2 ng horse serum and 10 ng / mL DOX to promote expression of the transgene) or normal conditions (10% FBS). The DNA was collected and extracted.
  • Target gene A differentiation inhibition score (AI X ⁇ T X ) / (A X ⁇ TI X )
  • AI X Read of barcode assigned to gene A of interest in cells collected on Day X after differentiation induction
  • T X total number of reads for all barcodes in cells collected on Day X
  • a X number of barcode reads given to gene of interest A in cells collected on Day X
  • TI X total number of barcode reads in cells collected on Day X after differentiation induction.
  • the differentiation suppression ability score of the target gene A indicates that the higher the value, the higher the differentiation suppression ability of the target gene A.
  • the results of this test are shown in the following table.
  • a differentiation-suppressing oncogene For the BRD3-NUT, a differentiation-suppressing oncogene, a higher value (2.5046) than the GFP value (0.60807) was detected under differentiation-inducing conditions (2% HS + dox and MYOD1 expression). It was shown that can also evaluate differentiation-suppressing oncogenes. Moreover, the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein showed a high value (3.4662) under differentiation induction conditions by this method, suggesting that the fusion protein of COL1A2 protein and DCAF6 protein is a novel differentiation-suppressing gene. .
  • plasmids were transfected into the DLD1 BRCA2 ( ⁇ / ⁇ ) strain together with the transposase expression plasmid pCMV-hyPBase (Sanger Institute) according to the manufacturer's protocol to prepare cells in which the BRCA gene was stably introduced into the genome.
  • the cell lines into which the mutant gene labeled with the barcode sequence was introduced were mixed in the same number of cells, and genomic DNA was extracted once at this time (Day 0).
  • the PARP inhibitor (olaparib) was administered at various concentrations and cultured.
  • the barcode sequence was PCR amplified using the genomic DNA extracted from the cells collected on Day 12 as a template, and deep-sequencing was performed using a next-generation sequencer. The effect of each mutation on drug sensitivity and cell proliferation ability was evaluated from the rate of change in the number of barcode reads between drug non-administration and drug administration.
  • K485 *, L997 *, Q1502 *, K1984 *, C2535 *, and W2970 * were all considered to be a loss-of-function carcinogenesis-related BRCA2 mutation.
  • Example 8 Evaluation of BRCA2 gene by MANO-B (MANO-BRCA) method> Regarding the mutations registered in Clinvar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) (18 benign mutations, 52 VUS or conflicting interpretations mutations, 8 malignant mutations), Example 7 and Evaluation by the MANO-B method was performed in the same manner (however, olaparib was 1 ⁇ M). As a result, benign and malignant mutations registered in Clinvar were generally evaluated as benign or malignant in the MANO-B method as well (data not shown).
  • FIG. 9 shows the result of evaluating the mutation of VUS or conflicting interpretations by the MANO-B method.
  • the present invention it is possible to quickly and accurately evaluate the function of a plurality of different target genes, for example, a method for evaluating canceration ability, and the sensitivity of a subject having each target gene to a drug. Since the present invention can evaluate canceration ability and drug susceptibility for many mutations such as VUS, its industrial utility value is very high.

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Abstract

本発明は、異なる複数の目的遺伝子の機能、例えばがん化能の評価方法、及び各目的遺伝子を有する被験者の薬剤に対する感受性を評価可能な方法を提供すること等を課題とする。　本発明は、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程、異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程、混合した宿主細胞を培養する工程、培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程、抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程、前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程を含む、異なる複数の目的遺伝子の評価方法等に関する。

Description

異なる複数の目的遺伝子の評価方法
　本発明は、異なる複数の目的遺伝子の評価方法、該評価方法によって同定されたがん検出用マーカー、分化抑制変異検出用マーカー、及び薬剤感受性又は耐性マーカー等に関する。
　進行性肺がんに対する抗がん剤ゲフィチニブ、エルロチニブ、又はアファチニブの第一治療の承認には、現在のところ、エキソン19における欠失変異又は点突然変異（L858R）等の古典的／感受性EGFR遺伝子の変異の存在を必要とする（非特許文献1）。さらに、エキソン18における挿入欠失、E790変異（非特許文献2）、G719変異（非特許文献3）、エキソン19における挿入（非特許文献4）、A763-764のFQEA挿入（非特許文献5）、S768I変異（非特許文献6）及びL861Q等の低頻度の感受性変異を有する患者に対して、EGFRチロシンキナーゼインヒビター（TKI）を臨床的に使用することが一般的である。しかしながら、前臨床及び臨床試験のデータは、ゲフィチニブ及びエルロチニブ等の第一世代のEGFR チロシンキナーゼインヒビター（TKI）が上記低頻度のEGFR変異に対してあまり有効でないことを示唆している（非特許文献7）。ゲフィチニブ及びエルロチニブに対する耐性に関わる主なメカニズムはEGFR遺伝子のT790M変異に起因するとされており、これはオシメルチニブ処置によって克服され得る（非特許文献8）。しかしながら、オシメルチニブ処置も、C797複合変異に対しては有効でないことが知られている（非特許文献9）。また、エキソン20における挿入も、EGFR TKI非感受性変異に関与することが知られている。以上の様に、EGFR遺伝子内の多くの変異が抗がん剤の感受性に強く影響を与えることが知られている。
　上記の主要な遺伝子変異に加えて、がん患者のゲノム上の遺伝子には、アミノ酸置換をもたらす非常に多くの非同義変異が存在する。例えば、体細胞突然変異のCOSMICデータベース（v78, http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/）では、EGFR遺伝子について合計770種の非同義変異が存在することが報告されている。同様に、肺がんに関与するALK遺伝子については442種の非同義変異が報告されている。しかしながら、そのような変異の大部分については、臨床的意義が明らかにされていない。
　患者ごとに適切な薬剤を選択するために、多数の非同義又は同義変異の臨床的意義を明らかにする方法、複数の機能未知の遺伝子やその変異のがん化能を評価する方法、及び被験者の薬剤感受性を迅速かつ正確に評価する方法、及び既存薬又は新薬に対する非同義又は同義変異の耐性又は感受性を評価する方法の開発は臨床学的に極めて重要である。しかし、個々の変異について正確かつ網羅的に分析し評価できる技術は現在までのところ知られていない。
Nature Medicine, 2015, 21, 2, p. 99 Ackerman A. et al., J. Thorac. Oncol. 2012, 7, e 19-20 Han, S.W. et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, pp. 2493-2501 He, M. et al., Clin. Cancer Res., 2012, 18, pp. 1790-1797 Yasuda, H. et al., Sci. Transl. Med., 2013, 5, 216ra177 Kancha, R.K. et al, Clin. Cancer Res., 2009, 15, pp. 460-467 Watanabe, S. et al. J. Thorac. Oncol., 2014, 9, pp. 189-194 Cross, D.A. et al., Cancer Discov., 2014, 4, pp. 1046-1061 Thress, K.S. et al., Nat. Med., 2015, 21, pp. 560-562
　本発明は、異なる複数の目的遺伝子の機能、例えばがん化能の評価方法、及び各目的遺伝子を有する被験者の薬剤に対する感受性等を評価可能な方法を提供することを課題とする。また、本発明は、上記方法によって同定されるがん検出用マーカー、薬剤感受性又は薬剤耐性マーカー、及びこれらのマーカーを検出するための手段等を提供することを課題とする。
　本発明者らは、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子等を含むポリヌクレオチドをゲノムDNAに挿入した複数の宿主細胞を混合して培養し、培養後の宿主細胞由来の前記ポリヌクレオチドをタグ配列に基づいて定量することで、培養後の各宿主細胞の相対的な細胞数を決定し、それに基づいて異なる複数の目的遺伝子を個別に、かつ網羅的に評価できることを見出した。また、本発明者らはこの方法に基づき、新規がん検出用マーカー及び薬剤感受性マーカー等を見出し、本願発明を完成させた。
　したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程、
　異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程、
　混合した宿主細胞を培養する工程、
　培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程、
　抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程、
　前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程、
を含む、異なる複数の目的遺伝子の評価方法。
（２）前記目的遺伝子が基準遺伝子を含み、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記培養後の相対的な細胞数が基準値に比べて高い場合に、その目的遺伝子はがん化能を有すると評価する工程をさらに含む、（２）に記載の方法。
（４）培養工程を、分化誘導条件下で行い、
　前記培養後の相対的な細胞数が基準値に比べて高い場合に、その目的遺伝子は分化抑制遺伝子であると評価する工程をさらに含む、（２）に記載の方法。
（５）培養工程を、被験環境下で行う、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）前記被験環境が、被験物質の存在下である、（５）に記載の方法。
（７）前記目的遺伝子ががん遺伝子であり、培養工程を抗がん剤の存在下で行い、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん遺伝子の抗がん剤に対する感受性を評価する工程を含む、（６）に記載の方法。
（８）抗がん剤が、低分子化合物及び／又は抗体薬剤である、（７）に記載の方法。
（９）（７）又は（８）に記載の方法を、複数の抗がん剤について一度に又は独立して複数回行い、得られた抗がん剤感受性の結果に基づいて各がん遺伝子に対して有効な抗がん剤を決定する工程を含む、抗がん剤決定方法。
（１０）前記目的遺伝子ががん抑制遺伝子であり、宿主細胞が前記癌抑制遺伝子を欠失させた細胞であり、培養工程を前記がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置下で行う、（６）に記載の方法。
（１１）薬剤がPARP阻害剤である、（１０）に記載の方法。
（１２）異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞が、同一の細胞株に由来する、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記目的遺伝子が、１つのがん遺伝子の複数の変異体を含む、（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記目的遺伝子が、野生型遺伝子に対して複数の変異を含む複合変異型遺伝子を含む、（１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）定量工程が、次世代シーケンスによるリード数に基づいて行われる、（１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）培養工程を、非ヒト動物を用いてin vivoで行う、（１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）がん検出用マーカーであって、H304Y、P741L、S752-I759del、H773Y、A767V、V786M、L838P、E865K、A871G、G874S、V802I、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質からなる、前記マーカー。
（１８）がん検出用マーカーであって、L62R及びG719S（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、I744M及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される複合変異を有するEGFRタンパク質からなる前記マーカー。
（１９）（１７）又は（１８）に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、がん検出用マーカー。
（２０）COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質。
（２１）配列番号7で示されるアミノ酸配列、配列番号7で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号7で示されるアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換したアミノ酸配列を含む、（２０）に記載の融合タンパク質。
（２２）（２０）又は（２１）に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（２３）（２０）又は（２１）に記載の融合タンパク質、又は（２２）に記載のポリヌクレオチドからなる分化抑制変異検出用マーカー。
（２４）L62R、L62R及びL858R（cis）、R108K、R108K及びL858R（cis）、A216T、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、H304Y、S306L、P596L、G598V、R669Q、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709K、E709V、K714R、L718Q、S720F、L747V、P753S、A767V、V769L、V769M、H773L、V774M、R776H、C797S、L833V、V843I、R776C、並びにR831Lからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、セツキシマブ感受性マーカー。
（２５）L62R及びG719S（trans）、L62R及びL858R（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、R669Q及びL858R（cis）、R669Q及びL858R（trans）、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、K739N、K739N及びL858R（cis）、K739N及びL858R（trans）、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-S752>V、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、L747V及びL858R（cis）、L747V及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、I759M、I759M及びL858R（cis）、I759M及びL858R（trans）、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773Y、V774-C775insHV、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、V851I、T854A、L858R、A859T、L861Q、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、E865K及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、セツキシマブ耐性マーカー。
（２６）A839T変異を有するEGFRタンパク質からなる、EGFRチロシンキナーゼインヒビター耐性マーカー。
（２７）R108K及びL858R（cis）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R831L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、L62R、R108K、R108K及びL858R（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（trans）、K714R、G719A、G719S、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、E865K、G874S、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ゲフィチニブ感受性マーカー。
（２８）L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、A864T、A871T、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ゲフィチニブ耐性マーカー。
（２９）R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、S768I及びL858R（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、L62R、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709V、K714R、G719A、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、A864T、E865K、A871G、A871T、G874S、S1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、エルロチニブ感受性マーカー。
（３０）L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、N771-P772insN、N771-P772insN、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、エルロチニブ耐性マーカー。
（３１）L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G、E709G及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、L747-P753>Q、L747S、T751-I759>N、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、V786M、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、A864T、E865K、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A871T、G874S、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、S1153I、T751I、S768I、V769L、H773L、V774M、G779S、T854A、A859T、並びにG873Eからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、アファチニブ感受性マーカー。
（３２）L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769-D770insASV、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、V774-C775insHV、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、C797S、V851I、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、アファチニブ耐性マーカー。
（３３）L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びL858R（cis）、V769-D770insASV、V769L、V769M、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、G779S、V786M、T790M、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、V851I、T854A、L858R、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、A864T、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、G874S、E746-S752>V、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、S1153I、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709G、E709K、E709V、K714R、G719A、I744M、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、T790M及びE746-A750del（trans）、L838V、L861Q及びG719A（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、並びにL861R及びG719A（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、オシメルチニブ感受性マーカー。
（３４）S306L、L703I、E709A及びG719S（cis）、E709A及びL858R（cis）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S768I及びG719A（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びG719A（cis）、C797S、L861Q及びG719A（cis）、E865K、A871T、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、オシメルチニブ耐性マーカー。
（３５）E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、H835L、L858R、A871T、A1118T、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、H304Y、P596L、L62R、G719A、G719C、G719S、G735S、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、D761-E762insEAFQ、V765M、H773L、V774-C775insHV、V774M、V786M、T790M、P798H、R831H、L833F、V851I、K860I、L861Q、G873E、G874S、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ロシレチニブ感受性マーカー。
（３６）A289V、S492R、G598V、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、S720F、P741L、P753S、A763-Y764insFQEA、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773Y、R776C、R776H、G779S、C797S、V802I、R831L、L833V、V834L、V834M、V843I、P848L、T854A、A859T、A864T、E865K、及びA871Gからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ロシレチニブ耐性マーカー。
（３７）
　R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、P2329L、D2913H、P2639L、S3291C、D23V、I2664M、K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、及びW2970*からなる群から選択される変異を有するBRCA2タンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、がん検出用マーカー。
（３８）（１７）～（１９）及び（２３）～（３７）のいずれかに記載のマーカーを検出するための、プライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキット。
（３９）被験者から得られたサンプルにおいて、（１７）～（１９）及び（３７）のいずれかに記載のマーカーを検出する工程を含む、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法。
（４０）被験者から得られたサンプルにおいて、（２３）に記載のマーカーを検出する工程を含む、分化抑制変異の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法。
（４１）被験者から得られたサンプルにおいて、（２４）又は（２５）に記載のマーカーを検出する工程を含む、セツキシマブ感受性の判別を補助する方法。
（４２）被験者から得られたサンプルにおいて、（２６）～（３６）のいずれかに記載のマーカーを少なくとも1つ検出する工程を含む、薬剤感受性の判別を補助する方法。
（４３）（１７）又は（１８）に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
（４４）（２０）又は（２１）に規定される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
（４５）（２４）～（３６）に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
（４６）（３７）に規定される変異を有するBRCA2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-069085号の開示内容を包含する。
　本発明により、異なる複数の目的遺伝子のがん化能等の機能、及び各目的遺伝子を有する細胞の薬剤に対する感受性又は耐性を迅速かつ正確に、また網羅的に評価することができる。さらに、本発明の方法により同定された各種マーカーに基づいて、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性、及び薬剤感受性等を評価することが可能となる。
図1は、本発明の異なる複数の目的遺伝子の評価方法の一実施形態を示す概念図である。 図2は、フォーカス形成アッセイにおけるギムザ染色領域（%）と、本発明の異なる複数の目的遺伝子の評価方法の一実施形態による倍率変化（day 8/day 0）が正の相関を有することを示すグラフである（r=0.63）。 図3は、活性型EGFR変異体（11種）又は他のがん化タンパク質（5種）を発現する16種のBa/F3細胞のプールに対して、様々なチロシンキナーゼインヒビター（以下、TKIとする）を試験した結果を示す図である。遺伝子導入細胞ごとの異なる倍化時間を考慮するため、TKI処理したBa/F3細胞のそれぞれをビヒクル処理対象と比較して、各細胞クローンの増殖阻害を計算した。用いた薬剤はゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、クリゾチニブ、アレクチニブ、及びピューロマイシンである。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM）を示し、横軸は各変異を有する細胞（1：EGFR：L858R、2：EGFR：746-750del、3：EGFR：G719S、4：EGFR：L861Q、5：EGFR：S768I、6：EGFR：E709K、7：EGFR：E709A、8：EGFR：A289V、9：EGFR：G598V、10：EGFR：T790M、11：EGFR：T790M及びC797S、12：KRAS：G12V、13：EML4-ALK、14：CD74-ROS1、15：KIFB-RET、及び16：ERBB2：V777L）を用いたことを示す。相対的な生存率を濃淡で表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図4は、A839T、L858R、並びにT790M及びC797Sを有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブに対する感受性を示す。横軸は薬剤濃度（nM）、縦軸は細胞生存率（%）を示す。 図5-1は、野生型EGFR（WT）、又は各変異を有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブに対する感受性を示す。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM）を示し、横軸は各変異を有する細胞を用いたことを示す。最上段の濃淡は、各変異の種類（ミスセンス変異、欠失変異、及び挿入変異）を表し、それ以外の部分の濃淡は、相対的な生存率を表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図5-1の続葉である。 図6-1は、各変異を有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブに対する感受性を示す。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM）を示し、横軸は各変異を有する細胞を用いたことを示す。相対的な生存率を濃淡で表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図6-1の続葉である。 図7は、3T3フォーカス形成アッセイで単一変異及び複合変異を含むEGFRタンパク質を発現する細胞を評価した結果を示す。溶液の色が濃い程細胞が増殖し、変異ががん化能を有することを示唆している。GFPは緑色蛍光タンパク質、Wtは野生型EGFRを有するタンパク質を発現する細胞を評価したことを示す。Singleは表の左欄に示した変異を含むタンパク質を、Cisは表の左欄に示した変異に加えてL858Rを（シス位置で）含むタンパク質を、Transは表の左欄に示した変異に加えてL858Rを（トランス位置で）含むタンパク質を発現する細胞を評価したことを示す。 図8-1は、各変異を有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、セツキシマブに対する感受性を示す。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL）を示し、横軸は各変異を有する細胞を用いたことを示す。相対的な生存率を濃淡で表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図8-1の続葉である。 図9は、Clinvarにおいて登録されたVUS又はconfricting interpretationsの変異を、MANO-B法により評価した結果に示す。
＜複数の目的遺伝子の評価方法＞
（本発明の評価方法）
　一態様において、本発明は、異なる複数の目的遺伝子の評価方法（以下、単に「本発明の評価方法」とも記載する）に関する。本明細書において、「複数」の範囲の下限は特に限定しないが、例えば2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、20以上、30以上、50以上、100以上であってよい。同様に、「複数」の範囲の上限は特に限定しないが、例えば1000以下、500以下、又は300以下であってよい。
　本明細書において、「目的遺伝子」の種類は特に限定しない。本発明の方法では細胞の増殖率及び／又は生存率を評価し得るため、目的遺伝子は、細胞の増殖率及び／又は生存率に影響を与える遺伝子であってよい。細胞の増殖率及び／又は生存率に影響を与える遺伝子の例として、例えばがん遺伝子、がん抑制遺伝子、アポトーシスに関与する遺伝子、細胞老化に関与する遺伝子、（分化誘導条件下での）分化抑制遺伝子、幹細胞性の維持に関わる遺伝子、（薬剤存在下での）薬剤感受性又は耐性遺伝子、（ストレス環境下での）ストレス感受性又は耐性遺伝子等が挙げられる。がん遺伝子の例として、EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor、上皮成長因子受容体）遺伝子、ALK（anaplastic lymphoma kinase）遺伝子、RAS遺伝子（KRAS遺伝子、NRAS遺伝子、HRAS遺伝子）、及びRET（REarranged during Transfection）遺伝子等が挙げられる。がん抑制遺伝子の例としてBRCA1、BRCA2、TP53、MSH2、MSH6、MLH1、APC、NF1、INK4A、PTEN、及びRB1が挙げられる。
　目的遺伝子の野生型及び変異型遺伝子の双方が、評価される機能を有していてもよいし、目的遺伝子の野生型及び変異型のいずれかが、評価される機能を有していてもよい。本明細書において、「変異」という用語は、集団の大多数（野生型）と異なる形質をもつことを意味し、「変異型」という用語は、そのような形質を有する核酸及びタンパク質等の物質を意味する。一般に、変異は、被験者における遺伝子の塩基配列又はタンパク質のアミノ酸配列を、野生型である健常体におけるそれらの配列と比較することにより同定される。
　変異の種類は限定しないが、例えば、遺伝子レベルでの変異、すなわち塩基配列上の変異の例として、アミノ酸のコドンが終止コドンに変わるナンセンス変異、コドン内の塩基の置換によりアミノ酸の置換が生じるミスセンス変異、コドン内の塩基の付加及び／又は欠失によりアミノ酸の付加及び／又は欠失が生じる付加欠失型変異、及び塩基の挿入又は欠失等によりコドンの読み枠がずれるフレームシフト変異等の非同義変異が挙げられる。塩基配列に変異が生じるが、アミノ酸に変化が生じないサイレント変異（同義変異）もまた、本明細書の変異に含まれる。また、一の遺伝子と他の遺伝子の融合によって形成される融合変異、及びエキソンの一部が除かれた転写産物が生ずるエキソンスキッピングもまた、本発明の変異に含まれる。目的遺伝子の変異は、意義が知られた変異であってもよいし、VUS（Variant of uncertain significance、意義不明の変異）であってもよい。
　目的遺伝子は、がん遺伝子等の1つの遺伝子の複数の変異体を含み得る。
　また、目的遺伝子は1つの野生型遺伝子に対して複数の変異を含む複合型変異を含んでよい。複合型変異に含まれる複数の変異の数は、限定しないが、例えば、2、3、又は4であってよい。
　本発明の目的遺伝子の評価方法は、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程（挿入工程）、異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程（混合工程）、混合した宿主細胞を培養する工程（培養工程）、培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程（抽出工程）、抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程（定量工程）、及び前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程（決定工程）を必須の工程として含む。
　また、本発明の評価方法は、任意の工程として、前記目的遺伝子が基準遺伝子を含み、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する工程（比較工程）を、前記決定工程後に含み得る。本発明の評価方法は、任意に、比較工程に加えて、比較工程で得られた基準値との比較により、又は他の目的遺伝子との比較により、目的遺伝子を評価する工程（評価工程）を前記決定工程後又は前記比較工程後にさらに含む。
　本発明の評価方法の一実施形態を、図1を用いて説明する。図1では、まずタグ配列を付した目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムDNAに挿入し、それらの細胞を混合した後、任意に細胞の一部を取り出して、Day0のサンプルとする。続いて、混合した細胞を任意の条件（例えば、通常の培養条件又は薬剤処理条件）で適当な期間培養し、その後細胞からゲノムDNAを抽出してタグ配列を含む核酸領域を増幅して定量し、その定量値に基づいて目的遺伝子を有する細胞の相対的な数を決定する。細胞の相対的な数を決定する際、任意にDay 0（培養前）の値により標準化してもよい。本発明の異なる複数の目的遺伝子の評価方法は、例えば、がん化能の有無の評価、分化抑制遺伝子の有無の評価、及びがん遺伝子の抗がん剤に対する感受性の評価等に用いることができる。
　本発明の方法を構成する各工程について、以下詳細に記載する。
（挿入工程）
　挿入工程では、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する。
　本明細書において、「タグ配列」又は「バーコード配列」とは、各目的遺伝子又はその断片に付される固有の識別配列を意味する。タグ配列は、目的遺伝子に直接連結されてもよいし、スペーサー配列等の他の配列を介して間接的に連結されてもよい。
　タグ配列を連結した目的遺伝子を含むポリヌクレオチドをゲノムDNAに挿入することによって、後述する定量工程において、ゲノムDNA中のポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量することが可能となる。タグ配列の長さは限定しないが、各目的遺伝子の識別が可能な程度長いことが好ましい。タグ配列のヌクレオチド長は、例えば2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、8以上であってよく、50以下、40以下、30以下、20以下、又は10以下であってよい。理論上は、タグ配列のヌクレオチド長をnとすれば、4n種の目的遺伝子のそれぞれに固有のタグ配列を付すことができる。
　目的遺伝子を、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する方法は限定せず、当業者に公知の方法、を用いて行うことができる。そのような方法の例として、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる方法、Cre-Lox等のリコンビナーゼを用いる方法、Piggy Bac Transposon Vector System 等のトランスポザーゼを用いて遺伝子を導入する方法、TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）（例えば、WO2011/072246号を参照）、CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated protein 9）（例えば、Hendel A. et al., Nature Biotechnology, 2015, 33, pp. 985-989を参照されたい）、及びZFN（zinc finger nuclease）（例えば、M. Bibikova et al., Genetics, 2002, 161, pp. 1169-1175を参照）等のゲノム編集タンパク質を用いる方法が挙げられる。
　挿入工程では、ポリヌクレオチドを、目的遺伝子が発現可能な状態で宿主細胞のゲノムDNAに挿入する。「目的遺伝子が発現可能な状態」とは、目的遺伝子がその発現に必要な調節配列と共に存在し、目的遺伝子が発現される状態を意味する。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D（シャインダルガルノ）配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。これらの調節配列は、宿主細胞のゲノムDNAに内在性（内因性）のものであってもよいし、目的遺伝子と共に挿入工程において宿主細胞のゲノムに人為的に挿入された外因性のものであってもよい。また、目的遺伝子は薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカーと共に宿主細胞のゲノムに挿入してもよく、挿入後にこの選択マーカーを用いて目的遺伝子が導入された細胞を選抜してもよい。
　宿主細胞の種類は限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトの細胞である。本発明の評価方法に用い得る細胞の例として、HEK293細胞、3T3細胞、Ba/F3細胞、CHO細胞等の株化細胞、及び初代培養細胞が挙げられる。用いる細胞は、評価する目的遺伝子に応じて、疾患の有無、変異の有無、及び／又は由来組織等を考慮して、適宜選択することができる。
　培養細胞は、野生型の細胞であってもよいし、特定の遺伝子、例えばがん遺伝子、がん抑制遺伝子、アポトーシスに関与する遺伝子、細胞老化に関与する遺伝子、分化抑制遺伝子、幹細胞性の維持に関わる遺伝子、薬剤感受性又は耐性遺伝子、ストレス感受性又は耐性遺伝子等をノックアウト又は欠失させた変異細胞であってもよい。
　本発明の評価方法は、2種以上の異なる細胞を用いて行い、複数の細胞に対する目的遺伝子の機能を評価してもよいが、後述する培養工程における細胞株間の増殖率等の差異による影響を除くため、同一の細胞株について挿入工程を行い、後の混合工程に用いることが好ましい。
（混合工程）
　混合工程では、前記挿入工程において異なる目的遺伝子を含むポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する。本工程では、複数の宿主細胞を概ね同率で混合することが好ましいが、異なる割合で細胞を混合してもよい。後述する定量値を標準化するために、混合直後の細胞を標準化細胞として一部採取してもよい。後述する培養工程後の宿主細胞の結果を標準化細胞の結果で標準化することによって、混合工程における細胞数の混合割合の差を補正することができる。
（培養工程）
　培養工程では、前記混合工程で混合した宿主細胞を適当な条件下で培養する。培養工程は、培地成分、温度、pH、湿度、CO2濃度等の培養条件を当業者に知られる通常の条件に設定して行ってもよいし、特定の被験環境下で行ってもよい。「被験環境」とは、本発明の目的の遺伝子を試験する特定の条件を意味し、その例として、被験物質、例えば抗がん剤等の薬剤の存在下、分化抑制又は促進条件下、飢餓ストレス及び温度ストレス等のストレス条件下が挙げられる。
　培養工程の期間は特に限定しない。培養工程は、例えば、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、1週間以上、2週間以上であってよく、また3ヶ月以下、2ヶ月以下、1ヶ月以下、又は2週間以下、例えば3日以上2週間以下であってよい。
　培養工程は、in vitro及びin vivoのいずれにおいても行うことができるが、試験の簡便性の点からin vitroで行うことがより好ましい。培養工程をin vivoで行う場合、前記混合工程で混合した宿主細胞を、非ヒト動物、例えばラット及びマウス等の実験動物に移植し、一定の期間経過後、後述する抽出工程に供すればよい。
（抽出工程）
　抽出工程では、前記培養工程で培養した後の宿主細胞（及び任意に、混合工程後、培養工程前の宿主細胞）から常法によりゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAの抽出方法は当業者に公知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参考にすればよい。具体的には、一般的なフェノールクロロフォルム抽出法や、市販のキット、例えばPureLink（登録商標） Genomic DNA（Thermo Fisher Scientific）、及びMag ExtractorTM-Genome-（TOYOBO）等の市販のキットを用いてゲノムDNAの抽出を行うことができる。抽出したDNAはそのまま、又は精製した後、PCRに用いることができる。なお、培養工程をin vivoで行った場合、宿主細胞を移植した非ヒト動物から適当な組織又は器官を採取し、それから上記方法でゲノムDNAを抽出すればよい。
（定量工程）
　定量工程では、前記抽出工程で抽出したゲノムDNA中に含まれる前記ポリヌクレオチドの量を、タグ配列に基づいて定量し、定量値を得る。「定量値」とは、定量方法によって得られる測定値である。定量値は、容量及び重量等の絶対値であってもよいし、基準となる値に対する相対値であってもよい。
　定量工程は当業者に公知の定量方法、例えばプローブを用いる定量法、又は特異的なプライマーを用いる半定量PCR又はReal-time PCRにより行うことができ、特に限定しないが、操作の迅速性及び正確性の点から、次世代シーケンスによるリード数に基づいて行うこと好ましい。次世代シーケンスは、次世代シーケンサーを用いた配列情報の取得法であり、Sanger法に比べて膨大な数のシーケンシング反応を同時並行して実行できることを特徴とする（例えば、Rick Kamps et al., Int. J. Mol. Sci., 2017, 18(2), p. 308及びInt. Neurourol. J., 2016, 20(Suppl. 2), S76-83を参照されたい）。
　次世代シーケンスの一般的な工程を以下に示す。まず初めに、サンプル調製（工程（1））を行う。サンプル調製では、解析対象となる核酸を、次世代シーケンサーのリード長に合わせて酵素的又は機械的に断片化する。続いて、多くの場合、後のシーケンス工程に必要なアダプター配列を付加する。また、特定の遺伝子領域を解析するために、PCR等により特定の遺伝子領域を富化してもよい。遺伝子領域の富化は、例えば4～12サイクルの増幅ステップにより行う。
　続いて、シーケンシング（工程（2））が行われる。シーケンシング工程の詳細は、次世代シーケンサーの種類により異なるが、典型的にはアダプター配列を介して基板に連結させ、またアダプター配列をプライミング部位としてシーケンシング反応が行われる。シーケンス反応の詳細については、例えばRick Kamps et al（上掲）を参照されたい。
　最後に、データ出力（工程（3））が行われる。この工程では、シーケンシング反応により得られた配列情報を集めたものが得られる。出力されたデータをさらに解析して、より意味のある結果を導くことができる。
　定量工程において利用され得る「リード数」とは、特定の配列を有する増幅産物の増幅量を指す。本発明の定量工程では、次世代シーケンスによる特定のタグ配列を含む領域のリード数を、ゲノムDNA中のタグ配列が連結された目的遺伝子の相対的な量とみなすことができる。
　本発明の定量工程では、特にタグ配列を含む核酸領域をPCRに供したものを次世代シーケンスに供することが好ましい。PCR工程によって、次世代シーケンスに必要なアダプター配列を付加するだけでなく、タグ配列を含む領域を富化し、検出感度を高めることができるからである。また、宿主の内在性の同一のPCRプライミング部位を利用して、及び／又は宿主細胞のゲノムに挿入した同一のPCRプライミング部位を利用して、同一のプライマーを用いてPCR反応を行うことが好ましい。これにより、異なるプライマーを用いる場合の増幅効率の差の影響を受けることなく、増幅前の割合を保ったまま、PCR反応を行うことができる。
（決定工程）
　決定工程では、前記定量工程で決定したポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する。
　定量工程ではゲノムDNA中の各ポリヌクレオチドが定量されるため、mRNA又はタンパク質を定量する場合とは異なり、発現量の相違の影響を受けることがない。したがって、ポリヌクレオチドのそれぞれの定量値は、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の細胞数を反映している。
　混合工程における混合直後の細胞を一部標準化細胞として採取し、決定工程で得られる宿主細胞の培養後の細胞数を、混合直後の宿主細胞の細胞数で標準化することによって、混合工程における細胞数の混合割合の差を補正することができる。
（比較工程）
　比較工程は、本発明の評価方法において、前記決定工程後に含まれ得る任意の工程である。比較工程が含まれる場合、目的遺伝子が基準遺伝子を含むことを前提とする。本明細書において、「基準遺伝子」とは、目的遺伝子の機能を評価するための基準となる遺伝子を意味し、その種類は限定しないが、例えば細胞増殖に影響を与えない、すなわちがん化能のないことが知られている陰性対照遺伝子（例えばがん化能を有さない野生型遺伝子）、及び細胞増殖に正又は負の影響を与えることが知られている陽性対照遺伝子（例えばがん遺伝子、薬剤感受性遺伝子又は薬剤耐性遺伝子）が挙げられる。
　比較工程では、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記決定工程で決定された宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する。基準遺伝子が含まれなくても、例えば他の目的遺伝子との比較により目的遺伝子を評価できるが、基準遺伝子との比較により、より正確に目的遺伝子を評価することが可能となる。
（評価工程）
　評価工程は、本発明の評価方法において、前記決定工程後又は前記比較工程後に含まれ得る任意の工程である。評価工程では、比較工程で得られた基準値との比較により、又は他の目的遺伝子との比較により、目的遺伝子を評価する。
　例えば、基準遺伝子が前記陰性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数が基準値よりも高いときには、目的遺伝子ががん化能を有すると評価することができる。同様に、基準遺伝子が前記陽性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数が基準値と同程度であるときには、目的遺伝子ががん化能を有すると評価することができる。これらの実施形態では、本発明の評価方法を、がん（候補）遺伝子の同定法として用いることができる。
　さらに、例えば、次世代シーケンスによるリード数に基づいて目的遺伝子の増殖能を評価する場合、以下の計算式によりされる増殖スコアに基づいてがん（候補）遺伝子を同定することができる。
目的遺伝子Aの増殖能スコア = (AX×T0) / (A0×TX)
［ただし、AX = Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
T0 = Day 0で回収された細胞における全タグ配列の総リード数、
A0 = Day 0で回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TX= Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数。］
（増殖能スコアは、その値が高い程目的遺伝子の増殖能（がん化能）が高いことを示す。ここで、Day0は培養前の結果を、Day Xは、X日培養した後の結果を示す。（以下も同様とする））
　通常、分化誘導条件で細胞を培養すれば分化が誘導され、細胞の増殖が停止する。したがって、前記培養工程を分化誘導条件下で行い、分化誘導条件下においても増殖が認められる変異については、分化抑制変異、例えばがん化能を有する分化抑制変異であると評価し得る。
　したがって、例えば、基準遺伝子が分化に影響を与えないことが知られている陰性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の分化誘導条件下での培養後の相対的な細胞数が基準値よりも高いときには、目的遺伝子が分化抑制能を有すると評価することができる。同様に、基準遺伝子が分化に影響を与えることが知られている陽性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の分化誘導条件下での培養後の相対的な細胞数が基準値と同程度であるときには、目的遺伝子ががん化能を有すると評価することができる。これらの実施形態では、本発明の評価方法を、分化抑制（候補）遺伝子の同定法として用いることができる。
　さらに、例えば、次世代シーケンスによるリード数に基づいて目的遺伝子の増殖能を評価する場合、以下の計算式により算出される分化抑制能スコアに基づいて分化抑制（候補）遺伝子を同定することができる。
目的遺伝子Aの分化抑制能スコア = (AIX×TX) / (AX×TIX)
［AIX = 分化誘導後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TX= Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数、
AX= Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TIX= 分化誘導後Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数。］
（分化抑制能スコアは、その値が高い程目的遺伝子の分化抑制能が高いことを示す。）
　また、本発明の評価方法は、薬剤に対する感受性又は耐性を評価するために用いることができる。例えば、次世代シーケンスによるリード数に基づいて薬剤感受性を評価する場合、以下の計算式により薬剤感受性スコアを算出することができる。
目的遺伝子Aの薬剤感受性スコア = (ADX×TX) / (AX×TDX)
［ただし、AX = Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TX= Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数、
ADX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TDX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数。］
（薬剤感受性スコアは、その濃度での目的遺伝子導入細胞の生存率を示し、その値が高い程目的遺伝子の薬剤感受性が低い（薬剤耐性が高い）ことを示す。）
　目的遺伝子の薬剤感受性又は耐性を評価する場合、薬剤の種類は限定しない。好適な薬剤として、抗がん剤、例えば低分子化合物及び／又は抗体が含まれる。抗がん剤として作用する低分子化合物の例としてEGFRチロシンキナーゼインヒビター（TKI）、例えばgefitinib（gefitinib）、エルロチニブ（erlotinib）、アファチニブ（afatinib）、オシメルチニブ（osimertinib）、ロシレチニブ（ロシレチニブ）、クリゾチニブ（crizotinib）、及びアレクチニブ（alectinib）が挙げられ、抗がん剤として作用する抗体の例としてEGFR抗体であるセツキシマブ（cetuximab）が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、目的遺伝子はがん遺伝子である。この実施形態において、本発明の評価方法は、培養工程を抗がん剤の存在下で行い、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん遺伝子の抗がん剤に対する感受性（又は耐性）を評価する工程を含み得る。
　抗がん剤に対する感受性又は耐性は、基準遺伝子（例えば野生型遺伝子）又は他の目的遺伝子と比較して定めることができる。基準遺伝子には、例えば薬剤感受性遺伝子又は薬剤耐性遺伝子のいずれも使用することができる。また、基準遺伝子を含めず、特定の薬剤濃度における細胞生存率を基に薬剤感受性又は耐性を評価することもできる。
　また、薬剤感受性又は耐性は、薬剤の種類及び生体内の薬剤濃度等を考慮して薬剤濃度を適宜定め、その薬剤濃度における生存率に基づいて決定することもできる。抗がん剤が上記低分子化合物である場合、例えば、薬剤濃度0.0001μM～10μM、0.0005μM～5μM、0.001μM～1μM、0.005μM～0.5μM、又は0.01μM～0.1μMの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができ、抗がん剤が抗体である場合、0.001μg/mL～100μg/mL、例えば、0.01μg/mL～10μg/mL、又は、0.1μg/mL～1μg/mLの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができる。
　これらの薬剤濃度において細胞生存性が高い場合、例えば細胞生存率が50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は100%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤耐性があると判断することができる。これらの薬剤濃度において細胞生存性が低い場合、例えば細胞生存率が50%以上、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、又は0%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤感受性があると判断することができる。
　本明細書において、感受性は、さらに薬剤が奏功する蓋然性が高い「狭義感受性」と、薬剤が奏功する蓋然性が狭義感受性に比べて劣る「一部感受性」に区別され得る。各薬剤の狭義感受性、一部感受性、及び耐性は、例えばIC90（細胞の増殖が90%阻害される薬剤濃度）に基づいて、以下の様に定めることができる。
　例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びオシメルチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる場合を狭義感受性、0.1μM ≦ IC90 ≦ 0.5μMとなる場合を一部感受性、IC90 > 0.5μMとなる場合を耐性とすることができる。また、アファチニブであれば、IC90 < 0.005μMとなる場合を狭義感受性、0.005μM ≦ IC90 ≦ 0.01μMとなる場合を一部感受性、IC90 > 0.01μMとなる場合を耐性とすることができる。ロシレチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる場合を狭義感受性、0.1μM ≦ IC90 ≦ 1μMとなる場合を一部感受性、IC90 > 1μMとなる場合を体制とすることができる。セツキシマブであれば、IC90 < 1μg/mLとなる場合を狭義感受性、1μg/mL ≦ IC90 ≦100μg/mLとなる場合を一部感受性、IC90 > 100μg/mLとなる場合を耐性とすることができる。
　本発明の一実施形態において、目的遺伝子はBRCA1遺伝子又はBRCA2遺伝子等のがん抑制遺伝子である。この実施形態において、宿主細胞は、目的遺伝子、例えば癌抑制遺伝子を欠失させた細胞であってもよい。また、この実施形態において、培養工程を、前記がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置下で行うことができる。がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置の例として、PARP（ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ）阻害剤等及び細胞障害性の抗がん剤(例えば白金性抗がん剤のシスプラチン、カルボプラチン等）等の薬剤、並びに放射線処置が挙げられる。PARP阻害剤の例として、オラパリブ（olaparib）、ニラパリブ（niraparib）、ベリパリブ（veliparib）、及びタラゾパリブ（Talazoparib）が挙げられる。この実施形態において、本発明の評価方法は、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん抑制遺伝子を評価する工程を含み得る。例えば、機能を有するがん抑制遺伝子が導入された細胞は修復能を有するため、PARP等の薬剤を加えても細胞数が低下しない。一方で機能欠失型のがん抑制遺伝子が導入された細胞は修復能を有さない為、PARP等の薬剤を加えると相対細胞数が低下する。このような基準にしたがって、培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん抑制遺伝子を評価することができる。
＜抗がん剤決定方法＞
　一態様において、本発明は抗がん剤決定方法に関する。本発明の抗がん剤決定方法は、複数の抗がん剤について上記薬剤の感受性の評価方法を行い、得られた結果に基づいて各がん遺伝子に対して有効な抗がん剤を決定する工程を含む。薬剤の感受性の評価方法は、培養工程を複数の薬剤の存在下で行うことで、複数の抗がん剤について一度に行ってもよい。これにより、組み合わせ薬剤又は組み合わせ療法に対する感受性を評価することができる。また、薬剤の感受性の評価方法は、薬剤ごとに独立して行い、複数の薬剤について独立に感受性を評価してもよい。これにより、各薬剤の感受性を比較し、より感受性の高い薬剤を決定することができる。この場合、各遺伝子の様々な薬剤感受性等を広く検証するため、各薬剤の作用機構が異なっていることが好ましい。特に、本発明者は、各がん遺伝子の抗体に対する感受性と低分子化合物に対する感受性が大きく異なっていることを見出したことから、抗体と薬剤の両方について感受性を評価することで、より適切な薬剤を選択することができる。
＜がん検出用マーカー＞
　一態様において、本発明は、がん検出用マーカーに関する。がん検出用マーカーとは、がんを検出するための指標となる因子を意味する。本発明のがん検出用マーカーにより検出されるがんとしては、限定はしないが、例えば、脳腫瘍、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、小腸がん、大腸がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、リンパ腫、若しくは黒色腫、好ましくは肺がんが挙げられる。
　一実施形態において、本発明のがん検出用マーカー、好ましくは肺がん検出用マーカーは、A767V、A871G、E865K、G874S、H304Y、H773Y、L838P、P741L、S1153I、及びS752-I759del、V786M、及びV802Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。
　本明細書において、EGFRタンパク質は、配列番号1で示されるヒトEGFRタンパク質のアミノ酸配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。また、EGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号2で示される塩基配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。
　本明細書において、置換変異は「X1a1X2」の記号で表され、これはタンパク質のアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときにa1位のX1アミノ酸がX2アミノ酸に置換されていることを意味する。例えば、EGFRタンパク質における上記A767Vは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の767位のロイシンがアルギニンに置換されていることを意味する。なお、本明細書におけるアミノ酸の一文字表記は、通常のアミノ酸表記方法に従う。
　また、本明細書において、挿入変異は「X1a1-X2a2insX3」の記号で表される。これはタンパク質のa1位のX1アミノ酸とa2位のX2アミノ酸の間に、X3アミノ酸が挿入（ins：insert）されていることを意味する。ここでX3は二以上のアミノ酸残基であってよい。例えば、EGFRタンパク質におけるK745-E746insVPVAIKは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の745位のリシンと746位のグルタミン酸の間にバリン、プロリン、バリン、アラニン、イソロイシン、及びリシンが挿入されていることを意味する。
　本明細書において、欠失変異は「X1a1-X2a2del」又は「delX1a1-X2a2」の記号で表される。これはタンパク質のa1位（のX1アミノ酸）からa2位（のX2アミノ酸）が欠失（del:delete）していることを意味する。例えば、EGFRタンパク質におけるL747-A750delは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の747位のロイシンから750位のアラニンが欠失していることを意味する。
　本明細書において、欠失置換変異は、「X1a1-X2a2>X3」の記号によって表される。これはタンパク質のa1位のX1アミノ酸からa2位のX2アミノ酸が、X3アミノ酸に置換されていることを意味する。X3アミノ酸は二以上のアミノ酸残基であってよい。ここで「欠失置換変異」とは、元のアミノ酸配列の1又は2以上のアミノ酸が異なる1又は2以上のアミノ酸と置換された変異を意味する。欠失置換変異は、欠失したアミノ酸残基数と置換後のアミノ酸残基数が異なる点で、通常置換変異とは区別され得る。例えば、EGFRタンパク質におけるE709-T710>Dは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の709位のグルタミン酸から710位のトレオニンが欠失し、アスパラギン酸に置換されていることを意味し、EGFRタンパク質におけるE746-A750>IPは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の746位のグルタミン酸から750位のアラニンが欠失し、イソロイシン及びプロリンに置換されていることを意味する。
　一態様において、本発明のがん検出用マーカーは、複合変異を有するEGFRタンパク質又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。複合変異とは、1つの野生型遺伝子に存在する異なる複数の変異をいう。
　本明細書において、2以上の変異を含む複合変異は、「X1a1X2及びX3a2X4」又は「X1a1X2+X3a2X4」のように、上記変異の記号の組み合わせとして表される。これはタンパク質のa1位のX1アミノ酸がX2アミノ酸に置換され、かつa2位のX3アミノ酸がX4アミノ酸に置換されていることを意味する。例えば、EGFRタンパク質におけるR108K及びL858Rは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の108位のR（アルギニン）がKに置換され、かつ858位のLがRに置換されていることを意味する。複合変異には、同一の染色体の1つの遺伝子内に複数の変異を含むシス型と、異なる染色体上の対立遺伝子の各々が異なる変異を含むトランス型が存在する。本明細書において、シス型の複合変異は（cis）、トランス型の複合変異は（trans）で表される。
　一実施形態において、本発明のがん検出用マーカー、好ましくは肺がん検出用マーカーは、L62R及びG719S（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、I744M及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される複合変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。
　一実施形態において、本発明のがん検出用マーカーは、R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、P2329L、D2913H、P2639L、S3291C、D23V、I2664M、K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、及びW2970*、好ましくは、R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、及びP2329Lからなる群から選択される変異を有するBRCA2タンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。
　本明細書において、BRCA2タンパク質は、配列番号13で示されるヒトBRCA2タンパク質のアミノ酸配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。また、BRCA2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号13で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号14で示される塩基配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。
　本明細書において、ナンセンス変異は、「X1a1*」の記号で表され、これはタンパク質のアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときにa1位のX1アミノ酸をコードするヌクレオチドが、ストップコドンをコードするヌクレオチドに置換されていることを意味する。例えば、BRCA2タンパク質における上記K485*は、配列番号13で示されるアミノ酸配列の485位のリシンをコードするヌクレオチドが、ストップコドンをコードするヌクレオチドに置換されていることを意味する。
＜COL1A2とDCAF6の融合タンパク質＞
　一態様において、本発明は、COL1A2（collagen type I alpha 2）タンパク質とDCAF6（DDB1 and CUL4 associated factor 6）タンパク質の融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。COL1A2タンパク質及びDCAF6の起源は特に限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
　COL1A2タンパク質は、好ましくは配列番号3で示されるヒトCOL1A2タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。また、COL1A2タンパク質は配列番号3で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。COL1A2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号4で示される塩基配列、配列番号4で示される塩基配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、COL1A2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号4で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
　本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。また、本明細書において、「１若しくは複数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。
　DCAF6タンパク質は、好ましくは配列番号5で示されるヒトDCAF6タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号5で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。また、DCAF6タンパク質は配列番号5で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。DCAF6タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号5で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号6で示される塩基配列、配列番号6で示される塩基配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、DCAF6タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号6で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
　COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は、分化抑制能を有する限り、限定しない。好ましくは、COL1A2タンパク質の一部を融合タンパク質のN末端側に含み、DCAF6タンパク質の一部を融合タンパク質のC末端側に含む。
　COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は、好ましくは配列番号7で示されるヒトCOL1A2タンパク質とヒトDCAF6タンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号7で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。また、COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は配列番号7で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号7で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号8で示される塩基配列、配列番号8で示される塩基配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号8で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
　COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は、分化抑制能、例えば筋肉細胞への分化を抑制する能力、及び／又は分化抑制能に起因するがん化能を有し得るため、該融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分化抑制変異検出用マーカー又は肺がん等のがん検出用マーカーとして用いることができる。分化抑制変異検出用マーカーとは、分化抑制変異を検出するための指標となる因子を意味する。
＜薬剤感受性又は耐性マーカー＞
　一態様において、本発明は薬剤感受性マーカー又は薬剤耐性マーカーに関する。薬剤感受性マーカーは薬剤に対する感受性を評価するための指標となる因子を意味し、薬剤耐性マーカーは薬剤に対する耐性を評価するための指標となる因子を意味する。本発明の薬剤感受性マーカー又は薬剤耐性マーカーは、適切な薬剤を選択するために用いることができる。
　薬剤感受性マーカー又は耐性マーカーは、本発明の評価方法に基づいて、例えば基準遺伝子（例えば野生型遺伝子）又は他の目的遺伝子と比較して定めることができる。例えば、EGFRタンパク質に関する薬剤感受性又は耐性マーカーについては、本願明細書の図５又は図６に基づいて、野生型（WT）を基準にして定めることができる。例えば、ゲフィチニブについては、図５又は図６に基づいて、WTよりも細胞生存性が高い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ感受性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、L62R、R108K、A289D、H304Y、P596L、G719C、G719S、S720F、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、V765M、R776C、R776H、V786M、V802I、R831H、R831L、V834M、H835L、P848L、L858R、A864T、A871G、A871T、G873E、G874S、A1118T、及びS1153Iからなる群から選択される変異が挙げられる。一方、ゲフィチニブについて、図５又は図６に基づいて、WTよりも細胞生存性が低い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ耐性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、E709-T710>D、E709A、E709G、V769-D770insASV、V769L、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、V774-C775insHV、V774M、T790M、T7900M及びC797S、V851I、及びT854Aからなる群から選択される変異が挙げられる。図５又は図６に基づいて、同様にエルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブについても、それぞれの薬剤に対する感受性又は耐性マーカーを定めることができる。
　また、薬剤感受性又は耐性は、薬剤の種類及び生体内の薬剤濃度等を考慮して薬剤濃度を適宜定め、その薬剤濃度における生存率に基づいて決定することもできる。抗がん剤が上記低分子化合物である場合、例えば、薬剤濃度0.0001μM～10μM、0.0005μM～5μM、0.001μM～1μM、0.005μM～0.5μM、又は0.01μM～0.1μMの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができ、抗がん剤が抗体である場合、0.001μg/mL～100μg/mL、例えば、0.01μg/mL～10μg/mL、又は、0.1μg/mL～1μg/mLの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができる。これらの薬剤濃度において細胞生存性が高い場合、例えば細胞生存率が50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は100%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤耐性があると判断することができる。これらの薬剤濃度において細胞生存性が低い場合、例えば細胞生存率が50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、又は0%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤感受性があると判断することができる。
　例えば、ゲフィチニブについては、図５又は図６に基づいて、例えば0.05μM、0.1μM、又は0.5μM、好ましくは0.1μMにおいて細胞生存率が低い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ感受性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、図５において着色がなされている、L62R、R108K、A289D、H304Y、P596L、G719C、G719S、S720F、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、V765M、R776C、R776H、V786M、V802I、R831H、R831L、V834M、H835L、P848L、L858R、A864T、A871G、A871T、G873E、G874S、A1118T、及びS1153Iからなる群から選択される変異が挙げられる。
　一方、ゲフィチニブについて、図５又は図６に基づいて、例えば0.1μM、0.5μM、又は1μM、好ましくは0.5μMにおいて細胞生存性が高い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ耐性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、図５において着色がなされていない、E709-T710>D、E709A、V769-D770insASV、V769L、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、V774-C775insHV、V774M、T790M、T7900M及びC797S、V851I、並びにT854Aからなる群から選択される変異が挙げられる。
　同様にエルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブについても、図５又は図６に基づいて、それぞれの薬剤に対する感受性又は耐性マーカーを定めることができる。例えば、図５又は６において、エルロチニブであれば、0.05μM、0.1μM、又は0.5μM、好ましくは0.1μMにおいて着色がなされている変異、アファチニブ及びオシメルチニブであれば0.0005μM、0.001μM、又は0.005μM、好ましくは0.001μMにおいて着色がなされている変異、ロシレチニブであれば0.5μM、1μM、又は5μM、好ましくは1μMにおいて着色がなされている変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、それぞれの薬剤に対する感受性マーカーとして用いることができる。
　また、図５又は６において、例えば、エルロチニブであれば、0.1μM、0.5μM、又は1μM、好ましくは0.5μMにおいて着色がなされていない変異、アファチニブ及びオシメルチニブであれば0.001μM、0.005μM、又は0.01μM、好ましくは0.005μMにおいて着色がなされていない変異、ロシレチニブであれば1μM、5μM、又は10μM、好ましくは5μMにおいて着色がなされていない変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、それぞれの薬剤に対する耐性マーカーとして用いることができる。
　また、図８において、セツキシマブであれば、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、又は100μg/mL、好ましくは1μg/mLにおいて着色がなされていない変異を感受性マーカーとすることができ、逆に着色がなされている変異を耐性マーカーとして用いることができる。
　本明細書において、感受性マーカーは、薬剤が奏功する蓋然性が高い「狭義感受性マーカー」と、薬剤が奏功する蓋然性が感受性に比べて劣る「一部感受性マーカー」にさらに区別され得る。各薬剤の狭義感受性マーカー、一部感受性マーカー、耐性マーカーは、例えばIC90（細胞の90%阻害濃度）に基づいて、以下の様に定めることができる。例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びオシメルチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる変異を狭義感受性マーカー、0.1μM ≦ IC90 ≦ 0.5μMとなる変異を一部感受性マーカー、IC90 > 0.5μMとなる変異を耐性マーカーとすることができる。また、アファチニブであれば、IC90 < 0.005μMとなる変異を狭義感受性マーカー、0.005μM ≦ IC90 ≦ 0.01μMとなる変異を一部感受性マーカー、IC90 > 0.01μMとなる変異を耐性マーカーとすることができる。ロシレチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる場合を狭義感受性マーカー、0.1μM ≦ IC90 ≦ 1μMとなる場合を一部感受性マーカー、IC90 > 1μMとなる場合を耐性マーカーとすることができる。この定義に従って定められる、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブの狭義感受性マーカー、一部感受性マーカー、及び耐性マーカーを以下に示す。
　ゲフィチニブの狭義感受性マーカーとしては、R108K及びL858R（cis）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R831L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、並びにA1118T及びE746-A750del（cis）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ゲフィチニブの一部感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R108K及びL858R（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（trans）、K714R、G719A、G719S、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、E865K、G874S、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　ゲフィチニブの耐性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、A864T、A871T、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　エルロチニブの狭義感受性マーカーとしては、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、S768I及びL858R（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、並びにA1118T及びE746-A750del（cis）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。エルロチニブの一部感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709V、K714R、G719A、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、A864T、E865K、A871G、A871T、G874S、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　エルロチニブの耐性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、N771-P772insN、N771-P772insN、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　アファチニブの狭義感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G、E709G及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、L747-P753>Q、L747S、T751-I759>N、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、V786M、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、A864T、E865K、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A871T、G874S、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。アファチニブの一部感受性マーカーとしては、T751I、S768I、V769L、H773L、V774M、G779S、T854A、A859T、及びG873Eからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　アファチニブの耐性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769-D770insASV、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、V774-C775insHV、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、C797S、V851I、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　オシメルチニブの狭義感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びL858R（cis）、V769-D770insASV、V769L、V769M、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、G779S、V786M、T790M、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、V851I、T854A、L858R、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、A864T、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、G874S、E746-S752>V、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。オシメルチニブの一部感受性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709G、E709K、E709V、K714R、G719A、I744M、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、T790M及びE746-A750del（trans）、L838V、L861Q及びG719A（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、並びにL861R及びG719A（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　オシメルチニブの耐性マーカーとしては、S306L、L703I、E709A及びG719S（cis）、E709A及びL858R（cis）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S768I及びG719A（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びG719A（cis）、C797S、L861Q及びG719A（cis）、E865K、A871T、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　ロシレチニブの狭義感受性マーカーとしてはE746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、H835L、L858R、A871T、A1118T、からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ロシレチニブの一部感受性マーカーとしては、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、H304Y、P596L、L62R、G719A、G719C、G719S、G735S、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、D761-E762insEAFQ、V765M、H773L、V774-C775insHV、V774M、V786M、T790M、P798H、R831H、L833F、V851I、K860I、L861Q、G873E、G874S、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　ロシレチニブの耐性マーカーとしては、A289V、S492R、G598V、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、S720F、P741L、P753S、A763-Y764insFQEA、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773Y、R776C、R776H、G779S、C797S、V802I、R831L、L833V、V834L、V834M、V843I、P848L、T854A、A859T、A864T、E865K、及びA871Gからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　セツキシマブであれば、例えば、IC90 < 1μg/mLとなる変異を狭義感受性マーカー、1μg/mL ≦ IC90 ≦ 100μg/mLとなる変異を一部感受性マーカー、IC90 > 100μg/mLとなる変異を耐性マーカーとすることができる。この定義に従って定められる、セツキシマブの狭義感受性マーカー、一部感受性マーカー、及び耐性マーカーを以下に示す。
　セツキシマブの狭義感受性マーカーとして、L62R、L62R及びL858R（cis）、R108K、R108K及びL858R（cis）、A216T、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、H304Y、S306L、P596L、G598V、R669Q、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709K、E709V、K714R、L718Q、S720F、L747V、P753S、A767V、V769L、V769M、H773L、V774M、R776H、C797S、L833V、並びにV843Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。セツキシマブの一部感受性マーカーとして、R776C及びR831Lから選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　セツキシマブの耐性マーカーとして、L62R及びG719S（trans）、L62R及びL858R（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、R669Q及びL858R（cis）、R669Q及びL858R（trans）、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、K739N、K739N及びL858R（cis）、K739N及びL858R（trans）、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-S752>V、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、L747V及びL858R（cis）、L747V及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、I759M、I759M及びL858R（cis）、I759M及びL858R（trans）、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773Y、V774-C775insHV、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、V851I、T854A、L858R、A859T、L861Q、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、E865K及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　一態様において、本発明は、A839T変異を有するEGFRタンパク質又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、EGFRチロシンキナーゼインヒビター耐性マーカーに関する。EGFRチロシンキナーゼの例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブが挙げられる。
＜マーカーを検出するための手段又はキット＞
　一態様において、本発明は、上記がん検出用マーカー、分化抑制変異検出用マーカー、薬剤感受性マーカー、又は薬剤耐性マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットに関する。これらは、上記マーカーに応じて、当業者であれば容易に設計することができる。
　プライマーセットは、上記の様々なマーカー、特に各マーカーのタンパク質又は遺伝子の変異部分を特異的に検出できるものであれば特に限定しないが、例えば、上記マーカーがEGFRタンパク質の変異である場合、
　（１）フォワードプライマーが配列番号2の連続する14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号2の配列の相補的な配列の連続する14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は
　（２）フォワードプライマーが配列番号2の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号2の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、
フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
　マーカーがCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質である場合、配列番号4、6、又は8で示される塩基配列に基づいて、同様にプライマーセットを調製することができる。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、公知のハイブリダイゼーション法の条件を利用することができる。例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定すればよい。具体的には、ハイブリダイゼーション法温度や溶液に含まれる塩濃度、及びハイブリダイゼーション法の洗浄工程における温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定すればよい。より詳細なストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25～500mM、好ましくは25～300mMであり、温度が42～68℃、好ましくは42～65℃が挙げられる。より具体的には、5×SSC (83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃が挙げられる。
　上記マーカーをコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブは、上記マーカー、特に上記マーカーのタンパク質又は遺伝子の変異部分を検出できるものであれば特に限定しない。
　例えば、マーカーがEGFRタンパク質の変異である場合、
　（１）配列番号2の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は
　（２）配列番号2の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
から構成されることが好ましい。
　マーカーがCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質である場合、配列番号4、6又は8で示される塩基配列に基づいて、同様にプローブを調製することができる。この場合、特にCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合部分を検出できるプローブを作製することが好ましい。
　プライマー及びプローブは、当業者に知られる公知の方法により調製することができ、限定されるものではないが、例えば化学合成法によって調製することができる。
　上記マーカーに対するアプタマーは、公知の方法、例えばSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法等により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有する核酸分子で構成されるプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後に増幅した後、次のラウンドの核酸プールにするという一連のサイクルを数～数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強い核酸を選択する方法である（例えば、Tuerk C, Gold L (1990) Science 249(4968):505-510を参照されたい）。
　上記マーカーと特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、及び合成抗体のいずれであってもよい。「ポリクローナル抗体」とは、同一抗原の異なるエピトープを認識して結合する複数種の免疫グロブリン群をいう。ポリクローナル抗体は、標的分子を抗原として動物に免疫後、その動物の血清から得ることができる。「モノクローナル抗体」とは、単一免疫グロブリンのクローン群をいう。モノクローナル抗体は、例えば、免疫を行った動物から抗体を産生するB細胞を単離し、これをミエローマがん細胞と融合したハイブリドーマを用いて作製することができる。本明細書において「組換え抗体」は、キメラ抗体及びヒト化抗体等の異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体を意味する。また、本明細書において「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法によって合成した抗体を意味し、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。
　本発明のキットは、上記プライマーセット、プローブ、アプタマー、又は抗体に加えて、例えば、バッファー、酵素、及び使用説明書等を含んでもよい。
＜がんの罹患又は分化抑制変異の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法＞
　一態様において、本発明は、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法に関する。本態様において罹患判別されるがんの種類は、限定はしないが、例えば、脳腫瘍、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、小腸がん、大腸がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、リンパ腫、若しくは黒色腫、好ましくは肺がんが挙げられる。
　本方法は、被験者被験者から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載のがん検出用マーカー又は分化抑制変異検出用マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。検出工程における検出方法は限定されず、上記マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよいし、次世代シーケンサーによる配列解析により検出してもよい。
　また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載のがん検出用マーカーが検出された場合に、被験者ががんに罹患しているか又はがんの罹患可能性が高いと決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
　本明細書において、被験者の生物種は、限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
　本明細書において、「サンプル」とは、本発明の方法に供される生体試料を意味する。本発明において使用可能なサンプルとしては、限定するものではないが、例えば生体から単離した細胞又は組織が挙げられる。組織の例として、がんの病変部位、例えば、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、胃、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、卵巣、好ましくは肺等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。
　一態様において、本発明は、分化抑制変異の有無の判別を補助する方法に関する。本方法は、被験者から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載の分化抑制変異検出用マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。検出工程における検出方法は限定されず、上記分化抑制変異検出用マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよいし、次世代シーケンサーによる配列解析により検出してもよい。また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載の分化抑制変異検出用マーカーが検出された場合に、被験者が分化抑制変異を有すると決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
＜薬剤感受性を評価する方法＞
　一態様において、本発明は、抗がん剤等の薬剤感受性（又は耐性）の判別を補助する方法に関する。本方法は、被験者から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載の薬剤感受性又は耐性マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。検出工程における検出方法は限定されず、上記薬剤感受性又は耐性マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよいし、次世代シーケンサーによる配列解析により検出してもよい。
　また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載の薬剤感受性マーカーが検出された場合に、被験者が薬剤感受性を有すると決定し、及び／又は本明細書に記載の薬剤耐性マーカーが検出された場合に、被験者が薬剤耐性を有すると決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
　本方法により、被験者の薬剤感受性又は耐性を評価し、それに基づいて適切な薬剤を選択することができる。
＜細胞集団＞
　一態様において、本発明は、細胞集団に関する。本発明の細胞集団は、本明細書に記載のがん検出用マーカー、分化抑制変異検出用マーカー、薬剤感受性又は耐性マーカーを構成するポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ、例えば3以上、4以上、5以上、7以上、10以上、20以上、50以上、また500以下、200以下、又は100以下含む。
　特に、これらのポリヌクレオチドは、それぞれ固有のタグ配列に連結されていることが好ましい。この場合、このような細胞集団は、本発明の評価方法において用いることができる。本発明の細胞集団を本発明の評価方法において用いる場合、挿入工程、及び混合工程を省略し得る。
＜実施例１：MANO（Mixed All Nominated mutants in One）法の感度及び精度の評価＞
材料と方法
１．細胞株
　HEK（Human Embryonic kidney）293細胞及びマウス3T3線維芽細胞は、American Type Culture Collectionから入手し、10%FBSを補充したダルベッコ改変イーグル培地F-12（DMEM-F12）（いずれもThermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で維持した。Ba/F3細胞は、10%FBS及びマウスIL-3（20U/mL;Sigma, St. Louis, MO）を補充したRPMI 1640培地（Thermo Fisher Scientific）で培養した。
２．ランダムバーコード配列を有するレトロウイルスベクターの構築
　pcx4-bleoベクター（https://www.addgene.org/vector-database/2309/）のBamHI制限酵素サイトに60bpの塩基（配列番号9）を挿入し、その後6bpのランダム配列を含むprimerを用いて部位特異的変異導入を行い、バーコード配列を付加したpcx5-bleoを作製した。野生型ヒトEGFRのcDNAを、野生型のEFGRを有する被験者の凍結検体から単離し、pcx5-bleoにライゲーションした。EGFR変異体をコードするcDNAを、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis kit（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて作製し、pcx5-bleoにライゲーションした。また、EML4-ALK（Manabu Soda et al., nature, 2007, 448, pp. 561-566）、KIF5B-RET（Takashi Kohno1 et al., nature medicine, 2012, 18(3), pp. 375-377）、KRAS(G12V)、CD74-ROS1（Kengo Takeuchi et al., nature medicine, 2012, 18(3),pp.378-381）、EGFR(E746-A750del)、EGFR(L858R)、BRAF(V600E)、MET exon 14 skipping22及び23、ERBB2(V777L)のcDNAを、各変異陽性の肺がん患者凍結検体から単離してpcx5-bleoベクターにクローニングした。
３．レトロウイルスの調製及び細胞株への形質導入
　上記の通り調製した組換えプラスミドをパッケージングプラスミド（Takara Bio, Shiga, Japan）と共にHEK293細胞に導入し、組換えレトロウイルス粒子を得た。フォーカス形成アッセイでは、4μg/mLのポリブレン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を用いて、3T3細胞にエコトロピックな組換えレトロウイルスを24時間感染させ、5%の仔ウシ血清を補充したDMEM-F12でさらに最大2週間培養した。細胞の形質転換は、位相差顕微鏡又はギムザ溶液による染色によって評価した。
４．MANO法による検出
　細胞溶解物由来のゲノムDNAを、5’-TGGAAAGGACCTTACACAGTCCTG-3’（配列番号10）及び5’-GACTCGTTGAAGGGTAGACTAGTC-3’（配列番号11）のプライマーを用いるPCRによって、バーコード配列を含む領域を増幅した。PCRの条件は以下の通りである。
初期変性：95℃で3分間
変性：95℃で15秒間
アニーリング：60℃で30秒間
伸長：72℃で60秒間
サイクル数：30
最終伸長：72℃で10分間
　増幅後のPCR産物をAMPure beads（Beckman Coulter, Brea, CA）を用いて精製した。NEB NextUltra DNA Library Prep Kit（NEB, Ipswich, MA）を用いて、製造業者の推奨に従ってシーケンシングライブラリーを作製した。ライブラリーの質をQubit 2.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）及びAgilent 2200 TapeStation systemにより評価した。ライブラリーを、Reagent Kit V2を用いるIllumina MiSeq（300サイクル）によって配列決定し、150 bpのペアエンドリードを作製した。これらのシークエンスリードは、バーコード配列を含む以下の配列：5’-CTAGACTGCCNNNNNNGGATCACTCT-3’（配列番号12）（ここで、Nは任意のヌクレオチドである）及びその相補的配列を含んでいた。これらのバーコード配列のリード数を数えることによって各変異体の量を推定した。DMSO処理した細胞混合物を、各細胞クローンのシグナルのスケーリングのために、参照対照として用いた。したがって、各処理細胞株由来のシグナルは、100×（リード数中央値）／（DMSO対照のリード数中央値）として算出される。リード数中央値は、独立した３回の実験におけるものである。
５．In vitro MANO法
　ウイルス感染後2日後に遺伝子導入細胞の細胞数をカウントし、同数の細胞ずつ混合し、混合した細胞の一部はDNA抽出に用いた（day 0とする）。続いて、混合細胞を薬剤の非存在下（がん化能評価）、又は様々な濃度の薬剤の存在下（薬剤感受性評価）で培養を行い、観測したい時間ごとに細胞を回収しDNA抽出を行った。用いた薬剤及びメーカーを以下に示す：
ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、及びクリゾチニブ：LC laboratories、
アレクチニブ：Selleck Chemicals、
ピューロマイシン：Invitrogen、
セツキシマブ：Merck Serono。
６．In vivo MANO法
　個別に形質導入を行った細胞クローンを同じ数混合し、この混合物の2.5×106細胞（すなわち、25の細胞クローンのそれぞれにつき1×105細胞）を、東京大学動物実験専門委員会によって認められた動物使用プロトコルに従って、6週齢のヌードマウスの皮下に注入した。細胞株の注入の5日後から、マウスを、EGFR TKI エルロチニブ（50 mg/kg体重）又はビヒクルコントロール（1%カルボキシメチルセルロースナトリウム）で、1日1回、16日間経管栄養で処置した。
　腫瘍を切除し、各腫瘍を4つの部位に切断した。各細胞クローンの相対的存在量をMANO法により決定した：すなわち、各サンプルについて、注入に用いた細胞混合物由来のバーコード数を用いて、各細胞株ごとのバーコード数を相対的細胞数（AX/TX）に変換した。これらの相対的細胞数を、各細胞株の腫瘍に対する相対的寄与を算出するために用いた。
７．増殖能スコア、薬剤感受性スコアの算出
　以下の計算式により目的遺伝子の増殖能スコア及び薬剤感受性スコアを算出した。
目的遺伝子Aの増殖能スコア = (AX×T0) / (A0×TX)
目的遺伝子Aの薬剤感受性スコア = (ADX×TX) / (AX×TDX)
［ただし、AX = Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、
T0 = Day 0で回収された細胞における全バーコードの総リード数、
A0 = Day 0で回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、TX = Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数、
ADX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、
TDX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数。］
　目的遺伝子Aの増殖能スコアは、その値が高い程目的遺伝子Aの増殖能が高いことを示し、目的遺伝子Aの薬剤感受性スコアは、その濃度での目的遺伝子A導入細胞の生存率を示す。
８．Alamar Blue cell viability assay
　（ウェルごとに100μLの培地を含む）96ウェルプレートで細胞をインキュベーションした後に、10μLのalamarBlue（Thermo Fisher Scientific）を添加し、各時間で蛍光（励起530 nm、放出590nm）を測定した。細胞を含まないウェルを陰性対照として用いた。全てのウェルについての蛍光ゲインの調整を、最大蛍光強度のウェルに対して行った。
（結果）
　まず初めに、MANO法の感受性を判定するために、EML4-ALK、KIF5B-RET、KRAS(G12V)、CD74-ROS1、EGFR(E746-A750del)又はEGFR(L858R)のcDNAを、それぞれバーコード配列と共にBa/F3細胞に導入した。続いて、EGFR(L858R)のcDNAを導入した細胞のみ細胞数を変えて（100～20000細胞）、各20000個ずつの他の5種のcDNAを導入した細胞と混合した。その後、細胞混合物からゲノムDNAを単離し、PCR及び次世代シーケンスに供した。EGFR(L858R)以外の5種のcDNAを導入したBa/F3細胞に対応するバーコード配列のリード数は、混合物中で一定であったのに対し、細胞数を変えて混合したEGFR(L858R)を発現するBa/F3細胞に対応するバーコード配列のリード数は、混合した細胞数に比例して変化した（r=0.99、データ示さず）。この結果は、MANO法が非常に高感度であり、わずか0.1%程度の細胞数も定量的に検出可能であることを示している。
　続いて、MANO法ががん化能を評価できるかを確かめた。最初に、標準的な3T3フォーカス形成アッセイを行い、14個のEGFR変異（EGFR(T790M)、EGFR(G719C)、EGFR(G719S)、EGFR(L861Q)、EGFR(S768I)、EGFR(E709K)、EGFR(E709A)、EGFR(A289V)、EGFR(G598V)、EGFR(E865K)、EGFR(E865R)、EGFR(P794H)、EGFR(T790M/C797S)、及びEGFR(E746-A750del)）及び野生型EGFRについて、がん化能を測定した。BRAF(V600E)、MET exon 14 skipping22及び23、ERBB2(V777L)等の他のがん化遺伝子についても同様に試験した。続いて、これらのcDNAについて、3T3細胞を用いてMANO法を実施した。3T3細胞を異なる培地条件で培養したところ、各遺伝子の割合について同様の結果が得られた（データ示さず）。また、フォーカス形成アッセイにおけるギムザ染色面積（%）と、MANO法による倍率変化（day 8/day 0）（すなわち、増殖能スコア）は、正の相関を示した（r=0.63、図2）。この結果は、MANO法がギムザ染色同様にがん化能を評価可能であることを示している。
　ヌードマウスにおいても、3T3細胞を用いるMANO法によって腫瘍形成能アッセイをin vivoで行った。緑色蛍光タンパク質（GFP）又は野生型EGFR、ERBB2又はMETは移植11日後に枯渇したが、EGFR(L858R)又はEGFR(E746-A750del)を発現する細胞は、同じ時期に徐々に増殖していた（データ示さず）。このような結果は、in vitroアッセイの結果と一致する。これらの結果は、MANO法がin vivoでのがん化能を評価できる方法であることを示している。
　続いて、活性型EGFR変異体（11種）又は他のがん化タンパク質（5種）を発現する16のBa/F3細胞のプールに対して、様々なチロシンキナーゼインヒビター（以下、TKIとする）を試験した。遺伝子導入細胞ごとの異なる倍化時間を考慮するため、TKI処理したBa/F3細胞のそれぞれをビヒクル処理対象と比較して、各細胞クローンの増殖阻害（薬剤感受性スコア）を計算した（図3）。細胞傷害性の化合物であるピューロマイシンは、細胞クローン間で均一な細胞死を誘導したが、EGFR TKI（ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ及びロシレチニブ）は、細胞プール中の5個のTKI感受性EGFR変異体（L858R、E746-A750 del、G719S、E861Q、及びS768I）に対して、用量依存的な細胞死をもたらした。EGFR(T790M)を発現するBa/F3細胞は、第一及び第二世代のEGFR TKI（ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブ）に対して耐性であったが、第三世代のEGFR TKI（オシメルチニブ及びロシレチニブ）には感受性であった。これに対し、EGFR(T790M/C797S)を発現する細胞は、第三世代のEGFR TKIに対しても耐性であった。同様に、ALK及びROS1に対するTKIであるクリゾチニブはEML4-ALK又はCD74-ROS1を発現する細胞の増殖を抑制し、ALK及びRETに対する他の阻害剤であるアレクチニブは、EML4-ALK又はKIF5B-RETの増殖を阻害した（図3）。EGFR変異体の感受性を独立に評価するために、生存細胞の数を、ミトコンドリアの酵素活性に基づいて細胞の生存性を定量する方法であるAlamar Blue assayによっても測定した。MANO法におけるリードカウントの相対的倍化数（細胞数を示す）は、Alamar Blue dataのデータと相関していた（r=0.89、データ示さず）。これらの結果は、従来の方法による報告と一致するものであり、MANO法ががん遺伝子を有する細胞の薬剤感受性を評価できる方法であることを示している。
　さらに、25個の3T3クローンをプールし、マウスの皮下に異種移植し、14日間ビヒクル、エルロチニブ又はアファチニブで処理した。エルロチニブ処理は、6個中6個のTKI感受性のEGFR変異体（L858R、E746-A750del、L861Q、G719C、G719S及びS768I）の相対的存在比の顕著な低減をもたらしたが、2個中2個のTKI耐性EGFR変異体（T790M及びT790M/C797S）及び他のがん遺伝子を有する9個中9個のクローンは、同じ時期に増加した（データ示さず）。同様の結果が、アファチニブ処理でも得られた（データ示さず）。これらの結果は、MANO法が薬剤感受性をin vivoでも評価できることを示している。
＜実施例２：EGFRのVUS（Variants of Unknown Significance、意義不明の変異）のMANO法による評価＞
　材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、評価対象としては、以下の通りEGFRのVUSを用いた。
　BaF3細胞及び3T3細胞の両方において評価対象として用いたEGFRのVUSは以下：R108K、R252C、T263P、A289D、A289T、A289V、H304Y、S492R、P596L、G598V、L62R、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、G719A、G719C、G719S、S720F、G735S、P741L、K745-A750>T、K745-A750del、K745-E746insVPVAIK、K745-E749del、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-P753del、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-P753del、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、P772-H773insPR、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773R、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776H、G779S、V786M、T790M、C797S、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、V834L、V834M、H835L、R836C、L838P、A839T、V843I、P848L、V851I、T854A、G857E、G857R、L858R、A859T、K860I、L861Q、A864T、E865K、A871G、A871T、G873E、G874S、S1153Iの98個である。上記以外に、A1118TをBaF3細胞においてのみ評価し、E746-E749del及びR222Cを3T3細胞において評価した（評価を行ったEGFR変異体は、合計101個である）。また、コントロールとして、野生型EGFR及びGFPを含めた。
（結果）
　COSMICのデータベースにおいて4～7386回報告されている101個のEGFR変異体をMANO法で評価した。その結果、3T3細胞及びBa/F3細胞におけるアッセイによって、合計80個のEGFR変異体（両方に共通して見出されたのが62個、3T3細胞のみに見出されたのが11個、Ba/F3のみに見出されたのが7個）ががん化能に寄与すると評価された。3T3細胞又はBa/F3細胞において野生型に比べて強力ながん化能が見出された変異は以下の通りである：L62R、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、A289V、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、G719A、G719C、G719S、S720F、G735S、P741L、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776H、G779S、V786M、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、V834L、V834M、H835L、V843I、P848L、V851I、L858R、A859T、K860I、L861Q、A864T、E865K、A871G、A871T、G873E、G874S、A1118T、及びS1153I。がん化能が見出されなかった22個のEGFR変異体について試験したところ、興味深いことに、A839T変異体が、全ての世代のEGFR TKIに対して顕著な耐性をもたらすことが示された（図4）。
＜実施例３：発がん変異を有する細胞の小分子化合物に対する感受性のMANO法による評価＞
　続いて、各EGFR変異体のTKI（小分子化合物）感受性を、MANO法を用いて薬剤感受性スコアを算出した。図5に示す通り、L858R及びE746-A750del変異体はいずれのTKIにも感受性であることが示されたが、T790M、C797S、T790M/C797S、及びT854A置換及びエキソン20の挿入は幾つかのTKIに耐性を示した。これらの結果は、MANO法がこれまでの研究の感受性データと一致するものであることを示している。興味深いことに、L858R又はエキソン19の欠失と比較して、細胞外ドメインの変異（エキソン2～15）、E709変異（エキソン18）、エキソン19ミスセンス変異、V769L（エキソン20）、及びV851I（エキソン21）は、全てTKIに対し非感受性であった。エキソン20挿入の感受性は、オシメルチニブ及びロシレチニブにおいて低下したが、N771-P772insN変化は、他の変異体に比べて高い感受性をもたらした（図5）。
＜実施例４：複合変異のMANO法による評価＞
　材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、評価対象としては、EGFRの複合変異を用いた。
（結果）
　複合変異について、同様にMANO法により薬剤感受性スコアを算出したところ、図6に示す複合変異についてもがん化能を有することが示された（データ示さず）。また、この複合変異について薬剤感受性試験を行ったところ、変異ごとに薬剤への感受性が異なることが示された（図6）。また、複合変異につき、3T3フォーカス形成アッセイを行ったところ、特にL858R及びE709V（cis）、L858R及びS720F（cis）、並びにL858R及びE709G（cis）ではがん化能がほとんど又は全く認められなかったが、試験した他の複合変異についてはがん化能を有することが認められた（図7）。
＜実施例５：発がん変異を有する細胞の抗体薬に対する感受性のMANO法による評価＞
　材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、EGFRの単一変異又は複合変異を評価対象とし、薬剤としては抗体薬（セツキシマブ）を用いた。
（結果）
　抗体薬（セツキシマブ）を用いて同様の実験を行い薬剤感受性スコアを算出した結果、抗体薬に対する感受性は、小分子化合物に対する感受性とは大きく異なることが示された（図8）。また、抗体薬ではドメインごと、及び変異ごとに感受性が大きく異なることも明らかとなった（図8）。
＜実施例６：分化抑制発がん遺伝子のMANO-D（MANO-Differentiation）法による評価＞
材料と方法
　材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、細胞には以下の異なるタグを付した遺伝子（GFP、BRD3-NUT（French CA et al., Oncogene, 2008 3;27(15), pp.2237-42）、及びCOL1A2とDCAF6の融合遺伝子（配列番号8））、及び分化誘導性の転写因子であるMYOD1又はRFP（Red fluorescent protein、コントロール）を、Tet-On Advanced 発現誘導システム(クロンテック社)を用いて、MYOD1又はRFPをクローニングしたpTRE-Tight Vector及びpTet-On Advanced Vectorを目的細胞に製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクションし導入した。この細胞を混合した後、細胞分化誘導条件下（2%ウマ血清及び上記導入遺伝子の発現を促す10 ng/mL DOX）又は通常条件（10% FBS）で14日間培養を行った後、細胞を回収しDNA抽出を行った。
　分化抑制能スコアの計算式は、以下の通りである。
目的遺伝子Aの分化抑制能スコア = (AIX×TX) / (AX×TIX)
［AIX = 分化誘導後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード、
TX= Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数、
AX= Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、TIX = 分化誘導後Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数。］
（目的遺伝子Aの分化抑制能スコアは、その値が高い程目的遺伝子Aの分化抑制能が高いことを示す。）
（結果）
　本試験の結果（分化抑制能スコア）を、以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　分化抑制がん遺伝子であるBRD3-NUTについて、分化誘導条件（2% HS +dox及びMYOD1発現）で、GFPの値（0.6807）に比べて高い値（2.5046）が検出されたことから、MANO法は分化抑制がん遺伝子についても評価可能であることが示された。また、本方法によりCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質が、分化誘導条件で高い値（3.4662）を示したことから、COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質が新規分化抑制遺伝子であることが示唆された。
＜実施例７：BRCA2遺伝子のMANO-B（MANO-BRCA）法による評価＞
材料と方法
　BRCA2野生型、K2729N変異(良性)、D2723H変異(病原性)、約500アミノ酸おきにstop codonを導入したtruncate variants 7種（K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、W2970*、C3304*）、piggyBac 空ベクター（System Biosciences, LLC）の計11種のプラスミドに特有のバーコード配列を3種類ずつ付加し(n=3で実験を行うため)、計33種類のプラスミドを準備した。DLD1 BRCA2(-/-)株に、これらのプラスミドをtransposase発現プラスミドpCMV-hyPBase(Sanger Institute)と共に製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクションし、BRCA遺伝子をゲノムに安定導入した細胞を準備した。
　barcode配列で標識された変異遺伝子を導入した細胞株を同細胞数ずつ混合し、この時点で一旦ゲノムDNAを抽出した(Day 0)。様々な濃度でPARP阻害薬（olaparib）を投与して培養し、Day 12において回収した細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として用いてbarcode配列をPCR増幅し、次世代シーケンサーでdeep-sequencingした。薬剤非投与時と薬剤投与時のbarcode read数の変化比率から各変異の薬剤感受性と細胞増殖能への影響を評価した。
　Day 12で回収した各検体の解析結果(n=3の平均値)を表２にまとめた。結果は、薬剤非投与時のread数値を1として正規化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　機能を有するBRCA2が細胞に導入された場合は相同組み換え修復能が回復するため、PARP阻害剤の薬剤感受性が低下し阻害剤耐性となる。一方で機能欠失型のBRCA2が導入された細胞はPARP阻害剤に感受性であるため、PARP阻害剤を加えると相対細胞数が低下する。このような基準に基づいて、変異BRCA2の機能について検討した。K2729N変異はPARP阻害剤に野生型と同程度の耐性を示したことから、機能が維持された良性の変異であると評価され、過去の報告と一致した。一方、D2723H変異については、耐性を示さなかったことから、機能が欠失した病原性の変異であると評価され、過去の報告と一致した。
　また、本実施例において、新たにK485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、W2970*が、いずれも機能欠失型の発がん関連BRCA2変異であると考えられた。
＜実施例８：BRCA2遺伝子のMANO-B（MANO-BRCA）法による評価＞
　Clinvar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）において登録された変異（良性変異18種、VUS又はconfricting interpretationsの変異52種、悪性変異8種）について、実施例７と同様の方法（ただしolaparibは1μM）で、MANO-B法による評価を行った。その結果、Clinvarに登録された良性変異及び悪性変異では概ねMANO-B法においても同様に良性又は悪性であると評価された（データ示さず）。VUS又はconfricting interpretationsの変異をMANO-B法により評価した結果を図9に示す。
　MANO-B法とClinVarの評価が一致したもののうち、良性変異で最も低い数値が0.73860142（N2436I）であり、悪性変異で最も高い数値が0.038385294（G2724W）であったことから、閾値を0.1と0.5として良性、悪性、及び判断不能（悪性の可能性がある変異）の3つに分類した。その結果、VUS又はconfricting interpretationsの変異を、悪性9変異体（R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、及びP2329L）、判断不能5変異体（D2913H、P2639L、S3291C、D23V、及びI2664M）、及び良性38変異体（R2896C、A2643G、S142N、N854S、Y42C、G602V、T3387A、T2412A、E3096K、E2020K、S3319F、V1532F、E747G、S2697N、K2411T、P3054S、Q147R、S445Y、S755C、Y600C、K2075N、V159E、P41L、H595Y、F266L、R3385H、T2337A、I2627V、I1167V、N55S、V208G、P3292L、S1074C、T598A、T207I、R324T、A2911V、E1695V）に分類することができた。
　本発明により、異なる複数の目的遺伝子の機能、例えばがん化能の評価方法、及び各目的遺伝子を有する被験者の薬剤に対する感受性を迅速かつ正確に評価することができる。本発明は、例えばVUS等の多数の変異につき、がん化能や薬剤感受性を評価することができるため、その産業上の利用価値は非常に高い。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

  1. 　タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程、
    　異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程、
    　混合した宿主細胞を培養する工程、
    　培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程、
    　抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程、
    　前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程、
    を含む、異なる複数の目的遺伝子の評価方法。
  2. 　前記目的遺伝子が基準遺伝子を含み、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記培養後の相対的な細胞数が基準値に比べて高い場合に、その目的遺伝子はがん化能を有すると評価する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　培養工程を、分化誘導条件下で行い、
    　前記培養後の相対的な細胞数が基準値に比べて高い場合に、その目的遺伝子は分化抑制遺伝子であると評価する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  5. 　培養工程を、被験環境下で行う、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　がん検出用マーカーであって、H304Y、P741L、S752-I759del、H773Y、A767V、V786M、L838P、E865K、A871G、G874S、V802I、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質からなる、前記マーカー。
  7. 　がん検出用マーカーであって、L62R及びG719S（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、I744M及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される複合変異を有するEGFRタンパク質からなる前記マーカー。
  8. 　請求項６又は７に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、がん検出用マーカー。
  9. 　COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質。
  10. 　請求項９に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　請求項９に記載の融合タンパク質又は請求項１０に記載のポリヌクレオチドからなる分化抑制変異検出用マーカー。
  12. 　L62R、L62R及びL858R（cis）、R108K、R108K及びL858R（cis）、A216T、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、H304Y、S306L、P596L、G598V、R669Q、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709K、E709V、K714R、L718Q、S720F、L747V、P753S、A767V、V769L、V769M、H773L、V774M、R776H、C797S、L833V、V843I、R776C、並びにR831Lからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、セツキシマブ感受性マーカー。
  13. 　L62R及びG719S（trans）、L62R及びL858R（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、R669Q及びL858R（cis）、R669Q及びL858R（trans）、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、K739N、K739N及びL858R（cis）、K739N及びL858R（trans）、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-S752>V、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、L747V及びL858R（cis）、L747V及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、I759M、I759M及びL858R（cis）、I759M及びL858R（trans）、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773Y、V774-C775insHV、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、V851I、T854A、L858R、A859T、L861Q、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、E865K及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、セツキシマブ耐性マーカー。
  14. 　R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、P2329L、D2913H、P2639L、S3291C、D23V、I2664M、K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、及びW2970*からなる群から選択される変異を有するBRCA2タンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、がん検出用マーカー。
  15. 　請求項６～８及び１１～１４のいずれか一項に記載のマーカーを検出するための、プライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキット。
  16. 　被験者から得られたサンプルにおいて、請求項６～８及び１４のいずれか一項に記載のマーカーを検出する工程を含む、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法。
  17. 　被験者から得られたサンプルにおいて、請求項１１に記載のマーカーを検出する工程を含む、分化抑制変異の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法。
  18. 　被験者から得られたサンプルにおいて、請求項１２又は１３に記載のマーカーを検出する工程を含む、セツキシマブ感受性の判別を補助する方法。
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