ES2660115T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de cáncer - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRINA-1 y comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad de SEQ ID NO: 5, 6 y 7, y una región variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11.
Description
comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10 y 11, y las secuencias de aminoácidos de regiones marco procedentes de anticuerpo humano y una región constante de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpo humano.
(iii) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de
5 aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de un anticuerpo humano, una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región constante de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de un anticuerpo humano.
Las secuencias de las regiones constantes y variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano están disponibles a través de, por ejemplo, NCBI (EE.UU.; GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, puede hacerse referencia a las siguientes secuencias en: n.º de acceso J00228 para una región constante de la cadena pesada de IgG1; n.º de acceso J00230 para una región constante de la cadena pesada de IgG2; n.º de acceso X03604 para una región constante de la cadena pesada de IgG3; n.º de acceso K01316 para una región constante de la cadena 15 pesada de IgG4; n.º de acceso V00557, X64135 y X64133 para una región constante κ de cadena ligera humana; y
n. de acceso X64132 y X64134 para una región constante λ de la cadena ligera humana.
Preferentemente, estos anticuerpos tienen actividad citotóxica y, por lo tanto, pueden ejercer un efecto antitumoral.
Las secuencias particulares anteriores de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y las CDR en los anticuerpos mencionados anteriormente se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y está claro que el anticuerpo de la presente invención no está limitado por las secuencias particulares. Se preparan hibridomas capaces de producir anticuerpos humanos anti-CAPRINA-1 humanos o anticuerpos animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos de ratón) diferentes de los descritos específicamente anteriormente y se recuperan anticuerpos
25 monoclonales producidos por los hibridomas y se determina si los anticuerpos recuperados son o no los anticuerpos de interés usando la actividad de unión inmunológica contra la CAPRINA-1 humana y la actividad citotóxica como indicadores. Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal de interés se identifican de este modo. A continuación, a partir de los hibridomas se preparan los ADN que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de interés y se secuencian, como se ha descrito anteriormente. Los ADN se usan para la preparación de los diferentes anticuerpos.
El anticuerpo descrito anteriormente puede ser el anticuerpo (a) que tiene la sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, en particular, en una secuencia de la región marco y/o una secuencia de la región constante, siempre que el anticuerpo tenga una especificidad tal que pueda reconocer específicamente a la CAPRINA-1. En el
35 presente documento, el término "varios" significa, preferentemente, de 2 a 5, más preferentemente 2 o 3.
El anticuerpo de la presente invención tiene una constante de afinidad Ka (kon/koff) de, preferentemente, al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 x 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1 o, al menos, 1013 M-1 para la proteína CAPRINA-1 o el fragmento de la misma.
El anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con un agente antitumoral. La conjugación del anticuerpo con el agente antitumoral se puede realizar a través de un espaciador que tiene un grupo reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similar (por ejemplo, un grupo succinimidilo, un grupo
45 formilo, un grupo 2-piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo o un grupo hidroxi).
Los ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos en las bibliografías, etc.; paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfán, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolmelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, 55 esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por ejemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, 65 mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido tenuazónico, triazicuona,
11
glioma que es tumor de tejido neuroepitelial, ependimoma ventricular, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionario, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentario, linfoma de células pequeñas a medias, cáncer cecal, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transverso, cáncer de colon sigmoide, cáncer de recto, cáncer de ovarios 5 epitelial, tumor de células germinales, tumor de células estromales, carcinoma ductal pancreático, carcinoma ductal pancreático invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasia papilar-mucinoso intraductal, neoplasia quística mucinosa, pancreatoblastoma, cistadenocarcinoma seroso, tumor papilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endocrina múltiple de tipo-1 (síndrome de Wermer), tumor de células de los islotes no funcionales, somatostatinoma y VIPoma.
El sujeto (paciente) como receptor es, preferentemente, mamíferos, por ejemplo, mamíferos, incluyendo primates, animales de compañía, ganado y animales de deporte, y, de manera particularmente preferente, seres humanos, perros y gatos.
15 Cuando se usa el anticuerpo de la presente invención es una composición farmacéutica, la composición farmacéutica puede formularse mediante un método conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede usar en forma de una inyección parenteral de una solución o suspensión aséptica con agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede formularse con el anticuerpo mezclado en una forma de dosificación unitaria requerida para la práctica farmacéutica generalmente aceptada, en combinación con vehículos o medios farmacológicamente aceptables, específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsionante, un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un agente aromatizante, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, etc., según sea apropiado. La cantidad del principio activo en dicha preparación se determina de tal forma que puede lograrse una dosis adecuada dentro del intervalo indicado.
25 Una composición aséptica para inyección se puede formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional usando un vehículo tal como agua destilada inyectable.
Los ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen solución salina fisiológica, soluciones isotónicas que contienen glucosa y otros adyuvantes, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico. Estas soluciones se pueden usar en combinación con un solubilizante apropiado, por ejemplo, un alcohol (particularmente, etanol) o un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol), o un tensioactivo no iónico, por ejemplo, polisorbato 80 (TM) o HCO-60.
35 Los ejemplos de soluciones oleosas incluyen aquellos que usan aceite de sésamo y aceite de soja. Las soluciones pueden usarse en combinación con un solubilizante, tal como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. Un tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato o una solución de tampón de acetato de sodio), un agente calmante (por ejemplo, clorhidrato de procaína), un estabilizante (por ejemplo, alcohol bencílico o fenol), o un antioxidante se pueden añadir a las soluciones. Las soluciones para inyección preparadas de este modo se cargan normalmente en ampollas adecuadas.
La composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía oral o parenteral, preferentemente por vía parenteral. Ejemplos específicos de sus formas de dosificación incluyen inyecciones, agentes de administración intranasal, agentes de administración transpulmonar y agentes de administración percutánea. Los ejemplos de las
45 inyecciones incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal e inyección subcutánea, a través de las cuales la composición farmacéutica se puede administrar sistémica o localmente.
Asimismo, el método de administración puede seleccionarse adecuadamente basándose en la edad, el peso, el sexo, los síntomas, etc. de un paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede seleccionarse dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dosis. Como alternativa, la dosis se puede seleccionar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,001 a 100000 mg/cuerpo de un paciente, aunque la dosis no se limita necesariamente a estos valores numéricos. Aunque la dosis y el método de administración varían dependiendo del peso, la edad, el sexo, los síntomas, etc. de un paciente, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la dosis y el método.
55 La composición farmacéutica que incluye el anticuerpo de la presente invención o fragmentos de la misma puede administrarse a un sujeto para tratar y/o prevenir el cáncer, preferentemente cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
La presente invención abarca además medios para tratar y/o prevenir el cáncer, mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente invención en combinación con el agente antitumoral como se ha ejemplificado anteriormente o una composición farmacéutica que contiene dicho agente antitumoral a un sujeto. El 65 anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo se puede administrar simultáneamente con el sujeto o por separado del agente antitumoral al sujeto. En el caso de la administración por separado de estas composiciones
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- (iii)
- polipéptidos de la CDR de la cadena pesada seleccionados del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas por las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, y un ADN que codifica los polipéptidos; y
- (iii)
- polipéptidos de la CDR de la cadena ligera seleccionados de las secuencias de aminoácidos mostradas por las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, y un ADN que codifica los polipéptidos.
5 Estos polipéptidos y ADN pueden prepararse usando técnicas de ingeniería genética como se ha descrito anteriormente.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no pretende estar limitado por estos ejemplos específicos.
Se investigó la expresión del gen de la CAPRINA-1 en tejidos normales de perro y ser humano y diversas líneas celulares por el método de RT-PCR de acuerdo con el ejemplo 1 (4) del documento WO2010/016526. Como resultado, se observó una fuerte expresión en los testículos entre los tejidos caninos sanos, mientras que la expresión se observó en cáncer de mama canino y tejidos de adenocarcinoma. Además, como resultado del examen de la expresión en tejidos humanos, la expresión se observó solo en el testículo entre tejidos normales, como con el gen CAPRINA-1 canino. En contraste, la expresión se detectó en muchos tipos de líneas celulares de cáncer, incluyendo 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB--231V y MRK-nu-1) y 4 líneas celulares de cáncer de páncreas (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 y BxPc-3),
25 entre las células cancerosas. Estos resultados demostraron que la expresión de CAPRINA-1 no se encuentra en tejidos normales aparte del testículo, mientras que CAPRINA-1 se expresa en las líneas celulares de cáncer de mama.
100 µg de proteínas CAPRINa-1 humanas (que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2) preparadas en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se mezclaron con una cantidad igual de adyuvante MPL + TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mezcla se usó como una solución de antígeno por ratón. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad (preparado por Japan SLC, Inc.). A 35 continuación, se realizaron 7 administraciones cada 1 semana para completar la inmunización. Tres días después de la inmunización final, el bazo de cada ratón se escindió y se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante se repitieron tres veces para obtener células del bazo. Los esplenocitos obtenidos se mezclaron con células de mieloma de ratón SP2/0 (adquiridas de la ATCC) en una proporción de 10:1. Se añadió a la mezcla celular una solución de PEG preparada mezclando 200 µl de un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 %, que se calentó a 37 ºC, con 800 µl de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH) y luego se dejó reposar durante 5 minutos para la fusión celular. Después de la eliminación del sobrenadante mediante centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 150 ml de un medio RPMI1640 que contenía 15 % de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solución HAT (Gibco)
45 (medio selectivo HAT). Esta suspensión se sembró en quince placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 µl/pocillo. Los esplenocitos y las células de mieloma se fusionaron mediante cultivo durante 7 días a 37 ºC, CO2 al 5 % para obtener hibridomas.
Los hibridomas preparados se sometieron a detección selectiva para determinar la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a las proteínas CAPRINA-1 como indicador. Una solución de 1 µg/ml de la proteína CAPRINA-1 preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 µl/pocillo y se dejó reposar a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina al 0,5 % (BSA) (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) a 400 µl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó
55 cada pocillo tres veces con 400 µl de PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 µl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadieron anticuerpos (H + L) IgG anti-ratón marcados con HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 µl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 µl/pocillo y se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1N a 100 µl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas productores de anticuerpos que tenían una alta absorbancia.
65 Se añadieron los hibridomas seleccionados a una placa de 96 pocillos a 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la
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