ES2645959T3

ES2645959T3 - Péptidos basados en lactoferrina humana que tienen actividad antiinflamatoria

Info

Publication number: ES2645959T3
Application number: ES12700715.1T
Authority: ES
Inventors: Margit Mahlapuu; Camilla Björn; Veronika SJÖSTRAND; Björn Walse; Bo Svensson
Original assignee: Pergamum AB
Current assignee: Pergamum AB
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2017-12-11
Anticipated expiration: 2032-01-25
Also published as: US8846608B2; EP2668204A2; RU2013139294A; JP2014505061A; KR20140026367A; US9132165B2; EP2668204B1; WO2012101157A1; CA2825247A1; KR20140020252A; JP2014505062A; ES2633353T3; WO2012101156A3; CN103459419A; RU2013139302A; PL2668205T3; CN103476792B; CN103476792A; KR101949210B1; US20140031296A1

Abstract

Un péptido seleccionado de:**Tabla**

Description

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pueden administrarse a un paciente por vía oral, sistémica, parenteral, local o tópica.

El término “paciente” usado en la presente memoria se refiere a cualquier persona con riesgo de o que padece un estado patológico, progresión de enfermedad u otra afección anormal o nociva.

La administración sistémica es adecuada, p.ej., para el tratamiento de infección del tracto urinario, colitis y tumores. La administración sistémica puede emprenderse por vía oral, nasal, pulmonar, bucofaríngea, intravenosa, intraarterial, intracavitaria, intramuscular, subcutánea, transdérmica, supositorios (incluyendo rectal) u otras vías conocidas por los especialistas en la materia.

La administración local es adecuada, p.ej., para el tratamiento de infecciones e inflamaciones de la piel y estructuras de la piel, infecciones respiratorias, todas las infecciones e inflamaciones en membranas mucosas, etc. La administración local puede emprenderse por vía tópica, epicutánea, oral, nasal, vaginal, oftálmica, ótica, pulmonar o bucofaríngea. Para el tratamiento de infecciones o inflamaciones locales, los péptidos o productos medicinales según la invención pueden incluirse, p.ej., en un gel, una crema, una pomada, solución o pasta, un polvo/solución de inhalación, una solución/suspensión/pomada ótica u oftálmica.

En el método según la invención, se administra a un paciente una cantidad eficaz de un péptido según la invención. El término “cantidad eficaz” usado en la presente memoria se refiere a una cantidad suficiente para tratar o prevenir un estado patológico, progresión de enfermedad u otras afecciones anormales o nocivas.

Los péptidos o productos medicinales o dispositivos médicos y métodos según la invención son particularmente bien adecuados para el tratamiento y/o la prevención de infección del tracto urinario y colitis, infecciones e inflamación de la piel y estructuras de la piel, infecciones e inflamación del oído externo, canal auricular, oído interno y ojo y sistema respiratorio, heridas crónicas y agudas, pero también son tratables varias otras enfermedades inflamatorias e infecciosas según la presente invención, tales como enfermedades intestinales inflamatorias, artritis reumatoide, artrosis, afecciones causadas por el virus VIH-1, afecciones causadas por el virus CMV y afecciones causadas por hongos, p.ej., especies de Candida tales como Candida albicans and Candida krusei, Aspergillus y Cryptococcus neoformans. Este listado no es en modo alguno limitante del alcance de la invención.

Los péptidos, productos medicinales, dispositivos médicos y métodos según la invención son también bien adecuados para el cuidado médico preventivo al reducir el riesgo de desarrollo de enfermedades inflamatorias o infecciosas en pacientes con un riesgo aumentado de atracción de tales complicaciones.

Los péptidos de la presente invención son adecuados para terapias antiinflamatorias e inmunomoduladoras, ejemplificadas pero no limitadas por:

1) Generalmente, tratamiento de inflamación y/o una afección médica resultante de la inflamación, y específicamente,

2a) Intestino; enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa,

2b) articulaciones; artritis reumatoide, artritis, artrosis, trastornos localizados en los músculos, incluyendo espasmo muscular, desgarro muscular, lesión muscular, esguince muscular, torcedura muscular,

2c) dermatología; psoriasis, eccema (eczema), dermatitis, acné,

2d) corazón; pericarditis, endocarditis, insuficiencia cardiaca,

2e) dolor (especificado adicionalmente en 2f a continuación),

2f) sistema nervioso; enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, síndrome del túnel carpiano, hernia de disco, rizopatía cervical, parálisis de Bell, lesión de médula espinal aguda, compresión de médula espinal, estenosis medular, neuralgia postherpética, encefalitis vírica, meningitis vírica, enfermedad de Menieres, polio y complicaciones después de polio, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía, neuralgia trigeminal, trastornos epilépticos crónicos,

2g) órganos sensoriales; glaucoma,

2h) superficies mucosas (inflamación como resultado de quimio/radioterapia),

2i) alergia,

2j) enfermedades autoinmunitarias.

Los péptidos de la invención son además adecuados para la prevención y el tratamiento de heridas y cicatrices en relación con afecciones y procedimientos ejemplificados, pero sin limitación, por:

3a) procedimientos quirúrgicos en diversos tejidos tales como piel, músculos, tendones, tejido nervioso, vasos

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sanguíneos, y en diferentes localizaciones del cuerpo tales como ojos, oídos, cuerdas vocales, manos, médula espinal, cavidad intraabdominal, cavidad intratorácica, cavidad intracraneal, cavidad oral, procedimientos ginecológicos, endometriosis, fimosis,

3b) acné,

3c) cicatrices hipertróficas y queloides,

3d) pleuritis,

3e) diálisis peritoneal,

3f) heridas agudas y crónicas.

Los péptidos de la invención se cree además que tienen efectos antiangiogénicos y son por lo tanto adecuados para

el tratamiento de: 4a) cáncer, 4b) artritis reumatoide. Los péptidos de la invención tienen efectos antiinfecciosos, y son adecuados para la prevención y el tratamiento de: 5a) efectos antibacterianos: tracto respiratorio superior e inferior (tonsilitis, sinusitis, neumonía, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis

quística, etc.), infecciones del ojo (p.ej., conjuntivitis), infecciones del tracto urinario, enfermedades de transmisión sexual (incluyendo el recubrimiento antimicrobiano de condones), tracto genital (incluyendo vaginosis, vaginitis, cervicitis, endometritis, PID), infecciones del tracto gastrointestinal (infecciones sistémicas iniciadas en el GI), infecciones del sistema nervioso central, infecciones de la piel y estructuras de la piel tales como lesiones traumáticas infectadas secundariamente,

incluyendo infecciones de sitio quirúrgico, celulitis o abscesos, dermatosis infectadas secundariamente, impétigo y

ántrax o forunculosis (incluyendo bacterias grampositivas y gramnegativas y estafilococos, por ejemplo MRSA,

estreptococos, nosocomiales, heridas, quemaduras), músculo, articulaciones (p.ej., artritis séptica), sistema óseo y

hematopoyético,

infecciones relacionadas con la boca, ojo, oído interno y externo y canal auricular, incluyendo parodontitis y

gingivitis

5b) Efectos antivíricos:

tracto respiratorio superior e inferior,

enfermedades de transmisión sexual,

infecciones del tracto gastrointestinal (infecciones sistémicas iniciadas en el GI),

infecciones del sistema nervioso central,

5c) Efectos antifúngicos:

tracto respiratorio superior e inferior (tales como aftas, candidiasis mucocutánea)

tracto genitourinario (tales como candidiadis vulvovaginal, balanitis)

infecciones del tracto gastrointestinal (infecciones sistémicas iniciadas en el GI)

infecciones del sistema nervioso central

infecciones de la piel y estructuras de la piel (tales como candidiasis mucocutánea), dermatosis y eczema.

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Lo más preferiblemente, los péptidos de la presente invención se usan para el tratamiento, la profilaxis y/o la prevención de impétigo, heridas por quemaduras, abrasiones infectadas, laceraciones infectadas, excoriaciones, erisipelas, celulitis, abscesos, forúnculos, ántrax, heridas suturadas, infecciones de sitio quirúrgico, dermatosis infectadas secundariamente; dermatitis atópica, psoriasis y dermatitis de contacto alérgica, mordeduras animales e infección relacionada con catéter.

Los péptidos, productos medicinales, dispositivos médicos y métodos según la invención pueden usarse solos, en combinación entre sí o en combinación con terapia convencional.

Según la presente invención, también es posible incluir los péptidos, en una cantidad eficaz, en cualquier clase de comida o bebida destinada a reducir infecciones y/o inflamaciones en pacientes con un riesgo aumentado de tales afecciones debido a una enfermedad subyacente, un bajo peso de nacimiento o un tratamiento médico. Por ejemplo, es posible incluir los péptidos, en una cantidad eficaz, en un alimento de fórmula para bebés destinado a inhibir los efectos dañinos de bacterias, tal como la pérdida de peso causada por la inflamación inducida por bacterias, virus u hongos en bebés. Cuando los péptidos según la invención se van a usar en comida, p.ej. con fines nutricionales, se prefiere especialmente usar péptidos de origen natural.

Puesto que los péptidos según la invención tienen efectos antimicrobianos, pueden usarse también como conservantes en diferentes comidas y productos medicinales tales como geles, cremas, pomadas, pastas, soluciones, emulsiones, etc.

La invención se describirá ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos pretenden solo ilustrar la invención y no debería considerarse en modo alguno que limitan el alcance de la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1. Representación de las diferentes clases de aminoácidos, que muestran similitud en términos de hidrofobia, tamaño y carga.

a una parte del péptido de SEQ ID NO:1, a saber

Figura 3. Gráfico de dispersión que muestra el agrupamiento de los péptidos de clase 2. Los péptidos se representan según sus propiedades fisicoquímicas. Los péptidos con actividad inhibidora de TNF- (a una concentración de péptido de 40 μM) pueden encontrarse en tres agrupamientos: agrupamientos A, B y C.

Figura 4. Efecto de dosis y respuesta del péptido 232 (SEQ ID NO 78)(A) y el péptido 220 (SEQ ID NO 67)(B) sobre la colonización bacteriana de heridas de extirpación infectadas en ratas. Las heridas infectadas con MRSA (CCUG 41879) y tratadas con el correspondiente péptido en H2O, a concentraciones de 0,1, 0,5 y 2 mg/ml, demuestran una reducción significativa de los recuentos bacterianos en forma de respuesta a la dosis. Los resultados se presentan como supervivencia bacteriana relativa (%) en comparación con el grupo de control ± EEM (n=15 heridas). Se estimó la significación estadística por la prueba de t de Student. *=p< 0,05, **=p <0,01, ***=p <0,001.

Figura 5. Efecto de dosis y respuesta del péptido 232 (SEQ ID NO 78)(A) y el péptido 220 (SEQ ID NO 67)(B) sobre la colonización bacteriana de heridas infectadas en piel de cerdo. Las heridas infectadas con S. aureus en PBS/suero (50/50) y tratadas con el correspondiente péptido en H2O, a concentraciones de 0,1, 0,5 y 2 mg/ml demuestran una reducción significativa de los recuentos bacterianos en forma de respuesta a la dosis. Los resultados se presentan como supervivencia bacteriana relativa (%) en comparación con el grupo de control ± EEM (n= 10 heridas). Se estimó la significación estadística por la prueba de t de Student. *=p< 0,05, **=p <0,01, ***=p <0,001.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Cribado peptídico 1

Se diseñaron y ensayaron dos clases de péptidos derivados de lactoferrina. Se identificaron los péptidos activos en todas las clases.

Se diseñaron nuevas variantes peptídicas basándose en la actividad antiinflamatoria y antimicrobiana medida de péptidos que tienen secuencias similares a la SEQ ID NO:1. Además, se tuvieron en cuenta las consideraciones estructurales de las correspondientes secuencias de estos péptidos. En la práctica, esto significaba mantener y potenciar la helicidad de los péptidos. Para la primera ronda de cribado, se diseñaron nuevas variantes de péptidos de clase 1 mediante la introducción de motivos N-terminales y espaciados de leucina (i, i+3) e (i, i+4), ambos sugeridos por mejorar la estabilidad de hélice. Además, se modificó el carácter anfipático de las hélices mediante la inserción de aminoácidos cargados positivamente polares en posiciones específicas. Se diseñaron nuevas variantes de péptidos de clase 2 aumentando la carga positiva y las regiones hidrófobas de los péptidos. Por tanto, se aumentó el carácter anfipático de los péptidos. (Figura. 2). Basándose en los nuevos diseños, se ordenaron aproximadamente 50 péptidos como una colección PEPscreen (Sigma) y se ensayaron tanto la actividad

antiinflamatoria como antimicrobiana.

Tabla 1. Lista de péptidos ensayados en el cribado 1

Péptido: Secuencia SEQ ID NO:

Péptido 101: imagen7 SEQ ID NO: 6

Péptido 102: SEQ ID NO: 7

Péptido 103: SEQ ID NO: 8

Péptido 104: SEQ ID NO: 9

Péptido 105: imagen8 SEQ ID NO: 10

Péptido 106: imagen9 SEQ ID NO: 11

Péptido 107: SEQ ID NO: 12

Péptido 108: imagen10 SEQ ID NO: 13

Péptido 109: SEQ ID NO: 14

Péptido 110: SEQ ID NO: 15

Péptido 111: SEQ ID NO: 16

Péptido 112: SEQ ID NO: 17

Péptido 113: imagen11 SEQ ID NO: 18

Péptido 114: SEQ ID NO: 19

Péptido 115: imagen12 SEQ ID NO: 20

Péptido 117: SEQ ID NO: 21

Péptido 118: SEQ ID NO: 22

Péptido 119: SEQ ID NO: 23

Péptido 120: imagen13 SEQ ID NO: 24

Péptido 121: imagen14 SEQ ID NO: 25

Péptido 122: SEQ ID NO: 26

Péptido 123: SEQ ID NO: 27

Péptido 124: SEQ ID NO: 28

Péptido 125: SEQ ID NO: 29

Péptido 128: SEQ ID NO: 30

Péptido 129: SEQ ID NO: 31

Péptido 131: SEQ ID NO: 32

Péptido 133: imagen15 SEQ ID NO: 33

Péptido 134: SEQ ID NO: 34

Péptido 135: SEQ ID NO: 35

Péptido 136: SEQ ID NO: 36

Péptido 137: SEQ ID NO: 37

Péptido 138: imagen16 SEQ ID NO: 38

Péptido 139: imagen17 SEQ ID NO: 39

Péptido 140: SEQ ID NO: 40

Péptido 141: imagen18 SEQ ID NO: 41

Péptido 143: SEQ ID NO: 42

Péptido 144: SEQ ID NO: 43

Péptido 147: imagen19 SEQ ID NO: 44

Péptido 148: SEQ ID NO: 45

Péptido 149: SEQ ID NO: 46

Péptido 158: SEQ ID NO: 47

Se midió la actividad antiinflamatoria como la inhibición de la producción en TNF- en células THP-1 estimuladas por LPS

Se mantuvo la estirpe celular THP-1 (TIB-202; ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) correspondiente a monocitos

5 humanos en RPMI 1640 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria), piruvato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y HEPES 20 mM (PAA, Laboratories GmbH, Pasching, Austria).

Se ajustó la densidad celular a 106 células/ml y se añadieron 100 μI de la suspensión por pocillo a placas de cultivo celular de 96 pocillos (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Se trataron las células con PMA 10 ng/ml (12-miristato 1310 acetato de forboI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 48 horas para diferenciar los monocitos en células similares a macrófagos. Después de ello, se estimularon las células mediante la adición de lipopolisacárido 0,1 ng/ml (LPS; serotipo de E. coli O55:B5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) al medio especificado anteriormente excepto por contener FBS termoinactivado al 5 %. 30 minutos después de la adición de LPS, se añadieron los péptidos (40 μM) por triplicado. Después de 6 horas de incubación a +37 ºC, 5 % de CO2 y en atmósfera húmeda, se

15 recogieron los sobrenadantes celulares, se centrifugaron y se mantuvieron congelados a -20 ºC hasta analizar el contenido de TNF- por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Los resultados se presentan como secreción relativa media (%), fijando el nivel de TNF- estimulado sin péptido en 100 % y fijando la secreción basal en 0 % (Tabla 2).

Tabla 2. Efectos antiinflamatorios de los péptidos ensayados en el cribado 1

SEQ ID NO: Péptido TNF- a péptido 40 μM Clase

SEQ ID NO 23: 119 10 % 1

SEQ ID NO 21: 117 13 % 1

SEQ ID NO 19: 114 15 % 1

SEQ ID NO 18: 113 22 % 1

SEQ ID NO 25: 121 35 % 1

SEQ ID NO 14: 109 47 % 1

SEQ ID NO 24: 120 49 % 1

SEQ ID NO 32: 131 87 % 2

SEQ ID NO 10: 105 87 % 1

SEQ ID NO 31: 129 91 % 2

SEQ ID NO 47: 158 91 % 2

SEQ ID NO 11: 106 96 % 1

SEQ ID NO 36: 136 96 % 2

SEQ ID NO 17: 112 101 % 1

SEQ ID NO 15: 110 102 % 1

SEQ ID NO 35: 135 103 % 2

SEQ ID NO 30: 128 104 % 2

SEQ ID NO 12: 107 108 % 1

SEQ ID NO 6: 102 108 % 1

SEQ ID NO 34: 134 109 % 2

SEQ ID NO 46: 149 109 % 2

SEQ ID NO 41: 141 109 % 2

SEQ ID NO 44: 147 111 % 2

SEQ ID NO 22: 118 113 % 1

SEQ ID NO 6: 101 116 % 1

SEQ ID NO 40: 140 117 % 2

SEQ ID NO 20: 115 119 % 1

SEQ ID NO 16: 111 121 % 1

SEQ ID NO 13: 108 127 % 1

SEQ ID NO 28: 124 128 % 2

SEQ ID NO 9: 104 132 % 1

SEQ ID NO 45: 148 132 % 2

SEQ ID NO 33: 133 135 % 2

SEQ ID NO 8: 103 135 % 1

SEQ ID NO 37: 137 137 % 2

SEQ ID NO 43: 144 140 % 2

SEQ ID NO 39: 139 148 % 2

SEQ ID NO 29: 125 150 % 2

SEQ ID NO 42: 143 153 % 2

SEQ ID NO 27: 123 156 % 2

SEQ ID NO 38: 138 172 % 2

Se midió la actividad antimicrobiana como el efecto bactericida sobre S. aureus usando la concentración microbicida mínima, MMC99, ensayo)

Se transfirieron S. aureus (nº 1800; CCUG, Gotemburgo, Suecia) cultivadas en placas de agar sanguíneo [agar Columbia (Oxoid, Basingstoke, RU) suplementado con sangre de caballo desfibrinada al 5 % (National Veterinary Institute (SVA), Uppsala, Suecia)] a caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI al 3,7 %; Difco, BD Diagnostics,

Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se incubaron en un agitador a 250 rpm +37º C durante una noche. Se diluyó después de ello el cultivo 1:10 con caldo BHI reciente y se incubó durante 2 horas adicionales para alcanzar el crecimiento en fase logarítmica. Se sedimentaron las bacterias y se suspendieron en medio BHI al 1 % (caldo BHI diluido 100 veces en agua ultrapura) hasta una concentración de 107 bacterias/ml estimada midiendo la densidad óptica a 600 nm. Se 5 diluyeron en serie los péptidos en etapas de dos veces desde 160 μM hasta 1,25 μM en medio BHI al 1 %. Se incubaron después de ello los péptidos (100 μl) con bacterias (5 μl a 107 bact./ml) durante 2 horas a +37 ºC. Se pusieron gotas (5 μl) de la suspensión en placas de agar sanguíneo. Se incubaron las placas de agar sanguíneo durante una noche a 37 ºC. Se registraron los valores de MMC99, concretamente la concentración de péptido mínima necesaria para conseguir un 99 % de reducción de las bacterias viables (Tabla 3). Se confirmó la concentración de 10 la suspensión bacteriana usada en el ensayo por los recuentos viables en placas de agar sanguíneo.

Tabla 3. Efectos antibacterianos de los péptidos ensayados en el cribado 1

SEQ ID NO: Péptido MMC99 μM en medio BHI al 1 % Clase

SEQ ID NO 19: 114 2,5 1

SEQ ID NO 21: 117 2,5 1

SEQ ID NO 32: 131 5 2

SEQ ID NO 24: 120 10 1

SEQ ID NO 25: 121 10 1

SEQ ID NO 31: 129 10 2

SEQ ID NO 43: 144 10 2

SEQ ID NO 44: 147 10 2

SEQ ID NO 46: 149 13,3 2

SEQ ID NO 16: 111 20 1

SEQ ID NO 23: 119 20 1

SEQ ID NO 26: 122 20 2

SEQ ID NO 27: 123 20 2

SEQ ID NO 28: 124 20 2

SEQ ID NO 29: 125 20 2

SEQ ID NO 30: 128 20 2

SEQ ID NO 35: 135 20 2

SEQ ID NO 41: 141 20 2

SEQ ID NO 42: 143 20 2

SEQ ID NO 45: 148 20 2

SEQ ID NO 34: 134 40 2

SEQ ID NO 39: 139 45 2

SEQ ID NO 11: 106 160 1

SEQ ID NO 14: 109 160 1

SEQ ID NO 6: 101 >160 1

SEQ ID NO 7: 102 >160 1

SEQ ID NO 8: 103 >160 1

imagen20

Péptido 213: SEQ ID NO: 60

Péptido 214: SEQ ID NO: 61

Péptido 215: SEQ ID NO: 62

Péptido 216: SEQ ID NO: 63

Péptido 217: SEQ ID NO: 64

Péptido 218: SEQ ID NO: 65

Péptido 219: imagen21 SEQ ID NO: 66

Péptido 220: SEQ ID NO: 67

Péptido 221: imagen22 SEQ ID NO: 68

Péptido 222: SEQ ID NO: 69

Péptido 223: SEQ ID NO: 70

Péptido 225: SEQ ID NO: 71

Péptido 226: SEQ ID NO: 72

Péptido 227: imagen23 SEQ ID NO: 73

Péptido 228: SEQ ID NO: 74

Péptido 229: SEQ ID NO: 75

Péptido 230: imagen24 SEQ ID NO: 76

Péptido 231: imagen25 SEQ ID NO: 77

Péptido 232: SEQ ID NO: 78

Péptido 233: SEQ ID NO: 79

Péptido 234: imagen26 SEQ ID NO: 80

Péptido 235: SEQ ID NO: 81

Péptido 236: SEQ ID NO: 82

Péptido 237: SEQ ID NO: 83

Péptido 238: imagen27 SEQ ID NO: 84

Péptido 239: imagen28 SEQ ID NO: 85

Péptido 240: SEQ ID NO: 86

Péptido 241: SEQ ID NO: 87

Péptido 242: imagen29 SEQ ID NO: 88

Péptido 243: SEQ ID NO: 89

Péptido 244: SEQ ID NO: 90

Péptido 245: SEQ ID NO: 91

Péptido 246: SEQ ID NO: 92

Péptido 247: SEQ ID NO: 93

Péptido 248: SEQ ID NO: 94

Péptido 249: SEQ ID NO: 95

Péptido 255: SEQ ID NO: 96

Se midió la actividad antiinflamatoria como inhibición de la producción de TNF- en células THP-1 estimuladas por LPS

Se mantuvo la estirpe celular THP-1 (TIB-202; ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) correspondiente a monocitos 5 humanos, en RPMI 1640 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria), piruvato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y HEPES 20 mM (PAA, Laboratories GmbH, Pasching, Austria).

Se ajustó la densidad celular a 106 células/ml y se añadieron 100 μI de la suspensión por pocillo a placas de cultivo celular de 96 pocillos (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Se trataron las células con PMA 10 ng/ml (12-miristato 1310 acetato de forboI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 48 horas para diferenciar los monocitos en células similares a macrófagos. Después de ello, se estimularon las células mediante la adición de lipopolisacárido 0,1 ng/ml (LPS; serotipo de E. coli O55:B5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) al medio especificado anteriormente excepto por contener FBS termoinactivado al 5 %. 30 minutos después de la adición de LPS, se añadieron péptidos (40 μM, 10 μM y 4 μM) por triplicado. Después de 6 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes celulares,

15 se centrifugaron y se mantuvieron congelados a -20 ºC hasta analizar el contenido de TNF- por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Se presentan los resultados como secreción relativa media (%), fijándose el nivel de TNF- estimulado sin péptido en 100 % y fijándose la secreción basal en 0 % (Tabla 5).

Tabla 5. Efectos antiinflamatorios de los péptidos ensayados en el cribado 2

SEQ ID NO: Péptido TNF- a péptido 40 μM TNF- a péptido 10 μM TNF- a péptido 4 μM Clase

48: 201 128,6 % nd nd 1

49: 202 90,3 % nd nd 1

50: 203 98,1 % nd nd 1

51: 204 96,9 % nd nd 1

52: 205 28,3 % 89,5 % 91,5 % 1

53: 206 51,0 % 92,9 % 96,9 % 1

54: 207 160,9 % nd nd 1

55: 208 130,2 % nd nd 1

56: 209 23,6 % 68,2 % 88,0 % 1

57: 210 101,0 % nd nd 1

58: 211 62,8 % 89,8 % 100,7 % 1

59: 212 25,7 % 85,8 % 90,9 % 1

60: 213 84,4 % 125,5 % 110,3 % 1

61: 214 88,8 % nd nd 1

62: 215 1,3 % 69,6 % 86,6 % 1

63: 216 121,9 % nd nd 1

64: 217 103,0 % nd nd 1

65: 218 9,2 % 55,7 % 81,8 % 1

66: 219 7,3 % 44,0 % 68,5 % 1

67: 220 11,6 % 37,0 % 70,8 % 1

68: 221 94,4 % nd nd 1

69: 222 32,9 % 65,9 % 89,2 % 1

70: 223 104,4 % nd nd otra

71: 225 111,6 % nd nd 1 y 2

72: 226 108,7 % nd nd 1 y 2

73: 227 111,0 % nd nd 2

74: 228 53,6 % 95,4 % 106,6 % 2

75: 229 108,5 % nd nd 2

76: 230 80,4 % 135,6 % 119,2 % 2

77: 231 49,8 % 89,1 % 102,6 % 2

78: 232 33,2 % 66,6 % 96,9 % 2

79: 233 90,7 % nd nd 2

80: 234 102,0 % nd nd 2

81: 235 89,3 % nd nd 2

82: 236 94,4 % nd nd 2

83: 237 89,2 % nd nd 2

84: 238 76,5 % 89,2 % 83,9 % 2

85: 239 7,4 % 56,5 % 65,6 % 2

86: 240 40,1 % 59,9 % 78,3 % 2

87: 241 8,1 % 57,9 % 92,7 % 2

88: 242 116,8 % nd nd 2

89: 243 113,1 % nd nd 2

90: 244 10,7 % 116,7 % 107,7 % 2

91: 245 146,3 % nd nd 2

92: 246 125,5 % nd nd 2

93: 247 88,2 % nd nd 2

94: 248 24,2 % 80,2 % 87,1 % 2

95: 249 -0,7 % 78,0 % 91,2 % 2

96: 255 100,7 % nd nd otra

nd= no realizado

Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se incubaron en un agitador a 250 rpm +37º C durante una noche. Se diluyó después de ello el cultivo 1:10 con caldo BHI reciente y se incubó durante 2 horas adicionales para alcanzar el crecimiento en fase logarítmica. Se sedimentaron las bacterias y se suspendieron en medio BHI al 1 % (caldo BHI diluido 100 veces en agua ultrapura) hasta una concentración de 107 bacterias/ml estimada midiendo la densidad óptica a 600 nm.

5 Se diluyeron en serie los péptidos en etapas de dos veces desde 400 μM hasta 0,78 μM en medio BHI al 1 % o bien en fluido de herida simulado termoinactivado al 50 % [SWF, que contiene 1 parte de peptona al 0,1 % (Oxoid, Basingstoke, RU) en solución salina y 1 parte de suero fetal bovino, diluido 2 veces en agua ultrapura].

Se incubaron después de ello los péptidos (100 μl) con bacterias (5 μl a 107 bact./ml) durante 2 horas a +37 ºC. Se pusieron gotas (5 μl) de la suspensión en placas de agar sanguíneo. Se incubaron las placas de agar sanguíneo 10 durante una noche a 37 ºC. Se registraron los valores de MMC99, concretamente la concentración de péptido mínima necesaria para conseguir un 99 % de reducción de las bacterias viables (Tabla 6). Se confirmó la concentración de la suspensión bacteriana usada en el ensayo por los recuentos viables en placas de agar sanguíneo.

Tabla 6. Efectos antibacterianos de los péptidos ensayados en el cribado 2

SEQ ID NO: Péptido MMC99 μM en medio BHI al 1 % MMC99 μM en SWF al 50 % Clase

52: 205 12,5 50 1

53: 206 12,5 100 1

56: 209 12,5 100 1

58: 211 6,25 100 1

59: 212 12,5 100 1

60: 213 25 200 1

62: 215 6,25 25 1

65: 218 6,25 50 1

66: 219 6,25 12,5 1

67: 220 12,5 25 1

69: 222 12,5 100 1

70: 223 25 nd otra

74: 228 12,5 50 2

76: 230 25 100 2

77: 231 12,5 50 2

78: 232 12,5 25 2

84: 238 12,5 100 2

85: 239 12,5 25 2

86: 240 12,5 25 2

87: 241 12,5 25 2

90: 244 12,5 50 2

94: 248 25 50 2

95: 249 12,5 6,25 2

96: 255 25 nd otra

nd= no realizado

imagen30

Se analizaron los efectos antimicrobianos de los péptidos 232 (SEQ ID NO: 78) y 220 (SEQ ID NO: 67) por el ensayo de MMC99 (concentración microbicida mínima) contra S. aureus (CCUG 1800), MRSA (CCUG 41879), P. aeruginosa (ATCC 15442), E. coli (CCUG 31246), S. pyogenes (CCUG 4207), P. acnes (CCUG 1794T), S. epidermidis (ATCC12228), K. pneumoniae (ATCC 13883), A. baumannii (ATCC 19606) y C. albicans (ATCC 64549). Se

5 adquirieron los péptidos en Biopeptide Company (San Diego, CA, EE.UU.) y Bachem AG (Bubendorf, Suiza) y los resultados se presentan en la Tabla 8A y 8B respectivamente.

Se diluyeron en serie los péptidos en dos medios de ensayo diferentes, medio BHI al 1 % (medio de infusión de cerebro y corazón) o fluido de herida simulado (SWF) termoinactivado al 50 %, y después de ello se incubó con los microorganismos durante 2 horas. Se pusieron gotas de la suspensión en placas de agar sanguíneo. Se registraron

10 los valores de MMC99, concretamente la concentración peptídica mínima necesaria para conseguir un 99 % de reducción de los microorganismos viables. Como se presenta en la Tabla 8, todos los péptidos tienen la capacidad de destruir microorganismos que aparecen frecuentemente en infecciones.

Tabla 8A. Efecto antimicrobiano in vitro medido como MMC99 (μg/ml)

Péptido 232 (SEQ ID NO 78): Péptido 220 (SEQ ID NO 67)

BHI al 1 %: SWF al 50 % BHI al 1 % SWF al 50 %

S. aureus: 5 44 7 28

MRSA: 6 100 6 200

P. aeruginosa: 5 >176 7 >200

E. coli: 5 >176 3 >200

P. acnes: 6 >200 <3 100

S. pyogenes: <3 >200 <3 50

15 Tabla 8B. Efecto antimicrobiano in vitro medido como MMC99 (μg/ml)

Péptido 232 (SEQ ID NO 78)

BHI al 1 %: SWF al 50 %

S. epidermidis: 3 50

K. pneumoniae: 6 >200

A. baumanii: 3 200

C. albicans: 3 50

Ejemplo 4. Efecto antimicrobiano in vivo en el modelo de herida por extirpación en ratas

Se investigaron los efectos antimicrobianos in vivo del péptido 232 (SEQ ID NO: 78) y el péptido 220 (SEQ ID NO: 67) en un modelo de herida por extirpación en ratas. Se inocularon las heridas con S. aureus resistente a meticilina

20 (MRSA) durante 2 horas, seguido de una sola administración de péptido o control (H2O) durante 2 horas antes de la terminación y recolección de las bacterias. Todos los péptidos mostraban un pronunciado efecto antimicrobiano (Figura 4).

Ejemplo 5. Efecto antimicrobiano in vivo en heridas infectadas en cerdo

Se investigaron los efectos antimicrobianos del péptido 232 (SEQ ID NO: 78) y el péptido 220 (SEQ ID NO: 67) en

25 un modelo ex vivo en piel de cerdo. Se inocularon las heridas con S. aureus en presencia de PBS/suero 50/50. 2 horas después de la inoculación, se trataron las heridas con una sola administración del péptido o placebo (H2O). 4 horas después del tratamiento, se recolectaron las bacterias y se determinaron los recuentos viables de cada herida. Los resultados confirman los hallazgos en rata que indican que los péptidos son agentes antiinfecciosos altamente eficaces cuando se aplican localmente (Figura 5).

30 20

Claims

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