JP3347819B2 - 抗菌性ペプチドの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、抗菌性ペプチドの簡
易な精製方法に関するものである。さらに詳しくは、こ
の発明は、ラクトフェリン類の加水分解中に存在する抗
菌性ペプチド［以下、ラクトフェリシン（登録商標）と
記載することがある］の新しい精製方法に関するものあ
る。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質溶液に蛋白分解酵素または酸を添
加し、蛋白質を分解し、得られた種々のペプチドを含む
ペプチド混合液から所望のペプチドを分離、精製する方
法として、従来より、特定の分画分子量を有する膜を用
いる方法、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロ
マトグラフィー等）による方法、ゲル電気泳動による方
法等が広範に採用されている。

【０００３】これらのうち、特定の分画分子量を有する
膜を用いる方法は、例えば、分子量３，０００ダルトン
のペプチドを分別する場合、分画分子量３，０００以下
の膜を使用し、濃縮液側を分取するのが通例であり、こ
のような低分子量のペプチドの分別に高分子物質分別用
の膜を使用した例はない。また、クロマトグラフィーお
よびゲル電気泳動法は、一度に大量のペプチドを分離で
きないという問題がある。

【０００４】一方、蛋白質や酵素を分離、精製する方法
としては、親水性微多孔膜を使用して蛋白質を精製する
方法（特開平３−１６１４９７号公報）、蛋白質または
酵素を吸着剤に吸着させ、膜により分離し、のち脱着
し、再度膜により吸着剤とこれらとを分離して精製する
ＣＡＣＦＦ(continuous affinity cross flow filtrati
on）法（化学工学、第５６巻、第４号、第２６８ペー
ジ、１９９２年）、あるいはα−ラクトアルブミン含量
の高い乳分画を得るために、セラミックと高分子膜を使
用するクロスフロー精密瀘過法（特開平４−２０７１５
７号公報）等が知られている。しかしながら、これらの
方法は、高分子量の蛋白質または酵素については実施さ
れているが、例えば、分子量３，０００ダルトン程度の
低分子量のペプチドについては実施されていない。

【０００５】さらに、抗菌性ペプチドとして知られてい
るマガイニン２およびメリチンは、高塩濃度において会
合することが知られている［フェブス・レターズ(FEBS
Letters)、第２４７巻、第１号、第１７ページ、１９８
９年及びバイオケミストリー(Biochemistry)、第２１
巻、第４６１ページ、１９８２年］。また、抗菌性ペプ
チドであるコリシンＡは、塩濃度とは無関係に低いｐＨ
で会合することも知られている［ヨーロッピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal
of Biochemistry)、第１７２巻、第５０７ページ、１９
８８年］。しかしながら、これらの性質を利用してマガ
イニン２、メリチンまたはコリシンＡを分離、精製した
例は皆無である。

【０００６】ラクトフェリシンは、この発明の発明者ら
が、ラクトフェリン類の加水分解物から初めて単離した
抗菌性ペプチドであり、既に特許出願（特開平５−９２
９９４号。以下先願１と記載することがある）してい
る。またクロマトグラフ用担体を用いた吸着による大量
精製法についても、この発明の発明者らが既に特許出願
（特願平３−１５０６０４号。以下先願２と記載するこ
とがある）している。

【０００７】しかしながら、ラクトフェリシンが特定の
ｐＨおよび塩濃度において会合することは、従来知られ
ていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】種々のペプチドを含む
ペプチド混合液から目的とする低分子量のペプチドを分
離、精製する場合に、前記従来のペプチド精製方法や蛋
白質精製方法を利用すると、複雑かつ多数の工程が必要
となるため、ペプチドの製造費が高くなるという不都合
があった。しかも、これらの従来法は、ペプチドの工業
的規模における大量精製には適さないという欠点を有し
てもいる。

【０００９】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、従来方法の欠点を解消し、ラクトフ
ェリン類を加水分解して得られる分解液から低分子量の
ラクトフェリシンを、簡易に、大量に、かつ安価に製造
する方法を提供することを目的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】この発明の発明者らは、
前記先願２を出願後も、より優れた精製方法について鋭
意研究を行い、その結果、蛋白質を加水分解して得られ
る種々のペプチドを含むペプチド混合液のｐＨおよび塩
濃度を特定の値以下に調整することにより、ラクトフェ
リシンが会合すること、および低分子量のラクトフェリ
シンを見掛け上高分子の物質と同様に処理し得ることを
見出し、この発明を完成した。

【００１１】すなわち、この発明は、ラクトフェリン類
を加水分解して得られる分解液から抗菌性ペプチドを精
製する方法において、分解液のｐＨを５以下、塩濃度を
１００ｍＭ以下に調整し、のち高分子分画用の膜でペプ
チドを分別し、回収することを特徴とするペプチドの精
製方法を提供する。また、この発明の方法においては、
抗菌性ペプチドが、配列番号１〜配列番号５のアミノ酸
配列を有すること、および高分子分画用の膜が、分画分
子量６，０００ダルトン以上であることを好ましい態様
としてもいる。

【００１２】次にこの発明についてさらに詳しく説明す
る。この発明の出発物質であるラクトフェリン類は、哺
乳動物の乳汁から分離されたラクトフェリン、金属飽和
ラクトフェリン、アポラクトフェリン、金属を一部結合
したラクトフェリンまたはこれらの混合物であり、市販
品（例えば、森永乳業社製のウシラクトフェリン、シグ
マ社製のヒトラクトフェリン等）、ホエーから常法によ
り分離、精製したもの、これらを常法により処理したも
の（例えば、鉄等の金属で飽和したもの、鉄等の金属が
一部結合したもの、脱金属したもの等）またはこれらの
混合物であってもよい。これらのラクトフェリン類を精
製水に溶解し、使用する酵素による所定のｐＨに調整
し、市販の酵素（例えば、シグマ社製のブタペプシン
等）を添加し、所定の温度で所定時間常法により加水分
解を行う。また、ラクトフェリン類の加水分解は、先願
１および先願２に記載の方法により行うこともできる。

【００１３】次いで、ｐＨを中性に調整し、加熱して酵
素を失活させ、室温に冷却し、必要に応じて遠心分離
し、透明な上清を得る。この上清には、種々の分子量か
らなるペプチドが混在しており、ラクトフェリシンを分
離、精製するには従来方法では複雑かつ多数の工程を要
したが、この発明の場合には、次のように簡単な工程で
所望のラクトフェリシンを高純度で得ることができる。

【００１４】なお、酸により加水分解を行う場合には、
常法により加水分解を行い、のちｐＨを中性に調整し、
室温に冷却し、必要に応じて遠心分離し、以下次の方法
によりラクトフェリシンを高純度で得ることができる。
また、蛋白分解酵素により加水分解した場合は、酵素を
除去するために、ｐＨおよび塩濃度を調製する前に、５
を超えるｐＨおよび１００ｍＭ超える塩濃度において
（即ち、ラクトフェリシンが会合していない状態で）常
法により一度高分子の酵素を分別する処理（例えば、分
画分子量３，０００ダルトンの膜による分画等）を行う
こともできる。

【００１５】すなわち、以上の前処理を施したのち、必
要に応じて常法（例えば、透析用チューブ、ゲル瀘過
等）により上清を脱塩し、ｐＨを５以下、望ましくは２
〜３に調整し、塩濃度を１００ｍＭ以下、望ましくは０
〜１０ｍＭに調整する。ｐＨおよび塩濃度の調整は、稀
塩酸、稀硫酸、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩
等により行うことができるが、得られた上清のｐＨおよ
び塩濃度が前記の範囲内にある場合は、調整を行わない
こともあり得る。

【００１６】ｐＨおよび塩濃度を調整した溶液を、市販
の高分子分画用の膜、例えば、分画分子量６，０００ダ
ルトンのＳＩＰ−００１３（旭化成工業社製）、分画分
子量１０，０００ダルトンのＳＬＰ−００５３（旭化成
工業社製）、分画分子量３０，０００ダルトンのＵＦ−
３０ＰＳ（東ソー社製）等に通液してラクトフェリシン
を分別する。つまり、前記ｐＨおよび塩濃度の調整によ
りラクトフェリシンは会合し、見掛け上分子量１０，０
００ダルトン以上に高分子化しているので、この分別に
より会合していない低分子量のペプチドと容易に分離す
ることができる。また、このようにして分離したペプチ
ド溶液のｐＨを５よりも高く、塩濃度を１００ｍＭより
も高く調整することにより、ラクトフェリシンを脱会合
させ、ラクトフェリシンと他の高分子物質とを分別する
ことができる。

【００１７】分別したラクトフェリシンを、常法により
回収し、必要に応じて凍結乾燥し、ほぼ純粋のラクトフ
ェリシンを得ることができる。以上のようにして種々の
ペプチドが混在する中から目的とするラクトフェリシン
を簡単に分離、精製することができる。なお、この発明
の方法は、常法により粗精製したラクトフェリシンの高
度精製および少量のラクトフェリシンの精製にも適用で
きることは言うまでもない。

【００１８】次に試験例を示してこの発明の作用効果を
詳しく説明する。なお、以下の説明において百分率の表
示は、特に断りのない限り重量による値である。 試験例１ この試験は、分解液のｐＨおよび塩濃度の至適範囲を調
べるために行った。 １）ラクトフェリシンの調製 脱脂乳から分離したウシラクトフェリン（森永乳業社
製。純度約９０％）２．０ｋｇを５％（Ｗ／Ｖ）の濃度
で蒸留水に溶解し、１規定塩酸を添加してｐＨを３．０
に調整した。結晶ペプシン（ディフコ社製）を基質の３
％の割合で添加し、３７℃で４時間加水分解し、のち８
０℃に１５分間加熱してペプシンを失活させ、１規定水
酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整し、不溶
物を瀘過して除去し、噴霧乾燥し、ラクトフェリシンを
約４％含有する粉末状のペプチド混合物約１．９ｋｇを
得た。

【００１９】この粉末状のペプチド混合物２５６ｇを５
％（Ｗ／Ｖ）の濃度で蒸留水に溶解し、出発物質を調整
した。一方、約１０００ｍｌの疎水性担体［ブチル・ト
ヨパール（商標）。東ソー社製］６５０Ｍを水で十分洗
浄して平衡化し、攪拌機付きタンク内でこの疎水性担体
に出発物質を吸着させ、液を分離し、疎水性担体をカラ
ム（長さ２２ｃｍ、直径８ｃｍ）に充填し、分離した液
を再度カラムに通液し、のち洗浄液の２８０ｎｍにおけ
る吸光度が０．０６以下になるまで１００ｍｌ／分の流
速で水を用いてカラムを十分洗浄した。次いで１０ｍＭ
塩酸をカラムに通液し、ラクトフェリシンを溶出し、等
量のマッキルバイン緩衝液（０．１Ｍクエン酸１７７：
０．２モル第一リン酸ナトリウム８２４の混合物。ｐＨ
７．０）と混合し、疎水性担体に吸着させ、２，０００
ｍｌの同じ緩衝液で洗浄し、３，０００ｍｌのマッキル
バイン緩衝液（０．１Ｍクエン酸４８５：０．２Ｍ第一
リン酸ナトリウム５１５の混合物。ｐＨ５．０）でラク
トフェリシンを溶出させた。疎水性担体は１０ｍＭ塩酸
および水で再生し、１規定水酸化ナトリウム溶液で溶出
液のｐＨを７．０に調整し、再生したカラムに溶出液を
通液し、１０リットルの水で洗浄して緩衝液の塩を除去
し、のち１０ｍＭ塩酸をカラムに通液してラクトフェリ
シンを溶出し、凍結乾燥し、粉末状のラクトフェリシン
約３．５ｇを得た。 ２）試料の調整と試験方法 前記ラクトフェリシン５０ｍｇを、次の溶液２００ｍｌ
に溶解して６種類の試料を調製し、４℃で２時間静置
し、のちウルトラ・フィルトレーション膜モジュールＳ
ＥＰ−００１３（旭化成工業社製。ポリスルフォン膜、
分画分子量３，０００）を装着したフィルトレーション
・システムＰＳ−２４００１（旭化成工業社製）を用
い、室温、入力圧約１．０ｋｇ／ｃｍ² 、出力圧約０．
９ｋｇ／ｃｍ ² でダイアフィルトレーション処理した。

【００２０】濃縮液側の２８０ｎｍにおける吸収を測定
し、ラクトフェリシンの回収率を試験した。 試料１：１０ｍＭ塩酸、ｐＨ２．０ 試料２：１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ２．８ 試料３：１００ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ２．５ 試料４：１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ７．２ 試料５：マックイルバイン緩衝液（０．１Ｍクエン酸４
８５：０．２Ｍ第一リン酸ナトリウム５１５の混合物）
を塩酸でｐＨ２．５に調整 試料６：マックイルバイン緩衝液（０．１Ｍクエン酸４
８５：０．２Ｍ第一リン酸ナトリウム５１５の混合
物）、ｐＨ５．０ なお、マックイルバイン緩衝液の塩濃度は、約１２０ｍ
Ｍである。 ３）試験結果 この試験の結果は、図１に示したとおりである。図１
は、透過液量と回収率との関係を示し、縦軸および横軸
は、それぞれ回収率および透過液量を示し、図中○は試
料１、▲は試料２、□は試料３、▽は試料４、●は試料
５、◆は試料６をそれぞれ示す。この図１から明らかな
ように、塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつｐＨが５
以下である試料１、試料２および試料３において、濃縮
液側のラクトフェリシン回収率が顕著に高く、９０％以
上を示した。これに対して、塩濃度が低くてｐＨが高い
試料４、塩濃度が高くてｐＨが低い試料５および塩濃度
とｐＨがともに高い試料６では、濃縮液側のラクトフェ
リシンの回収率が低く、ラクトフェリシンが透過液側へ
ほぼ透過することが認められた。

【００２１】以上の結果から、この発明のラクトフェリ
シンの精製においては、塩濃度およびｐＨを上記の値よ
りも低く維持する必要がある。なお、上記範囲における
その他の塩濃度およびｐＨの条件においても、ほぼ同様
の結果が得られた。 試験例２ この試験は、分別に使用する膜の分画分子量と分別効率
の関係を調べるために行った。 １）ラクトフェリシンの調製 試験例１と同一の方法によりラクトフェリシンを調製し
た。 ２）試験方法 ラクトフェリシン粉末５０ｍｇを１０ｍＭ塩酸溶液２０
０ｍｌに溶解し、４℃で２時間静置し、下記の瀘過膜を
装着したフィルトレーション・システムＰＳ−２４００
１（旭化成工業社製）を用い、室温、入力圧約１．０ｋ
ｇ／ｃｍ² 、出力圧約０．９ｋｇ／ｃｍ² でダイアフィ
ルトレーション処理し、試験例１と同一の方法により回
収率を測定し、試験した。 方法１：ウルトラ・フィルトレーション膜モジュールＳ
ＥＰ−００１３（旭化成工業社製。ポリスルフォン膜、
分画分子量３，０００ダルトン） 方法２：ウルトラ・フィルトレーション膜モジュールＳ
ＩＰ−００１３（旭化成工業社製。ポリスルフォン膜、
分画分子量６，０００ダルトン） 方法３：ウルトラ・フィルトレーション膜モジュールＳ
ＬＰ−００５３（旭化成工業社製。ポリスルフォン膜、
分画分子量１０，０００ダルトン） ３）試験結果 この試験の結果は、図２に示したとおりである。図２
は、透過液量と回収率との関係を示し、縦軸および横軸
は、それぞれ回収率および透過液量を示し、図中○は方
法１（対照）、△は方法２、◆は方法３をそれぞれ示
す。この図２から明らかなように、分子量約３，０００
ダルトンのラクトフェリシンが分画分子量３，０００ダ
ルトンの膜を用いた方法１（対照）でよく分別されるの
は当然であるが、方法２および方法３の分画分子量６，
０００ダルトンおよび分画分子量１０，０００ダルトン
の膜を使用した場合も、よく分別されることが判明し
た。なお、他の高分子分画用の膜およびラクトフェリシ
ンを使用した場合も、ほぼ同様の結果が得られた。 試験例３ 実施例１で得たラクトフェリシンを６Ｎ塩酸で加水分解
し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を
分析した。同一の試料を気相シークエンサー（アプライ
ド・バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン
分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の配列を決定し
た。またＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロ
ベンゾイック・アシド））を用いたジスルフィド結合分
析法［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytic
al Biochemistry)、第６７巻、第４９３頁、１９７５
年］によりジスルフィド結合が存在することを確認し
た。

【００２２】その結果、このラクトフェリシンは、２５
個のアミノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステ
イン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残
基からＮ−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目の
システイン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸が、そ
れぞれ結合した配列番号２のアミノ酸配列を有している
ことが確認された。 試験例４ 実施例２で得たラクトフェリシンを用いたことを除き、
試験例３と同一の方法によりアミノ酸残基の配列を決定
した。

【００２３】その結果、このラクトフェリシンは、２５
個のアミノ酸残基からなり、４番目と２１番目のシステ
イン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残
基からＮ−末端側に３個のアミノ酸残基が、２１番目の
システイン残基からＣ−末端側に４個のアミノ酸が、そ
れぞれ結合した配列番号１のアミノ酸配列を有している
ことが確認された。 試験例５ 試験例７と同一の逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り、実施例３で得たラクトフェリシンから２種のラクト
フェリシンを分離した。一方のラクトフェリシンには３
２回のエドマン分解を行ったこと、他のラクトフェリシ
ンには３８回のエドマン分解を行ったことを除き、試験
例３と同一の方法によりアミノ酸残基の配列を決定し
た。

【００２４】その結果、１つのラクトフェリシンは、３
８個のアミノ酸残基からなり、１６番目と３３番目のシ
ステイン残基がジスルフィド結合した配列番号３のアミ
ノ酸配列を有しており、他のラクトフェリシンは、３２
個のアミノ酸残基からなり、１０番目と２７番目のシス
テイン残基がジスルフィド結合した配列番号４のアミノ
酸配列を有していることが確認された。 試験例６ 実施例４で得たラクトフェリシンを用いたことおよび４
７回のエドマン分解を行ったことを除き、試験例３と同
一の方法によりアミノ酸残基の配列を決定した。その結
果、このラクトフェリシンは、４７個のアミノ酸残基か
らなり、９番目と２６番目のシステイン残基がジスルフ
ィド結合し、Ｃ−末端側の３５番目のシステイン残基が
ジスルフィド結合してシステイン残基を含む１１個のア
ミノ酸残基と結合した配列番号５のアミノ酸配列を有し
ていることが確認された。試験例７この試験は、膜処理
におけるラクトフェリシンの選択性を調べるために行っ
た。 １）試料の調製 実施例１と同一の方法によりラクトフェリシンを製造し
た。ただし、ウルトラ・フィルトレーション膜モジュー
ルＳＬＰ−００５３（旭化成工業社製。ポリスルフォン
膜、分画分子量１０，０００）で膜処理したときに、濃
縮液側および透過液側の試料を採取した。 ２）試験方法 採取した各試料を、次の条件による逆相高速液体クロマ
トグラフィーにかけ、カラムからの溶出液の２１８ｎｍ
における吸光度を連続的に測定し、自動的に記録し、両
試料のクロマトグラムから膜処理の特異性を試験した。
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ１２０Ｔ（東ソー社製。６．０
×１５０ｍｍ） 溶出液：溶出液Ａ（０．０５％トリフルオロ酢酸）と溶
出液Ｂ（９０％アセトニトリルの０．０５％トリフルオ
ロ酢酸液）との比率８０：２０の混合液を０．８ｍｌ／
分の流速で５分間通液し、３０分を要して両液の比率を
４０：６０までリニア・グラジエントで変化させて同一
流速で通液した。 ３）試験結果 この試験の結果は、図３および図４に示したとおりであ
る。図３および図４は、濃縮液側および透過液側の逆相
高速液体クロマトグラムであり、縦軸および横軸は、そ
れぞれ吸光度および時間を示す。図３から明らかなよう
に、高分子化したラクトフェリシンは、膜を透過する割
合が顕著に少なく濃縮液側に残留しているのに対して、
図４から明らかなように、高分子化していない夾雑ペプ
チドの多くは膜を透過している。従って、この発明の方
法によりラクトフェリシンが、高度に精製されることが
明らかである。なお、他の膜およびラクトフェリシンを
使用した場合も、ほぼ同様の結果が得られた。

【００２５】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の実施例に
限定されるものではない。

【００２６】

【実施例】

実施例１ 市販のウシラクトフェリン（シグマ社製）５０ｇを精製
水０．９ｌに溶解し、０．１Ｍ塩酸でｐＨを２．５に調
整し、のち市販のブタペプシン（シグマ社製）１．０ｇ
を添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１
規定の水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０
℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、
１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清
を得た。この上清にマックイルバイン緩衝液を０．１容
量添加し、ｐＨを５．５、ナトリウム塩濃度を１２０ｍ
Ｍに調整し、ウルトラ・フィルトレーション膜モジュー
ルＳＩＰ−００１３（旭化成工業社製。ポリスルフォン
膜、分画分子量６，０００ダルトン）を装着したフィル
トレーション・システムＰＳ−２４００１（旭化成工業
社製）を用いて室温、入力圧約１．０ｋｇ／ｃｍ² 、出
力圧約０．９ｋｇ／ｃｍ² でダイアフィルトレーション
処理し、透過液を得た。

【００２７】この透過液を透析用チューブ（フナコシ社
製。ＦＥ−０５２１−０５、分画分子量１，０００ダル
トン）で脱塩し、瀘過液のｐＨを稀塩酸で２．０に調整
し（塩濃度は、ほぼ０ｍＭ）、のちウルトラ・フィルト
レーション膜モジュールＳＬＰ−００５３（旭化成工業
社製。ポリスルフォン膜、分画分子量１０，０００）を
装着したフィルトレーション・システムＰＳ−２４００
１（旭化成工業社製）を用い、室温、入力圧約１．０ｋ
ｇ／ｃｍ² 、出力圧約０．９ｋｇ／ｃｍ² でダイアフィ
ルトレーション処理し、十分水洗し、濃縮液側を真空乾
燥し、ラクトフェリシン約１．８ｇを得た。 実施例２ 市販のヒトラクトフェリン（シグマ社製）１００ｍｇを
１０ｍＭリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解したこと、市販
のＶ８プロテアーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を
３．０ｍｇ用いたこと、３７℃で８時間加水分解したこ
とおよび脱塩した透過液のｐＨをクエン酸緩衝液で３．
０に、塩濃度を１０ｍＭに調整したことを除き、実施例
１と同一の方法によりラクトフェリシン約５ｍｇを得
た。

【００２８】得られたラクトフェリシンを試験例７と同
一の逆相高速液体クロマトグラフィーにより試験した結
果、回収率は、約１００％であった。 実施例３ 市販のウシラクトフェリン（ベルギーのオレオフィナ社
製）５００ｇを精製水１０．０ｌに溶解し、１Ｍの塩酸
でｐＨを２．０に調整し、１２０℃で１５分間加熱して
加水分解し、のち室温に冷却し、以下実施例１と同一の
方法によりラクトフェリシン約２２ｇを得た。

【００２９】得られたラクトフェリシンを試験例７と同
一の逆相高速液体クロマトグラフィーにより試験した結
果、回収率は、約９０％であり、２種のペプチドの混合
物であった。 実施例４ 市販のヒトラクトフェリン（シグマ社製）１００ｍｇを
精製水２．０ｍｌに溶解したこと、０．１規定塩酸でｐ
Ｈを２．５に調整したこと、市販のブタペプシン（シグ
マ社製）２．０ｍｇを添加したこと、３７℃で５時間加
水分解したこと、および脱塩した透過液のｐＨをクエン
酸緩衝液で２．５に、塩濃度を１００ｍＭに調整したこ
とを除き、実施例１と同一の方法によりラクトフェリシ
ン約４．５ｍｇを得た。

【００３０】得られたラクトフェリシンを試験例７と同
一の逆相高速液体クロマトグラフィーにより試験した結
果、回収率は、約１００％であった。

【００３１】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって以下の効果が奏せられる。 (1) 種々のペプチドが混在する中から目的とする低分子
量の抗菌性ペプチドを、簡便な方法により高純度で精製
することができる。 (2) 抗菌性ペプチドを大量に、かつ安価に製造すること
ができる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：下記配列において、４番の Cysと２１番の
Cysとがジスルフィド結合している。

【００３３】 配列： Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg 1 5 10 15 Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp 20 25 配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：下記配列において、３番の Cysと２０番の
Cysとがジスルフィド結合している。

【００３４】 配列： Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala 1 5 10 15 Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe 20 25 配列番号：３ 配列の長さ：３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：下記配列において、１６番の Cysと３３番
の Cysとがジスルフィド結合している。

【００３５】 配列： Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln Pro Glu Trp Phe Lys 1 5 10 15 Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser 20 25 30 Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe 35 配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：下記配列において、１０番の Cysと２７番
の Cysとがジスルフィド結合している。

【００３６】 配列： Thr Ile Ser Gln Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp 1 5 10 15 Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg 20 25 30 Ala Phe 配列番号：５ 配列の長さ：４７ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：下記配列において、配列の長さ３６であっ
て、９番、２６番、及び３５番に Cysを有するペプチド
の、９番の Cysと２６番のCysとがジスルフィド結合
し、下記配列の長さ３６のペプチドの３５番の Cysが、
配列の長さ１１であって１０番に Cysを有するペプチド
の１０番の Cysとがジスルフィド結合している。

【００３７】 配列： Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn 1 5 10 15 Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp 20 25 30 Ser Pro Ile Gln Cys Ile 35 Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＨおよび塩濃度による透過液量と回収率との
関係を示す。

【図２】分別に使用する膜の分画分子量の相違による透
過液量と回収率との関係を示す。

【図３】濃縮液側の逆相高速液体クロマトグラムであ
る。

【図４】透過液側の逆相高速液体クロマトグラムであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) テーマコード４Ｈ０４５

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトフェリン類を加水分解して得られ
   る分解液から抗菌性ペプチドを精製する方法において、
   分解液のｐＨを５以下、塩濃度を１００ｍＭ以下に調整
   し、のち高分子分画用の膜でペプチドを分別し、回収す
   ることを特徴とする抗菌性ペプチドの精製方法。
2. 【請求項２】 抗菌性ペプチドが、配列番号１〜配列番
   号５のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１の
   抗菌性ペプチドの精製方法。
3. 【請求項３】 高分子分画用の膜が、分画分子量６，０
   ００ダルトン以上である請求項１または２の抗菌性ペプ
   チドの精製方法。