JP3403066B2 - 牛乳あるいは牛乳誘導物から細胞増殖因子あるいは１種または２種以上の細胞増殖因子を含む組成物を回収する方法 - Google Patents
牛乳あるいは牛乳誘導物から細胞増殖因子あるいは１種または２種以上の細胞増殖因子を含む組成物を回収する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は牛乳あるいは牛乳誘
導物から細胞増殖因子あるいは１種または２種以上の細
胞増殖因子を含む組成物を回収する方法に関する。
導物から細胞増殖因子あるいは１種または２種以上の細
胞増殖因子を含む組成物を回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】牛乳は、所謂マクロ栄養素（脂肪、タン
パク質、炭化水素）以外に特殊機能を有する多数の微量
成分を含む。それらの内最もよく知られているものはラ
クトフェリンおよびラクトパーオキシダーゼであるが、
各種の細胞増殖因子もまたこの微量成分に属している。
パク質、炭化水素）以外に特殊機能を有する多数の微量
成分を含む。それらの内最もよく知られているものはラ
クトフェリンおよびラクトパーオキシダーゼであるが、
各種の細胞増殖因子もまたこの微量成分に属している。
【０００３】ラクトフェリンおよびラクトパーオキシダ
ーゼは工業的規模で牛乳あるいは乳製品から多量に回収
し得る。米国特許第５，５９６，０８２号には、牛乳あ
るいは牛乳生成物をカチオン交換体に大なる表面速度
（時間当たり５００ｃｍ以上）で且つ大なる液荷重（時
間当たり１００〜６００ベッド ボリュウム）で通過さ
せてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼをカチ
オン交換体に吸着させ、次いで該カチオン交換体を各種
濃度の多数の塩溶液で溶出せしめる方法が記載されてい
る。こうしてラクトフェリン含有画分とラクトパーオキ
シダーゼ含有画分が得られ、それを更に常法で処理する
のである。
ーゼは工業的規模で牛乳あるいは乳製品から多量に回収
し得る。米国特許第５，５９６，０８２号には、牛乳あ
るいは牛乳生成物をカチオン交換体に大なる表面速度
（時間当たり５００ｃｍ以上）で且つ大なる液荷重（時
間当たり１００〜６００ベッド ボリュウム）で通過さ
せてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼをカチ
オン交換体に吸着させ、次いで該カチオン交換体を各種
濃度の多数の塩溶液で溶出せしめる方法が記載されてい
る。こうしてラクトフェリン含有画分とラクトパーオキ
シダーゼ含有画分が得られ、それを更に常法で処理する
のである。
【０００４】牛乳および牛乳誘導物中に存在する細胞増
殖因子群はそれぞれ異なる極めて特異的な作用活性を有
している。これらの作用、その特性は細胞増殖因子の名
称により示されていることが多い、は人で有効である。
傷での皮膚回復促進に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を用
いることが提案されている。インスリン様成長因子（Ｉ
ＧＦ）は骨形成代謝で重要な役割を果たすものと考えら
れている。血管細胞増殖を誘因すると考えられているア
ンジオゲニンも細胞増殖因子群に属するものと考えられ
ている。
殖因子群はそれぞれ異なる極めて特異的な作用活性を有
している。これらの作用、その特性は細胞増殖因子の名
称により示されていることが多い、は人で有効である。
傷での皮膚回復促進に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を用
いることが提案されている。インスリン様成長因子（Ｉ
ＧＦ）は骨形成代謝で重要な役割を果たすものと考えら
れている。血管細胞増殖を誘因すると考えられているア
ンジオゲニンも細胞増殖因子群に属するものと考えられ
ている。
【０００５】牛乳中に存在する細胞増殖因子の研究がデ
ィーシェイムスによりエンドクリンレギュレーションズ
２８巻（１９９４）、３−８頁に、またシー イー
グロヴェノア 等によりエンドクリン レビューズ １
４巻（１９９２）７１０−７２８頁に記載されている。
後者にはさらに、牛乳中に存在するホルモン類の定性的
研究も報告されている。
ィーシェイムスによりエンドクリンレギュレーションズ
２８巻（１９９４）、３−８頁に、またシー イー
グロヴェノア 等によりエンドクリン レビューズ １
４巻（１９９２）７１０−７２８頁に記載されている。
後者にはさらに、牛乳中に存在するホルモン類の定性的
研究も報告されている。
【０００６】文献には牛乳からラクトフェリンおよびラ
クトパーオキシダーゼ以外の他の微量成分を単離するた
めの種々の方法が記載されている。
クトパーオキシダーゼ以外の他の微量成分を単離するた
めの種々の方法が記載されている。
【０００７】欧州特許０５５６０８３号には所謂分泌成
分を単離する方法が記載されている。この方法に従え
ば、牛乳あるいは牛乳誘導物がカチオン交換体に吸着せ
しめられ、次いで各種濃度の塩溶液で溶離せしめること
により種々の画分が得られる。分泌成分を含む画分以外
に、この方法でラクトフェリン含有画分およびラクトパ
ーオキシダーゼ含有画分が得られる。しかしながら吸着
に長い接触時間が必要であること、および処理量割合が
低いためこの方法は工業的実施には適していない。
分を単離する方法が記載されている。この方法に従え
ば、牛乳あるいは牛乳誘導物がカチオン交換体に吸着せ
しめられ、次いで各種濃度の塩溶液で溶離せしめること
により種々の画分が得られる。分泌成分を含む画分以外
に、この方法でラクトフェリン含有画分およびラクトパ
ーオキシダーゼ含有画分が得られる。しかしながら吸着
に長い接触時間が必要であること、および処理量割合が
低いためこの方法は工業的実施には適していない。
【０００８】ＷＯ−Ａ−９５／２６９８４には予め加熱
されたチーズ ホエーあるいはスキムミルクから出発し
ウシ インスリン様成長因子−１を含む組成物を製造す
る方法が記載されている。しかしながらこの方法で単離
せられる細胞増殖因子の種類ならびに量は限られてい
る。
されたチーズ ホエーあるいはスキムミルクから出発し
ウシ インスリン様成長因子−１を含む組成物を製造す
る方法が記載されている。しかしながらこの方法で単離
せられる細胞増殖因子の種類ならびに量は限られてい
る。
【０００９】欧州特許０４８９８８４号には細胞増殖因
子が天然的に多い原料である初乳から細胞増殖因子を単
離する方法が記載されている。この方法では種々のカラ
ムパッキングを用いた多数の連続クロマトグラフ工程群
を必要とする。この方法に従えば、存在する細胞増殖因
子の半分しか回収し得ないようである。
子が天然的に多い原料である初乳から細胞増殖因子を単
離する方法が記載されている。この方法では種々のカラ
ムパッキングを用いた多数の連続クロマトグラフ工程群
を必要とする。この方法に従えば、存在する細胞増殖因
子の半分しか回収し得ないようである。
【００１０】ＷＯ−Ａ ９５２９９３３にはｐＨ ２〜
３での酸変成細胞増殖因子の単離が記載されている。こ
の方法では、所望の、しかしまた特には望ましからざる
変成が生じる。
３での酸変成細胞増殖因子の単離が記載されている。こ
の方法では、所望の、しかしまた特には望ましからざる
変成が生じる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】そこで牛乳あるいは牛
乳誘導物から１種あるいは２種以上の細胞増殖因子を高
収率で回収しうる方法を提供することが本発明目的であ
る。本発明の別の目的は牛乳あるいは牛乳誘導物から１
種あるいは２種以上の細胞増殖因子を回収する方法であ
って、ラクトフェリンおよびラクトパーオキシダーゼの
工業的回収方法と組み合わすことが出来、しかもラクト
フェリンならびにラクトパーオキシダーゼの収率になん
ら悪影響を及ぼすこと無く細胞増殖因子の回収が可能で
ある方法を提供するにある。
乳誘導物から１種あるいは２種以上の細胞増殖因子を高
収率で回収しうる方法を提供することが本発明目的であ
る。本発明の別の目的は牛乳あるいは牛乳誘導物から１
種あるいは２種以上の細胞増殖因子を回収する方法であ
って、ラクトフェリンおよびラクトパーオキシダーゼの
工業的回収方法と組み合わすことが出来、しかもラクト
フェリンならびにラクトパーオキシダーゼの収率になん
ら悪影響を及ぼすこと無く細胞増殖因子の回収が可能で
ある方法を提供するにある。
【００１２】かかる目的達成の可能性ある方法はカチオ
ン交換体に牛乳あるいは牛乳誘導物から細胞増殖因子群
を吸着させ、次いでこのカチオン交換体の分別溶離を実
施するものであろう。しかしながら、こうして得られる
細胞増殖因子に富む画分の後処理に問題のあることが判
明した。
ン交換体に牛乳あるいは牛乳誘導物から細胞増殖因子群
を吸着させ、次いでこのカチオン交換体の分別溶離を実
施するものであろう。しかしながら、こうして得られる
細胞増殖因子に富む画分の後処理に問題のあることが判
明した。
【００１３】カチオン交換体に吸着させ、次いで溶出せ
しめた画分は通常いくつかの後処理、例えば脱塩、濃
縮、存在する細菌の除去および／または殺菌、乾燥に付
される。こう言った処理を行うと一方では許容し難いほ
ど多量の細胞増殖因子が失われ、また他方ではフィルタ
ー、イオン交換体等上記処理を実施するに要する装置を
極短時間使用した後、常にクリーニングするおよび／ま
たは取り替える必要があることが判っている。
しめた画分は通常いくつかの後処理、例えば脱塩、濃
縮、存在する細菌の除去および／または殺菌、乾燥に付
される。こう言った処理を行うと一方では許容し難いほ
ど多量の細胞増殖因子が失われ、また他方ではフィルタ
ー、イオン交換体等上記処理を実施するに要する装置を
極短時間使用した後、常にクリーニングするおよび／ま
たは取り替える必要があることが判っている。
【００１４】従って、本発明のさらに別の目的は牛乳あ
るいは牛乳誘導物から１種あるいは２種以上の細胞増殖
因子を回収する方法で、細胞増殖因子に富む画分の後処
理で細胞増殖因子の収率に殆ど影響しないような方法を
提供するにある。さらに別の目的は細胞増殖因子を、そ
れらが牛乳中に天然に存在するままの形で、変成なくあ
るいは実質的に変成を生じることなく単離せしめること
にある。
るいは牛乳誘導物から１種あるいは２種以上の細胞増殖
因子を回収する方法で、細胞増殖因子に富む画分の後処
理で細胞増殖因子の収率に殆ど影響しないような方法を
提供するにある。さらに別の目的は細胞増殖因子を、そ
れらが牛乳中に天然に存在するままの形で、変成なくあ
るいは実質的に変成を生じることなく単離せしめること
にある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は前記の後処理を
ｐＨ３．０より大なる弱酸性条件下で実施すると上述の
諸目的が達成せられるとの驚くべき発見に基づいてい
る。本発明に従えば、牛乳あるいは牛乳誘導物から少な
くとも１種の細胞増殖因子をカチオン交換体に吸着さ
せ、このカチオン吸着体を分別溶出せしめて細胞増殖因
子群に富む少なくとも１つの画分を得、次いでこの画分
を３．５から４．５以下のｐＨで後処理することによ
り、上記諸目的が後処理で通常認められる問題なしに、
達成せられるのである。
ｐＨ３．０より大なる弱酸性条件下で実施すると上述の
諸目的が達成せられるとの驚くべき発見に基づいてい
る。本発明に従えば、牛乳あるいは牛乳誘導物から少な
くとも１種の細胞増殖因子をカチオン交換体に吸着さ
せ、このカチオン吸着体を分別溶出せしめて細胞増殖因
子群に富む少なくとも１つの画分を得、次いでこの画分
を３．５から４．５以下のｐＨで後処理することによ
り、上記諸目的が後処理で通常認められる問題なしに、
達成せられるのである。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明に従い、細胞増殖因子に富
む画分の処理をｐＨ少なくとも３．５，より好ましくは
４から４．５以下で実施すると上述の諸問題は生ぜず、
従って後処理で細胞増殖因子の損失が無く、細胞増殖因
子の収率が極めて大となることが見いだされている。ま
た後処理で細胞増殖因子の変成は生ぜず、あるいは極め
て少ない。フィルター（もし、使用した場合）、および
／またはイオン交換体は、沈泥でうまることが無く、従
って長時間使用可能である。驚くべきことに酸性条件下
で作業しても細胞増殖因子ならびにその収率に殆どなん
らの悪影響も及ぼさない。
む画分の処理をｐＨ少なくとも３．５，より好ましくは
４から４．５以下で実施すると上述の諸問題は生ぜず、
従って後処理で細胞増殖因子の損失が無く、細胞増殖因
子の収率が極めて大となることが見いだされている。ま
た後処理で細胞増殖因子の変成は生ぜず、あるいは極め
て少ない。フィルター（もし、使用した場合）、および
／またはイオン交換体は、沈泥でうまることが無く、従
って長時間使用可能である。驚くべきことに酸性条件下
で作業しても細胞増殖因子ならびにその収率に殆どなん
らの悪影響も及ぼさない。
【００１７】本発明方法の出発物質として適当なものは
細胞増殖因子群を含む牛乳ならびに牛乳誘導物、例えば
チーズホエー、あるいはカゼインホエーである。好まし
い出発物質は牛乳である、というのは牛乳は多量の細胞
増殖因子を含み且つ大量に入手可能であるからである。
細胞増殖因子群を含む牛乳ならびに牛乳誘導物、例えば
チーズホエー、あるいはカゼインホエーである。好まし
い出発物質は牛乳である、というのは牛乳は多量の細胞
増殖因子を含み且つ大量に入手可能であるからである。
【００１８】好ましくは、出発物質は先ず最小限の加熱
処理に付される。かかる加熱処理で牛乳中に自然に存在
する細菌の大部分が殺されるのでこの処理が有利であ
る。この最小限の加熱処理は最大８０℃迄の温度で数秒
間以内の加熱を意味する。
処理に付される。かかる加熱処理で牛乳中に自然に存在
する細菌の大部分が殺されるのでこの処理が有利であ
る。この最小限の加熱処理は最大８０℃迄の温度で数秒
間以内の加熱を意味する。
【００１９】また 出発物質を吸着並びに溶出工程に付
すに先立ちストリッピングして脂肪を除去することが極
めて有利である。脱脂後はカチオン交換体を充填したカ
ラムが、カチオン交換体への吸着工程中で油よごれある
いは目づまりすることがないことが見いだされた。これ
はカラムの望ましからざる圧力増大並びに吸着サイクル
の望ましからざる短縮を防止する。
すに先立ちストリッピングして脂肪を除去することが極
めて有利である。脱脂後はカチオン交換体を充填したカ
ラムが、カチオン交換体への吸着工程中で油よごれある
いは目づまりすることがないことが見いだされた。これ
はカラムの望ましからざる圧力増大並びに吸着サイクル
の望ましからざる短縮を防止する。
【００２０】精密濾過により脱脂することが好ましい、
というのはこうすると出発物質の微生物汚染を同時に減
少せしめうるからである。ここで精密濾過とは０．１〜
１０μｍの開孔を有するフィルターを用いての濾過を意
味する。
というのはこうすると出発物質の微生物汚染を同時に減
少せしめうるからである。ここで精密濾過とは０．１〜
１０μｍの開孔を有するフィルターを用いての濾過を意
味する。
【００２１】牛乳あるいは牛乳誘導物からの成分が吸着
せしめられるカチオン交換体は当業者周知の任意の通常
のカチオン交換体でありうる。平均粒子径が１００μｍ
以上で、高圧に耐える十分な機械的強度を有するカチオ
ン交換体を用いることが好ましい。そうすると、カチオ
ン交換体は結合力を保持しつつ高い液体荷重に耐え、従
って工業的実施可能な方法に要求せられる大量の液体
を、所望の短時間内に圧入することができるとの利点が
得られる。好適なカチオン交換体の例はトーヨーパール
ＭＤ−Ｐ ＳＰ，ＳＰ−トーヨーパール、ＳＰ−セフ
ァローズおよびセファローズ ビッグ ビーズである。
せしめられるカチオン交換体は当業者周知の任意の通常
のカチオン交換体でありうる。平均粒子径が１００μｍ
以上で、高圧に耐える十分な機械的強度を有するカチオ
ン交換体を用いることが好ましい。そうすると、カチオ
ン交換体は結合力を保持しつつ高い液体荷重に耐え、従
って工業的実施可能な方法に要求せられる大量の液体
を、所望の短時間内に圧入することができるとの利点が
得られる。好適なカチオン交換体の例はトーヨーパール
ＭＤ−Ｐ ＳＰ，ＳＰ−トーヨーパール、ＳＰ−セフ
ァローズおよびセファローズ ビッグ ビーズである。
【００２２】好ましくは、カチオン交換体はｐＨ５．５
〜７．５のフォスフェート バッファーで予め調整して
おく。牛乳あるいは牛乳誘導物を例えばポンプ送りでカ
チオン交換体充填カラム中に送り込み、微量成分を出発
物質からカチオン交換体に吸着せしめる。この吸着は１
０℃以下の温度で実施し、細菌繁殖を最小限ならしめる
ことが好ましい。
〜７．５のフォスフェート バッファーで予め調整して
おく。牛乳あるいは牛乳誘導物を例えばポンプ送りでカ
チオン交換体充填カラム中に送り込み、微量成分を出発
物質からカチオン交換体に吸着せしめる。この吸着は１
０℃以下の温度で実施し、細菌繁殖を最小限ならしめる
ことが好ましい。
【００２３】本発明の好ましい一具体例によれば、出発
物質が大なる表面速度（毎時５００ｃｍ以上）で且つ大
なる液体荷重（毎時１００〜６００ ベッド ボリュー
ム）で、上記米国特許第５，５９６，０８２号記載の如
く、平均粒子径１００〜３００μｍのカチオン交換体上
にポンプ送りされる。この具体例に従えば工業的規模で
の実施が可能で経済的見地から極めて有利な吸着が実施
せられる。
物質が大なる表面速度（毎時５００ｃｍ以上）で且つ大
なる液体荷重（毎時１００〜６００ ベッド ボリュー
ム）で、上記米国特許第５，５９６，０８２号記載の如
く、平均粒子径１００〜３００μｍのカチオン交換体上
にポンプ送りされる。この具体例に従えば工業的規模で
の実施が可能で経済的見地から極めて有利な吸着が実施
せられる。
【００２４】この吸着工程の後、カチオン交換体充填カ
ラムをｐＨ５．５〜７．５にバッファーされ、塩濃度
０．２モル以下の塩（ＮａＣｌ）溶液で洗浄して残存牛
乳（出発物質）を洗い流すことが好ましい。
ラムをｐＨ５．５〜７．５にバッファーされ、塩濃度
０．２モル以下の塩（ＮａＣｌ）溶液で洗浄して残存牛
乳（出発物質）を洗い流すことが好ましい。
【００２５】出発物質をイオン交換樹脂に吸着させた
後、分別溶出が実施せられる。この場合種々の溶離液で
順次溶出がおこなわれ、種々の微量成分組成物を含む多
数の画分が得られる。
後、分別溶出が実施せられる。この場合種々の溶離液で
順次溶出がおこなわれ、種々の微量成分組成物を含む多
数の画分が得られる。
【００２６】好ましくはｐＨ５．５〜７．５，好ましく
は約６．５にバッファーされた各種塩溶液を用い少なく
とも３つの溶離工程が実施せられる。塩濃度を順次高く
した塩溶液を使用することにより牛乳あるいは牛乳誘導
物からの別々の微量成分に富む画分が順次得られる。
は約６．５にバッファーされた各種塩溶液を用い少なく
とも３つの溶離工程が実施せられる。塩濃度を順次高く
した塩溶液を使用することにより牛乳あるいは牛乳誘導
物からの別々の微量成分に富む画分が順次得られる。
【００２７】低ＮａＣｌ濃度例えば０．１５〜０．２５
モルの溶液で溶出せしめると実質的にラクトパーオキシ
ダーゼを含む画分が得られる。次により高濃度例えば
０．２５〜０．５モルのＮａＣｌ溶液で溶出せしめると
細胞増殖因子に富む画分で、少量のラクトパーオキシダ
ーゼおよびラクトフェリンを含むものが得られる。最後
により高濃度例えば０．７〜１．２モルのＮａＣｌ溶液
を用い溶出せしめると、実質的にラクトフェリンを含む
画分が得られる。
モルの溶液で溶出せしめると実質的にラクトパーオキシ
ダーゼを含む画分が得られる。次により高濃度例えば
０．２５〜０．５モルのＮａＣｌ溶液で溶出せしめると
細胞増殖因子に富む画分で、少量のラクトパーオキシダ
ーゼおよびラクトフェリンを含むものが得られる。最後
により高濃度例えば０．７〜１．２モルのＮａＣｌ溶液
を用い溶出せしめると、実質的にラクトフェリンを含む
画分が得られる。
【００２８】これら画分は例えばモノ−Ｓ−カラムを用
いるＦＰＬＣ，高速タンパク質液体クロマトグラフィー
で特徴づけられる。所望によりこのＦＰＬＣは調整スケ
ールで、得られた画分を更に精製するために使用するこ
とができる。
いるＦＰＬＣ，高速タンパク質液体クロマトグラフィー
で特徴づけられる。所望によりこのＦＰＬＣは調整スケ
ールで、得られた画分を更に精製するために使用するこ
とができる。
【００２９】実質的にラクトフェリンおよびラクトパー
オキシダーゼをそれぞれ含む画分は、常法でさらに処理
せられる。こう言った方法は脱塩、濃縮、細菌除去なら
びに乾燥工程からなる。このように、本発明方法は牛乳
あるいは牛乳誘導物からラクトフェリンならびにラクト
パーオキシダーゼを工業的規模で回収する方法と極めて
有利に組み合わせることができる。
オキシダーゼをそれぞれ含む画分は、常法でさらに処理
せられる。こう言った方法は脱塩、濃縮、細菌除去なら
びに乾燥工程からなる。このように、本発明方法は牛乳
あるいは牛乳誘導物からラクトフェリンならびにラクト
パーオキシダーゼを工業的規模で回収する方法と極めて
有利に組み合わせることができる。
【００３０】すでに述べた如く、本発明方法では分別溶
出で得られる細胞増殖因子に富む画分が４．５以下の弱
酸性ｐＨでさらに処理せられることが重要である。好ま
しくは、細胞増殖因子に富む画分は少なくとも４のｐＨ
で後処理せられる、というのはこうすると細胞増殖因子
の収率が大となるからである。上記ｐＨは溶離液を塩
酸、あるいは細胞増殖因子に悪影響を及ぼさない他の酸
で酸性化することにより達成せられる。好ましくは食品
に許容せられる酸が用いられる。
出で得られる細胞増殖因子に富む画分が４．５以下の弱
酸性ｐＨでさらに処理せられることが重要である。好ま
しくは、細胞増殖因子に富む画分は少なくとも４のｐＨ
で後処理せられる、というのはこうすると細胞増殖因子
の収率が大となるからである。上記ｐＨは溶離液を塩
酸、あるいは細胞増殖因子に悪影響を及ぼさない他の酸
で酸性化することにより達成せられる。好ましくは食品
に許容せられる酸が用いられる。
【００３１】細胞増殖因子に富む画分に対して施される
後処理の１つは脱塩である。塩溶液を用いて溶出した
後、所望の細胞増殖因子を含む画分はかなり多量の塩、
特にＮａＣｌを含んでいる。細胞増殖因子の多くの用途
においてこういった塩の存在は望ましくない。脱塩処理
は限外濾過あるいは電気透析により実施せられる。限外
濾過とは２．５ｋＤａ以下の膜での濾過を意味する。本
発明の非常に有利な点は細胞増殖因子に富む画分中に形
成せられる沈殿物の存在で限外濾過膜の目づまりが生じ
る危険性が無いという点である。
後処理の１つは脱塩である。塩溶液を用いて溶出した
後、所望の細胞増殖因子を含む画分はかなり多量の塩、
特にＮａＣｌを含んでいる。細胞増殖因子の多くの用途
においてこういった塩の存在は望ましくない。脱塩処理
は限外濾過あるいは電気透析により実施せられる。限外
濾過とは２．５ｋＤａ以下の膜での濾過を意味する。本
発明の非常に有利な点は細胞増殖因子に富む画分中に形
成せられる沈殿物の存在で限外濾過膜の目づまりが生じ
る危険性が無いという点である。
【００３２】後処理に通常含まれる別の処理は細胞増殖
因子に富む画分の精製あるいは濃縮である。この精製工
程は好ましくはカチオン交換体を使用する第２のクロマ
トグラフィー工程からなる。この工程では画分中に存在
するラクトパーオキシダーゼおよびラトフェリンが細胞
増殖因子から分離せられる。第２のクロマトグラフィー
工程を採用することは、加熱ならびに分離により不活性
化されて、ラクトフェリンならびにラクトパーオキシダ
ーゼを除去する際にしばしば認められる、細胞増殖因子
がラクトフェリンならびにラクトパーオキシダーゼに付
随して失われることが無くなるので有利である。
因子に富む画分の精製あるいは濃縮である。この精製工
程は好ましくはカチオン交換体を使用する第２のクロマ
トグラフィー工程からなる。この工程では画分中に存在
するラクトパーオキシダーゼおよびラトフェリンが細胞
増殖因子から分離せられる。第２のクロマトグラフィー
工程を採用することは、加熱ならびに分離により不活性
化されて、ラクトフェリンならびにラクトパーオキシダ
ーゼを除去する際にしばしば認められる、細胞増殖因子
がラクトフェリンならびにラクトパーオキシダーゼに付
随して失われることが無くなるので有利である。
【００３３】ＮａＣｌ濃度０．１５〜０．２５モルの溶
液で調整されたカチオン交換体に細胞増殖因子に富む画
分を適用すると、通過液体に、なを存在する全てのラク
トパーオキシダーゼが含まれるようになることが見いだ
された。０．４〜０．７および０．８〜１．２モル濃度
のＮａＣｌ溶液で順次溶出を進めると、２つの画分が得
られる。これらのうち最初のものは事実上細胞増殖因子
のみを含み、第２のものにはかなり純度の高いラクトフ
ェリンを含む。
液で調整されたカチオン交換体に細胞増殖因子に富む画
分を適用すると、通過液体に、なを存在する全てのラク
トパーオキシダーゼが含まれるようになることが見いだ
された。０．４〜０．７および０．８〜１．２モル濃度
のＮａＣｌ溶液で順次溶出を進めると、２つの画分が得
られる。これらのうち最初のものは事実上細胞増殖因子
のみを含み、第２のものにはかなり純度の高いラクトフ
ェリンを含む。
【００３４】細胞増殖因子に富む画分の後処理の一部を
なす第３の処理はその中に存在する細菌の除去および／
または殺菌である。好ましくは細菌は精密濾過で除去せ
られる。というのは児の場合生成物の損失あるいは不活
性化がないからである。
なす第３の処理はその中に存在する細菌の除去および／
または殺菌である。好ましくは細菌は精密濾過で除去せ
られる。というのは児の場合生成物の損失あるいは不活
性化がないからである。
【００３５】細胞増殖因子に富む画分に適用せられる第
４の処理は得られる生成物の品質を保持する目的での乾
燥である。好ましい乾燥法は雰霧乾燥あるいは凍結乾燥
である。
４の処理は得られる生成物の品質を保持する目的での乾
燥である。好ましい乾燥法は雰霧乾燥あるいは凍結乾燥
である。
【００３６】得られる細胞増殖因子に富む画分中に存在
する各種の細胞増殖因子を分離する必要がある場合に
は、この画分は第５の処理に付される。かかる分離工程
は例えば分取ＦＰＬＣにより実施せられる。
する各種の細胞増殖因子を分離する必要がある場合に
は、この画分は第５の処理に付される。かかる分離工程
は例えば分取ＦＰＬＣにより実施せられる。
【００３７】分別溶出の後、本発明で得られる細胞増殖
因子に富む画分の後処理のそれぞれ一部をなす上述の５
つの処理は、任意の順番で実施せられる。いかなる場合
にもこの５つの処理の全てを実施せねばならぬというわ
けではない。どの操作をいかなる順で実施すべきかは、
当業者により原料物質に応じ容易に決定しうる。しかし
ながら、本発明ではこれら５つの処理のいずれに於いて
も、細胞増殖因子に富む画分中に固形分を生じるといっ
た前述の問題を起こすことはない。
因子に富む画分の後処理のそれぞれ一部をなす上述の５
つの処理は、任意の順番で実施せられる。いかなる場合
にもこの５つの処理の全てを実施せねばならぬというわ
けではない。どの操作をいかなる順で実施すべきかは、
当業者により原料物質に応じ容易に決定しうる。しかし
ながら、本発明ではこれら５つの処理のいずれに於いて
も、細胞増殖因子に富む画分中に固形分を生じるといっ
た前述の問題を起こすことはない。
【００３８】最後に、本発明は上記方法を利用して得ら
れる細胞増殖因子、または１種あるいは２種以上の細胞
増殖因子を含む組成物、ならびにラクトパーオキシダー
ゼ、ラクトフェリン、あるいはラクトバーオキシダーゼ
またはラクトフェリンを含む組成物に関する。
れる細胞増殖因子、または１種あるいは２種以上の細胞
増殖因子を含む組成物、ならびにラクトパーオキシダー
ゼ、ラクトフェリン、あるいはラクトバーオキシダーゼ
またはラクトフェリンを含む組成物に関する。
【００３９】
【実施例】次に本発明方法を下記実施例により具体的に
説明する。
説明する。
【００４０】（実施例１）直径１．６メートルのイオン
交換カラムに２００リットルの粗粒子（１００〜３００
μｍ）カチオン交換体（Ｓ−セファローズ ビッグ ビ
ーズ、ファーマシア社製品）を充填し床高１０センチメ
ートルの交換体カラムを作った。このカラムをフォスフ
ェートバッファー（ｐＨ＝６．５，０．０２５モルフォ
スフェート）で調整した。このカラム中に限外濾過低脂
肪牛乳を毎時１００ベッド ボリュームの割合で３時間
ポンプ送りし、全量６０，０００リットルの牛乳を処理
した。
交換カラムに２００リットルの粗粒子（１００〜３００
μｍ）カチオン交換体（Ｓ−セファローズ ビッグ ビ
ーズ、ファーマシア社製品）を充填し床高１０センチメ
ートルの交換体カラムを作った。このカラムをフォスフ
ェートバッファー（ｐＨ＝６．５，０．０２５モルフォ
スフェート）で調整した。このカラム中に限外濾過低脂
肪牛乳を毎時１００ベッド ボリュームの割合で３時間
ポンプ送りし、全量６０，０００リットルの牛乳を処理
した。
【００４１】次いで、このカラムを、バッファーされた
（ｐＨ＝６．５）０．１モルＮａＣｌ溶液の５ベッド
ボリュームで洗浄した。次にこのカラムに吸着されてい
る微量成分を ａ）０．２ モルＮａＣｌ溶液 ５ベッド ボリューム ｂ）０．３ モルＮａＣｌ溶液 ５ベッド ボリューム ｃ）１．０ モルＮａＣｌ溶液 ５ベッド ボリューム で順次溶出せしめた。
（ｐＨ＝６．５）０．１モルＮａＣｌ溶液の５ベッド
ボリュームで洗浄した。次にこのカラムに吸着されてい
る微量成分を ａ）０．２ モルＮａＣｌ溶液 ５ベッド ボリューム ｂ）０．３ モルＮａＣｌ溶液 ５ベッド ボリューム ｃ）１．０ モルＮａＣｌ溶液 ５ベッド ボリューム で順次溶出せしめた。
【００４２】実質的にラクトパーオキシダーゼおよびラ
クトフェリンをそれぞれ含む溶離液ａ）およびｃ）はｐ
Ｈ６．５で限外濾過により脱塩し乾燥せしめた。ラクト
フェリンおよびラクトパーオキシダーゼの残さと細胞増
殖因子を含む溶離液ｂ）は塩酸でｐＨ４に酸性化し、
２．５ｋＤａ膜（コッホから入手可能）を用い２．５ｍ
Ｓの導電率になるまで（容積還元率９９％）限外濾過し
た。
クトフェリンをそれぞれ含む溶離液ａ）およびｃ）はｐ
Ｈ６．５で限外濾過により脱塩し乾燥せしめた。ラクト
フェリンおよびラクトパーオキシダーゼの残さと細胞増
殖因子を含む溶離液ｂ）は塩酸でｐＨ４に酸性化し、
２．５ｋＤａ膜（コッホから入手可能）を用い２．５ｍ
Ｓの導電率になるまで（容積還元率９９％）限外濾過し
た。
【００４３】精密濾過の後、ｐＨ６．５に中和し、つい
で乾燥し、ＦＰＬＣ分析した。クロマトグラム（図１）
にはラクトパーオキシダーゼのピーク（１３．２３３
分）とラクトフェリンのピーク（２９．４２８分）が明
瞭にみられ、また細胞増殖因子のピーク（１４．７８２
〜１９．０１１分）も認められた。
で乾燥し、ＦＰＬＣ分析した。クロマトグラム（図１）
にはラクトパーオキシダーゼのピーク（１３．２３３
分）とラクトフェリンのピーク（２９．４２８分）が明
瞭にみられ、また細胞増殖因子のピーク（１４．７８２
〜１９．０１１分）も認められた。
【００４４】（実施例２）実施例１に記載した条件と同
じ条件下に生低脂肪牛乳から０．３モルＮａＣｌ溶出液
を得た。
じ条件下に生低脂肪牛乳から０．３モルＮａＣｌ溶出液
を得た。
【００４５】この溶出液を直径１．６センチメートルの
カラムに、４０ｍｌのカチオン交換体（Ｓ−セファロー
ズ）を充填し、ｐＨ６．５の０．２モルＮａＣｌ溶液で
調整した第２のカラムを用いる第２クロマトグラフィ工
程に付した。前記溶出液はこのカラムに毎時１０ベッド
ボルームの割合でポンプ送りされた。通過せる液にはラ
クトパーオキシダーゼが含まれ、他方細胞増殖因子とラ
クトフェリンはこのカラムに吸着された。
カラムに、４０ｍｌのカチオン交換体（Ｓ−セファロー
ズ）を充填し、ｐＨ６．５の０．２モルＮａＣｌ溶液で
調整した第２のカラムを用いる第２クロマトグラフィ工
程に付した。前記溶出液はこのカラムに毎時１０ベッド
ボルームの割合でポンプ送りされた。通過せる液にはラ
クトパーオキシダーゼが含まれ、他方細胞増殖因子とラ
クトフェリンはこのカラムに吸着された。
【００４６】次に０．５５モルＮａＣｌ溶液（全量で５
ベッドボリューム）と１モルＮａＣｌ溶液を用い順次溶
出せしめた。後の溶離液にはラクトフェリンが含まれて
いた。０．５５モルＮａＣｌ溶液での溶離液を塩酸でｐ
Ｈ４に調節し、導電率２．５ｍＳまで限外濾過した。
ベッドボリューム）と１モルＮａＣｌ溶液を用い順次溶
出せしめた。後の溶離液にはラクトフェリンが含まれて
いた。０．５５モルＮａＣｌ溶液での溶離液を塩酸でｐ
Ｈ４に調節し、導電率２．５ｍＳまで限外濾過した。
【００４７】ＦＰＬＣ（図２）でのクロマトグラフによ
る同定法で、この生成物にはラクトフェリンおよび／ま
たはラクトパーオキシダーゼが殆ど全く含まれていない
ことが判った。１０．２０２から１７．６９８分のピー
クは全て細胞増殖因子である。
る同定法で、この生成物にはラクトフェリンおよび／ま
たはラクトパーオキシダーゼが殆ど全く含まれていない
ことが判った。１０．２０２から１７．６９８分のピー
クは全て細胞増殖因子である。
【００４８】かくして得られた生成物をモノ−Ｓ−カチ
オン交換体カラム５Ｘ５を用いて分離した。溶出は下記
の２つのバッファーを用いて実施した。 バッファーＡ：０．０２５モル Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ
６．５ バッファーＢ：０．０２５モル Ｎａ２ＨＰＯ４，２モ
ルＮａＣｌ，ｐＨ ６．５ その他の条件：サンプル荷重 ２．５ｍｌ（６．２ｍ
ｇ）；検出 ２２０ｎｍ，溶出 ｔ＝０分 ０％バッフ
ァーＢ，ｔ＝３０分 ５０％バッファーＢ
オン交換体カラム５Ｘ５を用いて分離した。溶出は下記
の２つのバッファーを用いて実施した。 バッファーＡ：０．０２５モル Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ
６．５ バッファーＢ：０．０２５モル Ｎａ２ＨＰＯ４，２モ
ルＮａＣｌ，ｐＨ ６．５ その他の条件：サンプル荷重 ２．５ｍｌ（６．２ｍ
ｇ）；検出 ２２０ｎｍ，溶出 ｔ＝０分 ０％バッフ
ァーＢ，ｔ＝３０分 ５０％バッファーＢ
【００４９】５画分を補集し、これらを更に逆相カラム
で分離した。条件は： カラム：ハイポアー３１８ ４．６Ｘ２５０ ビオラッ
ド バッファーＡ：１０ｍｌ アセトニトリル、１０００ｍ
ｌミリ Ｑ水、１ｍｌトリフルオロ酢酸 バッファーＢ：６００ｍｌアセトニトリル、４００ｍｌ
ミリ Ｑ水，１ｍｌトリフルオロ酢酸， 検出 ２２０ｎｍ，サンプル荷重１００μｌ，溶出：ｔ
＝０分 ０％バッファーＢ；ｔ＝６０分 ８５％バッフ
ァーＢ
で分離した。条件は： カラム：ハイポアー３１８ ４．６Ｘ２５０ ビオラッ
ド バッファーＡ：１０ｍｌ アセトニトリル、１０００ｍ
ｌミリ Ｑ水、１ｍｌトリフルオロ酢酸 バッファーＢ：６００ｍｌアセトニトリル、４００ｍｌ
ミリ Ｑ水，１ｍｌトリフルオロ酢酸， 検出 ２２０ｎｍ，サンプル荷重１００μｌ，溶出：ｔ
＝０分 ０％バッファーＢ；ｔ＝６０分 ８５％バッフ
ァーＢ
【００５０】２つのこれら分離物の高速液体クロマトグ
ラムが図３および図４に示されている。図３はアンジオ
ゲニン画分（これは質量分析ならびにＮ−末端シーケン
ス分析で完全に純粋であることを確認）のクロマトグラ
ムである。図４は別の画分で質量分析ならびにＮ−末端
シーケンス分析からアンジオゲニンペプチドを含むもの
と思われる画分のクロマトグラムである。
ラムが図３および図４に示されている。図３はアンジオ
ゲニン画分（これは質量分析ならびにＮ−末端シーケン
ス分析で完全に純粋であることを確認）のクロマトグラ
ムである。図４は別の画分で質量分析ならびにＮ−末端
シーケンス分析からアンジオゲニンペプチドを含むもの
と思われる画分のクロマトグラムである。
【図１】本発明方法で得られるラクトパーオキシダー
ゼ、ラクトフェリン及び細胞増殖因子を含む画分の高速
タンパク質液体クロマトグラフチャート
ゼ、ラクトフェリン及び細胞増殖因子を含む画分の高速
タンパク質液体クロマトグラフチャート
【図２】本発明方法で得られる細胞増殖因子群のみを含
む画分の高速タンパク質液体クロマトグラフチャート
む画分の高速タンパク質液体クロマトグラフチャート
【図３】本発明方法で得られるアンジオゲニン画分の高
速液体クロマトグラフチャート
速液体クロマトグラフチャート
【図４】本発明方法で得られるアンジオゲニンペプチド
を含む画分の高速液体クロマトグラフチャート
を含む画分の高速液体クロマトグラフチャート
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｎ 9/08
(72)発明者 ハーバート カーレル レメン
オランダ国 5423 ティーピー ハンデ
ルボスカント 13番地
(72)発明者 テオドールス ヨハネス アントニア
マリア ヴァン ケッセル
オランダ国 5476 ヴィビー ヴォルス
テンボッシュカムプウェッグ 19番地
(56)参考文献 特表 平９−512536（ＪＰ，Ａ)
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．251,
ｐ．95−103（1988)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 14/47
C07K 1/18
C07K 1/34
C07K 14/515
C07K 14/485
C07K 14/79
C07K 14/65
C12N 9/08
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (17)
- 【請求項１】 牛乳あるいは牛乳誘導体から少なくとも
１つの細胞増殖因子をカチオン交換体に吸着させ、次い
で該カチオン交換体を分別溶出させて細胞増殖因子分に
富む少なくとも１つの画分を得、この画分を３．５から
４．５以下のｐＨで後処理することを特徴とする牛乳あ
るいは牛乳誘導体から１種あるいはそれ以上の細胞増殖
因子を回収する方法。 - 【請求項２】 前記画分の後処理が４から４．５以下の
ｐＨで行なわれる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記画分の後処理が脱塩又は濃縮である
請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 脱塩が限外濾過あるいは電気透析により
行なわれる請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ分
別溶出を行なうことにより実施せられ、 後処理が画分中に存在する細菌の殺菌又は除去を含む請
求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ分
別溶出を行なうことにより実施せられ、 後処理が画分中に存在する細菌の殺菌及び除去を含む請
求項３に記載の方法。 - 【請求項７】 牛乳あるいは牛乳誘導体がカチオン交換
体に吸着せしめられる前に予め脱脂せられる請求項１に
記載の方法。 - 【請求項８】 牛乳あるいは牛乳誘導体の脱脂が、０．
１〜１０μｍの開孔を有するフィルターを用いる精密濾
過により実施せられる請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 牛乳あるいは牛乳誘導体が予め短時間加
熱処理せられる請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ
分別溶出を行なうことにより実施せられ、 少なくとも１つの細胞増殖因子のカチオン交換体への吸
着が、牛乳あるいは牛乳誘導体を大なる表面速度及び大
なる液荷重でカチオン交換体を充墳したカラム中に通過
させることにより実施せられる請求項３に記載の方法。 - 【請求項１１】 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ
分別溶出を行なうことにより実施せられ、 細胞増殖因子に富む画分を分取する前にラクトパーオキ
シダーゼに富む少なくとも１つの画分が回収せられ、 ラクトパーオキシダーゼに富む少なくとも１つの画分あ
るいはラクトフェリンに富む少なくとも１つの画分がさ
らに後処理されてラクトパーオキシダーゼあるいはラク
トフェリン製品が作られる請求項３に記載の方法。 - 【請求項１２】 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ
分別溶出を行なうことにより実施せられ、 細胞増殖因子に富む画分を分取する前にラクトパーオキ
シダーゼに富む少なくとも１つの画分が回収せられ、 ラクトパーオキシダーゼに富む少なくとも１つの画分あ
るいはラクトフェリンに富む少なくとも１つの画分がさ
らに後処理されてラクトパーオキシダーゼおよびラクト
フェリン製品が作られる請求項３に記載の方法。 - 【請求項１３】 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ
分別溶出を行なうことにより実施せられ、 細胞増殖因子に富む画分を分取する前にラクトパーオキ
シダーゼに富む少なくとも１つの画分が回収せられ、 細胞増殖因子に富む画分を分取した後にラクトフェリン
に富む少なくとも１つの画分が回収せられる請求項３記
載の方法。 - 【請求項１４】 細菌が精密濾過で除去せられる請求項
５または６記載の方法。 - 【請求項１５】 画分がさらに噴霧乾燥あるいは凍結乾
燥せられる請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 牛乳あるいは牛乳誘導体から少なくと
も１つの細胞増殖因子をカチオン交換体に吸着させ、次
いで該カチオン交換体を分別溶出させて細胞増殖因子分
に富む少なくとも１つの画分を得、この画分を４から
４．５以下のｐＨで後処理し、 前記画分の後処理が脱塩及び濃縮であり、 脱塩が限外濾過あるいは電気透析により行なわれ、 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ分別溶出を行なう
ことにより実施せられ、 後処理が画分中に存在する細菌の殺菌及び除去を含み、 細菌が精密濾過で除去せられ、 画分がさらに噴霧乾燥あるいは凍結乾燥せられ、 細胞増殖因子に富む画分が高速タンパク液体クロマトグ
ラフ法を用いて分取せられ、 アンジオゲニン又はアンジオゲニン誘導のペプチドに富
む少なくとも１つの画分が回収せられることを特徴とす
る牛乳あるいは牛乳誘導体から１種あるいはそれ以上の
細胞増殖因子を回収する方法。 - 【請求項１７】 牛乳あるいは牛乳誘導体から少なくと
も１つの細胞増殖因子をカチオン交換体に吸着させ、次
いで該カチオン交換体を分別溶出させて細胞増殖因子分
に富む少なくとも１つの画分を得、この画分を４から
４．５以下のｐＨで後処理し、 前記画分の後処理が脱塩及び濃縮であり、 脱塩が限外濾過あるいは電気透析により行なわれ、 濃縮がカチオン交換体に再度吸着させ分別溶出を行なう
ことにより実施せられ、 後処理が画分中に存在する細菌の殺菌及び除去を含み、 細菌が精密濾過で除去せられ、 画分がさらに噴霧乾燥あるいは凍結乾燥せられ、 細胞増殖因子に富む画分が高速タンパク液体クロマトグ
ラフ法を用いて分取せられ、 アンジオゲニン及びアンジオゲニン誘導のペプチドに富
む少なくとも１つの画分が回収せられることを特徴とす
る牛乳あるいは牛乳誘導体から１種あるいはそれ以上の
細胞増殖因子を回収する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1005677A NL1005677C2 (nl) | 1997-03-27 | 1997-03-27 | Werkwijze voor het winnen van groeifactoren, of een samenstelling die één of meer groeifactoren bevat, uit melk of een derivaat daarvan. |
| NL1005677 | 1997-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1121299A JPH1121299A (ja) | 1999-01-26 |
| JP3403066B2 true JP3403066B2 (ja) | 2003-05-06 |
Family
ID=19764687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12264598A Expired - Fee Related JP3403066B2 (ja) | 1997-03-27 | 1998-03-26 | 牛乳あるいは牛乳誘導物から細胞増殖因子あるいは１種または２種以上の細胞増殖因子を含む組成物を回収する方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6010698A (ja) |
| EP (1) | EP0869134B1 (ja) |
| JP (1) | JP3403066B2 (ja) |
| AT (1) | ATE214074T1 (ja) |
| AU (1) | AU705166B2 (ja) |
| DE (1) | DE69804031T2 (ja) |
| DK (1) | DK0869134T3 (ja) |
| NL (1) | NL1005677C2 (ja) |
| NZ (1) | NZ330061A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7932069B2 (en) | 2004-02-17 | 2011-04-26 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Process for producing lactoperoxidase |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| ATE220564T1 (de) | 1997-08-14 | 2002-08-15 | Sulzer Innotec Ag | Zusammensetzung und vorrichtung zur reparatur von knorpelgewebe in vivo bestehend aus nanokapseln mit osteoinduktiven und/oder chondroinduktiven faktoren |
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