ES2847388T3 - Composiciones y métodos para desestabilizar, alterar y dispersar biopelículas - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para inducir daño celular, matar células, bloquear procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de homeostasis, bloquear la adhesión entre células, inducir el reordenamiento tridimensional de la arquitectura, bloquear la señalización entre células, modificar las interacciones del metabolismo entre células, bloquear la adhesión a las superficies, reducir el potencial patogénico de las biopelículas, reducir la masa de la biopelícula, disminuir la proporción de bacterias patógenas en biopelículas, aumentar la proporción de bacterias beneficiosas en biopelículas y/o prevenir el crecimiento de microorganismos en biopelículas, que comprende: poner en contacto bacterias en una biopelícula con L-arginina sin células a una concentración de al menos 1 mM, en el que dicha puesta en contacto da como resultado uno o más de: inducir daño celular, matar células, bloquear procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de homeostasis, modificar la adhesión entre células, inducir el reordenamiento tridimensional de la arquitectura, modificar la señalización entre células, modificar las interacciones metabólicas entre células, interrumpir la adhesión a las superficies, reducir el potencial patogénico de las biopelículas, aumentar la proporción de bacterias beneficiosas en biopelículas y prevenir el crecimiento de dichos microorganismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para desestabilizar, alterar y dispersar biopelículas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. de Serie 61/881.762, presentada el 24 de septiembre de 2013 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. de Serie 61 972.920, presentada el 31 de marzo de 2014.

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a composiciones y métodos para desestabilizar biopelículas, alterar su estructura 3D y dispersarlas con el fin de mejorar la eliminación de células adheridas a éstas y/o la sensibilidad con respecto a otros agentes (por ejemplo, tratamientos locales o que se aplican al mismo tiempo). En particular, la presente descripción se refiere al uso de L-arginina en la eliminación y/o sensibilización (por ejemplo, frente a antimicrobianos) de microorganismos en aplicaciones médicas, industriales, domésticas o medioambientales, así como al tratamiento de infecciones bacterianas (por ejemplo, en biopelículas).

Antecedentes de la invención

Una biopelícula es una colonia muy organizada de microorganismos que se adhiere a las superficies y que se incrusta sobre sustancias poliméricas extracelulares viscosas (EPS, por sus siglas en inglés). Las EPS son una mezcla compleja de polímeros de alta masa molecular (> 10.000 Da) generada por las células bacterianas, los productos de lisis e hidrólisis celular y la materia orgánica adsorbida del sustrato. Las EPS están implicadas en el establecimiento de disposiciones estables de los microorganismos en las biopelículas (Wolfaardt et al. (1998) Microb. Ecol. 35: 213-223), siendo el ADN extracelular (eDNA) uno de los componentes principales de las EPS (Flemming et al. (2001) Water Sci. Technol. 43:9-16; Spoering et al. (2006) Curr. Opin. Microbiol. 9:133-137). Las bacterias que viven en las biopelículas suelen tener propiedades significativamente diferentes a las de las bacterias que flotan libremente (planctónicas) de la misma especie, ya que el entorno denso y protegido de la película les permite cooperar e interactuar de diversas formas. Un beneficio de este ambiente es que presentan una mayor resistencia frente a la acción de detergentes y antibióticos, ya que la densa matriz extracelular y la capa externa de las células protegen el interior de la colonia. En algunos casos, la resistencia frente a los antibióticos se puede multiplicar por mil (Stewart et al. (2001) Lancet 358: 135-138). Las biopelículas se pueden formar con diversas especies bacterianas (por ejemplo, Acinetobacter sp. (por ejemplo, A. baylyi, A. baumannii), Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli (por ejemplo, E. coli K-12). La formación de biopelículas a partir de dichas especies es un determinante importante del resultado médico durante el curso de la colonización o infección. Por ejemplo, la bacteria Acinetobacter spp. infecta con frecuencia a pacientes de entornos clínicos mediante la formación de biopelículas en los tubos de los respiradores, en la piel y donde se localizan heridas, en los tubos médicos, etc.; y son una causa común de la neumonía hospitalaria.

Como las biopelículas son estructuras complejas formadas con varios elementos, su eliminación o disgregación requiere tradicionalmente del uso de dispersantes, tensioactivos, detergentes, formulaciones enzimáticas, antibióticos, biocidas, procedimientos de desinfección por hervido, con productos químicos corrosivos, limpieza mecánica, uso de agentes antimicrobianos, inhibiendo las adhesiones microbianas, o el crecimiento de la biopelícula al eliminar los nutrientes esenciales, y promoviendo el desprendimiento de biomasa y la degradación de su matriz (Chen XS, PS: Biofilm removal caused by chemical treatments. Water Res 2000; 34: 4229-4233). Sin embargo, tales métodos clásicos de eliminación o disgregación no son eficaces o factibles en todas las situaciones en las que la formación de biopelículas es indeseable.

Se necesitan otros métodos para eliminar las bacterias indeseables en las biopelículas.

Kamaguchi et al., Microbiol. Immunol, 1.1.2001, vol. 44, páginas 649-656, han descrito que la arginina inhibe la agregación conjunta de bacterias in vitro. Sin embargo, estas bacterias no son analizadas cuando están presentes en biopelículas. Además, dicho documento se aparta del objeto de la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, ya que demuestra que tanto la L-arginina como la D-arginina son igualmente activas en la inhibición de la agregación conjunta in vitro de células de Porphyromonas gingivalis y células de Prevotella intermedia, mientras que, por el contrario, la presente invención muestra que la L-arginina modifica las colonias de biopelículas bacterianas, mientras que la D-arginina no presenta ese efecto. Existe alguna otra técnica anterior que describe la arginina racémica, pero sin diferenciar entre las L- y D-argininas estereoisoméricas y, en particular, no usa el estereoisómero L-arginina como la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, ver p. ej. Wang et al., The Chinese Journal of Dental Research, 1.1.2012, vol. 15, no. 2, páginas 115-120; Kraivaphan et al., CARIRES RESEARCH, 1.1.2013, vol. 47, no. 6, páginas 582-590; y Zhang et al., J. Infect. Dis, 22.1.2013, vol. 66, páginas 11-16.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no se encuentran dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. La presente descripción se refiere a composiciones y métodos para desestabilizar biopelículas, alterar su estructura 3D y dispersarlas con el fin de mejorar la eliminación de la adhesión de las células y/o la sensibilidad frente a otros agentes (por ejemplo, tratamientos locales o aplicados conjuntamente). En particular, la presente descripción se refiere al uso de L-arginina en la eliminación y/o sensibilización (por ejemplo, frente a agentes antimicrobianos) de microorganismos en aplicaciones médicas, industriales, domésticas o ambientales, así como frente al tratamiento de infecciones bacterianas (por ejemplo, en biopelículas).

La presente descripción proporciona composiciones (p. ej., farmacéuticas, comerciales, sanitarias, etc.), sistemas, usos y métodos que dan como resultado uno o más de los siguientes puntos: inducir daño celular, matar células, bloquear procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de la homeostasis, modificar la adhesión entre células, inducir la reordenación tridimensional de la arquitectura, alterar la señalización entre células, alterar las interacciones metabólicas entre células, modificar la adhesión a las superficies, reducir el potencial patogénico de las biopelículas, reducir la masa de la biopelícula, disminuir la proporción de bacterias patógenas en la biopelícula, aumentar la proporción de bacterias beneficiosas en la biopelícula o prevenir el crecimiento de los microorganismos en la biopelícula, que comprenden: poner en contacto las bacterias de una biopelícula con L-arginina sin células a una concentración de al menos 1 mM, en la que el contacto mata o inhibe el crecimiento de microorganismos y/o modifica la disposición tridimensional de las células en la biopelícula, lo que puede dañar a las bacterias al prevenir evitar que interactúen con otras y/o exponerlas a efectos ambientales nocivos. El microorganismo dado puede ser una bacteria. Las bacterias pueden estar coagregadas. La biopelícula puede ser una biopelícula dental. Las bacterias pueden estar en un coagregado o biopelícula con una pluralidad de especies bacterianas diferentes (por ejemplo, de Streptococcus y Actinomyces, tales como, por ejemplo, S. gordonii y A. oris). La L-arginina puede prevenir la agregación conjunta o promover la desadhesión / dispersión de dichas bacterias. La L-arginina puede estar presente a una concentración de al menos 1 mM (por ejemplo, al menos 10 mM, al menos 50 mM, al menos 100 mM, 200 mM, al menos 250 mM, al menos 300 mM, al menos 350 mM , al menos 400 mM, al menos 450 mM, al menos 500 mM, al menos 600 mM, al menos 700 mM, al menos 800 mM, al menos 900 mM, o, al menos, 1 M). Las bacterias pueden estar en biopelículas orales de múltiples especies (por ejemplo, placa dental en la saliva). La L-arginina puede eliminar a las biopelículas que crecen en la saliva sin actividad antimicrobiana. El método puede comprender además poner en contacto las bacterias con cloruro de cetilpiridinio (CPC).

La presente descripción comprende el uso de una composición que comprende L-arginina a una concentración de al menos 1 mM que imprime una o más de las siguientes acciones: inducir daño celular microbiano, matar células, bloquear procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de homeostasis, bloquear la adhesión entre células, inducir la reordenación tridimensional de la arquitectura, bloquear la señalización entre células, bloquear las interacciones metabólicas entre células, bloquear la adhesión a las superficies, reducir el potencial patogénico de las biopelículas, reducir la masa de la biopelícula, disminuir la proporción de bacterias patógenas en la biopelícula, aumentar la proporción de bacterias beneficiosas en la biopelícula o prevenir el crecimiento del microorganismo en la biopelícula. En algunas realizaciones, la composición comprende además cloruro de cetilpiridinio (CPC).

La presente descripción proporciona además un plásmido que transfiere la expresión o concentración de un componente de una biopelícula o población de células planctónicas, donde el plásmido comprende un primer marcador bajo el control de un promotor constitutivo o un segundo marcador bajo el control de un promotor inducido por el componente. El marcador puede ser un marcador fluorescente (por ejemplo, GFP o Mcherry). El primer promotor puede ser un promotor ribosómico estreptocócico (p. ej., un promotor de la proteína ribosómica DL1 50S de S. gordonii (SGO_1192)). El segundo promotor puede ser la proteína A de control catabólico de S. gordonii (SGO_0773), o el promotor argC o arcA de S. gordonii.

La presente descripción proporciona además una célula estreptocócica (por ejemplo, S. gordonii) que comprende el plásmido. La célula puede estar contenida en una biopelícula.

La presente descripción proporciona además métodos y usos para controlar la concentración de un componente (por ejemplo, arginina o AI-2) de la biopelícula o del cultivo de células planctónicas, que comprende: a) poner en contacto una célula estreptocócica con el plásmido descrito en este documento; y b) medir el nivel del marcador. El nivel de expresión del marcador puede correlacionarse con el nivel del componente. El método puede comprender además la etapa de poner en contacto la célula con un compuesto de prueba (por ejemplo, un fármaco que mate o inhiba o se sospeche que mata o inhibe el crecimiento de la célula en cuestión).

En este documento se describen otros aspectos.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra el papel de la arginina en el crecimiento de la placa dental. Las concentraciones altas y bajas de la L-arginina provocan la desestabilización de la biopelícula y dan como resultado que muchas células se dispersen o se desadhieran de la biopelícula, dejando atrás células muertas / dañadas insensibles.

La Figura 2 muestra la regulación de la expresión génica de S. gordonii argC y arcA como respuesta a cambios rápidos en la L-arginina exógena. (A) Se cultivaron células de S. gordonii en mucha arginina (5 mM) y se cambiaron a ninguna arginina en el tiempo = 0 min en el eje x. (B) Se cultivó S. gordonii en arginina intermedia (0,5 mM) a la fase exponencial tardía, cuando se añadió arginina en exceso (50 mM) (tiempo = 0 min).

La Figura 3 muestra biopelículas de S. gordonii en saliva con o sin arginina (Arg) 0,5 mM o 0,5 M (500 mM).

La Figura 4 muestra que el bloqueo de arcR reduce la formación de biopelículas por S. gordonii.

La Figura 5 muestra el efecto de la L-arginina respecto a la composición de especies de la colonia derivada de saliva desarrollada en saliva esterilizada por filtración combinada. (A) Muestra el aumento en la diversidad bacteriana (unidades taxonómicas operativas, OTU, por sus siglas en inglés) causado por la exposición prolongada de biopelículas orales de múltiples especies a 500 mM de L-arginina. Las barras de color negro representan datos derivados del análisis de biopelículas desarrolladas en el flujo de saliva no suplementada, mientras que las barras de color gris representan datos derivados del análisis de biopelículas desarrolladas en saliva suplementada con 500 mM. (B) Muestra cambios en phyla (codificación de colores como antes). (C) Muestra cambios en la composición de los géneros (la clave es de izquierda a derecha en orden de abajo hacia arriba en la barra; Neisseria, Granulicatella, Streptococcus, etc.).

La Figura 6 muestra el efecto del crecimiento de biopelículas de múltiples especies a concentraciones crecientes de L-arginina en condiciones estáticas. Representaciones 3D representativas de biopelículas orales de 20 horas cultivadas a partir de un inóculo de saliva que contiene células (CCS) en el sistema de biopelícula estática que contiene saliva sin células (CFS) complementado con diferentes concentraciones de monoclorhidrato de L-arginina (LAHCl). Las representaciones superiores (A¹-H¹) son del plano x-y. Las representaciones intermedias (A²-H²) son del plano x-z. Las representaciones inferiores (A³-H³) representan una vista en ángulo (x-y-z). Las barras representan 50 pm. La tabla asociada muestra los cambios en el porcentaje medio de viabilidad celular.

La Figura 7 muestra que la L-arginina desestabiliza la arquitectura de biopelículas orales de múltiples especies cultivadas en saliva en condiciones de flujo en un canal de microfluidos. Representaciones 3D representativas y características de la biopelícula derivadas del análisis de imágenes computacionales de biopelículas orales desarrolladas durante 20 h a diferentes concentraciones de monoclorhidrato de L-arginina (LAHCl) en el sistema de biopelícula de saliva fluido Bioflux™.

La Figura 8 muestra que la L-arginina 500 mM desestabiliza las biopelículas orales de múltiples especies preformadas en diferentes estadios de desarrollo.

La Figura 9 muestra que la L-arginina desestabiliza las colonias de biopelículas orales de múltiples especies preformadas y que, al hacerlo, puede mejorar la penetración de CPC (0,01 o 0,05%). Específicamente, esta figura muestra que la L-arginina 500 mM mejora la penetración y la destrucción de CPC de modo que se requiere menos CPC en comparación con cuando se usa en ausencia de L-arginina.

La Figura 10 muestra el doble de inducción de bioluminiscencia por Vibrio harveyi BB170 que responde a AI-2. Se muestra que AI-2 se produce en cantidades crecientes a medida que aumenta la concentración de L-arginina. Los datos de AI-2 se normalizan con el "control" (saliva no suplementada).

La Figura 11 muestra que la aplicación de L-arginina, pero no de D-arginina, desestabiliza y previene el crecimiento de colonias bacterianas.

La Figura 12 muestra (A) un plásmido modificable (pPE1010) que permite la generación de Streptococcus gordonii DL1 fluorescente (GFP o Mcherry) y (B) un ejemplo de dos promotores que permiten la evaluación de la expresión diferencial de fluorescencia de GFP en biopelículas DL1 de S. gordonii como respuesta al AI-2 agregado exógenamente.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, a continuación se definen una serie de términos y frases:

Tal como se usa en el presente documento, el término "biopelícula" se refiere a cualquier colonia microbiana tridimensional (p. ej., revestida de matriz) que presente características pluricelulares. Por consiguiente, como se usa en este documento, el término biopelícula incluye biopelículas asociadas a la superficie así como biopelículas en suspensión, tales como flóculos y gránulos. Las biopelículas pueden comprender una única especie microbiana o pueden ser complejos de especies mixtas, y pueden incluir bacterias, así como hongos, algas, protozoos u otros microorganismos. Las biopelículas pueden comprender organismos coagregantes. Las biopelículas pueden comprender un solo organismo o varios organismos que no se coagregen.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier célula eucariota o procariota (por ejemplo, células bacterianas como E. coli, células de levadura, células de mamíferos, células de aves, células de anfibios, células vegetales, células de peces y células de insectos), ya sea in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden estar ubicadas en un animal transgénico.

Tal y como se usa en este documento, el término "procariotas" se refiere a un grupo de organismos que normalmente carecen de un núcleo celular o cualquier otro orgánulo unido a la membrana. Los procariotas pueden ser bacterias. El término "procariota" incluye tanto arqueas como eubacterias.

Tal y como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a individuos (p. ej., seres humanos, animales u otro organismo) que serán tratados por los métodos o composiciones de la presente descripción. Los sujetos incluyen, entre otros, mamíferos (por ejemplo, murinos, simios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, etc.) y, lo más preferiblemente, incluye a seres humanos. En el contexto de la presente descripción, el término "sujeto" generalmente se refiere a un individuo que recibirá o que ha recibido tratamiento para una afección caracterizada por la presencia de bacterias formadoras de biopelículas, o en previsión de una posible exposición a bacterias formadoras de biopelículas.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "in vitro" se refiere a un ambiente artificial y a procesos o reacciones que ocurren dentro de un ambiente artificial. Los entornos in vitro incluyen, entre otros, tubos de ensayo y cultivos celulares. La expresión "in vivo" se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a los procesos o reacciones que ocurren dentro de un entorno natural.

Tal y como se usa en este documento, el término "virulencia" se refiere al grado de patogenicidad de un microorganismo (por ejemplo, bacteria u hongo), por ejemplo, según lo indicado por la gravedad de la enfermedad producida o su capacidad para invadir los tejidos de un sujeto. Generalmente se mide experimentalmente por la dosis letal mediana (LD50) o la dosis infecciosa mediana (DI50). El término también puede usarse para referirse a la competencia de cualquier agente infeccioso para producir efectos patológicos.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una composición (por ejemplo, una composición que comprende L-arginina) suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosis y no se pretende que se limite a una formulación o vía de administración particular. La cantidad eficaz puede ser al menos 1 mM (por ejemplo, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM o más).

Tal y como se usa en este documento, el término "administración" se refiere al acto de administrar un fármaco, profármaco u otro agente, o tratamiento terapéutico (p. ej., composiciones que comprenden L-arginina) a un sistema fisiológico (p. ej., un sujeto o in vivo, en células, tejidos y órganos in vitro o ex vivo). Las vías de administración ejemplares al cuerpo humano pueden ser a través de los ojos (oftálmica), boca (oral), piel (transdérmica), nariz (nasal), pulmones (inhalante), mucosa oral (bucal), oído, administración por inyección (p. ej., por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral, intraperitoneal, etc.), tópica, etc.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "tratar una superficie" se refiere al acto de exponer una superficie a una o más composiciones que comprenden L-arginina. Los métodos para tratar una superficie incluyen, entre otros, pulverizar, nebulizar, sumergir y revestir.

Tal y como se usa en este documento, el término "coadministración" se refiere a la administración de al menos dos agentes (por ejemplo, L-arginina en combinación con un agente antimicrobiano) o terapias a un sujeto. La coadministración de dos o más agentes o terapias puede ser concurrente. Puede administrarse un primer agente / terapia antes de un segundo agente / terapia. Los expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o vías de administración de los diversos agentes o terapias usados puedan variar. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis apropiada para la coadministración. Cuando se coadministran agentes o terapias, los respectivos agentes o terapias pueden administrarse en dosis más bajas que las apropiadas para su administración única. Por tanto, la coadministración es especialmente deseable cuando la coadministración de los agentes o terapias reduce la dosis requerida del agente o agentes potencialmente dañinos (por ejemplo, tóxicos).

Tal y como se usa en este documento, el término "herida" se refiere de forma amplia a lesiones en el tejido que incluyen la piel, tejido subcutáneo, músculo, hueso y otras estructuras iniciadas de diferentes maneras, en concreto, cirugía (por ejemplo, heridas abiertas posteriores a la resección del cáncer, que incluyen, entre otras, la extirpación de melanomas y el cáncer de mama, etc.), heridas quirúrgicas posoperatorias contenidas, llagas producidas por presión (por ejemplo, por reposo prolongado en cama) y heridas inducidas por traumas. Tal y como se usa en este documento, el término "herida" se usa sin limitación con respecto a la causa de la herida, ya sea por alguna causa física, como por la posición del cuerpo, como en el caso de las úlceras de decúbito, o por impactos, como en los traumatismos, o por alguna causa biológica, como en los procesos de enfermedad, procesos de envejecimiento, procesos obstétrico, o cualquier otra forma de los procesos biológicos. Las heridas causadas por presión también pueden clasificarse en alguno de los cuatro grados posibles según la profundidad de la herida: i) Grado I: heridas limitadas a la epidermis; ii) Grado II: heridas que se extienden hacia la dermis; iii) Grado III: heridas que se extienden al tejido subcutáneo; y iv) Grado IV: heridas en las que los huesos están expuestos (por ejemplo, un punto de presión ósea como el trocánter mayor o el sacro). La expresión "herida de espesor parcial" se refiere a heridas que se limitan a la epidermis y la dermis; una herida de cualquier etiología puede tener un espesor parcial. La expresión "herida de espesor total" incluye las heridas que se extienden a través de la dermis.

Tal y como se usa en este documento, "sitio de la herida" se refiere de forma amplia a la ubicación anatómica de una herida, sin limitación.

Tal y como se usa en este documento, el término "apósito" se refiere de forma amplia a cualquier material aplicado a alguna herida para su protección, absorbancia, drenaje, tratamiento, etc. Hay numerosos tipos de apósitos disponibles comercialmente, incluidas películas (por ejemplo, películas de poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidales hidrófilas unidas a espumas de poliuretano), hidrogeles (polímeros reticulados que contienen aproximadamente al menos un 60% de agua), espumas (hidrófilas o hidrófobas), alginatos de calcio (compuestos no tejidos de fibras de alginato de calcio) y celofán (celulosa con un plastificante) (Kannon y Garrett (1995) Dermatol. Surg. 21: 583-590; Davies (1983) Burns 10: 94). La presente descripción también contempla el uso de apósitos impregnados con compuestos farmacológicos (por ejemplo, antibióticos, antisépticos, trombina, compuestos analgésicos, etc.). Los apósitos para heridas celulares incluyen algunos materiales disponibles comercialmente como Apligraf®, Dermagraft®, Biobrane®, TransCyte®, Integra® Dermal Regeneration Template® y OrCell®.

Tal y como se usa en este documento, el término "tóxico" se refiere a cualquier efecto perjudicial o dañino sobre un sujeto, una célula o un tejido en comparación con la misma célula o tejido antes de la administración del tóxico.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo (por ejemplo, L-arginina) con un vehículo, inerte o activo, lo que hace que la composición sea especialmente adecuada para un uso diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.

Los términos "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable", como se usan en este documento, se refieren a composiciones que no producen sustancialmente reacciones adversas, por ejemplo, reacciones tóxicas, alérgicas o inmunológicas, cuando se administran a un sujeto.

Tal y como se usa en este documento, el término "tópicamente" se refiere a la aplicación de las composiciones de la presente descripción a la superficie de la piel y células y tejidos de las mucosas (por ejemplo, mucosa alveolar, bucal, lingual, masticatoria o nasal, y otros tejidos y células que recubren órganos huecos o cavidades corporales).

Tal y como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar que incluyen, entre otros, una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, como emulsiones de aceite en agua o agua en aceite), y diversos tipos de agentes humectantes, todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, lauril sulfato de sodio, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, desintegrantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio), etc. Las composiciones también pueden incluir estabilizantes y conservantes. Para ejemplos de vehículos, estabilizadores y adyuvantes véase, por ejemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edición, Mack Publ. Co., Easton, Pensilvania (1975). Las composiciones de la presente descripción se pueden formular para un uso veterinario, hortícola o agrícola. Tales formulaciones incluyen inmersiones, pulverizaciones, apósitos para semillas, inyecciones en el tallo, pulverizaciones y neblinas. Las composiciones de la presente descripción se pueden usar en cualquier aplicación en la que sea deseable modificar (por ejemplo, inhibir) la formación de biopelículas, por ejemplo, aplicaciones en la industria alimentaria; bienes de consumo (por ejemplo, productos médicos, productos destinados para consumidores con sistemas inmunitarios deficitarios o en desarrollo (por ejemplo, bebés, niños, ancianos, consumidores que padecen enfermedades o que están en riesgo de contraer enfermedades), etc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "dispositivos médicos" incluye cualquier material o dispositivo que se use tanto sobre el cuerpo, como dentro de éste, o, incluso, a través del cuerpo de un sujeto o paciente, por ejemplo, en el curso de un tratamiento médico (por ejemplo, en una enfermedad o lesión). Los dispositivos médicos incluyen, entre otros, elementos tales como implantes médicos, dispositivos para el cuidado de heridas, dispositivos de administración de fármacos y dispositivos de protección personal y de cavidades corporales. Los implantes médicos incluyen, entre otros, catéteres urinarios, catéteres intravasculares, derivaciones de diálisis, tubos de drenaje de heridas, suturas cutáneas, injertos vasculares, mallas implantables, dispositivos intraoculares, válvulas cardíacas, etc. Los dispositivos para el cuidado de heridas incluyen, entre otros, vendajes para heridas generales, materiales de injertos biológicos, cierres y vendajes con cinta y campos quirúrgicos para incisiones. Los dispositivos de administración de fármacos incluyen, entre otros, agujas, parches cutáneos de administración de fármacos, parches mucosos de administración de fármacos y esponjas médicas. Las cavidades corporales y los dispositivos de protección personal incluyen, entre otros, tampones, esponjas, guantes quirúrgicos y de examen, lentes de contacto y cepillos de dientes. Los dispositivos anticonceptivos incluyen, entre otros, dispositivos intrauterinos (DIU), diafragmas y condones.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente terapéutico" se refiere a composiciones que disminuyen la infectividad, la morbilidad o el inicio de la mortalidad en un sujeto (p. ej., un sujeto expuesto a un microorganismo formador de biopelículas) o que previenen la infectividad, morbilidad o inicio de la mortalidad en un hospedador expuesto a un microorganismo formador de biopelículas. Tal y como se usa en este documento, los agentes terapéuticos abarcan a ciertos agentes usados profilácticamente, por ejemplo, en ausencia de un organismo formador de biopelícula, en vista de una posible exposición futura a algún organismo formador de biopelícula. Dichos agentes pueden comprender adicionalmente compuestos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, adyuvantes, excipientes, estabilizadores, diluyentes, etc.). Los agentes terapéuticos de la presente descripción se pueden administrar en forma de composiciones tópicas, composiciones inyectables, composiciones ingeribles, etc. Cuando la vía es la tópica, la forma puede ser, por ejemplo, una solución, crema, ungüento, pomada o pulverización.

Tal y como se usa en este documento, el término "patógeno" se refiere a un agente biológico que causa un estado de enfermedad (por ejemplo, infección, cáncer, etc.) en un huésped. Los "patógenos" incluyen, entre otros, virus, bacterias, arqueas, hongos, protozoos, micoplasmas, priones y organismos parásitos.

Tal y como se usa en este documento, el término "microbio" se refiere a cualquier microorganismo y se pretende que abarque tanto a organismos individuales como a una preparación que comprenda cualquier cantidad de organismos. Como se usa en el presente documento, el término "microorganismo" se refiere a cualquier especie o tipo de microorganismo, incluyendo, entre otros, bacterias, arqueas, hongos, protozoos, micoplasmas y organismos parásitos.

Tal y como se usa en este documento, el término "hongos" se usa con referencia a organismos eucariotas tales como mohos y levaduras, incluidos hongos dimórficos.

Los términos "bacterias" y "bacteria" se refieren a todos los organismos procarióticos, incluidos los que se encuentran dentro de todos los filos del Reino Procaryotae. Se pretende que el término abarque a todos los microorganismos considerados bacterias, incluidos Mycoplasma, Chlamydia, Actinomyces, Streptomyces y Rickettsia. Todas las formas de bacterias están incluidas dentro de esta definición, incluidos cocos, bacilos, espiroquetas, esferoplastos, protoplastos, etc. También se incluyen dentro de este término los organismos procariotas que son gramnegativos o grampositivas. Los "gramnegativos" y los "grampositivos" se refieren a patrones de tinción con el proceso de tinción de Gram, que es habitual en la técnica. (Véase, por ejemplo, Finegold y Martin, Diagnostic Microbiology, 6a Ed., CV Mosby St. Louis, págs. 13-15 (1982)). Las "bacterias grampositivas" son bacterias que retienen el tinte primario utilizado en la tinción de Gram, lo que hace que las células teñidas aparezcan generalmente entre un color azul oscuro y púrpura bajo el microscopio. Las "bacterias gramnegativas" no conservan el tinte primario utilizado en la tinción de Gram, pero se tiñen con la contratinción. Por lo tanto, las bacterias gramnegativas en realidad aparecen en color rojo.

La expresión "bacterias no patógenas" o "bacteria no patógena" incluye a todas las bacterias no patógenas conocidas y desconocidas (grampositivas o gramnegativas) y cualquier bacteria patógena que haya sido mutada o convertida en una bacteria no patógena. Además, los expertos en la materia reconocen que algunas bacterias pueden ser patógenas en especies específicas y no patógenas en otras especies; por lo tanto, estas bacterias pueden utilizarse en las especies en las que no son patógenas o mutadas de modo que no sean patógenas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "animales no humanos" se refiere a todos los animales no humanos, incluidos, entre otros, los vertebrados, como p. ej. roedores, primates no humanos, ovinos, bovinos, rumiantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "cultivo celular" se refiere a cualquier cultivo de células in vitro, incluyendo, por ejemplo, células procariotas y células eucariotas. Dentro de este término se incluyen líneas celulares continuas (por ejemplo, con un fenotipo inmortal), cultivos de células primarias, líneas de células transformadas, líneas de células finitas (por ejemplo, células no transformadas), cultivos bacterianos en medios sólidos o sobre estos, o en medios líquidos, y cualquier otra población celular mantenida in vitro.

El término "recubrimiento", tal y como se usa en este documento, se refiere a una capa de material que cubre, por ejemplo, algún dispositivo médico o alguna parte del mismo. Puede aplicarse un recubrimiento a una superficie o impregnarse dentro del material del implante.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "agente antimicrobiano" se refiere a una composición que disminuye, previene o inhibe el crecimiento de organismos bacterianos y/o fúngicos. Los ejemplos de agentes antimicrobianos incluyen, por ejemplo, antibióticos y antisépticos.

El término "antiséptico", tal y como se usa en este documento, se define como una sustancia antimicrobiana que inhibe la acción de microorganismos, incluyendo, entre otros, a-terpineol, metilisotiazolona, cloruro de cetilpiridinio, cloroxilenol, hexaclorofeno, clorhexidina y otras biguanidas catiónicas, cloruro de metileno, yodo y yodóforos, triclosán, taurinamidas, nitrofurantoína, metenamina, aldehídos, ácido azílico, plata, peróxido de bencilo, alcoholes y ácidos y sales carboxílicos. Todo experto en la técnica es consciente de que estos antisépticos pueden usarse en combinaciones de dos o más para obtener un efecto sinérgico o aditivo. Algunos ejemplos de combinaciones de antisépticos incluyen una mezcla de clorhexidina, como clorhexidina y cloroxilenol, clorhexidina y metilisotiazolona, clorhexidina y (a-terpineol, metilisotiazolona y a-terpineol; timol y cloroxilenol; clorhexidina y cloruro de cetilpiridimiotiazolidina; o clorhexidina y cloruro, metilisotiazolona y timol. Estas combinaciones proporcionan un amplio espectro de actividad contra una amplia variedad de organismos.

El término "antibióticos", tal y como se usa en este documento, se define como una sustancia que inhibe el crecimiento de microorganismos, preferiblemente sin dañar al huésped. Por ejemplo, el antibiótico puede inhibir la síntesis de la pared celular, la síntesis de proteínas, la síntesis de ácidos nucleicos o modificar la función de la membrana celular.

Las diversas clases de antibióticos incluyen, entre otros, macrólidos (p. ej., eritromicina), penicilinas (p. ej., nafcilina), cefalosporinas (p. ej., cefazolina), carbapenémicos (p. ej., imipenem), monobactam (p. ej., aztreonam), otros antibióticos betalactámicos, inhibidores betalactámicos (por ejemplo, sulbactam), oxalinas (por ejemplo, linezolid), aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina), cloranfenicol, sufonamidas (por ejemplo, sulfametoxazol), glucopéptidos (por ejemplo, vancomicina), quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina), tetraciclinas (p. ej., minociclina), ácido fusídico, trimetoprim, metronidazol, clindamicina, mupirocina, rifamicinas (p. ej., rifampina), estreptograminas (p. ej., quinupristina y dalfopristina), lipoproteínas (p. ej., daptomicina), polienos (p. ej., anfotericina B), azoles (p. ej. fluconazol) y equinocandinas (p. ej., acetato de caspofungina).

Los ejemplos de antibióticos específicos incluyen, entre otros, eritromicina, nafcilina, cefazolina, imipenem, aztreonam, gentamicina, sulfametoxazol, vancomicina, ciprofloxacina, trimetoprim, rifampicina, metronidazol, clindamicina, teicoplanina, mupirocina, azitromicina, claritromicina, ofloxacina, lomefloxacina, norfloxacina, ácido nalidíxico, esparfloxacina, pefloxacina, amifloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina, gemifloxacina, enoxacina, fleroxacina, minociclina, linezolid, temafloxacina, tosufloxacina, clinafloxacina, ácido sulbactam, ácido clavulánico, amfotericina B, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, y nistatina. Otros ejemplos de antibióticos, como los enumerados en Sakamoto et al, patente de EE.UU. 4.642.104, pueden ser sugeridos fácilmente a los expertos en la técnica.

Tal y como se usa en este documento, el término "muestra" se usa en su sentido más amplio. En cierto sentido, se pretende que incluya una muestra o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse a partir de animales (incluidos los seres humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, como plasma, suero, etc. Sin embargo, tales ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no se encuentran dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. La presente descripción se refiere a composiciones y métodos para desestabilizar biopelículas, modificar su estructura 3D y dispersarlas, con el fin de mejorar la eliminación de las células de las biopelículas y/o la sensibilidad frente a otros agentes (por ejemplo, tratamientos locales o aplicados conjuntamente). En particular, la presente descripción se refiere al uso de L-arginina en la eliminación y/o sensibilización (por ejemplo, frente a antimicrobianos) de microorganismos en aplicaciones médicas, industriales, domésticas o ambientales, así como al tratamiento de infecciones bacterianas (por ejemplo, en biopelículas).

Una biopelícula es un agregado de microorganismos en el que las células se adhieren entre sí y/o a una superficie. Estas células adherentes están frecuentemente incrustadas dentro de una matriz autoproducida de alguna sustancia polimérica extracelular (EPS). La EPS de la biopelícula, también denominada limo, es un conglomerado polimérico compuesto generalmente de ADN extracelular, proteínas y polisacáridos en diversas configuraciones y de diversas composiciones. Las biopelículas pueden formarse en superficies vivas o no vivas, y representan un modo predominante de vida microbiana en entornos naturales, industriales y clínicos. Las células microbianas que crecen en una biopelícula son fisiológicamente distintas de las células planctónicas del mismo organismo, que, por el contrario, son células individuales que pueden flotar o nadar en un medio líquido.

Las biopelículas microbianas se forman como respuesta a muchos factores que incluyen, entre otros, el reconocimiento celular de sitios de unión específicos o no específicos en una superficie, señales nutricionales o, en algunos casos, por exposición de células planctónicas a concentraciones subinhibidoras de antibióticos. Cuando una célula cambia al modo de crecimiento de la biopelícula, experimenta un cambio fenotípico en el comportamiento en el que grandes conjuntos de genes se regulan de manera diferencial (Petrova et al., J. Bacteriol. 2012 Mayo; 194 (10): 2413-25; Stoodley et al., Annu Rev Microbiol. 2002;56:187-209).

Aunque la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, no esté limitada por ningún tipo de biopelícula, la formación de biopelículas comienza típicamente con la unión de microorganismos que flotan libremente sobre una superficie. Estas primeras colonias se adhieren a la superficie inicialmente a través de fuerzas de Van der Waals débiles y reversibles. Si las colonias no se separan inmediatamente de la superficie, pueden anclarse de forma más permanente utilizando estructuras de adhesión celular como los pili.

Las colonias iniciales comúnmente facilitan la llegada de otras células al proporcionar sitios de adhesión más diversos y comenzar a construir la matriz que mantiene unida la biopelícula. Algunas especies no pueden adherirse a una superficie por sí solas, pero, a menudo, pueden anclarse a la matriz o directamente a las primeras colonias. Es durante esta colonización que las células pueden comunicarse a través de la detección de quórum, por ejemplo, utilizando compuestos como la N-acil homoserina lactona (AHL). Una vez que se inicia la colonización, la biopelícula crece mediante una combinación de división celular y reclutamiento. La etapa final de la formación de biopelículas se conoce como desarrollo, aunque en este documento los términos "formación" y "desarrollo" se usan indistintamente. En esta etapa final, la biopelícula se establece y solo puede cambiar de forma y tamaño. El desarrollo de una biopelícula puede permitir que una colonia (o colonias) de células agregadas sea cada vez más resistente a los antibióticos.

La dispersión de células de la colonia de biopelículas es una etapa esencial del ciclo de vida de las biopelículas. La dispersión permite que las biopelículas se propaguen y colonicen nuevas superficies. Las enzimas que degradan la matriz extracelular de la biopelícula, como la dispersina B y la desoxirribonucleasa, pueden desempeñar un papel en la dispersión del biopelícula (Whitchurch et al. (2002) Science 295: 1487). Las enzimas que degradan la matriz de las biopelículas pueden ser útiles como agentes anti-biopelícula (Kaplan et al. (2004) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48 (7): 2633-6; Xavier et al. (2005) Microbiology 151 (Pt 12): 3817-32). Un mensajero de ácidos grasos, el ácido cis-2-decenoico, puede inducir la dispersión e inhibir el crecimiento de colonias de biopelículas. Secretado por Pseudomonas aeruginosa, este compuesto induce la dispersión en varias especies de bacterias y la levadura Candida albicans (Davies et al. (2009) Journal of Bacteriology, 191 (5): 1393-403).

Las biopelículas son ubicuas y generalmente se encuentran en sustratos sólidos sumergidos o expuestos a alguna solución acuosa, aunque pueden formarse como capas flotantes en superficies líquidas y también en la superficie de las hojas, particularmente en climas de mucha humedad. Con suficientes recursos para el crecimiento, las biopelículas crecerán rápidamente hasta ser macroscópicas. Muchos tipos de microbios pueden formar biopelículas, por ejemplo, bacterias, arqueas, protozoos, hongos y algas. Las biopelículas pueden comprender un solo tipo de microbio (biopelículas de una sola especie) o, comúnmente, varios tipos. En algunas biopelículas de especies mixtas, cada grupo realiza funciones metabólicas especializadas.

Las biopelículas se forman en ambientes que incluyen, entre otros: sustratos (por ejemplo, rocas, guijarros) en cuerpos de agua naturales (por ejemplo, ríos, piscinas, arroyos, océanos, manantiales); ambientes extremos (p. ej., manantiales termales, incluidas aguas con pH extremadamente ácido o extremadamente alcalino; glaciares congelados); entornos residenciales e industriales en los que las superficies sólidas estén expuestas a líquidos (por ejemplo, duchas, tuberías de agua y alcantarillado, pisos y mostradores en áreas de preparación o procesamiento de alimentos, sistemas de refrigeración por agua, sistemas de ingeniería marina); cascos e interiores de embarcaciones marinas; instalaciones de tratamiento de aguas residuales y aguas (por ejemplo, filtros de agua, tuberías, tanques de almacenamiento); aguas contaminadas; dentro o sobre organismos vivos (por ejemplo, placa dental, colonización superficial o infección, por ejemplo, de la piel, superficies de tejidos u órganos o cavidades corporales o en sitios de heridas; epidermis de plantas, interior de plantas); en las superficies inertes de dispositivos implantados tales como catéteres, válvulas cardíacas protésicas, articulaciones artificiales y dispositivos intrauterinos, etc.

Las biopelículas están involucradas en una amplia variedad de infecciones microbianas en el cuerpo. Los procesos infecciosos en los que están implicadas biopelículas incluyen, entre otros, infecciones del tracto urinario, infecciones del catéter, infecciones del oído medio, formación de la placa dental y gingivitis, contaminación por lentes de contacto (Imamura et al. (2008) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52 (1): 171-82), y procesos menos comunes pero más letales como la endocarditis, infecciones en fibrosis quística e infecciones de dispositivos permanentes como prótesis articulares y válvulas cardíacas (Lewis et al. (2001) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45 (4): 999-1007; Parsek et al. (2003) Annual Review of Microbiology, 57: 677-701). Las biopelículas bacterianas pueden afectar a la cicatrización de heridas cutáneas y reducir la eficacia antibacteriana tópica en la cicatrización o el tratamiento de heridas cutáneas infectadas (Davis et al. (2008) Wound Repair and Regeneration, 16 (1): 23-9).

La agregación conjunta es el reconocimiento y la adhesión altamente específicos de bacterias genéticamente distintas mediadas por adhesinas proteicas complementarias y receptores de polisacáridos en la superficie celular de las células en agregación conjunta (Kolenbrander, Annu Rev Microbiol 54, 413-437, 2000; Rickard et al., Trends Microbiol 11, 94-100, 2003 a). Este fenómeno es distinto de la autoagregación, que es el reconocimiento y la adhesión de bacterias genéticamente idénticas entre sí (Khemaleelakul et al., J Endod 32, 312-318, 2006; Rickard et al., FEMS Microbiol Lett 220, 133-140, 2003b; Van Houdt y Michiels, Res Microbiol 156, 626-633, 2005). La agregación conjunta se describió por primera vez entre las bacterias de la placa dental humana en 1970 (Gibbons & Nygaard, Arch Oral Biol 15, 1397-1400, 1970), y el trabajo de las últimas dos décadas ha demostrado que también ocurre entre bacterias aisladas del intestino humano, el tracto urogenital humano, en flóculos de aguas residuales y biopelículas de agua dulce (Ledder et al., FEMS Microbiol Ecol 66, 630-636, 2008; Phuong et al., J Biotechnol, 2011; Reid et al., Can J Microbiol 34, 344- 351, 1988; Rickard et al., Appl Environ Microbiol 66, 431-434, 2000; Simoes et al., Appl Environ Microbiol 74, 1259-1263, 2008). También se ha demostrado que se produce agregación conjunta entre numerosas especies de agua dulce taxonómicamente distintas (Rickard et al., Appl Environ Microbiol 68, 3644­ 3650, 2002; Rickard et al., 2003b, supra; Rickard et al., Appl Environ Microbiol 70, 7426-7435, 2004b; Simoes et al., Appl Environ Microbiol 74, 1259-1263, 2008) y en poblaciones planctónicas y de biopelículas (Rickard et al., J Appl Microbiol 96, 1367-1373, 2004 a). Los estudios de agregación conjunta entre Sphingomonas (Blastomonas) natatoria y Micrococcus luteus demostraron que la capacidad de la especie para coagregarse modifica el desarrollo de las biopelículas de dos especies tanto en entornos fluidos como estáticos (Min & Rickard, Appl Environ Microbiol 75, 3987-3997, 2009; Min et al., Biofouling 26, 931-940, 2010). La agregación conjunta puede mediar el desarrollo de biopelículas, cambios arquitectónicos y modificaciones en la composición de las especies (Hojo et al., J Dent Res 88, 982-990, 2009; Kolenbrander et al., Periodontol 200042, 47-79, 2006; Rickard et al., 2003a, supra). Además, la agregación conjunta puede desempeñar un papel en la promoción u obstaculización de la integración de especies patógenas en biopelículas de agua dulce (Buswell et al., Appl Environ Microbiol 64, 733-741, 1998). Se puede encontrar evidencias que apoyen tal posibilidad en estudios de biopelículas de placa dental donde se ha indicado que la agregación conjunta promueve la integración de patógenos orales como Porphyromonas gingivalis (Kolenbrander et al., Periodontol 200042, 47-79, 2006; Whitmore & Lamont, Mol Microbiol 81,305-314, 2011).

La placa dental está compuesta por cientos de especies de bacterias que pueden causar colectivamente enfermedades orales y sistémicas (Jakubovics et al., Oral diseases, 2010;16(8): 729-39; Kuo et al., Public Health, 2008;122(4):417-33). Durante el desarrollo de la placa dental, las bacterias detectan y responden a numerosos productos químicos exógenos derivados de bacterias o ambientales que modifican su capacidad para establecerse dentro de estas biopelículas.

Las biopelículas orales causan problemas importantes tanto en los países industrializados como en los países en desarrollo. Los datos de encuestas recientes indican que el 23,7% de los adultos estadounidenses tiene caries dentales no tratadas, mientras que el 38,5% de los adultos tienen periodontitis de moderada a grave (National Center for Health Statistics. Health, United States, 2011: With Special Feature on Socioeconomic Status and Health. Hyattsville, MD: 2012; Eke et al., Journal of dental research. 2012;91(10):914-20). La caries dental no tratada también afecta a entre el 15-20% de los niños hasta los 19 años, mientras que la periodontitis es un problema importante en la población anciana, donde el 64% de los adultos mayores de 65 años padece formas entre moderadas y graves de la afección (National Center for Health Statistics. Health, United States, 2011: With Special Feature on Socioeconomic Status and Health. Hyattsville, MD: 2012; Eke et al., Journal of dental research, 2012;91(10):914-20). Claramente, se necesitan con urgencia nuevos métodos para controlar las enfermedades relacionadas con la placa dental.

La placa dental consiste en una colonia bacteriana homeostática finamente equilibrada (Marsh et al., Periodontology 2000. 2011 ;55(1):16-35). La presente descripción proporciona una intervención de acción amplia que modifica el equilibrio de dichas colonias bacterianas orales y que es más eficaz en el control de las enfermedades relacionadas con la placa dental que las estrategias que se dirigen a eliminar especies individuales. La placa dental contiene una colonia interactiva "consciente" de microbios. En las superficies dentales limpias, la placa dental se desarrolla a través de una sucesión microbiana (Jakubovics et al, supra; Kolenbrander et al., Nature reviews Microbiology, 2010; 8(7): 471-80; Kolenbrander et al., Periodontology 2000. 2006; 42:47-79 23, 24). Los colonizadores iniciales, predominantemente especies de Streptococcus, se adhieren a la película salival y producen capas delgadas de biopelícula que impulsan la integración de otras especies a través de la agregación conjunta, la señalización entre células y el reconocimiento de metabolitos (Jakubovics et al, supra; Kolenbrander et al., Nature reviews Microbiology, 2010;8(7): 471-80; Hojo et al., Journal of dental research. 2009;88(11):982-90; Rickard et al., Trends Microbiol. 2003;11 (2):94-100; Bowden et al., Advances in dental research, 1997;11 (1 ):81 -99). La agregación conjunta implica el reconocimiento y la adhesión específicos entre bacterias y acerca a diferentes especies. Esto aumenta el potencial para intercambiar moléculas o metabolitos de señalización entre células (Kolenbrander et al., Nature reviews Microbiology, 2010;8(7): 471-80; Hojo et al., Supra). Por ejemplo, la molécula de señalización autoinducer-2 (AI-2) media el crecimiento mutualista de las parejas coagregantes Streptococcus oralis y Actinomyces oris, y facilita el desarrollo de biopelículas que contienen a las parejas coagulantes S. gordonii y S. oralis (Cuadra-Saenz et al., Microbiology, 2012;158 (Pt 7): 1783-95; Rickard et al., Molecular microbiology, 2006; 60(6):1446-56). Ejemplos de metabolitos importantes incluyen el peróxido de hidrógeno, que es producido por algunos estreptococos, y que inhibe a otras especies, incluidos los estreptococos mutantes (Zhu et al., Oxid Med Cell Longev. 2012; 2012: 717843), y el lactato, que es producido por estreptococos y utilizado por coagregar especies de Veillonella para obtener energía, (Egland et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004;101(48):16917-22). La arginina es importante en el intercambio de metabolitos (Jakubovics et al., supra) pero, a diferencia de otros mecanismos de comunicación, también bloquea la agregación conjunta entre bacterias orales y parece tener un impacto importante en la estructura de la biopelícula (Edwards et al., Oral microbiology and immunology, 2007;22(4): 217-24; Sato et al., J Microbiol Immunol Infect. 2012; Ellen et al., Oral microbiology and immunology, 1992;7(4):198-203).

Por lo tanto, la arginina, aunque ha recibido poca atención hasta la fecha, es un moderador global clave en el desarrollo de biopelículas y un componente fundamental en la aparición de caries o enfermedades periodontales (Nascimento et al., Oral microbiology and immunology, 2009;24(2):89-95). El concepto de 'virulencia nutricional', según el cual los sistemas bacterianos que adquieren los nutrientes del huésped se consideran factores clave para la patogénesis, está emergiendo como un paradigma importante en las enfermedades infecciosas (Abu Kwaik et al., Celular microbiology, 2013;15(6):882-90). Los aminoácidos en particular son a menudo un recurso limitante del crecimiento de las bacterias. Incluso cuando las especies poseen todos los genes necesarios para la biosíntesis de aminoácidos, pueden ser funcionalmente auxotróficas en determinadas condiciones. Por ejemplo, Staphylococcus aureus posee la vía genética completa que codifica la biosíntesis de L-arginina a partir de L-glutamato, pero no puede crecer in vitro sin L-arginina (Nuxoll et al., PLoS pathogens. 2012; 8 (11): e1003033). De manera similar, S. gordonii puede biosintetizar L-arginina anaeróbicamente pero es un auxótrofo de arginina funcional en condiciones aeróbicas (Jakubovics et al., supra). Los estreptococos orales poseen diversos requisitos de aminoácidos in vitro (Cowman et al., Applied microbiology. 1975;30(3): 374-80; Cowman et al., Journal of dental research, 1978; 57(1): 48; Terleckyj et al., Infect Immun. 1975; 11 (4): 656-64), y no se comprende bien cómo estas deficiencias nutricionales restringen el crecimiento de la placa dental. Las primeras bacterias colonizadoras obtienen la mayoría de sus nutrientes de la saliva (Bowden et al., Advances in dental research, 1997;11 (1 ):81 -99). La saliva humana puede contener hasta 40 pM de arginina libre (Van Wuyckhuyse et al., Journal of dental research, 1995;74(2):686-90). S. gordonii no puede crecer aeróbicamente en L-arginina <25 pM (Jakubovics et al., Supra). La restricción de arginina en el crecimiento de S. gordonii puede superarse mediante la agregación conjunta con A. oris (Jakubovics et al., supra). La expresión de genes en la biosíntesis de arginina de S. gordonii está fuertemente desregulada en los coagregados en comparación con los monocultivos, lo que indica que la agregación conjunta alivia el estrés por bajo contenido en arginina. Además, la agregación conjunta con A. oris estimula el crecimiento de S. gordonii en condiciones limitantes de arginina. Por lo tanto, las interacciones entre bacterias son importantes para su crecimiento en la saliva.

I. Métodos terapéuticos

Los experimentos realizados durante el curso del desarrollo de las realizaciones de la presente descripción demostraron que las altas concentraciones de arginina anulan la formación de biopelículas por S. gordonii. La formación de biopelículas fue muy sensible a los niveles milimolares de arginina de una manera dependiente de la dosis.

Se cree que las concentraciones de arginina en la saliva permanecen bajas debido a la absorción continua en las células y al recambio por parte de los sistemas bacterianos de arginina desiaminasa (ADS), que cataboliza la arginina en ATP, amoníaco y L-glutamina (Van Wuyckhuyse et al., Journal of dental research, 1995;74(2):686-90). La producción de amoníaco aumenta el pH local de la placa, que protege contra la caries (Liu et al., International journal of oral science, 2012;4(3):135-40). Las ADS de los patógenos oportunistas Pseudomonas aeruginosa y S. aureus están sobrereguladas en las biopelículas y estos sistemas son esenciales para proteger a las células del oxígeno y de los ácidos derivados de la glucólisis (39, 40). Se ha demostrado que las ADS de estreptococos orales influyen en la formación de biopelículas en sistemas de especies mixtas, donde la eliminación de L-arginina por ADS de S. intermedius inhibe la formación de biopelículas por el patógeno periodontal P. gingivalis (Cugini et al., Microbiology. 2013;159(Pt 2): 275-85). La producción de ADS está controlada a nivel de transcripción por reguladores de la familia ArgR / AhrC como ArcR (Liu et al., Applied and enviromental microbiology, 2008;74(16): 5023-30; Zeng et al., Journal of bacteriology, 2006;188(3):941 -9). ArcR es importante en la formación de biopelículas de S. gordonii en medios de crecimiento ricos en nutrientes.

Otros experimentos descritos en el presente documento demostraron que la L-arginina reduce el potencial patogénico de las biopelículas reduciendo la biomasa de las biopelículas y reduciendo la cantidad total y la proporción de patógenos (por ejemplo, sin actividad antimicrobiana directa); y la L-arginina aumenta / mejora la actividad de agentes antimicrobianos como CPC. Esto se logra mediante la mejora del acceso de agentes antimicrobianos al soltar la biopelícula y también al modificar la tasa de crecimiento de las bacterias; la L-arginina provoca una desregulación en la señalización celular; la L-arginina es un tratamiento combinado que sobreregula el metabolismo, modifica la señalización entre células e inhibe la adhesión entre células; y la L-arginina aumenta la proporción de bacterias beneficiosas que pueden combatir los efectos negativos de patógenos potenciales como S. mutans.

En consecuencia, la presente descripción proporciona composiciones (p. ej., composiciones o kits farmacéuticos o de investigación) que comprenden L-arginina (p. ej., sola o en combinación con CPC) y métodos farmacéuticos, industriales o de investigación de uso de L-arginina en el tratamiento y la prevención de infecciones bacterianas (por ejemplo, placa dental) y en la descontaminación de superficies (por ejemplo, superficies de dispositivos médicos). La presente descripción proporciona composiciones y métodos para usar L-arginina y bloquear las interacciones entre células (adhesión) dentro de una biopelícula, bloquear la homeostasis bacteriana, inducir daño y muerte celular, bloquear los procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de homeostasis, bloquear la adhesión entre células en biopelículas, reordenamiento de arquitectura en 3D en la biopelícula, bloquear la señalización entre células, bloquear las interacciones metabólicas entre células y/o bloquear la adhesión a las superficies.

La L-arginina puede inducir uno o más de las anteriores funciones que operan individual y colectivamente matando y/o reduciendo la actividad celular y la biomasa de la biopelícula. También puede permitir una mejor eliminación con agentes antimicrobianos (p. ej. L-arginina - agentes antimicrobianos o cócteles).

La presente descripción proporciona composiciones que comprenden L-arginina, sola o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable u otro material de administración deseado (por ejemplo, un limpiador o desinfectante, etc.).

La presente descripción proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones para el cuidado dental como pasta de dientes, enjuague bucal, etc.) que comprenden L-arginina en combinación, por ejemplo, con CPC.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos, enjuagues bucales y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes, etc.

Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobres o tabletas. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, coadyuvantes de dispersión o aglutinantes.

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, entre otros, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción incluyen, entre otros, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, entre otros, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.

Las formulaciones farmacéuticas, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales habituales en la industria farmacéutica.

Las composiciones pueden contener además otros componentes adjuntos que se encuentren convencionalmente en las composiciones farmacéuticas. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, agentes antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener otros materiales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones, como p. ej. colorantes, aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espesantes y estabilizadores. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales que influyen en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúan de forma perjudicial con los agentes activos de la formulación.

La composición farmacéutica puede contener a) L-arginina, y b) uno o más de otros agentes útiles para matar o prevenir el crecimiento de microorganismos (por ejemplo, antibióticos) o influir en el crecimiento, formación o impacto en la salud o microorganismos en biopelículas.

La presente descripción proporciona kits, composiciones farmacéuticas u otros sistemas de administración para el uso de L-arginina en el tratamiento o la prevención de infecciones bacterianas o biopelículas presentes en las superficies (por ejemplo, la placa dental). El kit puede incluir todos y cada uno de los componentes necesarios, útiles o suficientes para la investigación o usos terapéuticos que incluyen, entre otros, a la L-arginina, vehículos farmacéuticos y otros componentes útiles, necesarios o suficientes para tratar o prevenir las infecciones bacterianas. Los kits pueden proporcionar un subconjunto de los componentes requeridos, en donde se espera que el usuario suministre los componentes restantes. Los kits pueden comprender dos o más contenedores separados en los que cada contenedor alberga un subconjunto de los componentes que se van a administrar. Opcionalmente, las composiciones y los kits comprenden otros componentes activos que logran los efectos terapéuticos deseados. La L-arginina se puede utilizar para matar bacterias en coagregados o biopelículas. Las composiciones que comprenden L-arginina descritas en el presente documento encuentran su uso en la eliminación o inhibición del crecimiento de una variedad de microorganismos (por ejemplo, bacterias u hongos patógenos). La L-arginina o las composiciones que comprenden L-arginina pueden encontrar uso en el tratamiento de infecciones bacterianas en el cuerpo o sobre éste (por ejemplo, infecciones bacterianas en coagregados o biopelículas). La L-arginina o sus composiciones pueden usarse para tratar infecciones bacterianas en heridas, sepsis, infecciones bacterianas patógenas en el estómago o intestino, etc.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de forma continua o seguida (por ejemplo, una o más veces al día, dos o más veces al día, una o más veces a la semana, etc.). Las composiciones se pueden administrar de forma continua (por ejemplo, a través de un parche cutáneo, vendaje o formulación de liberación prolongada). Las composiciones se pueden administrar una, dos, 5 veces, 10 veces o más. Las composiciones pueden administrarse durante un período de semanas, meses, años o indefinidamente.

La L-arginina o las composiciones que comprenden L-arginina pueden encontrar uso en la descontaminación de dispositivos médicos (por ejemplo, catéteres, espéculos y similares) o dispositivos médicos implantables (por ejemplo, marcapasos, desfibriladores internos, articulaciones o huesos artificiales, etc.).

La L-arginina o las composiciones que comprenden L-arginina pueden encontrar uso en la descontaminación de superficies (por ejemplo, superficies que comprenden biopelículas). Los ejemplos incluyen, entre otros, superficies domésticas, hospitales o superficies clínicas (por ejemplo, mesas de exploración, quirófanos, etc.), etc.

La L-arginina o las composiciones que comprenden L-arginina pueden encontrar uso en la descontaminación o protección de alimentos o áreas de preparación de alimentos. Por ejemplo, se puede aplicar L-arginina a un alimento después de la cosecha para protegerlo contra una contaminación futura o tratar la contaminación existente.

La L-arginina o las composiciones que comprenden L-arginina pueden encontrar uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades de las encías y caries dentales. Se puede agregar L-arginina al enjuague bucal, pasta de dientes u otros productos para el cuidado bucal.

II. Métodos y composiciones de cribado

La presente descripción proporciona composiciones y métodos para determinar los niveles de componentes de biopelículas (por ejemplo, arginina o AI-2) en biopelículas o células planctónicas. La arginina es internalizada por estreptococos y detectada a través de la acción de tres proteínas reguladoras diferentes pero relacionadas: ArcR, AhrC y ArgR. Estos modifican su conformación cuando se unen a la arginina de modo que se unen a las secuencias promotoras o se liberan de los promotores.

Por consiguiente, la presente descripción proporciona un plásmido que transfiere la expresión o concentración de un componente a una biopelícula o cultivo de células planctónicas. El plásmido puede comprender un primer marcador detectable (por ejemplo, fluorescente) bajo el control de un promotor bacteriano que se exprese constitutivamente o un segundo marcador (por ejemplo, un marcador fluorescente de color diferente), que sea inducido por el componente en la biopelícula (por ejemplo, arginina o AI-2 presente en la biopelícula o cultivo celular). La presente descripción no se limita a promotores o genes indicadores particulares. Los ejemplos de marcadores fluorescentes incluyen, entre otros, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, proteína verde fluorescente (GFP) o Mcherry. El promotor puede ser un promotor estreptocócico (p. ej., un promotor activo en S. gordonii tal como, p. ej., la proteína ribosómica de S. gordonii DL1 50S (SGO_1192), promotores de S. gordonii argC o arcA, o la proteína A del control de catabolitos (SGO_0773)). El promotor de la proteína ribosómica 50S u otros promotores ribosómicos estreptocócicos o promotores lactocócicos, tales como usp45, pueden servir como promotores de control para la expresión constitutiva del primer marcador. El promotor de la proteína A de control de catabolitos puede ser un indicador de AI-2. Los promotores argC o arcA pueden responder a la arginina.

La presente descripción proporciona métodos de uso de los plásmidos descritos en este documento para controlar la concentración de componentes (por ejemplo, arginina o AI-2) de una biopelícula o población de células planctónicas (por ejemplo, en una especie de estreptococo como S. gordonii), que comprende: a) poner en contacto una célula estreptocócica con los promotores descritos en este documento; y b) medir el nivel del marcador. El nivel de la señal del marcador bajo el control del promotor inducido por el componente de biopelícula externo o el promotor constitutivo puede compararse con el nivel de la señal de cantidades / concentraciones conocidas del componente (por ejemplo, una curva estándar). El nivel de fluorescencia puede correlacionarse entonces en un fluorímetro o sistema de formación de imágenes.

Los plásmidos informadores y los métodos pueden encontrar uso en aplicaciones de investigación, detección (p. ej., detección de drogas) y diagnósticos. Por ejemplo, los compuestos de prueba (por ejemplo, fármacos antimicrobianos) pueden añadirse a una biopelícula o población de células planctónicas y analizar su efecto en el compuesto de prueba respecto a los niveles de los componentes de la biopelícula (por ejemplo, arginina).

Parte experimental

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente descripción.

Ejemplo 1

Este ejemplo se refiere a biopelículas formadas por una sola especie bacteriana. En estos sistemas, la L-arginina tiene diversos efectos sobre la regulación de genes bacterianos, el fenotipo, el metabolismo y la formación de biopelículas.

La detección de arginina desencadena la regulación genética.

S. gordonii contiene la vía genética completa para la biosíntesis de L-arginina. Sin embargo, como S. aureus, éste es un auxótrofo de arginina funcional en condiciones de laboratorio (Jakubovics et al., supra, Nuxoll et al., PLoS pathogens. 2012; 8 (11): e1003033). Un cambio de medio repleto de arginina a medio deficiente en arginina dio como resultado un cambio marcado en el fenotipo de S. gordonii. Además de los genes que previamente se demostró que estaban regulados por una agregación conjunta, hubo una disminución significativa y patente en la expresión de varias adhesinas de la superficie celular (Tabla 1). En general, el metabolismo disminuyó con la excepción de la vía de biosíntesis de arginina, que se encontraba fuertemente sobreregulada (Figura 2). Estos datos son consistentes con el desarrollo de un estado celular de dispersión de biopelícula especializado, similar al producido por la bacteria acuática dimórfica Caulobacter crescentus, tras la limitación de nutrientes (England et al., Journal of bacteriology, 2010;192(3):819-33). Este ejemplo se refiere a biopelículas formadas por una sola especie bacteriana. En estos sistemas, la L-arginina tiene diversos efectos sobre la regulación de los genes bacterianos, el fenotipo, el metabolismo y la formación de biopelículas.

Formación de biopelículas en un sistema de biopelículas de microfluidos respetuoso con el medio ambiente.

Los efectos de la dosificación dependiente de arginina de las biopelículas de S. gordonii se evalúan en un sistema de microfluidos Bioflux modificado. La saliva humana se recolectó y agrupó a partir de >6 voluntarios diferentes (Cuadra-Saenz et al., Microbiology. 2012;158(Pt 7): 1783-95), diluido al 25%, y con suplementos adicionales (por ejemplo, sacarosa, hemina, BHI) añadidos según era necesario para simular diferentes condiciones. Téngase en cuenta que se cultivaron biopelículas sólidas incluso en saliva no suplementada minimizando la acumulación de saliva la variación en los componentes salivales. Para obtener una indicación de los niveles de arginina libre en la saliva combinada, la arginina se mide en >3 muestras de saliva combinadas diferentes utilizando técnicas estándar (Jakubovics et al., supra; Van Wuyckhuyse et al., Journal of dental research. 1995;74(2):686-90). Los 24 canales del sistema Bioflux se recubren con saliva, se inoculan con monocultivos de S. gordonii (o biopelículas multiespecie extraídos de la saliva) y se desarrollan biopelículas a 37°C con saliva sin células. Después de 20 h, las células se tiñen con tinción viva / muerta y se visualizan con una cámara Leica SPE CLSM. Los parámetros de biomasa y biopelícula estructural se cuantifican utilizando COMSTAT (Heydorn et al., Microbiology. 2000;146 (Pt 10): 2395­ 407), ImageJ (Collins, Biotechniques, 2007;43(1 Suppl): 25-30) y software IMARIS (Bitplane, Suiza). La Figura 3 muestra que altas concentraciones de arginina (500 mM) reducen significativamente la extensión de la biopelícula presente.

La arginina y la formación de biopelículas bacterianas.

Se ha demostrado que la arginina desempeña un papel clave en la formación de biopelículas y la colonización del hospedador por bacterias grampositivas y gramnegativas. Por ejemplo, a concentraciones fisiológicas que se encuentran en los esputos de fibrosis quística, la arginina promueve la formación de biopelículas de P. aeruginosa (Bernier et al., Research in microbiology, 2011;162(7):680-8). La arginina fue el único aminoácido que evitó la plaga de P. aeruginosa y, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en la promoción de un estilo de vida sésil en esta especie (Bernier et al., Supra). En S. aureus, el gen final en la ruta de biosíntesis de arginina, argH, es esencial para desarrollar la virulencia en un modelo de absceso renal de ratón, lo que indica que la arginina está restringida in vivo (Nuxoll et al., supra). Muchos estreptococos orales son auxótrofos, o condicionalmente auxótrofos, para la arginina (Jakubovics et al., supra, Cowman et al. Applied microbiology. 1975;30(3): 374-80; Terleckyj et al., Infect Immun.

1975;11 (4): 656-64; Cowman et al., Applied Microbiology, 1974;27(1): 86-92; Rogers et al., Journal of general microbiology, 1990;136(12):2545-50). La importancia de la vía de biosíntesis de arginina de S. gordonii para el crecimiento en biopelículas salivales se investiga utilizando un mutante argH y una cepa complementada. La presente invención no se limita a un mecanismo particular. De hecho, no es necesario comprender el mecanismo para poner en práctica la presente invención. No obstante, se contempla que la arginina es un nutriente limitante para los estreptococos deficientes en la biosíntesis de L-arginina que crecen como colonias de una sola especie en biopelículas salivales. Además, se contempla que la agregación conjunta con otras especies en la biopelícula supera los efectos de la restricción de L-arginina, pero está sujeta a modificaciones al añadir cantidades elevadas de L-arginina.

Catabolismo de arginina en biopelículas.

En células de biopelículas de P. aeruginosa, el metabolismo de la arginina está regulado positivamente en comparación con las células planctónicas, debido a un aumento en la expresión de genes que codifican el sistema deiminasa de arginina (ADS) (Xu et al., PloS one. 2013; 8 (2): e57050; Sauer et al., Journal of bacteriology, 2002;184(4):1140-54). El ADS es un componente clave del metabolismo anaeróbico en este organismo. El cambio a la fermentación anaeróbica mediada por ADS está relacionado con una mayor susceptibilidad de P. aeruginosa frente a ciprofloxacina y tobramicina (Borriello et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2004;48(7):2659-64). El ADS también es importante en la patogenicidad de S. aureus. De hecho, el linaje patógeno USA300 de S. aureus ha adquirido un elemento genético denominado Elemento Móvil Catabólico de Arginina (ACME, por sus siglas en inglés), que contiene genes que codifican una vía ADS y que se cree que es un factor clave para promover el crecimiento y la supervivencia en la piel (Otto et al., International journal of medical microbiology: IJMM.2013). Por lo tanto, el ACME puede ser importante para desarrollar la alta transmisibilidad de las cepas USA300.

Las altas concentraciones de arginina afectan negativamente a la capacidad de ciertas bacterias orales de colonizar biopelículas orales. Se ha demostrado que la arginina inhibe varias interacciones de agregación conjunta diferentes entre bacterias orales (Edwards et al., Oral microbiology e immunology, 2007;22(4): 217-24; George et al., Oral microbiology e immunology, 1992;7(5):285-90, PubMed PMID: 1494452; Kaplan et al., Molecular microbiology, 2009;71 (1): 35-47; Takemoto et al., Journal of periodontal research, 1993;28(1):21-6; Nagata et al., Journal of dental research, 1990;69(8):1476-9). Los datos descritos en el presente documento muestran que el bloqueo de la agregación conjunta dentro de las biopelículas orales conduce a la liberación de bacterias desde la biopelícula. Los nutrientes inducen a la dispersión de las biopelículas de P. aeruginosa y este fenómeno involucra a los genes necesarios para el metabolismo de la arginina (Sauer et al., Journal of bacteriology, 2004 186(21): 7312-7326). La Figura 4 muestra que en S. gordonii el gen que codifica ArcR, el regulador de los genes del sistema de la arginina deiminasa, es necesario para la formación de biopelículas por S. gordonii ya que una cepa que carece del gen arcR no forma biopelículas fuertes. Por lo tanto, la L-arginina es un regulador central en la formación de biopelículas.

Tabla 1. Genes de S. gordonii seleccionados fuertemente regulados, siguiendo un desplazamiento a bajas concentraciones de arginina. Para los loci multi-génicos, se indica el promedio del número de recambio a través del locus.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe el impacto de la L-arginina en las biopelículas orales que contienen especies cultivadas en condiciones representativas de la cavidad oral humana. Utilizando un enfoque basado en microfluidos, y saliva humana como inóculo y saliva humana esterilizada con filtro al 25% como fuente de nutrientes, se demostró que la L-arginina equilibrada con HCL (LAHCL) desestabiliza las biopelículas orales de una manera dependiente de la concentración. La desestabilización se expresó como la pérdida de la estructura de la biopelícula y el cambio en la pertenencia a la colonia bacteriana, según lo determinado por microscopía de barrido láser confocal y pirosecuenciación 454. Fueron evidentes diversos efectos antimicrobianos muy limitados y solo se detectaron como consecuencia de la perturbación de la biopelícula, y la concentración óptima para la desestabilización fue entre 50 y 500 mM. No se registraron cambios sustanciales en el pH, debido al uso de una L-arginina equilibrada con HCl (monoclorhidrato de L-arginina) y la capacidad tampón de la saliva humana.

Dado que los enfoques tradicionales para controlar las biopelículas orales dependen en gran medida de los agentes antimicrobianos y se demostró que la L-arginina tenía un efecto desestabilizador, se investigó la sinergia con otros antimicrobianos para inactivar más eficazmente las células de la biopelícula. La mezcla de L-arginina con cloruro de cetilpiridinio (CPC) dio como resultado una inactivación de la biopelícula al menos cinco veces mayor (por tinción de vivo / muerto). Tomado colectivamente, se demostró que la L-arginina tiene amplios efectos desestabilizadores de la biopelícula oral en condiciones representativas de la boca humana. Estos efectos se utilizan para eliminar biopelículas o mejorar las estrategias tradicionales de los tratamientos antimicrobianos basados en CPC.

Los resultados se muestran en las Figuras 5-11. La Figura 5 muestra los cambios en la composición de la colonia en biopelículas tratadas con L-arginina (500 mM). La Figura 6 muestra el efecto de la L-arginina (CLSM) en biopelículas de bacterias de múltiples especies en una colonia derivada de saliva desarrollada en saliva esterilizada con filtro agrupada en un sistema de microplacas estático (que no fluye). Una concentración 500 mM de L-arginina desestabilizó a colonias de biopelículas orales de múltiples especies reduciendo la biomasa de las biopelículas (y, por lo tanto, el número total de bacterias, incluidos los patógenos) y también hizo que la biopelícula fuera más difusa con respecto a la arquitectura. No se observó ninguna destrucción sustancial, aunque había un ligero aumento estadísticamente significativo en la "señal" roja que indicaba que las células muertas / dañadas que no respondían quedaban dentro de la biopelícula.

La Figura 7 muestra representaciones 3D representativas y características de la biopelícula derivadas del análisis de imágenes computacionales de biopelículas orales desarrolladas durante 20 h en diferentes concentraciones de monoclorhidrato de L-arginina (LAHCl) en el sistema de biopelícula de saliva fluido de Bioflux™. La señal verde indica células vivas viables y la señal roja indica células dañadas / muertas. La tabla asociada muestra los cambios en la viabilidad celular, la biomasa de la biopelícula, el espesor y la rugosidad. Los datos derivados de al menos 18 representaciones en tres experimentos y las desviaciones estándar se muestran entre paréntesis. *P <0,05; **P <0,01; **P <0,001: diferencias significativas con el control CFS.

La Figura 8 muestra que la L-arginina 500 mM desestabiliza las biopelículas orales de múltiples especies preformadas en diferentes edades de desarrollo.

La Figura 9 muestra que la L-arginina desestabiliza las colonias de biopelículas orales de múltiples especies y mejora la penetración de CPC. Como consecuencia, se utilizan concentraciones de CPC más bajas para lograr el mismo nivel de destrucción / inactivación / daño celular.

La Figura 10 muestra el número de veces de inducción de la producción de luciferasa en la cepa informadora BB170 de Vibrio harveyi normalizada con un control positivo (BB152). Se comparó una serie de control de CFS simple (saliva sin células) con las concentraciones dadas de arginina con el flujo de salida de microfluidos, que contenía cualquier molécula secretada de bacterias cultivadas con la concentración dada de L-arginina. Los valores se produjeron tomando primero promedios de 4 ensayos en cada concentración y dividiéndolos por el promedio del control negativo, creando un número de inducción. La cantidad de AI-2 producida a partir de biopelículas de múltiples especies aumenta a medida que aumentan las concentraciones de arginina utilizada para tratarlas. Esto indica que la L-arginina estimula a las colonias bacterianas, porque AI-2 es un indicador del metabolismo. Un alto nivel de AI-2 también puede tener un efecto desestabilizador en la colonia, lo que podría explicar o contribuir a los cambios estructurales observados en las biopelículas.

La Figura 11 muestra que la aplicación de L-arginina modifica las colonias de biopelículas bacterianas, pero la D-arginina no tiene el mismo efecto. Por lo tanto, los efectos desestabilizadores de la arginina son específicos de la forma L.

En conclusión, estos ejemplos demuestran que la L-arginina reduce el potencial patogénico de las biopelículas reduciendo la biomasa de las biopelículas y la cantidad total y proporción de patógenos; L-arginina aumenta / mejora la actividad de agentes antimicrobianos como el CPC. Esto se logra mediante la mejora de la entrada de agentes antimicrobianos que sueltan la biopelícula y también que modifican la tasa de crecimiento de las bacterias; la L-arginina provoca una desregulación de la señalización celular; la L-arginina es un tratamiento combinado que regula al alza el metabolismo, modifica la señalización entre células e inhibe la adhesión entre células; y la L-arginina aumenta la proporción de bacterias beneficiosas que pueden combatir los efectos negativos de patógenos como S. mutans. La proporción de especies de Veillonella aumenta en las biopelículas al igual que las proporciones de estreptococos no cariogénicos.

Ejemplo 3

Se utilizó un plásmido (véase, por ejemplo, la Figura 12) para controlar la expresión de genes indicadores en presencia de arginina o AI-2. La estructura de pPE1010 descrita en England et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 30 de noviembre de 2004; 101 (48): 16917-22, Epub 2004 Nov 16) se modificó para expresar genes fluorescentes como GFP o Mcherry en DL1 de S. gordonii u otras especies de estreptococos. Específicamente, los promotores de genes regulados diferencialmente se insertaban cadena arriba de un gen de GFP o Mcherry albergado en pPE1010 (o un sistema de vector lanzadera de plásmido estreptocócico similar) expresándose diferencialmente (Figura 12A y 12B). Se realizó un ejemplo (Figura 12B) mostrando una expresión diferencial mínima por una proteína ribosómica 50S (SGO_1192; gen rplJ responsable de la proteína ribosómica 50S muy abundante L10) cuando se exponía al autoinductor-2 (AI-2) agregado exógenamente en comparación con la expresión génica drásticamente diferente por la proteína A de control de catabolitos (SGO_0773; ccpA). El plásmido proporciona sondas fluorescentes de producción constitutiva que permiten monitorear bacterias en biopelículas y sistemas informadores que indican las concentraciones de arginina (o AI-2) en biopelículas, como las que se encuentran en las biopelículas de la placa dental.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para inducir daño celular, matar células, bloquear procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de homeostasis, bloquear la adhesión entre células, inducir el reordenamiento tridimensional de la arquitectura, bloquear la señalización entre células, modificar las interacciones del metabolismo entre células, bloquear la adhesión a las superficies, reducir el potencial patogénico de las biopelículas, reducir la masa de la biopelícula, disminuir la proporción de bacterias patógenas en biopelículas, aumentar la proporción de bacterias beneficiosas en biopelículas y/o prevenir el crecimiento de microorganismos en biopelículas, que comprende: poner en contacto bacterias en una biopelícula con L-arginina sin células a una concentración de al menos 1 mM, en el que dicha puesta en contacto da como resultado uno o más de: inducir daño celular, matar células, bloquear procesos intracelulares que conducen a la desregulación / pérdida de homeostasis, modificar la adhesión entre células, inducir el reordenamiento tridimensional de la arquitectura, modificar la señalización entre células, modificar las interacciones metabólicas entre células, interrumpir la adhesión a las superficies, reducir el potencial patogénico de las biopelículas, aumentar la proporción de bacterias beneficiosas en biopelículas y prevenir el crecimiento de dichos microorganismos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo es una bacteria, preferiblemente en el que dichas bacterias están en un coagregado.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dichas bacterias están en un coagregado o biopelícula con una pluralidad de especies bacterianas diferentes, en el que preferiblemente dichas especies bacterianas son Streptococci spp. y Actinomyces spp., en donde otras de las mencionadas especies bacterianas preferidas son S. gordonii y A. oris.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha L-arginina evita la agregación conjunta o la desadhesión / dispersión de dichas bacterias.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha L-arginina está presente en una concentración de al menos 100 mM, preferiblemente al menos 200 mM, más preferiblemente al menos 500 mM.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto dichas bacterias con cloruro de cetilpiridinio (CPC).

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha biopelícula está en la saliva y dicha L-arginina modifica dicha biopelícula sin actividad antimicrobiana.

8. Una composición que comprende L-arginina a una concentración de al menos 1 mM para su uso en un método para reducir el potencial patogénico de biopelículas, disminuir la proporción de bacterias patógenas en biopelículas y/o prevenir el crecimiento de microorganismos en biopelículas, y en el que dicha biopelícula es una biopelícula dental.

9. La composición para uso de la reivindicación 8, en la que dicho microorganismo es una bacteria, preferiblemente en la que dichas bacterias están en un coagregado.

10. La composición para su uso de la reivindicación 9, en la que dichas bacterias están en un coagregado o biopelícula con una pluralidad de diferentes especies bacterianas, en donde preferiblemente dichas especies bacterianas son Streptococci spp. y Actinomyces spp., en donde otras de las especies bacterianas mencionadas preferidas son S. gordonii y A. oris.

11. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que dicha L-arginina previene la agregación conjunta o la desadhesión / dispersión de dichas bacterias.

12. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que dicha L-arginina está presente a una concentración de al menos 100 mM, preferiblemente al menos 200 mM, más preferiblemente al menos 500 mM.

13. La composición para su uso de la reivindicación 8, en la que dicha composición comprende además CPC.

14. La composición para uso de la reivindicación 8, en la que dicha biopelícula está en la saliva y dicha L-arginina rompe dicha biopelícula sin actividad antimicrobiana.

15. El uso in vitro de una composición que comprende L-arginina a una concentración de al menos 1 mM para reducir el potencial patogénico de las biopelículas, disminuir la proporción de bacterias patógenas en biopelículas, prevenir el crecimiento de microorganismos en biopelículas, modificar la adhesión entre células, inducir el reordenamiento tridimensional de la arquitectura, modificar la señalización entre células, modificar las interacciones metabólicas entre células, modificar la adhesión a las superficies.