ES2342692T3 - Uso de polisacaridos bacterianos para la inhibicion de biopeliculas. - Google Patents
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Abstract
Uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación de una composición que previene o inhibe la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas.
Description
Uso de polisacáridos bacterianos para la
inhibición de biopelículas.
La presente invención pertenece al campo de la
prevención de biopelículas. Más particularmente, la invención
proporciona nuevos componentes que pueden prevenir y/o inhibir la
formación de biopelículas bacterianas en varias superficies.
Una biopelícula es una acumulación de
microorganismos embebidos en una matriz de polisacáridos y adherente
a una superficie biológica o no biótica. En estas biopelículas
pueden encontrarse diversos microorganismos (bacterias, hongos y/o
protozoos, con bacteriófagos asociados y otros virus). Las
biopelículas son ubicuas en la naturaleza y se encuentran
comúnmente en una amplia serie de ambientes, incluyendo los sistemas
de agua domésticos e industriales.
Las biopelículas son también agentes etiológicos
para varias enfermedades en mamíferos. Los ejemplos incluyen
infecciones de los tejidos blandos orales, dientes, oído medio,
tracto gastrointestinal, tracto urogenital, tejido de vías
respiratorias/pulmonar, membrana peritoneal y los ojos. Las
biopelículas también se desarrollan en dispositivos intravasculares
médicos, tales como implantes dentales, prótesis del tracto
urinario, catéteres de diálisis peritoneal, catéteres permanentes
para hemodiálisis y para la administración crónica de agentes
quimioterapéuticos (catéteres de Hickman), implantes cardiacos tales
como marcapasos, válvulas protésicas del corazón, dispositivos de
asistencia ventricular (DAV), injertos y endoprótesis vasculares
sintéticas, prótesis, dispositivos de fijación interna, suturas
percutáneas y tubos traqueales y de ventilación.
El desarrollo de biopelículas en dispositivos
industriales tales como sistemas de agua o plantas agroalimentarias
también provoca problemas de seguridad.
Las bacterias planctónicas (es decir, bacterias
unicelulares suspendidas en medio líquido) generalmente se usan
como modelos para investigación y diseño de antibióticos. Sin
embargo, las bacterias en las biopelículas son mucho más
resistentes a antibióticos que sus homólogas planctónicas, y menos
accesibles para el sistema inmune. Además, la conjugación se
produce a una mayor proporción entre las células de las biopelículas
que entre las células planctónicas. Esta mayor oportunidad de
transferencia genética entre bacterias es importante, ya que las
bacterias resistentes a agentes antimicrobianos o a biocidas
químicos pueden transferir los genes de resistencia a bacterias
vecinas susceptibles. La transferencia genética también puede
convertir un organismo comensal avirulento previo en un patógeno
altamente virulento.
La formación de biopelículas no está limitada a
la unión de bacterias a una superficie. De hecho, cuando se aumenta
en profundidad, las bacterias de las biopelículas interaccionan más
entre ellas que con el sustrato físico real en el que se desarrolló
la película inicialmente. En una biopelícula, las bacterias pueden
comunicarse por medio de mecanismos de señalización química, de
forma que la comunidad experimenta cambios fenotípicos cuando se
alcanza una densidad mínima (el quórum) en la biopelícula. Este
fenómeno, llamado "quórum sensing" ("lenguaje químico de las
bacterias"), puede ser responsable de la expresión de factores de
virulencia.
Además de polisacáridos relacionados con las
biopelículas de E. coli tales como polímero de ácido
colánico, celulosa y (1-6)
\beta-N-acetilglucosamina, los
aislados de E. coli también producen dos polisacáridos
seroespecíficos de superficie: el lipopolisacárido (LPS) antígeno O
y el polisacárido capsular, antígeno K. Estas dos clases de
polímeros polisacarídicos expuestos de superficie han demostrado
jugar papeles indirectos en las biopelículas por medio de la
protección de la adhesina de la superficie bacteriana (Schembri
et al., 2004).
Las estrategias descritas hasta la fecha para
prevenir y/o romper las biopelículas están principalmente basadas
en inhibidores del quórum sensing (Schachter, 2003).
La presente invención proporciona una novedosa
estrategia para inhibir la formación de biopelículas, ya que los
inventores han demostrado, usando biopelículas bacterianas de
especies mezcladas in vitro, que algunas bacterias liberan
en el cultivo sobrenadante un polisacárido capsular soluble del
grupo II que previene la formación de biopelículas de una amplia
serie de bacterias Gram-negativas y
Gram-positivas. Como se describe en la parte
experimental más abajo, estos componentes capsulares inducen
alteraciones físico-químicas de la superficie,
llevando a una reducción de la superficie celular y de los contactos
célula-célula que limitan tanto la adhesión inicial
como el desarrollo de la biopelícula bacteriana.
Un primer objeto de la presente invención es,
por lo tanto, el uso de un polisacárido capsular soluble del tipo
del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación
de una composición que prevenga o inhiba la adhesión de
microorganismos y/o el desarrollo de biopelículas, en particular la
adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas.
En lo que sigue, el término "polisacárido", aunque se usa en
el singular, puede designar una mezcla de diferentes polisacáridos.
Los polisacáridos capsulares producidos por las bacterias, de
hecho, son de varios tamaños. De hecho, las capsulas de E.
coli, que constituyen la capa protectora más externa de la
superficie de la célula, se clasifican en cuatro grupos basados en
criterios genéticos y biosintéticos. La cápsula del grupo II es uno
de los 4 tipos capsulares descritos en E. coli, y está
constituido por polímeros polisacarídicos de alto peso molecular y
cargados producidos por las bacterias Escherichia coli más
uropatógenas (UPEC) y otras bacterias E. coli
extraintestinales. Las cápsulas del grupo II presentan una
organización genética modular conservada caracterizada por 3
regiones funcionales. La región 1 (kpsFEDCUS) y la región 3 (kpsMT)
están conservadas en todas las bacterias encapsuladas del grupo II
y codifican proteínas requeridas para la salida
ABC-dependiente. La región 2 codifica una diversidad
de componentes estructurales polisacarídicos tales como los
serotipos capsulares K1, K2 (CFT073), K5 y K96 (Whitfield, 2006;
Whitfield y Roberts, 1999). También se han descrito cápsulas del
tipo del grupo II en Haemophilus influenzae y en
Neisseria meningitidis (Roberts, 1996).
En una realización preferida de la invención, un
polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene en
el sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre
Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria
meningitidis. Sin embargo, en el presente texto, la frase
"polisacáridos capsulares del tipo del grupo II" puede
designar polisacáridos capsulares que se producen por otras
bacterias, siempre que conserven las propiedades
anti-biopelícula observadas para los polisacáridos
capsulares producidos por las cepas mencionadas anteriormente. Por
ejemplo, los polisacáridos capsulares producidos por la cepa 47 de
la colección ECOR (Ochman y Selander, 1984) se consideran aquí como
un "polisacárido capsular del tipo del grupo II", aunque esta
cepa produce aparentemente una cápsula híbrida de grupo II/grupo
III.
La presente invención puede llevarse a cabo con
polisacáridos que tienen diferentes niveles de purificación. Por
ejemplo, el sobrenadante bruto de un cultivo bacteriano (separado de
las bacterias por esterilización por filtración o centrifugación)
puede usarse de acuerdo con la invención como una composición que
comprende polisacáridos capsulares solubles del tipo del grupo II.
Sin embargo, con el fin de incrementar la actividad
anti-biopelícula de la composición, así como su
seguridad, el polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II
puede obtenerse como una fracción purificada. En la parte
experimental proporcionada más adelante se describen tres niveles
de purificación como ejemplos no limitantes. Alternativamente, una
composición según la invención puede obtenerse directamente a
partir del cultivo bacteriano, por ejemplo después de la lisis de
las bacterias.
Otro objeto de la presente invención es una
composición para inhibir la adhesión bacteriana y/o el desarrollo
de biopelículas bacterianas, que comprende un polisacárido capsular
soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana.
Tal composición puede comprender polisacáridos que tienen diferentes
niveles de purificación. En una realización preferida, tal
composición comprende una fracción purificada del sobrenadante de un
cultivo de bacterias seleccionadas entre E. coli, H.
influenzae y N. meningitidis, que comprende polisacáridos
capsulares solubles del tipo del grupo II.
La presente invención también se refiere a un
proceso de purificación de un polisacárido capsular del tipo del
grupo II de anti-biopelícula a partir de una cepa
bacteriana, que comprende los siguientes pasos:
- i.
- separar el sobrenadante de un cultivo de una cepa bacteriana que expresa una cápsula del tipo del grupo II de las células bacterianas,
- ii.
- precipitar los polisacáridos presentes en el sobrenadante obtenido, y
- iii.
- opcionalmente, resuspender el precipitado.
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso anterior preferiblemente se lleva a
cabo con una cepa bacteriana seleccionada entre E. coli, H.
influenzae y N. meningitidis, más preferiblemente con una
E. coli uropatógena.
En este proceso, el paso (i) puede llevarse a
cabo por centrifugación y/o esterilización por filtración del
cultivo bacteriano, para eliminar las células bacterianas. Por
ejemplo, en procesos industriales, puede realizarse filtración
tangencial sin ninguna centrifugación preliminar. La filtración
tangencial puede llevarse a cabo de manera
continua.
continua.
El experto en la materia puede usar cualquier
proceso de precipitación conocido en la técnica para llevar a cabo
el segundo paso del proceso descrito anteriormente. Por ejemplo, la
precipitación del paso (ii) se puede llevar a cabo con tres
volúmenes de etanol por un volumen de sobrenadante.
En una variante ventajosa del proceso según la
invención, el precipitado obtenido en el paso (ii) primero se
resuspende en agua, se dializa frente a agua desionizada, y luego se
liofiliza antes del paso (iii).
La resuspensión en el paso (iii) puede hacerse
en agua o en cualquier tampón adecuado para el uso deseado. Un
ejemplo de tampón que puede usarse es TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un
25% de propanol-1.
Al final del paso (iii), los polisacáridos
anti-biopelícula se obtienen como un producto
semi-purificado que puede usarse de acuerdo con la
invención, especialmente en aplicaciones que no necesiten productos
de calidad médica.
Para purificar adicionalmente los polisacáridos,
el proceso de purificación puede comprender un paso adicional (iv)
de purificación por cromatografía, especialmente cromatografía de
intercambio iónico, por ejemplo usando una columna de
DEAE-Sepharose. En esta realización de la invención,
puede llevarse a cabo un paso de centrifugación opcional entre el
paso (iii) y el paso (iv), para descartar la fracción insoluble.
El experto en la materia puede escoger cualquier
un tampón apropiado para llevar a cabo el paso (iv). Un ejemplo de
tampón que puede usarse es TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de
propanol-1. De acuerdo con una realización
ventajosa del proceso, el precipitado se resuspende en TrisHCl 20
mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1 en el paso
(iii), y la columna que se usa en el paso (iv) se equilibra con el
mismo tampón.
Cuando se lleva a cabo el paso de purificación
por cromatografía de intercambio iónico, los polisacáridos
capsulares del tipo del grupo II pueden eluirse usando un gradiente
de sal, por ejemplo un gradiente de NaCl. En una realización eficaz
del proceso, descrita en la parte experimental, los polisacáridos
capsulares del tipo del grupo II se eluyen con NaCl 300 mM en
TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1.
Por supuesto, los polisacáridos capsulares
solubles del tipo del grupo II obtenidos a través de un proceso
como el descrito anteriormente pueden usarse, de acuerdo con la
invención, para la preparación de una composición que prevenga o
inhiba la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas
bacterianas. También forma parte de la presente invención una
composición anti-biopelícula que comprende tales
polisacáridos.
En una realización particular, la composición de
la presente invención se formula para la administración preventiva
o terapéutica a un sujeto que lo necesita. Son ejemplos no
limitantes de composiciones de acuerdo con este aspecto de la
invención soluciones orales, soluciones para infusión dentro del
oído, colirios, pastas de dientes o dentífricos terapéuticos,
etc. Estas composiciones pueden usarse, por ejemplo, para
prevenir la (re)-colonización del intestino, el
pulmón, el oído, el seno o cualquier órgano o cavidad, por bacterias
patógenas.
En otra realización, la composición de acuerdo
con la invención es un líquido o una pasta, por ejemplo una
pintura, que puede aplicarse en cualquier tipo de superficie para
prevenir la formación de biopelículas en estas superficies.
Otro aspecto de la presente invención es un
revestimiento anti-biopelícula que comprende un
polisacárido capsular del tipo del grupo II procedente de una cepa
bacteriana. En tal revestimiento, el polisacárido capsular del tipo
del grupo II puede tener diferentes niveles de purificación, como se
describe anteriormente. En una realización preferida del
revestimiento de acuerdo con la invención, el polisacárido capsular
del tipo del grupo II procede de una cepa bacteriana seleccionada
de entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y
Neisseria meningitidis. Este revestimiento puede obtenerse,
por ejemplo, por aplicación de una composición como se describió
anteriormente. También puede estar en forma de láminas que pueden
aplicarse sobre cualquier tipo de dispositivo sobre el que debe
evitarse la formación de la biopelícula.
Por lo tanto, también forma parte de la presente
invención un dispositivo médico o industrial que esté al menos
parcialmente revestido con un revestimiento
anti-biopelícula que comprende un polisacárido
capsular del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana.
Tal objetivo puede obtenerse, por ejemplo, sumergiendo parte del
dispositivo o todo el dispositivo en una composición líquida como se
describe anteriormente. El experto en la materia puede escoger la
duración de la incubación dependiendo del material, la concentración
del polisacárido capsular del tipo del grupo II en la composición,
el uso deseado y similares. Típicamente, dicha incubación puede
durar desde 10 segundos a 30 minutos. Generalmente son suficientes
incubaciones cortas (\leq 1 a 5 minutos). Si es necesario, el
dispositivo revestido después se puede esterilizar por una
diversidad de tratamientos, sin dañar el revestimiento. Por
ejemplo, se puede lavar intensamente y/o esterilizar en autoclave.
Ventajosamente, de acuerdo con este aspecto de la invención puede
recubrirse cualquier tipo de dispositivo hecho de vidrio, pirex,
PVC, policarbonato, polipropileno y similares.
Son dispositivos médicos no limitantes que
pueden recubrirse ventajosamente de acuerdo con este aspecto de la
invención escalpelos, fresas y otras herramientas quirúrgicas y/u
odontológicas no desechables, y dispositivos intravasculares tales
como implantes dentales, prótesis del tracto urinario, catéteres
peritoneales de diálisis, catéteres permanentes para hemodiálisis y
para administración crónica de agentes quimioterapéuticos (catéteres
de Hickman), implantes cardiacos tales como marcapasos, válvulas
protésicas del corazón, dispositivos de asistencia ventricular
(DAV), injertos y endoprótesis vasculares sintéticas, prótesis,
dispositivos de fijación interna, suturas percutáneas y tubos
traqueales y de ventilación.
Son ejemplos no limitantes de dispositivos
industriales que pueden recubrirse ventajosamente de acuerdo con
este aspecto de la invención materiales de fontanería tales como
cañerías, tubos, válvulas y similares, torres de refrigeración
secas, sistemas de agua caliente, circuitos de refrigeración de
plantas de energía nuclear, especialmente circuitos secundarios y
terciarios, materiales agroalimentarios tales como silos,
fermentadores, coladores, etc., elementos del mobiliario
tales como mesas de laboratorio, encimeras y similares,
especialmente para salas blancas, etc.
La invención además se ilustra por las
siguientes figuras y ejemplos.
Figura 1: Efecto inhibidor de biopelículas de
CFT073. A, Formación de biopelículas de MG1655F' en
microfermentadores inoculados con 1 ó 10 equivalentes de DO_{600 \
nm} de células KS272 (gris) o CFT073 (negro). Biopelícula de
MG1655F' sola (\diameter, blanco). Los resultados son el promedio
de 6 réplicas \pm s.d. P<0,001 comparados con la
biopelícula de MG1655F'. B, Biopelícula de MG1655F' sola en placa de
microtitulación (\diameter), o en presencia de sobrenadante KS272
o sobrenadante CFT073, (S.KS272 y S.CFT073, respectivamente). C,
Biopelícula de MG1655F' en microfermentadores perfundidos con medio
sin sobrenadante (\diameter) o con S.KS272 o S.CFT073. D, Curvas
de crecimiento de MG1655F' solo (\diameter) o con S.KS272 o
S.CFT073. E, Viabilidad de células MG1655F' solas (\diameter) o
con S.KS272 o S.CFT073 visualizadas con tinción BacLight. F,
Análisis cualitativo de la formación de biopelículas en placa de
microtitulación por diferentes bacterias en la presencia de
sobrenadantes de CFT073 (S. CFT).
Figura 2: Efecto del sobrenadante de CFT073
sobre la formación de biopelículas bacterianas
Gram-positivas y
Gram-negativas. A, Cuantificación de la
formación de biopelículas en placas de microtitulación de diferentes
bacterias, solas (\diameter), con sobrenadante de KS272 (S.KS) o
con sobrenadante de CFT073 (S.CFT). Los niveles de violeta de
cristal retenidos se midieron espectrofotométricamente (DO_{570 \
nm}). B, Cuantificación de la biopelícula formada por varias
bacterias patógenas en microfermentadores usando medios no
suplementados (\diameter), o suplementados con S.CFT o S.KS. Las
barras de error representan la desviación típica de dos experimentos
independientes. C, Efecto del sobrenadante de CFT073 (S.CFT073) en
mezcla de biopelículas de E. coli (MG1655F') con P.
aeruginosa (PAK), K. pneumoniae (KP21), S.
epidermidis (O-47), S. aureus (15981) y
S. epidermidis (O-47) con S. aureus
(15981) y E. faecalis (54). El sobrenadante de la cepa de
E. coli CFT073\DeltakpsD (S. \DeltakpsD)
que no segrega ninguna cápsula del grupo II se usa como control
negativo. D, Análisis cualitativo de la formación de biopelículas de
S. aureus y P. aeruginosa en un microfermentador
usando medios no suplementados, o suplementados con el sobrenadante
de CFT073.
Figura 3: Relación entre la producción de la
cápsula y la actividad anti-biopelícula del
sobrenadante de CFT073. A, Organización genética de las
regiones R1, R2 y R3 de la cápsula de CFT073. Los genes con
inserciones de transposones se marcan con un asterisco. B,
Formación de la biopelícula de MG1655F' cultivada en presencia de
los sobrenadantes de mutantes de cápsula. C, Niveles de hexosa en
los sobrenadantes. kpsF, kpsU, c3692 y
c3693 corresponden a mutantes que no afectan a la producción
de la cápsula. D, Fase estacionaria de las capsulas de las células
bacterianas CFT073 o CFT073 \Delta teñidas con ferritina y
examinadas por microscopía electrónica de transmisión (100.000x;
barra = 0,2 \mum) (panel izquierdo); se observaron 125 y 105
células respectivamente. La cápsula CFT073 teñida se indica por una
flecha. En el panel de la derecha: micrografías electrónicas de
barrido de CFT073 o CFT073\DeltakpsD en fase estacionaria
(50.000x; barra = 0,5 \mum); se observaron 45 y 37 células
respectivamente.
Figura 4. Correlación entre la actividad
anti-biopelícula y la cápsula del grupo II.
Formación de biopelículas de las cepas de E. coli MG1655F' y
1091, y de la cepa 15981 de S. aureus cultivadas con: (A)
sobrenadantes de E. coli que exhiben una actividad
anti-biopelícula (véase la Tabla 1) (aparte de la
cepa 47, todas las cepas ensayadas producen cápsulas del grupo II).
(B) Sobrenadantes de las cepas CFT073, U-9,
U-15 y sus respectivos mutantes kpsD. (C)
Formación de biopelícula de cepas de UPEC CFT073,
U-9, U-15 (negro) en el
microfermentador y sus respectivos mutantes kpsD (gris)
desarrollados en M63B1glu, y mutantes kpsD desarrollados en
medios suplementados con sus sobrenadantes de tipo silvestre
correspondientes (blanco). Las biopelículas se desarrollaron
durante 36 h a 37ºC. Las barras de error representan la desviación
típica de la media. Las cepas identificadas por números simples
corresponden a las de la colección EcoR (Ochman y Selander,
1984).
Figura 5. Efecto
anti-biopelícula del sobrenadante de Neisseria
meningitidis . Cuantificación de la formación de biopelícula
en placa de microtitulación de MG1655F' en presencia de S.
Neisseria. La DO_{570 \ nm} del tinte violeta de cristal se
determinó como se describe (O'Toole y Kolter, 1998).
Figura 6: Propiedades
físico-químicas del sobrenadante de CFT073. a,
\zeta potencial de coloides catiónicos incubados con los
sobrenadantes dializados de: CFT073 (CFT), U-9,
IHE3034 (IHE), EcoR72 (E-72) (gris oscuro) y sus
mutantes de cápsula respectivos (gris claro). (\diameter)
Corresponde al tratamiento de M63Blglu. b, Ángulo de contacto de
una gota de agua en la superficie incubada con CFT,
U-9, IHE, E-72 (gris oscuro) y los
mutantes de cápsula (gris claro). c, Adsorción de yoduro de
propidio sobre partículas catiónicas incubadas con CFT,
U-9, IHE, E-72, FR2 (fracción
purificada del sobrenadante de CFT073, (gris oscuro) y sus mutantes
de cápsula respectivos (gris claro). El grado de adsorción se da
por la intensidad fluorescente (> 670 nm). d, Microscopía de
fluorescencia de partículas catiónicas incubadas con CFT,
S.CFT073\Delta R1 (\diameterR1), FR2 y no incubadas
(\diameter). Las barras de error representan la desviación típica
de la media.
Figura 7: Efecto de inhibición de la
biopelícula del sobrenadante de CFT073 en superficies
recubiertas. La formación de la biopelícula en
microfermentadores por varias bacterias usando: portaobjetos sin
tratar (panel superior), portaobjetos tratados con sobrenadante de
CFT073 (panel medio) y portaobjetos tratados con sobrenadante de
CFT073\DeltakpsD (panel inferior).
Figura 8. Impacto del tratamiento de espátula
recubierta con sobrenadante de S.CFT073 (S.CFT). Formación de
biopelículas en microfermentadores por MG1655F' usando portaobjetos
no tratados y portaobjetos tratados con S.CFT o con S.CFT llevado a
ebullición y luego esterilizado en autoclave o sometido a lavado
intenso.
Figura 9: El sobrenadante de CFT073 afecta a
la interacción célula-célula. A, Formación de la
biopelícula de MG1655F' en microfermentadores con medios
suplementados con sobrenadante de CFT073 (S.CFT) a los tiempos de 0
h, 1 h, 6 h (24 h de cultivo) y 24 h (48 h de cultivo).
\diameter: Sin adición de S.CFT. B, MG1655F' marcado con GFP
inoculado en una celda de flujo y monitoreado por microscopía
confocal. Los sobrenadantes de CFT073 o KS272 se suplementaron
después de 3 h de cultivo y las biopelículas se desarrollaron
durante un total de 12 h. C, Ensayo de autoagregación con cepas que
se agregan por diferentes mecanismos: MG1655F' (expresión del pilus
conjugativo F); MG1655ompR234 (sobreexpresión de curli);
MG1655\DeltaoxyR (sobreexpresión de la adhesina
autotransportadora Ag43); 1094 (producción de celulosa). Las
células se diluyeron hasta una DO_{600} de 2 en 3 ml de M63B1
(triángulo), el sobrenadante de CFT073 (circulo) y el sobrenadante
de \DeltakpsD (rectángulo).
Figura 10. Actividad
anti-biopelícula de la fracción FR2. La fracción
purificada (FR2) del sobrenadante de CFT073 se añadió al cultivo de
MG1655F' en concentraciones que variaban de 0,5 a 500 \mug/ml. La
formación de la biopelícula de MG1655F' se visualizó después de 24
h. Concentraciones de 50-100 \mug/ml inhibían la
biopelícula de MG1655F'.
Figura 11. Colonización intestinal por CFT073
y CFT073\DeltaR1. a, Las barras representan el error típico
del log 10 del número medio de UFC por gramo de heces; Para el
análisis estadístico se usó un ensayo de
Mann-Whitney, el nivel de significación estadístico
(*) se situó en el valor P de <0,016. b, Colonización del colon y
el ciego por CFT073 (círculos) y por CFT073\DeltaR1 (triángulos).
LD: límite de detección.
Figura 12. Efecto de la fase de crecimiento y
quórum-sensing en las propiedades de la
anti-película del sobrenadante de CFT073.
Formación de la biopelícula de MG1655F' en placa de microtitulación
en presencia de sobrenadantes purificados a partir de células en
fase exponencial, fase estacionaria y mutante \DeltaluxS.
Se centrifugaron 10^{10} células en la fase exponencial (DO_{600
\ nm} = 0,4) y en la fase estacionaria (DO_{600 \ nm} = 2) y los
sobrenadantes se precipitaron con 3 volúmenes de etanol. El
sobrenadante del mutante \DeltaluxS se purificó en un
cultivo durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas bacterianas se enumeran en la Tabla 1
presentada más adelante. Se desarrollaron bacterias
gram-negativas a 37ºC en un medio mínimo M63B1 con
un 0,4% de glucosa (M63B1glu) o en un medio LB rico. Se
desarrollaron bacterias Gram-positivas en TSB con
un 0,25% de glucosa (TSBglu) a 37ºC. El efecto del sobrenadante de
CFT073 sobre el crecimiento de las bacterias y la tasa de
viabilidad se evaluó usando determinación de curvas de crecimiento,
recuento de las unidades formadoras de colonias en la placa LB y el
tinte de viabilidad BacLight Live/Dead (Molecular Probes). La
tinción con ferritina y la microscopía electrónica de barrido se
realizaron como se describe en (Bahrani-Mougeot
et al., 2002). La epifluorescencia y la microscopía óptica
transmitida se adquirieron usando un microscopio Nikon E400. Los
ensayos de autoagregación se realizaron como se describe en (Beloin
et al., 2006).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Experimentos con microfermentadores: La
biopelícula se desarrolló como se describió anteriormente (Ghigo,
2001). Cultivos de biopelículas mezcladas: Una biopelícula de
MG1655F' de 8 horas formada en el portaobjetos interno de
microfermentadores se infectó con 1 equivalente de DO_{600 \ nm}
de cultivo de una noche de CFT073-gfp. Después de
24 horas de cultivo continuo en M63B1glu, se tomaron fotografías de
los portaobjetos. Se estimó la biomasa de la biopelícula por
determinación de la DO_{600 \ nm} de la resuspensión de la
biopelícula formada en el portaobjetos interno (Ghigo, 2001).
Ensayos de inhibición de biopelículas: el medio entrante se
mezcló en una proporción 1:1 con sobrenadantes filtrados y se llevó
a los microfermentadores a diferentes tiempos después de la
inoculación de las bacterias (0, 1, 6 ó 24 horas). La biopelícula se
cultivó además durante otras 24 horas adicionales antes de la
determinación de la biomasa. Análisis de la interacción
bacteriana con superficies tratadas: los portaobjetos se
incubaron 1 min con sobrenadante de CFT073 filtrado y se enjuagaron
una vez en agua desionizada antes de la inoculación en los
microfermentadores. La formación de la biopelícula en el
portaobjetos se determinó después de 24 horas.
Experimentos en placas de
microtitulación: Se realizaron ensayos de formación de
biopelículas estáticas en placas de microvaloración de PVC de 96
pocillos (Falcon) como se describe en (O'Toole y Kolter, 1998).
Ensayos de inhibición de biopelículas: los cultivos durante
la noche se ajustaron a DO_{600 \ nm} = 0,04 antes de inocular
100 \mul en placas 96 pocillos en presencia o ausencia de 50
\mul de sobrenadante. Experimentos de cámara de flujo. Se
desarrollaron biopelículas en M63B1glu a 37ºC en celdas de flujo de
3 canales (1 x 4 x 40 mm). Se montó el sistema de flujo y se
preparó como se describe en (Christensen et al., 1999). Los
inóculos se prepararon como sigue: se recogieron cultivos de una
noche de 16-20 horas en M63B1glu y se resuspendieron
como diluciones normalizadas (DO_{600 \ nm} = 0,005). Se
inyectaron 300 \mul en cada canal de flujo. El medio de entrada
se mezcló en una proporción 1:1 con sobrenadante filtrado. El flujo
se comenzó 1 h después de la inoculación a una velocidad constante
de 3 ml h^{-1} usando una bomba peristáltica de Watson Marlow
205S. Todos los ensayos se realizaron al menos por triplicado.
Se han ensayado tres niveles de
purificación:
- i.
- Filtración (esterilización) de los sobrenadantes activos (S.CFT, usados en todos los experimentos en placas de microtitulación o en microfermentadores)
- \bullet
- Se centrifugaron cultivos de una noche en M63B1glucosa al 0,4% durante 30 min a 5000 rpm a 4ºC y se filtraron a través de un filtro de 0,25 \mum para eliminar las bacterias.
- ii.
- Precipitación de polisacáridos contenidos en sobrenadantes activos.
- \bullet
- Los polisacáridos contenidos en el sobrenadante filtrado se precipitaron con 3 volúmenes de etanol, se resuspendieron en agua desionizada y se dializaron frente a agua desionizada en casetes de diálisis con un límite de 10 kDa (Pierce biochemical).
- iii.
- Purificación de la fracción activa de los polisacáridos capsulares (fracción activa capsular FR2).
- \bullet
- La fracción activa del sobrenadante parcialmente purificado obtenida en el paso (ii) se liofilizó y se resuspendió en 80 ml de tampón Tris HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía un 25% de propanol-1.
- \bullet
- Esta resuspensión se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm para eliminar las partículas insolubles.
- \bullet
- El sobrenadante soluble se cargó en una columna de DEAE-Sepharose (30 ml, 2,6 x 6 cm, Amersham) y se equilibró con un tampón Tris HCl 20 mM, pH 7,5 y 25% de propanol-1.
- \bullet
- La columna se lavó con un tampón Tris HCl 20 mM, pH 7,5 y 25% de propanol-1 con una tasa de 20 ml/h.
- \bullet
- Después del lavado, la columna se eluyó con un gradiente de NaCl (de 0 a 1 M en 400 ml) y la concentración de polisacáridos de cada fracción eluida (4,5 ml) se ensayó por el método Dubois (Dubois et al., 1956): 100 \mul de fenol al 5% y 500 \mul de ácido sulfúrico concentrado seguido por agitación en vórtice y lectura a 492 nm).
- \bullet
- Las fracciones positivas (aproximadamente 10 fracciones de 4,5 ml) se agruparon, se dializaron frente a agua desionizada y se liofilizaron.
- \bullet
- Se resuspendió 1 mg del liofilizado en 1 ml de agua desionizada.
Se centrifugaron cultivos de una noche en
M63B1glu a 37ºC 30 minutos a 5000 rpm a 4ºC. Después de la
filtración del sobrenadante con un filtro de 0,2 \mum, se
precipitaron macromoléculas con 3 volúmenes de etanol y se
dializaron frente a agua desionizada usando casetes de 10 kDa
(Pierce). Las cantidades totales de fosfato y azúcares neutros se
determinaron por los métodos de molibdato amónico/ácido ascórbico y
fenol/ácido sulfúrico, respectivamente. La composición de
polisacáridos se determinó por HPLC (columna de exclusión iónica) y
por cromatografía de gas-líquido como en (d'Enfert
y Fontaine, 1997; Fontaine et al., 2000). La fracción activa
del sobrenadante de CFT073, FR2, se purificó usando una columna de
DEAE-Sepharose (Amersham) y se eluyó con NaCl 300
mM en un 25% de propanol-1, Tris HCl 20 mM pH 7,5.
El peso molecular del polímero se estimó por cromatografía de
filtración en gel en Superdex-200 (Amersham) usando
dextrano como patrón. Las degradaciones de polisacáridos se
realizaron por hidrólisis ácida total (ácido trifluoroacético, 4 N,
4 H, 100ºC) o por ácido fluorhídrico acuoso (48% ac. HF, 2 días en
agua enfriada con hielo).
Se realizó la mutagénesis del transposón mariner
de E. coli CFT073 como se describe en (Da Re y Ghigo, 2006).
Los sobrenadantes de 10.000 mutantes de transposones incubados 24 h
en LB a 37ºC en placas de microtitulación de 97 pocillos se
extrajeron después de la centrifugación de las placas 15 min a 10000
rpm y se analizó su efecto en la formación de la biopelícula de
MG1655F'. Los sitios de inserción de transposones se determinaron
como se describe en (Da Re y Ghigo, 2006). Se realizaron búsquedas
de homología usando Blast 2.0. Se generaron mutantes de deleción
como se detalla en
http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Ggb/3SPCRprotocol.html,
usando los cebadores presentados en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió el potencial zeta como en (Caruso et
al., 1999) después de 20 minutos de incubación de partículas de
látex de coloides catiónicos de 10 \mum de diámetro con
sobrenadantes precipitados dializados (es decir, el nivel (ii) de
purificación indicado anteriormente). Las partículas de látex
soportan una carga positiva neta permanente debido a su
revestimiento de polietilenimina (PEI). La capa de PEI es un
polímero ramificado de peso molecular 6400 dalton que tiene
aproximadamente el 50% de funciones cuaternarias metiladas, lo cual
confiere una carga positiva estable a la molécula. Este polímero se
depositó en la fase acuosa sobre las partículas carboxiladas
inicialmente (Decher, 1997). Las propiedades hidrófilas de los
sobrenadantes se investigaron por determinación del ángulo de
contacto formado por una gota de 2,5 \mul de agua ultrapura con
una superficie plana de vidrio previamente incubada en los
sobrenadantes durante 20 minutos. Las interacciones de superficie
se analizaron por monitoreo de la adsorción del yoduro de propidio
en coloides catiónicos tratados con el sobrenadante. La afinidad de
las superficies tratadas por la sonda de fluorescencia se ensayó
usando citometría de flujo (Leboeuf y Henry, 2006) y microscopía de
fluorescencia. Todas las incubaciones de partículas con
sobrenadante se realizaron a una fracción baja de partículas/volumen
(aproximadamente el 0,2%) probablemente llevando a la saturación de
la superficie por las especies activas.
Se realizó una colonización in vivo de
CFT073 y CFT073\DeltaR1 como se describió previamente (Maroncle
et al., 2006). Los ratones se alimentaron intragástricamente
con 1010 UFC. Se numeraron bacterias contenidas en muestras fecales
en placas de agar. Para el examen del crecimiento bacteriano en el
hospedador, los ratones se sacrificaron a varios tiempos después de
la inoculación; el colon y el recto se homogeneizaron en agua
fisiológica y se cultivaron en placas para determinar las ufc por
gramo de tejido.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar las interacciones de UPEC dentro
de comunidades bacterianas de biopelículas multicelulares
(Hall-Stoodley et al., 2004), se desarrolló
un modelo de biopelícula bacteriana mixta in vitro en
microfermentadores (Ghigo, 2001). Usando este modelo, una
biopelícula de 8 horas formada por la cepa comensal de E.
coli K12 MG1655F' se inoculó con diferentes títulos de la cepa
de UPEC CFT073, y se cultivó adicionalmente durante 24 horas.
Después de aumentar los títulos de CFT073, se observó una fuerte
reducción del desarrollo de la biopelícula de E. coli K12
MG1655F', que no se observó cuando se usó la cepa comensal de E.
coli KS272 (Fig. 1A). Esto sugirió que CFT073 podía prevenir la
formación de la biopelícula de MG1655F' por contacto directo o por
secreción de una molécula inhibitoria. Para distinguir ente estas
dos posibilidades, el sobrenadante del cultivo de CFT073 en la fase
estacionaria se esterilizó por filtración y se ensayó su efecto
sobre la formación de biopelículas de E. coli. En presencia
del sobrenadante de CFT073, la biopelícula de MG1655F' se vio
severamente afectada (Fig. 1B, C). Esta inhibición de la biopelícula
no se debía a un defecto de crecimiento debido a una actividad
bactericida o bacteriostática, ya que la tasa de crecimiento y la
viabilidad celular de MG1655F' no se vieron afectadas por el
sobrenadante de CFT073
(Fig. 1D, E).
(Fig. 1D, E).
Para determinar el espectro de la actividad
anti-biopelícula del sobrenadante de CFT073, se
ensayó su efecto sobre varias bacterias adherentes (E. coli,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, S. epidermidis y
Enterococcus faecalis). Este análisis mostró que el
sobrenadante de CFT073 era activo contra una sorprendente serie de
bacterias, incluso en cultivos mixtos (Fig. 1F y Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Para dilucidar la base genética del efecto
anti-biopelícula, se ensayó la actividad del
sobrenadante de aproximadamente 10.000 mutantes de inserción de
transposón mariner aleatorios de CFT073. Los inventores
identificaron siente candidatos dañados en su capacidad para
inhibir la formación de biopelículas de MG1655F'. Todos estos
mutantes se mapearon en genes implicados en la expresión del
polisacárido capsular del grupo II, la estructura más externa de la
superficie de las células bacterianas (Whitfield y Roberts, 1999).
La cápsula del grupo II muestra una organización genética modular
conservada caracterizada por 3 regiones funcionales (Roberts, 1996)
(Fig. 3A). La región 1 (kpsFEDCUS) y la región 3
(kpsMT) están conservadas en todas las bacterias
encapsuladas del grupo II y codifican proteínas requeridas para la
salida de polisacáridos ABC-dependientes. La región
2 es variable y codifica serotipos de polisacáridos tales como K1,
K2 (CFT073), K5, K96 (Roberts, 1996). La región R1, R2 o R3, o cada
gen individual kps se delecionó y se observó que, excepto en
el caso de kpsU, c3692 y c3693, todos los
mutantes perdieron la capacidad de inhibir la formación de la
biopelícula de E. coli, lo cual está correlacionado con una
cantidad reducida de azúcares precipitados en el sobrenadante (Fig.
3B, 3C). Aunque aún podía detectarse una cápsula teñida con
ferritina alrededor de las células CFT073 (Fig. 3D), estos
resultados indicaron que la capsula de CFT073, sin embargo,
experimenta una liberación significativa en el sobrenadante del
medio que es responsable del efecto anti-biopelícula
observado.
Para determinar si la inhibición de la
biopelícula era una propiedad exclusiva del sobrenadante de E.
coli CFT073, los inventores seleccionaron varios aislados
bacterianos clínicos uropatógenos de Klebsiella,
Proteus, Enterobacter, Morganella,
Citrobacter y Serratia, así como una colección de 110
cepas de E. coli de diversos orígenes. Descubrieron que sólo
el sobrenadante filtrado de 40 E. coli, incluyendo 17 UPEC,
inhibía la formación de biopelículas en una amplia serie de
bacterias sin afectar a la tasa de crecimiento (fig. 4A). Además,
al igual que la cepa de E. coli CFT073, todas las cepas
activas son capaces de inhibir la formación de biopelículas de
bacterias adherentes diferentes de E. coli (véanse los datos
de la biopelícula de S. aureus 15981 en la Fig. 4A). Usando
sondas específicas de PCR (Johnson y O'Bryan, 2004), mostraron que
39 de las 40 cepas activas de E. coli portaban genes de la
capsula del grupo II. La cuadragésima bacteria, EcoR47,
efectivamente parece producir una cápsula híbrida del grupo II/grupo
III. Esta cepa ha mostrado llevar genes KPS del grupo II (Boyd y
Hartl, 1998). Sistemáticamente, la introducción de una mutación
kpsD en los aislados clínicos de UPEC U-9 y
U-15 anulaba el efecto inhibidor de las biopelículas
en sus sobrenadantes (Fig. 4B). De manera interesante, aunque las
cepas de CFT073 U-9 y U-15
presentaban una capacidad muy limitada de formar biopelículas en el
modelo de biopelícula del microfermentador, sus respectivos
mutantes kpsD mostraban un mayor fenotipo de biopelícula.
Este fenotipo podía revertirse tras la adición del sobrenadante de
CFT073, lo que sugiere que estas cepas también podrían
auto-inhibir su propia adhesión (Fig. 4C).
También se realizó un ensayo de inhibición de la
formación de biopelículas con una cepa de Neisseria
meningitidis, cuya cápsula es muy similar bioquímicamente a la
cápsula del grupo II de E. coli. De manera interesante, los
resultados muestran que el sobrenadante de N. meningitidis
también inhibe la formación de la biopelícula de E. coli
MG1655F' (Fig. 5), lo que demuestra que la actividad
anti-biopelícula no es sólo una propiedad de la
cápsula del grupo II de E. coli, sino también de capsulas que
se sabe que son similares a la última (es decir, capsulas del tipo
del grupo II).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando los inventores analizaron la composición
de las fracciones de polisacáridos precipitadas desde los
sobrenadantes activos de diferentes serotipos de E. coli de
cápsulas del grupo II, incluyendo CFT073 (K2), U-9
(no-K2) e IHE3034 (K1), observaron, de acuerdo con
estudios previos (Jann et al., 1980; Silver y Vimr, 1984),
que estas fracciones mostraban composiciones significativamente
diferentes (los datos no se muestran). Esto sugiere que, aunque son
bioquímicamente distintas, las cápsulas del grupo II liberadas por
estas cepas podían compartir un modo de acción similar que llevara
a la inhibición de la biopelícula. Para estudiar adicionalmente los
mecanismos por los que la capsula del grupo II inhibe la formación
de biopelículas bacterianas, estas fracciones se pusieron en
contacto con coloides catiónicos compuestos por partículas de látex
de 10 \mum de diámetro que tenían una carga neta positiva
permanente debido a su revestimiento de polietilenimina. La
determinación del potencial de interfaz \zeta (Zeta) mostró que
los sobrenadantes de tipo silvestre inducían una fuerte inversión
de carga de los coloides catiónicos, lo cual es indicativo de su
naturaleza altamente aniónica al compararlos con los sobrenadantes
de sus mutantes de cápsula respectivo (Fig. 6a). Además, el
tratamiento de portaobjetos limpiados con ácido con sobrenadante
activo redujo la energía interfacial del lado del agua, indicando
su naturaleza hidrófila (Fig. 6b).
Para analizar sí la cápsula del grupo II podía
inducir modificaciones en la superficie y afectar a las fuerzas
intermoleculares en las superficies tratadas, los inventores
monitorizaron la adsorción del yoduro de propidio, un ión catiónico
anfífilo fluorescente, en coloides revestidos con sobrenadantes
activos o inactivos. Primero mostraron que un sobrenadante aniónico
pero inactivo de E. coli encapsuladas que no era del grupo II
EcoR72 mostraba una fuerte afinidad por la sonda catiónica de
fluorescencia (Fig. 6c). A pesar de de su alta carga negativa, los
sobrenadantes activos mostraron una afinidad por la sonda
significativamente menor que los sobrenadantes de mutantes de
cápsula inactivos pero menos cargados negativamente (Fig. 6c y 6d).
Este efecto era todavía más pronunciado con la fracción capsular
activa de K2 de 500 kDa (FR2) purificada a partir de CFT073 por
cromatografía de intercambio aniónico que contenía galactosa,
glicerol, fosfato y acetato en una proporción molar de 1: 2: 1: 1
(Jann et al., 1980) (Fig. 6c y 6d). Por lo tanto, estos
resultados mostraron que, además de las fuertes modificaciones
electrostáticas, los sobrenadantes activos también inducían una
profunda remodelación de las propiedades de superficie del coloide,
posiblemente incluyendo hidratación de superficie y repulsión
estérica. Estos análisis confirman que las modificaciones de
superficie inducidas por capsulas del grupo II son más criticas
para la actividad de inhibición de la biopelícula que la composición
primaria de la cápsula.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades físico-químicas
mostradas por la cápsula del grupo II podrían alterar profundamente
la capacidad bacteriana para interaccionar con superficies y por lo
tanto reducir drásticamente la adhesión (Neu, 1996). Para ensayar
esta hipótesis, se analizó la capacidad tanto de MG1655F' como de
S. aureus de adherirse a superficies de vidrio pretratadas
con sobrenadante de CFT073. Después de una hora de incubación, E.
coli MG1655F' y S. aureus 15981 presentaron una
reducción de 3 veces en su adhesión inicial a la superficie tratada
(datos no mostrados). Sistemáticamente, el pretratamiento del
portaobjetos interno del microfermentador con sobrenadante de
CFT073 redujo drásticamente la formación de biopelícula por E.
coli y una amplia serie de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas
(Fig. 7). Se observó el mismo efecto cuando el sobrenadante de
CFT073 se perfundió en el microfermentador (Fig. 2B). No se observó
efecto cuándo se realizó un tratamiento similar con el sobrenadante
de CFT073\DeltakpsD (Fig. 7). Estos resultados, por lo
tanto, sugirieron que las modificaciones de superficie inducidas
por los polisacáridos capsulares liberados en el sobrenadarte de
CFT073 podían interferir con la formación de la biopelícula al
obstaculizar las interacciones iniciales
bacteria-superficie.
Increíblemente, el efecto
anti-biopelícula del sobrenadante de CFT073
persistía incluso después de drásticos tratamientos del
portaobjetos (Fig. 8), lo que sugiere que la cápsula del grupo II
podía usarse en aplicaciones que necesitasen un paso de
esterilización (tales como aplicaciones
agro-industriales o médicas).
Para investigar el efecto del sobrenadante de
CFT073 en las biopelículas ya existentes, se suplementaron
microfermentadores inoculados con MG1655F' en diferentes etapas de
la maduración de la biopelícula con sobrenadante de CFT073
filtrado. Estos análisis mostraron que, aunque el tratamiento de una
biopelícula madura de 24 h no inducía la dispersión de la
biopelícula, la adición del sobrenadante de CFT073 a 0, 1 y 6 h
después de la iniciación de la biopelícula de MG1655F' bloqueaba su
posterior desarrollo (Fig. 9A). Los inventores luego examinaron las
características de la biopelícula in vitro de MG1655F'
marcado con GFP después de la adición del sobrenadante de CFT073 y
microscopía láser confocal de barrido (MLCB). Tres horas después de
la inoculación inicial, la adición del sobrenadante exógeno de
CFT073 activo en una superficie regularmente cubierta afectó
profundamente al desarrollo de la estructura de la biopelícula
madura de MG1655F' (Fig. 9B). Este efecto no se observó después del
tratamiento de control del sobrenadante de KS272.
La contribución directa de estructuras de
superficie bacterianas a la estructura tridimensional de la
biopelícula de E. coli se ha demostrado ampliamente (Beloin,
et al., 2005). También se ha demostrado que estas estructuras
median la agregación bacteriana y la aglutinación en cultivos
permanentes. Para caracterizar adicionalmente el papel de la
cápsula del grupo II en la maduración de biopelículas, los
inventores ensayaron sus efectos en agregación bacteriana mediada
por diversos factores expuestos en la superficie diferentes también
implicados en la formación de las biopelículas. Se mostró que el
sobrenadante de CFT073 previene la formación de agregados
bacterianos inducida por diferentes tipos de estructuras de
superficie bacterianas (Fig. 9C).
La actividad anti-biopelícula de
diferentes concentraciones de la fracción FR2 se ensayó en ensayos
de placas de microtitulación. Esto mostró que la fracción FR2
purificada es activa a concentraciones que empiezan desde 50
\mug/ml (Fig. 10).
Considerados juntos, estos resultados sugieren
que las propiedades físico-químicas de los
polisacáridos capsulares del grupo II afectan a la formación de la
biopelícula por debilitamiento de los contactos
célula-superficie (adhesión inicial), pero también
por reducción de las interacciones célula-célula
(maduración de la biopelícula).
En conclusión, los inventores demostraron que en
el sobrenadante de cultivo se liberan polisacáridos capsulares del
tipo del grupo II y presentan propiedades de
anti-adhesión contra una amplia serie de bacterias,
incluyendo importantes patógenos nosocomiales. Este estudio revela
una novedosa propiedad de los polisacáridos capsulares del grupo II
que se expresan comúnmente por E. coli
extra-intestinal, pero también por otros patógenos
tales como Neisseria meningitidis (Kaijser, 1973; Sandberg
et al., 1988), cuyo sobrenadante podría también inhibir la
formación de biopelículas de E. coli (los datos no se
muestran). Se ha demostrado que las cápsulas del grupo II están
implicadas en la virulencia de UPEC al aumentar su resistencia a la
fagocitosis y a los efectos bactericidas del suero humano (Cross
et al., 1986; Kaper et al., 2004; Pluschke et
al., 1983; Russo et al., 1995). Las cápsulas podrían
también jugar un importante papel biológico en las interacciones de
UPEC con superficies vivas e inertes. En particular, además de la
competición bacteriana, la inhibición de la propia adhesión de UPEC
por la secreción de cápsulas del grupo II puede contribuir a la
colonización del tracto gastrointestinal reduciendo las
interacciones bacteria-bacteria (Schembri et
al., 2004), evitando de esta manera la eliminación bacteriana
debida a la formación de agregados (Favre-Bonte
et al., 1999). Consistentemente, se observó que un mutante
no encapsulado CFT073\DeltaRI es incapaz de colonizar el intestino
del ratón (Fig. 11).
Los análisis in vitro indican que la
cápsula del grupo II puede inducir modificaciones de superficie
tales como la inversión de carga de superficies catiónicas, y un
aumento de la humectabilidad y la repulsión molecular de la
superficie, llevando a propiedades de anti-adhesión
no específicas. Como este efecto inhibidor se observó en la fase de
crecimiento tanto exponencial como estacionario de los
sobrenadantes, así como en un mutante \DeltaluxS
quórum-sensing de CFT073 (Fig. 12), esto sugiere que
el efecto anti-biopelícula no implica señalización
de la célula (Waters y Bassler, 2005), sino que más bien actúa a
través de una alteración físico-química, de
superficies abióticas o bacterianas. Se sabe que el ensamblaje de
polímeros en superficies causa una fuerte repulsión física
dependiendo de su densidad, tamaño, solvatación y estructura (de
Gennes, 1987). Tales fuerzas repulsivas creadas por polímeros de la
cápsula podrían limitar la adhesión bacteriana inicial y el
desarrollo de la biopelícula al interferir con los contactos
célula-célula posteriores. Finalmente, los
inventores mostraron que la aplicación de polisacáridos capsulares
del grupo II en superficies abióticas reduce la adhesión bacteriana
inicial, y ha tenido un efecto de larga duración suficiente como
para inhibir significativamente el desarrollo de la biopelícula
madura de una amplia serie de bacterias. Este descubrimiento puede
tener aplicaciones de largo alcance en el diseño de estrategias
terapéuticas para limitar la formación de biopelículas patógenas,
por ejemplo en implantes médicos.
Bahrani-Mougeot, F. K.,
Buckles, E. L., Lockatell, C. V., Hebel, J. R.,
Johnson, D. E., Tang, C. M., y Donnenberg, M.
S. (2002). Type 1 fimbriae and extracellular polysaccharides
are preeminent uropathogenic Escherichia coli virulence
determinants in the murine urinary tract. Mol Microbiol 45,
1079-1093.
Beloin, C., Da Re, S. &
Ghigo, J. M. (2005) en Escherichia coli and
Salmonella Cellular and Molecular Biology, eds.
Curtiss III, R., Böck, A.,
Ingraham, J. L., Kaper, J. B., Neidhardt, F.
C., Riley, M. & Squires, C. L. (ASM Press,
Washington, D.C.), pp. Capítulo 8.3.1.3.
Beloin, C., Michaelis, K.,
Lindner, K., Landini, P., Hacker, J.,
Ghigo, J. M., y Dobrindt, U. (2006). The
Transcriptional Antiterminator RfaH Represses Biofilm Formation in
Escherichia coli. J Bacteriol 188,
1316-1331.
Boyd, E. F., and Hartl, D. L.
(1998). Chromosomal regions specific to pathogenic isolates
of Escherichia coli have a phylogenetically clustered
distribution. J Bacteriol 180, 1159-1165.
Caruso, F., Lichtenfeld, H.,
Donath, E., y Möhwald, H. (1999). Investigation
of electrostatic interactions in poly-electrolyte
multilayer films: binding of anionic fluorescent probes to layers
assembled onto colloids. Macromolecules 32,
2317-2328.
Christensen, B. B., Sternberg, C.,
Andersen, J. B., Palmer, R. J., Jr., Nielsen,
A. T., Givskov, M., y Molin, S. (1999).
Molecular tools for study of biofilm physiology. Methods
Enzymol 310, 20-42.
Cross, A. S., Kim, K. S.,
Wright, D. C., Sadoff, J. C., and Gemski, P.
(1986). Role of lipopolysaccharide and capsule in the serum
resistance of bacteremic strains of Escherichia coli. J
Infect Dis 154, 497-503.
Cucarella, C., Solano, C.,
Valle, J., Amorena, B., Lasa, I. I., y
Penades, J. R. (2001). Bap, a Staphylococcus aureus
Surface Protein Involved in Biofilm Formation. J Bacteriol
183, 2888-2896.
Da Re, S., y Ghigo, J. M.
(2006). A CsgD-independent pathway for
cellulose production and biofilm formation in Escherichia
coli. J Bacteriol 188, en prensa.
De Gennes, P. G. (1987). Polymers
at an interface: a simplified view. Adv Colloid Interface Sci
27, 189-209.
Decher, G. (1997). Fuzzy
Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites.
Science 277, 1232-1237.
Deghmane, A. E., Giorgini, D.,
Larribe, M., Alonso, J. M., y Taha, M. K.
(2002). Down-regulation of pili and capsule
of Neisseria meningitidis upon contact with epithelial cells
is mediated by CrgA regulatory protein. Mol Microbiol 43,
1555-1564.
D'Enfert, C., and Fontaine, T.
(1997). Molecular characterization of the Aspergillus
nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for
growth on trehalose. Mol Microbiol 24,
203-216.
Dubois, M., Gilles, K. A.,
Hamilton, J. K., Rebers, P. A., y Smith, F.
(1956). Colorimetric method for determination of sugars and
related substances. Anal Chem 28,
350-356.
Favre-Bonte, S.,
Licht, T. R., Forestier, C., y Krogfelt, K. A.
(1999). Klebsiella pneumoniae capsule expression is
necessary for colonization of large intestines of
streptomycin-treated mice. Infect Immun 67,
6152-6156.
Fontaine, T., Simenel, C.,
Dubreucq, G., Adam, O., Delepierre, M.,
Lemoine, J., Vorgias, C. E., Diaquin, M., y
Latge, J. P. (2000). Molecular organization of the
alkali-insoluble fraction of Aspergillus
fumigatus cell wall. J Biol Chem 275, 41528.
Galdbart, J. O., Allignet, J.,
Tung, H. S., Ryden, C., y El Solh, N.
(2000). Screening for Staphylococcus epidermidis
markers discriminating between skinflora strains and those
responsible for infections of joint prostheses. J Infect Dis
182, 351-355.
Ghigo, J. M. (2001). Natural
conjugative plasmids induce bacterial biofilm development.
Nature 412, 442-445.
Hall-Stoodley, L.,
Costerton, J. W., y Stoodley, P. (2004).
Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious
diseases. Nat Rev Microbiol 2, 95-108.
Heilmann, C., Gerke, C.,
Perdreau-Remington, F., y Gotz, F.
(1996). Characterization of Tn917 insertion mutants of
Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation.
Infect Immun 64, 277-282.
Jann, K., Jann, B.,
Schmidt, M. A., y Vann, W. F. (1980). Structure
of the Escherichia coli K2 capsular antigen, a teichoic
acid-like polymer. J Bacteriol 143,
1108-1115.
Johnson. J. R., y O'Bryan, T. T.
(2004). Detection of the Escherichia coli group 2
polysaccharide capsule synthesis Gene kpsM by a rapid and specific
PCR-based assay. J Clin Microbiol 42,
1773-1776.
Kaijser, B. (1973). Immunology of
Escherichia coli: K antigen and its relation to
urinary-tract infection. J Infect Dis 127,
670-677.
Kaper, J. B., Nataro, J. P., y
Mobley, H. L. (2004). Pathogenic Escherichia
coli. Nat Rev Microbiol 2, 123-140.
Leboeuf, D., y Henry, N.
(2006). Molecular bond formation between surfaces: anchoring
and shearing effects. Langmuir 22,
127-133.
Maroncle, N., Rich, C., y
Forestier, C. (2006). The role of Klebsiella
pneumoniae urease in intestinal colonization and resistance to
gastrointestinal stress. Res Microbiol 157,
184-193.
Meier, C., Oelschlaeger, T. A.,
Merkert, H., Korhonen, T. K., y Hacker, J.
(1996). Ability of Escherichia coli isolates that
cause meningitis in newborns to invade epithelial and endothelial
cells. Infect Immun 64, 2391-2399.
Mobley, H. L., Green, D. M.,
Trifillis, A. L., Johnson, D. E., Chippendale,
G. R., Lockatell, C. V., Jones, B. D., y
Warren, J. W. (1990). Pyelonephritogenic
Escherichia coli and killing of cultured human renal
proximal tubular epithelial cells: role of hemolysin in some
strains. Infect Immun 58, 1281-1289.
Neu, T. R. (1996). Significance of
bacterial surface-active compounds in interaction of
bacteria with interfaces. Microbiol Rev 60,
151-166.
Ochman, H., y Selander, R. K.
(1984). Standard reference strains of Escherichia coli
from natural populations. J Bacteriol 157,
690-693.
O'Toole, G. A., y Kolter, R.
(1998). Initiation of biofilm formation in Pseudomonas
fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling
pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol 28,
449-461.
Pluschke, G., Mayden, J.,
Achtman, M., y Levine, R. P. (1983). Role of
the capsule and the O antigen in resistance of O18: K
Escherichia coli to complement-mediated
killing. Infect Immun 42, 907-913.
Roberts, I. S. (1996). The
biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in
bacteria. Annu Rev Microbiol 50,
285-315.
Russo, T. A., Sharma, G.,
Weiss, J., y Brown, C. (1995). The construction
and characterization of colanic acid deficient mutants in an
extraintestinal isolate of Escherichia coli (O4/K54/H5).
Microb Pathog 18, 269-278.
Sandberg, T., Kaijser, B.,
Lidin-Janson, G., Lincoln, K.,
Orskov, F., Orskov, I., Stokland, E., y
Svanborg-Eden, C. (1988). Virulence
of Escherichia coli in relation to host factors in women with
symptomatic urinary tract infection. J Clin Microbiol 26,
1471-1476.
Schachter, B. (2003). Slimy
business--the biotechnology of biofilms. Nat Biotechnol 21,
361-365.
Schembri, M. A., Dalsgaard, D., y
Klemm, P. (2004). Capsule shields the function of
short bacterial adhesins. J Bacteriol 186,
1249-1257.
Silver, R. P., y Vimr, E. R.
(1984). Polysialic acid capsule of Escherichia coli
K1. In Molecular Basis of Bacterial Pathogenesis (Academic
Press, Inc., New York), pp. 39-60.
Strauch, K. L., y Beckwith, J.
(1988). An Escherichia coli mutation preventing
degradation of abnormal periplasmic proteins. Proc Natl Acad
Sci U S A 85, 1576-1580.
Toledo-Arana, A.,
Valle, J., Solano, C., Arrizubieta, M. J.,
Cucarella, C., Lamata, M., Amorena, B.,
Leiva, J., Penades, J. R., y Lasa, I.
(2001). The Enterococcal Surface Protein, Esp, Is Involved in
Enterococcus faecalis Biofilm Formation. Appl Environ
Microbiol 67, 4538-4545.
Valle, J.,
Toledo-Arana, A., Berasain, C.,
Ghigo, J. M., Amorena, B., Penades, J. R., y
Lasa, 1. (2003). SarA and not sigmaB is essential for
biofilm development by Staphylococcus aureus. Mol
Microbiol 48, 1075-1087.
Vasseur, P.,
Vallet-Gely, I., Soscia, C.,
Genin, S., y Filloux, A. (2005). The pel genes
of the Pseudomonas aeruginosa PAK strain are involved at
early and late stages of biofilm formation. Microbiology 151,
985-997.
Vidal, O., Longin, R.,
Prigent-Combaret, C., Dorel, C.,
Hooreman, M., y Lejeune, P. (1998). Isolation
of an Escherichia coli K-12 mutant strain
able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR
allele that increases curli expression. J Bacteriol 180,
2442-2449.
Waters, C. M., y Bassler, B. L.
(2005). Quorum sensing:
cell-to-cell communication in
bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol 21,
319-346.
Whitfield, C. (2006). Biosynthesis
and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli.
Annu Rev Biochem 75, 39-68.
Whitfield, C., y Roberts, I. S.
(1999). Structure, assembly and regulation of expression of
capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 31,
1307-1319.
Claims (22)
1. Uso de un polisacárido capsular soluble del
tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la
preparación de una composición que previene o inhibe la adhesión
bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene
en el sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre
Escherichia coli, Haemophilus influenzae y
Neisseria meningitidis.
3. El uso de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho polisacárido capsular soluble del
tipo del grupo II se obtiene como una fracción purificada.
4. Una composición para inhibir la adhesión
bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas,
caracterizada por que comprende un polisacárido capsular
soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana.
5. La composición de la reivindicación 4, que
comprende una fracción purificada del sobrenadante de un cultivo de
bacterias seleccionadas entre E. coli, H. influenzae y
N. meningitidis.
6. Un proceso para purificar un polisacárido
capsular del tipo del grupo II anti-biopelícula a
partir de una cepa bacteriana, que comprende los siguientes
pasos:
- (i)
- separar el sobrenadante de un cultivo de una cepa bacteriana que expresa una capsula del tipo del grupo II de las células bacterianas,
- (ii)
- precipitar los polisacáridos presentes en el sobrenadante obtenido, y
- (iii)
- opcionalmente resuspender el precipitado.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El proceso de la reivindicación 6, en el que
dicha cepa bacteriana que expresa una cápsula del tipo del grupo II
se selecciona entre E. coli, H. influenzae y N.
meningitidis.
8. El proceso de la reivindicación 6 o la
reivindicación 7, en el que dicha cepa bacteriana es una E.
coli uropatógena.
9. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones de 6 a 8, en el que la separación en el paso (i) se
realiza por esterilización por filtración y/o por centrifugación
del cultivo.
10. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que la precipitación en el paso (ii)
se realiza con tres volúmenes de etanol por un volumen de
sobrenadante.
11. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones de 6 a 10, en el que el precipitado obtenido en el
paso (ii) se resuspende en agua, se dializa frente a agua
desionizada, y luego se liofiliza antes del paso (iii).
12. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 11, que comprende además un paso adicional (iv)
de purificación por cromatografía de intercambio iónico.
13. El proceso de la reivindicación 12, en el
que el paso (iv) se realiza usando una columna de
DEAE-Sepharose.
14. El proceso de la reivindicación 12 o la
reivindicación 13, en el que la resuspensión en el paso (iii) se
hace en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de
propanol-1, y la columna que se usa en el paso (iv)
se equilibra con el mismo tampón.
15. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que se realiza un paso de
centrifugación entre el paso (iii) y el paso (iv) para descartar la
fracción insoluble.
16. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que dichos polisacáridos capsulares
del tipo del grupo II se eluyen con NaCl 300 mM en TrisHCl 20 mM,
pH 7,5, y 25% de propanol-1.
17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, o la composición de la reivindicación 4 o 5, en el que dicho
polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene a
través de un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 16.
18. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5 y 17, que se formula para la administración
preventiva o terapéutica a un sujeto que lo necesita.
19. Un revestimiento
anti-biopelícula, caracterizado por que
comprende un polisacárido capsular del tipo del grupo II de una
cepa bacteriana.
20. El revestimiento
anti-biopelícula de la reivindicación 19,
caracterizado por que dicho polisacárido capsular soluble
del tipo del grupo II procede de una cepa bacteriana seleccionada
entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y
Neisseria meningitidis.
21. El revestimiento
anti-biopelícula de la reivindicación 19 o de la
reivindicación 20, caracterizado por que se ha obtenido por
aplicación de una composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5 o 17.
22. Un dispositivo medico o industrial,
caracterizado por que está revestido al menos parcialmente
con un revestimiento anti-biopelícula de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 y 21.
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EP2510944A1 (en) | 2011-04-15 | 2012-10-17 | National University of Ireland, Galway | Treatment of bacterial infections |
US20120315260A1 (en) * | 2011-06-13 | 2012-12-13 | Svetlana A. Ivanova | Compositions and Methods to Prevent and Treat Biofilms |
US10420822B2 (en) | 2011-06-13 | 2019-09-24 | Ziolase, Llc | Compositions and methods to prevent and treat biofilms |
CN102633897B (zh) * | 2012-04-23 | 2014-04-23 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺 |
US9334507B2 (en) | 2012-06-15 | 2016-05-10 | Microvi Biotech, Inc. | Bioprocesses for making butanol |
US9752164B2 (en) | 2012-06-15 | 2017-09-05 | Microvi Biotech, Inc. | Enhanced efficiency ethanol and sugar conversion processes |
US9255281B2 (en) | 2012-06-15 | 2016-02-09 | Microvi Biotech Inc. | Bioconversion processes using water-insoluble liquids |
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US10900043B2 (en) | 2014-09-02 | 2021-01-26 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for treating bacterial disease |
WO2016036839A1 (en) * | 2014-09-02 | 2016-03-10 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for treating gonorrhea |
US11541105B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-01-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1187753B (it) * | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
US4727136A (en) * | 1985-10-01 | 1988-02-23 | Canadian Patents And Development Ltd. | Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine |
EP0333243A3 (en) * | 1988-03-10 | 1989-09-27 | Akzo N.V. | Sulphated k5 antigen and sulphated k5 antigen fragments |
RO111416B1 (ro) | 1989-12-14 | 1996-10-31 | Ca Nat Research Council | Polizaharide modificate de neisseria meningitidis si e coli, combinatii antigenice si metoda de imunizare |
FR2684385B1 (fr) * | 1991-11-28 | 1997-08-01 | Sanofi Elf | Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
ES2346022T3 (es) * | 1997-12-23 | 2010-10-07 | Baxter Healthcare S.A. | Procedimiento para la extraccion y el aislamiento de polisacaridos capsulares bacterianos para su uso como vacunas o ligandos a proteinas como vacunas de conjugados. |
US7223571B2 (en) * | 1998-04-02 | 2007-05-29 | The Board Of Regents Of The Universtiy Of Oklahoma | Targeted glycosaminoglycan polymers by polymer grafting and methods of making and using same |
US20060188966A1 (en) * | 1998-04-02 | 2006-08-24 | Deangelis Paul L | Natural, chimeric and hybrid glycosaminoglycan polymers and methods of making and using same |
ITMI991465A1 (it) * | 1999-07-02 | 2001-01-02 | Inalco Spa | Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli |
EA006313B1 (ru) * | 2000-06-29 | 2005-10-27 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Поливалентные иммуногенные композиции и способы их применения |
ITMI20032498A1 (it) * | 2003-12-17 | 2005-06-18 | Pasqua Anna Oreste | Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e |
US20030165870A1 (en) * | 2002-03-01 | 2003-09-04 | Blattner Frederick R. | Novel sequences of E. coli CFT073 |
WO2003079995A2 (en) * | 2002-03-20 | 2003-10-02 | Emory University | Neisseria mutants, lipooligosaccharides and immunogenic compositions |
US20060073168A1 (en) * | 2004-08-11 | 2006-04-06 | Stephens David S | Neisseria meningitidis serogroup a capsular polysaccharide acetyltransferase, methods and compositions |
FR2874931B1 (fr) * | 2004-09-08 | 2006-11-24 | Aventis Pharma Sa | Procede de production de polysaccharide k5 |
GB0424092D0 (en) * | 2004-10-29 | 2004-12-01 | Chiron Srl | Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins |
US9333250B2 (en) * | 2006-04-06 | 2016-05-10 | The Johns Hopkins University | Methods and compositions for treating bacterial infection |
EP1872791A1 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-02 | Institut Pasteur | Use of bacterial polysaccharides for biofilm inhibition |
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