ES2342692T3 - Uso de polisacaridos bacterianos para la inhibicion de biopeliculas. - Google Patents

Abstract

Uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación de una composición que previene o inhibe la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas.

Description

Uso de polisacáridos bacterianos para la inhibición de biopelículas.

La presente invención pertenece al campo de la prevención de biopelículas. Más particularmente, la invención proporciona nuevos componentes que pueden prevenir y/o inhibir la formación de biopelículas bacterianas en varias superficies.

Una biopelícula es una acumulación de microorganismos embebidos en una matriz de polisacáridos y adherente a una superficie biológica o no biótica. En estas biopelículas pueden encontrarse diversos microorganismos (bacterias, hongos y/o protozoos, con bacteriófagos asociados y otros virus). Las biopelículas son ubicuas en la naturaleza y se encuentran comúnmente en una amplia serie de ambientes, incluyendo los sistemas de agua domésticos e industriales.

Las biopelículas son también agentes etiológicos para varias enfermedades en mamíferos. Los ejemplos incluyen infecciones de los tejidos blandos orales, dientes, oído medio, tracto gastrointestinal, tracto urogenital, tejido de vías respiratorias/pulmonar, membrana peritoneal y los ojos. Las biopelículas también se desarrollan en dispositivos intravasculares médicos, tales como implantes dentales, prótesis del tracto urinario, catéteres de diálisis peritoneal, catéteres permanentes para hemodiálisis y para la administración crónica de agentes quimioterapéuticos (catéteres de Hickman), implantes cardiacos tales como marcapasos, válvulas protésicas del corazón, dispositivos de asistencia ventricular (DAV), injertos y endoprótesis vasculares sintéticas, prótesis, dispositivos de fijación interna, suturas percutáneas y tubos traqueales y de ventilación.

El desarrollo de biopelículas en dispositivos industriales tales como sistemas de agua o plantas agroalimentarias también provoca problemas de seguridad.

Las bacterias planctónicas (es decir, bacterias unicelulares suspendidas en medio líquido) generalmente se usan como modelos para investigación y diseño de antibióticos. Sin embargo, las bacterias en las biopelículas son mucho más resistentes a antibióticos que sus homólogas planctónicas, y menos accesibles para el sistema inmune. Además, la conjugación se produce a una mayor proporción entre las células de las biopelículas que entre las células planctónicas. Esta mayor oportunidad de transferencia genética entre bacterias es importante, ya que las bacterias resistentes a agentes antimicrobianos o a biocidas químicos pueden transferir los genes de resistencia a bacterias vecinas susceptibles. La transferencia genética también puede convertir un organismo comensal avirulento previo en un patógeno altamente virulento.

La formación de biopelículas no está limitada a la unión de bacterias a una superficie. De hecho, cuando se aumenta en profundidad, las bacterias de las biopelículas interaccionan más entre ellas que con el sustrato físico real en el que se desarrolló la película inicialmente. En una biopelícula, las bacterias pueden comunicarse por medio de mecanismos de señalización química, de forma que la comunidad experimenta cambios fenotípicos cuando se alcanza una densidad mínima (el quórum) en la biopelícula. Este fenómeno, llamado "quórum sensing" ("lenguaje químico de las bacterias"), puede ser responsable de la expresión de factores de virulencia.

Además de polisacáridos relacionados con las biopelículas de E. coli tales como polímero de ácido colánico, celulosa y (1-6) \beta-N-acetilglucosamina, los aislados de E. coli también producen dos polisacáridos seroespecíficos de superficie: el lipopolisacárido (LPS) antígeno O y el polisacárido capsular, antígeno K. Estas dos clases de polímeros polisacarídicos expuestos de superficie han demostrado jugar papeles indirectos en las biopelículas por medio de la protección de la adhesina de la superficie bacteriana (Schembri et al., 2004).

Las estrategias descritas hasta la fecha para prevenir y/o romper las biopelículas están principalmente basadas en inhibidores del quórum sensing (Schachter, 2003).

La presente invención proporciona una novedosa estrategia para inhibir la formación de biopelículas, ya que los inventores han demostrado, usando biopelículas bacterianas de especies mezcladas in vitro, que algunas bacterias liberan en el cultivo sobrenadante un polisacárido capsular soluble del grupo II que previene la formación de biopelículas de una amplia serie de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Como se describe en la parte experimental más abajo, estos componentes capsulares inducen alteraciones físico-químicas de la superficie, llevando a una reducción de la superficie celular y de los contactos célula-célula que limitan tanto la adhesión inicial como el desarrollo de la biopelícula bacteriana.

Un primer objeto de la presente invención es, por lo tanto, el uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación de una composición que prevenga o inhiba la adhesión de microorganismos y/o el desarrollo de biopelículas, en particular la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas. En lo que sigue, el término "polisacárido", aunque se usa en el singular, puede designar una mezcla de diferentes polisacáridos. Los polisacáridos capsulares producidos por las bacterias, de hecho, son de varios tamaños. De hecho, las capsulas de E. coli, que constituyen la capa protectora más externa de la superficie de la célula, se clasifican en cuatro grupos basados en criterios genéticos y biosintéticos. La cápsula del grupo II es uno de los 4 tipos capsulares descritos en E. coli, y está constituido por polímeros polisacarídicos de alto peso molecular y cargados producidos por las bacterias Escherichia coli más uropatógenas (UPEC) y otras bacterias E. coli extraintestinales. Las cápsulas del grupo II presentan una organización genética modular conservada caracterizada por 3 regiones funcionales. La región 1 (kpsFEDCUS) y la región 3 (kpsMT) están conservadas en todas las bacterias encapsuladas del grupo II y codifican proteínas requeridas para la salida ABC-dependiente. La región 2 codifica una diversidad de componentes estructurales polisacarídicos tales como los serotipos capsulares K1, K2 (CFT073), K5 y K96 (Whitfield, 2006; Whitfield y Roberts, 1999). También se han descrito cápsulas del tipo del grupo II en Haemophilus influenzae y en Neisseria meningitidis (Roberts, 1996).

En una realización preferida de la invención, un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene en el sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis. Sin embargo, en el presente texto, la frase "polisacáridos capsulares del tipo del grupo II" puede designar polisacáridos capsulares que se producen por otras bacterias, siempre que conserven las propiedades anti-biopelícula observadas para los polisacáridos capsulares producidos por las cepas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares producidos por la cepa 47 de la colección ECOR (Ochman y Selander, 1984) se consideran aquí como un "polisacárido capsular del tipo del grupo II", aunque esta cepa produce aparentemente una cápsula híbrida de grupo II/grupo III.

La presente invención puede llevarse a cabo con polisacáridos que tienen diferentes niveles de purificación. Por ejemplo, el sobrenadante bruto de un cultivo bacteriano (separado de las bacterias por esterilización por filtración o centrifugación) puede usarse de acuerdo con la invención como una composición que comprende polisacáridos capsulares solubles del tipo del grupo II. Sin embargo, con el fin de incrementar la actividad anti-biopelícula de la composición, así como su seguridad, el polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II puede obtenerse como una fracción purificada. En la parte experimental proporcionada más adelante se describen tres niveles de purificación como ejemplos no limitantes. Alternativamente, una composición según la invención puede obtenerse directamente a partir del cultivo bacteriano, por ejemplo después de la lisis de las bacterias.

Otro objeto de la presente invención es una composición para inhibir la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas, que comprende un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana. Tal composición puede comprender polisacáridos que tienen diferentes niveles de purificación. En una realización preferida, tal composición comprende una fracción purificada del sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre E. coli, H. influenzae y N. meningitidis, que comprende polisacáridos capsulares solubles del tipo del grupo II.

La presente invención también se refiere a un proceso de purificación de un polisacárido capsular del tipo del grupo II de anti-biopelícula a partir de una cepa bacteriana, que comprende los siguientes pasos:

i.

separar el sobrenadante de un cultivo de una cepa bacteriana que expresa una cápsula del tipo del grupo II de las células bacterianas,

ii.

precipitar los polisacáridos presentes en el sobrenadante obtenido, y

iii.

opcionalmente, resuspender el precipitado.

\vskip1.000000\baselineskip

El proceso anterior preferiblemente se lleva a cabo con una cepa bacteriana seleccionada entre E. coli, H. influenzae y N. meningitidis, más preferiblemente con una E. coli uropatógena.

En este proceso, el paso (i) puede llevarse a cabo por centrifugación y/o esterilización por filtración del cultivo bacteriano, para eliminar las células bacterianas. Por ejemplo, en procesos industriales, puede realizarse filtración tangencial sin ninguna centrifugación preliminar. La filtración tangencial puede llevarse a cabo de manera
continua.

El experto en la materia puede usar cualquier proceso de precipitación conocido en la técnica para llevar a cabo el segundo paso del proceso descrito anteriormente. Por ejemplo, la precipitación del paso (ii) se puede llevar a cabo con tres volúmenes de etanol por un volumen de sobrenadante.

En una variante ventajosa del proceso según la invención, el precipitado obtenido en el paso (ii) primero se resuspende en agua, se dializa frente a agua desionizada, y luego se liofiliza antes del paso (iii).

La resuspensión en el paso (iii) puede hacerse en agua o en cualquier tampón adecuado para el uso deseado. Un ejemplo de tampón que puede usarse es TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1.

Al final del paso (iii), los polisacáridos anti-biopelícula se obtienen como un producto semi-purificado que puede usarse de acuerdo con la invención, especialmente en aplicaciones que no necesiten productos de calidad médica.

Para purificar adicionalmente los polisacáridos, el proceso de purificación puede comprender un paso adicional (iv) de purificación por cromatografía, especialmente cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo usando una columna de DEAE-Sepharose. En esta realización de la invención, puede llevarse a cabo un paso de centrifugación opcional entre el paso (iii) y el paso (iv), para descartar la fracción insoluble.

El experto en la materia puede escoger cualquier un tampón apropiado para llevar a cabo el paso (iv). Un ejemplo de tampón que puede usarse es TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1. De acuerdo con una realización ventajosa del proceso, el precipitado se resuspende en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1 en el paso (iii), y la columna que se usa en el paso (iv) se equilibra con el mismo tampón.

Cuando se lleva a cabo el paso de purificación por cromatografía de intercambio iónico, los polisacáridos capsulares del tipo del grupo II pueden eluirse usando un gradiente de sal, por ejemplo un gradiente de NaCl. En una realización eficaz del proceso, descrita en la parte experimental, los polisacáridos capsulares del tipo del grupo II se eluyen con NaCl 300 mM en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1.

Por supuesto, los polisacáridos capsulares solubles del tipo del grupo II obtenidos a través de un proceso como el descrito anteriormente pueden usarse, de acuerdo con la invención, para la preparación de una composición que prevenga o inhiba la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas. También forma parte de la presente invención una composición anti-biopelícula que comprende tales polisacáridos.

En una realización particular, la composición de la presente invención se formula para la administración preventiva o terapéutica a un sujeto que lo necesita. Son ejemplos no limitantes de composiciones de acuerdo con este aspecto de la invención soluciones orales, soluciones para infusión dentro del oído, colirios, pastas de dientes o dentífricos terapéuticos, etc. Estas composiciones pueden usarse, por ejemplo, para prevenir la (re)-colonización del intestino, el pulmón, el oído, el seno o cualquier órgano o cavidad, por bacterias patógenas.

En otra realización, la composición de acuerdo con la invención es un líquido o una pasta, por ejemplo una pintura, que puede aplicarse en cualquier tipo de superficie para prevenir la formación de biopelículas en estas superficies.

Otro aspecto de la presente invención es un revestimiento anti-biopelícula que comprende un polisacárido capsular del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana. En tal revestimiento, el polisacárido capsular del tipo del grupo II puede tener diferentes niveles de purificación, como se describe anteriormente. En una realización preferida del revestimiento de acuerdo con la invención, el polisacárido capsular del tipo del grupo II procede de una cepa bacteriana seleccionada de entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis. Este revestimiento puede obtenerse, por ejemplo, por aplicación de una composición como se describió anteriormente. También puede estar en forma de láminas que pueden aplicarse sobre cualquier tipo de dispositivo sobre el que debe evitarse la formación de la biopelícula.

Por lo tanto, también forma parte de la presente invención un dispositivo médico o industrial que esté al menos parcialmente revestido con un revestimiento anti-biopelícula que comprende un polisacárido capsular del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana. Tal objetivo puede obtenerse, por ejemplo, sumergiendo parte del dispositivo o todo el dispositivo en una composición líquida como se describe anteriormente. El experto en la materia puede escoger la duración de la incubación dependiendo del material, la concentración del polisacárido capsular del tipo del grupo II en la composición, el uso deseado y similares. Típicamente, dicha incubación puede durar desde 10 segundos a 30 minutos. Generalmente son suficientes incubaciones cortas (\leq 1 a 5 minutos). Si es necesario, el dispositivo revestido después se puede esterilizar por una diversidad de tratamientos, sin dañar el revestimiento. Por ejemplo, se puede lavar intensamente y/o esterilizar en autoclave. Ventajosamente, de acuerdo con este aspecto de la invención puede recubrirse cualquier tipo de dispositivo hecho de vidrio, pirex, PVC, policarbonato, polipropileno y similares.

Son dispositivos médicos no limitantes que pueden recubrirse ventajosamente de acuerdo con este aspecto de la invención escalpelos, fresas y otras herramientas quirúrgicas y/u odontológicas no desechables, y dispositivos intravasculares tales como implantes dentales, prótesis del tracto urinario, catéteres peritoneales de diálisis, catéteres permanentes para hemodiálisis y para administración crónica de agentes quimioterapéuticos (catéteres de Hickman), implantes cardiacos tales como marcapasos, válvulas protésicas del corazón, dispositivos de asistencia ventricular (DAV), injertos y endoprótesis vasculares sintéticas, prótesis, dispositivos de fijación interna, suturas percutáneas y tubos traqueales y de ventilación.

Son ejemplos no limitantes de dispositivos industriales que pueden recubrirse ventajosamente de acuerdo con este aspecto de la invención materiales de fontanería tales como cañerías, tubos, válvulas y similares, torres de refrigeración secas, sistemas de agua caliente, circuitos de refrigeración de plantas de energía nuclear, especialmente circuitos secundarios y terciarios, materiales agroalimentarios tales como silos, fermentadores, coladores, etc., elementos del mobiliario tales como mesas de laboratorio, encimeras y similares, especialmente para salas blancas, etc.

La invención además se ilustra por las siguientes figuras y ejemplos.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Efecto inhibidor de biopelículas de CFT073. A, Formación de biopelículas de MG1655F' en microfermentadores inoculados con 1 ó 10 equivalentes de DO_{600 \ nm} de células KS272 (gris) o CFT073 (negro). Biopelícula de MG1655F' sola (\diameter, blanco). Los resultados son el promedio de 6 réplicas \pm s.d. P<0,001 comparados con la biopelícula de MG1655F'. B, Biopelícula de MG1655F' sola en placa de microtitulación (\diameter), o en presencia de sobrenadante KS272 o sobrenadante CFT073, (S.KS272 y S.CFT073, respectivamente). C, Biopelícula de MG1655F' en microfermentadores perfundidos con medio sin sobrenadante (\diameter) o con S.KS272 o S.CFT073. D, Curvas de crecimiento de MG1655F' solo (\diameter) o con S.KS272 o S.CFT073. E, Viabilidad de células MG1655F' solas (\diameter) o con S.KS272 o S.CFT073 visualizadas con tinción BacLight. F, Análisis cualitativo de la formación de biopelículas en placa de microtitulación por diferentes bacterias en la presencia de sobrenadantes de CFT073 (S. CFT).

Figura 2: Efecto del sobrenadante de CFT073 sobre la formación de biopelículas bacterianas Gram-positivas y Gram-negativas. A, Cuantificación de la formación de biopelículas en placas de microtitulación de diferentes bacterias, solas (\diameter), con sobrenadante de KS272 (S.KS) o con sobrenadante de CFT073 (S.CFT). Los niveles de violeta de cristal retenidos se midieron espectrofotométricamente (DO_{570 \ nm}). B, Cuantificación de la biopelícula formada por varias bacterias patógenas en microfermentadores usando medios no suplementados (\diameter), o suplementados con S.CFT o S.KS. Las barras de error representan la desviación típica de dos experimentos independientes. C, Efecto del sobrenadante de CFT073 (S.CFT073) en mezcla de biopelículas de E. coli (MG1655F') con P. aeruginosa (PAK), K. pneumoniae (KP21), S. epidermidis (O-47), S. aureus (15981) y S. epidermidis (O-47) con S. aureus (15981) y E. faecalis (54). El sobrenadante de la cepa de E. coli CFT073\DeltakpsD (S. \DeltakpsD) que no segrega ninguna cápsula del grupo II se usa como control negativo. D, Análisis cualitativo de la formación de biopelículas de S. aureus y P. aeruginosa en un microfermentador usando medios no suplementados, o suplementados con el sobrenadante de CFT073.

Figura 3: Relación entre la producción de la cápsula y la actividad anti-biopelícula del sobrenadante de CFT073. A, Organización genética de las regiones R1, R2 y R3 de la cápsula de CFT073. Los genes con inserciones de transposones se marcan con un asterisco. B, Formación de la biopelícula de MG1655F' cultivada en presencia de los sobrenadantes de mutantes de cápsula. C, Niveles de hexosa en los sobrenadantes. kpsF, kpsU, c3692 y c3693 corresponden a mutantes que no afectan a la producción de la cápsula. D, Fase estacionaria de las capsulas de las células bacterianas CFT073 o CFT073 \Delta teñidas con ferritina y examinadas por microscopía electrónica de transmisión (100.000x; barra = 0,2 \mum) (panel izquierdo); se observaron 125 y 105 células respectivamente. La cápsula CFT073 teñida se indica por una flecha. En el panel de la derecha: micrografías electrónicas de barrido de CFT073 o CFT073\DeltakpsD en fase estacionaria (50.000x; barra = 0,5 \mum); se observaron 45 y 37 células respectivamente.

Figura 4. Correlación entre la actividad anti-biopelícula y la cápsula del grupo II. Formación de biopelículas de las cepas de E. coli MG1655F' y 1091, y de la cepa 15981 de S. aureus cultivadas con: (A) sobrenadantes de E. coli que exhiben una actividad anti-biopelícula (véase la Tabla 1) (aparte de la cepa 47, todas las cepas ensayadas producen cápsulas del grupo II). (B) Sobrenadantes de las cepas CFT073, U-9, U-15 y sus respectivos mutantes kpsD. (C) Formación de biopelícula de cepas de UPEC CFT073, U-9, U-15 (negro) en el microfermentador y sus respectivos mutantes kpsD (gris) desarrollados en M63B1glu, y mutantes kpsD desarrollados en medios suplementados con sus sobrenadantes de tipo silvestre correspondientes (blanco). Las biopelículas se desarrollaron durante 36 h a 37ºC. Las barras de error representan la desviación típica de la media. Las cepas identificadas por números simples corresponden a las de la colección EcoR (Ochman y Selander, 1984).

Figura 5. Efecto anti-biopelícula del sobrenadante de Neisseria meningitidis . Cuantificación de la formación de biopelícula en placa de microtitulación de MG1655F' en presencia de S. Neisseria. La DO_{570 \ nm} del tinte violeta de cristal se determinó como se describe (O'Toole y Kolter, 1998).

Figura 6: Propiedades físico-químicas del sobrenadante de CFT073. a, \zeta potencial de coloides catiónicos incubados con los sobrenadantes dializados de: CFT073 (CFT), U-9, IHE3034 (IHE), EcoR72 (E-72) (gris oscuro) y sus mutantes de cápsula respectivos (gris claro). (\diameter) Corresponde al tratamiento de M63Blglu. b, Ángulo de contacto de una gota de agua en la superficie incubada con CFT, U-9, IHE, E-72 (gris oscuro) y los mutantes de cápsula (gris claro). c, Adsorción de yoduro de propidio sobre partículas catiónicas incubadas con CFT, U-9, IHE, E-72, FR2 (fracción purificada del sobrenadante de CFT073, (gris oscuro) y sus mutantes de cápsula respectivos (gris claro). El grado de adsorción se da por la intensidad fluorescente (> 670 nm). d, Microscopía de fluorescencia de partículas catiónicas incubadas con CFT, S.CFT073\Delta R1 (\diameterR1), FR2 y no incubadas (\diameter). Las barras de error representan la desviación típica de la media.

Figura 7: Efecto de inhibición de la biopelícula del sobrenadante de CFT073 en superficies recubiertas. La formación de la biopelícula en microfermentadores por varias bacterias usando: portaobjetos sin tratar (panel superior), portaobjetos tratados con sobrenadante de CFT073 (panel medio) y portaobjetos tratados con sobrenadante de CFT073\DeltakpsD (panel inferior).

Figura 8. Impacto del tratamiento de espátula recubierta con sobrenadante de S.CFT073 (S.CFT). Formación de biopelículas en microfermentadores por MG1655F' usando portaobjetos no tratados y portaobjetos tratados con S.CFT o con S.CFT llevado a ebullición y luego esterilizado en autoclave o sometido a lavado intenso.

Figura 9: El sobrenadante de CFT073 afecta a la interacción célula-célula. A, Formación de la biopelícula de MG1655F' en microfermentadores con medios suplementados con sobrenadante de CFT073 (S.CFT) a los tiempos de 0 h, 1 h, 6 h (24 h de cultivo) y 24 h (48 h de cultivo). \diameter: Sin adición de S.CFT. B, MG1655F' marcado con GFP inoculado en una celda de flujo y monitoreado por microscopía confocal. Los sobrenadantes de CFT073 o KS272 se suplementaron después de 3 h de cultivo y las biopelículas se desarrollaron durante un total de 12 h. C, Ensayo de autoagregación con cepas que se agregan por diferentes mecanismos: MG1655F' (expresión del pilus conjugativo F); MG1655ompR234 (sobreexpresión de curli); MG1655\DeltaoxyR (sobreexpresión de la adhesina autotransportadora Ag43); 1094 (producción de celulosa). Las células se diluyeron hasta una DO_{600} de 2 en 3 ml de M63B1 (triángulo), el sobrenadante de CFT073 (circulo) y el sobrenadante de \DeltakpsD (rectángulo).

Figura 10. Actividad anti-biopelícula de la fracción FR2. La fracción purificada (FR2) del sobrenadante de CFT073 se añadió al cultivo de MG1655F' en concentraciones que variaban de 0,5 a 500 \mug/ml. La formación de la biopelícula de MG1655F' se visualizó después de 24 h. Concentraciones de 50-100 \mug/ml inhibían la biopelícula de MG1655F'.

Figura 11. Colonización intestinal por CFT073 y CFT073\DeltaR1. a, Las barras representan el error típico del log 10 del número medio de UFC por gramo de heces; Para el análisis estadístico se usó un ensayo de Mann-Whitney, el nivel de significación estadístico (*) se situó en el valor P de <0,016. b, Colonización del colon y el ciego por CFT073 (círculos) y por CFT073\DeltaR1 (triángulos). LD: límite de detección.

Figura 12. Efecto de la fase de crecimiento y quórum-sensing en las propiedades de la anti-película del sobrenadante de CFT073. Formación de la biopelícula de MG1655F' en placa de microtitulación en presencia de sobrenadantes purificados a partir de células en fase exponencial, fase estacionaria y mutante \DeltaluxS. Se centrifugaron 10^{10} células en la fase exponencial (DO_{600 \ nm} = 0,4) y en la fase estacionaria (DO_{600 \ nm} = 2) y los sobrenadantes se precipitaron con 3 volúmenes de etanol. El sobrenadante del mutante \DeltaluxS se purificó en un cultivo durante la noche.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Métodos Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y análisis con microscopía

Las cepas bacterianas se enumeran en la Tabla 1 presentada más adelante. Se desarrollaron bacterias gram-negativas a 37ºC en un medio mínimo M63B1 con un 0,4% de glucosa (M63B1glu) o en un medio LB rico. Se desarrollaron bacterias Gram-positivas en TSB con un 0,25% de glucosa (TSBglu) a 37ºC. El efecto del sobrenadante de CFT073 sobre el crecimiento de las bacterias y la tasa de viabilidad se evaluó usando determinación de curvas de crecimiento, recuento de las unidades formadoras de colonias en la placa LB y el tinte de viabilidad BacLight Live/Dead (Molecular Probes). La tinción con ferritina y la microscopía electrónica de barrido se realizaron como se describe en (Bahrani-Mougeot et al., 2002). La epifluorescencia y la microscopía óptica transmitida se adquirieron usando un microscopio Nikon E400. Los ensayos de autoagregación se realizaron como se describe en (Beloin et al., 2006).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Cepas usadas en este estudio

1

2

3

4

Procedimientos de formación de biopelículas

Experimentos con microfermentadores: La biopelícula se desarrolló como se describió anteriormente (Ghigo, 2001). Cultivos de biopelículas mezcladas: Una biopelícula de MG1655F' de 8 horas formada en el portaobjetos interno de microfermentadores se infectó con 1 equivalente de DO_{600 \ nm} de cultivo de una noche de CFT073-gfp. Después de 24 horas de cultivo continuo en M63B1glu, se tomaron fotografías de los portaobjetos. Se estimó la biomasa de la biopelícula por determinación de la DO_{600 \ nm} de la resuspensión de la biopelícula formada en el portaobjetos interno (Ghigo, 2001). Ensayos de inhibición de biopelículas: el medio entrante se mezcló en una proporción 1:1 con sobrenadantes filtrados y se llevó a los microfermentadores a diferentes tiempos después de la inoculación de las bacterias (0, 1, 6 ó 24 horas). La biopelícula se cultivó además durante otras 24 horas adicionales antes de la determinación de la biomasa. Análisis de la interacción bacteriana con superficies tratadas: los portaobjetos se incubaron 1 min con sobrenadante de CFT073 filtrado y se enjuagaron una vez en agua desionizada antes de la inoculación en los microfermentadores. La formación de la biopelícula en el portaobjetos se determinó después de 24 horas.

Experimentos en placas de microtitulación: Se realizaron ensayos de formación de biopelículas estáticas en placas de microvaloración de PVC de 96 pocillos (Falcon) como se describe en (O'Toole y Kolter, 1998). Ensayos de inhibición de biopelículas: los cultivos durante la noche se ajustaron a DO_{600 \ nm} = 0,04 antes de inocular 100 \mul en placas 96 pocillos en presencia o ausencia de 50 \mul de sobrenadante. Experimentos de cámara de flujo. Se desarrollaron biopelículas en M63B1glu a 37ºC en celdas de flujo de 3 canales (1 x 4 x 40 mm). Se montó el sistema de flujo y se preparó como se describe en (Christensen et al., 1999). Los inóculos se prepararon como sigue: se recogieron cultivos de una noche de 16-20 horas en M63B1glu y se resuspendieron como diluciones normalizadas (DO_{600 \ nm} = 0,005). Se inyectaron 300 \mul en cada canal de flujo. El medio de entrada se mezcló en una proporción 1:1 con sobrenadante filtrado. El flujo se comenzó 1 h después de la inoculación a una velocidad constante de 3 ml h^{-1} usando una bomba peristáltica de Watson Marlow 205S. Todos los ensayos se realizaron al menos por triplicado.

Purificación de sobrenadantes de CFT073 o sobrenadantes de otras cepas encapsuladas del grupo II que presentan actividad anti-biopelícula

Se han ensayado tres niveles de purificación:

i.

Filtración (esterilización) de los sobrenadantes activos (S.CFT, usados en todos los experimentos en placas de microtitulación o en microfermentadores)

\bullet

Se centrifugaron cultivos de una noche en M63B1glucosa al 0,4% durante 30 min a 5000 rpm a 4ºC y se filtraron a través de un filtro de 0,25 \mum para eliminar las bacterias.

ii.

Precipitación de polisacáridos contenidos en sobrenadantes activos.

\bullet

Los polisacáridos contenidos en el sobrenadante filtrado se precipitaron con 3 volúmenes de etanol, se resuspendieron en agua desionizada y se dializaron frente a agua desionizada en casetes de diálisis con un límite de 10 kDa (Pierce biochemical).

iii.

Purificación de la fracción activa de los polisacáridos capsulares (fracción activa capsular FR2).

\bullet

La fracción activa del sobrenadante parcialmente purificado obtenida en el paso (ii) se liofilizó y se resuspendió en 80 ml de tampón Tris HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía un 25% de propanol-1.

\bullet

Esta resuspensión se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm para eliminar las partículas insolubles.

\bullet

El sobrenadante soluble se cargó en una columna de DEAE-Sepharose (30 ml, 2,6 x 6 cm, Amersham) y se equilibró con un tampón Tris HCl 20 mM, pH 7,5 y 25% de propanol-1.

\bullet

La columna se lavó con un tampón Tris HCl 20 mM, pH 7,5 y 25% de propanol-1 con una tasa de 20 ml/h.

\bullet

Después del lavado, la columna se eluyó con un gradiente de NaCl (de 0 a 1 M en 400 ml) y la concentración de polisacáridos de cada fracción eluida (4,5 ml) se ensayó por el método Dubois (Dubois et al., 1956): 100 \mul de fenol al 5% y 500 \mul de ácido sulfúrico concentrado seguido por agitación en vórtice y lectura a 492 nm).

\bullet

Las fracciones positivas (aproximadamente 10 fracciones de 4,5 ml) se agruparon, se dializaron frente a agua desionizada y se liofilizaron.

\bullet

Se resuspendió 1 mg del liofilizado en 1 ml de agua desionizada.

Manejo de los sobrenadantes de cultivo y análisis de polisacáridos

Se centrifugaron cultivos de una noche en M63B1glu a 37ºC 30 minutos a 5000 rpm a 4ºC. Después de la filtración del sobrenadante con un filtro de 0,2 \mum, se precipitaron macromoléculas con 3 volúmenes de etanol y se dializaron frente a agua desionizada usando casetes de 10 kDa (Pierce). Las cantidades totales de fosfato y azúcares neutros se determinaron por los métodos de molibdato amónico/ácido ascórbico y fenol/ácido sulfúrico, respectivamente. La composición de polisacáridos se determinó por HPLC (columna de exclusión iónica) y por cromatografía de gas-líquido como en (d'Enfert y Fontaine, 1997; Fontaine et al., 2000). La fracción activa del sobrenadante de CFT073, FR2, se purificó usando una columna de DEAE-Sepharose (Amersham) y se eluyó con NaCl 300 mM en un 25% de propanol-1, Tris HCl 20 mM pH 7,5. El peso molecular del polímero se estimó por cromatografía de filtración en gel en Superdex-200 (Amersham) usando dextrano como patrón. Las degradaciones de polisacáridos se realizaron por hidrólisis ácida total (ácido trifluoroacético, 4 N, 4 H, 100ºC) o por ácido fluorhídrico acuoso (48% ac. HF, 2 días en agua enfriada con hielo).

Mutagénesis y técnicas moleculares

Se realizó la mutagénesis del transposón mariner de E. coli CFT073 como se describe en (Da Re y Ghigo, 2006). Los sobrenadantes de 10.000 mutantes de transposones incubados 24 h en LB a 37ºC en placas de microtitulación de 97 pocillos se extrajeron después de la centrifugación de las placas 15 min a 10000 rpm y se analizó su efecto en la formación de la biopelícula de MG1655F'. Los sitios de inserción de transposones se determinaron como se describe en (Da Re y Ghigo, 2006). Se realizaron búsquedas de homología usando Blast 2.0. Se generaron mutantes de deleción como se detalla en http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Ggb/3SPCRprotocol.html, usando los cebadores presentados en la Tabla 2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Cebadores usados en este estudio

5

7

8

Análisis de las propiedades físico-químicas de las fracciones activas

Se midió el potencial zeta como en (Caruso et al., 1999) después de 20 minutos de incubación de partículas de látex de coloides catiónicos de 10 \mum de diámetro con sobrenadantes precipitados dializados (es decir, el nivel (ii) de purificación indicado anteriormente). Las partículas de látex soportan una carga positiva neta permanente debido a su revestimiento de polietilenimina (PEI). La capa de PEI es un polímero ramificado de peso molecular 6400 dalton que tiene aproximadamente el 50% de funciones cuaternarias metiladas, lo cual confiere una carga positiva estable a la molécula. Este polímero se depositó en la fase acuosa sobre las partículas carboxiladas inicialmente (Decher, 1997). Las propiedades hidrófilas de los sobrenadantes se investigaron por determinación del ángulo de contacto formado por una gota de 2,5 \mul de agua ultrapura con una superficie plana de vidrio previamente incubada en los sobrenadantes durante 20 minutos. Las interacciones de superficie se analizaron por monitoreo de la adsorción del yoduro de propidio en coloides catiónicos tratados con el sobrenadante. La afinidad de las superficies tratadas por la sonda de fluorescencia se ensayó usando citometría de flujo (Leboeuf y Henry, 2006) y microscopía de fluorescencia. Todas las incubaciones de partículas con sobrenadante se realizaron a una fracción baja de partículas/volumen (aproximadamente el 0,2%) probablemente llevando a la saturación de la superficie por las especies activas.

Experimentos in vivo en ratones

Se realizó una colonización in vivo de CFT073 y CFT073\DeltaR1 como se describió previamente (Maroncle et al., 2006). Los ratones se alimentaron intragástricamente con 1010 UFC. Se numeraron bacterias contenidas en muestras fecales en placas de agar. Para el examen del crecimiento bacteriano en el hospedador, los ratones se sacrificaron a varios tiempos después de la inoculación; el colon y el recto se homogeneizaron en agua fisiológica y se cultivaron en placas para determinar las ufc por gramo de tejido.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Actividad anti-biopelícula del sobrenadante de CFT073

Para estudiar las interacciones de UPEC dentro de comunidades bacterianas de biopelículas multicelulares (Hall-Stoodley et al., 2004), se desarrolló un modelo de biopelícula bacteriana mixta in vitro en microfermentadores (Ghigo, 2001). Usando este modelo, una biopelícula de 8 horas formada por la cepa comensal de E. coli K12 MG1655F' se inoculó con diferentes títulos de la cepa de UPEC CFT073, y se cultivó adicionalmente durante 24 horas. Después de aumentar los títulos de CFT073, se observó una fuerte reducción del desarrollo de la biopelícula de E. coli K12 MG1655F', que no se observó cuando se usó la cepa comensal de E. coli KS272 (Fig. 1A). Esto sugirió que CFT073 podía prevenir la formación de la biopelícula de MG1655F' por contacto directo o por secreción de una molécula inhibitoria. Para distinguir ente estas dos posibilidades, el sobrenadante del cultivo de CFT073 en la fase estacionaria se esterilizó por filtración y se ensayó su efecto sobre la formación de biopelículas de E. coli. En presencia del sobrenadante de CFT073, la biopelícula de MG1655F' se vio severamente afectada (Fig. 1B, C). Esta inhibición de la biopelícula no se debía a un defecto de crecimiento debido a una actividad bactericida o bacteriostática, ya que la tasa de crecimiento y la viabilidad celular de MG1655F' no se vieron afectadas por el sobrenadante de CFT073
(Fig. 1D, E).

Para determinar el espectro de la actividad anti-biopelícula del sobrenadante de CFT073, se ensayó su efecto sobre varias bacterias adherentes (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S. epidermidis y Enterococcus faecalis). Este análisis mostró que el sobrenadante de CFT073 era activo contra una sorprendente serie de bacterias, incluso en cultivos mixtos (Fig. 1F y Fig. 2).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Correlación entre la actividad anti-biopelícula y la cápsula de tipo II

Para dilucidar la base genética del efecto anti-biopelícula, se ensayó la actividad del sobrenadante de aproximadamente 10.000 mutantes de inserción de transposón mariner aleatorios de CFT073. Los inventores identificaron siente candidatos dañados en su capacidad para inhibir la formación de biopelículas de MG1655F'. Todos estos mutantes se mapearon en genes implicados en la expresión del polisacárido capsular del grupo II, la estructura más externa de la superficie de las células bacterianas (Whitfield y Roberts, 1999). La cápsula del grupo II muestra una organización genética modular conservada caracterizada por 3 regiones funcionales (Roberts, 1996) (Fig. 3A). La región 1 (kpsFEDCUS) y la región 3 (kpsMT) están conservadas en todas las bacterias encapsuladas del grupo II y codifican proteínas requeridas para la salida de polisacáridos ABC-dependientes. La región 2 es variable y codifica serotipos de polisacáridos tales como K1, K2 (CFT073), K5, K96 (Roberts, 1996). La región R1, R2 o R3, o cada gen individual kps se delecionó y se observó que, excepto en el caso de kpsU, c3692 y c3693, todos los mutantes perdieron la capacidad de inhibir la formación de la biopelícula de E. coli, lo cual está correlacionado con una cantidad reducida de azúcares precipitados en el sobrenadante (Fig. 3B, 3C). Aunque aún podía detectarse una cápsula teñida con ferritina alrededor de las células CFT073 (Fig. 3D), estos resultados indicaron que la capsula de CFT073, sin embargo, experimenta una liberación significativa en el sobrenadante del medio que es responsable del efecto anti-biopelícula observado.

Para determinar si la inhibición de la biopelícula era una propiedad exclusiva del sobrenadante de E. coli CFT073, los inventores seleccionaron varios aislados bacterianos clínicos uropatógenos de Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Morganella, Citrobacter y Serratia, así como una colección de 110 cepas de E. coli de diversos orígenes. Descubrieron que sólo el sobrenadante filtrado de 40 E. coli, incluyendo 17 UPEC, inhibía la formación de biopelículas en una amplia serie de bacterias sin afectar a la tasa de crecimiento (fig. 4A). Además, al igual que la cepa de E. coli CFT073, todas las cepas activas son capaces de inhibir la formación de biopelículas de bacterias adherentes diferentes de E. coli (véanse los datos de la biopelícula de S. aureus 15981 en la Fig. 4A). Usando sondas específicas de PCR (Johnson y O'Bryan, 2004), mostraron que 39 de las 40 cepas activas de E. coli portaban genes de la capsula del grupo II. La cuadragésima bacteria, EcoR47, efectivamente parece producir una cápsula híbrida del grupo II/grupo III. Esta cepa ha mostrado llevar genes KPS del grupo II (Boyd y Hartl, 1998). Sistemáticamente, la introducción de una mutación kpsD en los aislados clínicos de UPEC U-9 y U-15 anulaba el efecto inhibidor de las biopelículas en sus sobrenadantes (Fig. 4B). De manera interesante, aunque las cepas de CFT073 U-9 y U-15 presentaban una capacidad muy limitada de formar biopelículas en el modelo de biopelícula del microfermentador, sus respectivos mutantes kpsD mostraban un mayor fenotipo de biopelícula. Este fenotipo podía revertirse tras la adición del sobrenadante de CFT073, lo que sugiere que estas cepas también podrían auto-inhibir su propia adhesión (Fig. 4C).

También se realizó un ensayo de inhibición de la formación de biopelículas con una cepa de Neisseria meningitidis, cuya cápsula es muy similar bioquímicamente a la cápsula del grupo II de E. coli. De manera interesante, los resultados muestran que el sobrenadante de N. meningitidis también inhibe la formación de la biopelícula de E. coli MG1655F' (Fig. 5), lo que demuestra que la actividad anti-biopelícula no es sólo una propiedad de la cápsula del grupo II de E. coli, sino también de capsulas que se sabe que son similares a la última (es decir, capsulas del tipo del grupo II).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Propiedades físico-químicas del sobrenadante de CFT073

Cuando los inventores analizaron la composición de las fracciones de polisacáridos precipitadas desde los sobrenadantes activos de diferentes serotipos de E. coli de cápsulas del grupo II, incluyendo CFT073 (K2), U-9 (no-K2) e IHE3034 (K1), observaron, de acuerdo con estudios previos (Jann et al., 1980; Silver y Vimr, 1984), que estas fracciones mostraban composiciones significativamente diferentes (los datos no se muestran). Esto sugiere que, aunque son bioquímicamente distintas, las cápsulas del grupo II liberadas por estas cepas podían compartir un modo de acción similar que llevara a la inhibición de la biopelícula. Para estudiar adicionalmente los mecanismos por los que la capsula del grupo II inhibe la formación de biopelículas bacterianas, estas fracciones se pusieron en contacto con coloides catiónicos compuestos por partículas de látex de 10 \mum de diámetro que tenían una carga neta positiva permanente debido a su revestimiento de polietilenimina. La determinación del potencial de interfaz \zeta (Zeta) mostró que los sobrenadantes de tipo silvestre inducían una fuerte inversión de carga de los coloides catiónicos, lo cual es indicativo de su naturaleza altamente aniónica al compararlos con los sobrenadantes de sus mutantes de cápsula respectivo (Fig. 6a). Además, el tratamiento de portaobjetos limpiados con ácido con sobrenadante activo redujo la energía interfacial del lado del agua, indicando su naturaleza hidrófila (Fig. 6b).

Para analizar sí la cápsula del grupo II podía inducir modificaciones en la superficie y afectar a las fuerzas intermoleculares en las superficies tratadas, los inventores monitorizaron la adsorción del yoduro de propidio, un ión catiónico anfífilo fluorescente, en coloides revestidos con sobrenadantes activos o inactivos. Primero mostraron que un sobrenadante aniónico pero inactivo de E. coli encapsuladas que no era del grupo II EcoR72 mostraba una fuerte afinidad por la sonda catiónica de fluorescencia (Fig. 6c). A pesar de de su alta carga negativa, los sobrenadantes activos mostraron una afinidad por la sonda significativamente menor que los sobrenadantes de mutantes de cápsula inactivos pero menos cargados negativamente (Fig. 6c y 6d). Este efecto era todavía más pronunciado con la fracción capsular activa de K2 de 500 kDa (FR2) purificada a partir de CFT073 por cromatografía de intercambio aniónico que contenía galactosa, glicerol, fosfato y acetato en una proporción molar de 1: 2: 1: 1 (Jann et al., 1980) (Fig. 6c y 6d). Por lo tanto, estos resultados mostraron que, además de las fuertes modificaciones electrostáticas, los sobrenadantes activos también inducían una profunda remodelación de las propiedades de superficie del coloide, posiblemente incluyendo hidratación de superficie y repulsión estérica. Estos análisis confirman que las modificaciones de superficie inducidas por capsulas del grupo II son más criticas para la actividad de inhibición de la biopelícula que la composición primaria de la cápsula.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Prevención del desarrollo de la biopelícula

Las propiedades físico-químicas mostradas por la cápsula del grupo II podrían alterar profundamente la capacidad bacteriana para interaccionar con superficies y por lo tanto reducir drásticamente la adhesión (Neu, 1996). Para ensayar esta hipótesis, se analizó la capacidad tanto de MG1655F' como de S. aureus de adherirse a superficies de vidrio pretratadas con sobrenadante de CFT073. Después de una hora de incubación, E. coli MG1655F' y S. aureus 15981 presentaron una reducción de 3 veces en su adhesión inicial a la superficie tratada (datos no mostrados). Sistemáticamente, el pretratamiento del portaobjetos interno del microfermentador con sobrenadante de CFT073 redujo drásticamente la formación de biopelícula por E. coli y una amplia serie de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Fig. 7). Se observó el mismo efecto cuando el sobrenadante de CFT073 se perfundió en el microfermentador (Fig. 2B). No se observó efecto cuándo se realizó un tratamiento similar con el sobrenadante de CFT073\DeltakpsD (Fig. 7). Estos resultados, por lo tanto, sugirieron que las modificaciones de superficie inducidas por los polisacáridos capsulares liberados en el sobrenadarte de CFT073 podían interferir con la formación de la biopelícula al obstaculizar las interacciones iniciales bacteria-superficie.

Increíblemente, el efecto anti-biopelícula del sobrenadante de CFT073 persistía incluso después de drásticos tratamientos del portaobjetos (Fig. 8), lo que sugiere que la cápsula del grupo II podía usarse en aplicaciones que necesitasen un paso de esterilización (tales como aplicaciones agro-industriales o médicas).

Para investigar el efecto del sobrenadante de CFT073 en las biopelículas ya existentes, se suplementaron microfermentadores inoculados con MG1655F' en diferentes etapas de la maduración de la biopelícula con sobrenadante de CFT073 filtrado. Estos análisis mostraron que, aunque el tratamiento de una biopelícula madura de 24 h no inducía la dispersión de la biopelícula, la adición del sobrenadante de CFT073 a 0, 1 y 6 h después de la iniciación de la biopelícula de MG1655F' bloqueaba su posterior desarrollo (Fig. 9A). Los inventores luego examinaron las características de la biopelícula in vitro de MG1655F' marcado con GFP después de la adición del sobrenadante de CFT073 y microscopía láser confocal de barrido (MLCB). Tres horas después de la inoculación inicial, la adición del sobrenadante exógeno de CFT073 activo en una superficie regularmente cubierta afectó profundamente al desarrollo de la estructura de la biopelícula madura de MG1655F' (Fig. 9B). Este efecto no se observó después del tratamiento de control del sobrenadante de KS272.

La contribución directa de estructuras de superficie bacterianas a la estructura tridimensional de la biopelícula de E. coli se ha demostrado ampliamente (Beloin, et al., 2005). También se ha demostrado que estas estructuras median la agregación bacteriana y la aglutinación en cultivos permanentes. Para caracterizar adicionalmente el papel de la cápsula del grupo II en la maduración de biopelículas, los inventores ensayaron sus efectos en agregación bacteriana mediada por diversos factores expuestos en la superficie diferentes también implicados en la formación de las biopelículas. Se mostró que el sobrenadante de CFT073 previene la formación de agregados bacterianos inducida por diferentes tipos de estructuras de superficie bacterianas (Fig. 9C).

La actividad anti-biopelícula de diferentes concentraciones de la fracción FR2 se ensayó en ensayos de placas de microtitulación. Esto mostró que la fracción FR2 purificada es activa a concentraciones que empiezan desde 50 \mug/ml (Fig. 10).

Considerados juntos, estos resultados sugieren que las propiedades físico-químicas de los polisacáridos capsulares del grupo II afectan a la formación de la biopelícula por debilitamiento de los contactos célula-superficie (adhesión inicial), pero también por reducción de las interacciones célula-célula (maduración de la biopelícula).

En conclusión, los inventores demostraron que en el sobrenadante de cultivo se liberan polisacáridos capsulares del tipo del grupo II y presentan propiedades de anti-adhesión contra una amplia serie de bacterias, incluyendo importantes patógenos nosocomiales. Este estudio revela una novedosa propiedad de los polisacáridos capsulares del grupo II que se expresan comúnmente por E. coli extra-intestinal, pero también por otros patógenos tales como Neisseria meningitidis (Kaijser, 1973; Sandberg et al., 1988), cuyo sobrenadante podría también inhibir la formación de biopelículas de E. coli (los datos no se muestran). Se ha demostrado que las cápsulas del grupo II están implicadas en la virulencia de UPEC al aumentar su resistencia a la fagocitosis y a los efectos bactericidas del suero humano (Cross et al., 1986; Kaper et al., 2004; Pluschke et al., 1983; Russo et al., 1995). Las cápsulas podrían también jugar un importante papel biológico en las interacciones de UPEC con superficies vivas e inertes. En particular, además de la competición bacteriana, la inhibición de la propia adhesión de UPEC por la secreción de cápsulas del grupo II puede contribuir a la colonización del tracto gastrointestinal reduciendo las interacciones bacteria-bacteria (Schembri et al., 2004), evitando de esta manera la eliminación bacteriana debida a la formación de agregados (Favre-Bonte et al., 1999). Consistentemente, se observó que un mutante no encapsulado CFT073\DeltaRI es incapaz de colonizar el intestino del ratón (Fig. 11).

Los análisis in vitro indican que la cápsula del grupo II puede inducir modificaciones de superficie tales como la inversión de carga de superficies catiónicas, y un aumento de la humectabilidad y la repulsión molecular de la superficie, llevando a propiedades de anti-adhesión no específicas. Como este efecto inhibidor se observó en la fase de crecimiento tanto exponencial como estacionario de los sobrenadantes, así como en un mutante \DeltaluxS quórum-sensing de CFT073 (Fig. 12), esto sugiere que el efecto anti-biopelícula no implica señalización de la célula (Waters y Bassler, 2005), sino que más bien actúa a través de una alteración físico-química, de superficies abióticas o bacterianas. Se sabe que el ensamblaje de polímeros en superficies causa una fuerte repulsión física dependiendo de su densidad, tamaño, solvatación y estructura (de Gennes, 1987). Tales fuerzas repulsivas creadas por polímeros de la cápsula podrían limitar la adhesión bacteriana inicial y el desarrollo de la biopelícula al interferir con los contactos célula-célula posteriores. Finalmente, los inventores mostraron que la aplicación de polisacáridos capsulares del grupo II en superficies abióticas reduce la adhesión bacteriana inicial, y ha tenido un efecto de larga duración suficiente como para inhibir significativamente el desarrollo de la biopelícula madura de una amplia serie de bacterias. Este descubrimiento puede tener aplicaciones de largo alcance en el diseño de estrategias terapéuticas para limitar la formación de biopelículas patógenas, por ejemplo en implantes médicos.

Referencias

Bahrani-Mougeot, F. K., Buckles, E. L., Lockatell, C. V., Hebel, J. R., Johnson, D. E., Tang, C. M., y Donnenberg, M. S. (2002). Type 1 fimbriae and extracellular polysaccharides are preeminent uropathogenic Escherichia coli virulence determinants in the murine urinary tract. Mol Microbiol 45, 1079-1093.

Beloin, C., Da Re, S. & Ghigo, J. M. (2005) en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, eds.

Curtiss III, R., Böck, A., Ingraham, J. L., Kaper, J. B., Neidhardt, F. C., Riley, M. & Squires, C. L. (ASM Press, Washington, D.C.), pp. Capítulo 8.3.1.3.

Beloin, C., Michaelis, K., Lindner, K., Landini, P., Hacker, J., Ghigo, J. M., y Dobrindt, U. (2006). The Transcriptional Antiterminator RfaH Represses Biofilm Formation in Escherichia coli. J Bacteriol 188, 1316-1331.

Boyd, E. F., and Hartl, D. L. (1998). Chromosomal regions specific to pathogenic isolates of Escherichia coli have a phylogenetically clustered distribution. J Bacteriol 180, 1159-1165.

Caruso, F., Lichtenfeld, H., Donath, E., y Möhwald, H. (1999). Investigation of electrostatic interactions in poly-electrolyte multilayer films: binding of anionic fluorescent probes to layers assembled onto colloids. Macromolecules 32, 2317-2328.

Christensen, B. B., Sternberg, C., Andersen, J. B., Palmer, R. J., Jr., Nielsen, A. T., Givskov, M., y Molin, S. (1999). Molecular tools for study of biofilm physiology. Methods Enzymol 310, 20-42.

Cross, A. S., Kim, K. S., Wright, D. C., Sadoff, J. C., and Gemski, P. (1986). Role of lipopolysaccharide and capsule in the serum resistance of bacteremic strains of Escherichia coli. J Infect Dis 154, 497-503.

Cucarella, C., Solano, C., Valle, J., Amorena, B., Lasa, I. I., y Penades, J. R. (2001). Bap, a Staphylococcus aureus Surface Protein Involved in Biofilm Formation. J Bacteriol 183, 2888-2896.

Da Re, S., y Ghigo, J. M. (2006). A CsgD-independent pathway for cellulose production and biofilm formation in Escherichia coli. J Bacteriol 188, en prensa.

De Gennes, P. G. (1987). Polymers at an interface: a simplified view. Adv Colloid Interface Sci 27, 189-209.

Decher, G. (1997). Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science 277, 1232-1237.

Deghmane, A. E., Giorgini, D., Larribe, M., Alonso, J. M., y Taha, M. K. (2002). Down-regulation of pili and capsule of Neisseria meningitidis upon contact with epithelial cells is mediated by CrgA regulatory protein. Mol Microbiol 43, 1555-1564.

D'Enfert, C., and Fontaine, T. (1997). Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose. Mol Microbiol 24, 203-216.

Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., y Smith, F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 28, 350-356.

Favre-Bonte, S., Licht, T. R., Forestier, C., y Krogfelt, K. A. (1999). Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infect Immun 67, 6152-6156.

Fontaine, T., Simenel, C., Dubreucq, G., Adam, O., Delepierre, M., Lemoine, J., Vorgias, C. E., Diaquin, M., y Latge, J. P. (2000). Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall. J Biol Chem 275, 41528.

Galdbart, J. O., Allignet, J., Tung, H. S., Ryden, C., y El Solh, N. (2000). Screening for Staphylococcus epidermidis markers discriminating between skinflora strains and those responsible for infections of joint prostheses. J Infect Dis 182, 351-355.

Ghigo, J. M. (2001). Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature 412, 442-445.

Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., y Stoodley, P. (2004). Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol 2, 95-108.

Heilmann, C., Gerke, C., Perdreau-Remington, F., y Gotz, F. (1996). Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation. Infect Immun 64, 277-282.

Jann, K., Jann, B., Schmidt, M. A., y Vann, W. F. (1980). Structure of the Escherichia coli K2 capsular antigen, a teichoic acid-like polymer. J Bacteriol 143, 1108-1115.

Johnson. J. R., y O'Bryan, T. T. (2004). Detection of the Escherichia coli group 2 polysaccharide capsule synthesis Gene kpsM by a rapid and specific PCR-based assay. J Clin Microbiol 42, 1773-1776.

Kaijser, B. (1973). Immunology of Escherichia coli: K antigen and its relation to urinary-tract infection. J Infect Dis 127, 670-677.

Kaper, J. B., Nataro, J. P., y Mobley, H. L. (2004). Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol 2, 123-140.

Leboeuf, D., y Henry, N. (2006). Molecular bond formation between surfaces: anchoring and shearing effects. Langmuir 22, 127-133.

Maroncle, N., Rich, C., y Forestier, C. (2006). The role of Klebsiella pneumoniae urease in intestinal colonization and resistance to gastrointestinal stress. Res Microbiol 157, 184-193.

Meier, C., Oelschlaeger, T. A., Merkert, H., Korhonen, T. K., y Hacker, J. (1996). Ability of Escherichia coli isolates that cause meningitis in newborns to invade epithelial and endothelial cells. Infect Immun 64, 2391-2399.

Mobley, H. L., Green, D. M., Trifillis, A. L., Johnson, D. E., Chippendale, G. R., Lockatell, C. V., Jones, B. D., y Warren, J. W. (1990). Pyelonephritogenic Escherichia coli and killing of cultured human renal proximal tubular epithelial cells: role of hemolysin in some strains. Infect Immun 58, 1281-1289.

Neu, T. R. (1996). Significance of bacterial surface-active compounds in interaction of bacteria with interfaces. Microbiol Rev 60, 151-166.

Ochman, H., y Selander, R. K. (1984). Standard reference strains of Escherichia coli from natural populations. J Bacteriol 157, 690-693.

O'Toole, G. A., y Kolter, R. (1998). Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol 28, 449-461.

Pluschke, G., Mayden, J., Achtman, M., y Levine, R. P. (1983). Role of the capsule and the O antigen in resistance of O18: K Escherichia coli to complement-mediated killing. Infect Immun 42, 907-913.

Roberts, I. S. (1996). The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Annu Rev Microbiol 50, 285-315.

Russo, T. A., Sharma, G., Weiss, J., y Brown, C. (1995). The construction and characterization of colanic acid deficient mutants in an extraintestinal isolate of Escherichia coli (O4/K54/H5). Microb Pathog 18, 269-278.

Sandberg, T., Kaijser, B., Lidin-Janson, G., Lincoln, K., Orskov, F., Orskov, I., Stokland, E., y Svanborg-Eden, C. (1988). Virulence of Escherichia coli in relation to host factors in women with symptomatic urinary tract infection. J Clin Microbiol 26, 1471-1476.

Schachter, B. (2003). Slimy business--the biotechnology of biofilms. Nat Biotechnol 21, 361-365.

Schembri, M. A., Dalsgaard, D., y Klemm, P. (2004). Capsule shields the function of short bacterial adhesins. J Bacteriol 186, 1249-1257.

Silver, R. P., y Vimr, E. R. (1984). Polysialic acid capsule of Escherichia coli K1. In Molecular Basis of Bacterial Pathogenesis (Academic Press, Inc., New York), pp. 39-60.

Strauch, K. L., y Beckwith, J. (1988). An Escherichia coli mutation preventing degradation of abnormal periplasmic proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 1576-1580.

Toledo-Arana, A., Valle, J., Solano, C., Arrizubieta, M. J., Cucarella, C., Lamata, M., Amorena, B., Leiva, J., Penades, J. R., y Lasa, I. (2001). The Enterococcal Surface Protein, Esp, Is Involved in Enterococcus faecalis Biofilm Formation. Appl Environ Microbiol 67, 4538-4545.

Valle, J., Toledo-Arana, A., Berasain, C., Ghigo, J. M., Amorena, B., Penades, J. R., y Lasa, 1. (2003). SarA and not sigmaB is essential for biofilm development by Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 48, 1075-1087.

Vasseur, P., Vallet-Gely, I., Soscia, C., Genin, S., y Filloux, A. (2005). The pel genes of the Pseudomonas aeruginosa PAK strain are involved at early and late stages of biofilm formation. Microbiology 151, 985-997.

Vidal, O., Longin, R., Prigent-Combaret, C., Dorel, C., Hooreman, M., y Lejeune, P. (1998). Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J Bacteriol 180, 2442-2449.

Waters, C. M., y Bassler, B. L. (2005). Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol 21, 319-346.

Whitfield, C. (2006). Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 75, 39-68.

Whitfield, C., y Roberts, I. S. (1999). Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 31, 1307-1319.

Claims (22)

1. Uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación de una composición que previene o inhibe la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene en el sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene como una fracción purificada.

4. Una composición para inhibir la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas, caracterizada por que comprende un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana.

5. La composición de la reivindicación 4, que comprende una fracción purificada del sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre E. coli, H. influenzae y N. meningitidis.

6. Un proceso para purificar un polisacárido capsular del tipo del grupo II anti-biopelícula a partir de una cepa bacteriana, que comprende los siguientes pasos:

(i)

separar el sobrenadante de un cultivo de una cepa bacteriana que expresa una capsula del tipo del grupo II de las células bacterianas,

(ii)

precipitar los polisacáridos presentes en el sobrenadante obtenido, y

(iii)

opcionalmente resuspender el precipitado.

\vskip1.000000\baselineskip

7. El proceso de la reivindicación 6, en el que dicha cepa bacteriana que expresa una cápsula del tipo del grupo II se selecciona entre E. coli, H. influenzae y N. meningitidis.

8. El proceso de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que dicha cepa bacteriana es una E. coli uropatógena.

9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 8, en el que la separación en el paso (i) se realiza por esterilización por filtración y/o por centrifugación del cultivo.

10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la precipitación en el paso (ii) se realiza con tres volúmenes de etanol por un volumen de sobrenadante.

11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 10, en el que el precipitado obtenido en el paso (ii) se resuspende en agua, se dializa frente a agua desionizada, y luego se liofiliza antes del paso (iii).

12. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, que comprende además un paso adicional (iv) de purificación por cromatografía de intercambio iónico.

13. El proceso de la reivindicación 12, en el que el paso (iv) se realiza usando una columna de DEAE-Sepharose.

14. El proceso de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la resuspensión en el paso (iii) se hace en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1, y la columna que se usa en el paso (iv) se equilibra con el mismo tampón.

15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que se realiza un paso de centrifugación entre el paso (iii) y el paso (iv) para descartar la fracción insoluble.

16. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dichos polisacáridos capsulares del tipo del grupo II se eluyen con NaCl 300 mM en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, y 25% de propanol-1.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4 o 5, en el que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene a través de un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16.

18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 y 17, que se formula para la administración preventiva o terapéutica a un sujeto que lo necesita.

19. Un revestimiento anti-biopelícula, caracterizado por que comprende un polisacárido capsular del tipo del grupo II de una cepa bacteriana.

20. El revestimiento anti-biopelícula de la reivindicación 19, caracterizado por que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procede de una cepa bacteriana seleccionada entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis.

21. El revestimiento anti-biopelícula de la reivindicación 19 o de la reivindicación 20, caracterizado por que se ha obtenido por aplicación de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 o 17.

22. Un dispositivo medico o industrial, caracterizado por que está revestido al menos parcialmente con un revestimiento anti-biopelícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 y 21.