JP5124571B2 - バイオフィルム阻害のための細菌の多糖体の使用 - Google Patents
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Description
(i) グループII様莢膜を発現する細菌株の培養物を、細菌細胞から分離し、
(ii) 得られた上清中に存在する多糖体を沈殿させ、
(iii) 沈殿物を任意に再懸濁する
工程を含む、細菌株から抗バイオフィルムグループII様莢膜多糖体を精製する方法にも関する。
本発明による方法の有利な変動において、工程(ii)で得られる沈殿物は、工程(iii)の前に、まず水に再懸濁され、脱イオン水に対して透析され、次いで凍結乾燥される。
工程(iii)の最後に、抗バイオフィルム多糖体が、半精製生成物として得られ、これは、特に医療グレードの製品を必要としない用途において、本発明によりそのまま用い得る。
図面の凡例
図1:CFT073のバイオフィルム阻害効果。A, KS272 (灰色)又はCFT073 (黒色)細胞の1〜10 OD600nm相当物を植菌したマイクロ発酵槽(microfermentor)でのMG1655 F'のバイオフィルム形成。MG1655F'バイオフィルム単独(Φ、白色)。結果は、6回の反復の平均±s.dである。MG1655F'バイオフィルムと比較したP<0.001。B, マイクロタイタープレートMG1655F'バイオフィルム単独(Φ)、又はKS272若しくはCFT073の上清(それぞれS.KS272及びS.CFT073)の存在下。C, 上清なし(Φ)又はS.KS272若しくはS.CFT073を含む媒体で潅流したマイクロ発酵槽でのMG1655F'バイオフィルム。D, MG1655F'単独(Φ)、又はS.KS272若しくはS.CFT073を加えた場合の増殖曲線。E, BacLight染色で視覚化したMG1655F'細胞単独(O)、又はS.KS272若しくはS.CFT073を加えた場合のMG1655F'の生存性。F, CFT073上清(S. CFT)の存在下での種々の細菌によるマイクロタイタープレートでのバイオフィルム形成の質的分析。
細菌株、成長条件及び顕微鏡分析
細菌株を、以下の表1に列挙する。グラム陰性細菌は、0.4%グルコースを含むM63B1最少培地(M63B1glu)又はLBリッチ培地中で、37℃にて成長させた。グラム陽性細菌は、 0.25%グルコースを含むTSB (TSBglu)中で、37℃にて成長させた。細菌の成長及び生存率に対するCFT073上清の影響を、成長曲線の決定、LBプレート上でのコロニー形成単位の計数、及びBacLight Live/Dead生存性染色(Molecular Probes)を用いて評価した。フェリチン染色及び走査型電子顕微鏡観察を、(Bahrani-Mougeotら, 2002)に記載されるようにして行った。落射蛍光及び透過光顕微鏡法は、Nikon E400顕微鏡を用いて獲得した。自己凝集アッセイは、(Beloinら, 2006)に記載されるようにして行った。
マイクロ発酵槽実験:バイオフィルムを、以前に記載されたようにして行った(Ghigo, 2001)。混合バイオフィルム培養:マイクロ発酵槽内部のガラススライド(internal microfermentors glass slide)で形成された8時間MG1655F'バイオフィルムに、1 OD600nm相当のCFT073-gfp一晩培養物を感染させた。M63B1glu中での24時間の連続培養の後に、ガラススライドの写真を撮影した。バイオフィルムのバイオマスを、内部のガラススライド上に形成されたバイオフィルムを再懸濁したもののOD600nmを決定することにより評価した(Ghigo, 2001)。バイオフィルム阻害アッセイ:得られた培地を、ろ過した上清と1:1の比で混合し、細菌の接種の後の異なる時間でマイクロ発酵槽に入れた(0、1、6又は24時間)。バイオフィルムは、バイオマスの決定の前に、さらに24時間培養した。処理表面との細菌の相互作用の分析:ガラススライドを、ろ過したCFT073上清と1分間インキュベートし、脱イオン水で1回リンスした後に、マイクロ発酵槽に接種した。スライド上のバイオフィルムの形成を、24時間後に決定した。
3つの精製レベルを試験した。
(i) 活性上清のろ過(滅菌) (S.CFT、マイクロタイタープレート又はマイクロ発酵槽での全ての実験で用いた)
・M63B1glucose 0.4%中の一晩培養物を、5000 rpm、4℃にて30分間遠心分離し、0.25μmフィルタでろ過して細菌を除去した。
(ii) 活性上清に含まれる多糖体の沈殿
・ろ過された上清に含まれる多糖体を、3容量のエタノールを用いて沈殿させ、脱イオン水に再懸濁し、脱イオン水に対して10 kDaカットオフ透析カセット(Pierce biochemical)中で透析した。
・工程(ii)で得られた部分的に精製された上清の活性画分を凍結乾燥し、25%のプロパノール-1を含有する80 mlのTris HCl 20 mM pH 7.5緩衝液に再懸濁した。
・この再懸濁物を、3000 rpmにて10分間遠心分離して、不溶性粒子を除去した。
・可溶性の上清を、DEAE-セファロースカラムに装填し(30 ml、2.6×6 cm、Amersham)、Tris HCl 20 mM pH 7.5、25%プロパノール-1緩衝液で平衡化した。
・カラムを、Tris HCl 20 mM pH 7.5、25%プロパノール-1緩衝液で、20 ml/hの速度で洗浄した。
・洗浄の後に、カラムを、NaCl勾配(400 ml中に0〜1 M)を用いて溶出し、各溶出画分(4.5 ml)の多糖体濃度を、Dubois法(Duboisら, 1956):100μlの5%フェノール及び500μlの濃硫酸、続いて、ボルテックス撹拌及び492 nmでの読み取り) により試験した。
・陽性の画分(4.5 mlの画分が約10個)をまとめてプールし、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。
・1 mgの凍結乾燥物を1 mlの脱イオン水に再懸濁した。
37℃でのM63B1glu中の一晩培養物を、5000 rpm、4℃にて30分間遠心分離した。0.2μmフィルタでの上清のろ過の後に、巨大分子を3容量のエタノールを用いて沈殿させ、脱イオン水に対して10kDaカセット(Pierce)を用いて透析した。ホスフェート及び中性糖の合計量を、それぞれモリブデン酸アンモニウム/アスコルビン酸法及びフェノール/硫酸法により決定した。多糖体の組成は、(d'Enfert及びFontaine, 1997; Fontaineら, 2000)のように、HPLC (イオン排除カラム)及び気液クロマトグラフィーにより決定した。CFT073上清の活性画分であるFR2を、DEAE-セファロースカラム(Amersham)を用いて精製し、25%プロパノール-1、20 mM TrisHCl pH7.5中の300 mM NaClを用いて溶出した。ポリマーの分子量は、Superdex-200 (Amersham)でのゲルろ過クロマトグラフィーにより、デキストランを標準物質として用いて判断した。多糖体の分解は、全酸加水分解(トリフルオロ酢酸、4N、4H、100℃)又はフッ化水素酸水溶液(48% aq. HF、氷水上に2日間)により行った。
大腸菌CFT073のマリナートランスポゾン突然変異誘発を、(Da Re及びGhigo, 2006)に記載されるようにして行った。96ウェルマイクロタイタープレート中に、LB中で37℃にて24時間インキュベートした10,000個のトランスポゾン変異体の上清を、プレートを10000rpmにて15分間遠心分離した後に抽出し、MG1655F'バイオフィルム形成に対するそれらの影響を分析した。トランスポゾン挿入部位を、(Da Re及びGhigo, 2006)に記載されるようにして決定した。相同性の探索は、Blast 2.0を用いて行った。欠失変異体を、http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Ggb/3SPCRprotocol.htmlに詳細に説明されるようにして、表2に示すプライマーを用いて作製した。
ゼータ電位は、(Carusoら, 1999)に記載されるようにして、透析し沈殿させた上清(すなわち、上記の精製のレベル(ii))と、直径10μmのカチオン性コロイドラテックス粒子とを20分間インキュベーションした後に測定した。ラテックス粒子は、そのポリエチレンイミン(PEI)コーティングにより、永久実効正電荷を有する。PEIの層は、分子に安定な正電荷を与える約50%のメチル化第4級官能基を有する分岐で6400ダルトン分子量のポリマーである。このポリマーを、最初にカルボキシル化しておいた粒子上に水相中で堆積させた(Decher, 1997)。上清の親水性の特性を、上清中で20分間予めインキュベートしたガラス平面を用いて、2.5μlの超純水の水滴により形成される接触角を決定することにより調べた。表面相互作用を、上清で処理したカチオン性コロイド上でのプロピジウムアイオダイドの吸着をモニターすることにより分析した。蛍光プローブについての処理表面の親和性は、フローサイトメトリ(Leboeuf及びHenry, 2006)及び蛍光顕微鏡法を用いて試験した。上清との粒子のインキュベーションは全て、活性種による表面の飽和を導く可能性がある低い粒子/容積比率(約0.2%)で行った。
CFT073及びCFT073ΔR1のインビボコロニー形成を、以前に記載されたようにして行った(Maroncleら, 2006)。マウスを、1010 CFUで胃内に供給した。糞便試料中に含まれる細菌を、寒天プレート上で計数した。宿主内での細菌の成長を調べるために、接種の後の種々の時間でマウスを犠牲にした。結腸及び盲腸を、生理的な水の中でホモジナイズし、組織1グラム当たりのcfuを決定するために培養した。
多細胞バイオフィルム(Hall-Stoodleyら, 2004)細菌集団内のUPEC相互作用を研究するために、マイクロ発酵槽中のインビトロ混合細菌バイオフィルムモデルを開発した(Ghigo, 2001)。このモデルを用いて、共生大腸菌K12株MG1655F'により形成された8時間バイオフィルムに、異なる力価のUPEC CFT073株を接種し、さらに24時間培養した。CFT073の力価の増加に伴い、大腸菌K12株MG1655F'バイオフィルムの発達の強い低下が観察され、これは共生大腸菌KS272株を用いた場合には観察されなかった(図1A)。このことは、CFT073が、MG1655F'バイオフィルムの形成を、直接の接触又は阻害分子の分泌のいずれかにより妨げ得ることを示唆した。これらの2つの可能性を区別するために、CFT073定常期培養物の上清をフィルタ滅菌し、大腸菌バイオフィルム形成に対するその影響を試験した。CFT073上清の存在下では、MG1655F'バイオフィルムは大きく影響を受けた(図1B、C)。このバイオフィルムの阻害は、殺菌又は静菌活性による成長欠陥をもたらさなかった。なぜなら、MG1655F'成長速度及び細胞生存性は、CFT073上清により影響されなかったからである(図1D、E)。
抗バイオフィルム効果の遺伝子的な根本的原理を明らかにするために、約10,000個のCFT073ランダムマリナートランスポゾン挿入変異体の上清の活性を試験した。本発明者らは、MG1655F'バイオフィルム形成を阻害する能力が損なわれた7個の候補を同定した。これらの全ての変異体は、最外層の細菌細胞表面構造であるグループII莢膜多糖体の発現に関与する遺伝子についてマッピングされた(Whitfield及びRoberts, 1999)。グループII莢膜は、3つの機能的領域を特徴とする保存されたモジュール性遺伝子機構を示す(Roberts, 1996) (図3A)。領域1 (kpsFEDCUS)及び領域3 (kpsMT)は、全てのグループII莢膜形成細菌において保存され、ABC依存性多糖体排出に必要なタンパク質をコードする。領域2は可変であり、K1、K2 (CFT073)、K5、K96のような多糖体血清型をコードする(Roberts, 1996)。R1、R2若しくはR3領域、又はそれぞれ個別のkps遺伝子を欠失させ、kpsU、c3692及びc3693以外の全ての変異体が、大腸菌バイオフィルム形成を阻害する能力を喪失し、このことは上清中の沈殿された糖の量の減少に相関したことが観察された(図3B、3C)。フェリチン染色莢膜は、CFT073細胞の周囲でまだ検出され得たが(図3D)、これらの結果は、それにもかかわらずCFT073莢膜が、培地上清への著しい放出を受け、このことが、観察された抗バイオフィルム効果の原因であることを示した。
本発明者らが、CFT073 (K2)、U-9 (非K2)及びIHE3034 (K1)を含む異なるグループII莢膜大腸菌血清型の活性上清から沈殿させた多糖体画分の組成を分析したときに、以前の研究と同様に(Jannら, 1980; Silver及びVimr, 1984)、これらの画分が著しく異なる組成を示すことが観察された(データは示さず)。このことは、生化学的には異なるが、これらの株により放出されるグループII莢膜が、バイオフィルム阻害に導く類似の作用形態を有し得ることを示唆した。グループII莢膜が細菌バイオフィルム形成を阻害する機構をさらに研究するために、これらの画分を、それらのポリエチレンイミンコーティングにより永久実効正電荷を有する直径10μmのラテックス粒子で構成されるカチオン性コロイドと接触させた。界面のζ(ゼータ)電位を決定することにより、野生型上清がカチオン性コロイドの強い電荷反転を誘導することが示され、これは、該上清が、それらのそれぞれの莢膜変異体の上清に比較して、非常にアニオン性の性質であることを示した(図6a)。さらに、酸洗浄ガラススライドの活性上清での処理により、水−スライド界面エネルギーが低減され、このことは、それらの親水性の性質を示した(図6b)。
グループII莢膜の物理化学的特性は、表面と相互作用する細菌の能力を大きく変更させ、よって付着を劇的に低下させるはずである(Neu, 1996)。この仮定を試験するために、MG1655F'及び黄色ブドウ球菌が、CFT073上清で予め処理されたガラス表面に付着する能力を分析した。インキュベーションの1時間後に、大腸菌MG1655 F'及び黄色ブドウ球菌15981は、処理表面へのそれらの最初の付着の3倍の低下を示した(データは示さず)。一貫して、CFT073上清でのマイクロ発酵槽の内部のガラススライドの前処理は、大腸菌、並びに広範囲のグラム陽性及びグラム陰性細菌によるバイオフィルムの形成を劇的に低下させた(図7)。CFT073上清でマイクロ発酵槽を潅流した場合に、同じ効果が観察された(図2B)。CFT073ΔkpsD上清を用いて同様の処理を行った場合に、その効果は観察されなかった(図7)。よって、これらの結果は、CFT073上清中に放出される莢膜多糖体により誘導される表面の修飾が、初期の細菌−表面相互作用を損なうことによりバイオフィルムの形成を妨げ得ることを示唆した。
既に存在するバイオフィルムに対するCFT073上清の影響を調べるために、バイオフィルム成熟の種々の段階でMG1655 F'を接種したマイクロ発酵槽に、ろ過したCFT073上清を補充した。この分析は、成熟24時間バイオフィルムの処理はバイオフィルムの廃棄を誘導しなかったが、MG1655 F'バイオフィルムの開始の0、1及び6時間後のCFT073上清の添加は、そのさらなる発達を遮断したことを示した(図9A)。次いで、本発明者らは、CFT073上清の添加後のGFPタグ付加MG1655F'のインビトロバイオフィルムの特徴及び共焦点レーザ走査型電子顕微鏡(CLSM)を検討した。最初の接種の3時間後に、一様に被覆された表面への活性CFT073外因性上清の添加は、MG1655F'成熟バイオフィルム構造の発達に大きく影響した(図9B)。この影響は、対照のKS272上清での処置によっては観察されなかった。
Claims (21)
- 細菌の付着及び/又は細菌バイオフィルムの発達を予防又は阻害する組成物の製造のための、細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体の使用。
- 前記可溶性グループII様莢膜多糖体が、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌の培養物の上清で得られる請求項1に記載の使用。
- 前記可溶性グループII様莢膜多糖体が、精製画分として得られる請求項1又は2に記載の使用。
- 細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体を含むことを特徴とする、細菌の付着及び/又は細菌バイオフィルムの発達を阻害するための組成物。
- 大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌の培養物の上清の精製画分を含む請求項4に記載の組成物。
- 以下の:
(i) グループII様莢膜を発現する細菌株の培養物の上清を細菌細胞から分離し、
(ii) 得られた上清中に存在する多糖体を沈殿させ、
(iii) 沈殿物を任意に再懸濁する
工程を含む、細菌株から、請求項4又は5に記載の組成物に使用するための抗バイオフィルムグループII様莢膜多糖体を精製する方法。 - グループII様莢膜を発現する前記細胞株が、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される請求項6に記載の方法。
- 前記細胞株が、尿路疾患性大腸菌である請求項6又は7に記載の方法。
- 工程(i)における分離が、培養物のフィルタ滅菌及び/又は遠心分離により行われる請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(ii)における沈殿が、1容量の上清について3容量のエタノールを用いて行われる請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(ii)で得られる沈殿物が、工程(iii)の前に、水に再懸濁され、脱イオン水に対して透析され、次いで凍結乾燥される請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーによる精製の追加の工程(iv)をさらに含む請求項6〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(iv)が、DEAE-セファロースカラムを用いて行われる請求項12に記載の方法。
- 工程(iii)における再懸濁が、25%プロパノール-1を含むTrisHCl 20 mM、pH 7.5中で行われ、かつ工程(iv)において用いられるカラムが、同じ緩衝液で平衡化される請求項12又は13に記載の方法。
- 遠心分離工程を工程(iii)と工程(iv)との間に行って、不溶性画分を廃棄する請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グループII様莢膜多糖体が、TrisHCl 20 mM、pH 7.5、25%プロパノール-1中の300 mM NaClで溶出される請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 必要とする対象への予防的又は治療的投与用に処方された請求項4又は5に記載の組成物。
- 細菌株からのグループII様莢膜多糖体を含むことを特徴とする抗バイオフィルムコーティング。
- 前記グループII様莢膜多糖体が、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌株からであることを特徴とする請求項18に記載の抗バイオフィルムコーティング。
- 請求項4又は5に記載の組成物の使用により得られることを特徴とする請求項18又は19に記載の抗バイオフィルムコーティング。
- 請求項18、19及び20のいずれか1項に記載の抗バイオフィルムコーティングで少なくとも部分的に被覆されたことを特徴とする医療用又は工業用のデバイス。
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