CN111299267B - 一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法；所述方法包括如下步骤：A、对冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株进行分离、纯化和鉴定；B、分别测定分离得到的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株的胞外聚合物(EPS)各组分含量；C、检测分离菌株产生的群感效应信号分子，确定可调控EPS合成的关键信号分子；D、外源添加群感效应抑制剂，优化确定群感效应抑制剂添加剂量即可。本发明是针对传统管网消毒、冲洗和升级水质净化工艺清除供水管网生物膜方法效率有限提出的新方法。本发明方法主要针对供水管壁附着能力强、耐冲刷微生物，具有环境友好，工艺简单，成本低，节省水资源，对传统清除管网生物膜方法有明显强化效果。

Description

一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法及其应用
技术领域
本发明城市供水管网水质控制技术领域，尤其涉及一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法及其应用。
背景技术
作为城市供水管网中常见的微生物存在形式之一，管网生物膜的存在是造成城市饮用水在输配过程中产生二次污染的主要原因。一方面，生物膜上活性微生物通过自身新陈代谢活动和自发周期性脱落，造成饮用水水质恶化(浊度、色度和嗅味等)和继物理化学腐蚀之外微生物诱导的管道腐蚀等问题，据研究发现，管道总损失的20％是有由于微生物腐蚀引起的。另一方面，微生物以生物膜方式存在，不仅大大增强了饮用水中细菌对高氯和寡营养等胁迫性环境的适应性，而且为饮用水中残留受损微生物的恢复性再生长，尤其是强吸附性致病菌的寄居生长创造了良好条件。管壁生物膜中的活性微生物可以通过细菌再生长后的脱落或代谢产物的扩散作用，给居民饮水带来卫生学和感官上影响。
胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)是一类广泛分泌的聚合物，可高度附着在细胞表面或作为细胞外黏液在细胞周围释放，它具有多种作用，包括增强细菌粘附，促进生物膜的结构发展，提供保护屏障，以及吸附和储存生物膜生长的营养素。其中，多糖在抵抗渗透胁迫、抗生素、干燥、有毒化合物等方面具有重要作用。细菌中生物膜的形成与胞外聚合物(EPS)的产生密切相关，EPS作为一种胶水，有助于细胞表面与浸没结构的粘附。此外，EPS可能影响其他生物膜特征，进而影响其对水流剪切力的抵抗力。
供水系统属于严格的贫营养生长环境，悬浮水中微生物通过产生胞外聚合物(EPS)自凝聚附着在管壁上形成膜状微生物聚集体。理论上而言，成熟生物膜大致可分为致密的内聚层和松散的表层，在冲刷清洗中，松散的表层很快脱落，但是致密层由于黏附性能较强，因此对冲刷具有一定的抵御作用。如果供水管网中产生的冲刷剪切应力超过EPS的强度，部分生物膜和管底沉积物会离开管壁进入悬浮水中。进一步增加冲刷强度，在高水流剪切力的作用下，会进一步使生物膜脱落，由于生物膜上微生物自身分泌的胞外聚合物(EPS)的保护作用，使得冲刷无法完全去除管壁生物膜。如何降低耐冲刷细菌胞外聚合物含量，是彻底清除管壁生物膜的技术关键。
目前，同领域技术人员对供水管网生物膜的防控主要通过冲洗，氯化消毒剂投加抑制或杀死表面微生物，但仍然能检测到很多生物膜的存在。其中，对于营养限制，目前最有效的是降低水中有机质含量，但是由于净水工艺的局限性，无法从根本上控制管网微生物的再生和管网生物膜上细菌的数量。对于传统的自由氯或氯胺消毒，大部分消毒剂被消耗在与管材、与沉积物或腐蚀产物和与胞外聚合物(EPS)的反应中，渗透限制的局限使得消毒对生物膜内层微生物也不能发挥很好的效果。本专利技术发明人通过大量实验证明，冲刷不能完全去除生物膜。通过筛选对剪切力不敏感的微生物种类，探寻介导EPS产量的关键信号分子，通过群感淬灭效应，可以调控胞外聚合物EPS合成从而实现对供水管壁细菌生物膜的控制。
细菌生物膜的形成是一种群体行为，可能通过群感效应进行系统协调。陈伟在链球菌生物膜形成中的群感效应一文中(中国动物传染病学报，2010,18(4)：81-86)，综述了革兰氏阳性菌链球菌群感效应介导的生物膜形成及信号传递过程，特别是感受态刺激肽在群感效应中的作用。该文充分阐明了感受态刺激肽的功能,从感受态的形成到其它与细胞密度有关的表型，包括对生物膜形成的影响，以便对感受态刺激肽的作用有新的理解,为研发新型抗生物膜感染药物、提出有效的生物膜感染防制策略提供理论基础。该文是目前中文期刊查到的唯一一篇有关生物膜和群感效应的期刊论文，但该文主要针对链球菌病的防治策略，与城市供水系统生物膜的生长环境和可选择控制策略都完全不同，不具备任何借鉴意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种通过调控胞外聚合物EPS合成的技术方法以影响供水管壁细菌生物膜的形成，从而提高供水管网冲刷去除生物膜的效果的一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法及应用。
本发明提供一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，包括如下步骤：
A、对冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株进行分离、纯化和鉴定；
B、分别测定分离得到的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株的胞外聚合物(EPS) 各组分含量；
C、检测分离菌株产生的群感效应信号分子，确定可调控EPS合成的关键信号分子；
D、外源添加群感效应抑制剂，优化确定群感效应抑制剂添加剂量。
优选地，所述步骤A具体包括，采集冲刷前后供水管网管壁上生物膜的菌株样本，采用R2A培养基以平板划线分离纯化，再进行液体培养基富集；所述鉴定具体包括DNA 提取和测序确定耐冲刷菌株。
优选地，所述步骤B具体包括以下步骤：
a、将步骤A中分离的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株接种至R2A液体培养基中活化；在25±5℃，200±50rpm下培养至菌液由清变浑浊；将菌液浓度调至0.5麦氏浓度；
b、在24孔板中接入R2A液体培养基和各菌株0.5麦氏浓度的菌液，所述R2A液体培养基和菌液体积比为98:1，每株菌株3个平行，以25±5℃，100±50rpm下振荡培养5-7 天；
c、取步骤b中上层液体，用中性PBS冲洗数次，用无菌PBS抽打冲洗孔板底部的生物膜，取出并转移至EP管中；在紫外分光光度计下测定各菌液的OD值；
d、5500±1000r·min-1，4±10℃下离心10-15min，吸取上清液转移至无菌的EP管中，作为松散型EPS；
e、用PBS重悬沉淀，加入5％v/v的甲醛，在4±2℃下震荡2±0.5h；14000±1000r·min-1， 4±2℃离心15±5min，吸取上清液转移至无菌EP管中，作为紧密型EPS；
f、将所有菌株的松散型EPS和紧密型EPS的上清收集液，分别测定多糖、蛋白质浓度。
优选地，所述步骤C中检测分离菌株产生的群感效应信号分子具体包括以下步骤：
a1、将步骤A分离的冲刷前后管壁生物膜上的菌株进行富集培养；
b1、将富集培养液在4±2℃，14000±2000r·min-1下离心25±5min；
c1、取离心后的上清液，用等体积的含有乙酸，丙酮的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液至圆底瓶，并在25±5℃条件下进行旋转蒸发；
d1、用甲醇冲洗已悬干的圆底烧瓶，充分溶解后转移至离心管中，重复两次，得所需 AHLs样品；
e1、取各AHLs标准品的标准原液，用甲醇稀释至0.5ng/L、1ng/L、5ng/L、10ng/L、50ng/L的浓度梯度，将所有AHLs标品与各菌株样本所提取的AHLs样品，使用液相色谱串联质谱联用仪，采用正喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进行质谱定量分析。
优选地，所述步骤C中确定可调控EPS合成的关键信号分子具体包括以下步骤：通过比较冲刷前后两组分离细菌可检出信号分子，确定只存在于耐冲刷菌株中的信号分子为关键信号分子。
优选地，所述关键信号分子包括C6-HSL信号分子。
优选地，所述步骤D具体包括：根据步骤C中关键信号分子确认相应群感效应抑制剂，通过在需清除管壁生物膜的供水管网管壁添加可抑制供水管网中耐冲刷细菌合成主要EPS成分的群感效应抑制剂，并优化群感效应抑制剂的剂量完成管壁耐冲刷细菌的清除。
优选地，所述群感效应抑制剂包括香草醛。
优选地，所述群感效应抑制剂的外源添加量大于1.25mg·mL-1。
一种上述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法的应用，所述基于群感效应的供水管网生物膜控制方法应用于供水管网管壁上生物膜的清除。
本发明针对当前城镇供水管网管壁生物膜生长普遍存在，且采用传统的冲洗方式和加氯消毒方式清除管壁生物膜效果有限，而通过调控净水工艺净水能力完全去除水中有机物也存在水厂净水能力的局限性，研发了一种针对管壁耐冲刷细菌、基于群感效应调控的管壁生物膜清除方式。该技术从管壁生物膜的形成机制出发，通过调控管壁生物膜形成中起关键作用的胞外聚合物的合成过程达到深度去除管壁耐冲刷微生物的效应。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明通过目标管段一次冲洗前后耐冲刷细菌影响EPS合成的关键信号分子识别，应用针对性群感效应抑制剂对管壁耐冲刷微生物实施清除，可以强化清除各种冲刷设备不能清除的顽固性附着微生物；
(2)本发明避免了高消毒剂投加可能产生的环境生态风险和金属管壁侵蚀影响。供水管壁附着的微生物长期生长在管网一定余氯水平下，已经产生了较强的消毒剂抗性，如果采用消毒剂方式去除管壁生物膜，势必需要加大消毒剂投加量，如果不是从水厂投加，而是从管道中间投加，除了消毒剂的投加设备，高浓度消毒剂对金属管网设备的侵蚀也需慎重考虑，而本发明涉及的群感效应抑制剂投加量小，无毒性，对管道设备和人体影响都很小；
(3)各种冲刷方式包括水冲、气水冲、气液固三相冲所需的冲洗工艺设备庞大、复杂，为达到较好的清除效果，冲洗持续时间长，产生的冲洗水量大、水资源浪费，最终效果仍然不能将耐冲刷细菌完全清除。本发明专门针对耐冲刷细菌，具有强化清除，不需长时间冲刷，不产生大量冲洗污废水、不需复杂现场工艺设备，节省水资源等优点；
(4)通过管网水质营养调控清除管壁生物膜可不必针对不同管段开展清洗，主要通过提升水厂净化工艺效能，但要明显改善管网水质，需要对净水工艺进行大幅度改造提升，这将大幅度增加制水成本和能耗。本发明主要针对拟清洗管段，投加药剂量小，针对性强，可清除管壁附着能力强，耐冲刷微生物等优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是实施例1中供水管网生物膜中分离菌株的胞外聚合物组分测定；
图2是实施例1中添加不同浓度群感效应抑制剂条件下管壁生物膜的胞外多糖和胞外蛋白质含量变化；
图3是实施例1中不同管壁生物膜处理技术对管壁生物膜异养菌数量的影响。
具体实施方式
本申请以城镇供水管网管壁生物膜生长控制为目标，通过对待去除管段管壁生物膜上耐冲刷菌株进行鉴定，验证其胞外聚合物与冲刷耐受性的关系，检测其产生的群感效应信号分子，找出共有的关键信号分子，并通过外源添加针对性群感效应抑制剂的方式对供水管网生物膜附着性能进行调控。
以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1：
一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，包括如下步骤：
A、以直径100mm长期稳定通水的水泥涂衬球墨铸铁管段为研究对象，进行气水冲刷实验。采集实验管段在冲刷前和气-水冲刷后两条件下的生物膜样本，加入1mL无菌水制成悬液，依次稀释101、102、103、104、105倍，取原液及各梯度浓度的稀释液0.1mL 分别涂布于R2A固体培养基平板上，做好标记后培养。
R2A平板于28℃培养条件下培养1-7d后进行平板观察。根据菌落形态及颜色在R2A平板上进行连续平板划线，分离纯化冲刷前后生物膜上的微生物菌株。接种环挑取取经过分离纯化的菌株加入到配制好的R2A液体培养基中，28℃下振荡培养，转速为 110rpm，分别于培养适当时间后取出一定体积培养液用于提取总DNA和测序鉴定。
本次菌株分离鉴定共筛选出15株菌，从冲刷前生物膜中分离出8株细菌，冲刷后生物膜种分离出7株细菌。经16S rRNA序列比对分析，冲刷前即存在于生物膜中的8株细菌中，有3株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其余5株分别属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、短波单胞菌属(Brevundimonassp.) 和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)。冲刷后从生物膜上分离出7株菌，其中2株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，2株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，其余3株分别为微杆菌属 (Microbacterium sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)和罗河杆菌属(Rhodanobacter sp.)。上述菌株在冲刷后仍然存在于管壁生物膜上，故而定义其为耐冲刷菌，具有一定的冲刷耐受性。
B、将步骤A中分离的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株接种至5mL R2A液体培养基中活化，28℃ 200rpm下培养至菌液变浑浊；取3mL菌悬液至已灭菌的玻璃比色皿中，使用紫外分光光度计测定OD600，统一将所有菌液浓度调至0.5麦氏浓度(OD600＝0.13)；在24孔板中，接种1960μL的R2A液体培养基，接入20μL的各菌株0.5麦氏浓度的菌液，每株菌株3个平行，28℃下振荡培养，转速为110rpm下培养6天；轻轻吸取上层液体，用pH＝7的PBS轻轻冲洗3次，去掉悬浮微生物，用1mL的无菌PBS抽打冲洗孔板底部的生物膜，取出转移至2mL的EP管中；在紫外分光光度计下测定各菌液的OD600；
6000r·min-1 4℃离心15min，吸取上清液转移至2mL无菌的EP管中，作为松散型EPS；用1mL PBS重悬沉淀，加入5％v/v的甲醛50μL，在4℃下震荡2h；15 000r·min-1 4℃离心20min，吸取上清液转移至2mL无菌的EP管中，收集紧密型EPS；将所有菌株的两种EPS上清收集液，各取3个平行的20μL样品至96孔板中，分别采用苯酚硫酸法测定多糖、Bradford法测定蛋白质浓度，结果如图1。
如图1中所示，所有分离菌株产生的EPS范围为160～1200μg/OD600，而氮磷比的范围为0.7～15.2。具体而言，EPS分泌量最高的菌株是M21，属于Rhodanobacter sp，而最低的是M3，属于Rhizobium sp。对于所有具有冲刷耐受性的菌属，包括芽孢杆菌(A1,A2,A3,A4,A5)，假单胞菌(B1,B2,B3,B4)，微杆菌(C1)、分枝杆菌(C2)和罗丹诺杆菌(C3)，都是高产EPS的，其EPS的产量均大于350μg/OD600。相反地，仅存在冲刷前的生物膜中但在冲刷后无法分离培养的菌属，包括根瘤菌(D1)、诺卡氏菌(E1)、布氏单胞菌(F1)和类芽孢杆菌属(G1)，仅产生较少的EPS，产量均低于300μg/OD600。此外，对于大多数具有冲刷耐受性的菌株，胞外多糖的含量远高于细胞外蛋白质，是EPS的主导组分。
C、将步骤A分离的冲刷前后管壁生物膜上的菌株进行富集培养；将富集培养液在4℃ 12000rpm的转速下离心30min；取出上清液，并用等体积的含有0.02M乙酸，10％丙酮的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液至圆底瓶，并在28℃条件下进行旋转蒸发；取500μL 50％的甲醇冲洗已悬干的圆底烧瓶，充分溶解后转移至2mL离心管中，重复两次，得1mL样品。分别取各信号分子AHLs标准品的标准原液，用50％的甲醇稀释至0.5ng/L、1ng/L、5 ng/L、10ng/L、50ng/L的浓度梯度，将所有AHLs标品与各菌株样本所提取的AHLs，使用液相色谱串联质谱联用仪，采用正喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进行质谱定量分析。通过比较冲刷前后两组分离细菌可检出信号分子，确定只存在于耐冲刷菌株中，能够调控EPS合成，进而影响生物膜上微生物冲刷抗性的关键信号分子。
对于耐冲刷菌株，在所有分离株中至少可以检测到一种AHLs。在假单胞菌属中检测 C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL；大部分芽孢杆菌菌株(A2、A3)均检出C6-HSL和C10-HSL，而A1菌株除检出C6-HSL和C10-HSL外，还被检出可分泌C8-HSL、C12-HSL、 3-oxo-C12-HSL和3-oxo-C14–HSL；微杆菌属和罗河杆菌属中均检测到C6-HSL、C8-HSL、 C10-HSL这3种物质；对于分枝杆菌而言，只能检测到C6-HSL。另一方面，对于无冲刷耐受性的菌属，大多数都不是产生AHLs的细菌。通过对这两组菌属的比较不难发现，C6-HSL 为关键的信号分子，只存在于所有的耐冲刷菌株中，且同时不存在于任何无冲刷耐受性的菌株中。
D、根据步骤C中关键信号分子确认香草醛作为群感效应抑制剂，在需清除管壁生物膜的供水管网管壁添加可抑制供水管网中耐冲刷细菌合成主要EPS成分的群感效应抑制剂香草醛，香草醛对酰化高丝氨酸内酯类(AHLs)短链信号分子抑制效果较好，外源添加1.25-20mg·mL-1范围的香草醛，所有菌株的多糖在1.25mg·mL-1低浓度的香草醛处理下，即与对比例1和对比例2产生显著性的差异，当香草醛浓度到增大到一定程度时，部分菌株在5d的培养时间下无法成膜。对于胞外蛋白而言，在香草醛为1.25mg·mL-1低浓度的条件下，芽孢杆菌属中的1株菌(A2)胞外蛋白的含量无法到到显著性差异。当香草醛浓度达到50mg·mL-1时，所有菌株的胞外蛋白的含量能达到显著性的减少。同样地，当香草醛浓度增大到一定程度时，部分菌株在5d的培养时间下无法成膜，实验结果如图2所示。
依次经过水流冲刷，气水冲刷和外源添加香草醛的处理后，球墨铸铁管管壁生物膜上的可培养微生物数量呈现一个逐步递减的趋势(图3)。这说明，在进行高流速水冲刷之后，转换冲刷方式为气水冲刷，可显著增加水流中的机械剪切力，促使一部分粘附性较强的微生物从生物膜上脱落。进一步地，对于具有冲刷耐受性的部分微生物，经过外源添加群感效应抑制剂香草醛后，其胞外聚合物的合成受到抑制，生物膜的结构产生改变，应对水流剪切力的耐受性下降，故而使得生物膜上的生物量产生进一步的下降。
实施例2：
一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，包括如下步骤：
A、以直径100mm长期稳定通水的水泥涂衬球墨铸铁管段为研究对象，进行气水冲刷实验。采集实验管段在冲刷前和气-水冲刷后两条件下的生物膜样本，加入1mL无菌水制成悬液，依次稀释101、102、103、104、105倍，取原液及各梯度浓度的稀释液0.1mL 分别涂布于R2A固体培养基平板上，做好标记后培养。
R2A平板于28℃培养条件下培养1-7d后进行平板观察。根据菌落形态及颜色在R2A平板上进行连续平板划线，分离纯化冲刷前后生物膜上的微生物菌株。接种环挑取取经过分离纯化的菌株加入到配制好的R2A液体培养基中，28℃下振荡培养，转速为 110rpm，分别于培养适当时间后取出一定体积培养液用于提取总DNA和测序鉴定。
本次菌株分离鉴定共筛选出15株菌，从冲刷前生物膜中分离出8株细菌，冲刷后生物膜种分离出7株细菌。经16S rRNA序列比对分析，冲刷前即存在于生物膜中的8株细菌中，有3株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其余5株分别属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、短波单胞菌属(Brevundimonassp.) 和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)。冲刷后从生物膜上分离出7株菌，其中2株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，2株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，其余3株分别为微杆菌属 (Microbacterium sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)和罗河杆菌属(Rhodanobacter sp.)。上述菌株在冲刷后仍然存在于管壁生物膜上，故而定义其为耐冲刷菌，具有一定的冲刷耐受性。
B、将步骤A中分离的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株接种至5mL R2A液体培养基中活化，20℃ 250rpm下培养至菌液变浑浊；取3mL菌悬液至已灭菌的玻璃比色皿中，使用紫外分光光度计测定OD600，统一将所有菌液浓度调至0.5麦氏浓度(OD600＝0.13)；在24孔板中，接种1960μL的R2A液体培养基，接入20μL的各菌株0.5麦氏浓度的菌液，每株菌株3个平行，20℃下振荡培养，转速为150rpm下培养5天；轻轻吸取上层液体，用pH＝7的PBS轻轻冲洗3次，去掉悬浮微生物，用1mL的无菌PBS抽打冲洗孔板底部的生物膜，取出转移至2mL的EP管中；在紫外分光光度计下测定各菌液的OD600；
4500r·min-1-6℃离心13min，吸取上清液转移至2mL无菌的EP管中，作为松散型EPS；用1mL PBS重悬沉淀，加入5％v/v的甲醛50μL，在4℃下震荡2h；14000r·min-1 2℃离心15min，吸取上清液转移至2mL无菌的EP管中，收集紧密型EPS；将所有菌株的两种EPS上清收集液，各取3个平行的20μL样品至96孔板中，分别采用苯酚硫酸法测定多糖、Bradford法测定蛋白质浓度，结果如图1。
图1中，所有分离菌株产生的EPS范围为160～1200μg/OD600，而氮磷比的范围为0.7～15.2。具体而言，EPS分泌量最高的菌株是M21，属于Rhodanobacter sp，而最低的是M3，属于Rhizobium sp。对于所有具有冲刷耐受性的菌属，包括芽孢杆菌(A1,A2,A3,A4,A5)，假单胞菌(B1,B2,B3,B4)，微杆菌(C1)、分枝杆菌(C2)和罗丹诺杆菌(C3)，都是高产EPS的，其EPS的产量均大于350μg/OD600。相反地，仅存在冲刷前的生物膜中但在冲刷后无法分离培养的菌属，包括根瘤菌(D1)、诺卡氏菌(E1)、布氏单胞菌(F1)和类芽孢杆菌属(G1)，仅产生较少的EPS，产量均低于300μg/OD600。此外，对于大多数具有冲刷耐受性的菌株，胞外多糖的含量远高于细胞外蛋白质，是EPS的主导组分。
C、将步骤A分离的冲刷前后管壁生物膜上的菌株进行富集培养；将富集培养液在2℃ 14000rpm的转速下离心25min；取出上清液，并用等体积的含有0.02M乙酸，10％丙酮的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液至圆底瓶，并在20℃条件下进行旋转蒸发；取500μL 50％的甲醇冲洗已悬干的圆底烧瓶，充分溶解后转移至2mL离心管中，重复两次，得1mL样品。分别取各信号分子AHLs标准品的标准原液，用50％的甲醇稀释至0.5ng/L、1ng/L、5 ng/L、10ng/L、50ng/L的浓度梯度，将所有AHLs标品与各菌株样本所提取的AHLs，使用液相色谱串联质谱联用仪，采用正喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进行质谱定量分析。通过比较冲刷前后两组分离细菌可检出信号分子，确定只存在于耐冲刷菌株中，能够调控EPS合成，进而影响生物膜上微生物冲刷抗性的关键信号分子。
对于耐冲刷菌株，在所有分离株中至少可以检测到一种AHLs。在假单胞菌属中检测 C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL；大部分芽孢杆菌菌株(A2、A3)均检出C6-HSL和C10-HSL，而A1菌株除检出C6-HSL和C10-HSL外，还被检出可分泌C8-HSL、C12-HSL、 3-oxo-C12-HSL和3-oxo-C14–HSL；微杆菌属和罗河杆菌属中均检测到C6-HSL、C8-HSL、 C10-HSL这3种物质；对于分枝杆菌而言，只能检测到C6-HSL。另一方面，对于无冲刷耐受性的菌属，大多数都不是产生AHLs的细菌。通过对这两组菌属的比较不难发现，C6-HSL 为关键的信号分子，只存在于所有的耐冲刷菌株中，且同时不存在于任何无冲刷耐受性的菌株中。
D、根据步骤C中关键信号分子确认香草醛作为群感效应抑制剂，在需清除管壁生物膜的供水管网管壁添加可抑制供水管网中耐冲刷细菌合成主要EPS成分的群感效应抑制剂香草醛，香草醛对酰化高丝氨酸内酯类(AHLs)短链信号分子抑制效果较好，外源添加20mg·mL-1范围的香草醛，所有菌株的多糖在20mg·mL-1浓度的香草醛处理下，与对比例1和对比例2产生显著性的差异。
实施例3：
一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，包括如下步骤：
A、以直径100mm长期稳定通水的水泥涂衬球墨铸铁管段为研究对象，进行气水冲刷实验。采集实验管段在冲刷前和气-水冲刷后两条件下的生物膜样本，加入1mL无菌水制成悬液，依次稀释101、102、103、104、105倍，取原液及各梯度浓度的稀释液0.1mL 分别涂布于R2A固体培养基平板上，做好标记后培养。
R2A平板于28℃培养条件下培养1-7d后进行平板观察。根据菌落形态及颜色在R2A平板上进行连续平板划线，分离纯化冲刷前后生物膜上的微生物菌株。接种环挑取取经过分离纯化的菌株加入到配制好的R2A液体培养基中，28℃下振荡培养，转速为 110rpm，分别于培养适当时间后取出一定体积培养液用于提取总DNA和测序鉴定。
本次菌株分离鉴定共筛选出15株菌，从冲刷前生物膜中分离出8株细菌，冲刷后生物膜种分离出7株细菌。经16S rRNA序列比对分析，冲刷前即存在于生物膜中的8株细菌中，有3株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其余5株分别属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、短波单胞菌属(Brevundimonassp.) 和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)。冲刷后从生物膜上分离出7株菌，其中2株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，2株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，其余3株分别为微杆菌属 (Microbacterium sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)和罗河杆菌属(Rhodanobacter sp.)。上述菌株在冲刷后仍然存在于管壁生物膜上，故而定义其为耐冲刷菌，具有一定的冲刷耐受性。
B、将步骤A中分离的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株接种至5mL R2A液体培养基中活化，30℃ 250rpm下培养至菌液变浑浊；取3mL菌悬液至已灭菌的玻璃比色皿中，使用紫外分光光度计测定OD600，统一将所有菌液浓度调至0.5麦氏浓度(OD600＝0.13)；在24孔板中，接种1960μL的R2A液体培养基，接入20μL的各菌株0.5麦氏浓度的菌液，每株菌株3个平行，30℃下振荡培养，转速为50rpm下培养7天；轻轻吸取上层液体，用pH＝7的PBS轻轻冲洗3次，去掉悬浮微生物，用1mL的无菌PBS抽打冲洗孔板底部的生物膜，取出转移至2mL的EP管中；在紫外分光光度计下测定各菌液的OD600；
6500r·min-1 14℃离心10min，吸取上清液转移至2mL无菌的EP管中，作为松散型EPS；用1mL PBS重悬沉淀，加入5％v/v的甲醛50μL，在4℃下震荡2h；13000r·min-1 6℃离心10min，吸取上清液转移至2mL无菌的EP管中，收集紧密型EPS；将所有菌株的两种EPS上清收集液，各取3个平行的20μL样品至96孔板中，分别采用苯酚硫酸法测定多糖、Bradford法测定蛋白质浓度，结果如图1。
图1中，所有分离菌株产生的EPS范围为160～1200μg/OD600，而氮磷比的范围为0.7～15.2。具体而言，EPS分泌量最高的菌株是M21，属于Rhodanobacter sp，而最低的是M3，属于Rhizobium sp。对于所有具有冲刷耐受性的菌属，包括芽孢杆菌(A1,A2,A3,A4,A5)，假单胞菌(B1,B2,B3,B4)，微杆菌(C1)、分枝杆菌(C2)和罗丹诺杆菌(C3)，都是高产EPS的，其EPS的产量均大于350μg/OD600。相反地，仅存在冲刷前的生物膜中但在冲刷后无法分离培养的菌属，包括根瘤菌(D1)、诺卡氏菌(E1)、布氏单胞菌(F1)和类芽孢杆菌属(G1)，仅产生较少的EPS，产量均低于300μg/OD600。此外，对于大多数具有冲刷耐受性的菌株，胞外多糖的含量远高于细胞外蛋白质，是EPS的主导组分。
C、将步骤A分离的冲刷前后管壁生物膜上的菌株进行富集培养；将富集培养液在6℃ 16000rpm的转速下离心20min；取出上清液，并用等体积的含有0.02M乙酸，10％丙酮的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液至圆底瓶，并在28℃条件下进行旋转蒸发；取500μL 50％的甲醇冲洗已悬干的圆底烧瓶，充分溶解后转移至2mL离心管中，重复两次，得1mL样品。分别取各信号分子AHLs标准品的标准原液，用50％的甲醇稀释至0.5ng/L、1ng/L、5 ng/L、10ng/L、50ng/L的浓度梯度，将所有AHLs标品与各菌株样本所提取的AHLs，使用液相色谱串联质谱联用仪，采用正喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进行质谱定量分析。通过比较冲刷前后两组分离细菌可检出信号分子，确定只存在于耐冲刷菌株中，能够调控EPS合成，进而影响生物膜上微生物冲刷抗性的关键信号分子。
对于耐冲刷菌株，在所有分离株中至少可以检测到一种AHLs。在假单胞菌属中检测 C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL；大部分芽孢杆菌菌株(A2、A3)均检出C6-HSL和C10-HSL，而A1菌株除检出C6-HSL和C10-HSL外，还被检出可分泌C8-HSL、C12-HSL、 3-oxo-C12-HSL和3-oxo-C14–HSL；微杆菌属和罗河杆菌属中均检测到C6-HSL、C8-HSL、 C10-HSL这3种物质；对于分枝杆菌而言，只能检测到C6-HSL。另一方面，对于无冲刷耐受性的菌属，大多数都不是产生AHLs的细菌。通过对这两组菌属的比较不难发现，C6-HSL 为关键的信号分子，只存在于所有的耐冲刷菌株中，且同时不存在于任何无冲刷耐受性的菌株中。
D、根据步骤C中关键信号分子确认香草醛作为群感效应抑制剂，在需清除管壁生物膜的供水管网管壁添加可抑制供水管网中耐冲刷细菌合成主要EPS成分的群感效应抑制剂香草醛，香草醛对酰化高丝氨酸内酯类(AHLs)短链信号分子抑制效果较好，外源添加50mg·mL-1范围的香草醛，所有菌株的多糖在50mg·mL-1浓度的香草醛处理下，所有菌株的胞外蛋白的含量能达到显著性的减少。当香草醛浓度增大到一定程度时，部分菌株在5 d的培养时间下无法成膜，实验结果如图2所示。
对比例1：
一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，与实施例1的不同之处在于不添加群干效应抑制剂香草醛使用水冲刷实验管壁生物膜，如图3，冲刷后管壁生物膜量显著高于水中投加群感效应抑制剂香草醛后管壁的生物膜量。
对比例2：
一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，与实施例1的不同之处在于不添加群干效应抑制剂香草醛使用气水冲洗实验管壁生物膜，如图3，冲刷后管壁生物膜量比水冲后有所减少，但仍高于投加群感效应抑制剂香草醛后管壁的生物膜量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (9)

1.一种基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、对冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株进行分离、纯化和鉴定；
B、分别测定分离得到的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株的胞外聚合物各组分含量；
C、检测分离菌株产生的群感效应信号分子，确定可调控胞外聚合物合成的关键信号分子；
D、外源添加群感效应抑制剂，优化确定群感效应抑制剂添加剂量；
所述步骤B具体包括以下步骤：
a、将步骤A中分离的冲刷前后的供水管网管壁上生物膜的菌株接种至R2A液体培养基中活化；在25±5°C， 200±50rpm下培养至菌液由清变浑浊；将菌液浓度调至0.5麦氏浓度；
b、在24孔板中接入R2A液体培养基和各菌株0.5麦氏浓度的菌液，所述R2A液体培养基和菌液体积比为98:1，每株菌株3个平行，以25±5 °C，100±50 rpm下振荡培养5-7天；
c、取步骤b中上层液体，用中性PBS冲洗数次，用无菌PBS抽打冲洗孔板底部的生物膜，取出并转移至EP管中；在紫外分光光度计下测定各菌液的OD值；
d、5500±1000r·min-1，4±10℃下离心10-15 min，吸取上清液转移至无菌的EP管中，作为松散型胞外聚合物；
e、用 PBS重悬沉淀，加入5% v/v 的甲醛，在4±2℃下震荡2±0.5 h；14000±1000 r·min-1，4±2℃离心15±5 min，吸取上清液转移至无菌EP管中，作为紧密型胞外聚合物；
f、将所有菌株的松散型胞外聚合物和紧密型胞外聚合物的上清收集液，分别测定多糖、蛋白质浓度。
2.根据权利要求1所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述步骤A具体包括，采集冲刷前后供水管网管壁上生物膜的菌株样本，采用R2A培养基以平板划线分离纯化，再进行液体培养基富集；所述鉴定具体包括DNA提取和测序确定耐冲刷菌株。
3.根据权利要求1所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述步骤C中检测分离菌株产生的群感效应信号分子具体包括以下步骤：
a1、将步骤A分离的冲刷前后管壁生物膜上的菌株进行富集培养；
b1、将富集培养液在4±2℃，14000±2000 r·min-1下离心25±5min；
c1、取离心后的上清液，用等体积的含有乙酸，丙酮的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液至圆底瓶，并在 25±5 °C条件下进行旋转蒸发；
d1、用甲醇冲洗已悬干的圆底烧瓶，充分溶解后转移至离心管中，重复两次，得所需AHLs样品；
e1、取各AHLs标准品的标准原液，用甲醇稀释至0.5 ng/L、1 ng/L、5 ng/L、10 ng/L、50ng/L的浓度梯度，将所有AHLs标品与各菌株样本所提取的AHLs样品，使用液相色谱串联质谱联用仪，采用正喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进行质谱定量分析。
4.根据权利要求1所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述步骤C中确定可调控胞外聚合物合成的关键信号分子具体包括以下步骤：通过比较冲刷前后两组分离细菌可检出信号分子，确定只存在于耐冲刷菌株中的信号分子为关键信号分子。
5.根据权利要求4所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述关键信号分子包括C6-HSL信号分子。
6.根据权利要求1所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述步骤D具体包括：根据步骤C中关键信号分子确认相应群感效应抑制剂，通过在需清除管壁生物膜的供水管网管壁添加可抑制供水管网中耐冲刷细菌合成主要胞外聚合物成分的群感效应抑制剂，并优化群感效应抑制剂的剂量完成管壁耐冲刷细菌的清除。
7.根据权利要求6所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述群感效应抑制剂包括香草醛。
8.根据权利要求7所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法，其特征在于，所述群感效应抑制剂的外源添加量大于1.25 mg·mL-1。
9.一种根据权利要求1所述的基于群感效应的供水管网生物膜控制方法的应用，其特征在于，所述基于群感效应的供水管网生物膜控制方法应用于供水管网管壁上生物膜的清除。
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